CN114182358A - 一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列、制备方法及用途 - Google Patents

一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列、制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列、制备方法及用途，抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列由色氨酸‑苯丙氨酸二肽自组装形成，为分散排布的阵列，阵列中的颗粒为球形颗粒，且球形颗粒上负载有抗tau蛋白。本发明中制作了一种新型的荧光多肽纳米颗粒阵列，且用于测定血清中的tau蛋白。

Description

一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列、制备方法及用途
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列、制备方法及用途。
背景技术
随着世界人口老龄化，阿尔兹海默病(AD)的发病率急剧上升，这种中枢神经系统变性病严重危及老年人的健康。AD的发病率越来越高，但目前AD诊断方法的敏感性和特异性仍然远远不够可靠。相比基于脑脊液的AD诊断方法，基于血液的诊断方法更为可靠，因为其对病人的危害更小、易于获取且成本低。血液中含有大量AD生物标志物，适合于50岁以上患者的临床前人群筛查。虽然使用基于血液的生物标记物诊断AD具有重要意义，但目前尚无可靠的基于血液的诊断方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列、制备方法及用途，制作了一种新型的荧光多肽纳米颗粒阵列，且用于测定血清中的tau蛋白
本发明采用以下技术方案：一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列，由色氨酸-苯丙氨酸二肽自组装形成，为分散排布的阵列，阵列中的颗粒为球形颗粒，且球形颗粒上负载有抗tau蛋白。
进一步地，该纳米颗粒的粒径为15-25nm。
本发明还公开了上述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下：
步骤一、制备色氨酸-苯丙氨酸二肽；
步骤二、将浓度含量为(0.5-2)mg/mL，pH值为9-11的色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液通入芯片板体中的一微流进口通道中，流入微反应腔室内，在60-85℃条件下自组装合成多肽纳米颗粒阵列，多余的色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液由多余的微流出口通道流出；
芯片板体为二维板体，板体内设置有一微反应腔室，板体上还成对开设有多个微流进口通道和微流出口通道，各微流进口通道和微流出口通道的内端均与微反应腔室相连通，各微流进口通道和微流出口通道的外端均与外界相连通；
步骤三、在步骤二中的多肽纳米颗粒阵列上负载抗tau蛋白，即得抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列。
进一步地，在步骤三中，将抗tau蛋白溶液通入另一微流进口通道中，抗tau蛋白溶液在反应腔室内与多肽纳米颗粒阵列作用，抗tau蛋白负载于多肽纳米颗粒。
本发明还公开了上述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的用途，用于测定血清中的tau蛋白。
本发明的有益效果是：本发明设计并制作了一种新型的荧光多肽纳米颗粒阵列，通过与人血清中tau蛋白靶向结合，检测荧光强度、杨氏模量和聚集水平，用于诊断和监测AD的进展。
附图说明
图1为抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的形貌图。
图2为抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列与10和100ng/ml合成tau蛋白结合前后的固态荧光发射光谱。
图3为抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列与10和100ng/ml合成tau蛋白结合前后的杨氏模量。
图4为经合成tau蛋白处理的抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列的AFM图像。
图5为抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列与健康人和AD患者血清中tau蛋白结合前后的固态荧光发射光谱。
图6为抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列与健康人和AD患者血清中tau蛋白结合前后的杨氏模量。
图7为用健康人和AD患者血清中的tau蛋白处理荧光多肽纳米颗粒阵列的AFM图像。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
本发明公开了一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列，由色氨酸-苯丙氨酸二肽自组装形成，为分散排布的阵列，阵列中的颗粒为球形颗粒，且球形颗粒上负载有抗tau蛋白。纳米颗粒的粒径为15-25nm。如图1所示，抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的形貌图，由图中可知，纳米颗粒为球形颗粒，阵列成分散排布的阵列。图1中，是采用1mg/mL色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液自组装合成的荧光多肽纳米颗粒阵列。
本发明还公开了上述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的制备方法，该制备方法包括如下：
步骤一、制备色氨酸-苯丙氨酸二肽；使用ABI 433A多肽合成器合成线性多二肽，利用HPLC-MS纯化和收集二肽肽。
步骤二、将浓度含量为(0.5-2)mg/mL，pH值为9-11的色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液通入芯片板体中的一微流进口通道中，流入微反应腔室内，在60-85℃条件下自组装合成多肽纳米颗粒阵列，多余的色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液由多余的微流出口通道流出；具体地，持续通入色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液20-30分钟。
所述芯片板体为二维板体，板体内设置有一微反应腔室，板体上还成对开设有多个微流进口通道和微流出口通道，各所述微流进口通道和微流出口通道的内端均与微反应腔室相连通，各所述微流进口通道和微流出口通道的外端均与外界相连通，用于连接外界的溶液及控制设备。
上述芯片板体是通过软光刻技术，将所需图案转移到一个PDMS基板上制备的。芯片阵列的设计就绪，它被发送到具有阵列设计的转移图案的光掩模制造。基于掩模，阵列的模具将通过光刻制作。树脂以所需厚度(1-3mm)摊铺在硅片上。将PDMS和交联剂的混合物倒入模具中并放置在炉中。PDMS硬化后，可以将其从模具上取下。最后，对带有微通道的PDMS块的表面和玻璃载玻片表面进行等离子体处理，以粘合和闭合芯片。
对于tau蛋白靶向，用抗tau抗体修饰荧光多肽纳米颗粒阵列，以在芯片上检测tau蛋白。具体如步骤三：
步骤三、在所述步骤二中的多肽纳米颗粒阵列上负载抗tau蛋白，即得抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列。在所述步骤三中，具体操作如下：将浓度为10μg/mL的抗tau蛋白溶液通入另一微流进口通道中，抗tau蛋白溶液在所述反应腔室内与多肽纳米颗粒阵列作用，抗tau蛋白负载于多肽纳米颗粒。
更具体地，使用1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)催化剂，通过羧基封端肽纳米粒和胺封端抗tau抗体的偶联合成荧光多肽纳米颗粒/抗体偶联物。
为了激活羧基，用EDC和NHS处理荧光多肽纳米颗粒阵列(f-PNP)，反应约25分钟。将混合物以5000rpm离心30分钟，并溶解在去离子水中。在活化荧光多肽纳米颗粒的羧基后，在室温下过夜后，将10μg/mL的抗tau蛋白溶液以1mL/min的流速流过荧光多肽纳米颗粒阵列1分钟，并用磷酸盐缓冲盐水(PBS)冲洗多余的无界抗体，即得到了抗tau蛋白负载于多肽纳米颗粒。
本发明还公开了上述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的用途，用于测定血清中的tau蛋白。
实施例中使用的血清，是从32名54至83岁的受试者中获得，其中，8名健康者；8名轻度AD者；8名中度AD者；8名重度AD者；均基于临床诊断信息。均采集10毫升的血样，并让其在室温下垂直凝结30分钟。将血清样品在室温下1300g离心10分钟，将上清液等分加入2ml塑料聚丙烯螺旋盖管中，并在-80°C下冷冻以储存和进一步研究。
为了验证抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列与tau蛋白存在相互作用，进行如下验证，使用Varian Cary Eclipse荧光分光光度计在氙弧灯的激发下记录抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列的固态荧光光谱，如图2所示，抗tau荧光多肽纳米颗粒1分钟后在约420nm处出现荧光发射峰。控制浓度为10和100ng/mL的tau蛋白流过抗tau荧光多肽纳米颗粒进行靶向结合，并在室温下干燥，室温指的是25℃。当与10ng/ml tau蛋白结合后，抗tau荧光多肽纳米颗粒的荧光强度降低。当与100ng/mL tau蛋白结合后，抗tau荧光多肽纳米颗粒的荧光强度下降更多。抗tau荧光多肽纳米颗粒与tau蛋白的相互作用可以改变f-PNPs的荧光集团并使其荧光猝灭。荧光强度的降低表明抗tau荧光多肽纳米颗粒与tau蛋白之间存在相互作用。
本实施例纳米颗粒阵列是采用浓度为1mg/mL色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液自组装形成的荧光多肽纳米颗粒阵列。
验证纳米颗粒阵列的杨氏模量，纳米颗粒阵列的杨氏模量通过AFM纳米压痕进行纳米力学表征。当悬臂梁尖端接触纳米颗粒阵列时，纳米颗粒阵列和尖端之间的相互作用产生一条力曲线。根据该曲线，内置软件使用斜率计算并使用赫兹理论量化样品的刚度。如图3所示，抗tau荧光多肽纳米颗粒的杨氏模量约为200MPa，用浓度为10ng/mL和100ng/mL的tau蛋白处理的f-PNP具有约60MPa的相似值。。
使用MFP-3D AFM系统和ACTA-50探针对抗tau荧光多肽纳米颗粒的纳米形态聚集水平进行测试。tau蛋白聚集体的制备在含有100mM Na-Pipes、1mM EGTA、1mM MgSO4和1mMDTT的缓冲液中进行。为了诱导聚集体的形成，将固定浓度的重组人tau蛋白(10–20μM)与相同浓度的紫杉醇在37℃下孵育30分钟。通过离心从沉淀中获得tau蛋白聚集体。如图4所示，抗tau荧光多肽纳米颗粒为10nm的单层球形纳米颗粒，与不同浓度的tau蛋白相互作用后，抗tau荧光多肽纳米颗粒的聚集水平发生变化，从左到右随着tau蛋白浓度的增加，抗tau荧光多肽纳米颗粒的聚集水平逐渐增大。
使用Varian Cary Eclipse荧光分光光度计在氙弧灯的激发下记录抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列与不同来源血清反应后的固态荧光光谱，将抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列分别与来自AD患者和健康人的血清样本相互作用，并在室温下干燥。如图5所示，与健康人血清样本处理的抗tau荧光多肽纳米颗粒在约420nm处出现荧光强度最高荧光发射峰，与轻度到中度到重度患者血清样本处理的抗tau荧光多肽纳米颗粒荧光强度依次降低。强度降低是由于血清样本中检测到的tau蛋白聚集体数量增加。因此，结果证实，随着疾病严重程度从健康到严重AD患者的增加，血清中tau蛋白聚集体的浓度增加。
抗tau荧光多肽纳米颗粒与不同来源血清反应后的杨氏模量通过AFM纳米压痕进行纳米力学表征，如图6所示，与AD患者相比，抗tau荧光多肽纳米颗粒与健康人血清样品相互作用后的杨氏模量最低，仅为14MPa左右。抗tau荧光多肽纳米颗粒结合tau蛋白的杨氏模量随着疾病严重程度从轻度(38MPa)到中度(50MPa)到重度(65MPa)AD患者的增加而增加。tau蛋白聚集体硬度的增加是tau蛋白结构发生内部变化的结果。通常认为异常翻译后修饰，即过度磷酸化、乙酰化、糖基化、硝化和截断是AD中tau结构改变的原因。
使用MFP-3D AFM系统和ACTA-50探针对抗tau荧光多肽纳米颗粒与不同来源血清反应后的纳米形态聚集水平进行测试，将抗tau荧光多肽纳米颗粒阵列分别与健康人和不同阶段的AD患者血清中的tau蛋白聚集体相互作用后，抗tau荧光多肽纳米颗粒的聚集水平不同。如图6所示，与健康人相比，AFM图像显示AD患者抗tau荧光多肽纳米颗粒结合tau蛋白聚集体的聚集水平增加。此外，随着患者病情的加重，从轻度到中度到重度，血清中tau蛋白的聚集水平也不断增加。这些结果与上述荧光和杨氏模量观察结果一致，即tau蛋白聚集体的结构或聚集水平不同于健康人和不同阶段的AD患者，可用于诊断和监测AD的进展。

Claims (5)

1.一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列，其特征在于，由色氨酸-苯丙氨酸二肽自组装形成，为分散排布的阵列，阵列中的颗粒为球形颗粒，且球形颗粒上负载有抗tau蛋白。
2.如权利要求1所述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列，其特征在于，所述纳米颗粒的粒径为15-25nm。
3.根据权利1或2所述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的制备方法，其特征在于，该制备方法包括如下：
步骤一、制备色氨酸-苯丙氨酸二肽；
步骤二、将浓度含量为(0.5-2)mg/mL，pH值为9-11的色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液通入芯片板体中的一微流进口通道中，流入微反应腔室内，在60-85℃条件下自组装合成多肽纳米颗粒阵列，多余的色氨酸-苯丙氨酸二肽溶液由多余的微流出口通道流出；
所述芯片板体为二维板体，板体内设置有一微反应腔室，板体上还成对开设有多个微流进口通道和微流出口通道，各所述微流进口通道和微流出口通道的内端均与微反应腔室相连通，各所述微流进口通道和微流出口通道的外端均与外界相连通；
步骤三、在所述步骤二中的多肽纳米颗粒阵列上负载抗tau蛋白，即得抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列。
4.如权利要求3所述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的制备方法，其特征在于，在所述步骤三中，将抗tau蛋白溶液通入另一微流进口通道中，抗tau蛋白溶液在所述反应腔室内与多肽纳米颗粒阵列作用，抗tau蛋白负载于多肽纳米颗粒。
5.如权利要求1或2所述的一种抗tau蛋白荧光多肽纳米颗粒阵列的用途，其特征在于，用于测定血清中的tau蛋白。
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