WO2018003739A1 - 機能的リガンドを含む核酸複合体 - Google Patents

機能的リガンドを含む核酸複合体 Download PDF

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WO2018003739A1
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nucleic acid
polynucleotide
ligand
acid complex
linker
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矢野　純一
万顕 谷川原
拓也 秋澤
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レナセラピューティクス株式会社
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    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing

Definitions

  • the present invention relates to a nucleic acid having an activity of suppressing the expression of a target gene by, for example, an antisense effect, preferably a double-stranded nucleic acid, and more specifically, an antisense nucleic acid complementary to a transcription product of a target gene and the nucleic acid
  • the present invention relates to a nucleic acid, preferably a double-stranded nucleic acid, comprising a nucleic acid complementary to a complementary nucleic acid and a ligand bound to the complementary nucleic acid.
  • oligonucleotides have been developed as pharmaceuticals called nucleic acid pharmaceuticals.
  • development of nucleic acid pharmaceuticals using antisense methods has been energetically advanced. It has been.
  • the antisense method selects the expression of the protein encoded by the target gene by introducing into the cell an oligonucleotide (antisense oligonucleotide (ASO)) complementary to the partial sequence of the mRNA (sense strand) of the target gene. It is a method to inhibit.
  • ASO antisense oligonucleotide
  • oligonucleotide consisting of DNA
  • ASO the transcription product (mRNA) of the target gene and the ASO are combined to form a double strand, and this double strand serves as a lid.
  • Patent Document 1 discloses a double-stranded nucleic acid complex in which an LNA / DNA gapmer and a complementary strand composed of RNA are annealed. Yes.
  • the double-stranded nucleic acid as in this document is called HDO (heteroduplex oligonucleotide).
  • Patent Document 1 discloses that lipids, sugars, peptides, proteins, and the like are used as “functional moieties” having a function of delivering to a target as 3 ′ of nucleotides at the 3 ′ end of the nucleic acid chain. Binding to the 5 ′ position of the position or 5 ′ terminal nucleotide is described.
  • Non-Patent Document 1 for delivery of siRNA to hepatocytes, three N-acetylgalactosamines were bound at or near the 3 ′ end of the sense strand of the siRNA. Is described.
  • An object of the present invention is to provide a nucleic acid complex, preferably a double-stranded nucleic acid complex, having an excellent target gene expression suppression effect.
  • Still another object of the present invention is to provide a nucleic acid complex, preferably a double-stranded nucleic acid complex, capable of suppressing the growth of a target cell, for example, a target cancer cell, with excellent efficiency.
  • a further object of the present invention is a nucleic acid complex, preferably double stranded, which can be delivered to a target tissue or target site with excellent specificity and efficiency, and has excellent target gene expression suppression in those tissues or sites. It is to provide a nucleic acid complex.
  • a transcript eg, a transcript of a target gene
  • a carrier moiety that contains a nucleic acid that is complementary to the nucleic acid.
  • the expression of the transcript can be remarkably suppressed by using a nucleic acid complex, preferably a double-stranded nucleic acid complex, wherein at least one ligand is bound to a specific region of the nucleic acid of the carrier part. I found.
  • the present invention relates to: 1. (I) an active moiety comprising a polynucleotide comprising at least a chemically modified deoxyribonucleotide and optionally a nucleic acid analogue as building blocks, and (ii) a chemically modified nucleotide and optionally a nucleic acid analogue.
  • a carrier moiety comprising at least a part of (i) a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the active moiety,
  • a nucleic acid complex comprising: In a site where at least one ligand excludes (ii) the 5 ′ position of the structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety and the 3 ′ position of the structural unit located at the 3 ′ end of the polynucleotide. , (Ii) a nucleic acid complex bound to one or more structural units of the polynucleotide of the carrier moiety. 2. 2. The nucleic acid complex according to 1 above, which is a double-stranded nucleic acid complex. 3.
  • the at least one ligand is (ii) one or more structural units of the polynucleotide of the carrier moiety, not the structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide and the 3 ′ end of the polynucleotide 3.
  • the at least one ligand is composed of n consecutive structural units including one structural unit located at the center of the polynucleotide.
  • the polynucleotide When it is bound to one or a plurality of structural units within the range and the polynucleotide is composed of an even number of structural units, the consecutive n + 1 constitutions including two structural units located at the center of the polynucleotide 4.
  • the nucleic acid complex according to any one of 1 to 3, wherein the nucleic acid complex is bound to one or a plurality of structural units within a unit range (wherein n is an integer of 1 to 6). 5.
  • the at least one ligand is bound to one of the second to sixth constituent units from the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety (ii) and / or the second to sixth positions from the 3 ′ end. 4.
  • the nucleic acid complex according to any one of 1 to 3 above, which is bound to one of the structural units. 6). Any one of the above 1 to 5, wherein the at least one ligand is selected from the group consisting of a protein ligand, a peptide ligand, an aptamer ligand, a sugar chain ligand, a lipid ligand, a small molecule ligand, and a biomolecule / bioactive molecule ligand.
  • the nucleic acid complex according to 1. 7). 7.
  • the at least one ligand is a cyclic arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence-containing peptide, N-acetylgalactosamine, cholesterol, vitamin E (tocopherol), stearic acid, docosanoic acid, anisamide, folic acid, anandamide or spermine; 8.
  • RGD cyclic arginine-glycine-aspartic acid
  • the linker is a polyalkylene glycol linker, a maleimide linker, a bis (sulfosuccinimidyl) suberate linker, a DNA linker, a peptide linker, a silane linker, a polysaccharide linker, a disulfide linker, or a triazole linker.
  • Complex 11.
  • nucleic acid complex according to any one of 1 to 11 above, which comprises 13.
  • the polynucleotide in the active moiety comprises one or more nucleic acid analogs.
  • the polynucleotide in the active moiety comprises at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides, and the polynucleotide comprises: (A) a 5 ′ wing region located 5 ′ of the at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides and comprising one or more chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs; and / or , (B) a 3 ′ wing region located 3 ′ of the at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides and comprising one or more chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs; including, 13.
  • the polynucleotide in the active portion comprises (a) a 5 ′ wing region and (b) a 3 ′ wing region, wherein the 5 ′ wing region comprises at least one nucleic acid analog, and the 3 ′ wing region 16.
  • nucleic acid complex according to the above 20 wherein the crosslinked nucleic acid is selected from the group consisting of LNA, cEt-BNA, amide BNA and cMOE-BNA. 22. 22.
  • nucleic acid complex according to any one of (1) to (25) above, wherein the length of the polynucleotide in the (i) active portion is different from the length of the polynucleotide in the (ii) carrier portion.
  • nucleic acid complex according to any one of 1 to 28, wherein the polynucleotide in the carrier moiety comprises a chemically modified nucleotide. 30. 30.
  • nucleic acid complex according to any one of 1 to 29, wherein the structural unit to which a ligand is bound is a chemically modified nucleotide.
  • 31. The nucleic acid complex according to any one of 9, 10, and 12 to 30, wherein the structural unit to which a ligand is bonded via a linker is a nucleotide chemically modified for binding to the linker.
  • 32. The nucleic acid complex according to 31 above, wherein the structural unit to which a ligand is bonded via a linker forms the following structure together with the linker and the ligand:
  • R 10 is H or a base
  • R 11 and R 12 are each independently the remainder of the polynucleotide
  • LK is a linker
  • LG represents a ligand
  • R 10 is H or a base, and R 11 and R 12 each independently represent the remainder of the polynucleotide].
  • 34. (Ii) The polynucleotide according to any one of 28 to 33 above, wherein the polynucleotide in the carrier moiety is composed of deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides except for a structural unit to which a ligand is bound directly or via a linker.
  • Nucleic acid complex 35.
  • the present invention can also include the following embodiments: 1. (I) an active moiety comprising a polynucleotide comprising at least a chemically modified deoxyribonucleotide and optionally a nucleic acid analogue as building blocks, and (ii) a chemically modified nucleotide and optionally a nucleic acid analogue.
  • a carrier moiety comprising at least a part of (i) a polynucleotide complementary to the polynucleotide in the active moiety,
  • a nucleic acid complex comprising: In a site where at least one ligand excludes (ii) the 5 ′ position of the structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety and the 3 ′ position of the structural unit located at the 3 ′ end of the polynucleotide. , (Ii) a nucleic acid complex bound to one or more structural units of the polynucleotide of the carrier moiety. 2. 2. The nucleic acid complex according to 1 above, which is a double-stranded nucleic acid complex. 3.
  • the at least one ligand is (ii) one or more structural units of the polynucleotide of the carrier moiety, not the structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide and the 3 ′ end of the polynucleotide 3.
  • the at least one ligand is composed of n consecutive structural units including one structural unit located at the center of the polynucleotide.
  • the polynucleotide When it is bound to one or a plurality of structural units within the range and the polynucleotide is composed of an even number of structural units, the consecutive n + 1 constitutions including two structural units located at the center of the polynucleotide 4.
  • the nucleic acid complex according to any one of 1 to 3, wherein the nucleic acid complex is bound to one or a plurality of structural units within a unit range (wherein n is an integer of 1 to 6). 5.
  • the at least one ligand is bound to one of the second to sixth constituent units from the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety (ii) and / or the second to sixth positions from the 3 ′ end. 4.
  • the nucleic acid complex according to any one of 1 to 3 above, which is bound to one of the structural units. 6). Any one of the above 1 to 5, wherein the at least one ligand is selected from the group consisting of a protein ligand, a peptide ligand, an aptamer ligand, a sugar chain ligand, a lipid ligand, a small molecule ligand, and a biomolecule / bioactive molecule ligand.
  • the nucleic acid complex according to 1. 7). 7.
  • the at least one ligand is a cyclic peptide, N-acetylgalactosamine, cholesterol, vitamin E (tocopherol) or an analog thereof, stearic acid, docosanoic acid, anisamide, folic acid or an analog thereof, anandamide or spermine
  • nucleic acid complex according to 8 above, wherein the at least one ligand is a cyclic arginine-glycine-aspartate (RGD) sequence-containing peptide, tocopherol or folic acid. 10. 10. The nucleic acid complex according to any one of 1 to 9 above, wherein the at least one ligand is indirectly bound via a linker. 11.
  • RGD cyclic arginine-glycine-aspartate
  • Complex. 12 10. The nucleic acid complex according to any one of 1 to 9 above, wherein the at least one ligand is directly bound. 13.
  • nucleic acid complex according to 13 above comprising two or more ligands bound to different structural units. 15.
  • nucleic acid complex according to any one of 1 to 16 above, which comprises 18.
  • the polynucleotide in the active moiety comprises at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides, and the polynucleotide comprises: (A) a 5 ′ wing region located 5 ′ of the at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides and comprising one or more chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs; and / or , (B) a 3 ′ wing region located 3 ′ of the at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides and comprising one or more chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs; including, 18.
  • the nucleic acid complex according to any one of 1 to 17 above. 21.
  • the polynucleotide in the active portion comprises (a) a 5 ′ wing region and (b) a 3 ′ wing region, wherein the 5 ′ wing region comprises at least one nucleic acid analog, and the 3 ′ wing region 21.
  • nucleic acid complex according to 25 above wherein the crosslinked nucleic acid is selected from the group consisting of LNA, cEt-BNA, amide BNA and cMOE-BNA. 27. 27.
  • the nucleic acid complex according to 25 or 26 wherein the crosslinked nucleic acid is phosphorothioated. 28.
  • 28. The nucleic acid complex according to any one of 1 to 27, wherein (ii) the polynucleotide in the carrier moiety contains at least one mismatch with the polynucleotide in (i) the active moiety. 29.
  • nucleic acid complex according to any one of 1 to 32 above, wherein the polynucleotide in the carrier moiety comprises a deoxyribonucleotide which may be chemically modified and / or a ribonucleotide which may be chemically modified. . 34.
  • nucleic acid complex according to any one of the above 10, 11, and 13 to 35, wherein the structural unit to which a ligand is bound via a linker is a nucleotide chemically modified for binding to the linker. 37. 37. The nucleic acid complex according to 36, wherein the structural unit to which a ligand is bonded via a linker forms the following structure together with the linker and the ligand:
  • R 10 is H or a base
  • R 11 and R 12 are each independently the remainder of the polynucleotide
  • LK is a linker
  • LG represents a ligand
  • R 10 is H or a base, and R 11 and R 12 each independently represent the remainder of the polynucleotide].
  • 39. The nucleic acid complex according to 37, wherein the structural unit to which a ligand is bonded via a linker forms the following structure together with the linker and the ligand:
  • R 10 is H or a base, and R 11 and R 12 each independently represent the remainder of the polynucleotide].
  • 40. The nucleic acid complex according to 37, wherein the structural unit to which a ligand is bonded via a linker forms the following structure together with the linker and the ligand:
  • R 10 is H or a base, and R 11 and R 12 each independently represent the remainder of the polynucleotide].
  • 41. (Ii) The polynucleotide according to any one of the above 33 to 40, wherein the polynucleotide in the carrier moiety is composed of deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides except for a structural unit to which a ligand is bound directly or via a linker.
  • Nucleic acid complex 42. 42. The nucleic acid complex according to any one of the above 1 to 41, for reducing the expression of a target gene in a mammal. 43. 43.
  • the nucleic acid complex according to the above 44, wherein the target gene is an oncogene and the cell is a cancer cell.
  • 46. 46. A pharmaceutical composition comprising the nucleic acid complex according to any one of the above 1 to 45, and optionally a pharmacologically acceptable carrier. 47. 47.
  • a pharmaceutical composition for treating and / or preventing liver disease comprising the nucleic acid complex according to any one of the above 1 to 44, and optionally a pharmacologically acceptable carrier.
  • a target transcript typically in a target cell, for example in a target cancer cell
  • a target cancer cell typically in a target cancer cell
  • the nucleic acid complex it is possible to specifically and efficiently suppress the growth of the target cell, preferably the target cancer cell.
  • the nucleic acid complex can be delivered to the target tissue or target site with excellent specificity and efficiency, and by using the complex, the target gene can be efficiently and specifically transmitted in the tissue or site. Expression can be suppressed.
  • FIG. 1A shows the carrier portion of BDX-2-cRGD obtained in Example 3 as one embodiment of a carrier portion to which a ligand is bound via a linker.
  • FIG. 1B shows the carrier portion of BDX-2-RGE (Ne) obtained using GRGESP (negative control) as the ligand.
  • FIG. 2A shows an embodiment of the nucleic acid complex of the present invention in which two ligands are bonded to one constituent unit other than the 5 ′ end and the 3 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety via a branched linker. Show.
  • FIG. 1A shows the carrier portion of BDX-2-cRGD obtained in Example 3 as one embodiment of a carrier portion to which a ligand is bound via a linker.
  • FIG. 1B shows the carrier portion of BDX-2-RGE (Ne) obtained using GRGESP (negative control) as the ligand.
  • FIG. 2A shows an embodiment of the nucleic acid complex of the
  • FIG. 2B shows an embodiment of the nucleic acid complex of the present invention in which four ligands are bonded to one constituent unit other than the 5 ′ end and the 3 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety via a branched linker.
  • FIG. 2C shows the two ligands in the 5 ′ region and 3 ′ region (regions other than the 5 ′ end and other than the 3 ′ end) of the polynucleotide of the carrier part, and the structural units and linkers in the respective regions.
  • 1 shows an embodiment of the nucleic acid complex of the present invention that is bound via FIG.
  • FIG. 2D shows that one ligand binds to one constituent unit other than the 5 ′ end and the other than the 3 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety via a linker, and another ligand binds to the carrier via the linker.
  • FIG. 4 shows one embodiment of a nucleic acid complex of the invention attached to the 5 ′ end of a partial polynucleotide.
  • FIG. 2E shows one embodiment when the nucleic acid complex of the present invention contains one ligand.
  • FIG. 3 shows the results of a cell growth inhibitory activity test of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene when the A549 cell line is used.
  • FIG. 4A shows the structure of the carrier portion of BDX-2-DEcRGD.
  • FIG. 4B shows the structure of the carrier portion of BDX-2-TEcRGD.
  • FIG. 4C shows the structure of PEG3-Folate.
  • FIG. 4D shows the structure of PEG11-Folate.
  • FIG. 4E shows the structure of PEG23-Folate.
  • FIG. 5 shows the results of the growth-inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid in which a monomer, a dimer, and a tetramer cRGD are bound to the central part of the complementary strand on the OVCAR-3 cell line.
  • FIG. 5 shows the results of the growth-inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid in which a monomer, a dimer, and a tetramer cRGD are bound to the central part of the complementary strand on the OVCAR-3 cell line.
  • FIG. 6 shows the results of the growth inhibitory activity of BDX-2-cRGD in which a monomeric cRGD is bound to the center of the complementary strand on the DU145 cell line.
  • FIG. 7 shows the results of the growth inhibitory activity of BDX-2-cRGD in which monomeric cRGD is bound to the center of the complementary strand on the PANC-1 cell line.
  • FIG. 8 shows the results of the growth-inhibitory activity of BDX-2-cRGD in which monomeric cRGD is bound to the center of the complementary strand against the PC-3 cell line.
  • FIG. 9 shows the results of the growth inhibitory activity of BDX-2-cRGD in which monomeric cRGD is bound to the center of the complementary strand on the Caki-1 cell line.
  • FIG. 10 shows the results of the activity of inhibiting the growth of BDX-2-cRGD having a monomeric cRGD bound to the center of the complementary strand against the MCAS cell line.
  • FIG. 11 shows the results of adding BDX-4-cRGD to the PANC-1 cell line at 1 ⁇ M and quantifying the mRNA expression level 24 hours later.
  • FIG. 12 shows the results obtained by adding BDX-5-cRGD, BDX-5-DEcRGD, and BDX-5-TEcRGD to the K562 cell line at 10 ⁇ M, and quantifying the mRNA expression level 24 hours later.
  • FIG. 11 shows the results of adding BDX-4-cRGD to the PANC-1 cell line at 1 ⁇ M and quantifying the mRNA expression level 24 hours later.
  • FIG. 12 shows the results obtained by adding BDX-5-cRGD, BDX-5-DEcRGD, and BDX-5-TEcRGD to the K562 cell line at 10 ⁇ M, and
  • FIG. 13 shows the BCL2 gene knockdown effect in a pancreatic cancer site of a pancreatic orthotopic transplanted mouse model of a pancreatic cancer cell line with a double-stranded nucleic acid having cRGD bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 14 shows the results of drug efficacy evaluation in a pancreatic cancer cell line pancreas orthotopic transplant mouse model of a double-stranded nucleic acid having cRGD bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 15 shows the results of the liver weight ratio regarding the hepatotoxicity-reducing effect of the double-stranded nucleic acid having cRGD bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 16 shows an AST value regarding the hepatotoxicity-reducing effect of a double-stranded nucleic acid in which cRGD is bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 17 shows an ALT value regarding the hepatotoxicity-reducing effect of a double-stranded nucleic acid in which cRGD is bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 18 shows the survival-prolonging effect in a pancreatic cancer cell line orthotopic transplant mouse model of a double-stranded nucleic acid having cRGD bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 19 shows the results of a cell growth inhibitory activity test (PANC-1 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which cRGD is bound to one different position of the complementary strand.
  • FIG. 20 shows the results of a cell growth inhibitory activity test (AsPC-1 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which cRGD is bound to one site of different complementary strands.
  • FIG. 21 shows the results of a cell growth inhibitory activity test (OVCAR-3 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which cRGD is bound to one different position of the complementary strand.
  • FIG. 22 shows the results of a cytostatic activity test (PANC-1 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which cRGD is bound to two different positions of the complementary strand.
  • FIG. 23 shows the results of an mRNA expression inhibitory activity test (PANC-1 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which cRGD is bound to two different portions of the complementary strand.
  • FIG. 24 shows the results of a cell growth inhibitory activity test (OVCAR-3 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene having folic acid bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 25 shows the results of a cytostatic activity test (OVCAR-3 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which folic acid is bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 26 shows the results of adding BDX-15-PEG3-Folate to OVCAR-3 cell line at 1, 3, and 10 ⁇ M and quantifying mRNA expression level 24 hours later.
  • FIG. 27 shows the results of a cytostatic activity test (A549 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which folic acid is bound to two different portions of the complementary strand.
  • FIG. 28 shows the results of a double-stranded nucleic acid mRNA expression inhibitory activity test (OVCAR-3 cell line) targeting the human BCL2 gene in which folic acid is bound to two different parts of the complementary strand.
  • FIG. 29 shows the results of a cytostatic activity test (OVCAR-3 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which folic acid is bound at three different positions of the complementary strand.
  • FIG. 30 shows the results of an mRNA expression inhibitory activity test (OVCAR-3 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which folic acid is bound to three different positions of the complementary strand.
  • FIG. 31 shows the results of a cytostatic activity test (PANC-1 cell line) of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCL2 gene in which folic acid is bound to four different positions of the complementary strand.
  • FIG. 32 shows the results of an mRNA expression inhibitory activity test of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCR-ABL gene having folic acid bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 33 shows the results of an mRNA expression inhibitory activity test of a double-stranded nucleic acid targeting the human BCR-ABL gene having folic acid bound to the center of the complementary strand.
  • FIG. 34 shows the results of quantifying the expression level of APOB gene mRNA in the liver.
  • FIG. 35 shows the results of quantifying the mRNA expression level of the MALAT-1 gene in the liver.
  • the nucleic acid complex of the present invention includes (i) an active portion containing an antisense nucleic acid (DNA-based nucleic acid) and (ii) a nucleic acid that is at least partially complementary to the antisense nucleic acid.
  • a nucleic acid complex preferably a double stranded nucleic acid complex, comprising a carrier moiety, wherein at least one ligand is bound to a specific region of the nucleic acid of the carrier moiety.
  • the nucleic acid complex is a synthesized, purified and / or isolated nucleic acid complex, preferably a double-stranded nucleic acid complex.
  • the nucleic acid complex has an activity of suppressing the expression of a target gene and the level of a transcript (an mRNA transcript encoding a protein or a transcript not encoding a protein) by an antisense effect.
  • the nucleic acid complex of the present invention can suppress the growth of a target cell, preferably a target cancer cell, depending on the selection of a target transcript (typically a gene transcript).
  • a target transcript typically a gene transcript
  • a cell associated with enhanced expression of a target gene is used as a target cell, and its growth can be suppressed by the nucleic acid complex of the present invention.
  • an oncogene for example, BCL2 gene having a function of suppressing apoptosis or BCR-ABL gene
  • the nucleic acid complex of the present invention can be delivered to a target tissue or target site with excellent specificity and efficiency, the expression of the target gene can be efficiently suppressed in those tissues or sites. Therefore, by administering the nucleic acid complex to the subject, the proliferation of cells accompanied by increased expression of the target gene or the like is suppressed in a tissue / site-specific manner as necessary, thereby enhancing such expression or the like. It is also possible to treat and prevent various diseases associated therewith. For example, with the nucleic acid complex of the present invention, cancer can be treated and / or prevented by suppressing expression of BCL2 gene or BCR-ABL gene as a target in various cancer cells.
  • nucleic acid complex of the present invention to suppress the expression of a gene such as APOB or a translocation-related lung adenocarcinoma transcript (MALAT-1) in hepatocytes as a target, It is also possible to treat or prevent dyslipidemia and liver cancer.
  • a gene such as APOB or a translocation-related lung adenocarcinoma transcript (MALAT-1) in hepatocytes as a target
  • nucleic acid complex of the present invention has an antitumor effect in an animal model.
  • the “active portion” is one of the constituent elements of the nucleic acid complex, and the main effect intended for the nucleic acid complex, that is, the target gene and the target transcript (hereinafter, both are collectively referred to as “active part”).
  • the active portion includes a polynucleotide as an antisense nucleic acid for the target transcript.
  • the active moiety is a polynucleotide, ie consisting only of a polynucleotide.
  • the polynucleotide in the active part contains at least deoxyribonucleotide and optionally a nucleic acid analog as constituent units.
  • the deoxyribonucleotide may be chemically modified or not chemically modified. In one embodiment of the invention, the deoxyribonucleotide is modified.
  • the polynucleotide in the active moiety comprises only deoxyribonucleotides that may be chemically modified and optionally nucleic acid analogs as building blocks. In a further embodiment of the invention, the polynucleotide in the active moiety comprises only chemically modified deoxyribonucleotides and optionally nucleic acid analogs as building blocks. In another embodiment of the invention, the polynucleotide in the active moiety comprises only chemically modified deoxyribonucleotides, non-chemically modified deoxyribonucleotides and optionally nucleic acid analogs as building blocks.
  • the “carrier portion” is one of the components of the nucleic acid complex, and functions as a carrier of the active portion for an appropriate period until the active portion reaches the target transcript. It is a part that is considered to have.
  • the carrier part includes a polynucleotide that is at least partially complementary to the active part polynucleotide. Due to such complementarity, the carrier moiety serves as a carrier by forming a double strand with the polynucleotide of the active moiety.
  • the carrier moiety is a polynucleotide, i.e. consists only of a polynucleotide.
  • the nucleotide that is a structural unit of the polynucleotide in the carrier portion may be chemically modified or not chemically modified.
  • the polynucleotide in a carrier part contains the nucleotide which may be chemically modified, and the nucleic acid analog at least as a structural unit at least.
  • the polynucleotide in the carrier moiety comprises only optionally modified nucleotides and optionally nucleic acid analogs as building blocks.
  • the nucleic acid complex further comprises at least one ligand, for example 1 to 10, preferably 1 to 6, for example 1, 2, 3, 4 or 5 ligands.
  • the ligands may be the same or different from each other.
  • ligand means a substance capable of binding to a receptor, and typically, a substance capable of specifically binding to a receptor can be used.
  • the receptor is not particularly limited as long as it is a substance capable of binding a ligand, and examples thereof include various receptors present on cell membranes. That is, as used herein, the terms “ligand” and “receptor” are used to mean partners that can bind to each other, preferably those that can specifically bind to each other. It is not limited to what is done. For example, a substance that can specifically bind to a receptor present on the cell membrane surface of a target cell can be used as the ligand.
  • the ligand can be, for example, a protein, peptide, aptamer, sugar chain, lipid, small molecule, biomolecule / bioactive molecule, but is not limited thereto.
  • Protein means an ⁇ -L-amino acid (including glycine) linearly linked by peptide bonds.
  • protein is a concept including both a simple protein consisting only of amino acids and a complex protein including components other than amino acids, and refers to a protein composed of 100 or more amino acids.
  • proteins used as ligands include fatty acid binding protein FABP 1-12 (fatigue acid binding protein 1-12), outer membrane specific lipoprotein molecule chaperone LolA, outer membrane specific Specific lipoprotein receptors LolB, lipoxygenase and cyclooxygenase.
  • an example of a protein that can be used as a ligand is an antibody (hereinafter also referred to as “antibody ligand”).
  • antibody ligand an antibody that recognizes it as an antigen as a ligand
  • the nucleic acid complex of the present invention is converted into a target cell or tissue in which the receptor exists (typically, the receptor Can be specifically delivered to target cells or target tissues present on the surface).
  • peptides can be used as ligands.
  • “Peptide” is a substance in which two or more amino acids are linked by peptide bonds, and in this specification, refers to a substance in which amino acids of less than 100 residues are linked. In the present invention, preferably an amino acid having 60 residues or less, such as 50 residues or less, 40 residues or less, 30 residues or less, 20 residues or less, or 10 residues or less, such as 9 residues or less, A peptide in which amino acids of 8 residues or less, 7 residues or less, 6 residues or less and 5 residues or less are linked is used as a ligand.
  • Peptides used as ligands are not particularly limited, but examples include cyclic peptides such as cyclic RGD sequence-containing peptides, insulin, glucagon-like peptide-1, vasopressin, oxytocin Is mentioned.
  • cyclic RGD sequence-containing peptide (hereinafter also referred to as “cRGD” or “cRGD peptide”) is a peptide having at least one arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence and forming a cyclic structure. is there.
  • the above “cyclic peptides” are preferably peptides having the same or similar ligand properties, in particular target specificity, as cyclic RGD sequence-containing peptides.
  • the sequence length of the cyclic peptide is not particularly limited, but from the viewpoint of forming a ring structure, the number of amino acids is preferably 3 or more, for example, 4 to 15 or 5 to 10.
  • RGD sequence binds to and activates integrin molecules (especially ⁇ V ⁇ 3 and ⁇ V ⁇ 5 ) that are cell adhesion molecules on the cell surface, and induces cell-side endocytosis. And the use of RGD peptides as tumor targeting ligands is also known.
  • any cRGD peptide can be used as long as it has such an RGD sequence and forms a cyclic structure.
  • sequence length of the cRGD peptide is not particularly limited, but from the viewpoint of forming a ring structure, the number of amino acids is preferably 3 or more, for example, 4 to 15 or 5 to 10.
  • the types of amino acids constituting the portion other than the RGD sequence and their sequences are arbitrary. Therefore, the cRGD peptide may contain other kinds of natural amino acids and synthetic amino acids in addition to the 20 kinds of amino acids constituting the living body. However, amino acids and sequences thereof that do not undesirably affect the subject to which the nucleic acid complex of the present invention is administered, do not substantially impair the activity of the complex, and do not hinder the function of the RGD sequence are preferred.
  • the cRGD peptide has at least one RGD sequence. In one embodiment of the invention, the cRGD peptide has one RGD sequence.
  • cRGD peptides include, but are not limited to, peptides having the following amino acid sequences: cRGDfK (Arg-Gly-Asp-D-Phe-Lys) (SEQ ID NO: 53).
  • the cRGD peptide can be synthesized by a known automatic synthesizer, or a commercially available product (for example, “Cyclo ( ⁇ RGDfK)” manufactured by Selleck) can also be used.
  • aptamers can also be used as ligands (hereinafter also referred to as “aptamer ligands”).
  • An aptamer is a nucleic acid molecule that specifically binds to a specific molecule, typically by means other than hybridization, and usually binds specifically to a target molecule by randomly changing the sequence of the nucleic acid. Can be obtained by using a method known to those skilled in the art (for example, SELEX method or one-step selection method). Therefore, by using an aptamer that specifically binds to a target molecule as a ligand, the nucleic acid complex of the present invention can be bound to a target cell or tissue in which the target molecule exists (typically, the target molecule is on the surface). It can be delivered specifically to existing target cells and target tissues).
  • sugar chains can also be used as ligands.
  • the term “sugar chain” refers to a molecule in which monosaccharides such as glucose, galactose, mannose, fucose, xylose, N-acetylglucosamine, N-acetylgalactosamine, sialic acid, and derivatives thereof are linked in a chain by glycosidic bonds. Point to.
  • the sugar chain used as the ligand (hereinafter also referred to as “sugar chain ligand”) is not particularly limited, and examples thereof include N-acetylgalactosamine, hyaluronic acid, dextrin and cellulose.
  • Lipids can also be used as the ligand.
  • lipid includes simple lipids, complex lipids and derived lipids.
  • the lipid used as the ligand (hereinafter also referred to as “lipid ligand”) is not particularly limited, and examples thereof include phospholipids and glycolipids that are complex lipids, and fatty acids and steroids that are derived lipids.
  • Examples of phospholipids are sphingophospholipids, examples of glycolipids are sphingoglycolipids, examples of fatty acids are linear or branched C 4 to C 30 saturated or unsaturated fatty acids such as lauric acid, myristic Examples include acids, palmitic acid, stearic acid, oleic acid, linolenic acid, and docosanoic acid. Examples of steroids include cholesterol. Further, vitamin E (tocopherol), which is a fat-soluble vitamin, can also be mentioned as an example of a lipid that can be used as a ligand.
  • vitamin E tocopherol
  • the tocopherol is, for example, selected from the group consisting of ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol, ⁇ -tocopherol and ⁇ -tocopherol.
  • an analog of tocopherol can also be used.
  • analog refers to a compound having the same or similar basic skeleton as a certain compound and having a similar structure and properties, particularly a compound having the same or similar ligand characteristics.
  • Analogs include, for example, biosynthetic intermediates, metabolites, compounds with substituents, and the like. One skilled in the art can determine whether a compound is an analog of another compound.
  • tocopherol analog refers to an unsaturated analog of tocopherol (eg, tocotrienol such as ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, ⁇ -tocotrienol, etc.), tocopherol or a pharmaceutical agent of the above unsaturated analog.
  • esters eg, acetate, succinate, propionate
  • pharmaceutically acceptable salts thereof eg, sodium, potassium, calcium, magnesium.
  • the above salts can be formed especially in the case of esters with dicarboxylic acids such as succinic acid.
  • the tocopherol analogs described above can have the same or similar ligand properties, especially target specificity, as tocopherols.
  • a low molecular weight or low molecular weight compound can also be used as the ligand.
  • the low molecular weight / low molecular compound (hereinafter also referred to as “low molecular ligand”) that can be used as a ligand is not particularly limited, and examples thereof include anisamide, tirofiban, and 2-pyrrolidin-1-yl-N— [ 4- [4- (2-Pyrrolidin-1-yl-acetylamino) -benzyl] -phenyl] -acetamide.
  • Biomolecules / bioactive molecules can also be used as the ligand.
  • the biomolecule / bioactive molecule that can be used as a ligand (hereinafter also referred to as “biomolecule / bioactive molecule ligand”) is particularly limited as long as it is a molecule related to the living body or a molecule having an activity that can affect the living body. Examples of such are folic acid, anandamide, and spermine.
  • folic acid is a vitamin (water-soluble vitamin) that all cells need for DNA synthesis. It has been reported that folate receptors are overexpressed in many cancer cells, and folic acid is therefore widely used as a cancer targeting ligand. It has also been reported that a complex of folic acid and a folic acid receptor is taken up into cells by endocytosis, and that many cancer cells have a high uptake of folic acid.
  • such folic acid can also be used as the above-mentioned ligand.
  • commercially available folic acid for example, “folic acid” manufactured by Sigma-Aldrich
  • folic acid manufactured by Sigma-Aldrich
  • an analogue of folic acid can also be used.
  • folic acid analog refers to a compound having a fused pyrimidine heterocycle linked to an amino acid moiety (preferably a glutamic acid moiety) via a benzoyl moiety, that is, an amino acid moiety, a benzoyl moiety and a fused pyrimidine heterocycle.
  • an amino acid moiety preferably a glutamic acid moiety
  • a benzoyl moiety that is, an amino acid moiety, a benzoyl moiety and a fused pyrimidine heterocycle.
  • fused pyrimidine heterocycle include a pyrimidine obtained by further fusing a 5- or 6-membered heterocycle such as pteridine or bicyclic pyrrolopyrimidine.
  • Examples of folic acid or its analogs are based on the folic acid (pteroyl-glutamic acid) backbone, optionally substituted folic acid, folinic acid, pteropolyglutamic acid, and folic acid receptor binding pteridines such as tetrahydropterin, dihydrofolic acid , Tetrahydrofolic acid, deaza and dideaza analogs.
  • the folic acid analog can have the same or similar ligand properties, particularly target specificity, as folic acid.
  • nucleic acid / bioactive molecule ligands in consideration of information on each receptor, for example, the expression level and expression specificity in various tissues and cells, and the like.
  • an appropriate biomolecule / bioactive molecule ligand can be appropriately selected.
  • the ligand is selected from the group consisting of a protein ligand, a peptide ligand, an aptamer ligand, a sugar chain ligand, a lipid ligand, a small molecule ligand, and a biomolecule / bioactive molecule ligand, more preferably It is selected from the group consisting of peptide ligands, sugar chain ligands, lipid ligands, small molecule ligands and biomolecule / bioactive molecule ligands.
  • the ligand is a cyclic peptide, such as a cyclic arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence-containing peptide, folic acid or an analogue thereof, vitamin E (tocopherol) or an analogue thereof, stearic acid, docosane Selected from acids, anandamide, spermine, cholesterol, anisamide or N-acetylgalactosamine.
  • RGD cyclic arginine-glycine-aspartic acid
  • the ligand is selected from a peptide ligand, a biomolecule / bioactive molecule ligand or a lipid ligand, such as a cyclic RGD sequence-containing peptide, folic acid or vitamin E (tocopherol).
  • the nucleic acid complex of the present invention having the ligand as described above uses a cell or tissue having a receptor to which the ligand can specifically bind as a target cell or tissue (for example, on the surface thereof). Can do.
  • the type of the target cell or target tissue is not particularly limited, and an appropriate cell or tissue can be targeted according to the purpose.
  • the target cell may be a cell that forms a tissue or an organ.
  • the target cell may be a single cell such as a leukemia cell, and infiltrate a cell that forms a tumor in a tissue, such as a solid cancer cell, a lymphoid tissue, or another tissue It may be a cell or the like (hereinafter, these cells are collectively referred to simply as “cancer cells”).
  • a cell-specific target ligand or a tissue-specific target ligand by using a cell-specific target ligand or a tissue-specific target ligand, it is possible to target and deliver the nucleic acid complex to a target cell or target tissue.
  • cell-specific target ligands or tissue-specific target ligands ligands specific to various cells and tissues are known to those skilled in the art, and in the present invention, they can be appropriately used depending on the purpose. .
  • the ligands can also be classified based on their function (target specificity), for example, the cancer cell-specific target ligand or cancer tissue-specific target ligand (collectively “cancer target ligand”). Also referred to as a liver-targeting ligand specific to the liver.
  • the cancer target ligand is not particularly limited as long as it is a ligand specific to cancerous cells or cancerous tissues.
  • ligands are also well known to those skilled in the art.
  • integrin high affinity ligands for example, the above-mentioned cyclic arginine-glycine-aspartic acid (RGD) sequence-containing peptides
  • folate receptor high affinity ligands for example, folic acid or its analog
  • transferrin receptor high affinity ligand for example, CD34 high affinity ligand
  • PSMA prostate specific membrane antigen
  • the liver target ligand is not particularly limited as long as it is a ligand specific to hepatocytes or liver.
  • ligands are also well known to those skilled in the art and include, for example, ⁇ -TPP high affinity ligands (eg, tocopherol or analogs thereof), asialoglycoprotein receptor high affinity ligands (eg, N- Acetylglucosamine).
  • the nucleic acid complex consists only of an active part, a carrier part and a ligand. In another embodiment of the invention, the nucleic acid complex consists only of an active moiety, a carrier moiety, a ligand and a linker.
  • Antisense effect refers to hybridization of a target transcript (RNA sense strand) with, for example, a DNA strand complementary to a partial sequence thereof, or a strand that is usually designed to produce an antisense effect. Means suppression of target gene expression or target transcript level. In some cases, splicing function conversion effects such as translational inhibition or exon skipping that may occur by coating the transcript with a hybridization product, and / or transcription that may occur due to recognition of a hybridized portion. Said suppression caused by degradation of the product may also be included.
  • target gene or “target transcript” whose expression is suppressed by the antisense effect is not particularly limited, and examples thereof include genes whose expression is enhanced in various diseases.
  • the target gene is an oncogene or a gene associated with dyslipidemia.
  • target gene transcript refers to mRNA transcribed from genomic DNA encoding the target gene, and includes mRNA that has not undergone base modification, mRNA precursors that have not undergone splicing, and the like.
  • a “transcript” is any RNA synthesized by a DNA-dependent RNA polymerase.
  • nucleic acid complex refers to a nucleic acid complex comprising at least two polynucleotide strands, each of which is a naturally occurring substance.
  • polynucleotide itself that is, the whole polynucleotide
  • the polynucleotide means a substance that does not occur in nature and / or a substance that does not substantially occur in nature.
  • the nucleic acid complex is a double-stranded nucleic acid complex.
  • adenine (A) is complementary to thymidine (T)
  • adenine (A) is complementary to uracil (U).
  • a nucleotide at a position of a polynucleotide of the active moiety can form a base pair with a nucleotide at a position of a transcript of a target gene through hydrogen bonding
  • the polynucleotide and the transcript are Considered complementary in position.
  • both polynucleotides are complementary at all positions in the base sequence. There is no need. Also in the present invention, in order for the nucleic acid complex to exert its function, it does not have to be complementary at all positions in the base sequence, and mismatches at some positions are allowed.
  • the base sequence of the target transcript and the base sequence of the polynucleotide in the above (i) active portion need not be completely complementary, that is, they need not be complementary at all positions. .
  • the base sequence of the target transcript and the polynucleotide base sequence in the active part are at least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more, or 100%) may be complementary.
  • 70% nucleotides are complementary, they have 70% “complementarity”. In a preferred embodiment of the present invention, both are completely complementary, i.e. have 100% complementarity.
  • complementarity of two polynucleotides is the double-stranded region (when mismatches are included) when both have different lengths. Can be calculated as complementarity in the entire double-stranded region including them).
  • sequence complementarity can be determined by using a BLAST program or the like.
  • a person skilled in the art can easily design an antisense nucleic acid complementary to the target transcript based on, for example, information on the base sequence of the target gene.
  • the polynucleotide in the active portion and the polynucleotide in the carrier portion can be “annealed” based on the above complementarity to form a double strand.
  • a person skilled in the art can easily determine conditions (temperature, salt concentration, etc.) under which two nucleic acid strands can be annealed.
  • nucleic acid refers to a natural nucleic acid, a non-natural nucleic acid and / or a nucleic acid analog, but “nucleic acid” may mean a monomer nucleotide, and is an oligo composed of a plurality of monomers. It may also mean a nucleotide or a polynucleotide.
  • nucleic acid strand is also used herein to refer to an oligonucleotide or polynucleotide.
  • Nucleic acid strands may be prepared in whole or in part by chemical synthesis methods such as the use of automated synthesizers, and are not limited to polymerase, ligase or restriction enzyme reactions, but may be prepared by enzymatic treatment. Good.
  • the polynucleotide in the nucleic acid complex of the invention is artificially prepared by chemical synthesis or enzymatic reaction.
  • the “natural nucleic acid” is a natural world in which nucleotides are the basic units and phosphate is polymerized by forming a diester-bonded bridge between the 3 ′ and 5 ′ carbons of each sugar between the nucleotides.
  • non-natural nucleic acid refers to a nucleic acid containing or consisting of a non-natural nucleotide.
  • non-natural nucleotide refers to an artificially constructed or artificially chemically modified nucleotide that does not exist in nature and has similar properties and / or structures to the naturally occurring nucleotide.
  • Examples include abasic nucleosides, arabino nucleosides, 2'-deoxyuridines, ⁇ -deoxyribonucleosides, ⁇ -L-deoxyribonucleosides, and other nucleotides with sugar modifications. Furthermore, substituted pentasaccharide (2′-O-methylribose, 2′-deoxy-2′-fluororibose, 3′-O-methylribose, 1 ′, 2′-deoxyribose), arabinose, substituted arabinose sugar; Nucleotides with substituted hexose and alpha-anomeric sugar modifications are included.
  • Non-natural nucleotides also include nucleotides that include artificially constructed base analogs or artificially chemically modified bases (modified bases).
  • Base analog includes, for example, 2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 5-substituted-2-oxo (1H) -pyridin-3-yl group, 2-amino-6- (2 -Thiazolyl) purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-thiazolyl) purin-9-yl group, 2-amino-6- (2-oxazolyl) purin-9-yl group and the like.
  • Modified bases include, for example, modified pyrimidines (eg, 5-hydroxycytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil), modified purines (eg, 6-methyladenine, 6-thioguanosine) and other heterocycles Examples include bases. Chemically modified nucleic acids such as methylphosphonate DNA / RNA, phosphorothioate DNA / RNA (ie, DNA / RNA having a thiophosphate bond), phosphoramidate DNA / RNA, 2′-O-methyl DNA / RNA, Nucleic acid analogs can also be included.
  • modified pyrimidines eg, 5-hydroxycytosine, 5-fluorouracil, 4-thiouracil
  • modified purines eg, 6-methyladenine, 6-thioguanosine
  • other heterocycles examples include bases. Chemically modified nucleic acids such as methylphosphonate DNA / RNA, phosphorothioate DNA / RNA (ie, DNA /
  • nucleic acid analog refers to an artificially constructed compound having a structure and / or property similar to that of a natural nucleic acid. Examples thereof include peptide nucleic acids (PNA: Peptide Nucleic Acid), peptide nucleic acids having a phosphate group (PHONA), cross-linked nucleic acids (BNA / LNA: Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid), morpholino nucleic acids, and the like. These nucleic acid analogs may further be subjected to the chemical modification as described above.
  • PNA Peptide Nucleic Acid
  • PONA peptide nucleic acids having a phosphate group
  • BNA / LNA Bridged Nucleic Acid / Locked Nucleic Acid
  • morpholino nucleic acids and the like.
  • the nucleic acid complex of the present invention includes, in an active part and / or a carrier part, a nucleic acid (polynucleotide) containing or combining various nucleic acids as described above as appropriate.
  • the polynucleotide in the active part contains at least a “chemically modified deoxyribonucleotide and optionally a nucleic acid analog” as a constituent unit.
  • This terminology means that the polynucleotide has deoxyribonucleotides that are either chemically modified or not, and optionally further nucleic acid analogs.
  • the polynucleotide in the carrier portion includes at least “an optionally modified nucleotide and optionally a nucleic acid analog” as a constituent unit.
  • This terminology means that the polynucleotide has nucleotides that are either chemically modified or not, and may optionally further comprise a nucleic acid analog.
  • the nucleotide which is an essential constituent unit may be deoxyribonucleotide, ribonucleotide, or a combination thereof.
  • the nucleotides may be independently chemically modified or not chemically modified.
  • the length of the polynucleotide in the active portion is not particularly limited, but is preferably at least 8 bases, at least 10 bases, at least 12 bases, at least 13 bases, at least 14 bases, or at least 15 bases. It is a base.
  • the length is preferably 100 bases or less, 35 bases or less, 25 bases or less, 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, or 17 bases or less.
  • the length range is preferably 10 to 35 bases, more preferably 12 to 25 bases, and still more preferably 13 to 20 bases.
  • the length is selected according to the strength of the antisense effect by the nucleic acid strand against the target, cost, and other factors such as synthesis yield.
  • the polynucleotide in the active moiety is an antisense polynucleotide that is at least partially complementary to the target transcript, and comprises at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides. It can be a polynucleotide having a region to include.
  • “At least 4 consecutive chemically modified deoxyribonucleotides” can be a region comprising 4 to 20 bases of consecutive deoxyribonucleotides (which may be chemically modified), preferably 5 to 16 It is a region containing deoxyribonucleotides (which may be chemically modified) of bases, more preferably 6 to 14 bases, for example, 7 to 13 bases of continuous deoxyribonucleotides (which may be chemically modified). It is an area.
  • This region contains nucleotides that are recognized by RNaseH that cleaves RNA strands when hybridized to ribonucleotides, such as natural deoxyribonucleotides or deoxyribonucleotides that are chemically modified only for phosphate-binding moieties (for example, phosphorothioated deoxyribonucleotides). Nucleotides) can also be used. Further, in one embodiment of the present invention, in the deoxyribonucleotide, each nucleotide is modified independently of each other, and modifications available for deoxyribonucleotides are known in the art.
  • nucleotide refers to a compound in which the sugar moiety of a nucleoside forms an ester with phosphoric acid
  • nucleoside refers to a nitrogen-containing organic base such as a purine base or a pyrimidine base. It means a glycoside compound in which a reducing group of sugar is bound by a glycosidic bond.
  • deoxyribonucleotide is a nucleotide whose sugar moiety is composed of D-2-deoxyribose
  • ribonucleotide is a nucleotide whose sugar moiety is composed of D-ribose
  • Polynucleotide is a chain in which a plurality of nucleotides are polymerized in which a nucleotide is a basic unit and phosphoric acid is linked by forming a diester bond bridge between the 3 ′ and 5 ′ carbons of the sugar between each nucleotide. Means a solid material. This also includes so-called oligonucleotides.
  • a nucleotide (in a polymerized state) contained as a structural unit in such a polynucleotide is also referred to as “nucleotide”.
  • deoxyribonucleotide means a naturally occurring deoxyribonucleotide.
  • the deoxyribonucleotide may be chemically modified in its base, sugar or phosphate bond.
  • ribonucleotide means a naturally occurring ribonucleotide.
  • the ribonucleotide may be chemically modified at its base, sugar or phosphate bond. Examples of the chemical modification are as described above.
  • the chemically modified nucleotide may have a modified base site.
  • modification of the base site include cytosine 5-methylation, 5-fluorination, 5-bromination, 5-iodination, N4-methylation, thymidine 5-demethylation, 5-fluorination, 5- Examples include bromination, 5-iodination, N6-methylation of adenine, 8-bromination, N2-methylation of guanine, and 8-bromination.
  • the phosphodiester binding site may be modified.
  • Examples of the modification of the phosphoric acid diester binding site include phosphorothioation, methylphosphonation, methylthiophosphonation, chiral-methylphosphonation, phosphorodithioate, and phosphoramidate formation. From the viewpoint of being present, phosphorothioation (thiophosphate bond) is preferred. Further, such chemical modification of the base site and chemical modification of the phosphodiester binding site may be applied to the same nucleotide in combination of a plurality of types.
  • nucleotide for example, deoxyribonucleotide, ribonucleotide
  • the chemical modification as described above may be applied to the same nucleotide in combination of a plurality of types.
  • the chemical modification as described above does not affect the base pair formation, and therefore, it is considered that the complementarity between nucleotides and the complementarity between polynucleotides are not affected. That is, usually two complementary nucleotides can maintain the ability to form base pairs after being chemically modified and can therefore still be complementary.
  • the antisense effect of the nucleic acid complex after chemical modification is measured, and the obtained measurement value is not significantly lower than that of the nucleic acid complex before chemical modification (for example, after chemical modification). If the measured value of the nucleic acid complex is 30% or more of the measured value of the nucleic acid complex before chemical modification), the chemical modification can be evaluated.
  • the measurement of the antisense effect is performed, for example, by introducing a test nucleic acid compound into a cell or the like and expressing the target gene expression level (mRNA amount, cDNA amount, etc.) in the cell or the like suppressed by the antisense effect exerted by the test nucleic acid compound.
  • the amount of protein etc.) can be performed by appropriately utilizing known methods such as Northern blotting, quantitative PCR, Western blotting and the like.
  • a test nucleic acid compound is introduced into a cell, and cell growth suppression caused by target gene expression suppression exerted by the test nucleic acid compound is changed to WST (or similar dyes MTT, XTT, MTS, etc.) to formazan dye.
  • WST or similar dyes MTT, XTT, MTS, etc.
  • the measurement can be performed by using a known method such as a colorimetric method for measuring the reducing enzyme activity, a measurement of BrdU incorporation, or flow cytometry.
  • the polynucleotide of the nucleic acid complex of the present invention can optionally include a nucleic acid analog.
  • nucleic acid analogs used in the present invention include the above-mentioned BNA / LNA, as well as hexitol nucleic acid (HNA), cyclohexene nucleic acid (CeNA), glycol nucleic acid (GNA), threose nucleic acid (TNA), tricyclo -DNA (tcDNA) and the like.
  • the nucleic acid analog is BNA / LNA, preferably BNA represented by the following formula (1).
  • Base is an aromatic heterocyclic group or aromatic hydrocarbon ring group which may have a substituent, for example, a base part of a natural nucleoside (purine base, pyrimidine base) or non-natural Indicates the base site of a type (chemical modification) nucleoside.
  • R 1 and R 2 which may be the same or different, are a hydrogen atom, a hydroxyl-protecting group for nucleic acid synthesis, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl group, a sulfonyl group, and a silyl group.
  • R 3 and R 4 may be the same or different, Hydroxyl group protected with a protective group for synthesis, mercapto group, mercapto group protected with a protective group for nucleic acid synthesis, amino group, alkoxy group having 1 to 5 carbon atoms, alkylthio group having 1 to 5 carbon atoms, 1 to carbon atoms 6 represents a cyanoalkoxy group having 6 or an amino group substituted with an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms).
  • LNA and BNA include a form (nucleotide) in which a phosphate group is bonded to the nucleoside. That is, in this specification, when the terms “LNA” and “BNA” are used, it also means LNA / BNA incorporated as a nucleotide in a polynucleotide.
  • BNA for example, LNA ( ⁇ -L-methyleneoxy (4′-CH 2 —O-2), also called Locked Nucleic Acid (registered trademark), 2 ′, 4′-BNA) is used.
  • ⁇ -D-methyleneoxy (4'-CH 2 -O-2') BNA ethyleneoxy (4 '-(CH 2 ) 2 -O-2'), also referred to as ENA BNA
  • ⁇ -D-thio (4′-CH 2 —S-2 ′) BNA
  • aminooxy (4′-CH 2 —ON (R 3 ) -2 ′) BNA 2 ′, 4′- Oxyamino (4′-CH 2 —N (R 3 ) —O-2 ′) BNA, also referred to as BNANC, 2 ′, 4′-BNACOC, 3′amino-2 ′, 4′-BNA, 5′- (4'-CH (CH 3 ) -O-2 ') BNA
  • the nucleic acid analog (eg, LNA / BNA) may be further subjected to the above-described chemical modification (or combination of chemical modifications).
  • a nucleic acid analog (eg LNA / BNA) is incorporated into the polynucleotide as a phosphorothioated nucleotide.
  • a person skilled in the art can appropriately select and apply a chemical modification possible for each according to the type of nucleotide (for example, deoxyribonucleotide, ribonucleotide) and the type of nucleic acid analog.
  • nucleotide for example, deoxyribonucleotide, ribonucleotide
  • nucleic acid analog for example, deoxyribonucleotide, ribonucleotide
  • a wing region comprising one or more chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs comprises the at least four or more consecutive chemically modified deoxyribonucleotides. It is arranged at the 5 ′ end side and / or 3 ′ end side of the region (hereinafter also referred to as “DNA gap region”).
  • a region comprising a chemically modified nucleotide and / or nucleic acid analog located at the 5 ′ end of the DNA gap region (hereinafter also referred to as “5 ′ wing region”), and the DNA gap region
  • the regions containing chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs (hereinafter also referred to as “3 ′ wing regions”) arranged at the 3 ′ end of each are independent, and chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs It suffices to contain at least one kind, and in addition to such chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs, natural nucleotides (deoxyribonucleotides or ribonucleotides) may also be included.
  • the chain lengths of the 5 ′ wing region and the 3 ′ wing region can be independently usually 1 to 10 bases, preferably 1 to 7 bases, or 2 to 5 bases, for example 2 to 4 bases. .
  • the type, number, and position of chemically modified nucleotides and / or nucleic acid analogs and natural nucleotides in the 5 ′ wing region and the 3 ′ wing region affect the antisense effect exhibited by the nucleic acid complex in an embodiment. Therefore, the preferred embodiment may vary depending on the sequence and the like. Although it cannot be generally stated, a person skilled in the art can determine a preferred embodiment in consideration of the description of a literature relating to an antisense method such as that described in US Pat. No. 8,299,039 to Tachas et al. .
  • the nucleic acid after chemical modification and / or after introduction of a nucleic acid analog preferably an anti-antibodies possessed by a double-stranded nucleic acid. If the sense effect is measured and the resulting measurements are not significantly lower than those of these previous nucleic acids, preferably double stranded nucleic acids, the chemical modification and / or nucleic acid analog is in a preferred embodiment. It can be evaluated that there is.
  • the antisense method consisting only of RNA and LNA which has been tried in the past, suppressed translation by binding to target mRNA, but its effect is generally inferior. It was enough.
  • the antisense method consisting only of DNA since it becomes a double-stranded structure consisting of DNA and RNA when bound to the target gene, it is expected to have a strong target gene expression suppression effect by cleaving mRNA by becoming the target of RNaseH. Although it was possible, the actual effect was still inadequate because the binding to the target gene itself was weak.
  • DNA or chemically modified DNA having a chain length of at least 4 bases or more is arranged at the center, and LNA (or other DNA) having strong binding ability to RNA (ie, target transcript)
  • LNA or other DNA having strong binding ability to RNA (ie, target transcript)
  • the 5 'wing region and the 3' wing region each contain a nucleic acid analog.
  • the 5 'wing region and the 3' wing region each comprise a nucleic acid analog.
  • the nucleic acid analog may be further chemically modified.
  • Each of the 5 'wing region and the 3' wing region may contain BNA / LNA.
  • LNA / BNA may be further chemically modified.
  • LNA / BNA is phosphorothiated.
  • the polynucleotide in the active moiety consists of deoxyribonucleotides that may be chemically modified.
  • the polynucleotide may consist of phosphorothioated deoxyribonucleotides, in which case the deoxyribonucleotides may be further chemically modified.
  • the polynucleotide includes a phosphodiester bond (PO type bond) and a phosphorothioated (PS) bond (PS type bond) in which one of the oxygen atoms of the phosphate group is replaced with a sulfur atom as an internucleic acid bond.
  • Random, alternating, block, gradient or a combination thereof preferably consisting of deoxyribonucleotides, preferably in an alternating arrangement, in which case the deoxyribonucleotides may have undergone further chemical modifications .
  • Examples of random, alternating, block, and gradient arrangement of PO type bonds and PS type bonds are shown below.
  • A represents a deoxyribonucleoside (or nucleic acid analog) which may be chemically modified
  • po represents a PO-type bond
  • ps represents a PS-type bond.
  • the polynucleotide in the active moiety consists of deoxyribonucleotides and nucleic acid analogs that may be chemically modified.
  • the nucleic acid analog may be further chemically modified.
  • the polynucleotide in the active moiety comprises at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides and a 5 ′ wing region located 5 ′ and a 3 ′ located 3 ′. It consists of a wing area.
  • part or all of the deoxyribonucleotide may be chemically modified.
  • part or all of the deoxyribonucleotide is more preferably phosphorothioated.
  • the deoxyribonucleotide may have PO-type bonds and PS-type bonds as internucleic acid bonds in an arrangement of random, alternating, block, gradient, or a combination thereof, preferably in an alternating arrangement.
  • the 5 'wing region and the 3' wing region consist of phosphorothioated nucleic acid analogs, more preferably phosphorothioated LNA / BNA.
  • the polynucleotide in the active moiety does not contain ribonucleotides or contains neither ribonucleotides nor chemically modified ribonucleotides.
  • the polynucleotide in the carrier portion is a polynucleotide that is at least partially complementary to the polynucleotide in the active portion described above.
  • the base sequence of the polynucleotide in the carrier portion and the base sequence of the polynucleotide in the active portion need not be completely complementary as long as they can at least partially form a double strand, for example , At least 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 90% or more (for example, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or more).
  • both polynucleotides have 100% complementarity.
  • the complementarity is calculated as the complementarity in the double-stranded forming region (entire double-stranded forming region) as described above.
  • the entire active portion polynucleotide is completely complementary to a portion of the carrier portion polynucleotide. The completely complementary portion becomes a double-stranded forming region.
  • the entire polynucleotide of the carrier portion is completely complementary to a part of the polynucleotide of the active portion, and is completely complementary This part becomes a double-stranded forming region.
  • both polynucleotides are completely complementary throughout.
  • the polynucleotide in the carrier portion includes a nucleotide that may be chemically modified as described above, and optionally a nucleic acid analog. From the standpoint of high resistance to nucleolytic enzymes such as RNases, nucleotides (eg, deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides) in the carrier moiety are also chemically modified as described for the polynucleotide in the active moiety. You may have received it.
  • the polynucleotide can contain deoxyribonucleotides that may be chemically modified and / or ribonucleotides that may be chemically modified as nucleotides.
  • the polynucleotide may include deoxyribonucleotides that may be chemically modified and ribonucleotides that may be chemically modified as nucleotides.
  • the number of deoxyribonucleotides and ribonucleotides in the polynucleotide is not particularly limited.
  • the polynucleotide may contain deoxyribonucleotides that may be chemically modified and ribonucleotides that may be chemically modified, which are alternately present.
  • one or more of the deoxyribonucleotides may be chemically modified and / or one or more of the ribonucleotides may be chemically modified.
  • the polynucleotide comprises one or more nucleotides with abasic nucleosides as chemically modified nucleotides.
  • the polynucleotide comprises one or more nucleotides that have been chemically modified for attachment to a ligand or linker.
  • the polynucleotide in the carrier moiety is not chemically modified. In another embodiment of the invention, the polynucleotide in the carrier moiety is not chemically modified, except for the building block to which the ligand is attached directly or through a linker. In one embodiment of the invention, the polynucleotide in the carrier moiety consists of deoxyribonucleotides. In one embodiment of the invention, the polynucleotide in the carrier moiety consists of deoxyribonucleotides, except for the building block to which the ligand is attached directly or via a linker.
  • the polynucleotide in the carrier moiety consists of deoxyribonucleotides and ribonucleotides, wherein the number of ribonucleotides is 1 or 2 and the ribonucleotides are, for example, 1 It is located at the ⁇ 35th, preferably 2-30th, 3-25th, 4-20th, or 5-15th position.
  • the polynucleotide in the carrier moiety is composed of deoxyribonucleotides and ribonucleotides, except for the structural unit to which the ligand is bound directly or via a linker, and the number of the ribonucleotides is one or two.
  • the ribonucleotide is present at the 1st to 35th positions, preferably the 2nd to 30th positions, the 3rd to 25th positions, the 4th to 20th positions, or the 5th to 15th positions from the 5 ′ end.
  • the polynucleotide in the carrier moiety consists of alternating chemically modified deoxyribonucleotides and optionally chemically modified ribonucleotides.
  • the polynucleotide in the carrier moiety may be chemically modified deoxyribonucleotides and chemically modified, except for the building blocks to which the ligand is attached directly or via a linker.
  • the structural unit (the structural unit to which the ligand is bound directly or via a linker) may be chemically modified for binding to the ligand or the linker, for example, binding to the ligand or the linker.
  • the polynucleotide in the carrier moiety consists of deoxyribonucleotides and one abasic nucleotide (eg, abasic ribonucleotide) that is further linked to a ligand or linker. Chemical modification of may be made.
  • the abasic nucleotide (which may be chemically modified for binding to a ligand or a linker) is a structural unit to which the ligand is bound directly or via a linker.
  • the polynucleotide is degraded by RNase H in a specific cell while suppressing degradation by RNase A or the like, until the carrier polynucleotide is delivered into the nucleus of the specific cell.
  • the polynucleotide in the carrier portion may contain a nucleic acid analog as described for the polynucleotide in the active portion.
  • the nucleic acid analog when the nucleic acid analog is included, the nucleic acid analog may be further chemically modified.
  • the polynucleotide in the carrier portion comprises a nucleic acid analog. In other embodiments of the invention, the polynucleotide in the carrier portion does not include nucleic acid analogs.
  • the number and position of the chemical modification and the nucleic acid analog may affect the antisense effect or the like exhibited by the nucleic acid complex in an embodiment, the number of the nucleic acid analog and the position of the chemical modification in the polynucleotide of the carrier portion.
  • the nucleic acid complex after chemical modification or after introduction of a nucleic acid analog. It can be identified by measuring the antisense effect of the body.
  • the polynucleotide in the carrier moiety is chemically modified nucleotide and / or nucleic acid-like in a region complementary to the 5 ′ wing region and / or the 3 ′ wing region of the polynucleotide of the active moiety.
  • a body for example, in the polynucleotide in the carrier moiety, the region complementary to the 5 ′ wing region and the 3 ′ wing region of the polynucleotide in the active moiety is a chemically modified nucleotide, such as a phosphorothioated 2′-O-methylated ribonucleoside. It can consist of nucleotides.
  • the region other than the region complementary to the wing region can be composed of, for example, deoxyribonucleotides and / or ribonucleotides that are not chemically modified (provided that the ligand is bound directly or via a linker).
  • the building block may be chemically modified for binding to the ligand or linker.
  • the ligand or linker is bound to a structural unit present in a region other than the region complementary to the wing region.
  • the length of the polynucleotide in the carrier portion is not particularly limited, but is at least 8 bases, at least 10 bases, at least 12 bases, at least 13 bases, at least 14 bases, at least 15 bases, or at least 16 bases.
  • the length is preferably 100 bases or less, 35 bases or less, 25 bases or less, 20 bases or less, 19 bases or less, 18 bases or less, or 17 bases or less.
  • the length range is preferably 10 to 35 bases, more preferably 12 to 25 bases, and still more preferably 13 to 20 bases. Usually, the length is selected depending on the effect on delivery to the target site, cost, and other factors such as synthesis yield.
  • the length of the polynucleotide in the active portion and the length of the polynucleotide in the carrier portion may be the same or different.
  • the length of the polynucleotide in the active portion is greater than the length of the polynucleotide in the carrier portion.
  • the length of the polynucleotide in the active portion is less than the length of the polynucleotide in the carrier portion.
  • the polynucleotide in the carrier moiety comprises at least one mismatch to the polynucleotide in the active moiety.
  • a “mismatch” is a position within a double-stranded forming region formed by annealing between a polynucleotide in the active portion and a polynucleotide in the carrier portion (hereinafter also simply referred to as “double-stranded forming region”). Means that no Watson-Crick base pair is formed between nucleotides of both polynucleotide strands.
  • the mismatch here refers to the same number of nucleotides and / or nucleic acid analogues (hereinafter collectively referred to as “nucleotides”) in the double-stranded forming region of the active portion polynucleotide and the carrier portion polynucleotide.
  • nucleotides nucleic acid analogues
  • mismatches and bulges (and / or overhangs) It does not preclude being at the same time.
  • the polynucleotide in the carrier portion contains at least one mismatch with the polynucleotide in the active portion
  • the polynucleotide in the active portion and the polynucleotide in the carrier portion have the same length in the double-stranded forming region. And the latter means that at least one nucleotide or the like that does not form a Watson-Crick base pair between both polynucleotides is contained in the double-stranded region.
  • mismatches include A vs G, C vs A, U vs C, A vs A, G vs G, C vs C, and U vs G, U vs C, U vs T, etc.
  • mismatch used here includes a position such that the thermodynamic stability of the duplex at a particular position is lower than the thermodynamic stability of the Watson-Crick base pair at that position. Or any transformation at that location that reduces the thermodynamic stability in the vicinity.
  • the polynucleotide in the carrier portion may contain at least one mismatch with the polynucleotide in the active portion.
  • the number of mismatches is not particularly limited as long as the formation of double-stranded nucleic acid is not hindered.
  • each mismatch may exist apart from each other or is continuous. Even if they exist, both may exist in combination.
  • the polynucleotide in the carrier moiety can contain one mismatch to the polynucleotide in the active moiety.
  • the position of the mismatch is not particularly limited as long as it can form a mismatch structure.
  • the polynucleotide of the active portion and the polynucleotide of the carrier portion each have a length of 10 to 35 bases, for example, the 5 ′ end of the double-stranded forming region (in the above region of the polynucleotide of the active portion)
  • a mismatch can be introduced at the 2-15th position, for example, at the 6-11th position (for example, 6, 7, 8, 9, 10 or 11th position) counting from the 5 ′ end.
  • the nucleic acid complex of the present invention has at least one mismatch
  • the carrier moiety is moderately cleaved (whether the carrier moiety polynucleotide is deoxyribonucleotide, ribonucleotide, or a combination thereof) and the active moiety
  • the polynucleotide of the active part promotes the formation of a good duplex with the target mRNA.
  • the polynucleotide in the active part and the polynucleotide in the carrier part are not completely complementary. However, as described above, in the present invention, both of them are not completely complementary. Good. In one preferred embodiment of the present invention, when the polynucleotide of the carrier moiety contains a mismatch, both polynucleotides have 100% complementarity in the double-stranded forming region excluding the mismatch moiety.
  • the polynucleotide in the carrier portion does not contain a mismatch.
  • At least one of the polynucleotides in the carrier portion as described above may be used instead of or in addition to forming the mismatch as described above.
  • Ribonucleotides can also be included. Ribonucleotides are generally less resistant to nucleolytic enzymes than deoxyribonucleotides (including chemically modified deoxyribonucleotides) and nucleic acid analogs, so that the cleavage of polynucleotides starting from the ribonucleotide introduction site in the carrier portion is moderately promoted. It is thought to get.
  • the polynucleotide in the carrier moiety comprises one or more ribonucleotides as building blocks.
  • the polynucleotide in the carrier moiety comprises at least one mismatch to the polynucleotide in the active moiety and comprises ribonucleotides as building blocks.
  • the polynucleotide in the carrier moiety comprises at least one mismatch to the polynucleotide in the active moiety and comprises ribonucleotides as building blocks and at least one of the ribonucleotides Form the mismatch.
  • the polynucleotide in the carrier moiety comprises at least one mismatch to the polynucleotide in the active moiety, and comprises abasic nucleotides (eg abasic ribonucleotides) as building blocks, At least one of the abasic nucleotides (eg, abasic ribonucleotide) forms the mismatch.
  • a polynucleotide in the carrier moiety may have a G vs U mismatch (active moiety is G and carrier moiety U) or a G vs abasic nucleotide mismatch (active moiety is G;
  • the carrier moiety can contain one abasic nucleotide).
  • the position of the ribonucleotide in the polynucleotide of the carrier part is not particularly limited.
  • the polynucleotide has a length of 10 to 35 bases, it is 1 to 35, for example, 2 to 30, 3 to 25, 4 to 20, 5 to 15 from the 5 ′ end.
  • Ribonucleotides can be included at positions 6-11 (eg, 6, 7, 8, 9, 10 or 11).
  • the nucleic acid complex can have an overhang.
  • overhang refers to a non-base-paired nucleotide (chemically modified nucleotide and non-base-paired nucleotide) that arises from a single-stranded region where one strand extends beyond the end of the complementary other strand forming a duplex. (Or nucleic acid analog).
  • Each overhang contains at least one nucleotide (chemically modified nucleotide and / or nucleic acid analog).
  • each overhang is a two nucleotide overhang.
  • the nucleotide constituting the overhang can be arbitrarily selected.
  • the overhanging nucleotide may or may not base pair with the target transcript. Examples of the two nucleotide overhangs include, but are not limited to, UU, TT, AA, GG, CC, AC, CA, AG, GA, GC and CG.
  • the positions of the overhangs include the 5 ′ end of the polynucleotide in the active portion, the 3 ′ end of the polynucleotide in the active portion, the 5 ′ end and 3 ′ end of the polynucleotide in the active portion, and the 5 ′ end of the polynucleotide in the carrier portion.
  • the nucleic acid complex does not contain an overhang.
  • the polynucleotide of the carrier moiety comprises at least four consecutive chemically modified deoxyribonucleotides, as described for the active moiety polynucleotide, 5 ′ side thereof. And / or a 3 ′ wing region located on the 3 ′ side thereof.
  • the polynucleotide in the carrier moiety consists only of deoxyribonucleotides, except for the structural unit to which the ligand is bound directly or via a linker.
  • deoxyribonucleotides may be chemically modified or not chemically modified.
  • the nucleic acid complex can satisfactorily suppress the level of the target transcript, which is considered to be due to the following mechanism: DNA formed by the polynucleotide in the active part and the polynucleotide in the carrier part -It is recognized by DNase until the DNA duplex is delivered to the target transcript, and the polynucleotide in the carrier part is degraded by the DNase. Thereafter, the polynucleotide in the remaining active part forms a DNA-RNA duplex with the target transcript, and this part is recognized and degraded by RNaseH.
  • the polynucleotide in the carrier portion does not contain ribonucleotides.
  • the deoxyribonucleotides in the carrier moiety polynucleotide are not modified.
  • the ribonucleotides in the polynucleotide of the carrier moiety are not modified.
  • the polynucleotide of the carrier moiety has only a phosphodiester bond (PO-type bond) as an internucleic acid bond.
  • the nucleic acid complex is a nucleic acid complex for decreasing the expression of a target gene in a cell or a mammal.
  • the nucleic acid complex suppresses the expression of a target gene (preferably a cancer gene or a gene associated with dyslipidemia) in a target cell (preferably a cancer cell or a hepatocyte). By doing so, it is a nucleic acid complex for suppressing the proliferation of the target cell.
  • a cell associated with enhanced expression of the target gene can be used as a target cell.
  • the nucleic acid complex is a nucleic acid complex for suppressing the expression of a target gene in a target tissue and / or a target site.
  • the polynucleotide in the active portion is the antisense strand that is complementary to any region of the target gene mRNA.
  • the target gene is human bcl-2.
  • the target gene is human BCR-ABL.
  • the target gene is an APOB gene.
  • the polynucleotide in the active moiety is an antisense strand that is complementary to any region of a transcript that does not encode the target protein, eg, a target non-coding RNA.
  • the target non-coding RNA is a human or mouse translocation-associated lung adenocarcinoma transcript (MALAT1).
  • the polynucleotide (i) in the active moiety is a polynucleotide selected from the following (a) to (d): (A) a polynucleotide having the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, 5, 41, 42, 45 or 49, (B) a polynucleotide having a sequence identity of 70% or more with the polynucleotide of (a) above, (C) a polynucleotide in which a small number of nucleotides of the polynucleotide of (a) are substituted, deleted, added and / or inserted; (D) A polynucleotide comprising the polynucleotide of any one of (a) to (c) above as a partial sequence.
  • the polynucleotide (b) is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, particularly preferably 95% or more, with the base sequence of the polynucleotide (a). For example, having a sequence identity of 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more.
  • the polynucleotide (b) has an activity of suppressing the expression of the target transcript.
  • the polynucleotide (c) is a small number, preferably 1 to several, such as 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 or It can be a polynucleotide with 10 nucleotides substituted, deleted, added and / or inserted.
  • the polynucleotide (c) has an activity of suppressing the expression of the target transcript.
  • the polynucleotide (d) is a polynucleotide containing any of the polynucleotides (a) to (c) as a partial sequence, and preferably has an activity of suppressing the expression of the target transcript.
  • the length of the polynucleotide (d) is 8 to 100 bases.
  • the length is at least 10 bases, at least 12 bases, or at least 13 bases.
  • the length may be 100 bases or less, 35 bases or less, 25 bases or less, or 20 bases or less.
  • sequence identity with respect to a base sequence means that both base sequences are aligned so that the bases of the two base sequences to be compared match as much as possible, and the number of bases matched is divided by the total number of bases. Is expressed as a percentage (%).
  • a gap is appropriately inserted in one or both of the two sequences to be compared as necessary.
  • Such alignment of sequences can be performed using a well-known program such as BLAST, FASTA, CLUSTAL W, etc. (Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 2264-2268, 1993; Altschul et al., Nucleic Acids Res., 25: 3389-3402, 1997).
  • the total number of bases is the number of bases obtained by counting one gap as one base.
  • the identity (%) is calculated by dividing the total number of bases of the longer sequence and dividing the number of matched bases.
  • the polynucleotide (ii) in the carrier moiety is a polynucleotide selected from the following (a ′) to (d ′): (A ′) a polynucleotide having the base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 to 4, 6 to 40, 43 to 44, 48 or 52, (B ′) a polynucleotide having 70% or more sequence identity with the polynucleotide of (a ′) above, (C ′) a polynucleotide in which a small number of nucleotides in the polynucleotide of (a ′) above are substituted, deleted, added and / or inserted; (D ′) a polynucleotide comprising any one of the polynucleotides (a ′) to (c ′) as a partial sequence.
  • the polynucleotide (b ′) is 70% or more, preferably 80% or more, more preferably 85% or more, still more preferably 90% or more, and particularly preferably 95% with the nucleotide sequence of the polynucleotide (a ′). %, For example, 96% or more, 97% or more, 98% or more, 99% or more, or 99.5% or more.
  • the polynucleotide (b ′) has a function as a carrier for the active moiety.
  • the polynucleotide (c ′) is a small number, preferably 1 to several of the polynucleotide (a ′), for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, Nine or ten nucleotides can be substituted, deleted, added and / or inserted polynucleotides.
  • the polynucleotide (c ′) has a function as a carrier for the active moiety.
  • the polynucleotide (d ′) is a polynucleotide containing any one of the polynucleotides (a ′) to (c ′) as a partial sequence, and preferably has a function as a carrier for the active portion.
  • the length of the polynucleotide (d ′) is 8 to 100 bases.
  • the length is at least 10 bases, at least 12 bases, at least 13 bases, at least 14 bases, at least 15 bases, or at least 16 bases.
  • the length is preferably 100 bases or less, 45 bases or less, 35 bases or less, 30 bases or less, 25 bases or less, 24 bases or less, 23 bases or less, 22 bases or less, 21 bases or less, or 20 bases or less. it can.
  • the nucleic acid complex of the present invention contains at least one ligand.
  • the nucleic acid complex of the invention comprises one ligand.
  • the nucleic acid complex of the invention comprises a plurality of ligands, for example 2 to 10, preferably 2 to 6, for example 2, 3, 4, 5 or 6 ligands. Can do.
  • the ligand is bound to one or a plurality of structural units of the polynucleotide of (ii) carrier moiety.
  • the ligand binds to a structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide, the ligand binds to a site other than the 5 ′ position of the structural unit, and / or the ligand is When binding to a structural unit located at the 3 ′ end of the polynucleotide, the ligand is bound to a site other than the 3 ′ position of the structural unit.
  • a structural unit that binds to (eg, the 2′-position or the 4′-position) and the ligand is located at the 3 ′ end of the polynucleotide ( the first structural unit from the 3 ′ end, ie, the 3 ′ side of the polynucleotide)
  • the ligand may be a site other than the 3 ′ position of the structural unit (eg, 2 ′ position or Which means that it is bonded to the 4 'position).
  • the ligand When the ligand binds to a structural unit located at a position other than the 5 ′ end and other than the 3 ′ end, the ligand may bind to any site (for example, the 2 ′ position or the 4 ′ position) of the structural unit. it can.
  • the ligand is bound to a structural unit that is not a structural unit located at the 5 'end of the polynucleotide and is not a structural unit located at the 3' end of the polynucleotide.
  • the ligand is bound to a structural unit other than the structural units located at both ends (the structural unit located at the extreme end of each side and containing the 5 ′ end or 3 ′ end, respectively).
  • the ligand can bind to any site of the structural unit.
  • the ligand is bound to a structural unit near the center of the polynucleotide.
  • the ligand is suspended from the building block, ie, the ligand is not suspended from the polynucleotide backbone, but from the polynucleotide building block. (FIG. 1A).
  • At least one ligand is not present at one or more constituent units of the polynucleotide of the carrier moiety but at the 5 ′ position of the constituent unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide. It binds via a site that is not the 3 ′ position of the structural unit located at the 3 ′ end of the polynucleotide, which means that at least one ligand may be bound to such a site. I.e., it does not prevent further ligands from binding to the 5 'and / or 3' positions.
  • the nucleic acid complex of the present invention is not limited to the 5′-position of the 5′-end structural unit of the polynucleotide of the carrier moiety and the ligand bound to the site that is not the 3′-position of the 3′-end structural unit.
  • a ligand bound to the 5 ′ position and / or the 3 ′ position of the polynucleotide or not the 5 ′ position of the structural unit at the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety, and Only a ligand bound at a site other than the 3′-position of the 3′-end structural unit, for example, not a structural unit located at the 5′-end of the polynucleotide and a structural unit located at the 3′-end of the polynucleotide It may contain only ligands that are bound in no constituent units (preferably constituent units near the center of the polynucleotide).
  • At least one ligand comprises the 5 ′ position of the structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety and the 3 ′ position of the structural unit located at the 3 ′ end of the polynucleotide. Is bonded to one or more structural units of the polynucleotide of the carrier moiety.
  • the nucleic acid complex is located at the 5 ′ position of the structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety and / or at the 3 ′ end of the polynucleotide. It can further comprise a ligand bound to the 3 ′ position of the building block.
  • the additional ligand can be a ligand similar to that described for the at least one ligand, and can be bound to the polynucleotide by the same manner and means as those cases.
  • the nucleic acid complex may include a ligand bound to the 5 ′ position of the structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety, and the 3 ′ of the polynucleotide. It also does not include ligands that are bound to the 3 ′ position of the terminal structural unit.
  • these ligands may be bound to the same structural unit (for example, bound to the same position (for example, 2 ′ position) of the same structural unit). Or may be bonded to different structural units. In the former case, for example, by using an appropriate branched linker as described later, a plurality of ligands can be converted into multimers (for example, 2 to 10 mer, preferably 2 to 6 mer, for example 2, 3, 4, 5 or Hexamer) may be bonded to the same structural unit.
  • multimers for example, 2 to 10 mer, preferably 2 to 6 mer, for example 2, 3, 4, 5 or Hexamer
  • the activity of the nucleic acid complex is further enhanced when two or more ligands are bound to different structural units in the nucleic acid complex of the present invention. Furthermore, in the present application, it has also been found that good activity is achieved even when a plurality of ligands are bound as a multimer to the same structural unit in the nucleic acid complex of the present invention.
  • At least one ligand comprises (ii) one constituent unit located in the center of the polynucleotide when the polynucleotide of the carrier moiety consists of an odd number of constituent units.
  • the two structural units located in the center of the polynucleotide are bound to one or a plurality of structural units within the range of consecutive n structural units. To one or more structural units within a range of consecutive n + 1 structural units.
  • n is an integer of 1 to 100, preferably an integer of 1 to 50, more preferably an integer of 1 to 30, or an integer of 1 to 20.
  • n may be 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, or 20. .
  • n 3
  • up to the structural unit underlined in (2) below is included, and up to the structural unit underlined in (3) below may be included up to the 5 ′ direction.
  • n 3
  • the maximum may be included in the 5 ′ direction up to the structural unit underlined in (3 ′) below.
  • the polynucleotide chain length is long, for example, when the polynucleotide chain length exceeds 30, the number of structural units as described above is used for the range including the structural unit to which the ligand binds. It may be more appropriate to express the percentage as a percentage of the total polynucleotide than to express it.
  • the at least one ligand (hereinafter, also simply referred to as “the ligand”) has one or more structural units in the central region defined below having a number of m% with respect to the total number of polynucleotides.
  • m is an integer of 1 to 70, for example, an integer of 2 to 60, an integer of 5 to 50, an integer of 10 to 40, for example, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, It can be 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60 or 65.
  • the “central region” means that when the polynucleotide is composed of an odd number of structural units, one structural unit located at the center of the polynucleotide, the 5 ′ direction and 3 ′ from the central structural unit. 'A region containing the same number of structural units in each direction, wherein the center of the polynucleotide and the center of the region are the same, and the polynucleotide is composed of an even number of structural units. Is a region comprising two structural units located in the center of the polynucleotide and the same number of structural units in the 5 ′ direction and 3 ′ direction from the central structural unit, respectively, It means a region where the center of the region is the same.
  • the ligand is placed at a site other than the 5 ′ position of the 5 ′ end of the polynucleotide and other than the 3 ′ position of the 3 ′ end, for example, other than the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier portion and 3 ′.
  • the target transcript expression suppression effect and target It has been found that a cell growth inhibitory effect can be obtained.
  • the nucleic acid complex includes a plurality of ligands, it is sufficient that one of them is bound to a structural unit at a specific position as described above.
  • an excellent effect is achieved by binding a ligand near the center of the polynucleotide of the carrier portion.
  • the ligand is bound to the corresponding region.
  • the functional expression as siRNA is hindered, such a configuration cannot be adopted.
  • Non-Patent Document 1 can be cited as an example of ligand binding to a position that does not interfere with the functional expression of siRNA. Therefore, the above effect is not achieved until the configuration having the carrier portion (that is, the portion capable of binding the ligand to an arbitrary position including the center because it only has a function as a carrier) as in the present invention. It will be possible.
  • the binding site of the ligand in the nucleotide (or chemically modified nucleotide or nucleic acid analog) as the structural unit is not particularly limited, but preferably, the ligand is the 2 ′ position of the nucleotide (or chemically modified nucleotide or nucleic acid analog) or Bonded at the 4 'position.
  • the ligand is bound to a structural unit constituting a mismatch.
  • the structural unit to which the ligand is bound is deoxyribonucleotide or ribonucleotide, which may or may not be chemically modified.
  • the ligand may be indirectly bonded to the above structural unit via a linker, or may be directly bonded to the above structural unit.
  • linkers Many methods for binding ligands and nucleic acids are well known in the art, including the use of linkers.
  • the linker When the ligand is bound via a linker, usually one end of the linker is bound to the end of the ligand (if the ligand is a cRGD peptide, for example, to the lysine amino group of the cRGD peptide) The end will be bound to (ii) a structural unit (ie, nucleotide, chemically modified nucleotide or nucleic acid analog) located other than the 3 ′ end and other than the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety.
  • a structural unit ie, nucleotide, chemically modified nucleotide or nucleic acid analog
  • the site to which the linker binds is not particularly limited, but is preferably bound to the 2'-position or 4'-position of the nucleotide (or chemically modified nucleotide or nucleic acid analog).
  • the other end of the linker is bound to a structural unit located at the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety, the other end of the structural unit other than the 5 ′ position (for example, the 2 ′ position or the 4 ′ position).
  • the linker binds to a structural unit located at the 3 ′ end of the polynucleotide of the carrier part, it binds to a site other than the 3 ′ position of the structural unit (for example, the 2 ′ position or the 4 ′ position). To do.
  • bonds may be a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, or the like, but a covalent bond is preferable from the viewpoint of obtaining a more stable bond.
  • linker means a chemical moiety that links a polynucleotide and a ligand via a covalent bond, or a chemical moiety that covalently bonds a ligand to a polynucleotide.
  • the linker also includes a structure for changing the length of the linker (a so-called “spacer”, for example, a PEG moiety in the following PEG linker).
  • the type of the linker is not particularly limited as long as it can link the polynucleotide of the carrier portion and the ligand, and a linker known in the art can be used as a linker for linking two molecules.
  • the linker include polyalkylene glycol linker, maleimide linker, bis (sulfosuccinimidyl) suberate linker, DNA linker, peptide linker, silane linker, polysaccharide linker, disulfide linker, triazole linker, etc. These are not limited.
  • a heterobifunctional polyalkylene glycol linker represented by the following formula (I) is used as the linker:
  • a and B contain different reactive groups
  • x is an integer from 2 to 10, such as 2, 3 or 4, 5, 6, 7 or 8
  • y is an integer from 1 to 100, such as 1
  • Said A and B can contain, for example, an amine reactive group, a thiol reactive group, an alkyne reactive group or a dibenzocyclooctyne reactive group independently of each other.
  • a and B are independently of each other a group having 1 to 6 carbon atoms, for example 1, 2, 3 or 4 carbon atoms, preferably a C 1-6 alkylene group (for example, a methylene group, an ethylene group). ), Or one or more —C (O) O—, —O— or —C (O) NH—.
  • amine reactive groups include carboxylic acid, isothiocyanate, isocyanate, acyl azide, sulfonyl chloride, aldehyde, glyoxal, epoxide, oxirane, carbonate, aryl halide, imide ester, which may be activated with NHS or sulfo-NHS. Etc.
  • thiol reactive groups include haloacetyl groups (eg, iodoacetyl), alkyl halides, maleimides, aziridines, acryloyl groups, vinyl sulfones, benzoquinones, fluorobenzene groups, and disulfide groups, such as pyridyl disulfide groups.
  • alkyne reactive groups and dibenzocyclooctyne reactive groups include, for example, azide.
  • a reactive group such as carboxylic acid is usually difficult to react with an amine under physiological conditions, and therefore, by forming an unstable ester bond using an activating group such as NHS described above, for example. , Can be reactive.
  • a heterobifunctional polyalkylene glycol linker of the following formula (II) is used.
  • A, x and y are as defined in formula (I) above, and X and Y are each independently 1 to 6 carbon atoms, eg 1, 2, 3 or 4 A group having a carbon atom, preferably a C 1-6 alkylene group (eg methylene group, ethylene group), or —C (O) O—, —O— or —C (O) NH—, 'Is H or an active group].
  • X and Y are each independently 1 to 6 carbon atoms, eg 1, 2, 3 or 4 A group having a carbon atom, preferably a C 1-6 alkylene group (eg methylene group, ethylene group), or —C (O) O—, —O— or —C (O) NH—, 'Is H or an active group].
  • Examples of the active group include an N-succinimidyl group.
  • B ' is an active group, this contributes to the improvement of reactivity, and an active reactive group (composed of Y and B') is obtained.
  • A is an amine reactive group, a thiol reactive group, an alkyne reactive group or a dibenzocyclooctyne reactive group.
  • the above-mentioned reactive group can be appropriately selected according to the type of the structural unit of the polynucleotide to which the ligand is bound via the linker, the type of the ligand, and the like.
  • a linker where x 2 in formula (I) or (II) above, ie a heterobifunctional polyethylene glycol (PEG) linker (eg an integer from 1 to 100, eg 1 to 50). An integer of 2 to 30 or an integer of 1 to 12, for example, a PEG-based linker having a PEG length of 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8). (Hereinafter also referred to as “PEG linker”).
  • PEG linker Various types of commercially available heterobifunctional polyethylene glycol (PEG) linkers are readily available.
  • heterobifunctional polyethylene glycol (PEG) linkers include, but are not limited to, N-hydroxysuccinimidyl-PEG (n) -azide (where n is as defined above).
  • N-hydroxysuccinimidyl-PEG (n) -azide is commercially available.
  • Azido-PEG4-NHS ester (NHS-PEG4-Azido Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.) having the following structure: A2388) manufactured by Co., Ltd. can be used.
  • a linker based on polyalkylene glycol for example, PEG
  • the length of the polyalkylene glycol (for example, PEG) of the linker is an integer of 1 to 100, for example, an integer of 1 to 50, 2 to 30 Or an integer from 1 to 12, for example 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 or 8.
  • the length of the polyalkylene glycol (eg PEG) is 1-30, preferably 1-20, more preferably 2-15.
  • each binding partner at both ends of the linker is considered.
  • Those skilled in the art will appropriately select an appropriate combination of these in consideration of the structural unit, ligand, and linker reactive groups (for example, A and B above) in the polynucleotide to which the linker is bound. Is possible.
  • the structural unit in the polynucleotide that becomes the binding partner of the linker is chemically modified as necessary.
  • an amine-reactive group in the linker, thiol A covalent bond can be formed between the structural unit and the linker through a reaction with a reactive group, an alkyne reactive group or a dibenzocyclooctyne reactive group.
  • nucleotides with such chemical modifications are also referred to herein as “chemically modified nucleotides for attachment to a linker”, and such modifications constitute one aspect of the chemical modifications described above. is there.
  • “nucleotides chemically modified for binding to the linker” form a covalent bond with one end of the linker as a result of the reaction as exemplified above, and therefore can have different structures before and after the reaction.
  • a form of nucleotide that forms a covalent bond with a linker can also be referred to herein as a “nucleotide that has been chemically modified for attachment to the linker”. This also applies to “nucleotides chemically modified for binding to a ligand” described later.
  • nucleotides chemically modified for attachment to a linker and reactive groups of the linker include the following: Aminated nucleotide-NHS ester Nucleotide and linker are linked by amide coupling by the active ester method. Thiolated nucleotide-pyridyl disulfide group Nucleotides and linkers are linked by a disulfide bond with a pyridyldithiol activating ligand. Thiolated nucleotide-maleimide As a result of thiol-maleimide coupling, the nucleotide and linker are linked by a covalent bond.
  • nucleotides and linkers are linked by an alkylated nucleotide-azide click reaction (usually using a copper catalyst).
  • Dibenzocyclooctylated nucleotide-azide Nucleotides and linkers are linked by a click reaction (copper free click reaction) that proceeds in an aqueous catalyst-free buffer.
  • the ligand may be modified in accordance with the chemical bond (for example, amino group modification, carboxyl group modification, thiol group modification, hydroxyl group modification, or click reaction modification (for example, as necessary) in connection with the binding between the linker and the ligand.
  • the chemical bond for example, amino group modification, carboxyl group modification, thiol group modification, hydroxyl group modification, or click reaction modification (for example, as necessary) in connection with the binding between the linker and the ligand.
  • Azide, alkyne, dibenzocyclooctyne) for example, amino group modification, carboxyl group modification, thiol group modification, hydroxyl group modification, or click reaction modification (for example, as necessary) in connection with the binding between the linker and the ligand.
  • Azide alkyne, dibenzocyclooctyne
  • peptides or proteins when used as ligands, these usually have an NH 2 group at the N-terminus, and therefore by using a linker having an amine reactive group, the NH 2 group and the amine reactive group It is possible to form a covalent bond between the two via a reaction between the two.
  • peptides or proteins when peptides or proteins contain arginine or lysine in their amino acid sequences, a bond can be formed between the NH 2 group of the side chain and the amine reactive group. That is, forming a bond between one or more of the NH 2 groups (N-terminal, lysine and / or arginine NH 2 groups) inherent in peptides and proteins and amine reactive groups. You can also. Incidentally, those skilled in the art, whether to use the NH 2 group in the reaction can be appropriately selected depending on the desired structure, the reaction process in using the NH 2 group respectively, well known to those skilled in the art ing.
  • the direction of the linker is arbitrary, and either side may bind to the nucleotide and any side may bind to the ligand.
  • the intended orientation can be achieved by a chemical modification of the nucleotide, a combination of ligand and linker reactive groups (A and B above).
  • a combination of an alkynylated nucleotide and an azide is used as the combination of a chemically modified nucleotide and linker reactive group for attachment to the linker.
  • a combination of a linker reactive group and a ligand (ligand reactive site) a combination of an NHS ester and an NH 2 group of lysine originally possessed by a peptide as a ligand can be used.
  • the above Azido-PEG4-NHS ester is an example of a linker that can be used in this embodiment, and is one embodiment of the above formula (II) (A is an azide, B is an N-succinimidyl group, and X is an ethylene group) And Y is —C (O) O—, x is 2, and y is 4.
  • the polynucleotide building block (nucleotide or nucleic acid analog) and the ligand are linked via the following structure:
  • Nuc represents a structural unit of a polynucleotide to which a ligand binds via a linker, and LG represents a ligand].
  • a nucleotide chemically modified for binding to the linker and one end of the linker form a covalent bond as a result of the reaction exemplified above, and similarly, the other end of the linker and the ligand
  • the linker usually has a different structure before and after use (after linking the nucleotide and the ligand).
  • those skilled in the art will recognize the type of both reactive groups of the linker prior to use, the type of nucleotide chemically modified for binding to the linker, and the ligand (or the ligand chemically modified for binding to the linker).
  • a linker before use as described above is also referred to as a linker, including a linker incorporated in a linking moiety (that is, a linking moiety having a structure derived from a ligand before use).
  • the linkage between one end of the linker and the ligand, and the linkage between the other end of the linker and the nucleotide (or chemically modified nucleotide or nucleic acid analog) located outside the 3 ′ end and 5 ′ end of the polynucleotide are:
  • each can be carried out according to methods and techniques known to those skilled in the art. For example, when a commercially available linker or ligand is used, those skilled in the art can perform the above-mentioned coupling according to the instructions of their suppliers.
  • the structural unit responsible for binding in the polynucleotide may be chemically modified for binding with the linker.
  • the structural unit to which the ligand is bonded via the linker is a nucleotide (deoxyribonucleotide or ribonucleotide) that has been chemically modified for binding to the linker.
  • the structural unit to which the ligand is bonded via the linker forms the following structure together with the linker and the ligand:
  • R 10 is H or a base
  • R 11 and R 12 are each independently the remainder of the polynucleotide
  • LK is a linker
  • LG represents a ligand.
  • the base can be adenine, thymine, cytosine, guanine, uracil or the above chemically modified base.
  • the linker can be, for example, a polyalkylene glycol linker and the ligand can be, for example, a cyclic RGD sequence-containing peptide, folic acid or vitamin E. ].
  • the building block to which the ligand is attached via a linker forms the following structure with the linker and ligand (cRGDfK):
  • R 10 is H or a base
  • R 11 and R 12 each independently represent the remainder of the polynucleotide.
  • the base is as defined above.
  • the structural unit to which the ligand is bonded via the linker forms the following structure together with the linker and the ligand (folic acid):
  • R 10 is H or a base, and R 11 and R 12 each independently represent the remainder of the polynucleotide].
  • ligand binding via a linker can be performed by those skilled in the art based on various known methods and techniques.
  • cRGDfK as a ligand
  • Azido-PEG 4 as a linker.
  • a method for using the NHS ester to suspend a ligand from position 2 ′ of a nucleotide is briefly described below:
  • (A) Ligand and linker binding cRGDfK and Azido-PEG 4 -NHS ester are linked by a condensation reaction of NHS ester and the amino group of lysine of cRGDfK, and azido-PEG 4 is linked to cRGDfK by an amide bond.
  • Azide cRGDfK is prepared.
  • a polynucleotide having an alkyne-modified nucleotide as a structural unit at a position where a ligand is to be bound (via a linker) is prepared.
  • Methods for preparing such polynucleotides are known to those skilled in the art and can be synthesized, for example, by using alkyne phosphoramidites in standard oligo synthesis.
  • alkyne-modified nucleotides for example, 2′-O-propargyladenosine, 2′-O-propargylcytidine, 2′-O-propargylguanosine, 2′-O-propargyluridine or 2′-O-propargyl Abasic ribose can be used.
  • C Click reaction An azide-cRGDfK and an alkyne-modified nucleotide are bound using an addition sensitization reaction (click reaction) with an azide and an alkyne.
  • a polynucleotide having cRGDfK bound to PEG 4 via a triazole to the 2 ′ site of the nucleotide (or chemically modified nucleotide or nucleic acid analog) at the desired position ie, A polynucleotide (FIG. 1A) is obtained in which the ligand is suspended from the 2 ′ position of the nucleotide via a linker.
  • cRGDfK can be bound to the nucleotide via a linker using the same technique.
  • the ligand can be directly bonded.
  • the bond is usually considered to be a covalent bond, an ionic bond, a hydrogen bond, or the like, but a viewpoint that a more stable bond can be obtained. Therefore, a covalent bond is preferable.
  • a structural unit (nucleotide or nucleic acid analog) of a polynucleotide to which the ligand is appropriately bound, for example, with chemical modification or reactive group as described above for binding of the ligand via a linker, and It is possible to form a covalent bond between the structural unit and the ligand by introducing the ligand into the ligand and / or using a known reaction such as the reaction described above.
  • the nucleotide deoxyribonucleotide or ribonucleotide
  • a nucleotide that has been chemically modified for binding to a ligand is also referred to as “a nucleotide that has been chemically modified for binding to a ligand”.
  • the direct binding of the ligand can also be carried out by those skilled in the art based on various known methods and techniques.
  • cRGDfK is used as the ligand to suspend from the 2 ′ position of the nucleotide. If so, the binding can be performed as follows:
  • nucleic acid complex of the present invention can also contain a plurality of ligands as described above.
  • nucleic acid complex of the present invention includes a plurality of ligands.
  • ligands are bonded to one constituent unit other than the 5 'end and the 3' end of the polynucleotide of the carrier portion via a branched linker (Fig. 2 (B)).
  • a branched linker having a two-stage branched structure as shown in the figure.
  • the structural unit and linker in each region (C) In each of the two ligands, in the 5′-side region and 3′-side region (regions other than the 5 ′ end and other than the 3 ′ end) of the polynucleotide of the carrier part, the structural unit and linker in each region (FIG. 2C).
  • the ligand is bound to one building block of 2-10th, eg 2-6, from the 5 ′ end of the polynucleotide of the carrier moiety, and / or 2-10th from the 3 ′ end, For example, it is bonded to one of the second to sixth structural units.
  • FIG. 1 For reference, a schematic diagram of one embodiment when the nucleic acid complex of the present invention includes one ligand is also shown in FIG.
  • linkers in the above (C) and (D) those described above can be used.
  • a two-branch branch linker (A) or a four-branch branch linker having double two branches can be used.
  • the branched linker is not limited to these, and a multi-branched linker or one having a different structure can also be used depending on the desired structure.
  • a linker that links a polynucleotide and two cRGDfKs as shown below can be used as a branching linker.
  • two cRGDfKs can be bound to the same structural unit nucleotide in the form of a dimer.
  • Nuc represents a structural unit of a polynucleotide to which a ligand binds via a linker
  • LG represents a ligand. Note that Nuc and LG can be any combination different from the above combination. .
  • Nuc represents a structural unit of a polynucleotide to which a ligand binds via a linker
  • LG represents a ligand. Note that Nuc and LG can be any combination different from the above combination. .
  • ligands when a plurality of ligands are bound, they may be the same or different from each other. Similarly, when multiple linkers are used, they may be the same or different from one another. Even when the nucleic acid complex includes a plurality of ligands and / or a plurality of linkers (or branched linkers), the respective bonds (linkage between nucleotide and linker, bond between linker and ligand) are the above-described methods. It is possible to carry out by the same method.
  • a method for attaching various linkers to the 3 'end or 5' end of a polynucleotide is well known to those skilled in the art.
  • the nucleic acid complex in some embodiments is not limited to the above typical example.
  • the polynucleotide of the active moiety and the polynucleotide of the carrier moiety can be prepared by those skilled in the art by appropriately selecting a known method.
  • a nucleic acid base sequence is designed based on information on the base sequence of the target transcript (typically, the base sequence of the target gene), and a commercially available nucleic acid synthesizer (Applied Biosystems, Beckman) Etc.) and then purifying the resulting polynucleotide using a reverse phase column or the like to prepare a nucleic acid.
  • nucleic acid thus prepared is mixed in an appropriate buffer, denatured at about 90 to 98 ° C. for several minutes (for example, 5 minutes), and then about 30 to 70 ° C.
  • Nucleic acid complexes in some embodiments can be prepared by annealing for 1-8 hours.
  • a ligand is bound to the polynucleotide of the carrier portion.
  • the nucleic acid complex is prepared by using a polynucleotide having a ligand bound thereto in advance as described above. It can be prepared by annealing with nucleotides.
  • the nucleic acid complex of the present invention is considered to exert its antisense effect mainly through an RNase H-dependent pathway.
  • the nucleic acid complex of the invention may have an RNase H independent antisense effect.
  • RNaseH-independent antisense effect means a splicing function such as inhibition of translation and exon skipping by hybridizing a transcription product (RNA sense strand) of a target gene with a nucleic acid strand complementary to the partial sequence. It means the activity of suppressing the expression of the target gene caused by the conversion effect.
  • the nucleic acid complex of the present invention is incorporated into a target cell with high specificity and efficiently, suppresses the expression of a target gene in the cell or the level of a target transcript, and extremely effectively suppresses the proliferation of the cell. Can do. Therefore, the present invention provides a composition containing the nucleic acid complex as an active ingredient, for example, a composition for suppressing the expression of a target gene and / or the proliferation of a target cell (for example, a cancer cell) by an antisense effect. Can do.
  • the nucleic acid complex of the present invention can be delivered to a target tissue or target site with excellent specificity and efficiency, and can suppress the growth of target cells with high specificity and efficiency.
  • a medicinal effect can be obtained, and a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with increased expression of a target gene such as a metabolic disease, tumor or infection can be provided with few side effects.
  • a target gene such as a metabolic disease, tumor or infection
  • a pharmaceutical composition for treating or preventing a disease associated with increased expression of a target gene such as a metabolic disease, tumor or infection
  • a nucleic acid complex of the present invention when used, compared to the case of using another nucleic acid complex (for example, a nucleic acid complex to which no ligand is bound), It has also been found that side effects associated with its administration, in particular hepatotoxicity, are significantly reduced.
  • the present invention relates to the nucleic acid complex for reducing the expression of a target gene in a mammal, preferably in a target tissue / target site.
  • the present invention relates to a nucleic acid complex for suppressing the growth of cells in which expression of a target gene is enhanced in a mammal, preferably in a target tissue / target site.
  • the present invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the nucleic acid complex and optionally a pharmacologically acceptable carrier.
  • the present invention relates to the use of the nucleic acid complex for producing the pharmaceutical composition.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing a disease associated with increased expression of a gene, comprising the step of administering the nucleic acid complex to a mammal.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing cancer in a mammal, comprising a step of administering the nucleic acid complex to the mammal.
  • the present invention relates to a method for treating or preventing liver disease in a mammal, comprising a step of administering the nucleic acid complex to the mammal.
  • the pharmaceutical composition can be a pharmaceutical composition for suppressing the growth of cancer cells, or the pharmaceutical composition can be a pharmaceutical composition for treating and / or preventing cancer. In addition, the pharmaceutical composition can be a pharmaceutical composition for treating and / or preventing liver disease.
  • the cancer of the cancer cell and the cancer are, for example, brain tumor; squamous cell carcinoma of head, neck, lung, uterus or esophagus; melanoma; adenocarcinoma of lung or uterus; renal cancer; malignant mixed tumor; Cancer; Sputum cell-like gingival tumor; Oral mass; Perianal adenocarcinoma; Anal sac mass; Anal sac Apocrine adenocarcinoma; Sertoli cell tumor; Vaginal vestibular cancer; Sebaceous gland cancer; Sebaceous gland epithelioma; Intranasal adenocarcinoma; nasal adenocarcinoma; thyroid cancer; colon cancer; bronchial adenocarcinoma; adenocarcinoma; ductal carcinoma; mammary carcinoma; complex mammary carcinoma; Periosteum; sarcoma; osteosarcoma; chondrosarcoma; soft tissue sarcoma
  • liver diseases include hepatitis A, hepatitis B, hepatitis C, hepatitis D, hepatitis E, liver cancer, neonatal hepatitis, nonalcoholic liver disease, nonalcoholic steatohepatitis, autoimmune hepatitis, Liver ischemia / reperfusion, liver fibrosis, cirrhosis, acute liver failure, fulminant hepatitis, alcoholic liver injury, ⁇ 1 antitrypsin deficiency, chronic hepatitis, cholestatic liver disease, liver cyst, fatty liver, Gilbert syndrome , Hemochromatosis, porphyria, primary biliary cirrhosis, Reye syndrome, sarcoidosis, steatohepatitis, radiation hepatitis, drug-induced liver injury, metabolic liver disease, dyslipidemia (eg familial hypercholesterolemia), virus Selected from the group consisting of sexual hepatitis and Wilson disease.
  • the present invention relates to a method for reducing the level of intracellular transcripts comprising the step of contacting said nucleic acid complex with a cell.
  • the present invention relates to a method for suppressing the growth of the cell, comprising the step of bringing the nucleic acid complex into contact with a cell, preferably a cancer cell.
  • the present invention relates to the use of the above-described nucleic acid complex for reducing the expression of a target gene in a mammal, preferably in a target tissue / target site.
  • the present invention relates to the use of the above-mentioned nucleic acid complex for suppressing the growth of a target cell, preferably a cancer cell, in a target tissue / target site in a mammal.
  • the present invention further relates to the use of the nucleic acid complex for producing a drug for reducing the expression of a target gene in a mammal, preferably in a target tissue / target site.
  • the present invention also relates to the use of the above-mentioned nucleic acid complex for producing a drug for suppressing the growth of a target cell, preferably a cancer cell, in a mammal, preferably in a target tissue / target site.
  • the present invention relates to a method for reducing the expression level of a target gene in a mammal, preferably in a target tissue / target site, comprising the step of administering the nucleic acid complex to the mammal.
  • the present invention comprises the step of administering the above-mentioned nucleic acid complex to a mammal, wherein the proliferation of a target cell, preferably a cancer cell, preferably in a target tissue / target site is performed in the mammal. It is related with the control method.
  • the polynucleotide of the active portion is an antisense strand complementary to any region of the transcript.
  • the transcript is an mRNA transcript that encodes a protein.
  • the protein is human BCL2, human BCR-ABL or human APOB.
  • the transcript is a transcript that does not encode a protein, such as a translocation-associated lung adenocarcinoma transcript (MALAT-1).
  • MALAT-1 translocation-associated lung adenocarcinoma transcript
  • the target gene is human bcl-2, human BCR-ABL, human APOB or human MALAT-1.
  • the mammal is a human.
  • composition or drug containing the nucleic acid complex can be formulated by a known pharmaceutical method.
  • a known pharmaceutical method for example, capsule, tablet, pill, liquid, powder, granule, fine granule, film coating, pellet, troche, sublingual, chewing agent, buccal, paste, syrup, suspension, As elixirs, emulsions, coatings, ointments, plasters, cataplasms, transdermal preparations, lotions, inhalants, aerosols, injections, suppositories, etc. enteral (oral) or non-enteric Can be used enterally.
  • pharmacologically or food and drink acceptable carriers specifically, sterilized water, physiological saline, vegetable oils, solvents, bases, emulsifiers, suspensions, surfactants, pH regulators. , Stabilizer, flavoring agent, fragrance, excipient, vehicle, preservative, binder, diluent, tonicity agent, soothing agent, bulking agent, disintegrant, buffering agent, coating agent, lubricant, It can be appropriately combined with a colorant, sweetener, thickener, flavoring agent, solubilizing agent or other additives.
  • compositions or drugs there is no particular limitation on the preferred administration form of the composition or drug, and enteral (oral etc.) or non-enteral, more specifically, intravenous administration, intraarterial administration, intraperitoneal administration, subcutaneous administration. , Intradermal administration, intratracheal administration, rectal administration and intramuscular administration, administration by infusion.
  • the nucleic acid complex or composition can be used for animals including humans, that is, it can be used for humans and / or non-human animals.
  • animals other than a human Various livestock, poultry, a pet, a laboratory animal, etc. can be made into object.
  • the dose or ingestion is the age, weight, symptom, health status of the subject, type of composition (pharmaceuticals, food and drink, etc.), etc.
  • the effective intake of the nucleic acid complex or composition according to an embodiment is preferably 0.001 mg / kg / day to 50 mg / kg / day in terms of nucleotides.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention targeting bcl-2 or human BCR-ABL, which is an oncogene, or of the present invention targeting APOB or MALAT-1 Double-stranded nucleic acid complexes can suppress the growth of target cells with very high efficiency.
  • the double-stranded nucleic acid complex of the present invention can be delivered to a target tissue or target site with excellent specificity and efficiency. Therefore, the present invention can provide a method of adding or administering the nucleic acid complex of the present invention to a subject and suppressing the expression of a target gene or a target transcript by an antisense effect.
  • the present invention suppresses the proliferation of cells accompanied by increased expression of a target gene, if necessary, in a tissue / site-specific manner by administering the nucleic acid complex of the present invention to a subject, thereby It is also possible to provide a method for treating and preventing various diseases associated with excessive expression.
  • Example 1 Synthesis of double-stranded nucleic acid Based on the sequence of the human BCL2 gene, a double-stranded nucleic acid containing a base having a DNA-DNA targeting the gene as a basic skeleton and a ligand binding site at the sugar site was designed.
  • the sequence of the antisense strand nucleotide (16mer) is shown in SEQ ID NO: 1
  • the complementary strand nucleotide sequence is shown in SEQ ID NOs: 2 to 4.
  • a double-stranded nucleic acid is formed by annealing an antisense strand and a complementary strand of each gene sequence.
  • a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 1 and 2 is BDX-1
  • a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 1 and 3 is BDX-2
  • a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 1 and 4 is Let it be BDX-3.
  • Single-stranded nucleic acids were synthesized by Gene Design Co., Ltd., and double-stranded nucleic acids were formed in-house by annealing the antisense strand and each complementary strand.
  • RNA The nucleotides underlined as sequence notation are RNA,
  • ps represents a thiophosphate bond and po represents a phosphodiester bond as a nucleotide binding mode.
  • Example 2 [CRGD addition to the 5 ′ end] CRGD addition to the 5 ′ end of the BDX-1 complementary strand (SEQ ID NO: 2) was performed as follows.
  • cRGD peptide 1: 2.5 (2.5 molar equivalent), stirred at 25 ° C. for 2 hours to carry out the addition reaction. Since unreacted substances were confirmed by LC / MS, an additional 10 molar equivalents of cRGD peptide were added (total: 12.5 molar equivalents) for reaction.
  • a double-stranded nucleic acid obtained by annealing an antisense strand (SEQ ID NO: 1) and a BDX-1 complementary strand added with a cRGD peptide is referred to as BDX-1-cRGD.
  • Example 3 [Addition of RGD to sugar 2 'site] RGD addition to the BDX-2 complementary strand (SEQ ID NO: 3) and BDX-3 complementary strand (SEQ ID NO: 4) was performed as follows.
  • GRGESP negative control: Fibronectin Related Peptide (GRGESP) manufactured by Takara Bio Inc. TKR SP002)
  • cRGDfK Monomeric RGD : Cyclo (-RGDfK) Selleck Co.
  • a double-stranded nucleic acid obtained by annealing a BDX-2 complementary strand and a BDX-3 complementary strand added with an antisense strand (SEQ ID NO: 1) and a GRGESP (negative control) peptide is BDX-2-RGE (Ne) , BDX-3-RGE (Ne).
  • a double-stranded nucleic acid obtained by annealing an antisense strand (SEQ ID NO: 1) and a BDX-2 complementary strand and a BDX-3 complementary strand to which cRGDfK (Monomeric RGD) peptide is added is BDX-2-cRGD, BDX-3 -CRGD.
  • the carrier portion of BDX-2-cRGD has a structure as shown in FIG. 1A.
  • a 16-mer polynucleotide (1-7 and 9-16 from the 5 ′ side are deoxyribonucleotides).
  • CRGDfK binds to the amino group of the lysine at the 2 ′ position of the 8th ribonucleotide derivative of the 8th nucleotide that is chemically modified for conjugation with the linker, specifically a ribonucleotide derivative.
  • BDX-3-cRGD a 16-mer polynucleotide (carriers 1 to 7 and 9 to 16 from the 5 ′ side are deoxyribonucleotides, and the eighth is a linker and a linker.
  • Abasic nucleotides, specifically abasic ribonucleotide derivatives that are chemically modified to bind 8 th 2 'position of the abasic ribonucleotide derivatives, CRGDfK are coupled via a linker.
  • the structure of the carrier portion of BDX-2-RGE (Ne) obtained using GRGESP (negative control) as the ligand is shown in FIG. 1B.
  • Tm values of BDX-1, BDX-1-cRGD, BDX-2-RGE (Ne), BDX-2-cRGD, BDX-3-RGE (Ne), and BDX-3-cRGD were measured as follows. (1) Measuring equipment UV-1800 (manufactured by Shimadzu Corporation) (2) System used BioSpec-1600 (3) Temperature parameter Start temperature: 20 ° C Start hold: 20 minutes Temperature rate: 0.5 ° C / minute Measurement sensation: 0.5 ° C
  • Example 5 As a human cancer-derived cell line used in the test described later, a cell line maintained by the following method was used.
  • Human alveolar basal epithelial adenocarcinoma cell line (A549 cell line: purchased from JCRB cell bank, cell number: JCRB0076) is 10% by weight fetal bovine serum, MEM non-essential amino acid (NEAA), 100 units / ml A growth medium (MEM: GIBCO) supplemented with penicillin and 100 ⁇ g streptomycin was used and maintained at 37 ° C. under 5 mass% CO 2 conditions.
  • Example 6 Cell proliferation assay The cell proliferation assay performed in the test described below was performed by the following method unless otherwise specified. Using a 96-well microplate, cells were cultured in a medium of 100 ⁇ l / well under humidified conditions (37 ° C., 5% CO 2 ). In the cell proliferation assay, 10 ⁇ l of cell proliferation reagent WST-1 (Roche) was added to each well, and the absorbance was measured using a microplate reader (BioRad).
  • Example 7 Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene
  • a double-stranded nucleic acid (BDX-1, BDX-1-cRGD, BDX-2-cRGE (Ne), BDX-2-cRGD, BDX-3-cRGE (Ne), BDX-3-cRGD) is prepared, and A549 It added to the cell line so that it might become 10, 30, 100 nM.
  • the cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above.
  • the double-stranded nucleic acid to which cRGD was bound showed the growth inhibitory activity against the A549 cancer cell line without using a transfection reagent by targeting the human BCL2 gene. Further, it was revealed that the growth inhibitory activity is enhanced in the structure in which cRGD is bonded to the center of the complementary strand rather than the complementary strand 5 'end.
  • Example 8 Synthesis of double-stranded nucleic acid
  • a double-stranded nucleic acid containing a base having a DNA-DNA targeting the gene as a basic skeleton and a ligand binding site at the sugar site was designed.
  • the antisense strand nucleotide sequence (16mer) for the BCL2 gene is shown in SEQ ID NO: 5
  • the complementary strand nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 6-40.
  • antisense strand nucleotide sequence (20 mer) for the BCR-ABL gene is shown in SEQ ID NOs: 41 and 42
  • complementary strand nucleotide sequences are shown in SEQ ID NOs: 43 and 44 (here, SEQ ID NO: 1 and
  • the polynucleotide represented by SEQ ID NO: 2 is also used as the antisense strand nucleotide and the complementary strand nucleotide, respectively).
  • a double-stranded nucleic acid is formed by annealing an antisense strand and a complementary strand of each gene sequence.
  • a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 1 and 6 targeting the human BCL2 gene is formed from BDX-4, a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 5 and 7 is formed from BDX-5, and SEQ ID NOs: 1 and 8
  • the double-stranded nucleic acid formed is BDX-6, the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOS: 1 and 9 is BDX-7, the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOS: 1 and 10 is BDX-8, SEQ ID NO: 1 BDX-9 is a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 1 and 12, BDX-10 is a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOS: 1 and 12, and BDX-11 is a double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOS: 1 and 13
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 41 and 43 targeting the human BCR-ABL gene is BDX-41
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 41 and 44 is BDX-42
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 42 and 44 is referred to as BDX-44.
  • Single-stranded nucleic acids of SEQ ID NOs: 5 to 9 and 27 to 44 were synthesized in-house using a DNA / RNA automatic synthesizer (NTSH-8: manufactured by Nippon Techno Service Co., Ltd.) according to a conventional method.
  • the single-stranded nucleic acids of SEQ ID NOs: 10 to 26 were outsourced to Gene Design Co., Ltd. In addition, double-stranded nucleic acids were formed in-house by annealing the antisense strand and the complementary strand.
  • the nucleotide underlined as the sequence notation is RNA,
  • N 1 is 2'-O-Propyl Cytidine
  • N 2 is 2'-O-Propyl Adenocine
  • N 3 is 2'-O-Propyl Guanocine
  • N 4 is 2'-O-Propyl Uridine
  • N 5 Thymidine obtained by coupling 5′-hexylphosphoramide at the 5 ′ position by an automatic synthesizer
  • N 6 represents Adenocine obtained by coupling 5′-hexyphosphoramide at the 5 ′ position by an automatic synthesizer
  • DNA otherwise
  • ps represents a thiophosphate bond and po represents a phosphodiester bond as a nucleotide binding mode.
  • Example 9 [Add cRGD] Among the complementary strands, cRGD was added to the complementary strand having a Propargyl group.
  • a double-stranded nucleic acid to which cRGD is added is referred to by adding “cRGD” to the double-stranded nucleic acid name.
  • BDX-4 with cRGD added is referred to as “BDX-4-cRGD”.
  • BDX-4-cRGD the complementary strand (SEQ ID NO: 31) has a propargyl group at two positions as in BDX-29-cRGD
  • cRGD is added at both positions, that is, the double-stranded nucleic acid is different.
  • cRGD is a linker to a complementary strand having a propargyl group (or a complementary strand coupled with 5′-hexylphosphoramide at the 5 ′ position) by the click reaction shown in Example 3. Added through. (Similarly, cRGD was added by click reaction to the complementary strand in which 5′-Hexynyl Phosphoramidite was coupled to the 5 ′ position.)
  • the double-stranded nucleic acid name is referred to by adding “DEcRGD” (dimer) or “TEcRGD” (tetramer) (for example, “ BDX-2-DEcRGD ”,“ BDX-2-TEcRGD ”).
  • DEcRGD dimer
  • TEcRGD tetramer
  • the carrier portion of BDX-2-DEcRGD has a structure as shown in FIG. 4A
  • the carrier portion of BDX-2-TEcRGD has a structure as shown in FIG. 4B.
  • BDX-24-cRGD was conjugated with cRGD at the 3 ′ end via maleimide by the same method as shown in Example 2. That is, based on the nucleotide of SEQ ID NO: 26, the following complementary nucleotides: 5'- TpoGpoGpoCpoGpoCpoApo U poGpoCpoTpoGpoGpoGpoApoG-L (6) -X -3 ' [Wherein L (6) represents Amino C6 linker, and X represents MAL-dPEG 6 -NHS ester] was prepared, and cRGD was bound thereto, and the resulting complementary strand was then annealed with the antisense strand shown in SEQ ID NO: 1 to form a double-stranded nucleic acid.
  • Example 10 [Addition of folic acid] Folic acid was also added to the complementary strand having a Propargyl group by a click reaction. (Folic acid was similarly added by click reaction to the complementary strand in which 5′-Hexynyl Phosphoramidite was coupled to the 5 ′ position.)
  • PEG3-Folate manufactured by base click: BCFA-111-1.
  • FIG. 4 (C) Having a structure as shown in FIG. 4 (C); -PEG11-Folate synthesized in-house.
  • Example 11 [Tm value (melting temperature) measurement] The Tm value was measured by the method shown in Example 5. The obtained Tm values are shown in Table 5.
  • Example 12 [Cell culture] As a human cancer-derived cell line used in the test described later, a cell line maintained by the following method was used.
  • Human alveolar basal epithelial adenocarcinoma-derived cell line (A549 cell line: purchased from JCRB cell bank, cell number: JCRB0076) is 10% by mass fetal bovine serum, MEM non-essential amino acid (NEAA), 100 units / ml.
  • MEM GIBCO
  • human pancreatic cancer-derived cell line PANC-1 cell line: purchased from Riken Cell Bank, cell number: RBRC-RCB2095
  • human prostate cancer-derived cell line DU145 cell line: purchased from Riken Cell Bank, cell number: RBRC-RCB2143
  • human prostate cancer cell line PC-3 cell line: purchased from Riken Cell Bank, cell number: RBRC-RCB2145)
  • human ovarian cancer cell line OVCAR-3 cell line: purchased from RIKEN Cell Bank, cells No .: RBRC-RCB2135
  • human chronic myeloid leukemia cell line K562 cell line: purchased from JCRB cell bank, cell number: JCRB0019
  • human pancreatic cancer-derived cell line AsPC-1 cell line: purchased from ATCC cell bank, Cell number: CRL-1682
  • uses a growth medium RPMI1640: manufactured by GIBCO
  • -1 cell line purchased from JCRB cell bank, cell number: JCRB0801) growth medium supplemented with 10% by weight fetal bovine serum, MEM non-essential amino acid (NEAA), 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g streptomycin (MEM: GIBCO), human Nest cancer-derived cell line (MCAS cell line: purchased from JCRB cell bank, cell number: JCRB0240) is a growth medium (MEM: GIBCO) supplemented with 20% by mass fetal bovine serum, 100 units / ml penicillin and 100 ⁇ g streptomycin. Was maintained at 37 ° C. under 5% by mass CO 2 conditions.
  • Example 13 Quantitative RT-PCR performed in the experiment described below was performed by the following method unless otherwise specified.
  • Total RNA was extracted from the cultured cells using Rneasy Mini Kit (QIAGEN).
  • Quantitative RT-PCR using the above total RNA was performed under the recommended conditions using Quant-Fast Probe RT-PCR Kit (manufactured by QIAGEN).
  • QIAGEN Quant-Fast Probe RT-PCR Kit
  • ⁇ -Actin manufactured by the same company was used as the endogenous control primer.
  • the quantitative RT-PCR amplification was performed using ROTOR-Gene Q (manufactured by QIAGEN).
  • the mRNA expression level was calculated by the Delta Delta CT method.
  • Example 14 Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with cRGD bound to the center of complementary strand.
  • Double-stranded nucleic acids were prepared and added to various cell lines to 300 nM. The cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above.
  • FIG. 5 shows the results of the growth-inhibiting activity of the double-stranded nucleic acid in which the monomer, dimer, and tetramer cRGD are bound to the center of the complementary strand against the OVCAR-3 cell line.
  • BDX-2-TEcRGD in which tetramer cRGD is bound to the central part has a further enhanced growth inhibitory activity than double-stranded nucleic acid in which monomeric cRGD is bound to the central part. became.
  • FIG. 6 results of the growth inhibitory activity of BDX-2-cRGD in which monomeric cRGD was bound to the center of the complementary strand against various cell lines are shown in FIG. 6 for the DU145 cell line, FIG. 7 for the PANC-1 cell line, and PC. -3 cell line is shown in FIG. 8, Caki-1 cell line is shown in FIG. 9, and MCAS cell line is shown in FIG.
  • BDX-2-cRGD in which cRGD is bound to the center of the complementary strand is more than BDX-1-cRGD in which monomeric cRGD is bound to the 5 ′ end. It was revealed that the growth inhibitory activity was enhanced.
  • Example 15 [Test for inhibiting mRNA expression of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with cRGD bound to the center of complementary strand]
  • the following experiment was conducted by the quantitative RT-PCR method described in Example 4 above.
  • FIG. 11 shows the results of adding BDX-4-cRGD to the PANC-1 cell line to 1 ⁇ M and quantifying the mRNA expression level 24 hours later.
  • FIG. 11 shows the results of adding BDX-4-cRGD to the PANC-1 cell line to 1 ⁇ M and quantifying the mRNA expression level 24 hours later.
  • FIG. 12 shows the results of quantifying the amount of mRNA expression 24 hours later after adding BDX-5-cRGD, BDX-5-DEcRGD, and BDX-5-TEcRGD to the K562 cell line at 10 ⁇ M.
  • BDX-4-cRGD in which cRGD is bound to the center of the complementary strand is more effective in suppressing mRNA expression than BDX-1-cRGD in which monomeric cRGD is bound to the 5 ′ end. It became clear that it was strengthened.
  • FIG. 12 revealed that the mRNA expression inhibitory action was enhanced depending on the number of cRGD bound to the central part.
  • Example 16 Verification of knockdown effect of BCL2 gene in pancreatic cancer site of pancreatic cancer cell line pancreatic orthotopic transplantation of double-stranded nucleic acid with cRGD bound to the center of complementary strand.
  • FIG. 13 The results of quantifying the BCL2 gene mRNA expression level at the pancreatic cancer site by the method shown in Example 13 are shown in FIG. As can be seen from FIG. 13, it was revealed that BDX-1-cRGD in which cRGD was bound to the 5 ′ end had an enhanced effect on suppressing the expression of mRNA than BDX-1 in which cRGD was not bound. It was confirmed that BDX-4-cRGD in which cRGD was bound to the center of the complementary strand further enhanced the mRNA expression inhibitory action.
  • Example 17 Evaluation of efficacy of double-stranded nucleic acid with cRGD bound to the center of complementary strand in pancreatic cancer cell line pancreatic orthotopic mouse model.
  • Example 18 Reduction effect on hepatotoxicity of double-stranded nucleic acid with cRGD bound to the center of complementary strand. In order to evaluate the fact that the accumulation effect of nucleic acid at the cancer site is increased by binding cRGD, the non-specific accumulation in the liver is reduced, and the expression of hepatotoxicity is evaluated. It was.
  • BDX-4-cRGD and BDX-6-cRGD in which cRGD is bound to the center of the complementary strand have increased liver weight compared to BDX-4 and BDX-6 to which no ligand is bound. It became clear that there was no.
  • BDX-4-cRGD in which RGD is bound to the center of the complementary strand in both the AST value and the ALT value and BDX-4 in which BDX-6-cRGD is not bound to the ligand. The value was lower than that of BDX-6, and it became clear that liver dysfunction was reduced.
  • Example 19 Effective effect of double-stranded nucleic acid with cRGD bound to the center of complementary strand in pancreatic cancer cell line pancreatic orthotopic mouse model.
  • Example 20 [Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene in which cRGD is bound to one different part of complementary strand]
  • Various nucleic acids were prepared and added at 300 nM for the PANC-1 cell line and AsPC-1 cell line and 1, 3, 10 ⁇ M for the OVCAR-3 cell line.
  • the cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above.
  • the results are shown in FIG. 19 for the PANC-1 cell line, FIG. 20 for the AsPC-1 cell line, and FIG. 21 for the OVCAR-3 cell line.
  • FIGS. 19 and 20 it was clarified that the activity varies depending on the cell type.
  • cRGD binds to the 5 ′ end of the complementary strand (5 ′ position of the structural unit located at the 5 ′ end) or 3 ′ end (3 ′ position of the structural unit located at the 3 ′ end).
  • the activity is enhanced by binding to a position other than that of the complementary strand, and the activity is further enhanced when binding near the center among positions other than the 5′- and 3′-ends. It became clear to do.
  • Example 21 Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene in which cRGD is bound to two different parts of complementary strand.
  • Various nucleic acids were prepared and added to the PANC-1 cell line to 300 nM. The cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above. The result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 22, it was revealed that the cell growth inhibitory activity was enhanced by binding cRGD to two different positions of the complementary strand (BDX-29-cRGD).
  • Example 22 [Test of mRNA expression inhibition activity of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with cRGD bound to two different positions of complementary strand]
  • the quantitative RT-PCR method described in Example 4 above The following experiment was conducted.
  • FIG. 23 shows the results obtained by preparing various nucleic acids and adding them to the PANC-1 cell line so as to have a concentration of 300 nM, and quantifying the mRNA expression level after 24 hours. As can be seen from FIG. 23, it was revealed that the mRNA expression inhibitory activity was enhanced by binding cRGD to two different positions of the complementary strand (BDX-29-cRGD).
  • Example 23 [Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with folic acid bonded to the center of complementary strand]
  • Double-stranded nucleic acid was prepared and added to the OVCAR-3 cell line at 1, 3, 10 ⁇ M.
  • the cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above.
  • FIGS As can be seen from the figure, in any double-stranded nucleic acid having a different antisense strand structure, it was revealed that the cell growth inhibitory activity was enhanced by binding folic acid to the center of the strand.
  • Example 24 [Test for inhibiting mRNA expression of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with folic acid bound to the center of complementary strand]
  • the following experiment was conducted by the quantitative RT-PCR method described in Example 4 above.
  • FIG. 26 shows the results of adding BDX-15-PEG3-Folate to OVCAR-3 cell line at 1, 3, 10 ⁇ M and quantifying the mRNA expression level 24 hours later. As can be seen from FIG. 26, a dose-dependent mRNA expression-inhibiting action of BDX-15-PEG3-Folate in which folic acid was bound to the center of the complementary strand was confirmed.
  • Example 25 Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with folic acid bound to two different strands.
  • Double-stranded nucleic acid was prepared and added to the A549 cell line at 300 nM. The cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above. The result is shown in FIG. As can be seen from FIG.
  • Example 26 [Test for inhibiting mRNA expression of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with folic acid bound to two different strands]
  • the quantitative RT-PCR method described in Example 4 above The following experiment was conducted.
  • FIG. 28 shows the results of preparing various nucleic acids and adding them to the OVCAR-3 cell line so as to have a concentration of 300 nM, and quantifying the mRNA expression level after 24 hours. As can be seen from FIG. 28, it was revealed that the activity of suppressing mRNA expression was enhanced by binding folic acid to two different portions of the complementary strand (BDX-29-PEG3-Folate).
  • Example 27 Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene in which folic acid is bound to three different complementary strands.
  • Double-stranded nucleic acid was prepared and added to the OVCAR-3 cell line at 300 nM. The cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above. The result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 29, it was revealed that cell growth inhibitory activity was enhanced by binding folic acid to three different positions of the complementary strand (BDX-37-PEG3-Folate).
  • Example 28 [Test for inhibiting mRNA expression of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene with folic acid bound to three different complementary strands]
  • the quantitative RT-PCR method described in Example 4 above The following experiment was conducted.
  • FIG. 30 shows the results of preparing various nucleic acids and adding them to the OVCAR-3 cell line so as to have a concentration of 300 nM, and quantifying the mRNA expression level after 24 hours. As can be seen from FIG. 30, it was revealed that mRNA expression inhibitory activity was further enhanced by binding folic acid to three different positions of the complementary strand (BDX-37-PEG3-Folate).
  • Example 29 Cell growth inhibitory activity test of double-stranded nucleic acid targeting human BCL2 gene in which folic acid is bound to four different strands.
  • Double-stranded nucleic acid was prepared and added to the PANC-1 cell line at 300 nM.
  • the cells were cultured for 72 hours after the addition of the double-stranded nucleic acid, and the cell growth inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was measured by the cell proliferation assay described in Example 6 above. The result is shown in FIG. As can be seen from FIG. 31, it was revealed that the cell growth inhibitory activity was further enhanced by binding folic acid to four different positions of the complementary strand (BDX-40-PEG3-Folate).
  • Example 30 [Test for inhibiting mRNA expression of double-stranded nucleic acid targeting human BCR-ABL gene with folic acid bound to the center of complementary strand]
  • the following experiment was conducted by the quantitative RT-PCR method described in Example 4 above.
  • a nucleic acid in which folic acid having a different PEG linker length is bound to the center of the complementary strand is added to the K562 cell line so as to have a concentration of 300 nM.
  • FIGS. 32 The results of quantifying the mRNA expression after time are shown in FIGS.
  • folic acid was bound to the center of the complementary strand (FIG. 32: BDX-42-PEG3-Folate, BDX-42-PEG11- Folate, FIG. 33: BDX-44-PEG3-Folate, BDX-44-PEG11-Folate, BDX-44-PEG23-Folate), and it was revealed that the mRNA expression inhibitory activity was enhanced. In this experiment, it was also confirmed that the shorter the PEG length, the higher the activity.
  • Example 31 Synthesis of double-stranded nucleic acid
  • a double-stranded nucleic acid containing a base having a DNA-DNA targeting the gene as a basic skeleton and a ligand binding site at the sugar site was designed.
  • the sequence (13 mer) of the antisense strand nucleotide for the APOB gene is shown in SEQ ID NO: 45
  • the complementary strand nucleotide sequence is shown in SEQ ID NOs: 46, 47 and 48.
  • sequence of the antisense strand nucleotide (16mer) for the MALAT-1 gene is shown in SEQ ID NO: 49
  • the complementary strand nucleotide sequence is shown in SEQ ID NOs: 50, 51, and 52.
  • a double-stranded nucleic acid is formed by annealing an antisense strand and a complementary strand of each gene sequence.
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 45 and 46 targeting the human APOB gene is BDX-45
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 45 and 47 is BDX-46-Toc (5 ′)
  • the sequence The double-stranded nucleic acid formed from numbers 45 and 48 is BDX-47
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 49 and 50 targeting the human MALAT-1 gene is from BDX-48
  • SEQ ID NOs: 49 and 51 The double-stranded nucleic acid formed is designated as BDX-49-Toc (5 ′)
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 49 and 52 is designated as BDX-50.
  • the double-stranded nucleic acid formed from SEQ ID NOs: 47 and 51 is designated as BDX-50.
  • N (m) (such as U (m)) represents 2′-Ome modified nucleotides
  • N 2 represents 2′-O-Propagyl Adenocine
  • ps represents a thiophosphate bond and po represents a phosphodiester bond as a nucleotide binding mode.
  • Example 32 [Addition of tocopherol] Tocopherol addition to the BDX-47 complementary strand (SEQ ID NO: 48) and BDX-50 complementary strand (SEQ ID NO: 52) was performed as follows. (1) In a 70% DMSO / 10% tert-BuOH solution, BDX-47 complementary strand (SEQ ID NO: 48) and BDX-50 complementary strand (SEQ ID NO: 52) and tocopherol-PEG3-azido (Tocopherol-PEG3-Azide Baslick) A click reaction was performed in the presence of a Cu (II) / THPTA complex using BCFA-028-1) produced by the manufacturer.
  • BDX-47-Toc A double-stranded nucleic acid obtained by annealing an antisense strand (SEQ ID NO: 45) targeting the human APOB gene and a BDX-47 complementary strand modified with tocopherol is referred to as BDX-47-Toc (10).
  • SEQ ID NO: 45 an antisense strand
  • SEQ ID NO: 45 a BDX-47 complementary strand modified with tocopherol
  • BDX-47-Toc a 10-mer ribonucleotide derivative of a 13-mer polynucleotide as a carrier moiety (2′-O-Propagyl Adenocine modified 10th from the 5 ′ side for binding to a ligand)
  • tocopherol is bound via a linker.
  • a double-stranded nucleic acid obtained by annealing an antisense strand (SEQ ID NO: 49) targeting the human MALAT-1 gene and a BDX-50 complementary strand modified with tocopherol is referred to as BDX-50-Toc (7).
  • BDX-50-Toc (7) a 7-mer ribonucleotide derivative of a 16-mer polynucleotide (7 'from the 5' side is 2'-O-Propagyl Adenocine modified chemically for binding to a ligand) as a carrier moiety.
  • tocopherol is bound via a linker.
  • Table 7 summarizes the double-stranded nucleic acids prepared in Examples 31 and 32.
  • Example 33 (Tm value (melting temperature) measurement] The Tm value was measured by the method shown in Example 4. The obtained Tm values are shown in Table 8.
  • Example 34 Verification of APOB and MALAT-1 gene knockdown effects in mouse liver of double-stranded nucleic acid with Toc bound to the center of complementary strand. The purpose is to confirm the knockdown effect in the mouse liver of the double-stranded nucleic acid targeting the human APOB and MALAT-1 genes.
  • the grouping was performed using the body weight of ICR mice (4-8 weeks old: male) acclimatized for several days as an index. Saline and BDX-45, 46-Toc (5 ′), 47-Toc (10), 48, 49-Toc (5 ′), 50-Toc (7) at a dose of 0.75 mg / kg (100 ⁇ l / 10 g) And administered from the tail vein. After administration, 24 (day 1), 72 (day 3), and 168 (day 7) hours later, after euthanasia by cervical dislocation, the liver was removed. Total RNA was extracted from the extracted organ, and the mRNA expression inhibitory activity of the double-stranded nucleic acid was quantified by the quantitative RT-PCR method described in Example 13 above.
  • FIG. 34 shows the result of quantifying the mRNA expression level of the APOB gene in the liver
  • FIG. 35 shows the result of quantifying the mRNA expression level of the MALAT-1 gene.
  • BDX-47-Toc (10) and BDX-50-Toc (7) with Toc bound to the center of the complementary strand are all points than double-stranded nucleic acid with Toc bound to the 5 'end. It was confirmed that the effect of suppressing mRNA expression was further enhanced.

Abstract

優れた標的遺伝子発現抑制効果を有する核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を提供すること。　転写産物（例えば標的遺伝子の転写産物）に相補的でありかつＤＮＡをベースとするアンチセンス核酸を含む活性部分と、該核酸に相補的である核酸を含むキャリアー部分とを含み、さらに、少なくとも１つのリガンドが、上記キャリアー部分の核酸の特定の領域に結合されている核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を用いることにより、上記課題は解決される。

Description

機能的リガンドを含む核酸複合体
　本発明は、例えばアンチセンス効果によって、標的遺伝子の発現を抑制する活性を有する核酸、好ましくは二本鎖核酸に関し、より詳しくは、標的遺伝子の転写産物に相補的なアンチセンス核酸と、該核酸に相補的な核酸と、この相補的核酸に結合しているリガンドとを含む核酸、好ましくは二本鎖核酸に関する。
　近年、オリゴヌクレオチドは、核酸医薬と称される医薬品としての開発が進められており、特に標的遺伝子の選択性の高さの観点から、アンチセンス法を利用した核酸医薬の開発が精力的に進められている。アンチセンス法は、標的遺伝子のｍＲＮＡ（センス鎖）の部分配列に相補的なオリゴヌクレオチド（アンチセンスオリゴヌクレオチド（ＡＳＯ））を細胞内に導入することにより、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現を選択的に阻害する方法である。
　ＡＳＯとしてＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合、標的遺伝子の転写産物（ｍＲＮＡ）と当該ＡＳＯとが結合して、部分的に二本鎖が形成され、この二本鎖が蓋の役割をして、リボソームによる翻訳を生じさせず、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることが知られている。
　また、ＡＳＯとしてＤＮＡからなるオリゴヌクレオチドを細胞に導入した場合、部分的にＤＮＡ－ＲＮＡのヘテロオリゴヌクレオチドが形成され、ＲＮａｓｅＨによってこの部分が認識され、標的遺伝子のｍＲＮＡが分解されるため、標的遺伝子がコードするタンパク質の発現が阻害されることも知られている。ＡＳＯが蓋の役割をする場合に比べ、このＲＮａｓｅＨ依存的経路の場合の方が、多くの場合において遺伝子発現の抑制効果が高いことも明らかになっている。
　ＡＳＯとしてＤＮＡを用いた場合のアンチセンス効果に関連して、特許文献１には、ＬＮＡ／ＤＮＡギャップマーとそれに対するＲＮＡからなる相補鎖とをアニーリングさせた二本鎖核酸複合体が開示されている。ここでは、当該二本鎖核酸のアンチセンス効果について記載されている。当該文献におけるような二本鎖核酸は、ＨＤＯ（ｈｅｔｅｒｏｄｕｐｌｅｘ　ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）と呼ばれるものである。
　また、核酸医薬や遺伝子治療に関しては、目的の核酸・遺伝子を標的組織へ適切に集積させること、および／または細胞内へ適切に取り込ませることが課題となっており、それらの効率を向上させるために様々な試みがなされてきた。このような核酸の送達に関して、例えば特許文献１には、脂質、糖、ペプチドおよびタンパク質等を、標的への送達機能を有する「機能性部分」として、核酸鎖の３’末端のヌクレオチドの３’位または５’末端のヌクレオチドの５’位に結合させることが記載されている。
　さらに、ＡＣＳ　ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，１１８１－１１８７（非特許文献１）には、ｓｉＲＮＡの肝細胞への送達のために、当該ｓｉＲＮＡのセンス鎖の３’末端または３’末端付近に３つのＮ－アセチルガラクトサミンを結合させることが記載されている。
特表２０１５－５０２１３４号公報
ＡＣＳ　ｃｈｅｍ．Ｂｉｏｌ．２０１５，１０，１１８１－１１８７
　本発明の目的は、優れた標的遺伝子発現抑制効果を有する核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を提供することである。
　本発明のさらに別の目的は、優れた効率で、標的細胞、例えば標的癌細胞の増殖を抑制可能な核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を提供することである。
　本発明のさらなる目的は、優れた特異性と効率で、標的組織や標的部位に送達が可能であり、それらの組織や部位において優れた標的遺伝子発現抑制を有する核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を提供することである。
　本発明の他の目的は、以下の記載から明らかとなろう。
　本発明者等は、転写産物（例えば標的遺伝子の転写産物）に相補的でありかつＤＮＡをベースとするアンチセンス核酸を含む活性部分と、該核酸に相補的である核酸を含むキャリアー部分とを含み、さらに、少なくとも１つのリガンドが、上記キャリアー部分の核酸の特定の領域に結合されている核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を用いることにより、該転写産物の発現を著しく抑制できることを見出した。
　従って、本発明は以下に関する：
１．（ｉ）化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドを含む活性部分、および
　（ｉｉ）化学修飾されていてもよいヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む核酸複合体であって、
　少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位と上記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位とを除く部位において、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に結合している、核酸複合体。
２．二本鎖核酸複合体である、上記１に記載の核酸複合体。
３．上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位であって、当該ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位ではなくかつ当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位ではない構成単位に結合している、上記１または２に記載の核酸複合体。
４．上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドが奇数個の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位を含む連続ｎ個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合しており、当該ポリヌクレオチドが偶数の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位を含む連続ｎ＋１個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合している（ここで、上記ｎは１～６の整数である）、上記１～３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
５．上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端から２～６番目の構成単位のうちの１つに結合しており、および／または３’末端から２～６番目の構成単位のうちの１つに結合している、上記１～３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
６．上記少なくとも１つのリガンドが、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、アプタマーリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、上記１～５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
７．上記少なくとも１つのリガンドが、ペプチドリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、上記６に記載の核酸複合体。
８．上記少なくとも１つのリガンドが、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、Ｎ－アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸、アナンダミドまたはスペルミンである、上記７に記載の核酸複合体。
９．上記少なくとも１つのリガンドが、リンカーを介して間接的に結合している、上記１～８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１０．上記リンカーが、ポリアルキレングリコールリンカー、マレイミドリンカー、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートリンカー、ＤＮＡリンカー、ペプチドリンカー、シランリンカー、多糖リンカー、ジスルフィドリンカーまたはトリアゾールリンカーである、上記９に記載の核酸複合体。
１１．上記少なくとも１つのリガンドが、直接結合している、上記１～８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１２．上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位、および／または上記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位に結合しているリガンドをさらに含む、上記１～１１に記載の核酸複合体。
１３．上記（ｉ）活性部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの一部または全部が化学修飾されている、上記１～１２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１４．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数の核酸類似体を含む、上記１～１３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１５．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドを含み、そして
　当該ポリヌクレオチドが、
（ａ）上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む３’ウィング領域、
を含む、
上記１～１２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１６．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ａ）５’ウィング領域および（ｂ）３’ウィング領域を含み、該５’ウィング領域は少なくとも１つの核酸類似体を含み、該３’ウィング領域は、少なくとも１つの核酸類似体を含む、上記１５に記載の核酸複合体。
１７．上記５’ウィング領域が２～５個の核酸類似体を含み、上記３’ウィング領域が２～５個の核酸類似体を含む、上記１６に記載の核酸複合体。
１８．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド、５’ウィング領域および３’ウィング領域からなる、上記１１～１７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１９．上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、上記１５～１８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２０．上記５’ウィング領域および３’ウィング領域が、核酸類似体として架橋化核酸を含む、上記１５～１９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２１．上記架橋化核酸が、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ－ＢＮＡからなる群から選択される、上記２０に記載の核酸複合体。
２２．上記架橋化核酸がホスホロチオエート化されている、上記２０または２１に記載の核酸複合体。
２３．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む、上記１～２２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２４．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが８～１００塩基である、上記１～２３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２５．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さが、８～１００塩基である、上記１～２４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２６．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、上記１～２５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２７．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、上記１～２５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２８．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび／または化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを含む、上記１～２７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２９．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されたヌクレオチドを含む、上記１～２８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３０．リガンドが結合している上記構成単位が、化学修飾されたヌクレオチドである、上記１～２９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３１．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドである、上記９、１０および１２～３０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３２．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、上記３１に記載の核酸複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部であり、ＬＫはリンカーであり、そしてＬＧはリガンドを表す］。
３３．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、上記３２に記載の核酸複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
３４．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、リガンドが直接またはリンカーを介して結合している構成単位を除き、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドからなる、上記２８～３３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３５．哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、上記１～３４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３６．活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、上記３５に記載の核酸複合体。
３７．哺乳動物において、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、上記１～３６のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３８．上記標的遺伝子ががん遺伝子であり、上記細胞が癌細胞である、上記３７に記載の核酸複合体。
３９．上記１～３８のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
４０．癌を治療および／または予防するための、上記３９に記載の医薬組成物。
　また、本発明は、以下の態様も包含し得る：
１．（ｉ）化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドを含む活性部分、および
　（ｉｉ）化学修飾されていてもよいヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
を含む核酸複合体であって、
　少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位と上記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位とを除く部位において、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に結合している、核酸複合体。
２．二本鎖核酸複合体である、上記１に記載の核酸複合体。
３．上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位であって、当該ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位ではなくかつ当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位ではない構成単位に結合している、上記１または２に記載の核酸複合体。
４．上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドが奇数個の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位を含む連続ｎ個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合しており、当該ポリヌクレオチドが偶数の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位を含む連続ｎ＋１個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合している（ここで、上記ｎは１～６の整数である）、上記１～３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
５．上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端から２～６番目の構成単位のうちの１つに結合しており、および／または３’末端から２～６番目の構成単位のうちの１つに結合している、上記１～３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
６．上記少なくとも１つのリガンドが、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、アプタマーリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、上記１～５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
７．上記少なくとも１つのリガンドが、ペプチドリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、上記６に記載の核酸複合体。
８．上記少なくとも１つのリガンドが、環状ペプチド、Ｎ－アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）もしくはその類縁体、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸もしくはその類縁体、アナンダミドまたはスペルミンである、上記７に記載の核酸複合体。
９．上記少なくとも１つのリガンドが、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、トコフェロールまたは葉酸である、上記８に記載の核酸複合体。
１０．上記少なくとも１つのリガンドが、リンカーを介して間接的に結合している、上記１～９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１１．上記リンカーが、ポリアルキレングリコールリンカー、マレイミドリンカー、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートリンカー、ＤＮＡリンカー、ペプチドリンカー、シランリンカー、多糖リンカー、ジスルフィドリンカーまたはトリアゾールリンカーである、上記１０に記載の核酸複合体。
１２．上記少なくとも１つのリガンドが、直接結合している、上記１～９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１３．上記少なくとも１つのリガンドとして、２個以上のリガンドを含む、上記１～１２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１４．互いに異なる構成単位に結合している２個以上のリガンドを含む、上記１３に記載の核酸複合体。
１５．同一の構成単位に結合している２個以上のリガンドを含む、上記１３または１４に記載の核酸複合体。
１６．上記少なくとも１つのリガンドとして、分岐リンカーを介して同一の構成単位に結合している２個以上のリガンドを含む、上記１～１１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１７．上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位、および／または当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位に結合しているリガンドをさらに含む、上記１～１６に記載の核酸複合体。
１８．上記（ｉ）活性部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの一部または全部が化学修飾されている、上記１～１７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
１９．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数の核酸類似体を含む、上記１～１８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２０．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドを含み、そして
　当該ポリヌクレオチドが、
（ａ）上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む５’ウィング領域、および／または、
（ｂ）上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む３’ウィング領域、
を含む、
上記１～１７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２１．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ａ）５’ウィング領域および（ｂ）３’ウィング領域を含み、該５’ウィング領域は少なくとも１つの核酸類似体を含み、該３’ウィング領域は少なくとも１つの核酸類似体を含む、上記２０に記載の核酸複合体。
２２．上記５’ウィング領域が２～５個の核酸類似体を含み、上記３’ウィング領域が２～５個の核酸類似体を含む、上記２１に記載の核酸複合体。
２３．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド、５’ウィング領域および３’ウィング領域からなる、上記２０～２２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２４．上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、上記２０～２３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２５．上記５’ウィング領域および３’ウィング領域が、核酸類似体として架橋化核酸を含む、上記２０～２４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２６．上記架橋化核酸が、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ－ＢＮＡからなる群から選択される、上記２５に記載の核酸複合体。
２７．上記架橋化核酸がホスホロチオエート化されている、上記２５または２６に記載の核酸複合体。
２８．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む、上記１～２７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
２９．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが８～１００塩基である、上記１～２８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３０．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さが、８～１００塩基である、上記１～２９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３１．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、上記１～３０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３２．上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、上記１～３０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３３．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび／または化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを含む、上記１～３２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３４．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されたヌクレオチドを含む、上記１～３３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３５．リガンドが結合している上記構成単位が、化学修飾されたヌクレオチドである、上記１～３４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３６．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドである、上記１０、１１および１３～３５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
３７．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、上記３６に記載の核酸複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
 ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部であり、ＬＫはリンカーであり、そしてＬＧはリガンドを表す］。
３８．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、上記３７に記載の核酸複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
 ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
３９．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、上記３７に記載の核酸複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
 または
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
 ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
４０．リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、上記３７に記載の核酸複合体：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
 ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
４１．上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、リガンドが直接またはリンカーを介して結合している構成単位を除き、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドからなる、上記３３～４０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４２．哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、上記１～４１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４３．活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、上記４２に記載の核酸複合体。
４４．哺乳動物において、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、上記１～４３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
４５．上記標的遺伝子ががん遺伝子であり、上記細胞が癌細胞である、上記４４に記載の核酸複合体。
４６．上記１～４５のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
４７．癌を治療および／または予防するための、上記４６に記載の医薬組成物。
４８．上記１～４４のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、肝疾患を治療および／または予防するための医薬組成物。
　リガンドが特定の領域に結合した本発明の核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体を用いることにより、細胞内（特に標的細胞内、例えば標的癌細胞内）における標的転写産物（典型的には標的遺伝子の転写産物）の発現を極めて特異的かつ効率的に抑制することが可能である。
　また、上記核酸複合体を用いることにより、標的細胞、好ましくは標的癌細胞の増殖を特異的かつ効率的に抑制することが可能である。
　さらに、上記核酸複合体は優れた特異性と効率で標的組織や標的部位に送達が可能であり、当該複合体を用いることにより、上記の組織や部位において、特異的かつ効率的に標的遺伝子の発現を抑制することが可能である。
図１Ａは、リガンドがリンカーを介して結合しているキャリアー部分の一態様として、例３で得られたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤのキャリアー部分を示す。図１Ｂは、リガンドとしてＧＲＧＥＳＰ（ネガティブコントロール）を使用して得られたＢＤＸ－２－ＲＧＥ（Ｎｅ）のキャリアー部分を示す。 図２Ａは、２つのリガンドが分岐リンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端以外かつ３’末端以外の１つの構成単位に結合している、本発明の核酸複合体の一態様を示す。図２Ｂは、４つのリガンドが分岐リンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端以外かつ３’末端以外の１つの構成単位に結合している、本発明の核酸複合体の一態様を示す。図２Ｃは、２つのリガンドがそれぞれ、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’側の領域と３’側の領域（５’末端以外かつ３’末端以外の領域）において、それぞれの領域における構成単位とリンカーを介して結合している、本発明の核酸複合体の一態様を示す。図２Ｄは、１つのリガンドがリンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端以外かつ３’末端以外の１つの構成単位に結合し、さらに別の１つのリガンドがリンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に結合している、本発明の核酸複合体の一態様を示す。図２Ｅは、本発明の核酸複合体が１つのリガンドを含む場合の一態様を示す。 図３は、Ａ５４９細胞株を用いた場合の、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験の結果を示す。 図４Ａは、ＢＤＸ－２－ＤＥｃＲＧＤのキャリアー部分の構造を示す。 図４Ｂは、ＢＤＸ－２－ＴＥｃＲＧＤのキャリアー部分の構造を示す。 図４Ｃは、ＰＥＧ３-Ｆｏｌａｔｅの構造を示す。 図４Ｄは、ＰＥＧ１１-Ｆｏｌａｔｅの構造を示す。 図４Ｅは、ＰＥＧ２３-Ｆｏｌａｔｅの構造を示す。 図５は、相補鎖中央部に１量体、２量体、４量体のｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸のＯＶＣＡＲ－３細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果を示す。 図６は、相補鎖中央部に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤのＤＵ１４５細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果示す。 図７は、相補鎖中央部に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤのＰＡＮＣ－１細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果示す。 図８は、相補鎖中央部に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤのＰＣ－３細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果示す。 図９は、相補鎖中央部に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤのＣａｋｉ－１細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果示す。 図１０は、相補鎖中央部に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤのＭＣＡＳ細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果示す。 図１１は、ＢＤＸ－４－ｃＲＧＤを１μＭとなるようにＰＡＮＣ－１細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を示す。 図１２は、ＢＤＸ－５－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－５－ＤＥｃＲＧＤ、ＢＤＸ－５－ＴＥｃＲＧＤを１０μＭとなるようにＫ５６２細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を示す。 図１３は、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルの膵癌部位におけるＢＣＬ２遺伝子ノックダウン効果を示す。 図１４は、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおける薬効評価の結果を示す。 図１５は、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の肝毒性軽減効果に関して、肝重量比の結果を示す。 図１６は、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の肝毒性軽減効果に関して、ＡＳＴ値を示す。 図１７は、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の肝毒性軽減効果に関して、ＡＬＴ値を示す。 図１８は、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおける生存期間延長効果を示す。 図１９は、相補鎖の異なる一箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＰＡＮＣ－１細胞株）の結果を示す。 図２０は、相補鎖の異なる一箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＡｓＰＣ－１細胞株）の結果を示す。 図２１は、相補鎖の異なる一箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＯＶＣＡＲ－３細胞株）の結果を示す。 図２２は、相補鎖の異なる二箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＰＡＮＣ－１細胞株）の結果を示す。 図２３は、相補鎖の異なる二箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験（ＰＡＮＣ－１細胞株）の結果を示す。 図２４は、相補鎖中央部に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＯＶＣＡＲ－３細胞株）の結果を示す。 図２５は、相補鎖中央部に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＯＶＣＡＲ－３細胞株）の結果を示す。 図２６は、ＢＤＸ－１５－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅを１、３、１０μＭとなるようにＯＶＣＡＲ－３細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を示す。 図２７は、相補鎖の異なる二箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（Ａ５４９細胞株）の結果を示す。 図２８は、相補鎖の異なる二箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験（ＯＶＣＡＲ－３細胞株）の結果を示す。 図２９は、相補鎖の異なる三箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＯＶＣＡＲ－３細胞株）の結果を示す。 図３０は、相補鎖の異なる三箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験（ＯＶＣＡＲ－３細胞株）の結果を示す。 図３１は、相補鎖の異なる四箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験（ＰＡＮＣ－１細胞株）の結果を示す。 図３２は、相補鎖中央部に葉酸を結合させたヒトＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。 図３３は、相補鎖中央部に葉酸を結合させたヒトＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験の結果を示す。 図３４は、肝臓におけるＡＰＯＢ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した結果を示す。 図３５は、肝臓におけるＭＡＬＡＴ－１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した結果を示す。
　上述のように、本発明の核酸複合体は、（ｉ）アンチセンス核酸（ＤＮＡをベースとする核酸）を含む活性部分と（ｉｉ）該アンチセンス核酸に少なくとも一部が相補的な核酸を含むキャリアー部分とを含み、少なくとも１つのリガンドが、上記キャリアー部分の核酸の特定の領域に結合されている核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体である。そして、本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体は、合成、精製および／または単離された核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体である。当該核酸複合体は、標的遺伝子の発現や転写産物（タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物またはタンパク質をコードしない転写産物）のレベルをアンチセンス効果によって抑制する活性を有する。
　また、本発明の核酸複合体は、標的転写産物（典型的には遺伝子の転写産物）の選択に応じて、標的細胞、好ましくは標的癌細胞の増殖を抑制することができる。典型的には、標的遺伝子の発現亢進を伴う細胞を標的細胞とし、本発明の核酸複合体により、その増殖を抑制することができる。例えば、本発明の核酸複合体により、標的癌細胞においてがん遺伝子（例えば、アポトーシス抑制機能を有するＢＣＬ２遺伝子、またはＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子）を標的遺伝子としてその発現を抑制することにより、当該癌細胞の増殖を抑制することができる。
　さらに、本発明の核酸複合体は、優れた特異性と効率で、標的組織や標的部位に送達が可能なため、それらの組織や部位において、標的遺伝子の発現を効率的に抑制することができ、従って、当該核酸複合体を対象に投与することによって、必要に応じて組織・部位特異的に、標的遺伝子の発現亢進等を伴う細胞の増殖を抑制し、それによってこのような発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防することも可能である。例えば、本発明の核酸複合体により、各種癌細胞において、ＢＣＬ２遺伝子またはＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子を標的としてその発現を抑制することにより、癌を治療および／または予防することも可能である。また、例えば、本発明の核酸複合体により、肝細胞において、ＡＰＯＢのような遺伝子や転位関連肺腺癌転写産物（ＭＡＬＡＴ－１）を標的としてその発現を抑制することにより、肝疾患（典型的には脂質異常症や肝臓癌）を治療または予防することも可能である。
　実際に本願では、実施例に示すように、本発明の核酸複合体が、動物モデルにおいて抗腫瘍効果を奏することが実証された。
　ここで、「活性部分」とは、上記核酸複合体の構成要素の１つであって、上記核酸複合体に関して意図する主要な効果、すなわち、標的遺伝子や標的転写産物（以下、両者をまとめて「標的転写産物」とも呼ぶ）の発現や標的細胞の増殖を抑制する効果を達成するための機能を主として担うと考えられる部分、換言すると、標的転写産物の発現抑制活性や標的細胞の増殖抑制活性を有する部分である。
　上記活性部分は、標的転写産物に対するアンチセンス核酸としてのポリヌクレオチドを含む。本発明の１つの実施態様において、上記活性部分はポリヌクレオチドであり、すなわち、ポリヌクレオチドのみからなる。
　また、活性部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含む。上記デオキシリボヌクレオチドは化学修飾されていても、化学修飾されていなくてもよい。本発明の１つの実施態様において、上記デオキシリボヌクレオチドは修飾されている。
　本発明の１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体のみを構成単位として含む。本発明のさらなる実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されたデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体のみを構成単位として含む。本発明の別の態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されたデオキシリボヌクレオチド、化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドおよび任意に核酸類似体のみを構成単位として含む。
　本発明において、「キャリアー部分」とは、上記核酸複合体の構成要素の１つであって、上記活性部分が標的転写産物に到達するまでの適切な期間、当該活性部分のキャリアーとしての機能を有すると考えられる部分である。
　上記キャリアー部分は、活性部分のポリヌクレオチドに対して少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドを含む。このような相補性により、当該キャリアー部分は、そこにおけるポリヌクレオチドが上記活性部分のポリヌクレオチドと二本鎖を形成し、それによってキャリアーとしての機能を果たす。本発明の１つの実施態様において、上記キャリアー部分はポリヌクレオチドであり、すなわち、ポリヌクレオチドのみからなる。
　また、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの構成単位であるヌクレオチドは化学修飾されていても、化学修飾されていなくてもよい。そして、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含む。本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいヌクレオチドと任意に核酸類似体のみを構成単位として含む。
　上記核酸複合体はさらに、少なくとも１つのリガンド、例えば１～１０個、好ましくは１～６個、例えば１、２、３、４または５個のリガンドを含む。上記核酸複合体が複数のリガンドを含む場合、それらのリガンドは同じであってもよく、あるいは各々互いに異なっていてもよい。
　本発明において、「リガンド」とは、レセプターと結合する能力を有する物質を意味しており、典型的にはレセプターに特異的に結合可能な物質を利用することができる。レセプターはリガンドを結合可能な物質であれば特に限定されないが、例えば、細胞膜上に存在する種々のレセプターが挙げられる。すなわち、ここで用いる場合、「リガンド」と「レセプター」の用語は、互いに結合可能な相手、好ましくは互いに特異的に結合可能な相手の意味で用いており、それらの結合により何らかの生体反応が惹起されるものに限定されない。例えば、標的細胞の細胞膜表面に存在するレセプターに特異的に結合可能な物質をリガンドとして使用することができる。
　上記リガンドは、例えば、タンパク質、ペプチド、アプタマー、糖鎖、脂質、低分子、生体分子／生体活性分子であることができるが、これらに限定はされない。
　「タンパク質」は、α－Ｌ－アミノ酸（グリシンを含む）がペプチド結合により直鎖状に連結したものを意味する。本明細書においては、タンパク質は、アミノ酸のみからなる単純タンパク質も、アミノ酸以外の構成成分を含む複合タンパク質も含む概念であり、１００残基以上のアミノ酸から構成されるものを指す。リガンドとして使用されるタンパク質（以下、「タンパク質リガンド」とも呼ぶ）の例としては、脂肪酸結合タンパク質ＦＡＢＰ１～１２（ｆａｔｔｙ　ａｃｉｄ　ｂｉｎｄｉｎｇ　ｐｒｏｔｅｉｎ　１－１２）、外膜特異的リポタンパク質分子シャペロンＬｏｌＡ、外膜特異的リポタンパク質受容体ＬｏｌＢ、リポキシゲナーゼおよびシクロオキゲナーゼが挙げられる。
　またリガンドとして使用できるタンパク質としては、抗体も挙げることができる（以下、「抗体リガンド」とも呼ぶ）。例えば、適切なレセプターを選択し、それを抗原として認識する抗体をリガンドとして使用することにより、本発明の核酸複合体を、当該レセプターが存在する標的細胞や標的組織（典型的には、当該レセプターが表面に存在する標的細胞や標的組織）に特異的に送達することができる。
　また、リガンドとしてはペプチドを使用することもできる。「ペプチド」とは、２分子以上のアミノ酸がペプチド結合で連結した物質であり、本明細書においては、１００残基未満のアミノ酸が連結した物質を指す。本発明においては、好ましくは、６０残基以下のアミノ酸、例えば５０残基以下、４０残基以下、３０残基以下、２０残基以下、または１０残基以下のアミノ酸、例えば９残基以下、８残基以下、７残基以下、６残基以下、５残基以下のアミノ酸が連結したペプチドがリガンドとして使用される。リガンドとして使用されるペプチド（以下、「ペプチドリガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、その例としては、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドのような環状ペプチド、インスリン、グルカゴン様ペプチド－１、バソプレシン、オキシトシンが挙げられる。
　ここで、「環状ＲＧＤ配列含有ペプチド」（以後、「ｃＲＧＤ」、「ｃＲＧＤペプチド」とも呼ぶ）は、少なくとも１つのアルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列を有し、環状構造を形成するペプチドである。上記の「環状ペプチド」は、好ましくは、環状ＲＧＤ配列含有ペプチドと同一のまたは類似のリガンド特性、特に標的特異性を有するペプチドである。なお、環状ペプチドの配列長は特に制限されないが、環構造を形成する観点から、アミノ酸数が通常３以上、例えば、４～１５または５～１０であることが好ましい。
　ＲＧＤ配列は、細胞表面上の細胞接着分子であるインテグリン分子（特にαＶβ３やαＶβ５等）に結合してこれを活性化することや、細胞側のエンドサイトーシスを誘導することが知られており、ＲＧＤぺプチドの腫瘍標的リガンドとしての使用も知られている。
　本発明では、斯かるＲＧＤ配列を有し、環状構造を形成するペプチドであれば、任意のｃＲＧＤペプチドを使用することが可能である。
　ｃＲＧＤペプチドの配列長は特に制限されないが、環構造を形成する観点から、アミノ酸数が通常３以上、例えば、４～１５または５～１０であることが好ましい。
　また、ＲＧＤ配列以外の部分を構成するアミノ酸の種類およびこれらの配列は任意である。従って、ｃＲＧＤペプチドは、生体を構成する２０種類のアミノ酸の他に、その他の種類の天然アミノ酸や合成アミノ酸を含んでいてもよい。ただし、本発明の核酸複合体の投与対象に望ましくない影響を及ぼさず、当該複合体の活性を実質的に損なわず、さらにＲＧＤ配列の機能を妨げないアミノ酸およびそれらの配列が好ましい。
　上述のように、ｃＲＧＤペプチドは、少なくとも１つのＲＧＤ配列を有する。本発明の１つの実施態様において、上記ｃＲＧＤペプチドは、１つのＲＧＤ配列を有する。
　ｃＲＧＤペプチドの具体例としては、以下のアミノ酸配列を有するペプチドが挙げられるがこれに限定はされない：
　ｃＲＧＤｆＫ（Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｌｙｓ）（配列番号５３）。
　上記ｃＲＧＤペプチドは、周知の自動合成装置によって合成することが可能であり、または市販されているもの（例えば、Ｓｅｌｌｅｃｋ社製「Ｃｙｃｌｏ（－ＲＧＤｆＫ）」）を使用することも可能である。
　さらに、リガンドとしてはアプタマーを使用することもできる（以下、「アプタマーリガンド」とも呼ぶ）。アプタマーとは、特定の分子と、典型的にはハイブリダイズ以外の手段で、特異的に結合する核酸分子であり、通常、核酸の配列をランダムに変化させて、標的の分子と特異的に結合するものを当業者に公知の方法（例えばＳＥＬＥＸ法や一段階セレクション法）を用いて選択することによって得ることができる。従って、標的分子に特異的に結合するアプタマーをリガンドとして使用することにより、本発明の核酸複合体を、当該標的分子が存在する標的細胞や標的組織（典型的には、当該標的分子が表面に存在する標的細胞や標的組織）に特異的に送達することができる。
　リガンドとしては糖鎖を使用することもできる。ここで「糖鎖」とは、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、キシロース、Ｎ－アセチルグルコサミン、Ｎ－アセチルガラクトサミン、シアル酸などの単糖およびこれらの誘導体がグリコシド結合によって鎖状に結合した分子を指す。リガンドとして使用される糖鎖（以下、「糖鎖リガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、その例としては、Ｎ－アセチルガラクトサミン、ヒアルロン酸、デキストリンおよびセルロースが挙げられる。
　リガンドとしては脂質を使用することもできる。本明細書で使用する場合に、「脂質」には、単純脂質、複合脂質および誘導脂質が含まれる。リガンドとして使用される脂質（以下、「脂質リガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、例えば、複合脂質であるリン脂質や糖脂質、誘導脂質である脂肪酸やステロイドが挙げられる。リン脂質の例としてはスフィンゴリン脂質、糖脂質の例としてはスフィンゴ糖脂質、脂肪酸の例としては、直鎖状または分岐状のＣ４～Ｃ３０飽和または不飽和脂肪酸、例えば、ラウリン酸、ミリスチン酸、パルミチン酸、ステアリン酸、オレイン酸、リノレン酸、ドコサン酸が挙げられ、ステロイドの例としてはコレステロールが挙げられる。また、脂溶性ビタミンであるビタミンＥ（トコフェロール）もリガンドとして使用できる脂質の一例として挙げることができる。トコフェロールは、例えば、α-トコフェロール、β-トコフェロール、γ-トコフェロールおよびδ-トコフェロールからなる群から選択される。また、本発明では、トコフェロールの類縁体を使用することもできる。
　ここで、「類縁体（ａｎａｌｏｇ）」とは、ある化合物と同一または類似の基本骨格を有し、類似した構造および性質を有する化合物、特に同一または類似のリガンド特性を有する化合物を指す。類縁体には、例えば、生合成中間体、代謝産物、置換基を有する化合物などが含まれる。ある化合物が別の化合物の類縁体であるかどうかは、当業者であれば判定することが可能である。
　本明細書において、「トコフェロール類縁体」には、トコフェロールの不飽和アナログ（例えば、α-トコトリエノール、β-トコトリエノール、γ-トコトリエノール、δ-トコトリエノール等のトコトリエノール）、トコフェロールもしくは上記不飽和アナログの薬学的に許容可能なエステル（例えば、酢酸エステル、コハク酸エステル、プロピオン酸エステル）、およびそれらの薬学的に許容可能な塩（例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、カルシウム塩、マグネシウム塩）が含まれる。上記の塩は、特に、コハク酸のような二カルボン酸とのエステルの場合に形成させることが可能である。上記のトコフェロール類縁体は、トコフェロールと同一のまたは類似のリガンド特性、特に標的特異性を有することができる。
　リガンドとしては低分子・低分子化合物を使用することもできる。リガンドとして使用され得る低分子・低分子化合物（以下、「低分子リガンド」とも呼ぶ）は、特に限定されないが、その例としては、アニスアミド、チロフィバン、および２－ピロリジン－１－イル－Ｎ－［４－［４－（２－ピロリジン－１－イル－アセチルアミノ）－ベンジル］－フェニル］－アセトアミドが挙げられる。
　リガンドとしては生体分子／生体活性分子を使用することもできる。リガンドとして使用され得る生体分子／生体活性分子（以下、「生体分子／生体活性分子リガンド」とも呼ぶ）は、生体に関連する分子、または生体に影響を与え得る活性を有する分子であれば特に限定されないが、その例としては、葉酸、アナンダミド、スペルミンが挙げられる。
　例えば、「葉酸」は、すべての細胞がＤＮＡ合成に必要とするビタミン（水溶性ビタミン）である。多くの癌細胞において葉酸受容体が過剰発現していることが報告されており、従って、葉酸は癌標的リガンドとして広く使用されている。また、葉酸と葉酸受容体の複合体がエンドサイトーシスによって細胞内に取り込まれることや、多くの癌細胞において、葉酸の取り込みが多いことも報告されている。
　本発明では、このような葉酸も上記リガンドとして使用することができ、葉酸は例えば、市販のもの（例えば、Ｓｉｇｍａ－Ａｌｄｒｉｃｈ社製「葉酸」）を容易に入手することが可能である。また、本発明では、葉酸の類縁体を使用することもできる。
　ここで、本明細書において、「葉酸類縁体」は、ベンゾイル部分を介してアミノ酸部分（好ましくはグルタミン酸部分）と結合した縮合ピリミジン複素環を有する化合物、すなわち、アミノ酸部分、ベンゾイル部分および縮合ピリミジン複素環をベースとした化合物を指す（葉酸自体は除く）。上記「縮合ピリミジン複素環」としては、例えば、プテリジン又は二環式ピロロピリミジンなど５若しくは６員環の複素環をさらに融合させたピリミジンを挙げることができる。葉酸またはその類縁体の例としては、葉酸(プテロイル－グルタミン酸)骨格をベースとし、任意選択的に置換された葉酸、ホリニン酸、プテロポリグルタミン酸、ならびに葉酸レセプター結合プテリジン、例えば、テトラヒドロプテリン、ジヒドロ葉酸、テトラヒドロ葉酸、デアザおよびジデアザアナログが挙げられる。上記の葉酸類縁体は、葉酸と同一のまたは類似のリガンド特性、特に標的特異性を有することができる。
　また、当業者は、他の生体分子／生体活性分子リガンドについても、それぞれのレセプターの情報、例えば、各種組織や細胞における発現レベルや発現特異性等を考慮に入れながら、本発明の核酸複合体の所望の標的に応じて、適切な生体分子／生体活性分子リガンドを適宜選択することが可能である。
　本発明の１つの好ましい態様において、上記リガンドは、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、アプタマーリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択され、より好ましくはペプチドリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される。
　本発明のさらなる好ましい態様において、上記リガンドは、環状ペプチド、例えば環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、葉酸もしくはその類縁体、ビタミンＥ（トコフェロール）もしくはその類縁体、ステアリン酸、ドコサン酸、アナンダミド、スペルミン、コレステロール、アニスアミドまたはＮ－アセチルガラクトサミンから選択される。
　本発明の別の実施態様において、上記リガンドは、ペプチドリガンド、生体分子／生体活性分子リガンドまたは脂質リガンドから選択され、例えば、環状ＲＧＤ配列含有ペプチド、葉酸またはビタミンＥ（トコフェロール）から選択される。
　好ましくは、上記のようなリガンドを有する本発明の核酸複合体は、上記リガンドが特異的に結合可能なレセプターを有する細胞や組織（例えばそれらの表面に有する）を標的細胞または標的組織とすることができる。標的細胞や標的組織の種類は特に限定されず、目的などに応じて適宜の細胞や組織を標的とすることができる。例えば、標的細胞は組織や臓器を形成する細胞であってもよい。あるいは、標的細胞は、白血病細胞のように単独で存在する細胞であってもよく、固形がん細胞のように組織に腫瘍を形成している細胞やリンパ組織や他の組織に浸潤している細胞などであってもよい（以下、これらの細胞をまとめて単に「癌細胞」とも呼ぶ）。
　このように、本発明では、細胞特異的標的リガンドまたは組織特異的標的リガンドを用いることにより、上記核酸複合体を標的細胞または標的組織に標的化送達することが可能である。細胞特異的標的リガンドまたは組織特異的標的リガンドは、種々の細胞、組織に特異的なリガンドが当業者に知られており、本発明では、それらを目的に応じて適宜使用することが可能である。上記リガンドは、その機能（標的特異性）に基づいても分類することができ、上記リガンドは例えば、癌性細胞特異的標的リガンドもしくは癌性組織特異的標的リガンド（まとめて、「癌標的リガンド」とも呼ぶ）、または肝臓に特異的な肝臓標的リガンドであることができる。
　癌標的リガンドは、癌性細胞もしくは癌性組織に特異的なリガンドであれば特に限定はされない。このようなリガンドの例についても当業者によく知られており、例えばインテグリン高親和性リガンド（例えば、上述の環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド）や葉酸受容体高親和性リガンド（例えば、上述の葉酸もしくはその類縁体）、トランスフェリン受容体高親和性リガンド、ＣＤ３４高親和性リガンド、前立腺特異的膜抗原（ＰＳＭＡ）高親和性リガンド（例えば、２－［３－（１，３－ｄｉｃａｒｂｏｘｙｐｒｏｐｙｌ）ｕｒｅｉｄｏ］ｐｅｎｔａｎｅｄｉｏｉｃ　ａｃｉｄ　（ＤＵＰＡ））を挙げることができる。
　肝臓標的リガンドは、肝細胞もしくは肝臓に特異的なリガンドであれば特に限定はされない。このようなリガンドの例についても当業者によく知られており、例えばα－ＴＰＰ高親和性リガンド（例えば、上述のトコフェロールもしくはその類縁体）、アシアロ糖タンパク質受容体高親和性リガンド（例えば、Ｎ－アセチルグルコサミン）を挙げることができる。
　１つの実施態様において、上記核酸複合体は、活性部分、キャリアー部分およびリガンドのみからなる。本発明の他の実施態様において、上記核酸複合体は、活性部分、キャリアー部分、リガンドおよびリンカーのみからなる。
　「アンチセンス効果」とは、標的転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、例えば、その部分配列に相補的なＤＮＡ鎖、又は通常アンチセンス効果が生じるように設計された鎖等とがハイブリダイズすることによって生じる、標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルの抑制を意味する。ある場合においては、ハイブリダイゼーション産物により前記転写産物を被覆することによって生じ得る翻訳の阻害又はエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果、及び／又は、ハイブリダイズした部分が認識されることにより生じ得る前記転写産物の分解によって生じる、前記抑制も包含し得る。
　アンチセンス効果によって発現が抑制される「標的遺伝子」又は「標的転写産物」としては、特に制限はなく、例えば、各種疾患において発現が亢進している遺伝子が挙げられる。本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子は、がん遺伝子または脂質異常症に関連する遺伝子である。また「標的遺伝子の転写産物」とは、標的遺伝子をコードするゲノムＤＮＡから転写されたｍＲＮＡのことであり、塩基の修飾を受けていないｍＲＮＡや、スプライシングを受けていないｍＲＮＡ前駆体等も含まれる。通常、「転写産物」は、ＤＮＡ依存性ＲＮＡポリメラーゼによって合成される、いかなるＲＮＡでもよい。
　「合成、精製および／または単離された核酸複合体」という文言は、ここでは少なくとも２つのポリヌクレオチド鎖を含む核酸複合体であって、各ポリヌクレオチドの構成単位はそれぞれ天然に生じる物質であっても、天然には生じない物質でもあってもよいが、ポリヌクレオチド自体（すなわちポリヌクレオチド全体）としては、天然では生じないものおよび／または天然では実質的に生じないものを意味する。
　本発明の１つの態様において、上記核酸複合体は二本鎖核酸複合体である。
　「相補的」という文言は、ヌクレオチドの塩基が他のヌクレオチドの塩基と、水素結合を介して、いわゆるワトソン－クリック型塩基対（天然型塩基対）や非ワトソン－クリック型塩基対（フーグスティーン型塩基対等）を形成できる関係のことを意味する。例えば、ＤＮＡにおいては、アデニン（Ａ）がチミジン（Ｔ）に対して相補的であり、ＲＮＡにおいては、アデニン（Ａ）はウラシル（Ｕ）に対して相補的である。
　例えば、活性部分のポリヌクレオチドのある位置のヌクレオチドが、標的遺伝子の転写産物のある位置のヌクレオチドと水素結合を介して塩基対を形成できる場合、上記ポリヌクレオチドと上記転写産物は、当該水素結合の位置において相補的であると考えられる。
　あるポリヌクレオチドが他のポリヌクレオチドとハイブリダイズもしくはアニーリング（本明細書では、これらの語を互換的に使用する）するためには、両ポリヌクレオチドは、塩基配列の全ての位置において相補的である必要はない。そして、本発明に関しても、核酸複合体が機能を発揮するためには、塩基配列の全ての位置において相補的である必要はなく、一部の位置におけるミスマッチが許容される。
　例えば、標的転写産物の塩基配列と、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列とは、完全に相補的である必要はなく、すなわち、両者は全ての位置で相補的である必要はない。
　本発明では、活性部分におけるポリヌクレオチドは、その少なくとも一部が、標的転写産物に対して相補的である。本発明の１つの実施態様において、標的転写産物の塩基配列と活性部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列は、その少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上、または１００％）が相補的であればよい。例えば、７０％のヌクレオチドが相補的な場合、両者は７０％の「相補性」を有する。本発明の好ましい１つの実施態様において、両者は完全に相補的であり、すなわち、１００％の相補性を有する。
　なお、２つのポリヌクレオチドの相補性（例えば、標的転写産物と活性部分のポリヌクレオチドとの相補性）は、両者が異なる長さを有する場合には、二本鎖形成領域（ミスマッチを含む場合にはそれらを含めた二本鎖形成領域全体）における相補性として算出することができる。
　配列の相補性は、ＢＬＡＳＴプログラム等を利用することにより決定することができる。そして、当業者であれば、例えば、標的遺伝子の塩基配列の情報に基づいて、標的転写産物に相補的なアンチセンス核酸を容易に設計することができる。
　本発明では、活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上述の相補性に基づいて「アニーリング」し、二本鎖を形成することができる。当業者であれば、２本の核酸鎖がアニーリングできる条件（温度、塩濃度等）を容易に決定することができる。
　本明細書において、「核酸」とは、天然型核酸、非天然型核酸及び／又は核酸類似体をいうが、「核酸」はモノマーヌクレオチドを意味する場合もあり、複数のモノマーから構成されるオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを意味する場合もある。「核酸鎖」という文言は、ここではオリゴヌクレオチドやポリヌクレオチドを称するためにも用いられる。核酸鎖は、その全部又は一部を、自動合成機の使用といった化学合成法によって調製してもよく、ポリメラーゼ、ライゲース又は制限酵素反応に限定されるわけではないが、酵素処理により調製してもよい。本発明の１つの実施態様において、本発明の核酸複合体におけるポリヌクレオチドは、化学合成または酵素的反応によって人工的に調製されたものである。
　本明細書において、「天然型核酸」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、リン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合の橋をつくって結ばれ重合した自然界に存在するポリヌクレオチドをいう。通常は、アデニン、グアニン、シトシン及びウラシルのいずれかの塩基を有するリボヌクレオチドが連結したＲＮＡ及び／又はアデニン、グアニン、シトシン及びチミンのいずれかの塩基を有するデオキシリボヌクレオチドが連結したＤＮＡが該当する。
　本明細書において、「非天然型核酸」とは、非天然型ヌクレオチドを含む又はそれからなる核酸をいう。ここで「非天然型ヌクレオチド」とは、人工的に構築された又は人工的に化学修飾された自然界に存在しないヌクレオチドであって、前記天然に存在するヌクレオチドに類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオチド、又は天然に存在するヌクレオシド若しくは塩基に類似の性質及び／又は構造を有するヌクレオシド若しくは塩基を含むヌクレオチドをいう。例えば、脱塩基ヌクレオシド、アラビノヌクレオシド、２’－デオキシウリジン、α－デオキシリボヌクレオシド、β－Ｌ－デオキシリボヌクレオシド、その他の糖修飾を有するヌクレオチドが挙げられる。さらに、置換五単糖（２’－Ｏ－メチルリボース、２’－デオキシ－２’－フルオロリボース、３’－Ｏ－メチルリボース、１’，２’－デオキシリボース）、アラビノース、置換アラビノース糖；置換六単糖及びアルファ－アノマーの糖修飾を有するヌクレオチドが含まれる。また、非天然型ヌクレオチドは、人工的に構築された塩基類似体又は人工的に化学修飾された塩基（修飾塩基）を包含するヌクレオチドも含む。「塩基類似体」には、例えば、２－オキソ（１Ｈ）－ピリジン－３－イル基、５位置換－２－オキソ（１Ｈ）－ピリジン－３－イル基、２－アミノ－６－（２－チアゾリル）プリン－９－イル基、２－アミノ－６－（２－チアゾリル）プリン－９－イル基、２－アミノ－６－（２－オキサゾリル）プリン－９－イル基等が挙げられる。「修飾塩基」には、例えば、修飾化ピリミジン（例えば、５－ヒドロキシシトシン、５－フルオロウラシル、４－チオウラシル）、修飾化プリン（例えば、６－メチルアデニン、６－チオグアノシン）及び他の複素環塩基等が挙げられる。メチルホスホネート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、ホスホロチオエート型ＤＮＡ／ＲＮＡ（すなわち、チオリン酸結合を有するＤＮＡ／ＲＮＡ）、ホスホルアミデート型ＤＮＡ／ＲＮＡ、２’－Ｏ－メチル型ＤＮＡ／ＲＮＡ等の化学修飾核酸や核酸類似体も含むこともできる。
　本明細書において「核酸類似体」とは、天然型核酸に類似の構造及び／又は性質を有する人工的に構築された化合物をいう。例えば、ペプチド核酸（ＰＮＡ：Ｐｅｐｔｉｄｅ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、ホスフェート基を有するペプチド核酸（ＰＨＯＮＡ）、架橋化核酸（ＢＮＡ／ＬＮＡ：Ｂｒｉｄｇｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ／Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ）、モルホリノ核酸等が挙げられる。なお、これらの核酸類似体は、上記のような化学修飾をさらに受けていてもよい。
　本発明の１つの実施態様において、本発明の核酸複合体は、上記のような各種核酸を適宜組み合わせて含むかまたは組み合わせてなる核酸（ポリヌクレオチド）を、活性部分および／またはキャリアー部分に有する。
　本発明では、活性部分におけるポリヌクレオチドは「化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体」を構成単位として少なくとも含む。この文言は、上記ポリヌクレオチドが、化学修飾されているかもしくはされていないデオキシリボヌクレオチドを有し、また任意に核酸類似体を更に有していてもよいということを意味する。
　キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、「化学修飾されていてもよいヌクレオチドと任意に核酸類似体」を構成単位として少なくとも含む。この文言は、上記ポリヌクレオチドが、化学修飾されているかもしくはされていないヌクレオチドを有し、また任意に核酸類似体を更に有していてもよいということを意味する。ここで、必須の構成単位である上記ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドであっても、リボヌクレオチドであっても、これらの組み合わせであってもよい。また、当該ヌクレオチドはそれぞれ独立に、化学修飾されていても、化学修飾されていなくてもよい。
　活性部分におけるポリヌクレオチドの長さは特に制限はないが、好ましくは少なくとも８塩基であり、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、又は少なくとも１５塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下、２０塩基以下、１９塩基以下、１８塩基以下または１７塩基以下であることができる。前記長さの範囲は、好ましくは１０～３５塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、さらに好ましくは１３～２０塩基である。通常、前記標的に対する核酸鎖によるアンチセンス効果の強さや、費用、合成収率等の他の要素に応じて、前記長さは選択される。
　本発明の１つの実施形態において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、標的転写産物に少なくとも一部が相補的なアンチセンスポリヌクレオチドであって、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドを含む領域を有するポリヌクレオチドであることができる。
　「少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド」は、４～２０塩基の連続したデオキシリボヌクレオチド（化学修飾されていてもよい）を含む領域であることができ、好ましくは５～１６塩基の連続したデオキシリボヌクレオチド（化学修飾されていてもよい）を含む領域であり、より好ましくは６～１４塩基、例えば７～１３塩基の連続したデオキシリボヌクレオチド（化学修飾されていてもよい）を含む領域である。この領域には、リボヌクレオチドにハイブリダイズした際に、ＲＮＡ鎖を切断するＲＮａｓｅＨによって認識されるヌクレオチド、例えば天然型デオキシリボヌクレオチドやリン酸塩結合部分のみが化学修飾されたデオキシリボヌクレオチド（例えばホスホロチオエート化デオキシリボヌクレオチド）を用いることもできる。また、本発明の１つの実施態様において、上記デオキシリボヌクレオチドにおいて、各ヌクレオチドは互いに独立に修飾されており、デオキシリボヌクレオチドに関して利用可能な修飾はこの分野において知られている。
　本明細書において、「ヌクレオチド」とはヌクレオシドの糖部分がリン酸とエステルをつくっている化合物を意味し、ここで「ヌクレオシド」とは、プリン塩基またはピリミジン塩基のような窒素を含む有機塩基と糖の還元基とがグリコシド結合によって結合した配糖体化合物を意味する。
　また、「デオキシリボヌクレオチド」は、糖部分がＤ－２－デオキシリボースからなるヌクレオチドであり、「リボヌクレオチド」は、糖部分がＤ－リボースからなるヌクレオチドである。
　「ポリヌクレオチド」とは、ヌクレオチドを基本単位とし、リン酸が各ヌクレオチド間で糖の３’と５’位炭素の間にジエステル結合の橋をつくって結ばれた、複数のヌクレオチドが重合した鎖状の物質を意味する。これは、いわゆるオリゴヌクレオチドも包含する。なお、本明細書では、このようなポリヌクレオチドにその構成単位として含まれるヌクレオチド（重合した状態にある）についても同様に「ヌクレオチド」と呼ぶ。
　ここで、上記「デオキシリボヌクレオチド」は、天然に存在するデオキシリボヌクレオチドを意味する。当該デオキシリボヌクレオチドは、その塩基、糖若しくはリン酸塩結合が化学修飾されていてもよい。同様に、「リボヌクレオチド」は、天然に存在するリボヌクレオチドを意味する。当該リボヌクレオチドは、その塩基、糖若しくはリン酸塩結合が化学修飾されていてもよい。化学修飾としては例えば上述したようなものが考えられる。
　本発明の１つの実施態様において、化学修飾ヌクレオチドは、塩基部位が修飾されていてもよい。塩基部位の修飾としては、例えば、シトシンの５－メチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、Ｎ４－メチル化、チミジンの５－デメチル化、５－フルオロ化、５－ブロモ化、５－ヨード化、アデニンのＮ６－メチル化、８－ブロモ化、グアニンのＮ２－メチル化、８－ブロモ化が挙げられる。さらにまた、ある実施態様における化学修飾ヌクレオチドにおいては、リン酸ジエステル結合部位が修飾されていてもよい。リン酸ジエステル結合部位の修飾としては、例えば、ホスホロチオエート化、メチルホスホネート化、メチルチオホスホネート化、キラル－メチルホスホネート化、ホスホロジチオエート化、ホスホロアミデート化が挙げられるが、体内動態に優れているという観点から、ホスホロチオエート化（チオリン酸結合）が好ましい。また、このような塩基部位の化学修飾やリン酸ジエステル結合部位の化学修飾は同一のヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
　当業者であれば、ヌクレオチドの種類（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド）に応じて、適宜、それぞれにおいて可能な化学修飾を選択して施すことが可能である。
　上記のような化学修飾は同一のヌクレオチドに対して、複数種組み合わせて施されていてもよい。
　通常、上記のような化学修飾は、塩基対形成には影響を及ぼさず、従って、ヌクレオチド間の相補性やポリヌクレオチド間の相補性には影響を及ぼさないと考えられる。すなわち、通常、相補的な２つのヌクレオチドは、化学修飾された後も塩基対を形成する能力を維持することができ、従って依然として相補的であることができる。
　しかしながら、ある場合において、化学修飾の数や位置によっては、ここで開示する二本鎖核酸が奏するアンチセンス効果等に影響を与えることになるかもしれない。これらの態様は、標的遺伝子の配列等によっても異なるため、一概には言えないが、当業者であれば、アンチセンス法に関する文献の記載等を参酌しながら、決定することができる。また、化学修飾後の核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、化学修飾前の核酸複合体のそれよりも有意に低下していなければ（例えば、化学修飾後の核酸複合体の測定値が化学修飾前の核酸複合体の測定値の３０％以上であれば）、当該化学修飾は評価することができる。アンチセンス効果の測定は、例えば、細胞等に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏するアンチセンス効果によって抑制された該細胞等における標的遺伝子の発現量（ｍＲＮＡ量、ｃＤＮＡ量、タンパク質量等）を、ノザンブロッティング、定量的ＰＣＲ、ウェスタンブロッティング等の公知の手法を適宜利用することによって行うことができる。あるいは、例えば、細胞に被検核酸化合物を導入し、該被検核酸化合物が奏する標的遺伝子発現抑制に起因する細胞増殖抑制を、ＷＳＴ（または類似の色素ＭＴＴ、ＸＴＴ、ＭＴＳ等）をホルマザン色素へ還元する酵素活性を測定する比色定量法、ＢｒｄＵ取込量の測定、フローサイトメトリー等の公知の手法を用いて測定することにより行うことができる。
　上述のように、本発明の核酸複合体のポリヌクレオチドは、任意選択で核酸類似体を含むことができる。本発明において使用される核酸類似体の例としては、上述したＢＮＡ／ＬＮＡや、その他にも、ヘキシトール核酸（ＨＮＡ）、シクロヘキセン核酸（ＣｅＮＡ）、グリコール核酸（ＧＮＡ）、トレオース核酸（ＴＮＡ）、トリシクロ－ＤＮＡ（ｔｃＤＮＡ）等が挙げられる。
　本発明の１つの実施態様において、上記核酸類似体は、ＢＮＡ／ＬＮＡ、好ましくは下記の式（１）で表されるＢＮＡである。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
［式（１）中、Ｂａｓｅは、置換基を有していてもよい芳香族複素環基若しくは芳香族炭化水素環基、例えば、天然型ヌクレオシドの塩基部位（プリン塩基、ピリミジン塩基）又は非天然型（化学修飾）ヌクレオシドの塩基部位を示す。なお、塩基部位の化学修飾の例は、前述の通りである。Ｒ１、Ｒ２は、同一又は異なっていてもよく、水素原子、核酸合成の水酸基の保護基、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、リン酸基、核酸合成の保護基で保護されたリン酸基、又は、－Ｐ（Ｒ３）Ｒ４（ここで、Ｒ３及びＲ４は、同一又は異なっていてもよく、水酸基、核酸合成の保護基で保護された水酸基、メルカプト基、核酸合成の保護基で保護されたメルカプト基、アミノ基、炭素数１～５のアルコキシ基、炭素数１～５のアルキルチオ基、炭素数１～６のシアノアルコキシ基又は炭素数１～５のアルキル基で置換されたアミノ基を示す）を示す］。
　なお、前記化学式において示されている化合物はヌクレオシドであるが、本明細書において、「ＬＮＡ」や「ＢＮＡ」には、当該ヌクレオシドにリン酸基が結合した形態（ヌクレオチド）も含まれる。すなわち、本明細書において「ＬＮＡ」や「ＢＮＡ」という語句を用いた場合には、ポリヌクレオチド中に、ヌクレオチドとして組み込まれているＬＮＡ／ＢＮＡも意味する。
　また、ＢＮＡとしては、例えば、ＬＮＡ（ロックド核酸（Ｌｏｃｋｅｄ　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄ（登録商標）、２’，４’－ＢＮＡ）とも称される、α－Ｌ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）の他に、β－Ｄ－メチレンオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＥＮＡとも称されるエチレンオキシ（４’－（ＣＨ２）２－Ｏ－２’）ＢＮＡ）、β－Ｄ－チオ（４’－ＣＨ２－Ｓ－２’）ＢＮＡ、アミノオキシ（４’－ＣＨ２－Ｏ－Ｎ（Ｒ３）－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＮＣとも称されるオキシアミノ（４’－ＣＨ２－Ｎ（Ｒ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、２’，４’－ＢＮＡＣＯＣ、３’アミノ－２’，４’－ＢＮＡ、５’－メチルＢＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ｃＭＯＥ－ＢＮＡとも称される（４’－ＣＨ（ＣＨ２ＯＣＨ３）－Ｏ－２’）ＢＮＡ、ＡｍＮＡとも称されるアミドＢＮＡ（４’－Ｃ（Ｏ）－Ｎ（Ｒ）－２’）ＢＮＡ（Ｒ＝Ｈ、Ｍｅ）、当業者に知られた他のＢＮＡが挙げられる。
　本発明の１つの実施態様では、核酸類似体（例えばＬＮＡ／ＢＮＡ）はさらに、上述の化学修飾（または化学修飾の組み合わせ）を受けていてもよい。本発明の１つの実施態様では、核酸類似体（例えばＬＮＡ／ＢＮＡ）は、ホスホロチオエート化が施されたヌクレオチドとして、上記ポリヌクレオチドに組み込まれている。
　当業者であれば、ヌクレオチドの種類（例えば、デオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチド）や核酸類似体の種類に応じて、適宜、それぞれにおいて可能な化学修飾を選択して施すことが可能である。
　本発明の１つの実施態様において、「１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含むウィング領域」は、前記少なくとも４つ以上の連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドを含む領域（以下「ＤＮＡギャップ領域」とも称する）の５’末側及び／又は３’末側に配置されるものである。
　本発明の１つの実施態様において、該ＤＮＡギャップ領域の５’末端に配置された化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む領域（以下「５’ウィング領域」とも称する）、及び該ＤＮＡギャップ領域の３’末端に配置された化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む領域（以下「３’ウィング領域」とも称する）は、それぞれ独立したものであり、化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を少なくとも１種含んでいればよく、さらに、かかる化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体以外に天然型のヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド）も含まれていてもよい。また、５’ウィング領域及び３’ウィング領域の鎖長は独立的に、通常１～１０塩基であることができ、好ましくは１～７塩基、又は２～５塩基、例えば２～４塩基である。
　さらに、５’ウィング領域及び３’ウィング領域における化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体及び天然型のヌクレオチドの種類や数や位置については、ある実施形態における核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、好ましい態様は、配列等によっても変わり得る。一概には言えないが、当業者であれば、例えば、Ｔａｃｈａｓらの米国特許第８２９９０３９号明細書の記載のようなアンチセンス法に関する文献の記載を参酌しながら、好ましい態様を決定することができる。また、前記「少なくとも４つ以上の連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド」を含む領域同様に、化学修飾後および／または核酸類似体導入後の核酸、好ましくは二本鎖核酸が有するアンチセンス効果を測定し、得られた測定値が、これらの前の核酸、好ましくは二本鎖核酸のそれよりも有意に低下していなければ、当該化学修飾および／または核酸類似体は好ましい態様であると評価することができる。
　なお、特許文献１で述べられているように、従前から試みられているＲＮＡやＬＮＡのみからなるアンチセンス法は、標的となるｍＲＮＡと結合することで翻訳を抑制したが、その効果は概して不十分であった。一方ＤＮＡのみからなるアンチセンス法では、標的遺伝子と結合するとＤＮＡとＲＮＡからなる二本鎖構造となるため、ＲＮａｓｅＨの標的となることでｍＲＮＡが切断されることにより強い標的遺伝子発現抑制効果が期待できたが、標的遺伝子との結合自体が弱いため実際の効果はやはり不十分だった。従って、活性部分におけるポリヌクレオチドにおいて、中央に少なくとも４塩基以上の鎖長のＤＮＡ（または化学修飾ＤＮＡ）が配置され、さらにＲＮＡ（すなわち、標的転写産物）と強い結合能力を持つＬＮＡ（又は他のＢＮＡ）が両端に配置されることによって、このような複合鎖は、ＲＮａｓｅＨによる標的ＲＮＡの切断を促進し得る。
　よって、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、核酸類似体を含んでいることが望ましい。本発明の１つの実施態様において、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、核酸類似体からなる。この場合、核酸類似体はさらに化学修飾されていてもよい。上記５’ウィング領域および３’ウィング領域はそれぞれ、ＢＮＡ／ＬＮＡを含んでいてもよく、この場合、ＬＮＡ／ＢＮＡはさらに化学修飾されていてもよい。本発明の１つの実施態様において、ＬＮＡ／ＢＮＡはホスホロチエート化されている。
　また、本発明の別の実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドからなる。当該ポリヌクレオチドは、ホスホロチオエート化されたデオキシリボヌクレオチドからなっていてもよく、この場合、当該デオキシリボヌクレオチドはさらなる化学修飾を受けていてもよい。あるいは、当該ポリヌクレオチドは、核酸間結合として、ホスホジエステル結合（ＰＯ型結合）と、リン酸基の酸素原子の一つを硫黄原子に置換したホスホロチオエート化（ＰＳ化）結合（ＰＳ型結合）を、ランダム、交互、ブロック、グラジエントまたはこれらの組み合わせの配置で有する、好ましくは交互の配置で有する、デオキシリボヌクレオチドからなっていてもよく、この場合、当該デオキシリボヌクレオチドはさらなる化学修飾を受けていてもよい。
 以下に、ＰＯ型結合とＰＳ型結合のランダム、交互、ブロック、グラジエントの配置の例を示す。ここで、Ａは化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオシド（もしくは核酸類似体）を示し、ｐｏはＰＯ型結合、ｐｓはＰＳ型結合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
　上記のように、ポリヌクレオチドのバックボーンとしてＰＯ型結合とＰＳ型結合を交互に用いた構造は、例えば、ＵＳ２００３／０２２０４８６Ａ１から知られている。
　本発明の他の実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび核酸類似体からなる。この場合、核酸類似体はさらに化学修飾されていてもよい。
　本発明のさらなる実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドとその５’側に位置する５’ウィング領域および３’側に位置する３’ウィング領域とからなる。この態様において、上記デオキシリボヌクレオチドはその一部または全部が化学修飾されていてもよく、好ましくは、上記デオキシリボヌクレオチドはその一部または全部が、より好ましくは全部が、ホスホロチオエート化されている。あるいは、上記デオキシリボヌクレオチドは、核酸間結合として、ＰＯ型結合とＰＳ型結合を、ランダム、交互、ブロック、グラジエントまたはこれらの組み合わせの配置で、好ましくは交互の配置で有していてもよい。好ましくは、上記５’ウィング領域および３’ウィング領域は、ホスホロチオエート化された核酸類似体、より好ましくはホスホロチオエート化されたＬＮＡ／ＢＮＡからなる。
　本発明の１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含まないか、あるいは、リボヌクレオチドも化学修飾されたリボヌクレオチドも含まない。
　上述のように、本発明において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、前述の活性部分におけるポリヌクレオチドと少なくとも一部が相補的なポリヌクレオチドである。キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列と活性部分におけるポリヌクレオチドの塩基配列とは、両者が少なくとも部分的に二本鎖を形成することが可能であれば、完全に相補的である必要はなく、例えば、少なくとも７０％以上、好ましくは８０％以上、さらに好ましくは９０％以上（例えば、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％以上）の相補性を有していればよい。
　本発明の１つの好ましい実施態様において、両ポリヌクレオチドは１００％の相補性を有する。ここで、相補性は上記のように二本鎖形成領域（二本鎖形成領域全体）における相補性として算出する。この態様では、例えば、キャリアー部分のポリヌクレオチドの長さが、活性部分のポリヌクレオチドの長さより長い場合には、活性部分のポリヌクレオチド全体がキャリアー部分のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。また、キャリアー部分のポリヌクレオチドの長さが、活性部分のポリヌクレオチドより短い場合には、キャリアー部分のポリヌクレオチド全体が活性部分のポリヌクレオチドの一部分と完全に相補的であり、その完全に相補的な部分が二本鎖形成領域となる。そして、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチドが同じ長さを有する場合には、両ポリヌクレオチドは全体にわたって完全に相補的である。
　キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、上述のように、化学修飾されていてもよいヌクレオチドと、任意に核酸類似体とを含む。ＲＮＡ分解酵素等の核酸分解酵素に対する耐性が高いという観点から、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドにおいても、ヌクレオチド（例えばデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチド）は、活性部分におけるポリヌクレオチドに関して述べたような化学修飾を受けていてもよい。
　従って、当該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドとして、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび／または化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを含むことができる。本発明の１つの実施態様において、当該ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドとして、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを含むことができる。上記ポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドの数は、特に制限はされない。例えば、上記ポリヌクレオチドは、交互に存在する化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを含んでいてもよい。これらの態様において、例えば、デオキシリボヌクレオチドの１つまたは複数が化学修飾されていてもよく、および／またはリボヌクレオチドの１つまたは複数が化学修飾されていてもよい。本発明のさらなる実施態様において、当該ポリヌクレオチドは、化学修飾ヌクレオチドとして、脱塩基ヌクレオシドを有するヌクレオチドを１つまたは複数含む。本発明のさらなる態様において、当該ポリヌクレオチドは、リガンドまたはリンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドを１つまたは複数含む。
　本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、化学修飾されていない。本発明の別の実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位を除き、化学修飾されていない。本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドからなる。本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位を除き、デオキシリボヌクレオチドからなる。本発明のさらなる実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなり、当該リボヌクレオチドの数は１つまたは２つであって、リボヌクレオチドは例えば、５’末端から数えて、１～３５番目、好ましくは２～３０番目、３～２５番目、４～２０番目または５～１５番目の位置に存在する。本発明の他の実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位を除き、デオキシリボヌクレオチドおよびリボヌクレオチドからなり、当該リボヌクレオチドの数は１つまたは２つであって、リボヌクレオチドは例えば、５’末端から数えて、１～３５番目、好ましくは２～３０番目、３～２５番目、４～２０番目または５～１５番目の位置に存在する。本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、交互に存在する化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドからなる。本発明のさらなる実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位を除き、交互に存在する化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドからなる。これらの態様において、上記構成単位（リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位）は、リガンドまたはリンカーとの結合のための化学修飾がなされていてもよく、例えば、リガンドまたはリンカーとの結合のために化学修飾されたリボヌクレオチドである。　
　本発明のさらなる実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチドと、１つの脱塩基ヌクレオチド（例えば脱塩基リボヌクレオチド）とからなり、この脱塩基ヌクレオチドはさらに、リガンドまたはリンカーとの結合のための化学修飾がなされていてもよい。本発明の１つの態様において、当該脱塩基ヌクレオチド（リガンドまたはリンカーとの結合のための化学修飾がなされていてもよい）が、リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位となる。
　また、キャリアー部分のポリヌクレオチドが特定の細胞の核内に送達されるまで、ＲＮａｓｅＡ等のＲＮＡ分解酵素による分解を抑制しつつも、特定の細胞内においてはＲＮａｓｅＨにより該ポリヌクレオチドが分解されることにより、アンチセンス効果を発揮し易いという観点から、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに関して述べたような核酸類似体を含んでいてもよい。
　なお、活性部分におけるポリヌクレオチドの場合と同様に、核酸類似体を含む場合には当該核酸類似体はさらに化学修飾を受けていてもよい。
　本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、核酸類似体を含む。本発明の他の実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、核酸類似体を含まない。
　化学修飾および核酸類似体の数や位置は、ある実施形態における核酸複合体が奏するアンチセンス効果等に影響を与える場合もあるため、キャリアー部分のポリヌクレオチドにおける核酸類似体の数及び化学修飾の位置には好ましい態様が存在する。この好ましい態様は、化学修飾対象となる核酸の種類、配列等によっても異なるため、一概には言えないが、前述の活性部分におけるポリヌクレオチド同様に、化学修飾後または核酸類似体導入後の核酸複合体が有するアンチセンス効果を測定することにより特定することができる。
　本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分のポリヌクレオチドの５’ウィング領域及び／又は３’ウィング領域に対して相補的な領域に、化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を有する。例えば、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドにおいて、活性部分のポリヌクレオチドの５’ウィング領域及び３’ウィング領域に対して相補的な領域は、化学修飾ヌクレオチド、例えばホスホロチオエート化された２’－Ｏ－メチル化リボヌクレオチドからなることができる。この場合、上記のウィング領域に対して相補的な領域以外の領域は、例えば化学修飾されていないデオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドからなることができる（ただし、リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位は、リガンドまたはリンカーとの結合のための化学修飾がなされていてもよい）。この実施態様において、好ましくは、リガンドまたはリンカーは上記のウィング領域に対して相補的な領域以外の領域に存在する構成単位に結合している。
　キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さは特に制限されないが、少なくとも８塩基であり、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、少なくとも１５塩基、または少なくとも１６塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下、２０塩基以下、１９塩基以下、１８塩基以下または１７塩基以下であることができる。前記長さの範囲は、好ましくは１０～３５塩基であり、より好ましくは１２～２５塩基であり、さらに好ましくは１３～２０塩基である。通常、標的部位への送達に及ぼす効果や、費用、合成収率等の他の要素に応じて、長さは選択される。
　本発明の１つの実施形態において、活性部分におけるポリヌクレオチドの長さとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さは同一であってもよく、異なっていてもよい。
　本発明の１つの実施形態において、活性部分におけるポリヌクレオチドの長さは、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さよりも大きい。
　本発明の他の実施形態において、活性部分におけるポリヌクレオチドの長さは、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さよりも小さい。
　本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む。
　「ミスマッチ」とは、活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドとの間のアニーリングによって形成された二本鎖形成領域（以下、単に「二本鎖形成領域」とも呼ぶ）内のある位置において、両ポリヌクレオチド鎖のヌクレオチド間でワトソン－クリック型塩基対が形成されないことをいう。
　ただし、ここでいうミスマッチは、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチドが二本鎖形成領域内で同一の数のヌクレオチドおよび／または核酸類似体（以下、まとめて「ヌクレオチド等」とも呼ぶ）を有し、上記位置を除く全ての位置において塩基対を形成しているにもかかわらずに、当該位置でのみ塩基対が形成されないことを意味する。従って、これは、オーバーハングや、二本鎖形成領域内の両ポリヌクレオチドの長さの相違に起因して生じるバルジのような構造は含まない。なおこれは、ミスマッチとオーバーハングやバルジとを区別することを意図するものであり、本発明の核酸複合体、好ましくは二本鎖核酸複合体において、ミスマッチとバルジ（および／またはオーバーハング）が同時に存在することを妨げるものではない。
　従って、「キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む」とは、活性部分のポリヌクレオチドとキャリアー部分のポリヌクレオチドが二本鎖形成領域内において同一の長さを有し、かつ、後者が、両ポリヌクレオチド間でワトソン－クリック型塩基対を形成しないようなヌクレオチド等を当該二本鎖形成領域内において少なくとも１つ含むことを意味する。ミスマッチの例としては、Ａ対Ｇ、Ｃ対Ａ、Ｕ対Ｃ、Ａ対Ａ、Ｇ対Ｇ、Ｃ対Ｃ等や、リボヌクレオチドを用いたＵ対Ｇ、Ｕ対Ｃ、Ｕ対Ｔ等が挙げられるが、同様に、例えば、非塩基残基対ヌクレオチド等、非環状残基対ヌクレオチド等も含まれる。広い意味において、ここで用いられるミスマッチには、特定の位置における二本鎖の熱力学的安定性がその位置におけるワトソン－クリック型塩基対の熱力学的安定性よりも低くなるように、その位置またはその近傍での熱力学的安定性を減少させる、その位置での任意の変換も含まれる。
　本発明において、核酸複合体は、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含んでいてもよい。ミスマッチの数は、二本鎖核酸の形成が妨げられない範囲内であれば特に制限はされず、ミスマッチを複数個含む場合には、各ミスマッチは互いに離れて存在していてもよく、または連続して存在していても、両者が組み合わされて存在していてもよい。本発明の１つの実施態様では、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して１つのミスマッチを含むことができる。
　ミスマッチの位置は、ミスマッチ構造を形成できる位置であれば特に制限はされない。
　例えば、活性部分のポリヌクレオチドおよびキャリアー部分のポリヌクレオチドがそれぞれ１０～３５塩基の長さを有する場合には、例えば、二本鎖形成領域の５’末端（活性部分のポリヌクレオチドの上記領域内の５’末端）から数えて、２～１５番目の位置に、例えば６～１１番目（例えば６、７、８、９、１０または１１番目）の位置にミスマッチを導入することができる。
　本発明の核酸複合体が少なくとも１つのミスマッチを有する場合、ミスマッチの部分、すなわち、二本鎖が形成されていない部分において、ＤＮａｓｅまたはＲＮａｓｅの攻撃を適度に受けるため、細胞内または生体内において、標的ｍＲＮＡに送達される頃までの間に、当該キャリアー部分のみが適度に切断されて（キャリアー部分のポリヌクレオチドがデオキシリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたはこれらの組み合わせのいずれの場合であっても）、活性部分のポリヌクレオチドのみとなり、当該活性部分のポリヌクレオチドが標的ｍＲＮＡと良好に二本鎖を形成するのを促進することも考えられる。
　上記のようなミスマッチを有する場合、活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドは完全に相補的ではなくなるが、上記のように、本発明ではこのように両者が完全に相補的でなくてもよい。本発明の１つの好ましい態様では、キャリアー部分のポリヌクレオチドがミスマッチを含む場合、両ポリヌクレオチドは、ミスマッチ部分を除く二本鎖形成領域において、１００％の相補性を有する。
　本発明の別の実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、ミスマッチを含まない。
　また、例えばキャリアー部分におけるポリヌクレオチドを適度に切断するという観点から、上記のようなミスマッチを形成させる代わりに、または、ミスマッチ形成に加えて、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドに上述のように、少なくとも１つのリボヌクレオチドを含ませることも可能である。リボヌクレオチドは概して、デオキシリボヌクレオチド（化学修飾デオキシリボヌクレオチドを含む）や核酸類似体よりも核酸分解酵素に対する耐性が弱いため、キャリアー部分においてリボヌクレオチド導入部位を起点としたポリヌクレオチドの切断が適度に促進され得ると考えられる。
　従って、本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、構成単位として１つまたは複数のリボヌクレオチドを含む。
　本発明のさらなる実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、構成単位としてリボヌクレオチドを含む。
　本発明のさらに１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、リボヌクレオチドを構成単位として含み、かつ、当該リボヌクレオチドの少なくとも１つが当該ミスマッチを形成する。本発明のさらに１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含み、かつ、脱塩基ヌクレオチド（例えば脱塩基リボヌクレオチド）を構成単位として含み、かつ、当該脱塩基ヌクレオチド（例えば脱塩基リボヌクレオチド）の少なくとも１つが当該ミスマッチを形成する。例えば、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、活性部分におけるポリヌクレオチドに対して、Ｇ対Ｕのミスマッチ（活性部分がＧで、キャリアー部分がＵ）またはＧ対脱塩基ヌクレオチドのミスマッチ（活性部分がＧで、キャリアー部分が脱塩基ヌクレオチド）を１つ含むことができる。
　キャリアー部分のポリヌクレオチドにおけるリボヌクレオチドの位置は、特に制限はされない。上記ポリヌクレオチドが１０～３５塩基の長さを有する場合には、５’末端から数えて、１～３５番目、例えば２～３０番目、３～２５番目、４～２０番目、５～１５番目、６～１１番目（例えば、６、７、８、９、１０または１１番目）の位置にリボヌクレオチドを含むことができる。
　また、本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体はオーバーハングを有することができる。
　ここで、「オーバーハング」とは、一方の鎖が二本鎖を形成する相補性の他鎖の末端を超えて伸びる１本鎖領域から生じる、末端塩基対非形成型ヌクレオチド（化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体）のことをいう。各オーバーハングは、少なくとも１つのヌクレオチド（化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体）を含む。好ましくは、各オーバーハングは、２ヌクレオチドオーバーハングである。オーバーハングを構成するヌクレオチドは任意に選択することができる。オーバーハングのヌクレオチドは、標的転写産物と塩基対を形成してもしなくてもよい。上記２ヌクレオチドオーバーハングの例としては、ＵＵ、ＴＴ、ＡＡ、ＧＧ、ＣＣ、ＡＣ、ＣＡ、ＡＧ、ＧＡ、ＧＣおよびＣＧが挙げられるが、これらに限定はされない。
　オーバーハングの位置としては、活性部分におけるポリヌクレオチドの５’末端、活性部分におけるポリヌクレオチドの３’末端、活性部分におけるポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの５’末端、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの３’末端、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの５’末端および３’末端、活性部分のポリヌクレオチドの５’末端およびキャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端、または活性部分のポリヌクレオチドの３’末端およびキャリアー部分のポリヌクレオチドの３’末端が可能である。
　本発明の他の実施態様において、上記核酸複合体はオーバーハングを含まない。
　また、本発明の別の実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドは、活性部分のポリヌクレオチドに関して記載したように、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドを含み、その５’側に位置する５’ウィング領域、および／またはその３’側に位置する３’ウィング領域を含むことができる。
　また上述のように、本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、リガンドが直接またはリンカーを介して結合する構成単位を除き、デオキシリボヌクレオチドのみからなる。この場合、デオキシリボヌクレオチドは化学修飾されていてもよいし、化学修飾されていなくともよい。この態様の場合でも、上記核酸複合体は標的転写産物のレベルを良好に抑制できるが、これは以下の機構によるものと考えられる：活性部分におけるポリヌクレオチドとキャリアー部分におけるポリヌクレオチドにより形成されたＤＮＡ－ＤＮＡ二本鎖が標的転写産物に送達されるまでの間にＤＮａｓｅに認識され、当該ＤＮａｓｅによってキャリアー部分におけるポリヌクレオチドが分解される。その後、残った活性部分におけるポリヌクレオチドが標的転写産物とＤＮＡ－ＲＮＡ二本鎖を形成し、ＲＮａｓｅＨによってこの部分が認識され、分解される。
　本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、リボヌクレオチドを含まない。
　本発明の別の実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドは修飾されていない。
　本発明のさらに別の実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドにおけるリボヌクレオチドは修飾されていない。
　本発明の１つの実施態様において、キャリアー部分のポリヌクレオチドは、核酸間結合として、ホスホジエステル結合（ＰＯ型結合）のみを有する。
　本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体は、細胞または哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための核酸複合体である。また、本発明のさらなる実施態様において、上記核酸複合体は、標的細胞（好ましくは癌細胞または肝細胞）内の標的遺伝子（好ましくはがん遺伝子または脂質異常症に関連する遺伝子）の発現を抑制することにより、当該標的細胞の増殖を抑制するための核酸複合体である。典型的には、上記標的遺伝子の発現亢進を伴う細胞を標的細胞とすることができる。また、本発明のさらなる実施態様において、上記核酸複合体は、標的組織および／または標的部位において、標的遺伝子の発現を抑制するための核酸複合体である。
　本発明のさらなる１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子はヒトｂｃｌ－２である。本発明の別の実施態様において、上記標的遺伝子はヒトＢＣＲ－ＡＢＬである。本発明の別の実施態様において、上記標的遺伝子は、ＡＰＯＢ遺伝子である。
　本発明のさらなる１つの実施態様において、活性部分におけるポリヌクレオチドは、標的としてのタンパク質をコードしない転写産物、例えば標的ノンコーディングＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。本発明の１つの実施態様において、標的ノンコーディングＲＮＡは、ヒトまたはマウスの転位関連肺腺癌転写産物（ＭＡＬＡＴ１）である。
　本発明の１つの実施態様において、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドは、以下の（ａ）～（ｄ）から選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ）配列番号１、５、４１、４２、４５または４９で示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ）上記（ａ）のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ）上記（ａ）のポリヌクレオチドのうちの少数のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチド、
（ｄ）上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチド。
　上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）のポリヌクレオチドの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有する。好ましくは、上記（ｂ）のポリヌクレオチドは、標的転写産物の発現抑制活性を有する。
　上記（ｃ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）のポリヌクレオチドのうちの少数の、好ましくは、１個～数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチドであることができる。好ましくは、上記（ｃ）のポリヌクレオチドは、標的転写産物の発現抑制活性を有する。
　上記（ｄ）のポリヌクレオチドは、上記（ａ）～（ｃ）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドであり、好ましくは標的転写産物の発現抑制活性を有する。本発明の１つの実施態様において、上記（ｄ）のポリヌクレオチドの長さは８～１００塩基である。好ましくは、前記長さは、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、又は少なくとも１３塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、３５塩基以下、２５塩基以下または２０塩基以下であることができる。
　本明細書において、塩基配列に関する「配列同一性」とは、比較すべき２つ塩基配列の塩基ができるだけ多く一致するように両塩基配列を整列させ、一致した塩基数を全塩基数で除したものを百分率（％）で表したものである。上記整列の際には、必要に応じ、比較する２つの配列の一方又は双方に適宜ギャップを挿入する。このような配列の整列化は、例えばＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＣＬＵＳＴＡＬ　Ｗ等の周知のプログラムを用いて行なうことができる（Ｋａｒｌｉｎ及びＡｌｔｓｃｈｕｌ，　Ｐｒｏｃ．　Ｎａｔｌ．　Ａｃａｄ．　Ｓｃｉ．　Ｕ．Ｓ．Ａ．，８７：２２６４－２２６８，　１９９３；　Ａｌｔｓｃｈｕｌら，　Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃｉｄｓ　Ｒｅｓ．，２５：３３８９－３４０２，　１９９７）。ギャップが挿入される場合、上記全塩基数は、１つのギャップを１つの塩基として数えた塩基数となる。このようにして数えた全塩基数が、比較する２つの配列間で異なる場合には、同一性（％）は、長い方の配列の全塩基数で、一致した塩基数を除して算出される。
　通常、上述の化学修飾や核酸類似体の存在は、上記の配列同一性に影響を及ぼさない。
　本発明の１つの実施態様において、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドは、以下の（ａ’）～（ｄ’）から選択されるポリヌクレオチドである：
（ａ’）配列番号２～４、６～４０、４３～４４、４８または５２のいずれか１つで示される塩基配列を有するポリヌクレオチド、
（ｂ’）上記（ａ’）のポリヌクレオチドと７０％以上の配列同一性を有するポリヌクレオチド、
（ｃ’）上記（ａ’）のポリヌクレオチドのうちの少数のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチド、
（ｄ’）上記（ａ’）～（ｃ’）のいずれか１つのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチド。
　上記（ｂ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）のポリヌクレオチドの塩基配列と７０％以上、好ましくは８０％以上、より好ましくは８５％以上、さらに好ましくは９０％以上、特に好ましくは９５％以上、例えば９６％以上、９７％以上、９８％以上、９９％以上又は９９．５％以上の配列同一性を有する。好ましくは、上記（ｂ’）のポリヌクレオチドは、活性部分のキャリアーとしての機能を有する。
　上記（ｃ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）のポリヌクレオチドのうちの少数の、好ましくは、１個～数個、例えば１、２、３、４、５、６、７、８、９または１０個のヌクレオチドが置換し、欠失し、付加し及び／又は挿入されたポリヌクレオチドであることができる。好ましくは、上記（ｃ’）のポリヌクレオチドは、活性部分のキャリアーとしての機能を有する。
　上記（ｄ’）のポリヌクレオチドは、上記（ａ’）～（ｃ’）のいずれかのポリヌクレオチドを部分配列として含むポリヌクレオチドであり、好ましくは活性部分のキャリアーとしての機能を有する。本発明の１つの実施態様において、上記（ｄ’）のポリヌクレオチドの長さは８～１００塩基である。好ましくは、前記長さは、少なくとも１０塩基であり、少なくとも１２塩基であり、少なくとも１３塩基であり、少なくとも１４塩基であり、少なくとも１５塩基、または少なくとも１６塩基である。前記長さは、好ましくは１００塩基以下、４５塩基以下、３５塩基以下、３０塩基以下、２５塩基以下、２４塩基以下、２３塩基以下、２２塩基以下、２１塩基以下または２０塩基以下であることができる。
　上述のように、本発明の核酸複合体は、少なくとも１つのリガンドを含む。本発明の１つの実施態様において、本発明の核酸複合体は、１個のリガンドを含む。本発明の他の実施態様において、本発明の核酸複合体は、複数のリガンド、例えば２～１０個、好ましくは２～６個、例えば２、３、４、５または６個のリガンドを含むことができる。
　上記リガンドは、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に結合している。ただし、上記リガンドが上記ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位に結合する場合には、上記リガンドは当該構成単位の５’位ではない部位に結合しており、および／または上記リガンドが上記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位に結合する場合には、上記リガンドは当該構成単位の３’位ではない部位に結合している。これは、上記リガンドは、上記ポリヌクレオチドのいずれの構成単位に結合していてもよいが、上記リガンドが上記ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位（＝５’末端から１番目の構成単位、すなわち、ポリヌクレオチドの５’側の一番端に位置し、ポリヌクレオチドの５’末端を含んでいる構成単位）に結合する場合には、上記リガンドは当該構成単位の５’位以外の部位（例えば、２’位または４’位）に結合し、上記リガンドが上記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位（＝３’末端から１番目の構成単位、すなわち、ポリヌクレオチドの３’側の一番端に位置し、ポリヌクレオチドの３’末端を含んでいる構成単位）に結合する場合には、上記リガンドは当該構成単位の３’位以外の部位（例えば、２’位または４’位）に結合していることを意味する。上記リガンドが５’末端以外かつ３’末端以外に位置する構成単位に結合する場合には、上記リガンドは当該構成単位の任意の部位（例えば、２’位または４’位）に結合することができる。
　例えば、上記リガンドは、上記ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位ではなくかつ当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位ではない構成単位に結合している。これは、上記リガンドが両端に位置する構成単位（それぞれ両側の一番端に位置し、それぞれ５’末端または３’末端を含んでいる構成単位）以外の構成単位に結合していることを意味する。この場合、上記リガンドは構成単位の任意の部位に結合することができる。好ましくは上記リガンドはポリヌクレオチドの中央付近の構成単位に結合している。本発明の１つの実施態様において、上記リガンドは、上記構成単位から懸垂されており、すなわち、上記リガンドはポリヌクレオチド主鎖を構成するのではなく、ポリヌクレオチドの構成単位から懸垂された状態にある（図１Ａ）。
　なお、上述のように、本発明では少なくとも１つのリガンドが、キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に、当該ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位ではなくかつ当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位ではない部位を介して結合しているが、これは、少なくとも１つのリガンドがこのような部位に結合していればよいことを意味しており、すなわち、さらに別のリガンドが上記の５’位および／または３’位に結合していることを妨げるものではない。従って、本発明の核酸複合体は、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端の構成単位の５’位ではなくかつ３’末端の構成単位の３’位ではない部位に結合しているリガンドの他に、上記ポリヌクレオチドの５’位および／または３’位に結合しているリガンドを含んでいてもよいし、あるいは、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端の構成単位の５’位ではなくかつ３’末端の構成単位の３’位ではない部位において結合しているリガンドのみ、例えば上記ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位ではなくかつ当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位ではない構成単位（好ましくはポリヌクレオチドの中央付近の構成単位）において結合しているリガンドのみを含んでいてもよい。
　すなわち、本発明においては、少なくとも１つのリガンドが、上記キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位と当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位とを除く部位において、上記キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に結合している。そして、本発明の１つの実施態様において、上記核酸複合体は、上記キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位、および／または当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位に結合しているリガンドをさらに含むことができる。この場合、このさらなるリガンドは、上記の少なくとも１つのリガンドに関して記載したものと同様のリガンドを用いることができ、それらの場合と同様の様式、手段によって上記ポリヌクレオチドに結合させることができる。また、本発明の別の実施態様において、上記核酸複合体は、上記キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位に結合しているリガンドも、当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位に結合しているリガンドも含まない。
　また、上記核酸複合体が複数のリガンドを含む場合、これらのリガンドは同一の構成単位に結合していてもよく（例えば、同一の構成単位の同一の位置（例えば２’位）に結合していてもよい）、または互いに異なる構成単位に結合していてもよい。前者の場合、例えば、後述するような適当な分岐リンカーを用いることにより、複数のリガンドを多量体（例えば２～１０量体、好ましくは２～６量体、例えば２、３、４、５または６量体）として同一の構成単位に結合させてもよい。
　本願では、本発明の核酸複合体において、２個以上のリガンドをそれぞれ、互いに異なる構成単位に結合させた場合に、当該核酸複合体の活性がさらに増強することも見出された。さらに、本願では、本発明の核酸複合体において、複数のリガンドを多量体として同一の構成単位に結合させた場合でも、良好な活性が達成されることも見出された。
　本発明の好ましい実施態様において、少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドが奇数個の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位を含む連続ｎ個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合しており、当該ポリヌクレオチドが偶数の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位を含む連続ｎ＋１個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合している。
　ここで、上記ｎは、１～１００の整数、好ましくは１～５０の整数、より好ましくは１～３０の整数または１～２０の整数である。例えば、上記ｎは、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９または２０であることができる。
　例えば、（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドが１５個（奇数）の構成単位からなる場合、下記のように、中央には１個の構成単位（矢印）が存在する（構成単位としてのヌクレオチドまたは核酸類似体をＮとして記載。以下も同様）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
　ここで、例えばｎ＝３の場合、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位を含む連続ｎ個（＝連続３個）の構成単位の範囲には、３’方向に関しては最大で、下記（２）で下線を施された構成単位までが含まれ、５’方向に関しては最大で、下記（３）で下線を施された構成単位までが含まれ得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
　従って、ｎ＝３の場合には、「当該ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位を含む連続ｎ個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位」は、下記（４）で下線を施された構成単位（５つの構成単位）のうちの１つまたは複数を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
　同様に、例えば、（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドが１６個（偶数）の構成単位からなる場合、下記のように、中央には２個の構成単位（矢印）が存在する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
　ここで、例えばｎ＝３の場合、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位を含む連続ｎ＋１個（＝連続４個）の構成単位の範囲には、３’方向に関しては最大で、下記（２’）で下線を施された構成単位までが含まれ、５’方向に関しては最大で、下記（３’）で下線を施された構成単位までが含まれ得る。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
　従って、ｎ＝３の場合には、「当該ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位を含む連続ｎ＋１個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位」は、下記（４’）で下線を施された構成単位（６つの構成単位）のうちの１つまたは複数を意味する。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
　なお、ポリヌクレオチドの鎖長が長い場合には、例えばポリヌクレオチドの鎖長が３０個を超える場合には、リガンドが結合する構成単位が含まれる範囲は、上記のように構成単位の個数を用いて表すよりも、ポリヌクレオチド全体に対するパーセントを用いて表すほうが適切であろう。
　従って、上記少なくとも１つのリガンド（以下、単に「上記リガンド」ともいう）は、ポリヌクレオチド全体の個数に対してｍ％の個数を有する、下記に定義する中央領域内における１つまたは複数の構成単位に結合していることができる。ｍは、１～７０の整数、例えば２～６０の整数、５～５０の整数、１０～４０の整数であり、例えば、１、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１５、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０または６５であることができる。
　ここで、「中央領域」とは、上記ポリヌクレオチドが奇数個の構成単位からなる場合には、上記ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位と、当該中央構成単位から５’方向および３’方向にそれぞれ同じ数の構成単位とを含む領域であって、上記ポリヌクレオチドの中央と当該領域の中央とが同一である領域を意味し、上記ポリヌクレオチドが偶数個の構成単位からなる場合には、上記ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位と、当該中央構成単位から５’方向および３’方向にそれぞれ同じ数の構成単位とを含む領域であって、上記ポリヌクレオチドの中央と当該領域の中央とが同一である領域を意味する。
　本発明では、上記リガンドを、ポリヌクレオチドの５’末端の５’位以外でありかつ３’末端の３’位以外である部位に、例えば、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端以外かつ３’末端以外の構成単位に、特に上記のような特定の位置の構成単位に結合させた場合に、末端に結合させた場合と比較して、顕著に優れた標的転写産物の発現抑制効果、および標的細胞の増殖抑制効果が得られることが見出された。なお、上記核酸複合体が複数のリガンドを含む場合には、そのうちの１つが上記のような特定の位置の構成単位に結合されていれば十分である。
　この理由は、明らかではないが、例えば立体構造が異なることに起因することが考えられる。
　また、この場合には、リポフェクトアミン等のトランスフェクション試薬を使用しなくとも、非常に優れた細胞内での標的転写産物の発現抑制効果および細胞増殖抑制効果を達成することができ、さらに顕著に優れた標的組織、標的部位への送達も達成できる。
　本発明においては、上記のように、キャリアー部分のポリヌクレオチドの中央付近にリガンドを結合することにより優れた効果が達成されるが、例えばｓｉＲＮＡの場合には、これに対応する領域にリガンドを結合させると、ｓｉＲＮＡとしての機能発現が妨げられるために、このような構成を取ることはできない。例えばｓｉＲＮＡの機能発現を妨げないような位置へのリガンド結合を行った例として、非特許文献１が挙げられる。従って、上記の効果は、本発明におけるようにキャリアー部分（すなわち、単にキャリアーとしての機能しか持たないために、中央を含めた任意の位置にリガンドを結合させることができる部分）を有する構成によって初めて可能になるものである。
　上記構成単位としてのヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体）における上記リガンドの結合部位は特に限定されないが、好ましくは、上記リガンドはヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体）の２’位または４’位において結合されている。
　本発明の１つの実施態様において、上記リガンドは、ミスマッチを構成している構成単位に結合している。本発明のさらなる実施態様において、上記リガンドが結合している構成単位は、デオキシリボヌクレオチドまたはリボヌクレオチドであり、これらは化学修飾されていても、されていなくてもよい。
　上記リガンドは、上記の構成単位にリンカーを介して間接的に結合していてもよく、または上記の構成単位に直接結合していてもよい。リガンドと核酸とを結合させるための多くの方法は、リンカーを用いる場合も含めて、当該分野においてよく知られている。
　上記リガンドがリンカーを介して結合される場合、通常は、リンカーの一端がリガンドの末端に（リガンドがｃＲＧＤペプチドである場合には、例えばｃＲＧＤペプチドのリジンのアミノ基に）結合し、リンカーの他端が上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの３’末端以外かつ５’末端以外に位置する構成単位（すなわち、ヌクレオチド、化学修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体）に結合することになる。後者に関して、リンカーが結合する部位は特に限定されないが、好ましくは、ヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体）の２’位または４’位に結合される。なお、上記のリンカー他端がキャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位に結合する場合には、当該構成単位の５’位以外の部位（例えば２’位または４’位）に、上記のリンカー他端がキャリアー部分のポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位に結合する場合には、当該構成単位の３’位以外の部位（例えば２’位または４’位）に結合する。
　これらの結合としては、共有結合、イオン結合、水素結合等が考えられるが、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合が好ましい。
　ここで、「リンカー」とは、共有結合を介してポリヌクレオチドとリガンドとを連結する化学的部分、あるいはリガンドをポリヌクレオチドに共有結合させる化学的部分を意味する。リンカーには、リンカーの長さを変えるための構造（いわゆる「スペーサー」であり、例えば下記のＰＥＧリンカーにおけるＰＥＧ部分）も含まれる。
　上記リンカーの種類は、キャリアー部分のポリヌクレオチドとリガンドを連結できるものであれば特に制限されず、２つの分子を連結させるためのリンカーとして本技術分野において公知のものを使用することができる。上記リンカーの例としては、ポリアルキレングリコールリンカー、マレイミドリンカー、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートリンカー、ＤＮＡリンカー、ペプチドリンカー、シランリンカー、多糖リンカー、ジスルフィドリンカー、トリアゾールリンカー等が挙げられるが、これらに限定はされない。
　本発明の１つの態様において、上記リンカーとして、以下の式（Ｉ）で表されるヘテロ二官能性ポリアルキレングルコールリンカーが使用される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
［式中、ＡおよびＢは異なる反応性基を含み、ｘは２～１０の整数、例えば２、３または４、５、６、７または８であり、ｙは１～１００の整数、例えば１～５０の整数、２～３０の整数または１～１２の整数であり、例えば１、２、３、４、５、６、７または８である］。
　上記のＡおよびＢは、例えば、互いに独立にアミン反応性基、チオール反応性基、アルキン反応性基またはジベンゾシクロオクチン反応性基を含むことができる。また、上記ＡおよびＢは互いに独立に、１～６個の炭素原子、例えば１、２、３または４個の炭素原子を有する基、好ましくはＣ１－６アルキレン基（例えばメチレン基、エチレン基）、あるいは１つまたは複数の－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－または－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－を有することもできる。
　アミン反応性基の例としては、ＮＨＳもしくはスルホ－ＮＨＳで活性化されていてもよいカルボン酸、イソチオシアネート、イソシアネート、アシルアジド、スルホニルクロリド、アルデヒド、グリオキサール、エポキシド、オキシラン、カーボネート、アリールハライド、イミドエステルなどが挙げられる。チオール反応性基の例としては、ハロアセチル基（例えばヨードアセチル）、アルキルハライド、マレイミド、アジリジン、アクリロイル基、ビニルスルホン、ベンゾキノン、フルオロベンゼン基、およびジスルフィド基、例えばピリジルジスルフィド基が挙げられる。アルキン反応性基およびジベンゾシクロオクチン反応性基の例としては、例えばアジドが挙げられる。
　なお、例えば、カルボン酸のような反応性基は、通常生理学的条件下ではアミンと反応し難いため、例えば上記のＮＨＳのような活性化基を用いて不安定なエステル結合を形成させることによって、反応性にすることができる。
　本発明のさらなる態様において、下記式（ＩＩ）のヘテロ二官能性ポリアルキレングルコールリンカーが使用される。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
［式中、Ａ、ｘおよびｙは上記式（Ｉ）に定義されるとおりであり、ＸおよびＹは、それぞれ独立に、１～６個の炭素原子、例えば１、２、３または４個の炭素原子を有する基、好ましくはＣ１－６アルキレン基（例えばメチレン基、エチレン基）であるか、あるいは－Ｃ（Ｏ）Ｏ－、－Ｏ－または－Ｃ（Ｏ）ＮＨ－であり、Ｂ’はＨまたは活性基である］。
　上記活性基としては、例えば、Ｎ－スクシンイミジル基が挙げられる。Ｂ’が活性基である場合には、これが反応性の向上に寄与し、活性な反応性基（ＹおよびＢ’から構成される）が得られる。
　本発明の好ましい実施態様において、式（ＩＩ）において、上記のＡは、アミン反応性基、チオール反応性基、アルキン反応性基またはジベンゾシクロオクチン反応性基である。
　上記の反応性基は、リンカーを介してリガンドを結合させるポリヌクレオチドの構成単位の種類や、リガンドの種類等に応じて、適宜選択することができる。
　本発明の１つの実施態様では、上記式（Ｉ）または（ＩＩ）においてｘ＝２であるリンカー、すなわち、ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー（例えば１～１００の整数、例えば１～５０の整数、２～３０の整数または１～１２の整数、例えば１、２、３、４、５、６、７または８の長さのＰＥＧを有する、ＰＥＧをベースとするリンカー）が使用される（以下、「ＰＥＧリンカー」とも呼ぶ）。種々のタイプの市販のヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーを容易に入手することができる。
　ヘテロ二官能性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーの具体例としては、Ｎ－ヒドロキシスクシンイミジル－ＰＥＧ（ｎ）－アジド（ｎは上記の定義のとおり）が挙げられるがこれに限定はされない。このようなＮ－ヒドロキシスクシンイミジル－ＰＥＧ（ｎ）－アジドは市販のものを入手することができ、例えば、以下の構造を有するＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ（ＮＨＳ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｏ東京化成工業株式会社製　Ａ２３８８）を使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
　もちろん、上記式（Ｉ）または（ＩＩ）以外の、ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）をベースとするリンカーも使用することができる。これらも含めてポリアルキレングリコールリンカー（例えばＰＥＧリンカー）が使用される場合、当該リンカーのポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）の長さは、１～１００の整数、例えば１～５０の整数、２～３０の整数または１～１２の整数、例えば１、２、３、４、５、６、７または８であることができる。本発明の１つの実施態様において、上記ポリアルキレングリコール（例えばＰＥＧ）の長さは、１～３０、好ましくは１～２０、より好ましくは２～１５である。
　上述のように、リンカーの選択にあたっては、リンカー両端のそれぞれの結合相手が考慮される。当業者であれば、リンカーが結合するポリヌクレオチド中の構成単位、リガンド、およびリンカーの反応性基（例えば上記のＡおよびＢ）を総合的に考慮した上で、これらの適当な組み合わせを適宜選択することが可能である。
　この場合、リンカーの結合相手となるポリヌクレオチド中の構成単位は、必要に応じて、化学修飾がなされる。例えば、上記構成単位（デオシキリボヌクレオチド、リボヌクレオチドまたは核酸類似体）のリンカー結合部位をアミノ化、チオール化、アルキン化またはジベンゾシクロオクチン化することにより、それぞれ、リンカーにおけるアミン反応性基、チオール反応性基、アルキン反応性基またはジベンゾシクロオクチン反応性基との反応を介して、上記構成単位とリンカーとの間に共有結合を形成させることができる。このような化学修飾がなされたヌクレオチドを、ここでは「リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」とも呼び、このような修飾は、上で説明した化学修飾の一態様を構成するものである。なお、「リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」は、上記で例示したような反応の結果としてリンカーの一端と共有結合を形成するため、反応前と反応後では異なる構造を取り得るが、リンカーと共有結合を形成している形態のヌクレオチドも、ここでは「リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」として呼ぶことができる。そして、このことは、後述の「リガンドとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」にも当てはまる。
　例えば、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドとリンカーの反応基との組み合わせとしては、以下が挙げられる：
・アミノ化ヌクレオチド－ＮＨＳエステル
　活性エステル法によるアミドカップリングによって、ヌクレオチドとリンカーが連結される。
・チオール化ヌクレオチド－ピリジルジスルフィド基
　ピリジルジチオール活性化リガンドによるジスルフィド結合によって、ヌクレオチドとリンカーが連結される。
・チオール化ヌクレオチド－マレイミド
　チオール－マレイミドカップリングの結果、共有結合によりヌクレオチドとリンカーが連結される。
・アルキン化ヌクレオチド－アジド
　クリック反応（通常、銅触媒を用いる）により、ヌクレオチドとリンカーが連結される。
・ジベンゾシクロオクチン化ヌクレオチド－アジド
　触媒なしの水性バッファー中で進行するクリック反応（銅フリーのクリック反応）により、ヌクレオチドとリンカーが連結される。
　これらの組み合わせやその反応様式の詳細に関しては、例えばＴｈｅｒ　Ｄｅｌｉｖ．２０１３　Ｊｕｌｙ；４（７）：７９１－８０９（Ｆｉｇｕｒｅ　５）を参照することができる（当該文献は参照することにより本明細書に組み込まれる）。
　また、リガンドも、リンカーとリガンドとの結合に関連して、必要に応じて上記のような化学修飾（例えばアミノ基修飾、カルボキシル基修飾、チオール基修飾、水酸基修飾、またはクリック反応用修飾（例えばアジド、アルキン、ジベンゾシクロオクチン））を施すことができる。
　しかしながら、リガンドとしてペプチドやタンパク質を使用する場合には、これらは通常、Ｎ末端にＮＨ２基を有するため、アミン反応性基を有するリンカーを用いることにより、当該ＮＨ２基とアミン反応性基との間の反応を介して、両者の間に共有結合を形成させることが可能である。また、ペプチドやタンパク質がアルギニンやリジンをそれらのアミノ酸配列に含む場合、それらの側鎖のＮＨ２基とアミン反応性基との間で結合を形成させることもできる。すなわち、ペプチドやタンパク質が元来有するＮＨ２基（Ｎ末端の、リジンの、および／またはアルギニンのＮＨ２基）のうちの１つまたは複数とアミン反応性基との間で結合を形成させることもできる。なお、当業者は、いずれのＮＨ２基を反応に使用するかを所望の構造に応じて適宜選択することができ、各ＮＨ２基を用いる際の反応方法はそれぞれ、当業者によく知られている。
　なお、リンカーの向きは任意であり、いずれの側がヌクレオチドに結合し、いずれの側がリガンドに結合してもよい。典型的には、ヌクレオチドの化学修飾、リガンドおよびリンカーの反応性基（上記のＡおよびＢ）の組み合わせによって、意図する向きを達成することができる。
　本発明の１つの態様では、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドとリンカーの反応基との組み合わせとして、アルキン化ヌクレオチドとアジドとの組み合わせが使用される。また、リンカーの反応基とリガンド（リガンドの反応部位）の組み合わせとして、ＮＨＳエステルとリガンドとしてのペプチドが元来有するリジンのＮＨ２基との組み合わせを使用することができる。上記のＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒは、この態様において使用できるリンカーの一例であって、上記式（ＩＩ）の一態様（Ａがアジドであり、ＢがＮ－スクシンイミジル基であり、Ｘがエチレン基であり、Ｙが－Ｃ（Ｏ）Ｏ－であり、ｘが２であり、ｙが４であるＰＥＧリンカー）に相当する。この場合には、以下の構造を介して、ポリヌクレオチドの構成単位（ヌクレオチドまたは核酸類似体）とリガンドとが連結される：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
［式中、Ｎｕｃは、リンカーを介してリガンドが結合するポリヌクレオチドの構成単位を表し、ＬＧはリガンドを表す］。
　なお、上記のように、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドとリンカーの一端が上記で例示したような反応の結果として共有結合を形成し、そして同様にリンカーの他端とリガンドもそのような反応の結果として共有結合を形成するため、リンカーは通常、使用前と使用後（ヌクレオチドとリガンドを連結後）とでは異なる構造をとる。しかしながら、当業者であれば、使用前のリンカーの両反応基の種類、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドの種類およびリガンド（またはリンカーとの結合のために化学修飾されたリガンド）の種類や、各反応条件などから、使用したリガンドがどのような構造でヌクレオチドとリガンドとの間に連結部分として組み込まれるかを明確に理解することが可能である。本明細書においては、上記のような使用前のリンカーも、連結部分に組み込まれた形態のリンカー（すなわち使用前リガンド由来の構造を有する連結部分）も含めて、リンカーと呼ぶ。
　上述のように、リンカーの一端とリガンドとの結合、ならびにリンカーの他端とポリヌクレオチドの３’末端および５’末端以外に位置するヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体）との結合は、選択されたリガンドやリンカーに応じて、そして、ヌクレオチドにおける結合部位に応じて、それぞれに関して当業者に公知の方法・技術に従って実施することができる。そして、例えば市販のリンカーやリガンドを使用する場合には、当業者は、それらの供給者の指示に従って上記結合を実施することが可能である。
　上記のように、リンカーを介してリガンドがキャリアー部分のポリヌクレオチドに結合している場合、当該ポリヌクレオチドにおける結合を担う構成単位は、リンカーとの結合のために化学修飾されていてもよい。従って、本発明の１つの態様において、リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位は、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）である。
　本発明の１つの実施態様において、リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位は、リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部であり、ＬＫはリンカーであり、そしてＬＧはリガンドを表す。上記塩基は、アデニン、チミン、シトシン、グアニン、ウラシルまたは上記の化学修飾塩基であることができる。リンカーは、例えば、ポリアルキレングリコールリンカーであり、リガンドは、例えば環状ＲＧＤ配列含有ペプチド、葉酸またはビタミンＥであることができる。］。
　本発明のさらなる実施態様において、リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位は、リンカーおよびリガンド（ｃＲＧＤｆＫ）とともに以下の構造を形成している：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000026
［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す。上記塩基は上記に定義されるとおりである。］。
　本発明のさらに別の実施態様において、リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位は、リンカーおよびリガンド（葉酸）とともに以下の構造を形成している：
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000027
 ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
　上述のように、リンカーを介したリガンドの結合は、当業者であれば、公知の各種方法・技術に基づいて実施することが可能であるが、例えば、リガンドとしてｃＲＧＤｆＫ、リンカーとしてＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒを使用して、リガンドをヌクレオチドの２’位から懸垂させる場合の方法を以下に簡単に説明する：
（ａ）リガンドとリンカーとの結合
　ｃＲＧＤｆＫとＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒを、ＮＨＳエステルとｃＲＧＤｆＫのリジンのアミノ基との縮合反応により結合させて、ｃＲＧＤｆＫにアミド結合によりアジド－ＰＥＧ４が連結しているアジド化ｃＲＧＤｆＫを作成する。
（ｂ）アルキン修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドの調製
　（リンカーを介して）リガンドを結合させたい位置の構成単位をアルキン修飾ヌクレオチドとしたポリヌクレオチドを調製する。このようなポリヌクレオチドの調製方法は、当業者には公知であり、例えば、標準的なオリゴ合成においてアルキンホスホロアミダイトを用いることにより合成することができる。アルキン修飾ヌクレオチドの調製のためには、例えば、２’－Ｏ－プロパルギルアデノシン、２’－Ｏ－プロパルギルシチジン、２’－Ｏ－プロパルギルグアノシン、２’－Ｏ－プロパルギルウリジンまたは２’－Ｏ－プロパルギル脱塩基リボースを使用することができる。
（ｃ）クリック反応
　アジドとアルキンによる付加感化反応（クリック反応）を用いて、アジド化ｃＲＧＤｆＫとアルキン修飾ヌクレオチドとを結合させる。
　これにより、所望の位置のヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチドまたは核酸類似体）の２’の部位に、トリアゾールを介してＰＥＧ４が結合し、そこにアミド結合によって結合したｃＲＧＤｆＫを有するポリヌクレオチド、すなわち、リガンドがリンカーを介してヌクレオチドの２’位から懸垂しているポリヌクレオチド（図１Ａ）が得られる。
　ヌクレオチドの４’位に結合させる場合にも、同様の手法を用いて、ｃＲＧＤｆＫをリンカーを介してヌクレオチドに結合させることができる。
　また上述のように、上記リガンドは直接結合させることができ、その場合、通常は、当該結合としては、共有結合、イオン結合、水素結合等が考えられるが、より安定した結合が得られるという観点から、共有結合が好ましい。
　上記リガンドを直接結合させる場合には、例えば、リンカーを介したリガンドの結合に関して上述したような化学修飾や反応性基を適宜、リガンドを結合させるポリヌクレオチドの構成単位（ヌクレオチドまたは核酸類似体）および／またはリガンドに導入し、公知の反応、例えば上述したような反応を使用することにより、当該構成単位とリガンドとの間で共有結合を形成させることが可能である。この場合、上記のような化学修飾がされたヌクレオチド（デオキシリボヌクレオチドもしくはリボヌクレオチド）を「リガンドとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド」とも呼ぶ。
　リガンドの直接の結合についても、当業者であれば、公知の各種方法・技術に基づいて実施することが可能であるが、例えば、リガンドとしてｃＲＧＤｆＫを使用して、ヌクレオチドの２’の位置から懸垂させる場合には、以下のように結合を実施することができる：
　例えばｃＲＧＤｆＫのリジンのＮＨ２基を公知の縮合反応によりアジド化して、アジド化ｃＲＧＤｆＫを作成し、その後クリック反応を用いて、このアジド化ｃＲＧＤｆＫとアルキン修飾ヌクレオチドを含むポリヌクレオチドとを結合させることにより、所望の位置のヌクレオチド（または化学修飾ヌクレオチド等）の２’の部位に直接、ｃＲＧＤｆＫが結合したポリヌクレオチドを得ることができる。
　また、本発明の核酸複合体は、上記のように、複数のリガンドを含むこともできる。
　本発明の核酸複合体が複数のリガンドを含む場合の態様として、例えば以下のものが挙げられる。
　（Ａ）２つのリガンドが分岐リンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端以外かつ３’末端以外の１つの構成単位に結合している（図２（Ａ））。
　（Ｂ）４つのリガンドが分岐リンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端以外かつ３’末端以外の１つの構成単位に結合している（図２（Ｂ））。ここでは、図に示すような２段階の分岐構造を有する分岐リンカーを用いることにより、４つのリガンドを１つの構成単位に結合させている。
　（Ｃ）２つのリガンドがそれぞれ、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’側の領域と３’側の領域（５’末端以外かつ３’末端以外の領域）において、それぞれの領域における構成単位とリンカーを介して結合している（図２（Ｃ））。例えば、リガンドは、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端から２～１０番目、例えば２～６番目のうちの１つの構成単位に結合しており、および／または３’末端から２～１０番目、例えば２～６番目のうちの１つの構成単位に結合している。
　（Ｄ）１つのリガンドがリンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端以外かつ３’末端以外の１つの構成単位に結合し、さらに別の１つのリガンドがリンカーを介して、キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端または３’末端に結合している（図２（Ｄ））。
　なお、参考までに、本発明の核酸複合体が１つのリガンドを含む場合の一態様の概略図も図２（Ｅ）として示す。
　上記（Ｃ）および（Ｄ）における各リンカーは上記に記載したようなものを使用することができる。上記（Ａ）および（Ｂ）のような態様においては、例えば２分岐型の分岐リンカー（Ａ）や二重の２分岐を有する４分岐型の分岐リンカーを使用することができる。分岐リンカーとしては、これらに限定されず、所望の構造に応じて、さらに多分岐のリンカーや異なる構造を有するものも使用することができる。
　本発明においては、例えば、分岐リンカーとして、ポリヌクレオチドと２つのｃＲＧＤｆＫとを以下に示すように連結するリンカーを使用することができる。この場合、２つのｃＲＧＤｆＫを２量体の形態で、同一の構成単位ヌクレオチドに結合させることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000028
　また、例えば、４分岐型の分岐リンカーを使用して４つのｃＲＧＤｆＫとポリヌクレオチドとを連結することにより、以下に示すように、４つのｃＲＧＤｆＫを４量体の形態で、同一の構成単位ヌクレオチドに結合させることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000029
　また、以下のような公知の分岐リンカー（例えばＴｈｅｒ　Ｄｅｌｉｖ．２０１３　Ｊｕｌｙ；４（７）：７９１－８０９参照）も同様に使用することができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000030
（式中、Ｎｕｃは、リンカーを介してリガンドが結合するポリヌクレオチドの構成単位を表し、ＬＧはリガンドを表す。なお、ＮｕｃおよびＬＧは、上記の組み合わせとは異なる任意の組み合わせであることができる。）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000031
（式中、Ｎｕｃは、リンカーを介してリガンドが結合するポリヌクレオチドの構成単位を表し、ＬＧはリガンドを表す。なお、ＮｕｃおよびＬＧは、上記の組み合わせとは異なる任意の組み合わせであることができる。）
　なお、複数のリガンドが結合される場合、それらは同一であっても、または互いに異なっていてもよい。同様に、複数のリンカーを用いる場合、それらは同一であっても、または互いに異なっていてもよい。上記核酸複合体が複数のリガンドおよび／または複数のリンカー（または分岐リンカー）を含む場合であっても、それぞれの結合（ヌクレオチドとリンカーとの結合、リンカーとリガンドとの結合）は、上述した方法と同様の方法で行うことが可能である。また、上記（Ｄ）の態様に関して、ポリヌクレオチドの３’末端または５’末端に各種リンカーを結合させる方法も、当業者にはよく知られている。
　以上、いくつかの実施態様において、核酸複合体の好適な典型例について説明したが、いくつかの実施態様における核酸複合体は上記典型例に限定されるものではない。また、いくつかの実施形態において、活性部分のポリヌクレオチドおよびキャリアー部分のポリヌクレオチドは、当業者であれば公知の方法を適宜選択することにより調製することができる。例えば、標的転写産物の塩基配列（典型的には標的遺伝子の塩基配列）の情報に基づいて、核酸の塩基配列を設計し、市販の核酸自動合成機（アプライドバイオシステムズ社製、べックマン社製等）を用いて合成し、次いで、得られるポリヌクレオチドを逆相カラム等を用いて精製することにより、核酸を調製することができる。そして、このようにして調製した核酸を適当な緩衝液中にて混合し、約９０～９８℃にて数分間（例えば、５分間）かけて変性させた後、約３０～７０℃にて約１～８時間かけてアニーリングさせることにより、いくつかの実施形態における核酸複合体を調製することができる。なお、本発明の核酸複合体ではキャリアー部分のポリヌクレオチドにリガンドが結合しているが、当該核酸複合体は、例えば、予めリガンドを結合させたポリヌクレオチドを用いて、前記の通り活性部分のポリヌクレオチドとアニーリングすることにより、調製することができる。
　なお、上述のように、本発明の核酸複合体は、主にＲＮａｓｅＨ依存的な経路により、そのアンチセンス効果を発揮するものと考えられる。しかしながら、本発明のさらなる実施態様において、本発明の核酸複合体は、ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果を有し得る。「ＲＮａｓｅＨ非依存的アンチセンス効果」とは、標的遺伝子の転写産物（ＲＮＡセンス鎖）と、その部分配列に相補的な核酸鎖とがハイブリダイズすることによる翻訳の阻害やエキソンスキッピング等のスプライシング機能変換効果によって生じる標的遺伝子の発現を抑制する活性のことを意味する。
　＜標的遺伝子の発現又は標的転写産物を抑制するための組成物＞
　本発明の核酸複合体は、特異性高く効率良く標的細胞内に取り込まれて、当該細胞内の標的遺伝子の発現又は標的転写産物レベルを抑制し、当該細胞の増殖を極めて効果的に抑制することができる。従って、上記核酸複合体を有効成分として含有する、例えば、標的遺伝子の発現および／または標的細胞（例えば癌細胞）の増殖をアンチセンス効果によって抑制するための組成物を、本発明は提供することができる。特に、本発明の核酸複合体は、優れた特異性と効率で標的組織や標的部位に送達することができ、高い特異性および効率で標的細胞の増殖を抑制できるため、低濃度の投与により高い薬効を得ることができ、少ない副作用で、代謝性疾患、腫瘍、感染症といった標的遺伝子の発現亢進に伴う疾患を治療、予防するための医薬組成物も提供することができる。実際に、実施例に示されるように、本願では、本発明の核酸複合体を使用すると、他の核酸複合体（例えばリガンドが結合されていない核酸複合体）を使用した場合と比較して、その投与に伴う副作用、特に肝毒性が、顕著に軽減されることも見出された。
　従って、本発明の１つの実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現を減少させるための、上記核酸複合体に関する。
　また、本発明のさらなる実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、核酸複合体に関する。
　さらに、本発明の１つの実施態様において、本発明は、上記核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物に関する。
　また、本発明の別の実施態様において、本発明は、上記医薬組成物を製造するための、上記核酸複合体の使用に関する。
　本発明の１つの実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、遺伝子の発現亢進を伴う疾患を治療または予防する方法に関する。
　さらに別の実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において癌を治療または予防する方法に関する。
　別の実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において肝疾患を治療または予防する方法に関する。
　上記医薬組成物は、癌細胞の増殖を抑制するための医薬組成物であることができ、または、上記医薬組成物は、癌治療用および／または予防用医薬組成物であることができる。
　また、上記医薬組成物は、肝疾患治療用および／または予防用医薬組成物であることができる。
　上記癌細胞の癌および上記癌は、例えば、脳腫瘍；頭、首、肺、子宮又は食道の扁平上皮癌；メラノーマ；肺又は子宮の腺癌；腎癌；悪性混合腫瘍；肝細胞癌；基底細胞癌；勅細胞腫様歯肉腫；口腔内腫瘤；肛門周囲腺癌；肛門嚢腫瘤；肛門嚢アポクリン腺癌；セルトリ細胞腫；膣前庭癌；皮脂腺癌；皮脂腺上皮腫；脂腺腺腫；汗腺癌；鼻腔内腺癌；鼻腺癌；甲状腺癌；大腸癌；気管支腺癌；腺癌；腺管癌；乳腺癌；複合型乳腺癌；乳腺悪性混合腫瘍；乳管内乳頭状腺癌；線維肉腫；血管周皮腫；肉腫；骨肉腫；軟骨肉腫；軟部組織肉腫；組織球肉腫；粘液肉腫；未分化肉腫；肺癌；肥満細胞腫；皮膚平滑筋腫；腹腔内平滑筋腫；平滑筋腫；慢性型リンパ球性白血病；リンパ腫；消化管型リンパ腫；消化器型リンパ腫；小～中細胞型リンパ腫；副腎髄質腫瘍；顆粒膜細胞腫；褐色細胞腫；頭頸部癌；乳癌；肺癌；結腸癌；卵巣癌；前立腺癌；神経膠腫；神経膠芽腫；星状細胞腫；多形神経膠芽腫；炎症性乳癌；ウィルムス腫瘍；ユーイング肉腫；横紋筋肉腫；上衣腫；髄芽腫；腎癌；肝癌；黒色腫；膵臓癌；骨巨細胞腫；甲状腺癌；リンパ芽球性Ｔ細胞白血病；慢性骨髄性白血病；慢性リンパ球性白血病；ヘアリー細胞白血病；急性リンパ芽球性白血病；急性骨髄性白血病；ＡＭＬ；慢性好中球性白血病；急性リンパ芽球性Ｔ細胞白血病；形質細胞腫；免疫芽球性大細胞型白血病；マントル細胞白血病；多発性骨髄腫；巨核芽球性白血病；急性巨核球性白血病；前骨髄球性白血病；赤白血病；ホジキンリンパ腫；非ホジキンリンパ腫；リンパ芽球性Ｔ細胞リンパ腫；バーキットリンパ腫；濾胞性リンパ腫；神経芽細胞腫；膀胱癌；尿路上皮癌；外陰癌；子宮頸癌；子宮内膜癌；中皮腫；食道癌；唾液腺癌；肝細胞癌；胃癌；上咽頭癌；頬癌；口腔癌ＧＩＳＴ（消化管間葉性腫瘍）；上皮様細胞癌；肺胞基底上皮腺癌および精巣癌からなる群から選択される。
　上記肝疾患は、例えば、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎、Ｃ型肝炎、Ｄ型肝炎、Ｅ型肝炎、肝臓癌、新生児肝炎、非アルコール性肝疾患、非アルコール性脂肪肝炎、自己免疫性肝炎、肝臓虚血／再かん流、肝線維症、肝硬変、急性肝不全、劇症肝炎、アルコール性肝障害、α１アンチトリプシン欠損症、慢性肝炎、胆汁鬱滞型肝疾患、肝嚢胞、脂肪肝、ジルベール症候群、ヘモクロマトーシス、ポルフィリン症、原発性胆汁性肝硬変、ライ症候群、サルコイドーシス、脂肪性肝炎、放射線肝炎、薬物性肝障害、代謝性肝疾患、脂質異常症（例えば家族性高コレステロール血症）、ウイルス性肝炎およびウィルソン病からなる群から選択される。
　本発明のさらなる実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を細胞と接触させる工程を含む、細胞内の転写産物レベルを低減する方法に関する。
　本発明の別の実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を細胞、好ましくは癌細胞と接触させる工程を含む、当該細胞の増殖を抑制する方法に関する。
　本発明の別の実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現を低減させるための、上記核酸複合体の使用に関する。
　本発明の別の実施態様において、本発明は、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制するための、上記核酸複合体の使用に関する。
　本発明はさらに、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現を低減させるための薬剤を製造するための、上記核酸複合体の使用に関する。本発明はまた、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制するための薬剤を製造するための、上記核酸複合体の使用に関する。
　さらなる実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的遺伝子の発現レベルを低減する方法に関する。本発明の別の実施態様において、本発明は、上記核酸複合体を哺乳動物に投与する工程を含む、哺乳動物において、好ましくは標的組織・標的部位における、標的細胞、好ましくは癌細胞の増殖を抑制する方法に関する。
　これらの態様では、好ましくは、活性部分のポリヌクレオチドは、上記転写産物のいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である。
　１つの実施態様において、上記転写産物は、タンパク質をコードするｍＲＮＡ転写産物である。好ましくは、上記タンパク質はヒトＢＣＬ２、ヒトＢＣＲ－ＡＢＬまたはヒトＡＰＯＢである。他の実施態様において、上記転写産物は、タンパク質をコードしない転写産物、例えば、転位関連肺腺癌転写産物（ＭＡＬＡＴ－１）である。
　また、本発明の１つの実施態様において、上記標的遺伝子は、ヒトｂｃｌ－２、ヒトＢＣＲ－ＡＢＬ、ヒトＡＰＯＢまたはヒトＭＡＬＡＴ－１である。
　１つの好ましい実施態様において、上記哺乳動物はヒトである。
　核酸複合体を含む上記組成物や薬剤は、公知の製剤学的方法により製剤化することができる。例えば、カプセル剤、錠剤、丸剤、液剤、散剤、顆粒剤、細粒剤、フィルムコーティング剤、ペレット剤、トローチ剤、舌下剤、咀嚼剤、バッカル剤、ペースト剤、シロップ剤、懸濁剤、エリキシル剤、乳剤、塗布剤、軟膏剤、硬膏剤、パップ剤、経皮吸収型製剤、ローション剤、吸引剤、エアゾール剤、注射剤、坐剤等として、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的に使用することができる。
　これら製剤化においては、薬理学上もしくは飲食品として許容可能な担体、具体的には、滅菌水や生理食塩水、植物油、溶剤、基剤、乳化剤、懸濁剤、界面活性剤、ｐＨ調節剤、安定剤、香味剤、芳香剤、賦形剤、ベヒクル、防腐剤、結合剤、希釈剤、等張化剤、無痛化剤、増量剤、崩壊剤、緩衝剤、コーティング剤、滑沢剤、着色剤、甘味剤、粘稠剤、矯味矯臭剤、溶解補助剤あるいはその他の添加剤等と適宜組み合わせることができる。
　上記組成物または薬剤の好ましい投与形態としては特に制限はなく、経腸管的（経口的等）又は非経腸管的、より具体的には、静脈内投与、動脈内投与、腹腔内投与、皮下投与、皮内投与、気道内投与、直腸投与及び筋肉内投与、輸液による投与が挙げられる。
　各実施形態において核酸複合体や組成物は、ヒトを含む動物を対象として使用することができ、すなわち、ヒトおよび／またはヒト以外の動物を対象とすることができる。ヒト以外の動物としては特に制限はなく、種々の家畜、家禽、ペット、実験用動物等を対象とすることができる。
　いくつかの実施形態における核酸複合体または組成物を投与又は摂取する場合、その投与量又は摂取量は、対象の年齢、体重、症状、健康状態、組成物の種類（医薬品、飲食品など）等に応じて、適宜選択されるが、ある実施形態にかかる核酸複合体または組成物の有効摂取量は、ヌクレオチド換算で０．００１ｍｇ／ｋｇ／日～５０ｍｇ／ｋｇ／日であることが好ましい。
　後述の実施例で示されるように、がん遺伝子であるｂｃｌ－２またはヒトＢＣＲ－ＡＢＬを標的とする本発明の二本鎖核酸複合体、あるいはＡＰＯＢやＭＡＬＡＴ－１を標的とする本発明の二本鎖核酸複合体は、非常に高い効率で標的細胞の増殖を抑制することができる。また、本発明の二本鎖核酸複合体は、優れた特異性と効率で、標的組織や標的部位に送達することが可能である。従って、本発明は、対象に対して、本発明の核酸複合体を添加または投与し、標的遺伝子の発現又は標的転写産物をアンチセンス効果によって抑制する方法を提供することができる。また、本発明は、本発明の核酸複合体を対象に投与することによって、必要に応じて組織・部位特異的に、標的遺伝子の発現亢進等を伴う細胞の増殖を抑制し、それによってこのような発現亢進等を伴う各種疾患を治療、予防するための方法をも提供することができる。
　以下、例に基づいて本発明をより具体的に説明するが、実施形態は以下の例に限定されるものではない。
　例１
［２本鎖核酸の合成］
　ヒトＢＣＬ２遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするＤＮＡ－ＤＮＡを基本骨格とし、糖部位にリガンド結合部位を有する塩基を含む２本鎖核酸を設計した。ＢＣＬ２遺伝子に対するに対する２本鎖核酸の具体例としては、アンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（１６ｍｅｒ）を配列番号１に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号２～４に示す。各々の遺伝子配列においてアンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖をアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成する。配列番号１と２から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１、配列番号１と３から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２、配列番号１と４から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３とする。１本鎖核酸は株式会社ジーンデザイン社に合成を委託し、アンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖のアニーリングによる２本鎖核酸の形成は社内で行った。
　配列表記として下線で示すヌクレオチドはＲＮＡ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000032
 はＬＮＡ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000033
 は２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ｃｙｔｉｄｉｎｅ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000034
 は２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ－１，１－ｄｉｈｙｄｒｏ－Ｄ－ｒｉｂｏｓｅ、それ以外はＤＮＡを表す。また、ヌクレオチドの結合様式としてｐｓはチオリン酸結合、ｐｏはホスホジエステル結合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000035
　例２
　［５’末端へのｃＲＧＤ付加］
　ＢＤＸ－１相補鎖（配列番号２）の５’末端へのｃＲＧＤ付加は以下の通り行った。
　（１）センス鎖へのヘテロリンカーの導入（反応組成）
（ｉ）５’－アミノ修飾ＢＤＸ－１相補鎖（配列番号２）　３０ｎｍｏｌ（６ｍＭ／Ｄ．Ｗに溶解）
（ｉｉ）０．５Ｍ　ｓｏｄｉｕｍ　ｔｅｔｒａｂｏｒａｔｅ　ｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　６．８）
（ｉｉｉ）ＭＡＬ－ｄＰＥＧ（登録商標） ６－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ（Ｑｕａｎｔａ　ＢｉｏＤｅｓｉｇｎ社製　日油株式会社より購入）　９０ｎｍｏｌ　（１８ｍＭ／ジメチルスルホキシド：アセトニトリル＝４：１に溶解）
　それぞれ同液量を混合し、２５℃、２時間撹拌して反応した。モル比／オリゴヌクレオチド：ＭＡＬ－ｄＰＥＧ（登録商標） ６－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ＝１：３（３モル当量）で付加反応を実施した。
　（２）ｃＲＧＤ　ペプチドの付加反応（反応組成）
　（１）で得られた生成物（ＢＤＸ－１相補鎖＿ＭＡＬ－ｄＰＥＧと表記）に以下の組成でｃＲＧＤ　ペプチド付加反応を行った。
（ｉ）ＢＤＸ－１相補鎖＿ＭＡＬ－ｄＰＥＧ　４５ｎｍｏｌ（２ｍＭ）
（ｉｉ）２Ｍ　Ｔｒｉｅｔｈｙｌａｍｍｏｎｉｕｍ　ａｃｅｔａｔｅ／Ｆｏｒｍａｍｉｄｅ　ｂｕｆｆｅｒ
（ｉｉｉ）ｃＲＧＤ　ペプチド（Ｃｙｃｌｏ（－Ａｒｇ－Ｇｌｙ－Ａｓｐ－Ｄ－Ｐｈｅ－Ｃｙｓ）　ＢＡＣＨＥＭ社製　ＣＣａｔ．Ｎｏ．Ｈ－７２２６）（１０ｍＭ／Ｄ．Ｗに溶解）
　モル比／ＢＤＸ－１相補鎖：ｃＲＧＤ　ペプチド＝１：２．５（２．５　モル当量）、２５℃、２　時間撹拌して付加反応を実施した。ＬＣ／ＭＳ　にて未反応物を確認したため、さらに追加でｃＲＧＤペプチドを１０モル当量分追加（合計；１２．５モル当量）して反応させた。アンチセンス鎖（配列番号１）と、ｃＲＧＤペプチドの付加したＢＤＸ－１相補鎖をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＤＸ－１－ｃＲＧＤとする。
　例３
　［糖部２’部位へのＲＧＤ付加］
　ＢＤＸ－２相補鎖（配列番号３）及びＢＤＸ－３相補鎖（配列番号４）へのＲＧＤ付加は以下の通り行った。
（１）ＧＲＧＥＳＰ（ネガティブコントロール：Ｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ　Ｒｅｌａｔｅｄ　Ｐｅｐｔｉｄｅ（ＧＲＧＥＳＰ）　タカラバイオ株式会社製　ＴＫＲ　ＳＰ００２）、ｃＲＧＤｆＫ（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　ＲＧＤ：Ｃｙｃｌｏ（－ＲＧＤｆＫ）　Ｓｅｌｌｅｃｋ社製　Ｓ７８３４）の２種類のペプチドのＮＨ２基（前者はＮ末端のＮＨ２基、後者は、リジンのＮＨ２基）に縮合反応（２８℃、４時間）によりＡｚｉｄｏ－ＰＥＧ４－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒ（ＮＨｓ－ＰＥＧ４－Ａｚｉｄｏ東京化成工業株式会社製　Ａ２３８８）を結合させアジド化ペプチドを作製した。
（２）３０％ＤＭＳＯ溶液中、ＢＤＸ－２相補鎖（配列番号３）及びＢＤＸ－３相補鎖（配列番号４）とアジド化ペプチドを原料として、Ｃｕ（ＩＩ）錯体の存在下、クリック反応を行った。（３０％ＤＭＳＯ溶液中、ｐｅｐｔｉｄｅ－Ｎ３　５等量、ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ　５等量を加え４０℃で１６時間反応させた。
（３）クリック反応による過剰なＣｕはオリゴＤＮＡのリン酸ジエステル、塩基部あるいはトリアゾールに付着している可能性があり、陽イオン交換樹脂（Ａｇ（登録商標）ＭＰ－５０（バイオラッド社製）によりＮａ＋に置換した。
（４）アンチセンス鎖（配列番号１）と、ＧＲＧＥＳＰ（ネガティブコントロール）ペプチドの付加したＢＤＸ－２相補鎖及びＢＤＸ－３相補鎖をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＤＸ－２－ＲＧＥ（Ｎｅ）、ＢＤＸ－３－ＲＧＥ（Ｎｅ）とする。また、アンチセンス鎖（配列番号１）と、ｃＲＧＤｆＫ（Ｍｏｎｏｍｅｒｉｃ　ＲＧＤ）ペプチドの付加したＢＤＸ－２相補鎖及びＢＤＸ－３相補鎖をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＤＸ－２－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－３－ｃＲＧＤとする。ここで、ＢＤＸ－２－ｃＲＧＤのキャリアー部分は図１Ａに示すような構造を有し、具体的には、１６ｍｅｒのポリヌクレオチド（５’側から１～７番目および９～１６番目がデオキシリボヌクレオチドであり、８番目がリンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチド、具体的にはリボヌクレオチド誘導体である）の８番目のリボヌクレオチド誘導体の２’位に、ｃＲＧＤｆＫがそのリジンのアミノ基に結合したリンカーを介して結合されており、ＢＤＸ－３－ｃＲＧＤでは、キャリアー部分としての１６ｍｅｒのポリヌクレオチド（５’側から１～７番目および９～１６番目がデオキシリボヌクレオチドであり、８番目がリンカーとの結合のために化学修飾された脱塩基ヌクレオチド、具体的には脱塩基リボヌクレオチド誘導体である）の８番目の脱塩基リボヌクレオチド誘導体の２’位に、リンカーを介してｃＲＧＤｆＫが結合されている。リガンドとしてＧＲＧＥＳＰ（ネガティブコントロール）を使用して得られたＢＤＸ－２－ＲＧＥ（Ｎｅ）のキャリアー部分の構造を図１Ｂに示す。
　例４
　［Ｔｍ値（融解温度）測定］
　ＢＤＸ－１、ＢＤＸ－１－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－２－ＲＧＥ（Ｎｅ）、ＢＤＸ－２－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－３－ＲＧＥ（Ｎｅ）、ＢＤＸ－３－ｃＲＧＤのＴｍ値を以下の通り測定した。
（１）測定機器
　ＵＶ－１８００（株式会社島津製作所製）
（２）使用システム
　ＢｉｏＳｐｅｃ－１６００
（３）温度パラメーター
　開始温度：２０℃
　開始保持：２０分
　温度速度：０．５℃／分
　測定感覚：０．５℃
得られたＴｍ値を表２に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000036
　例５
　［細胞培養］
　後述の試験に用いるヒト癌由来細胞株は、以下の方法で維持した細胞株を用いた。
　ヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株（Ａ５４９細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ００７６）は、１０質量％のウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。
　例６
　［細胞増殖アッセイ］
　後述の試験で行った細胞増殖アッセイは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。９６穴マイクロプレートを用い、加湿条件下（３７℃、５％　ＣＯ２）、１００μｌ／ウェルの培地で細胞を培養した。細胞増殖アッセイには細胞増殖試薬　ＷＳＴ－１（ロッシュ社製）を１ウェルに対し１０μｌ添加し、マイクロプレートリーダー（Ｂｉｏ　Ｒａｄ社製）を用いて吸光度を測定した。
　例７
　［ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
　上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸（ＢＤＸ－１、ＢＤＸ－１－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－２－ｃＲＧＥ（Ｎｅ）、ＢＤＸ－２－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－３－ｃＲＧＥ（Ｎｅ）、ＢＤＸ－３－ｃＲＧＤ）を用意し、Ａ５４９細胞株に１０，３０，１００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。
　その結果を図３に示す。図３より明らかなように、ｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸は、ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とすることでトランスフェクション試薬を使用せずともＡ５４９癌細胞株に対する増殖抑制活性を示した。また、相補鎖５’末端より、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させる構造の方が、増殖抑制活性が増強されることが明らかとなった。
　例８
［２本鎖核酸の合成］　
　ヒトＢＣＬ２及びＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするＤＮＡ－ＤＮＡを基本骨格とし、糖部位にリガンド結合部位を有する塩基を含む２本鎖核酸を設計した。各標的遺伝子に対する２本鎖核酸の具体例としては、ＢＣＬ２遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（１６ｍｅｒ）を配列番号５に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号６～４０に示す。また、ＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（２０ｍｅｒ）を配列番号４１、４２に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号４３、４４に示す（なおここでは、例１で示した配列番号１および配列番号２で示すポリヌクレオチドも、それぞれアンチセンス鎖ヌクレオチド、相補鎖ヌクレオチドとして使用する）。各々の遺伝子配列においてアンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖をアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成する。ヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とした配列番号１と６から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４、配列番号５と７から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－５、配列番号１と８から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－６、配列番号１と９から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－７、配列番号１と１０から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－８、配列番号１と１１から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－９、配列番号１と１２から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１０、配列番号１と１３から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１１、配列番号１と１４から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１２、配列番号１と１５から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１３、配列番号１と１６から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１４、配列番号１と１７から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１５、配列番号１と１８から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１６、配列番号１と１９から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１７、配列番号１と２０から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１８、配列番号１と２１から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－１９、配列番号１と２２から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２０、配列番号１と２３から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２１、配列番号１と２４から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２２、配列番号１と２５から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２３、配列番号１と２６から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２４、配列番号１と２７から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２５、配列番号１と２８から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２６、配列番号１と２９から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２７、配列番号１と３０から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２８、配列番号１と３１から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－２９、配列番号１と３２から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３０、配列番号５と２から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３１、配列番号５と１７から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３２、配列番号１と３３から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３３、配列番号１と３４から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３４、配列番号１と３５から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３５、配列番号１と３６から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３６、配列番号１と３７から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３７、配列番号１と３８から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３８、配列番号１と３９から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－３９、配列番号１と４０から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４０とする。また、ヒトＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子を標的とした配列番号４１と４３から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４１、配列番号４１と４４から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４２、配列番号４２と４３から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４３、配列番号４２と４４から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４４とする。配列番号５～９及び２７～４４の１本鎖核酸は社内でＤＮＡ／ＲＮＡ自動合成機（ＮＴＳＨ－８：日本テクノサービス株式会社製）を用い、常法に従い合成した。配列番号１０～２６の１本鎖核酸は株式会社ジーンデザイン社に合成を委託した。また、アンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖のアニーリングによる２本鎖核酸の形成は社内で行った。
　配列表記として下線で示すヌクレオチドはＲＮＡ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000037
 はＬＮＡ、Ｎ1は２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ｃｙｔｉｄｉｎｅ、Ｎ２は２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ａｄｅｎｏｃｉｎｅ、Ｎ３は２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ｇｕａｎｏｃｉｎｅ、Ｎ４は２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ｕｒｉｄｉｎｅ、Ｎ5は５’位に５’－Ｈｅｘｙｎｙｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを自動合成機によりカップリングさせたＴｈｙｍｉｄiｎｅ、Ｎ6は５’位に５’－Ｈｅｘｙｎｙｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅを自動合成機によりカップリングさせたＡｄｅｎｏｃｉｎｅ、それ以外はＤＮＡを表す。また、ヌクレオチドの結合様式としてｐｓはチオリン酸結合、ｐｏはホスホジエステル結合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000038
Figure JPOXMLDOC01-appb-I000039
　例９
　［ｃＲＧＤの付加］
　上記の相補鎖のうち、Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ基を有する相補鎖にｃＲＧＤの付加を行った。ｃＲＧＤを付加した２本鎖核酸は、２本鎖核酸名に「ｃＲＧＤ」を付して呼ぶ。例えば、ｃＲＧＤを付加したＢＤＸ－４は、「ＢＤＸ－４－ｃＲＧＤ」と呼ぶ。また、ＢＤＸ－２９－ｃＲＧＤのように、相補鎖（配列番号３１）が２つの位置でＰｒｏｐａｒｇｙｌ基を有する場合には、両方の位置でｃＲＧＤが付加され、すなわち、この２本鎖核酸は、異なる二箇所にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸である。相補鎖が３つ以上の位置にＰｒｏｐａｒｇｙｌ基を有する場合にも同様に、Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ基と同じ数のｃＲＧＤが付加される。ここで、ｃＲＧＤは、ＢＤＸ－２４－ｃＲＧＤを除いて、例３で示したクリック反応によってＰｒｏｐａｒｇｙｌ基を有する相補鎖（または５’位に５’－Ｈｅｘｙｎｙｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅをカップリングさせた相補鎖）にリンカーを介して付加した。（５’位に５’－Ｈｅｘｙｎｙｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅをカップリングさせた相補鎖に対しても同様に、クリック反応によってｃＲＧＤを付加した。）
　さらに、多量体のｃＲＧＤを付加した２本鎖核酸の場合には、２本鎖核酸名に「ＤＥｃＲＧＤ」（二量体）や「ＴＥｃＲＧＤ」（四量体）を付して呼ぶ（例えば、「ＢＤＸ－２－ＤＥｃＲＧＤ」、「ＢＤＸ－２－ＴＥｃＲＧＤ」）。ここで、ＢＤＸ－２－ＤＥｃＲＧＤのキャリアー部分は図４（Ａ）に示すような構造を、ＢＤＸ－２－ＴＥｃＲＧＤのキャリアー部分は図４（Ｂ）に示すような構造を有する。
　ＢＤＸ－２４－ｃＲＧＤは、例２に示した方法と同様の方法により、マレイミドを介して３’末端にｃＲＧＤを結合させた。すなわち、配列番号２６のヌクレオチドをベースに以下の相補鎖ヌクレオチド：
　5’-  TpoGpoGpoCpoGpoCpoApoUpoGpoCpoTpoGpoGpoGpoApoG-L(6)-X -3’
［式中、Ｌ（６）はＡｍｉｎｏ　Ｃ６　ｌｉｎｋｅｒ、ＸはＭＡＬ－ｄＰＥＧ６－ＮＨＳ　ｅｓｔｅｒを表す］
を調製し、これにｃＲＧＤを結合させ、得られた相補鎖をその後、配列番号１に示されるアンチセンス鎖とアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成させた。　
　例１０
　［葉酸の付加］
　葉酸もクリック反応によりＰｒｏｐａｒｇｙｌ基を有する相補鎖に付加した。（５’位に５’－Ｈｅｘｙｎｙｌ　Ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｉｔｅをカップリングさせた相補鎖に対しても同様に、クリック反応によって葉酸を付加した。）　
　ここで、葉酸としては、ＰＥＧ構造を有する以下のものを使用した：
・ＰＥＧ３-Ｆｏｌａｔｅ（ｂａｓｅ　ｃｌｉｃｋ社製：ＢＣＦＡ－１１１－１）。図４（Ｃ）に示すような構造を有する；
・社内で合成したＰＥＧ１１-Ｆｏｌａｔｅ。図４（Ｄ）に示すような構造を有する；
・社内で合成したＰＥＧ２３-Ｆｏｌａｔｅ。図４（Ｅ）に示すような構造を有する。
　葉酸を付加した２本鎖核酸についても、ｃＲＧＤを付加した２本鎖核酸の場合と同様に、付加した葉酸リガンドに応じて、「ＰＥＧ３-Ｆｏｌａｔｅ」、「ＰＥＧ１１-Ｆｏｌａｔｅ」または「ＰＥＧ２３-Ｆｏｌａｔｅ」のいずれかを２本鎖核酸名に付して呼ぶ。
　以下、表４に上記の例で作製したリガンド付加２本鎖核酸をまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000040
　例１１
　［Ｔｍ値（融解温度）測定］
　例５に示した方法でＴｍ値を測定した。
　得られたＴｍ値を表５に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000041
　例１２
　［細胞培養］　
　後述の試験に用いるヒト癌由来細胞株は、以下の方法で維持した細胞株を用いた。　
　ヒト肺胞基底上皮腺癌由来細胞株（Ａ５４９細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ００７６）は、１０質量％のウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＰＡＮＣ－１細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ－ＲＣＢ２０９５）、ヒト前立腺癌由来細胞株（ＤＵ１４５細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ－ＲＣＢ２１４３）、ヒト前立腺癌由来細胞株（ＰＣ－３細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ－ＲＣＢ２１４５）、及びヒト卵巣癌由来細胞株（ＯＶＣＡＲ－３細胞株：理研セルバンクより購入、細胞番号：ＲＢＲＣ－ＲＣＢ２１３５）、ヒト慢性骨髄性白血病細胞株（Ｋ５６２細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ００１９）、ヒト膵臓癌由来細胞株（ＡｓＰＣ－１細胞株：ＡＴＣＣ細胞バンクより購入、細胞番号：ＣＲＬ－１６８２）は、１０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＲＰＭＩ１６４０：ＧＩＢＣＯ社製）を用い、ヒト腎癌由来細胞株（Ｃａｋｉ－１細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０８０１）は、１０質量％のウシ胎児血清、ＭＥＭ用非必須アミノ酸（ＮＥＡＡ）、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）、ヒト卵巣癌由来細胞株（ＭＣＡＳ細胞株：ＪＣＲＢ細胞バンクより購入、細胞番号：ＪＣＲＢ０２４０）は、２０質量％のウシ胎児血清、１００ユニット／ｍｌのペニシリン及び１００μｇのストレプトマイシンを添加した成長培地（ＭＥＭ：ＧＩＢＣＯ社）を用い、３７℃、５質量％ＣＯ２条件下にて維持した。
　例１３
　［定量ＲＴ－ＰＣＲ］
　後述の実験で行った定量ＲＴ－ＰＣＲは、特に断りのない限り、以下の方法で行った。Ｒｎｅａｓｙ　Ｍｉｎｉ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社）を用いて、培養細胞からトータルＲＮＡを抽出した。上記トータルＲＮＡを用いた定量ＲＴ－ＰＣＲはＱｕａｎｔ－Ｆａｓｔ　Ｐｒｏｂｅ　ＲＴ－ＰＣＲ　Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ社製）を使用し、推奨される条件で行った。プライマーはＡｐｐｌｉｅｄ　Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ社製　ＴａｑＭａｎ　Ｇｅｎｅ　Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ　Ａｓｓａｙｓ　Ｐｒｏｂｅを使用した。内因性コントロールプライマーには同社製β－Ａｃｔｉｎを用いた。上記定量ＲＴ－ＰＣＲの増幅は、ＲＯＴＯＲ－Ｇｅｎｅ　Ｑ　（ＱＩＡＧＥＮ社製）を用いて行った。ｍＲＮＡ発現量はＤｅｌｔａ　Ｄｅｌｔａ　ＣＴ法により算出した。
　例１４
［相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］　
　上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸を用意し、各種細胞株に３００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。
　相補鎖中央部に１量体、２量体、４量体のｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸のＯＶＣＡＲ－３細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果を図５に示す。その結果、５’末端に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－１－ｃＲＧＤより相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤの方が、増殖抑制活性が増強されることが明らかとなった。また、４量体のｃＲＧＤを中央部に結合させたＢＤＸ－２－ＴＥｃＲＧＤは、１量体のｃＲＧＤを中央部に結合させた２本鎖核酸よりも増殖抑制活性がさらに増強することが明らかとなった。
　相補鎖中央部に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤの様々な細胞株に対する増殖抑制活性作用の結果を、ＤＵ１４５細胞株は図６、ＰＡＮＣ－１細胞株は図７、ＰＣ－３細胞株は図８、Ｃａｋｉ－１細胞株は図９、ＭＣＡＳ細胞株は図１０に示す。図から分かる通り、いずれの細胞においても５’末端に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－１－ｃＲＧＤよりも、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－２－ｃＲＧＤの方が、増殖抑制活性が増強されることが明らかとなった。
　例１５
［相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
　上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ－ＰＣＲ法により以下の実験を行った。ＢＤＸ－４－ｃＲＧＤを１μＭとなるようにＰＡＮＣ－１細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図１１に示す。また、ＢＤＸ－５－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－５－ＤＥｃＲＧＤ、ＢＤＸ－５－ＴＥｃＲＧＤを１０μＭとなるようにＫ５６２細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図１２に示す。その結果、図１１より、５’末端に１量体のｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－１－ｃＲＧＤより相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－４－ｃＲＧＤの方が、ｍＲＮＡ発現抑制作用が増強されることが明らかとなった。また、図１２より、中央部に結合させたｃＲＧＤの数依存的に、ｍＲＮＡ発現抑制作用が増強されることが明らかとなった。
　例１６
［相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルの膵癌部位におけるＢＣＬ２遺伝子ノックダウン効果の検証］
　上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルの膵癌部位におけるＢＣＬ２遺伝子ノックダウン効果の検証をするため、以下の実験を行った。
　飼育環境下で数日間馴化したＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ／ｎｕマウス（６週令：雄、日本クレア株式会社より購入）に三種混合麻酔薬（ドミトール０．３ｍｇ／ｋｇ　＋　ドルミカム４ｍｇ／ｋｇ　＋　ベトルファール５ｍｇ／ｋｇ）をマウス体重１０ｇあたり８０μｌ、腹腔内投与して全身麻酔を施した後、１匹あたり１×１０６個のヒト癌細胞株（ＡｓＰＣ－１）を膵臓に注入し、膵臓同所移植モデルマウスを作製した。尚、移植翌日から毎日（午後）体重を測定し、人道的エンドポイントから急激な体重減少（数日間で２０％以上）、自力歩行不能かつ摂食・摂水不能な重篤状態に陥ったマウスには安楽死処置を施すこととした。癌細胞移植２１日後（ｄａｙ２１）、体重を指標に群分けを行い、Ｓａｌｉｎｅ及びＢＤＸ－１、ＢＤＸ－１－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－４－ｃＲＧＤを１０ｍｇ／ｋｇの用量で３日間連続で尾静脈より投与した。また、Ｓｈａｍ群にはＳａｌｉｎｅを投与した。最終投与から２４時間後、頸椎脱臼にて安楽死させた後、膵臓を摘出した。例１３に示した方法で膵癌部位におけるＢＣＬ２遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図１３に示す。図１３から分かる通り、ｃＲＧＤを結合させていないＢＤＸ－１よりも５’末端にｃＲＧＤを結合したＢＤＸ－１－ｃＲＧＤの方がｍＲＮＡの発現抑制効果が増強されることが明らかとなったが、相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させたＢＤＸ－４－ｃＲＧＤの方が、ｍＲＮＡ発現抑制作用がさらに増強されることが確認された。
　例１７
［相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおける薬効評価］
　上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおける薬効評価を検証をするため、以下の実験を行った。
　飼育環境下で数日間馴化したＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ／ｎｕマウス（６週令：雄、日本クレア株式会社より購入）に三種混合麻酔薬（ドミトール０．３ｍｇ／ｋｇ　＋　ドルミカム４ｍｇ／ｋｇ　＋　ベトルファール５ｍｇ／ｋｇ）をマウス体重１０ｇあたり８０μｌ、腹腔内投与して全身麻酔を施した後、１匹あたり１×１０６個のヒト癌細胞株（ＡｓＰＣ－１）を膵臓に注入し、膵臓同所移植モデルマウスを作製した。尚、移植翌日から毎日（午後）体重を測定し、人道的エンドポイントから急激な体重減少（数日間で２０％以上）、自力歩行不能かつ摂食・摂水不能な重篤状態に陥ったマウスには安楽死処置を施すこととした。癌細胞移植４日後（ｄａｙ４）、体重を指標に群分けを行い、Ｓａｌｉｎｅ及びＢＤＸ－４－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－６－ｃＲＧＤを３ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈より投与した。また、無処置マウス群にはＳａｌｉｎｅを投与した。投与期間及び回数は１日１回（ｄａｙ４，６，８，１２，１５，１８，２０，２２）の合計８回実施した。体重測定等で経過を観察し、癌細胞移植から２４日後、頸椎脱臼にて安楽死させた後、膵臓を摘出した。抗腫瘍効果を評価するため、摘出した膵臓重量を測定し、マウス体重で補正することで膵重量比を算出した。その結果を図１４に示す。図１４から分かる通り、ｃＲＧＤを相補鎖中央部に結合させたＢＤＸ－４－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－６－ｃＲＧＤは、膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおいて抗腫瘍効果を示した。
　例１８
［相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の肝毒性軽減効果］
　ｃＲＧＤを結合させることによって、核酸の癌部位への集積効果が高まることから、非特異的な肝臓への集積が減少し、肝毒性の発現が低減することを評価するため、以下の実験を行った。
　例１７の「相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた構造の２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおける薬効評価」における膵臓の摘出と同時に、肝臓及び腹部大静脈より静脈血を採取した。肝臓は重量を測定し、マウス体重で補正することで膵重量比を算出した。また、静脈血は肝機能マーカーであるＡＳＴ、ＡＬＴの測定を行うため、株式会社ＬＳＩメディエンス社に委託した。肝重量比の結果を図１５、ＡＳＴ値を図１６、ＡＬＴ値を図１７に示す。図１５から分かる通り、ｃＲＧＤを相補鎖中央部に結合させたＢＤＸ－４－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－６－ｃＲＧＤは、リガンドを結合させていないＢＤＸ－４、ＢＤＸ－６よりも肝重量が増加していないことが明らかとなった。また、図１６、図１７から分かる通り、ＡＳＴ値、ＡＬＴ値ともＲＧＤを相補鎖中央部に結合させたＢＤＸ－４－ｃＲＧＤ、ＢＤＸ－６－ｃＲＧＤの方がリガンドを結合させていないＢＤＸ－４、ＢＤＸ－６よりも値が低く肝機能障害が軽減されていることが明らかとなった。
　例１９
［相補鎖中央部にｃＲＧＤを結合させた２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおける生存期間延長効果］
　上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の膵癌細胞株膵臓同所移植マウスモデルにおける生存期間延長効果を検証をするため、以下の実験を行った。
　飼育環境下で数日間馴化したＢＡＬＢ／ｃＡ　Ｊｃｌ－ｎｕ／ｎｕマウス（６週令：雄、日本クレア株式会社より購入）に三種混合麻酔薬（ドミトール０．３ｍｇ／ｋｇ　＋　ドルミカム４ｍｇ／ｋｇ　＋　ベトルファール５ｍｇ／ｋｇ）をマウス体重１０ｇあたり８０μｌ、腹腔内投与して全身麻酔を施した後、１匹あたり１×１０６個のヒト癌細胞株（ＡｓＰＣ－１）を膵臓に注入し、膵臓同所移植モデルマウスを作製した。尚、移植翌日から毎日（午後）体重を測定し、人道的エンドポイントから急激な体重減少（数日間で２０％以上）、自力歩行不能かつ摂食・摂水不能な重篤状態に陥ったマウスには安楽死処置を施すこととした。癌細胞移植４日後（ｄａｙ４）、体重を指標に群分けを行い、Ｓａｌｉｎｅ及びＢＤＸ－４－ｃＲＧＤを１０ｍｇ／ｋｇの用量で尾静脈より投与した。また、無処置マウス群にはＳａｌｉｎｅを投与した。投与期間及び回数は１日１回（ｄａｙ４，８，１１，１５，１８，２２、２５、２９、３２、３５、３８、４２、４４）の合計１３回実施した。体重測定等で経過を観察し、癌細胞細胞移植から７０日後までの生存期間を比較した。その結果を図１８に示す。図１８から分かる通り、Ｓａｌｉｎｅ投与群よりもｃＲＧＤを相補鎖中央部に結合させたＢＤＸ－４－ｃＲＧＤ投与群の方が生存期間を延長していることが明らかとなった、
　例２０
［相補鎖の異なる一箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる一箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。各種核酸を用意し、ＰＡＮＣ－１細胞株及びＡｓＰＣ－１細胞株には３００ｎＭ、ＯＶＣＡＲ－３細胞株には１、３、１０μＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。その結果を、ＰＡＮＣ－１細胞株は図１９、ＡｓＰＣ－１細胞株は図２０、ＯＶＣＡＲ－３細胞株は図２１に示す。図１９、２０からわかる通り、細胞種によって活性に差が生じることが明らかとなった。また、図２１から分かる通り、ｃＲＧＤは相補鎖の５’末端（５’末端に位置する構成単位の５’位）または３’末端（３’末端に位置する構成単位の３’位）に結合させるよりも、相補鎖のそれ以外の位置に結合させることによって、活性が増強すること、さらに、５’－および３’－末端以外の位置の中でも、中央付近に結合させた場合に活性が増強することが明らかとなった。
　例２１
［相補鎖の異なる二箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる二箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。各種核酸を用意し、ＰＡＮＣ－１細胞株に３００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。その結果を図２２に示す。図２２からわかる通り、ｃＲＧＤを相補鎖の異なる二箇所に結合させることによって（ＢＤＸ－２９－ｃＲＧＤ）、細胞増殖抑制活性が増強することが明らかとなった。
　例２２
［相補鎖の異なる二箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる二箇所にｃＲＧＤを結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ－ＰＣＲ法により以下の実験を行った。各種核酸を用意し３００ｎＭとなるようにＰＡＮＣ－１細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図２３に示す。図２３からわかる通り、ｃＲＧＤを相補鎖の異なる二箇所に結合させることによって（ＢＤＸ－２９－ｃＲＧＤ）、ｍＲＮＡ発現抑制活性が増強することが明らかとなった。
　例２３
［相補鎖中央部に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
　上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸を用意し、ＯＶＣＡＲ－３細胞株に１、３、１０μＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。その結果を図２４、２５に示す。図から分かる通り、アンチセンス鎖の構造の異なるいずれの２本鎖核酸においても、葉酸を鎖中央部に結合させることによって細胞増殖抑制活性が増強することが明らかとなった。
　例２４
［相補鎖中央部に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
上記のヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ－ＰＣＲ法により以下の実験を行った。ＢＤＸ－１５－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅを１、３、１０μＭとなるようにＯＶＣＡＲ－３細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図２６に示す。図２６より分かる通り、相補鎖中央部に葉酸を結合させたＢＤＸ－１５－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅの用量依存的なｍＲＮＡ発現抑制作用が確認された。
　例２５
［相補鎖の異なる二箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる二箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸を用意し、Ａ５４９細胞株に３００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。その結果を図２７に示す。図２７から分かる通り、葉酸を相補鎖の異なる二箇所に結合させることによって（ＢＤＸ－２６－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ、ＢＤＸ－３０－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ、ＢＤＸ－３４－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ、ＢＤＸ－３５－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ）、細胞増殖抑制活性が増強することが明らかとなった。
　例２６
［相補鎖の異なる二箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる二箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ－ＰＣＲ法により以下の実験を行った。各種核酸を用意し３００ｎＭとなるようにＯＶＣＡＲ－３細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図２８に示す。図２８からわかる通り、葉酸を相補鎖の異なる二箇所に結合させることによって（ＢＤＸ－２９－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ）、ｍＲＮＡ発現抑制活性が増強することが明らかとなった。
　例２７
［相補鎖の異なる三箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる三箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸を用意し、ＯＶＣＡＲ－３細胞株に３００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。その結果を図２９に示す。図２９から分かる通り、葉酸を相補鎖の異なる三箇所に結合させることによって（ＢＤＸ－３７－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ）、細胞増殖抑制活性が増強することが明らかとなった。
　例２８
［相補鎖の異なる三箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる三箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ－ＰＣＲ法により以下の実験を行った。各種核酸を用意し３００ｎＭとなるようにＯＶＣＡＲ－３細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図３０に示す。図３０からわかる通り、葉酸を相補鎖の異なる三箇所に結合させることによって（ＢＤＸ－３７－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ）、ｍＲＮＡ発現抑制活性がさらに増強することが明らかとなった。
　例２９
［相補鎖の異なる四箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性試験］
　上記の相補鎖の異なる四箇所に葉酸を結合させたヒトＢＣＬ２遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおける細胞増殖抑制を調べるために、以下の実験を行った。２本鎖核酸を用意し、ＰＡＮＣ－１細胞株に３００ｎＭとなるよう添加した。２本鎖核酸添加後７２時間培養し、上述の例６に記載の細胞増殖アッセイ法により２本鎖核酸の細胞増殖抑制活性を測定した。その結果を図３１に示す。図３１から分かる通り、葉酸を相補鎖の異なる四箇所に結合させることによって（ＢＤＸ－４０－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ）、細胞増殖抑制活性がさらに増強することが明らかとなった。
　例３０
［相補鎖中央部に葉酸を結合させたヒトＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子を標的とする２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性試験］
　上記のヒトＢＣＲ－ＡＢＬ遺伝子を標的とする２本鎖核酸のインビトロにおけるｍＲＮＡ発現抑制活性を調べるために、上述の実施例４に記載の定量ＲＴ－ＰＣＲ法により以下の実験を行った。アンチセンス鎖の構造の異なる２本鎖核酸に対して、相補鎖の中央部にＰＥＧリンカーの長さの異なる葉酸を結合させた核酸を３００ｎＭとなるようにＫ５６２細胞株に対して添加し、２４時間後にｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図３２、３３に示す。図より分かる通り、アンチセンス鎖の構造の異なるいずれの２本鎖核酸においても、葉酸を相補鎖中央部に結合させることによって（図３２：ＢＤＸ－４２－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ、ＢＤＸ－４２－ＰＥＧ１１－Ｆｏｌａｔｅ、図３３：ＢＤＸ－４４－ＰＥＧ３－Ｆｏｌａｔｅ、ＢＤＸ－４４－ＰＥＧ１１－Ｆｏｌａｔｅ、ＢＤＸ－４４－ＰＥＧ２３－Ｆｏｌａｔｅ）、ｍＲＮＡ発現抑制活性が増強することが明らかとなった。また、この実験では、ＰＥＧの長さは短い方が活性が増強することも確認された。
例３１
［２本鎖核酸の合成］　
　ヒトＡＰＯＢ及びＭＡＬＡＴ－１遺伝子の配列に基づいて、該遺伝子を標的とするＤＮＡ－ＤＮＡを基本骨格とし、糖部位にリガンド結合部位を有する塩基を含む２本鎖核酸を設計した。各標的遺伝子に対する２本鎖核酸の具体例としては、ＡＰＯＢ遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（１３ｍｅｒ）を配列番号４５に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号４６、４７、４８に示す。また、ＭＡＬＡＴ－１遺伝子に対するアンチセンス鎖ヌクレオチドの配列（１６ｍｅｒ）を配列番号４９に、相補鎖ヌクレオチド配列を配列番号５０、５１、５２に示す。各々の遺伝子配列においてアンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖をアニーリングさせることで２本鎖核酸を形成する。ヒトＡＰＯＢ遺伝子を標的とした配列番号４５と４６から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４５、配列番号４５と４７から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４６－Ｔｏｃ（５’）、配列番号４５と４８から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４７、ヒトＭＡＬＡＴ－１遺伝子を標的とした配列番号４９と５０から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４８、配列番号４９と５１から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－４９－Ｔｏｃ（５’）、配列番号４９と５２から形成される２本鎖核酸をＢＤＸ－５０とする。尚、配列番号４７、５１の５’末端には、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000042
 で表示している５’－Ｏｃｔｙｌ－ｔｏｃｈｏｐｈｅｒｏｌ（Ｌｉｎｋ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ社製）を結合させた。これらの１本鎖核酸は株式会社ジーンデザイン社に合成を委託し、アンチセンス鎖とそれぞれの相補鎖のアニーリングによる２本鎖核酸の形成は社内で行った。配列表記として下線で示すヌクレオチドはＲＮＡ、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000043
 はＬＮＡ、Ｎ（ｍ）（例えばＵ（ｍ）のような）は２’－Ｏｍｅ修飾ヌクレオチド、Ｎ２は２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ａｄｅｎｏｃｉｎｅ、それら以外はＤＮＡを表す。また、ヌクレオチドの結合様式としてｐｓはチオリン酸結合、ｐｏはホスホジエステル結合を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000044
例３２
　［トコフェロールの付加］
　ＢＤＸ－４７相補鎖（配列番号４８）及びＢＤＸ－５０相補鎖（配列番号５２）へのトコフェロール付加は以下の通り行った。
（１）７０％　ＤＭＳＯ／１０％　ｔｅｒｔ－ＢｕＯＨ溶液中、ＢＤＸ－４７相補鎖（配列番号４８）及びＢＤＸ－５０相補鎖（配列番号５２）とトコフェロール－ＰＥＧ３－ａｚｉｄｏ（Ｔｏｃｏｐｈｅｒｏｌ－ＰＥＧ３－Ａｚｉｄｅ　Ｂａｓｅｃｌｉｃｋ社製　ＢＣＦＡ－０２８－１）を原料として、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＨＰＴＡ錯体の存在下、クリック反応を行った。７０％　ＤＭＳＯ／１０％　ｔｅｒｔ－ＢｕＯＨの有機溶媒を含む０．２　Ｍ　ＴＥＡＡｂｕｆｆｅｒ（ｐＨ　７．０）溶液中、トコフェロール－ＰＥＧ３－ａｚｉｄｏ　２．５等量、Ｃｕ（ＩＩ）／ＴＨＰＴＡ錯体　５等量、アスコルビン酸ナトリウム　５等量を加え室温で１６時間反応させた。
（２）クリック反応終了後、エタノール沈殿、ＨＰＬＣ精製を行い未反応のオリゴ並びにＣｕ（ＩＩ）／ＴＨＰＴＡ錯体、アスコルビン酸等を除去し、目的とするオリゴを単離した。
（３）ヒトＡＰＯＢ遺伝子を標的としたアンチセンス鎖（配列番号４５）と、トコフェロールで修飾したＢＤＸ－４７相補鎖をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＤＸ－４７－Ｔｏｃ（１０）とする。具体的には、キャリアー部分としての１３ｍｅｒのポリヌクレオチド（５’側から１０番目がリガンドとの結合のために化学修飾された２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ａｄｅｎｏｃｉｎｅである）の１０番目のリボヌクレオチド誘導体の２’位に、トコフェロールがリンカーを介して結合している。また、ヒトＭＡＬＡＴ－１遺伝子を標的としたアンチセンス鎖（配列番号４９）と、トコフェロールで修飾したＢＤＸ－５０相補鎖をアニーリングさせた２本鎖核酸をＢＤＸ－５０－Ｔｏｃ（７）とする。具体的には、キャリアー部分としての１６ｍｅｒのポリヌクレオチド（５’側から７番目がリガンドとの結合のために化学修飾された２’－Ｏ－Ｐｒｏｐａｒｇｙｌ　Ａｄｅｎｏｃｉｎｅである）の７番目のリボヌクレオチド誘導体の２’位に、トコフェロールがリンカーを介して結合している。
　以下、表７に例３１および３２で作製した２本鎖核酸をまとめる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000045
例３３
［Ｔｍ値（融解温度）測定］
　例４に示した方法でＴｍ値を測定した。
　得られたＴｍ値を表８に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000046
例３４
［相補鎖中央部にＴｏｃを結合させた２本鎖核酸のマウス肝臓におけるＡＰＯＢ及びＭＡＬＡＴ－１遺伝子ノックダウン効果の検証］
　上記のヒトＡＰＯＢ及びＭＡＬＡＴ－１遺伝子を標的とする２本鎖核酸のマウス肝臓におけるノックダウン効果を確認することを目的とする。
　数日間馴化したＩＣＲマウス（４～８週令：雄）の体重を指標に群分けを行った。Ｓａｌｉｎｅ及びＢＤＸ－４５、４６－Ｔｏｃ（５’）、４７－Ｔｏｃ（１０）、４８、４９－Ｔｏｃ（５’）、５０－Ｔｏｃ（７）を０．７５ｍｇ／ｋｇ（１００μｌ／１０ｇ）の用量で尾静脈より投与した。投与、２４（ｄａｙ１）、７２（ｄａｙ３）、１６８（ｄａｙ７）時間後、頸椎脱臼にて安楽死させた後、肝臓を摘出した。摘出した臓器からＴｏｔａｌ　ＲＮＡを抽出し、上述の例１３に記載の定量ＲＴ－ＰＣＲ法により２本鎖核酸のｍＲＮＡ発現抑制活性を定量した。
　肝臓におけるＡＰＯＢ遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図３４に、ＭＡＬＡＴ－１遺伝子のｍＲＮＡ発現量を定量した結果を図３５に示す。図から分かる通り、相補鎖中央部にＴｏｃを結合させたＢＤＸ－４７－Ｔｏｃ（１０）及びＢＤＸ－５０－Ｔｏｃ（７）は５’末端にＴｏｃを結合した２本鎖核酸よりも全てのポイントにおいてｍＲＮＡ発現抑制作用がさらに増強されることが確認された。

Claims (48)

  1. 　（ｉ）化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドを含む活性部分、および
    　（ｉｉ）化学修飾されていてもよいヌクレオチドと任意に核酸類似体とを構成単位として少なくとも含むポリヌクレオチドであって、少なくとも一部が上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して相補的なポリヌクレオチドを含む、キャリアー部分、
    を含む核酸複合体であって、
    　少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位と上記ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位とを除く部位において、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位に結合している、核酸複合体。
  2. 　二本鎖核酸複合体である、請求項１に記載の核酸複合体。
  3. 　上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの１つまたは複数の構成単位であって、当該ポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位ではなくかつ当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位ではない構成単位に結合している、請求項１または２に記載の核酸複合体。
  4. 　上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドが奇数個の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する１個の構成単位を含む連続ｎ個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合しており、当該ポリヌクレオチドが偶数の構成単位からなる場合には、当該ポリヌクレオチドの中央に位置する２個の構成単位を含む連続ｎ＋１個の構成単位の範囲内における１つまたは複数の構成単位に結合している（ここで、上記ｎは１～６の整数である）、請求項１～３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  5. 　上記少なくとも１つのリガンドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端から２～６番目の構成単位のうちの１つに結合しており、および／または３’末端から２～６番目の構成単位のうちの１つに結合している、請求項１～３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  6. 　上記少なくとも１つのリガンドが、タンパク質リガンド、ペプチドリガンド、アプタマーリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、請求項１～５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  7. 　上記少なくとも１つのリガンドが、ペプチドリガンド、糖鎖リガンド、脂質リガンド、低分子リガンドおよび生体分子／生体活性分子リガンドからなる群から選択される、請求項６に記載の核酸複合体。
  8. 　上記少なくとも１つのリガンドが、環状ペプチド、Ｎ－アセチルガラクトサミン、コレステロール、ビタミンＥ（トコフェロール）もしくはその類縁体、ステアリン酸、ドコサン酸、アニスアミド、葉酸もしくはその類縁体、アナンダミドまたはスペルミンである、請求項７に記載の核酸複合体。
  9. 　上記少なくとも１つのリガンドが、環状アルギニン－グリシン－アスパラギン酸（ＲＧＤ）配列含有ペプチド、トコフェロールまたは葉酸である、請求項８に記載の核酸複合体。
  10. 　上記少なくとも１つのリガンドが、リンカーを介して間接的に結合している、請求項１～９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  11. 　上記リンカーが、ポリアルキレングリコールリンカー、マレイミドリンカー、ビス（スルホスクシンイミジル）スベレートリンカー、ＤＮＡリンカー、ペプチドリンカー、シランリンカー、多糖リンカー、ジスルフィドリンカーまたはトリアゾールリンカーである、請求項１０に記載の核酸複合体。
  12. 　上記少なくとも１つのリガンドが、直接結合している、請求項１～９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  13. 　上記少なくとも１つのリガンドとして、２個以上のリガンドを含む、請求項１～１２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  14. 　互いに異なる構成単位に結合している２個以上のリガンドを含む、請求項１３に記載の核酸複合体。
  15. 　同一の構成単位に結合している２個以上のリガンドを含む、請求項１３または１４に記載の核酸複合体。
  16. 　上記少なくとも１つのリガンドとして、分岐リンカーを介して同一の構成単位に結合している２個以上のリガンドを含む、請求項１～１１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  17. 　上記（ｉｉ）キャリアー部分のポリヌクレオチドの５’末端に位置する構成単位の５’位、および／または当該ポリヌクレオチドの３’末端に位置する構成単位の３’位に結合しているリガンドをさらに含む、請求項１～１６に記載の核酸複合体。
  18. 　上記（ｉ）活性部分のポリヌクレオチドにおけるデオキシリボヌクレオチドの一部または全部が化学修飾されている、請求項１～１７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  19. 　上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが１つまたは複数の核酸類似体を含む、請求項１～１８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  20. 　上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドを含み、そして
    　当該ポリヌクレオチドが、
    （ａ）上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドの５’側に位置し、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む５’ウィング領域、および／または、
    （ｂ）上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドの３’側に位置し、１つまたは複数の化学修飾ヌクレオチドおよび／または核酸類似体を含む３’ウィング領域、
    を含む、
    請求項１～１７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  21. 　上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ａ）５’ウィング領域および（ｂ）３’ウィング領域を含み、該５’ウィング領域は少なくとも１つの核酸類似体を含み、該３’ウィング領域は少なくとも１つの核酸類似体を含む、請求項２０に記載の核酸複合体。
  22. 　上記５’ウィング領域が２～５個の核酸類似体を含み、上記３’ウィング領域が２～５個の核酸類似体を含む、請求項２１に記載の核酸複合体。
  23. 　上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチド、５’ウィング領域および３’ウィング領域からなる、請求項２０～２２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  24. 　上記少なくとも４つの連続した化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドが、ホスホロチオエート化されている、請求項２０～２３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  25. 　上記５’ウィング領域および３’ウィング領域が、核酸類似体として架橋化核酸を含む、請求項２０～２４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  26. 　上記架橋化核酸が、ＬＮＡ、ｃＥｔ－ＢＮＡ、アミドＢＮＡ及びｃＭＯＥ－ＢＮＡからなる群から選択される、請求項２５に記載の核酸複合体。
  27. 　上記架橋化核酸がホスホロチオエート化されている、請求項２５または２６に記載の核酸複合体。
  28. 　上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドに対して少なくとも１つのミスマッチを含む、請求項１～２７のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  29. 　上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが８～１００塩基である、請求項１～２８のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  30. 　上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さが、８～１００塩基である、請求項１～２９のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  31. 　上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドと同じ長さを有する、請求項１～３０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  32. 　上記（ｉ）活性部分におけるポリヌクレオチドの長さが、上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドの長さと異なる、請求項１～３０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  33. 　上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されていてもよいデオキシリボヌクレオチドおよび／または化学修飾されていてもよいリボヌクレオチドを含む、請求項１～３２のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  34. 　上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、化学修飾されたヌクレオチドを含む、請求項１～３３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  35. 　リガンドが結合している上記構成単位が、化学修飾されたヌクレオチドである、請求項１～３４のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  36. 　リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、リンカーとの結合のために化学修飾されたヌクレオチドである、請求項１０、１１および１３～３５のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  37. 　リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、請求項３６に記載の核酸複合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
     ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、Ｒ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部であり、ＬＫはリンカーであり、そしてＬＧはリガンドを表す］。
  38. 　リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、請求項３７に記載の核酸複合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000002
     ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
  39. 　リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、請求項３７に記載の核酸複合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
     または
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
     ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
  40. 　リンカーを介してリガンドが結合している上記構成単位が、上記リンカーおよびリガンドとともに以下の構造を形成している、請求項３７に記載の核酸複合体：
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
     ［式中、Ｒ１０は、Ｈまたは塩基であり、そしてＲ１１およびＲ１２はそれぞれ独立にポリヌクレオチドの残部を表す］。
  41. 　上記（ｉｉ）キャリアー部分におけるポリヌクレオチドが、リガンドが直接またはリンカーを介して結合している構成単位を除き、デオキシリボヌクレオチドおよび／またはリボヌクレオチドからなる、請求項３３～４０のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  42. 　哺乳動物において標的遺伝子の発現を減少させるための、請求項１～４１のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  43. 　活性部分におけるポリヌクレオチドが、標的遺伝子ｍＲＮＡのいずれかの領域に相補的なアンチセンス鎖である、請求項４２に記載の核酸複合体。
  44. 　哺乳動物において、標的遺伝子の発現が亢進している細胞の増殖を抑制するための、請求項１～４３のいずれか１つに記載の核酸複合体。
  45. 　上記標的遺伝子ががん遺伝子であり、上記細胞が癌細胞である、請求項４４に記載の核酸複合体。
  46. 　請求項１～４５のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、医薬組成物。
  47. 　癌を治療および／または予防するための、請求項４６に記載の医薬組成物。
  48. 　請求項１～４４のいずれか１つに記載の核酸複合体と、任意に薬理学的に許容可能な担体とを含む、肝疾患を治療および／または予防するための医薬組成物。
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