CN105259350B - 基于量子点多级检测标记物传感器及其制备方法 - Google Patents

基于量子点多级检测标记物传感器及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种基于量子点的多级检测自身免疫疾病生物标记物传感器及其制备方法，该传感器利用不同发射峰的CdTe‑ZnS核壳量子点同抗原结合，形成携带多种光信号的QDs‑Ag复合物，负载于硅烷化玻璃基底，通过抗原同生物标记物间的免疫识别对目标物进行检测，并进一步通过二抗‑DNA‑Au NPs 复合物的连接，在QDs同Au NPs 间形成荧光共振能量转移，产生光学信号的变化。CdTe‑ZnS 核壳量子点利用水热法合成，二抗‑DNA‑Au NPs 复合物由生物交联方法获得。本发明通过量子点宽激发，窄发射的荧光性质可以完成自身免疫疾病生物标记物的多级检测。

Description

基于量子点多级检测标记物传感器及其制备方法
技术领域
本发明属于纳米材料制备和免疫组化技术交叉领域，涉及一种传感器及其制作方法尤其是一种量子点结合免疫探针检测自身免疫病生物标记物的光学传感器及其制备方法，应用于检测和监控自身免疫疾病技术领域。
背景技术
量子点与传统的突光染料相比,具有以下优点：(1)光稳定性好、耐漂白、荧光强度约为罗丹明6G的20倍，稳定性约为它的100倍；(2)激发光谱范围宽并且可以实现多组分同时激发；(3)发射光谱半峰宽比较窄、峰形尖锐、对称性好及发光光谱可调性,可调波长范围为400-2000mn，覆盖了紫外到近红外区域；(4)荧光寿命较长；(5)颜色具有多样性，不同粒径的量子点颜色也不同；(6)检测便利性,对检测仪器的要求不是很高；(7)量子产率高、斯托克位移较大等。因此量子点广泛应用在生物传感、突光探针标记及检测、分子诊断、靶向治疗、生物成像和生物分析等方面。
生物传感利用量子点作为一个平台，根据调节量子点的荧光强度(而不是改变量子点的数量)为组装生物探针提供一种信号转换。虽然人们对CT传感越来越有兴趣，但是调整量子点荧光强度最常见也许是最具特色的机制仍是荧光共振能量转移，量子点是突光共振能量转移理想的供体，当遇到合适的供体时也能变成极好的受体。因此，量子点在FRET传感器方面获得了极大的发展。
自从1998年《Science》上报道了可将生物大分子偶联到量子点的表面之后，科学研究者对量子点标记生物分子越来越感兴趣。最近十年这个领域的研究更集中于低毒性，高生物亲和性的量子点的合成及生物医学应用。
19世纪末，大多数学者认为，免疫现象只是机体对外界传染因子的入侵而发生的防御反应，而对人体自身组织成分不产生抗体，称之为免疫耐受。随着科学发展，科学家发现有一类疾病是由于机体对自身抗原的耐受失去时，免疫系统对自身抗原发起攻击进而引起组织或器官造成的损害，这类疾病被称为自身免疫病。抗原性质变异、交叉免疫反应、遗传因素和病毒因素都会引起机体的自身抗原耐受失去。
对于自身免疫病的国际通用诊断标准主要依靠临床症状及实验室对血清中自身抗体抗原的评估，尤其是通过患者血清内的一种或几种生物标记物水平表征。生物标志物可用来反映自身免疫病的发病机制，并用于疾病的诊断、监测、分层和预测个人对治疗的反应。长期以来，抗dsDNA抗体、补体活性和免疫复合物等免疫学指标是自身免疫病活动性的经典标志。随着技术的进步和研究的深入，大量新相关生物标志物出现。
生物芯片、蛋白微阵列技术是20世纪末期产生的高通量平行检测技术，它一经产生就显示了极大的优势，寡核苷酸微阵列已经在基因表达和人类疾病的研究中取得了广泛的成果。而蛋白质微阵列近年来也发展迅速.已经应用于TORCH感染病原体和过敏原的检测。目前，自身抗体抗原及其类似物的检测手段主要是western blotting和ELISA(酶联免疫吸附)等，但这些手段无一例外都拥有繁琐的制备过程，又由于需要相对大量的试剂和临床标本而受到限制，并不能进行多级检测。
发明内容
针对目前自身免疫病检测的技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，采用新的检测体系，提供一种基于量子点荧光共振能量转移(FRET)多级检测自身免疫疾病生物标记物的方法。提高相关疾病生物标记物检测的灵敏度、精确度，与其他检测方法相比，有更为灵敏的检测效果，大大降低最低检测浓度和检出限，并且可以进行多级检测，对具有多种生物标记物的自身免疫病的检测更具有应用价值。
为达到上述目的，本发明采取如下技术方案：基于量子点多级检测肿瘤标记物传感器，基于量子点荧光共振能量转移(FRET)检测自身免疫病生物标记物体系由玻璃基底、QDs-Ag复合物为免疫探针、二抗-DNA-Au NPs复合物为识别生物标记物的探针构成体系。玻璃基底经过硅烷化试剂进行硅烷化修饰，在生物交联剂作用下作为携带荧光信号的QDs-Ag复合物的承载体。而二抗-DNA-Au NPs复合物中的Au NPs作为荧光共振能量转移(FRET)的能量受体，接受与其接近的QDs-Ag复合物提供的能量供给，从而形成荧光信号的变化。二抗-DNA-Au NPs通过生物交联剂结合二抗、长链DNA及均一尺寸金纳米颗粒构成，经过免疫结合过程连接到体系之中。
基于量子点多级检测自身免疫疾病生物标记物传感器，该传感器包括：利用量子点偶联抗原形成QDs-Ag复合物作为免疫探针，负载玻璃基底和识别生物标记物的探针，所述识别生物标记物的探针为二抗-DNA-Au NPs复合物。
进一步，所述量子点同抗原偶联方法有：双功能蛋白或生物素-亲和素介导非共价结合偶联法；氨基同羧基、氨基与巯基、醛基和酰肼共价结合方法。
本发明的另一目的是提供一种制备上述传感器的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1)、CdTe-ZnS核壳量子点的合成；
步骤2)QDs-Ag复合物的合成及负载；
步骤3)二抗-DNA-Au NPs复合物的合成；
进一步，所述步骤1的核壳量子点合成，具体步骤如下：
步骤1.1：配制亚碲酸钾溶液作为碲前体，水合乙酸镉提供镉源，按比例加入巯基丙酸作为包被液，三者之间浓度比为1：2：1.7；调节体系pH在10-11，在温度为100℃下，加热回流1-10h，得到CdTe QDs；
步骤1.2：取步骤1得到CdTe QDs加入二水合乙酸锌和硫化钠的混合物中，二水合乙酸锌和硫化钠的比例为2：1，以巯基丙酸溶液为包被液，三者之间浓度比为2：1：1.7；重新调节体系的pH为10-11，采用高温水热法最终合成最终得到发射峰为550nm-676nm的CdTe-ZnS核壳量子点。
进一步，所述步骤2的具体步骤如下：
步骤:2.1：将合成的CdTe-ZnS核壳量子点通过交联剂的作用，活化CdTe-ZnS核壳量子点表面的羧基，同自身免疫抗原上的氨基结合，形成QDs-Ag复合物，超速离心除去未连接的CdTe-ZnS核壳量子点和自身免疫抗原；
步骤2.2：利用浓度为25％氢氧化钠溶液对玻璃基片进行浸泡处理30min，使玻璃基片表面羟基化，再通过硅烷偶联剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷的浸泡使得玻璃基片硅烷化；将步骤2.1得到的QDs-Ag复合物负载于硅烷化后的玻璃基底上，在温度为4℃下放置过夜，完成负载。
进一步，所述二抗-DNA-Au NPs复合物的合成的步骤如下：
利用交联剂将免疫球蛋白、二抗同3‘修饰氨基的DNA双链结合，免疫球蛋白、二抗同3‘修饰氨基的DNA双链的浓度配比为3：1，形成二抗-DNA复合物，色谱纯化后再利用DNA5’端修饰的巯基同Au NPs形成配位键，两者浓度比为1：2.5，构成二抗-DNA-Au NPs复合物，对所述二抗-DNA-Au NPs复合物使用色谱法进行纯化。
进一步，所述步骤2.1中的交联剂为EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，二者之间的质量比为4：1。
4)荧光强度变化表征目标物浓度。
通过标准溶液检测，得出不同QDs-Ag复合物荧光淬灭即荧光强度减小量与标准液浓度的关系式，利用关系式在实际检测中得出目标物浓度。能够同时进行多种自身免疫疾病生物标记物的检测，是本发明的主要创新点。
利用纳米荧光分子作为能量受体接近QDs-Ag复合物，产生荧光共振能量转移(FRET)。纳米荧光分子可以是诸如CdTe、CdSn/ZnS等不同类型的量子点；可以是以聚苯乙烯、聚甲基丙烯酸酯类、聚丙烯酰胺类为微粒主体，表面键合或吸附荧光素、菁色素等荧光物质的荧光纳米微球；也可以是金、银纳米颗粒等具有荧光性质的贵金属纳米颗粒。这一部分的是在那个步骤中处理的？(此部分属于荧光淬灭部分，所涉及的是纳米荧光分子的不同种类以及能引起荧光分子淬灭的相关具有接受荧光共振能量转移的纳米颗粒)
本发明与现有的检测技术相比较，主要优势及特点如下：
1、采用免疫阵列检测生物标记物，通过免疫分子之间的免疫反应进行目标物检测。量子点属于纳米材料，所以在同抗体结合的过程中只需要微量的QDs和蛋白抗原。故整个检测体系所需的检测试剂和临床样本量远远小于之前的检测方法；
2、QDs-Ag复合物携带荧光信号，经过与二抗-DNA-Au NPs复合物结合成体系，发生荧光共振能量转移(FRET)造成荧光信号的改变，根据体系的设计，可以同时检测多种自身免疫疾病的生物标记物，达到多级检测的目的。由于采用的是高稳定性、高生物活性的核壳型量子点，其发射波长窄，理论上在相互不干扰的情况下，可以完成三种甚至更多种生物标记物的检测。
附图说明
图1是本发明基于量子点荧光共振能量转移(FRET)自身免疫病生物标记物多级检测传感器示意图。
图2是本发明在实施例1中，量子点合成过程中回流时间同量子点发射峰波长对应关系图。
图3是本发明在实施例1中，合成量子点在长时间放置后荧光强度稳定性检测图。
图4(a)、(b)分别是应用实例2中，两种生物标记物检测的标准曲线。
具体实施方式
下面结合实例来进一步说明本发明，此实例仅用于具体说明，而不仅限于本发明的实际应用范围。下面结合实例阐述本发明的步骤，实例只用于更好地用于说明本方法。本方法的实际应用范围不仅限于实例。
如图1所示，本发明基于量子点的多级检测自身免疫疾病生物标记物传感器，该传感器包括：利用量子点偶联抗原形成QDs-Ag复合物作为免疫探针，负载玻璃基底和识别生物标记物的探针，所述识别生物标记物的探针为二抗-DNA-Au NPs复合物。
所述量子点同抗原偶联方法有：双功能蛋白或生物素-亲和素介导非共价结合偶联法；氨基同羧基、氨基与巯基、醛基和酰肼共价结合方法。
本发明基于量子点的多级检测自身免疫疾病生物标记物传感器制备传感器的方法，该方法包括以下步骤：
步骤1)、CdTe-ZnS核壳量子点的合成；
步骤2)QDs-Ag复合物的合成及负载；
步骤3)二抗-DNA-Au NPs复合物的合成；
所述步骤1的核壳量子点合成，具体步骤如下：
步骤1.1：配制亚碲酸钾溶液作为碲前体，水合乙酸镉提供镉源，按比例加入巯基丙酸作为包被液，三者之间浓度比为1：2：1.7；调节体系pH在10～11，在温度为100℃下，加热回流1-10，得到CdTe QDs；
步骤1.2：取步骤1得到CdTe QDs加入二水合乙酸锌和硫化钠的混合物中，二水合乙酸锌和硫化钠的比例为2：1，以巯基丙酸溶液为包被液，三者之间浓度比为2：1：1.7；重新调节体系的pH为10～11，采用高温水热法最终合成最终得到发射峰为550nm-676nm的CdTe-ZnS核壳量子点。
所述步骤2的具体步骤如下：
步骤:2.1：将合成的CdTe-ZnS核壳量子点通过交联剂的作用，活化CdTe-ZnS核壳量子点表面的羧基，同自身免疫抗原上的氨基结合，形成QDs-Ag复合物，超速离心除去未连接的CdTe-ZnS核壳量子点和自身免疫抗原；
步骤2.2：利用浓度为25％氢氧化钠溶液对玻璃基片进行浸泡处理30min，使玻璃基片表面羟基化，再通过硅烷偶联剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷的浸泡使得玻璃基片硅烷化；将步骤2.1得到的QDs-Ag复合物负载于硅烷化后的玻璃基底上，在温度为4℃下放置过夜，完成负载。
所述二抗-DNA-Au NPs复合物的合成的步骤如下：
利用交联剂将免疫球蛋白、二抗同3‘修饰氨基的DNA双链结合，免疫球蛋白、二抗同3‘修饰氨基的DNA双链的浓度配比为3：1，形成二抗-DNA复合物，色谱纯化后再利用DNA5’端修饰的巯基同Au NPs形成配位键，两者浓度比为1：2.5，构成二抗-DNA-Au NPs复合物，对所述二抗-DNA-Au NPs复合物使用色谱法进行纯化。
所述交联剂包括EDC(1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物)和NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)，二者之间的质量比为4：1。
实施例1
基于量子点的多级检测自身免疫疾病生物标记物传感器的制备方法：
1)、CdTe-ZnS核壳量子点合成。
CdTe-ZnS核壳量子点合成步骤如下：称取12.69mg亚碲酸钾，配制成溶液作为碲前体，53.306mg水合乙酸镉提供镉源，按比例加入巯基丙酸作为包被液29.6μL，调节体系pH至10.5-11，不断回流加热1h，利用高温水热法合成得到发射峰为518nm的CdTe QDs留用。量取10mL CdTe QDs，通入氮气20min，保证处于无氧环境中。加入3.512mg的二水合乙酸锌配成的10mL溶液，再加入3.84mg硫化钠，同样以3.4μL巯基丙酸为包被液，重新调节体系pH在10.5-11，继续通氮气，并100℃回流加热20min，最终得到发射峰分别为550nm-676nm的CdTe/ZnS量子点。高温水热法最终合成高稳定性、高生物相容性的CdTe-ZnS核壳量子点。本次实验获得发射峰分别为550nm的量子点。
2)、QDs-Ag复合物的合成及负载于玻璃基底上。
a、将合成的核壳型QDs，在交联剂40mM EDC的作用下，活化量子点表面的羧基15min，将10mM的NHS同10μL 5mg/mL的52kDa Ro/SSA抗原和白塞病抗原加入490μL PBS中，将两种溶液混合，负载2h。量子点表面的羧基同自身免疫抗原上的氨基结合，形成复合物QDs-Ag；4℃10000r/min超速离心三次，除去上清液，取1mLPBS回溶。
b、利用30％的NaOH溶液对玻璃基片进行浸泡处理20min，使玻璃基片表面羟基化，然后通过硅烷偶联剂(3-氯丙基-三乙氧基硅烷)的浸泡使得玻璃基片硅烷化。将两种QDs-Ag复合物分别滴加20μL负载于硅烷化后的玻璃基底上，4℃放置过夜完成负载。
3)、二抗-DNA-Au NPs复合物的合成。
利用交联剂sulfo-SMPB将免疫球蛋白、二抗同3‘修饰氨基的DNA双链结合形成二抗-DNA复合物色谱纯化后再利用DNA 5’端修饰的巯基同Au NPs形成配位键，构成二抗-DNA-Au NPs复合物，同样使用色谱法进行纯化。
上述实验中所使用的DNA序列为：(5’-3’)5’-SH-TAT ATT ACT TAC ATC TAC TATCAT CAT CgC TCg TCg TCT gAC TCA CgT TCT ATC TCT CAC TCg TAT CgT gAC Tgg gTCATg Cag ggg TTT gCA ACg TTC g-NH2-3’
4)QDs-Ag复合物、抗体、二抗-DNA-Au NPs免疫识别过程：
a.将浓度为0.5mg/mL的52kDa Ro/SSA取2μL加入负载有QDs-Ag复合物的玻璃基底上，反应20min，再加入浓度分别为0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL的二抗-DNA-Au NPs复合物。相同浓度目标分子的状况下，三种浓度的复合物造成的荧光淬灭率分别为61％、83％、76％。1mg/mL的二抗-DNA-Au NPs复合物浓度可以产生更多的能量转移，故采用此浓度。
b.将两种不同发射峰的QDs-Ag复合物各25μL负载于玻璃基底，加入呈梯度的标准抗体溶液10μL，浓度分别为：2.0μg/mL、1.5μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL。分别加入1mg/mL的二抗-DNA-Au NPs。
5)荧光强度变化表征目标物浓度。
通过标准溶液检测，得出不同QDs-Ag复合物荧光淬灭即荧光强度减小量与标准液浓度的关系式，利用关系式在实际检测中得出目标物浓度。
实施例2：
基于量子点的多级检测自身免疫疾病生物标记物传感器的制备工艺，具体包括以下步骤：
1)、CdTe-ZnS核壳量子点合成。
CdTe-ZnS核壳量子点合成步骤如下：称取12.69mg亚碲酸钾，配制成溶液作为碲前体，53.306mg水合乙酸镉提供镉源，按比例加入巯基丙酸作为包被液29.6μL，调节体系pH至10.5-11，不断回流加热6h，利用高温水热法合成得到621nm的CdTe QDs留用。量取10mLCdTe QDs，通入氮气20min，保证处于无氧环境中。加入3.512mg的二水合乙酸锌配成的10mL溶液，再加入3.84mg硫化钠，同样以3.4μL巯基丙酸为包被液，重新调节体系pH在10.5-11，继续通氮气，并100℃回流加热20min，最终得到发射峰分别为633nm的CdTe/ZnS核壳量子点。
2)、QDs-Ag复合物的合成及负载于玻璃基底上。
a、将合成的核壳型QDs，在交联剂40mM EDC的作用下，活化量子点表面的羧基15min，将10mM的NHS同10μL 5mg/mL的52kDa Ro/SSA抗原和白塞病抗原加入490μL PBS中，将两种溶液混合，负载2h。量子点表面的羧基同自身免疫抗原上的氨基结合，形成复合物QDs-Ag；4℃10000r/min超速离心三次，除去上清液，取1mLPBS回溶。
b、利用30％的NaOH溶液对玻璃基片进行浸泡处理20min，使玻璃基片表面羟基化，然后通过硅烷偶联剂(3-氯丙基-三乙氧基硅烷)的浸泡使得玻璃基片硅烷化。将两种QDs-Ag复合物分别滴加20μL负载于硅烷化后的玻璃基底上，4℃放置过夜完成负载。
3)、二抗-DNA-Au NPs复合物的合成。
利用交联剂sulfo-SMPB(磺基琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸)将免疫球蛋白IgG二抗同3’修饰氨基的DNA双链结合形成二抗-DNA复合物色谱纯化后再利用DNA 5’端修饰的巯基同Au NPs形成配位键，构成二抗-DNA-Au NPs复合物，同样使用色谱法进行纯化。
上述实验中所使用的DNA序列为：(5’-3’)5’-SH-TAT ATT ACT TAC ATC TAC TATCAT CAT CgC TCg TCg TCT gAC TCA CgT TCT ATC TCT CAC TCg TAT CgT gAC Tgg gTCATg Cag ggg TTT gCA ACg TTC g-NH2-3’
4)QDs-Ag复合物、抗体、二抗-DNA-Au NPs免疫识别过程：
a.将浓度为0.5mg/mL的52kDa Ro/SSA取2μL加入负载有QDs-Ag复合物的玻璃基底上，反应20min，再加入浓度分别为0.5mg/mL、0.1mg/mL、0.05mg/mL的二抗-DNA-Au NPs复合物。相同浓度目标分子的状况下，三种浓度的复合物造成的荧光淬灭率分别为61％、83％、76％。1mg/mL的二抗-DNA-Au NPs复合物浓度可以产生更多的能量转移，故采用此浓度。
b.将两种不同发射峰的QDs-Ag复合物各25μL负载于玻璃基底，加入呈梯度的标准抗体溶液10μL，浓度分别为：2.0μg/mL、1.5μg/mL、1.0μg/mL、0.5μg/mL。分别加入1mg/mL的二抗-DNA-Au NPs。
表1 不同浓度检测样本荧光强度数据。

Claims (2)

1.基于量子点的多级检测自身免疫疾病生物标记物传感器的制备方法，该传感器包括：利用量子点偶联抗原形成QDs-Ag 复合物作为免疫探针，负载玻璃基底和识别生物标记物的探针，所述识别生物标记物的探针为二抗 -DNA-Au NPs 复合物，所述量子点同抗原偶联方法为氨基同羧基共价结合方法，该传感器的制备方法包括以下步骤：
步骤1）、CdTe-ZnS 核壳量子点的合成，具体步骤如下：
步骤1.1：配制亚碲酸钾溶液作为碲前体，水合乙酸镉提供镉源，按比例加入巯基丙酸作为包被液，三者之间浓度比为1：2：1.7；调节体系pH在10-11，在温度为100℃下，加热回流1-10 h，得到CdTe QDs ；
步骤1.2：取步骤1.1得到的CdTe QDs加入二水合乙酸锌和硫化钠的混合物中，二水合乙酸锌和硫化钠的比例为2：1，以巯基丙酸溶液为包被液，二水合乙酸锌、硫化钠和以巯基丙酸三者之间浓度比为2：1：1.7；重新调节体系的pH为10-11，采用高温水热法最终合成发射峰为550 nm-676 nm的CdTe-ZnS核壳量子点；
步骤2）QDs-Ag 复合物的合成及负载；
QDs-Ag 复合物的合成及负载的具体步骤如下：
步骤:2.1：将合成的CdTe-ZnS 核壳量子点通过交联剂的作用，活化CdTe-ZnS 核壳量子点表面的羧基，同自身免疫抗原上的氨基结合，形成QDs-Ag复合物，超速离心除去未连接的CdTe-ZnS 核壳量子点和自身免疫抗原；
步骤2.2：利用浓度为25%氢氧化钠溶液对玻璃片进行浸泡处理30 min，使玻璃片表面羟基化，再通过硅烷偶联剂3-氨丙基-三乙氧基硅烷的浸泡使得玻璃片硅烷化；将步骤2.1得到的QDs-Ag 复合物负载于硅烷化后的玻璃片上，在温度为4℃下放置过夜，完成负载；
步骤3）二抗-DNA-Au NPs 复合物的合成；二抗-DNA-Au NPs 复合物的合成的步骤如下：
利用交联剂sulfo-SMPB（磺基琥珀酰亚胺4-[P-苯基马来酰亚胺]-丁酸）将免疫球蛋白IgG二抗同3’修饰氨基的DNA双链结合，免疫球蛋白IgG二抗同3’修饰氨基的DNA双链的浓度配比为3：1，形成二抗-DNA复合物，色谱纯化后再利用DNA 5’端修饰的巯基同Au NPs 形成配位键，两者浓度比为1：2.5，构成二抗-DNA-Au NPs 复合物，对所述二抗-DNA-Au NPs 复合物使用色谱法进行纯化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤2.1的交联剂包括EDC（1-乙基-3-[3-二甲基氨基丙基]碳化二亚胺盐酸化物）和NHS（N-羟基琥珀酰亚胺），二者之间的质量比为4：1。
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