ES2827327B2 - Sistema teranostico para difusion dirigida a celulas cancerosas de agentes terapeuticos y de imagen - Google Patents

Sistema teranostico para difusion dirigida a celulas cancerosas de agentes terapeuticos y de imagen Download PDF

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Description

DESCRIPCIÓN
SISTEMA TERANÓSTICO PARA DIFUSIÓN DIRIGIDA A CÉLULAS CANCEROSAS
DE AGENTES TERAPÉUTICOS Y DE IMAGEN
La presente invención se refiere a un sistema multifuncional estable en medio fisiológico, definido como teranóstico, que incorpora en la misma plataforma una molécula anticancerígena, un agente de imagen y una molécula directora que interacciona específicamente con receptores de membrana de células cancerosas, y que permite llevar a cabo conjuntamente la adquisición de imagen de los tejidos patológicos y la acción farmacológica con gran especificidad. Asimismo, la administración de dicho sistema teranóstico por vía intratumoral facilita la difusión selectiva a las células cancerosas, y minimiza los inconvenientes de la quimioterapia.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
La administración de agentes antitumorales por vía parenteral puede acarrear problemas serios de toxicidad, lo que limita drásticamente la dosis del agente terapéutico y con ello la eficacia del tratamiento. En este sentido, la incorporación de la molécula biológicamente activa sobre un vehículo farmacéutico que facilite la difusión selectiva a las células cancerosas minimiza los inconvenientes de la quimioterapia. Ello es especialmente evidente cuando se cumplen dos premisas:
i) la administración intratumoral directa, en lugar de la vía parenteral;
ii) la incorporación de una molécula directora en el vehículo farmacéutico que garantice la interacción específica con receptores de membrana de células tumorales.
En este contexto, las nanopartículas de determinados materiales porosos presentan un enorme potencial como vehículos farmacéuticos capaces de incorporar numerosas funcionalidades en su superficie y en el interior de los poros, como agentes terapéuticos, fluorocromos, elementos paramagnéticos, radionúcleos y moléculas directoras, además de sustancias protectoras que garantizan la estabilidad en fluidos biológicos y una mínima o nula inmunogenicidad. De esta forma, un mismo sistema, definido como teranóstico, permitiría llevar a cabo en una administración de bolo simple la adquisición de imagen de los tejidos patológicos y la acción farmacológica.
En el caso particular del cáncer de próstata (CaP), la evolución del tumor tiene lugar durante un periodo prolongado, en el que durante las fases T el tumor sólo afecta a la glándula, y durante la fase N el tumor afecta a la glándula y se propaga a los ganglios linfáticos cercanos. Por tanto, resulta viable llevar a cabo un tratamiento con agentes quimioterápicos mediante administración intratumoral. Dicho tratamiento, sin embargo, no resultaría recomendable una vez alcanzada la fase M (metástasis) del CaP. Asimismo, dado que determinadas líneas celulares de CaP desarrollan receptores específicos de membrana, como el receptor FOLH1, también llamado antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), la incorporación en la superficie de los vehículos nanoparticulados de moléculas de un anticuerpo que interaccione específicamente con dichos receptores permitirá alcanzar niveles de eficacia y selectividad altísimos en el tratamiento de la patología, así como una resolución de imagen de nivel celular mediante la instrumentación adecuada.
Por tanto, existe una urgente necesidad de desarrollar nuevos vehículos farmacéuticos basados en nanopartículas de materiales porosos portadoras de moléculas antitumorales y agentes de imagen, capaces de llevar a cabo interacciones específicas de tipo antígeno-anticuerpo con células cancerosas, para su administración vía intratumoral.
En la patente WO2014145606A1 se describe nanopartículas de sílice con utilidad teranóstica que comprenden un compuesto fluorescente, polietilenglicol (PEG), un anticuerpo monoclonal dirigido contra el PSMA prostático y un agente terapéutico como, por ejemplo, DTX. Las nanopartículas pueden comprender asimismo un agente de contraste constituido por un radionúcleo seleccionado entre: 89Zr, 64Cu, 68Ga, 86Y, 124I y 177Lu.
Por otro lado, E. Rivero-Buceta y col. (ACS Omega 2019, 4, 1281-1291), desarrollan nanopartículas de sílice porosa de tipo MCM-41 funcionalizadas con DTX y un anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 (clone C803N) dirigido contra receptores FOLH1 para tratamiento del cáncer de próstata, obteniendo alta selectividad por la línea celular LNCaP, sobre la que se obtiene una actividad citotóxica muy superior a la del DTX libre.
Asimismo, P. K. B. Nagesh y col. (Colloids and Surfaces B: Biointerfaces 2016, 144, 8­ 20) sintetizan nanopartículas paramagnéticas de tipo SPION que comprenden un núcleo de óxido de hierro y capas de p-ciclodextrina y poloxámero 407 (Pluronic® F-127). Estas nanopartículas están cargadas con DTX e incorporan además el anticuerpo monoclonal anto-FOLH1 (clone J591), dirigido contra receptores FOLH1. El sistema presenta gran eficacia contra el cáncer de próstata y proporciona un alto grado de internalización del DTX en células C4-2, así como en tumores que contienen esta línea celular.
Por otro lado, el documento de A. S. Oliveira (Desenvolvimento de novos nanocarreadores para liberapáo controlada de Olanzapina e Camptotecina. 2018. 141f. Tese, Universidade Federal do Rio Grande do Norte, Natal, 2018) describe la síntesis de un vehículo para la administración de camptotecina basado en una red covalente orgánica de tipo COF-5 con grupos amina primarios a la que se une de forma covalente el 20-O-succinato de camptotecina, por cuanto que se trata de un material 100% orgánico y biodegradable, lo que solucionaría los problemas de acumulación en el organismo de residuos de nanopartículas que pueden producirse con los materiales inorgánicos, como sílice y óxido de hierro. Además, debido a su elevada superficie específica, el COF es capaz de incorporar una elevada cantidad de moléculas del agente bioactivo, facilitando su administración a dosis reducidas. Sin embargo, la incorporación de grupos amina (y por tanto la unión de camptotecina) en la red está limitada por la repulsión electrónica que generan en el interior de la misma, lo que desestabiliza la estructura hexagonal laminar (2D) del material. Ello reduce notablemente la cristalinidad, así como la estabilidad en medio fisiológico, provocando la rápida disolución de las partículas y liberando la carga farmacológica de forma no controlada. En este sentido, este sistema resultó poco eficaz frente a cultivos de la línea celular cancerosa HeLa.
En la presente invención se detalla la síntesis de nanopartículas de redes covalentes orgánicas estables en medio fisiológico, solventado el problema de disolución parcial o total observado en las redes covalentes borónicas descritas anteriormente, lo que permite su utilización para diagnóstico y terapia del cáncer, incorporando en la misma plataforma una molécula anticancerígena, un agente de imagen y una molécula directora que interacciona específicamente con receptores de membrana de células cancerosas. De esta manera, se obtiene un sistema multifuncional definido como teranóstico, que permite llevar a cabo conjuntamente la adquisición de imagen de los tejidos patológicos y la acción farmacológica con gran especificidad. Asimismo, la administración de dicho sistema teranóstico por vía intratumoral facilita la difusión selectiva a las células cancerosas, y minimiza los inconvenientes de la quimioterapia.
DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN
La presente invención se refiere a un sistema teranóstico estable en medio fisiológico que interacciona específicamente con receptores FOLH1 de células o tejidos, y que comprende nanopartículas de un material poroso caracterizadas por que dicho material poroso presenta una estructura cristalina que corresponde a una red covalente orgánica (COF) a la que se unen a través de grupos amino terminales presentes en su estructura los siguientes elementos:
- al menos una molécula terapéutica,
- un agente de imagen, y
- un anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 que interacciona de forma específica con receptores FOLH1,
donde las nanopartículas tienen un diámetro superior a 20 nm (por ejemplo, determinado por dispersión de luz dinámica, DLS), y más preferiblemente un diámetro de entre 20 y 500 nm.
En una realización particular, las nanopartículas presentan un diámetro de poro medio de entre 2 y 10 nm.
En la presente invención, se entiende por red covalente orgánica una nueva clase de materiales orgánicos porosos que presentan estructuras cristalinas en dos (2D) o tres (3D) dimensiones gracias a los enlaces covalentes que unen las diferentes unidades o monómeros orgánicos que forman dichas redes.
En una realización particular, el monómero orgánico que conforma la red covalente orgánica se selecciona de entre boronato, boroxina, borosilicato, borazina, imida, amida, hidrazona, amina, dioxina, triazina, imina, p-cetoenamina, azina, tiazol, oxazol, azodióxido, y un viologeno;
En otra realización particular adicional, el material poroso de las nanopartículas presenta estructura cristalina que corresponde a una red covalente orgánica seleccionada de entre los siguientes materiales: COF-5 (covalent organic framework 5), COF-10 (covalent organic framework 10), COF-42 (covalent organic framework 42), COF-43 (covalent organic framework 43), COF-66 (covalent organic framework 66), COF-117 (covalent organic framework 117), COF-118 (covalent organic framework 118), COF-336 (covalent organic framework 336), COF-367 (covalent organic framework 367), TPB-DMTP-COF (triphenylbenzene-dimethoxyterephaldehyde-covalent organic framework), HHTP-DPB-COF (2,3,6,7,10,11-hexahydroxytriphenylene- 4,4’-diphenylbutadiynebis(boronic acid)-covalent organic framework), TP-COF (triphenylene covalent organic framework), COF-S-SH (covalent organic framework sulfur derivative), NiPc-COF (nickel phthalocyanine-covalent organic framework), ZnPc-PPE-COF (zinc phthalocyanine-phenylbis(phenylethynyl)-covalent organic framework), [C 60 ]-ZnPc-COF ([C60]- zinc phthalocyanine-covalent organic framework), MC-COF-NiPc-E 1 E 7 (multiple component-covalent organic framework-nickel phthalocyanine-1,4-benzene diboronic acid-p-phenylenediamine), CuPc-FPBA-DETHz (2,3,9,10,16,17,23,24-octahydroxyphthalocyaninato-4-formylphenylboronic acid-2,5-diethoxyterephthalohydrazide), TPE-Ph-COF (tetraphenylethene-phenyl-covalent organic framework), Py-Azine-COF (pyrene-azine-covalent organic framework), TTF-Py-COF (tetrathiafulvalene-pyrene-covalent organic framework), ICOF-2 (ionic covalent organic framework 2), Star-COF (star-covalent organic framework), CCOF-2 (chiral covalent organic framework 2), y 3D-Py-COF (3D-pyrene-covalent organic framework).
En la presente invención se entiende por grupo amino un punto de unión covalente de ligandos orgánicos portadores de una molécula bioactiva, entendiéndose por molécula terapéutica, un agente de imagen o un anticuerpo monoclonal. Por su parte, el grupo metoxi reduce la repulsión electrónica en la estructura de la red covalente orgánica mediante un efecto de resonancia del anillo aromático, mejorando sustancialmente la cristalinidad del material y la estabilidad de las nanopartículas en medio fisiológico, retrasando o evitando su disolución.
En otra realización particular, la molécula terapéutica del sistema teranóstico se selecciona de entre al menos una molécula pequeña, una macromolécula, un anticuerpo, un péptido, una proteína, una enzima, un ácido nucleico, y un polímero orgánico. En el campo de la presente invención, se entiende por macromolécula cualquier molécula de origen biológico o sintético cuyo peso molecular es superior a 3.000 Da. Asimismo, se entiende por molécula pequeña cualquier molécula de origen biológico o sintético cuyo peso molecular es inferior a 3.000 Da. Además, el sistema de la presente invención puede contener uno o más tipos de moléculas terapéuticas.
En una realización particular adicional, la molécula terapéutica se une a las nanopartículas del sistema teranóstico mediante unión covalente o no-covalente.
En una realización particular adicional preferida, la molécula terapéutica es un agente antitumoral, seleccionado de entre camptotecina, doxorubicina, docetaxel, paclitaxel, y cabazitaxel, o una combinación de los mismos.
En una realización particular adicional aún más preferida, la molécula terapéutica se une a las nanopartículas del sistema teranóstico a través de un ligando orgánico o linker que facilita su unión covalente a un grupo amino terminal mediante un enlace bio-hidrolizable seleccionado de entre un éster, amida, carbamato o carbonato. Dicho ligando orgánico es una cadena hidrocarbonada no ramificada de longitud n, en cuyos extremos se disponen sendos grupos carboxilo, y donde n se refiere al número de carbonos de dicha cadena, que varía entre 1 y 4. De modo aún más preferido, la molécula terapéutica es docetaxel (DTX), y el ligando orgánico o linker es ácido succínico, que se une por un extremo al DTX en posición 2’-OH mediante enlace éster (Suc-DTX) y por el extremo opuesto a un grupo amino terminal mediante enlace amida. De esta forma, la liberación de la molécula terapéutica en el entorno intracelular y su actividad citotóxica depende de la acción de esterasas citoplasmáticas.
Entre las ventajas que presenta el sistema teranóstico de la invención se encuentra la mejora la biodisponibilidad de la molécula terapéutica, a la vez que se reducen sus interacciones con otras moléculas terapéuticas y con componentes del plasma sanguíneo. Igualmente, se reduce o elimina la respuesta inmune, se le protege del metabolismo, se modula la cinética de liberación, se aumenta el tiempo de residencia plasmática y la vida media, se reduce la toxicidad y los efectos secundarios asociados a su administración, se aumenta la eficacia, se normaliza su metabolismo en sujeto de diferentes especies y etnias y/o razas, y se promueve la difusión dirigida a tejidos y/o células específicas.
En el campo de la presente invención, la concentración de la molécula terapéutica puede oscilar entre el 0,1 y el 40% en peso, de manera más preferente entre el 3 y el 15% en peso cuando la molécula terapéutica es una molécula pequeña o una macromolécula.
En la presente invención se entiende por agente de imagen una sustancia que una vez introducida en el cuerpo es capaz de emitir una señal con el fin de resaltar o destacar el tejido u órgano que se desea examinar. Una vez dentro del organismo, un equipo de detección de dicho agente identificará las señales emitidas y creará imágenes con una gran precisión, dando lugar a la obtención de información más detallada.
En una realización preferida, el agente de imagen del sistema teranóstico se selecciona de entre un fluorocromo, un elemento paramagnético, y un radionúcleo.
En una realización particular adicional, el agente de imagen se une a las nanopartículas del sistema teranóstico mediante unión covalente.
En una realización particular adicional más preferida, el agente de imagen se une a las nanopartículas del sistema teranóstico a través de un ligando orgánico o linker que facilita su unión covalente a un grupo amino terminal mediante un enlace amida o carbamato.
En otra realización particular adicional, el agente de imagen del sistema teranóstico es un fluorocromo que se selecciona de entre fluoresceína, rodamina, cumarina, y cianina, o una combinación de las mismas. En el campo de la presente invención, la concentración del fluorocromo puede oscilar entre el 0,01 y el 10% en peso, de manera más preferente entre el 0,5 y el 2% en peso.
En otra realización particular adicional, el agente de imagen del sistema teranóstico es un elemento paramagnético que se selecciona de entre Gd (III), Fe (III), Mn (II), y 19F, o una combinación de los mismos. En el campo de la presente invención, la concentración del elemento paramagnético puede oscilar entre el 0,01 y el 10% en peso.
En otra realización particular adicional, el agente de imagen del sistema teranóstico es un radionúcleo seleccionado de entre un emisor p+ como 18F, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 99Tc, 177Lu, un emisor de electrones Auger, como 111In, 125I, un emisor a como 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac, y 227Th, o una combinación de los mismos. En el campo de la presente invención, la concentración del radionúcleo puede oscilar entre el 0,0001 y el 1% en peso.
En otra realización particular, el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 se selecciona de entre un anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 de origen sintético, semi-sintético, o natural.
En una realización particular adicional, el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 se une a las nanopartículas del sistema teranóstico mediante unión covalente.
A efectos de la presente invención, el término "anticuerpo" se refiere a moléculas de inmunoglobulinas, o a porciones inmunológicamente activas de moléculas de inmunoglobulinas, es decir, moléculas que contienen un sitio de fijación de antígeno que se une específicamente (inmunorreacciona) a la proteína FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L). Ejemplos de porciones de moléculas de inmunoglobulinas inmunológicamente activas incluyen fragmentos F(ab) y F(ab')2, los cuales pueden ser generados tratando el anticuerpo con una enzima tal como la pepsina, o recombinantemente.
A efectos de la presente invención, todos los números de acceso a la base de datos PROTEIN DATA BANK están actualizados a fecha de noviembre del año 2019.
En una realización preferida, el anticuerpo de la invención puede ser policlonal (incluye típicamente anticuerpos distintos dirigidos contra determinantes o epítopos distintos) o monoclonal (dirigido contra un único determinante en el antígeno). La expresión "anticuerpo monoclonal" alude a una población de moléculas de anticuerpos que contienen solamente una especie de un sitio de fijación de antígeno capaz de inmunorreaccionar con un epítopo particular del antígeno. El anticuerpo monoclonal puede ser alterado bioquímicamente, mediante manipulación genética, o puede ser sintético, careciendo, posiblemente, el anticuerpo en su totalidad o en partes, de porciones que no son necesarias para el reconocimiento del antígeno. En una realización preferida el anticuerpo, según se describe su uso en la presente invención, es preferiblemente un anticuerpo monoclonal.
El término "antígeno" a efectos de la presente invención se refiere a una región predeterminada al que el anticuerpo es capaz de unirse de manera selectiva. El antígeno puede ser un polipéptido, un carbohidrato, un ácido nucleico, un lípido, un hapteno u otra molécula natural o sintética. Preferiblemente, el antígeno es un polipéptido, más preferiblemente, el antígeno es la proteína FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L).
En otra realización preferida del anticuerpo monoclonal del sistema de la invención, éste se caracteriza porque puede ser un anticuerpo recombinante, humanizado, quimérico, sintético o una combinación de cualquiera de los anteriores. Un "anticuerpo recombinante" (rAC) es un anticuerpo que ha sido producido en una célula hospedadora transformada o transfectada con un polinucleótido que codifica para el péptido FOLH1, con un ácido nucleico codificante para el anticuerpo de la invención, o que produce el anticuerpo que se une específicamente a la proteína FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L)., o la proteína FOLH1, como resultado de la recombinación homóloga. Un “anticuerpo quimérico” es un anticuerpo en el que una región de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a las secuencias correspondientes en anticuerpos procedentes de una especie determinada o pertenecientes a una clase o subclase de anticuerpos determinados, mientras que la(s) cadena(s) restante(s) es(son) idéntica(s), u homóloga(s), a las secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de dichos anticuerpos, de manera que exhiban la actividad biológica deseada. Un “anticuerpo sintético”, es un anticuerpo que se genera usando la tecnología de ADN recombinante. Debería considerarse también que el término significa un anticuerpo que se ha generado mediante la síntesis de una molécula de ADN que codifica el anticuerpo y que dicha molécula de ADN expresa una proteína de anticuerpo, o una secuencia aminoacídica específica del anticuerpo, en el que la secuencia de ADN o aminoacídica se ha obtenido usando la tecnología de secuenciación de ADN o aminoácidos sintéticos que está disponible y es bien conocida en la materia.
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En una realización más preferida, cualquier anticuerpo monoclonal anti-FOLHI conocido en la técnica puede utilizarse en la presente invención. Más particularmente, el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L).se selecciona de la lista que consiste en: J591 (The Prostate 2014, 74, 1674-1690), J415 (The Prostate 2014, 74, 1674-1690), D2B (J. Nucí. Med. 2014, 55, 995-1001), 107-1A4 (NOVUS BIOLOGICALS), GCP-05 (INVITROGEN), 2G7 (The Prostate 2014, 74, 768­ 780), YPSMA-1 (ABCAM), YPSMA-2 (ANOGEN), GCP-02 (Neuroscience 2007, 144, 1361-1372), GCP-04 (NOVUS BIOLOGICALS), 3E6 (DAKO), 24.4E6 (The Prostate 2014, 74, 768-780), C803N (CREATIVE DIAGNOSTICS) y 7E11-C5.3 (J. Nucl. Med.
2003, 44, 610-617).
En una realización particular adicional más preferida, el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 se une a las nanopartículas del sistema teranóstico a través de un ligando orgánico que facilita su unión covalente (linker) a un grupo amino terminal mediante enlace amida o carbamato. Dicho ligando orgánico es una cadena hidrocarbonada no ramificada de longitud n, que contiene un grupo carboxilo en un extremo y un grupo amino en el otro, y donde n se refiere al número de carbonos de dicha cadena, que varía entre 7 y 13. En una realización preferida el ligando orgánico o linker se selecciona de entre ácido 10-aminododecanoico, ácido-9-aminononanoico, ácido 11-cloro-11-oxoundecanoico y ácido 11-aminoundecanoico; y de modo aún más preferido, el ligando orgánico o linker es ácido 11-aminoundecanoico, el cual se une por enlace covalente a un grupo amino terminal de la superficie de la nanopartícula, permitiendo separar la molécula directora (anticuerpo) a receptores FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L) de la molécula terapéutica, con el fin de evitar el posible impedimento estérico asociado a la proximidad de dos moléculas voluminosas. En el campo de la presente invención, la cantidad de anticuerpo ligado a las nanopartículas puede oscilar entre 0,0008 y 0,16 pmol/g.
En otra realización particular, el sistema teranóstico de la presente invención comprende nanopartículas cuya superficie se encuentra cubierta de grupos amino terminales, y una molécula de un poli(etilenglicol) (PEG) unida por enlace covalente a un grupo amino terminal de la nanopartícula. La molécula de PEG aumenta la solubilidad y estabilidad del material en medio acuoso, permitiendo la preparación de coloides estables a la vez que reduce las interacciones del sistema teranóstico con componentes del plasma sanguíneo, aumenta el tiempo de residencia plasmática, reduce o elimina la respuesta inmune, reduce la toxicidad y aumenta la eficacia, y promueve la difusión dirigida a tejidos y/o células específicas.
En una realización particular adicional, la molécula de PEG tiene un peso molecular de entre 200 y 5.000 Da. En el campo de la presente invención, la concentración del PEG puede oscilar entre el 0,05 y el 10% en peso, de manera más preferente entre el 0,5 y el 3% en peso.
Un segundo aspecto de la presente invención es el uso del sistema teranóstico definido anteriormente en una aplicación biotecnológica y que, en el campo de la presente invención, ese refiere al diagnóstico y/o tratamiento de aquellos tipos de cáncer en los que las células malignas desarrollan receptores de membrana tipo FOLH1 (próstata, mama, pulmón, colorrectal y riñón, entre otros), y que comprende poner en contacto una o más células “in vitro” con el sistema de la invención.
En una realización preferida, dicha aplicación biotecnológica es el diagnóstico y/o tratamiento del cáncer de próstata, mama, pulmón, colorrectal y riñón; y más preferiblemente el diagnóstico y/o tratamiento del cáncer de próstata. Por lo tanto, otro aspecto de la invención es el uso del sistema teranóstico de la invención en el diagnóstico y/o el tratamiento del adenocarcinoma de próstata.
Se ha comprobado que la mayoría de líneas celulares del adenocarcinoma de próstata desarrollan receptores específicos de membrana FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L) también llamado antígeno de membrana específico de próstata (PSMA), por ejemplo, pero sin limitar el campo de la presente invención: RWPE-1, PIN Cells, RWPE-2, LNCaP, LAPC-4, LAPC-9, VCaP, MDA PCa 2a/2b, LuCaP, C4-2, C4-2B, 22Rv1, ARCaP. Por tanto, la incorporación sobre la superficie de las nanopartículas de un anticuerpo que interaccione selectivamente con dichos receptores (anti-FOLH1), favorece la difusión selectiva del sistema teranóstico al interior de las células tumorales.
Un tercer aspecto de la presente invención, consiste en la administración del sistema teranóstico en forma de coloide estable mediante administración parenteral o intratumoral. De una manera preferente, la administración se lleva a cabo mediante inyección intratumoral sobre la glándula prostética. Dicha vía de administración limita sustancialmente la difusión del sistema teranóstico al resto del cuerpo.
Tanto la presencia del anticuerpo anti-FOLHI (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L) en el sistema teranóstico, como el protocolo de administración intratumoral minimizan la actividad del sistema sobre otros órganos y tejidos distintos de la próstata, evitando efectos indeseados, a la vez que se aumenta la concentración de forma local tanto de la molécula terapéutica como del agente de imagen.
Desde el punto de vista exclusivo de la quimioterapia, la actividad y la selectividad del sistema teranóstico administrado por vía intratumoral son máximas cuando el cáncer se encuentra en las fases T y N de la enfermedad, y disminuye su eficacia en la fase M.
En el campo de la presente invención, la concentración equivalente de la molécula terapéutica administrada al paciente con el sistema teranóstico por vía intratumoral, oscila entre 0,0001 mg/(kg h) y 10 mg/(kg h), durante 1 a 2000 h. Se entiende como concentración equivalente la cantidad necesaria de nanopartículas a las que está unida la molécula terapéutica que deben administrarse con el fin de incorporar la concentración del fármaco o principio activo establecida o de referencia.
En el campo de la presente invención, la concentración de nanopartículas del sistema teranóstico administrada al paciente en el tejido prostático varía entre 1 y 1000 pg/ml, y preferentemente entre 5 y 200 pg/ml.
En el campo de la presente invención la concentración equivalente de molécula terapéutica en el medio celular necesaria para provocar una acción citotóxica oscila entre 0,005 pg/ml y 200 pg/ml.
A lo largo de la descripción y las reivindicaciones la palabra "comprende" y sus variantes no pretenden excluir otras características técnicas, aditivos, componentes o pasos. Para los expertos en la materia, otros objetos, ventajas y características de la invención se desprenderán en parte de la descripción y en parte de la práctica de la invención. Los ejemplos que se proporcionan con a modo de ilustración, y no se pretende que sean limitativos de la presente invención.
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BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS FIGURAS
FIG. 1 es una ilustración esquemática de la secuencia de funcionalización de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos amino y metoxi terminales mediante anclaje covalente de la molécula terapéutica Suc-DTX, el agente de imagen [18F]FDG, la cadena espaciadora ácido 11-aminoundecanoico y el anticuerpo anti-FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L).
FIG. 2 es una ilustración esquemática de la secuencia de funcionalización de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos amino y metoxi terminales mediante anclaje covalente del agente de imagen rodamina B, la cadena espaciadora ácido 11-aminoundecanoico y el anticuerpo anti-FOLH1 (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L).
FIG. 3 Imagen obtenida en el microscopio electrónico de transmisión (TEM) mostrando la morfología de nanopartículas del material COF-25 del Ejemplo 3.
FIG. 4 Representación de los patrones de difracción de polvo obtenidos para nanopartículas de los materiales COF-0 (COF-5) y COF-25 obtenidos en el Ejemplo 3, y presentados en la Tabla 1.
FIG. 5 Curva de liberación de DTX a partir del sistema teranóstico del Ejemplo 4 en tampón fosfato salino (PBS, 1x, pH 7,4). Condiciones experimentales: T = 37 °C; agitación = 1500 rpm; concentración = 5 mg/ml.
EJEMPLOS
A continuación, se ilustrará la invención mediante unos ensayos realizados por los inventores, que pone de manifiesto la efectividad del producto de la invención.
Materiales
EJEMPLO 1: Síntesis de Suc-DTX
En un matraz de 50 ml con un imán agitador se introducen 200 mg de DTX (0,24 mmol, I), 50 mg de anhídrido succínico (0,500mmol) y 1 mg de 4-(dimetilamino)piridina (DMAP, 0,008 mmol). A continuación, se inyecta una mezcla anhidra de 12 ml (11:1) de diclorometano (DCM) y dimetilformamida (DMF). Se mantiene la disolución en agitación durante 24 h a temperatura ambiente y bajo atmósfera inerte. Transcurrido este tiempo se evapora el disolvente a vacío (50 torr), obteniéndose un sólido blanco, el cual se redisuelve en 30 ml de acetato de etilo. A continuación, la fase orgánica se lava con disolución acuosa de ácido clorhídrico (1%, w/v) (3 x 30 ml) y seguidamente, con agua ultrapura (3 x 30 ml). La fase orgánica se separa, se seca con sulfato de magnesio anhidro y se evapora el disolvente a vacío (50 torr), obteniéndose un sólido blanco. Dicho residuo blanco se disuelve en la mínima cantidad de disolvente y se purifica mediante una columna cromatográfica, utilizando DCM y metanol (100%^-96:4%, v/v) como fase móvil.
La fracción que contiene el producto deseado se evapora el disolvente a vacío (50 torr), y se obtienen 168 mg (75 %) de un sólido blanco (Suc-DTX, II).
1H-RMN (300 MHz, dmso-da) 0,97 (s, 6H); 1,38 (s, 9H); 1,51 (s, 3H); 1,68 (s, 3H); 2,23 (s, 3H); 2,51 (2H, debajo de la señal del disolvente); 2,61 (d, 2H, J=6,3 Hz); 3,61 (m, 2H); 4,03 (m, 3H); 4,44 (s, 1H); 5,00 (m, 5H); 5,39 (d, 1H); 5,77 (m, 1H); 7,19 (t, 1H); 7,39 (m, 4H); 7,69 (m, 3H); 7,87 (d, 1H); 7,98 (d, 2H); 12,83 (sa, 1H); 13C-RMN (75 MHz, dmso-da) 9,74; 13,64; 20,72; 22,43; 26,40; 28,47; 28,62; 28,72; 30,73; 34,90; 36,56; 42,82; 45,94; 51,32; 55,08; 56,92; 70,70; 71,04; 73,69; 74,76; 75,33; 76,77; 78,46; 80,25; 83,71; 127,42; 128,01; 128,50; 128,64; 129,52; 130,00; 133,34; 135,96; 136,75; 137,39; 155,16; 162,27; 165,24; 168,82; 169,50; 171,45; 172,55; 172,97; 209,28. Q-TOF MS (ESI, m/z) [M-Na]- calculada para C 47 H 57 NO 17 Na, 930,3524; encontrada 930,3502.
Esquema 1
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EJEMPLO 2: Síntesis del ácido 2-amino-5-metoxi-benceno-1,4-diborónico
Se disuelven 2,96 g (11,13 mmol) del 1,4-dibromo-5-metoxibenceno en tetrahidrofurano anhidro (100 ml) y se baja la temperatura de la mezcla a -78 °C. A continuación, se añaden 14,8 ml de n-BuLi (23,65 mmol, 1,6 M en hexano) gota a gota durante 30 minutos. Una vez adicionado el n-BuLi, se mantiene la agitación durante 5 horas con refrigeración. Transcurrido este tiempo se añaden 5,4 ml de borato de trimetilo (48,30 mmol) lentamente y se mantiene la agitación magnética de la mezcla a -78 °C. Se deja agitando toda la noche permitiendo que alcance temperatura ambiente. Transcurrido este tiempo se añade ácido acético y se agita durante 2 horas a temperatura ambiente. Se evapora el disolvente a vacío, se filtra la suspensión y se lava con agua. El compuesto se recristaliza en una mezcla agua/acetonitrilo (100 ml, 50:50 v/v), se filtra y el sólido obtenido se seca a vacío (8 torr) durante 24 horas. Se obtienen 1,02 g (47%) de ácido 5-metoxi-1,4-bencenodiborónico (MDMB).
30 ml de ácido nítrico al 90% se enfrían a 0 °C durante 15 minutos. A continuación, se añaden 100 mg de urea (1,67 mmol) y se baja la temperatura de la mezcla a -10 °C. Posteriormente, 5,91 g (30,1 mmol) del ácido 2-metoxi-1,4-bencenodiborónico (MBDB) se añade en pequeñas porciones con fuerte agitación durante 1 hora. Tras completar la adición del MBDB, se mantiene la agitación magnética de la mezcla a -10 °C durante 15 minutos más. Transcurrido este tiempo la disolución de color rojo oscuro se vierte sobre un baño de hielo que contiene una pequeña cantidad de agua. Se filtra la suspensión, se lava con agua, y el sólido obtenido se seca a vacío (8 torr) durante 24 horas. Se obtienen 4,36 g (60%) de un sólido amarillo (ácido 2-nitro-5-metoxi-1,4-bencenodiborónico (NO 2 -MBDB)).
1H-RMN (300 MHz, dmso-d6) 4,13 (s, 3H); 7,53 (s, 1H); 8,54 (s, 1H). 13C-RMN (75 MHz, dmso-d6) 56.2; 115,28; 124,80; 125,46; 135,40; 139,34; 168,48. Q-TOF MS (ESI, m/z) [M-H]- calculada para C 7 H 10 B 2 NO 7 , 241,05; encontrada 240,75.
En una segunda etapa de reacción, a una disolución de 570 mg de NO 2 -MBDB en una mezcla de 10 ml de metanol y 0,2 ml de ácido clorhídrico al 36,5%, se le añaden 150
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mg de paladio soportado sobre carbono (Pd/C, 10% wt Pd). Se lleva a cabo el tratamiento en un reactor de hidrogenación (H 2 , 10 bares) a temperatura ambiente y con agitación durante 1 hora. Transcurrido este tiempo se filtra la suspensión sobre Celita® para separar el paladio soportado sobre carbono. La fracción que contiene el producto deseado se evapora el disolvente a vacío (50 torr), y se obtienen 580 mg (99,4%) de un sólido blanco (ácido 2-amino-5-metoxi-1,4-bencenodiborónico (NMBB)).
1H-RMN (300 MHz, dmso-d6) 3.83 (s, 3H); 7,46 (s, 1H); 7,61 (s, 1H); 13C-RMN (75 MHz, dmso-d6) 56,24; 115,11; 116,35; 125,30; 128,03; 128,60; 143,60; 152,38. Q-TOF MS (ESI, m/z) [M-H]- calculada para C 7 H 12 B 2 NO 5 , 211,07; encontrada 210,76.
Esquema 2
Figure imgf000017_0001
EJEMPLO 3: Preparación de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos metoxi y amino terminales.
Para la síntesis de los derivados de COF-5 con grupos amino terminales se llevó a cabo la sustitución secuencial del MBDB por NMBB durante la condensación de la red covalente orgánica. El material obtenido se designa por la nomenclatura CF-x, donde x representa el grado de sustitución: porcentaje de NMBB sobre el total de ligando bicoordinado (MBDB NMBB).
Inicialmente, a una disolución de MBDB (221 mg, 1,128 mmol) y CH 3 OH (0,47 mL, 11.7 mmol) en 75 mL de una mezcla anhidra 1,4-dioxano:mesitileno (4:1 v/v) se le añaden 243 mg de HHTP (0,749 mmol). La suspensión resultante se somete a sonicación durante 1 minuto y se filtra (0.45 pm PTFE) para introducirlo en un tubo Schlenk. A continuación, se inyectan 187 ml de acetonitrilo anhidro y 112 ml más de la mezcla anhidra de 1,4-dioxano/mesitileno (4:1, v/v) para obtener nanopartículas con una concentración 2 mM del HHTP en un acetonitrilo 50% (v/v). La mezcla se purga con N 2 y se llevan a cabo 2 ciclos de N 2 /vacío para eliminar cualquier traza de humedad. La mezcla de reacción se deja con agitación magnética a 90 °C durante 20 horas. Transcurrido este tiempo se filtra la suspensión, se lava con tolueno anhidro, y el sólido obtenido se seca a vacío (8 torr) durante 24 horas. Se recogen 206 mg de nanopartículas del material poroso COF-25.
La sustitución secuencial del MBDB por NMBB condujo a la obtención de los diferentes materiales COF-x, cuya composición se resume en la Tabla 1.
En la Figura 3 se muestra una imagen de las nanopartículas del material COF-25 obtenido en este ejemplo. Asimismo, en la Figura 4 se muestra los difractogramas de rayos X de los materiales COF-0 (no incorpora grupos amino terminales) y COF-25 obtenidos en este ejemplo.
Tabla 1 Composición inicial utilizada para la preparación de nanopartículas del material COF-5 y derivados COF-x estables en medio fisiológico.
Relación molar Composición del gel de síntesis x
COF-x (MBDB: HHTP HHTP MBDB MBDB NMBB NMBB [%]
HHTP:NMBB) (mg) (mmol) (mg) (mmol) (mg) (mmol) COF-0 0 3,00 : 2 : 0,00 243 0,75 187 0,96 --- ---COF-25 25 2,53 : 2 : 0,86 243 0,75 186 0,95 68 0,32 COF-40 40 1,91 : 2 : 1,29 243 0,75 140 0,72 102 0,48 COF-60 57 1,54 : 2 : 2,06 243 0,75 113 0,58 163 0,77 COF-70 71 1,27 : 2 : 3,11 243 0,75 93 0,48 246 1,17 COF-80 78 1,04 : 2 : 3,71 243 0,75 76 0,39 293 1,39
EJEMPLO 4: Preparación de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos metoxi terminales y grupos amino terminales sobre los que se une Suc-DTX por enlace covalente.
Se secan (100 °C, vacío, 24 horas) 200 mg del material poroso COF-25 obtenido en el Ejemplo 3. A continuación se suspenden en 20 ml de DCM anhidro, se añaden 200 mg del profármaco Suc-DTX (0,22 mmol, preparado según el Ejemplo 1), 84 mg de
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hexafluorofosfato (V) de 1-óxido-3-(bis(dimetilamino)metilen)-3H-[1,2,3]triazolo[4,5-bipiri-dina (HATU, 0,22 mmol) y 115 pl de N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA, 0,66 mmol). La mezcla de reacción se deja agitando a temperatura ambiente bajo atmósfera de argón durante 48 h. Transcurrido ese tiempo se filtra la suspensión, se lava con DCM anhidro y el sólido gris obtenido se seca a vacío (8 torr) durante 24 horas. Se recogen 224 mg de nanopartículas del material poroso CF-25 cuya superficie está cubierta de grupos amina terminales a los que se unen moléculas de Suc-DTX por enlace amida (COF-25-DTX, Figura 1).
EJEMPLO 5: Preparación de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos metoxi terminales y grupos amino terminales sobre los que se une Suc-DTX y la molécula de un PEG por enlace covalente
Se secan (80 °C, vacío, 24 horas) 200 mg del material poroso COF-25-DTX obtenido en el Ejemplo 4, y se suspenden en 30 ml de DCM anhidro, y se añaden 250 pl de N,N'-diisopropiletilamina (DIPEA, 0,46 mmol) en atmósfera de argón. A continuación, se añade 150 mg de ácido 2,5,8,11-tetraoxatetradecan-14-oico succinimidil éster (PEG 3 ) y la mezcla se agita a temperatura ambiente durante 16 h. Tras eliminar el disolvente en rotavapor el sólido se re-dispersa mediante agitación en 100 ml de etanol. Esta suspensión se filtra y lava con etanol. Finalmente, el sólido se liofiliza (-55 °C, 16 h). Se recogen 268 mg de nanopartículas del material poroso COF-25-DTX@PEG cuya superficie está cubierta de grupos amina terminales a los que se unen moléculas de Suc-DTX y de PEG 3 por enlace amida.
EJEMPLO 6: Preparación de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos metoxi terminales y grupos amino terminales sobre los que se unen Suc-DTX, el linker ácido-11-aminoundecanoico y la molécula directora anti-FOLH1 (clon C803N, Creative Diagnostics; PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L) por enlace covalente.
Se secan (60 °C, vacío, 24 horas) 100 mg de nanopartículas de COF-25-DTX obtenido según el Ejemplo 4, y se suspenden en 10 ml de DCM anhidro. A continuación, se añaden 61 mg de ácido 11-aminoundecanoico (AU, 0,30 mmol), 114 mg de HATU (0,30 mmol) y 157 pl de DIPEA (0,90 mmol), y se deja agitando a
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temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón durante 48 horas. Transcurrido este tiempo se filtra la suspensión, se lava con DCM anhidro, y el sólido obtenido se seca a vacío (8 torr) durante 24 horas. Se obtienen 115 mg de nanopartículas del material poroso COF-25 cuya superficie está cubierta de grupos amina terminales a los que se unen, respectivamente, moléculas de Suc-DTX y ácido 11-aminoundecanoico por enlace amida (COF-25-DTX/AU, Figura 1).
10 pl del anticuerpo anti-FOLH1 (clon C803N, Creative Diagnostics, 5 mg/ml) se suspenden en 100 pl de buffer comercial ácido 2-(N-morfolino) etanosulfónico monohidratado (MES, 0,1 M, pH 6,0). A continuación, se añaden 100 pl de una disolución de N-(3-dimetilaminopropil)-N'-etilcarbodiimida (EDC, 8 mg/ml) y 100 pl de una disolución de N-hidroxisuccinimida (NHS, 20 mg/ml), y se deja agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transcurrido ese tiempo, 1 mg de nanopartículas de COF-25-DTX/AU obtenidas según paso anterior se dispersan en 1 ml de PBS (1x, pH 8,5) y se añaden sobre la disolución del anticuerpo preparada anteriormente. Se deja agitando durante 2 h a temperatura ambiente. Al final del período de reacción, la muestra se centrifuga (16100 g), se lava el residuo con PBS (1x, pH 7,4), se liofiliza a -55 °C durante 16 horas y se almacena a 4 °C hasta su utilización (COF-25-DTX/aFOLH1, Figura 1).
La cantidad de anticuerpo unido mediante enlace amida al grupo amino terminal de la cadena espaciadora AU se determina por el método de Bradford. En este ensayo la cantidad de proteína (anticuerpo) no conjugada a las partículas se cuantifica por espectrofotometría visible (A= 595 nm) mediante la unión que se establece entre un colorante (azul de Coomassie G-250) y la proteína de estudio.
EJEMPLO 7: Preparación de nanopartículas del material poroso COF-5 con grupos metoxi terminales y grupos amino terminales sobre los que se unen Suc-DTX, el agente de imagen [18F]FDG, el linker ácido-11-aminoundecanoico y la molécula directora anti-FOLH1 (clon C803N, Creative Diagnostics; (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L) por enlace covalente.
Una alícuota de [18F]-fluorodesoxiglucosa [18F]FDG recién obtenida (~3 mCi) se seca a 110 °C y vacío. Sobre la [18F]FDG seca se añade 1 ml de una suspensión en agua Milli
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Q® estéril de nanopartículas de COF-25-DTX/aFOLH1 (1 mg/ml) obtenidas en el Ejemplo 6. La suspensión resultante se agita a temperatura ambiente durante 15 min en ambiente estéril. Transcurrido este tiempo se centrifuga (16100 g) y se lava varias veces con agua Milli Q® estéril. La mezcla final contiene 1 mg/ml de COF-25-DTX/aFOLH1/[18F] en agua Milli Q® estéril y está lista para su administración intratumoral o parenteral.
EJEMPLO 8: Preparación de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos metoxi terminales y grupos amino terminales sobre los que se une el agente de imagen rodamina B por enlace covalente.
Se secan (100 °C, vacío, 24 horas) 200 mg del material poroso COF-25 obtenido en el Ejemplo 3. Posteriormente se suspende en 10 ml de DCM anhidro. A continuación, se añaden 3,0 mg de rodamina B (0,006 mmol), 11 mg de HATU (0,030 mmol) y 16 pl de DIPEA (0,090 mmol), y se deja agitando a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón durante 48 horas. Transcurrido este tiempo se filtra la suspensión, se lava con DCM anhidro, y el sólido obtenido se seca a vacío (8 torr) durante 24 horas. Se recogen 233 mg de nanopartículas del material poroso COF-25 cuya superficie está cubierta de grupos amina terminales a los que se unen moléculas de rodamina B por enlace amida (COF-25-RhB, Figura 2).
EJEMPLO 9: Preparación de nanopartículas del material poroso COF-25 con grupos metoxi terminales y grupos amino terminales sobre los que se unen el agente de imagen rodamina B, el linker ácido-11-aminoundecanoico y la molécula directora anti-FOLH1 (clon C803N, Creative Diagnostics; (PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L) por enlace covalente.
Se secan (60 °C, vacío, 24 horas) 100 mg de nanopartículas de COF-25-RhB obtenido según el Ejemplo 8, y se suspenden en 10 ml de DCM anhidro. A continuación, se añaden 61 mg de ácido 11-aminoundecanoico (AU, 0,30 mmol), 114 mg de HATU (0,30 mmol) y 157 pl de DIPEA (0,90 mmol), y se deja agitando a temperatura ambiente y bajo atmósfera de argón durante 48 horas. Transcurrido este tiempo se filtra la suspensión, se lava con DCM anhidro, y el sólido obtenido se seca a vacío (8 torr) durante 24 horas. Se obtienen 112 mg de nanopartículas del material poroso COF-25 cuya superficie está cubierta de grupos amina terminales a los que se unen, respectivamente, moléculas de rodamina B y ácido 11-aminoundecanoico por enlace amida (COF-25-RhB/AU, Figura 2).
10 pl del anticuerpo anti-FOLH1 (clon C803N, Creative Diagnostics, 5 mg/ml) se suspenden en 100 pl de MES (0,1 M, pH 6,0). A continuación, se añaden 100 pl de una disolución de EDC (8 mg/ml) y 100 pl de una disolución de NHS (20 mg/ml), y se deja agitando a temperatura ambiente durante 30 minutos. Transcurrido ese tiempo, 1 mg de nanopartículas de COF-25-RhB/AU obtenidas según paso anterior se dispersan en 1 ml de PBS (1x, pH 8,5) y se añaden sobre la disolución del anticuerpo preparada anteriormente. Se deja agitando durante 2 h a temperatura ambiente. Al final del período de reacción, la muestra se centrifuga (16100 g), se lava el residuo con PBS (1x, pH 7,4), se liofiliza a -55 °C durante 16 horas y se almacena a 4 °C hasta su utilización (COF-25-RhB/aFOLH1, Figura 2).
EJEMPLO 10: Liberación de DTX en tampón fosfato salino.
Se prepara una suspensión de 5 mg/ml de nanopartículas obtenidas según el Ejemplo 4 en 1 ml de PBS en tubo eppendorf de 2 ml y se incuba a 37 °C durante los diferentes tiempos establecidos. Las muestras incubadas a los distintos tiempos se centrifugan, se lava el residuo con metanol (2 x 1 ml) y se liofiliza el sobrenadante a -55 °C durante 24 h. El residuo obtenido se reconstituye con 1 ml de una disolución metanol. 5 pl de dicha disolución se inyectan en un equipo de HPLC. Se integra el área del pico del DTX y se compara con una curva de calibrado. Todas las medidas se hicieron por triplicado, calculando la media ± desviación estándar (DS) en cada caso.
Se comprueba que el material presenta una gran estabilidad en PBS, con una liberación en torno al 10% de la carga total en la primera hora de incubación, caracterizada como una mezcla de DTX libre y Suc-DTX (aproximadamente un 20% del total). Esta liberación inicial se relaciona con moléculas del profármaco adsorbidas en el interior de los poros. Posteriormente, la liberación de DTX es escasa hasta al menos 6 h de exposición (15% de la carga total).
En la Figura 5 se muestra la curva de liberación en PBS de DTX a partir del sistema teranóstico COF-25-DTX.
EJEMPLO 11: Determinación de la IC50 mediante ensayo MTT
La actividad citotóxica in vitro del sistema teranóstico se determinó mediante el test del bromuro de 3-[4,5-dimetiltiazol-2-il]-2,5-difeniltetrazolio (MTT). En estos ensayos la proliferación de las células vivas se determina vía la actividad de deshidrogenasa mitocondrial: las mitocondrias viables reducen el MTT generando cristales de MTT-formazán cuantificables por espectrofotometría visible.
Para estos ensayos se utilizó dos tipos de líneas celulares de adenocarcinoma de próstata humano: LNCaP (con receptores de membrana FOLH1, PROTEIN DATA BANK ID FOLH1: 1Z8L) y PC3 (sin receptores FOLH1).
Las células se siembran en placas de 96 pocillos a razón de 10.000 células/pocillo en ambos casos, 24 h antes de incorporar las nanopartículas. Se preparan alícuotas de 3 mg mL-1 de DTX en DMSO y se mantienen a -20 °C. Cuando sea necesario se descongela una alícuota, y se preparan alícuotas de trabajo (100 |jg/ml por dilución en medio RPMI enriquecido). Alternativamente, se preparan alícuotas de 100 jg/m l de DTX en medio RPMI enriquecido y se mantienen a -20 °C hasta necesario.
Se prepara una suspensión de nanopartículas obtenidas según el Ejemplo 4 en medio RPMI enriquecido con 10% de suero bovino fetal y con 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C, en atmósfera húmeda de aire (95%) y CO 2 (5%), con una concentración equivalente de 100 jg/mL de DTX y se trata con ultrasonidos para mejorar la dispersión de las nanopartículas. La suspensión se reparte en alícuotas que se mantienen -20 °C hasta necesario.
Alternativamente, se prepara una suspensión de nanopartículas obtenidas según el Ejemplo 6 en medio RPMI enriquecido con 10% de suero bovino fetal y con 1% de penicilina/estreptomicina a 37 °C, en atmósfera húmeda de aire (95%) y CO 2 (5%), con una concentración equivalente de 100 jg/mL de DTX y se trata con ultrasonidos en idénticas condiciones.
Las células se tratan con DTX o con nanopartículas obtenidas según el Ejemplo 4, en un rango de dosis de DTX entre 0,005 jg/ml y 100 jg/m l durante 72 horas.
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Alternativamente, las células se tratan con nanopartículas obtenidas según el Ejemplo 6 durante 72 horas. Al final del periodo de incubación se añaden 10 pl a cada pocillo (5 mg/ml) de la disolución de MTT y 4 horas más tarde se disuelven los cristales de formazán con isopropanol, y se mide la absorbancia a 570 nm. Se determina el porcentaje de supervivencia celular relativo a las células no tratadas y se calcula los valores de IC 50 a partir de la curva concentración DTX-(%) células vivas. Los valores de IC 50 se listan en la Tabla 2.
Tabla 2. Valores de IC 50 (media ± DS, en pg/ml) para DTX libre, COF-25-DTX del Ejemplo 4 y COF-25-DTX/aFOLH1 del Ejemplo 6 en células PC3 y LNCaP (n = número de experimentos).
Línea celular DTX COF-25-DTX COF-25-DTX/aFOLH1 n LNCaP 0,80 ± 0,20 0,14 ± 0,02 0,02 ± 0,01 3 PC3 - - - 3

Claims (38)

REIVINDICACIONES
1. Un sistema teranóstico que comprende nanopartículas de un material poroso caracterizadas por que dicho material poroso presenta una estructura cristalina que corresponde a una red covalente orgánica a la que se unen a través de grupos amino terminales presentes en su estructura los siguientes elementos:
- al menos una molécula terapéutica,
- un agente de imagen, y
- un anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 que interacciona de forma específica con receptores FOLH1,
donde las nanopartículas tienen un diámetro superior a 20 nm.
2. El sistema teranóstico según la reivindicación 1, caracterizado por que las nanopartículas tienen un diámetro comprendido entre 20 y 500 nm.
3. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que las nanopartículas presentan un diámetro de poro de entre 2 y 10 nm.
4. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la red covalente orgánica está conformada por monómeros orgánicos que se seleccionan de entre boronato, boroxina, borosilicato, borazina, imida, amida, hidrazona, amina, dioxina, triazina, imina, p-cetoenamina, azina, tiazol, oxazol, azodióxido, y un viologeno.
5. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el material poroso de las nanopartículas presenta estructura cristalina que se seleccionada de entre COF-5, COF-10, COF-42, COF-43, COF-66, COF-117, COF-118, COF-336, COF-367, , TPB-DMTP-COF, HHTP-DPB-COF, TP-COF, COF-S-SH, NiPc-COF, ZnPC-PPE-COF, [C 60 ]-ZnPc-COF, MC-COF-NiPc-E^r, CuPc-FPBA-DETHz, TPE-Ph-COF, Py-Azine-COF, TTF-Py-COF, ICOF-2, Star-COF, CCOF-2 y 3D-Py-COF.
6. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores,
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caracterizado por que la estructura presenta además grupos metoxi terminales.
7. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la molécula terapéutica se selecciona de entre una molécula pequeña de origen biológico o sintético cuyo peso molecular es inferior a 3.000 Da, una macromolécula, un anticuerpo, un péptido, una proteína, una enzima, un ácido nucleico o un polímero orgánico.
8. El sistema teranóstico según la reivindicación 7, caracterizado por que la molécula terapéutica pequeña es un agente antitumoral, seleccionado de entre camptotecina, doxorubicina, docetaxel, paclitaxel, y cabazitaxel, o una combinación de estos.
9. El sistema teranóstico según la reivindicación 8, caracterizado porque la concentración de la molécula terapéutica puede oscilar entre el 0,1 y el 40% en peso.
10. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones 8-9, caracterizado por que la molécula terapéutica se une a las nanopartículas mediante unión covalente.
11. El sistema teranóstico según la reivindicación 10, caracterizado por que la molécula terapéutica se une a las nanopartículas a través de un linker que facilita su unión covalente al grupo amino terminal mediante un enlace bio-hidrolizable seleccionado de entre un éster, amida, carbamato o carbonato.
12. El sistema teranóstico según la reivindicación 11, caracterizado por que la molécula terapéutica es docetaxel (DTX), y el linker es ácido succínico.
13. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el agente de imagen se selecciona de entre un fluorocromo, un elemento paramagnético, y un radionúcleo.
14. El sistema teranóstico según la reivindicación 13, caracterizado por que el agente de imagen se une a las nanopartículas mediante unión covalente.
15. El sistema teranóstico según la reivindicación 14, caracterizado por que el agente de imagen se une a las nanopartículas a través de un linker que facilita su unión covalente a un grupo amino terminal mediante un enlace amida o carbamato.
16. El sistema teranóstico según la reivindicación 13, caracterizado por que el fluorocromo se seleccionado de entre una fluoresceína, rodamina, cumarina, y cianina, o una combinación de estas.
17. El sistema teranóstico según la reivindicación 16, caracterizado por que la concentración del fluorocromo puede oscilar entre el 0,01 y el 10% en peso.
18. El sistema teranóstico según la reivindicación 13, caracterizado por que el elemento paramagnético se selecciona de entre Gd (III), Fe (III), Mn (II), y 19F, o una combinación de los mismos.
19. El sistema teranóstico según la reivindicación 18, caracterizado por que la concentración del elemento paramagnético puede oscilar entre el 0,01 y el 10 % en peso.
20. El sistema teranóstico según la reivindicación 13, caracterizado por que el radionúcleo se selecciona de entre un emisor p como 18F, 64Cu, 68Ga, 89Zr, 99Tc, 177Lu, un emisor de electrones Auger, como 111In, 125I, un emisor a como 211At, 212Bi, 213Bi, 225Ac, y 227Th o una combinación de los mismos.
21. El sistema teranóstico según la reivindicación 20, caracterizado por que la concentración del radionúcleo puede oscilar entre el 0,0001 y el 1 % en peso.
22. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 se selecciona de entre un anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 de origen sintético, semi-sintético o natural.
23. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 se selecciona de la lista que consiste en: J591, J415, D2B, 107-1A4, GCP-05, 2G7, YPSMA-1, YPSMA-2, GCP-02, GCP-04, 3E6, 24.4E6, clon C803N y 7E11-C5.3.
24. El sistema teranóstico según la reivindicación 22, caracterizado por que el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 se une a las nanopartículas mediante unión covalente.
25. El sistema teranóstico según la reivindicación 24, caracterizado por que el anticuerpo monoclonal anti-FOLH1 se une a las nanopartículas a través de un linker mediante enlace amida o carbamato.
26. El sistema teranóstico según la reivindicación 25, caracterizado por que el linker se selecciona de entre ácido 10-aminododecanoico, ácido-9-aminononanoico, ácido 11-cloro-11-oxoundecanoico y ácido 11-aminoundecanoico.
27. El sistema teranóstico según la reivindicación 26, caracterizado por que el linker es ácido 11-aminoundecanoico.
28. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones 22 a 27, caracterizado por que la cantidad de anticuerpo ligado a las nanopartículas puede oscilar entre 0,0008 y 0,16 pmol/g.
29. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que comprende además una molécula de un PEG unida a la nanopartícula por enlace covalente a un grupo amino terminal.
30. El sistema teranóstico según la reivindicación 29, caracterizado por que la molécula de PEG tiene un peso molecular entre 200 y 5.000 Da.
31. El sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones 29 a 30, caracterizado por que la concentración del PEG puede oscilar entre el 0,05 y el 10% en peso.
32. Sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones anteriores para su uso como medicamento.
33. Sistema teranóstico según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 31, para su uso en el tratamiento del cáncer de próstata, mama, pulmón, colorrectal y riñón.
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34. Sistema teranóstico para su uso según la reivindicación 33 donde el cáncer de próstata es un adenocarcinoma de próstata.
35. Sistema teranóstico para su uso según la reivindicación 33 o 34, caracterizado por que la vía de administración se selecciona de entre intratumoral o parenteral.
36. Sistema teranóstico para su uso según la reivindicación 35, caracterizado por que la vía de administración se realiza mediante inyección intratumoral sobre la glándula prostática.
37. Sistema teranóstico para su uso según la reivindicación 35, caracterizado por que la concentración equivalente de la molécula terapéutica administrada al paciente por vía intratumoral oscila entre 0,0001 mg/(kg h) y 10 mg/(kg h), durante 1 a 2000 h.
38. Sistema teranóstico para su uso según la reivindicación 34, caracterizado por que la concentración de nanopartículas administrada al paciente en el tejido prostático varía entre 1 y 1000 pg/ml, y preferentemente entre 5 y 200 pg/ml.
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