WO2017047097A1 - 構造強化されたｍｉＲＮＡ阻害剤Ｓ－ＴｕＤ - Google Patents

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英夫 伊庭
健 原口
浩一 南海
佐藤　秀昭
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Definitions

  • the present invention relates to a miRNA inhibitor with enhanced structure.
  • the present invention provides the following. (1) a miRNA inhibition complex comprising RNA or an analog thereof, wherein the miRNA inhibition complex comprises at least one double-stranded structure and a miRNA binding sequence, wherein the two strands of the miRNA binding sequence are A miRNA-inhibiting complex, wherein the miRNA-inhibiting complex comprises at least one cross-linked nucleic acid (BNA), one bound to at least one strand of at least one end of a double-stranded structure. (2) The BNA contains at least one atom selected from the group consisting of oxygen and carbon on the 2 ′ position, and at least one atom selected from the group consisting of carbon, carbon and nitrogen on the 4 ′ position. 2. A complex according to item 1, comprising BNA cross-linked via. (3) The BNA is
  • R 1 , R 1 ′, R 2 , R 2 ′, and R 3 each independently represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, substituted or non-substituted, Substituted cycloalkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or unsubstituted aralkyl group, substituted or unsubstituted acyl group, substituted or unsubstituted sulfonyl group, substituted or unsubstituted silyl group, and functional molecule
  • Base is from an adenylyl group, a thyminyl group, a urasilyl group, an inosinyl group, a cytosynyl group, a guan
  • R 3 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl group, a sulfonyl group, a silyl group, and a functional molecular unit substituent.
  • Base represents a group selected from the group consisting of an adenylyl group, a thyminyl group, a urasilyl group, an inosinyl group, a cytosynyl group, a guaninyl group, and a methylcytosynyl group, and a methylcytosynyl group, and m is an integer of 0 to 2, 4.
  • the complex according to any one of items 1 to 3, comprising a 2 ′, 4′-substituted cross-linked nucleic acid represented by the following formula: n is an integer of 1 to 3. (5)
  • the complex according to any one of items 1 to 4 comprising 2 ′, 4 ′ methano-bridged nucleic acid (LNA).
  • LNA methano-bridged nucleic acid
  • (6) The complex according to any one of items 1 to 5, wherein the BNA is BNA NC (NMe).
  • NMe BNA NC
  • (7) The complex according to any one of items 1 to 6, wherein the BNA is contained in at least one strand of the double-stranded structure moiety and at least one strand of a complementary strand of the miRNA binding sequence.
  • (9) The complex according to any one of items 1 to 8, wherein the BNA is contained in both chains of the double-stranded structure moiety.
  • (13) The complex includes two or more of the double-stranded structures, and each of the two strands at one end of the first double-stranded structure of the double-stranded structure includes one strand containing a miRNA binding sequence. Two strands of a second double-stranded structure of each of the two or more double-stranded structures so that each other end of the chain is bound and sandwiched between the two or more double-stranded structures 13.
  • the complex according to any one of items 1 to 17, wherein the double-stranded structure has a length of at least 10 bases.
  • a complex comprising the structure shown in 1. wherein I and II of the structure are double-stranded structures, each comprising a miRNA binding sequence in a and b of the structure.
  • 24A The complex according to any one of Items 1 to 24, wherein the double-stranded structure is in the form of a single-stranded nucleic acid in which the ends of each strand are bonded to each other.
  • 24B The complex according to any one of items 1 to 24 or 24A, which is composed of linear single-stranded RNA or an analog thereof.
  • the two strands containing the miRNA binding sequence are bound to two strands at one end of the double-stranded structure one by one through a linker of 1 to 5 bases each.
  • Two strands comprising the miRNA binding sequence comprising a second multiple strand structure selected from double strands or quadruplexes and sandwiched between the double strand structure and the second multiple strand structure Any one of 1 to 24, 24A, or 24B, wherein the other end of each is bonded to two strands at one end of the second multi-stranded structure via a linker of 1 to 5 bases, respectively.
  • a miRNA-inhibiting complex wherein the two strands containing the miRNA binding sequence are each one containing a miRNA binding sequence and two strands containing a miRNA binding sequence (24D)
  • the complex according to any one of items 1 to 24, 24A, 24B or 24C, wherein the two strands comprising each comprises a miRNA binding sequence and there are two strands comprising a miRNA binding sequence.
  • RNA constituting the complex according to any one of items 1 to 24, 24A, 24B, 24C or 24D or an analog thereof.
  • a method for producing the complex according to any one of items 1 to 24, 24A, 24B, 24C, or 24D, or the RNA according to item 25 or an analog thereof A) A step of synthesizing a single-stranded protector of a target RNA or its analog and a protector of its complement using ribonucleic acid and BNA by chemical synthesis; B) a step of deprotecting each of the produced single-stranded protector and its complement; and, if necessary, C) two of the deprotected single strands arranged in double-strand formation conditions.
  • a method comprising the step of forming a chain.
  • a medicament comprising the complex according to any one of items 1 to 24, 24A, 24B, 24C or 24D.
  • (27A) The complex according to any one of items 1 to 24, 24A, 24B, 24C or 24D for use as a medicament.
  • (27B) A method for the treatment or prevention of a disease or disorder, comprising the step of administering a complex according to any one of items 1 to 24, 24A, 24B, 24C or 24D to a subject in need thereof.
  • the improved S-TuD of the present invention has been found to have a miRNA inhibitory activity that is more stable than the conventional S-TuD and is not unexpectedly purified and has reduced impurities in pharmaceutical grade. It was. By strengthening the double strands, the cost can be reduced as STEM region shortened S-TuD having the same activity.
  • the improved S-TuD of the present invention also has a significantly improved biological activity compared to the conventional S-TuD.
  • FIG. 1A shows a schematic diagram of a conventional S-TuD and a partially substituted S-TuD of the present invention.
  • FIG. 1B shows a comparison of S, AS, and double strands analyzed by reverse phase HPLC (RP-HPLC) analysis of conventional S-TuD (C18 reverse phase ion pair HPLC, XBridge column).
  • FIG. 2A shows the structure of the oligonucleotide used. The top row shows the original oligonucleotide, and the second and subsequent rows are modified oligonucleotides.
  • FIG. 2B shows the structure of the oligonucleotide used.
  • FIG. 3 shows the structure of psiCHECK2-UT (top) and psiCHECK2-miRT (bottom).
  • FIG. 4-1 shows the structure of the oligo used.
  • FIG. 4-2 shows the results of the miR-199a-3p reporter assay of the oligo of FIG. 4-1. Bars indicate the ratio of control reporter activity to miR-199a-3p reporter inhibitor activity. The higher the inhibitory effect of S-TuD, the higher the bar.
  • FIG. 5 shows the concentration dependency of various modified S-TuD199a-3p. As the cell, HeLaS3-miR199a was used.
  • FIG. 6 shows the structure of S-TuD (S-TuD199a-3p) used in the substitution experiment for the MBS region. The upper row shows the structure of the original S-TuD199a-3p-1_18-pf.
  • the modified S-TuD of the present invention is (16) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2, (22) S-TuD-miR-199a-3p-1_18- pf-L18B6-2-MBSB1 (complement of the seed region into BNA NC (NMe)), (23) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2 (complement of the non-seed region) The sequence is BNA NC (NMe)), (24) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-3-MBSB2 (the complementary sequence of the non-seed region is BNA NC (NMe)).
  • FIG. 7 shows the structure of S-TuD used in the substitution experiment to the MBS region.
  • S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1 complementary sequence of the seed region is converted to BNA NC (NMe)
  • S-TuD199a-3p-1_18-pf -S10-BT6-MBSB2 complementary sequence of non-seed region is converted to BNA NC (NMe)
  • (23) - (2 ) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2 the complementary sequence of the non-seed region BNA NC (NMe)
  • FIG. 8-1 and FIG. 8-2 show the results of replacement of part of the MBS region with BNA NC (NMe). As shown in FIGS. 8-1 and 8-2, a structure in which the inhibitory activity was improved 3 times or more compared to the original S-TuD could be obtained. It was important to insert a portion of BNA NC (NMe) into the non-seed region of the MBS region.
  • FIG. 8-1 and FIG. 8-2 show the results of replacement of part of the MBS region with BNA NC (NMe). As shown in FIGS. 8-1 and 8-2, a structure in which the inhibitory activity was improved 3 times or more compared to the original S-TuD could be obtained.
  • the result of having performed the concentration dependence test is shown.
  • the diamond indicates S 2 -TuD NC2 (SEQ ID NOs: 57 and 58), the square indicates the original, and the triangle indicates (18).
  • FIG. 10 shows the structure of S-TuD used in the experiment for confirming the effect of inserting the BNA NC (NMe) into the STEM region shortening + MBS region.
  • the upper part shows the original structure of S-TuD199a-3p.
  • FIG. 11-1 shows the results at 100 pM.
  • the effect of BNA NC (NMe) modification on the short type was examined.
  • the original and long type Stem-BNA NC (NMe) modifications (16) were added to the comparison.
  • Short type-BNA NC (NMe) unmodified (1) ′ the effect of (6) ′ with BNA NC (NMe) modification in the stem portion was greatly enhanced.
  • addition of BNA NC (NMe) modification to the Seed equivalent site (17) did not enhance the effect.
  • FIG. 11-1 and FIG. 11-2 show the results (3 ⁇ T199a-3p / UT (%)) at individual S-TuD 100 pM and 300 pM.
  • FIG. 11-2 shows the results at 300 pM.
  • the effect of BNA NC (NMe) modification on the short type was examined. The original and long type Stem-BNA NC (NMe) modifications (16) were added to the comparison.
  • FIG. 12 shows the structure of the modified S-TuD used in the stability experiment in serum. The top is the original structure.
  • FIG. 13 shows the structure of modified S-TuD used in serum stability experiments. From above, (1) 'S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10, (6)' S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6, (17) S-TuD199a-3p-1_18-pf- S10-BT6-MBSB1 (complementary sequence of seed region is converted to BNA NC (NMe)) and (18) S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2 (complementary sequence of non-seed region is converted to BNA NC (NMe) )).
  • FIG. 14 shows an electropherogram after treatment with mouse serum.
  • FIG. 15 shows an electropherogram. (1) 'S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10, (6)' S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6 from the upper left, (17) S-TuD199a-3p from the lower left -1_18-pf-S10-BT6-MBSB1 (complementary sequence of seed region converted to BNA NC (NMe)) and (18) S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2 (complementary sequence of non-seed region) Is converted to BNA NC (NMe).
  • FIG. 16 shows a schematic diagram of the luciferase reporter vector used in the examples.
  • FIG. 16 shows a schematic diagram of the luciferase reporter vector used in the examples.
  • FIG. 17 shows the psiCHECK2-T200c-3p-s, psiCHECK2-T200c-3p-a, psiCHECK2-T199a-3px3-s, psiCHECK2-T199a-3px3-a, psiCHECK2-T21-5p-s used in the luciferase reporter vector. , Shows the sequence information of psiCHECK2-T21-5p-a. These sequences (SEQ ID NOs: 75 to 80) are all unmodified DNA.
  • FIG. 18 shows the arrangement of S-TuD-NC2 used in the examples.
  • FIG. 19 shows the S-TuD structure of miR-200c used in the universality confirmation experiment.
  • FIG. 20 shows an electropherogram after treatment with mouse serum. 0h, 24h, 48h and 72h indicate the time of treatment in mouse serum at 37 ° C. From left, (41) S-TuD-200c-1_22-pf, (42) S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6, (44) S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2, (45 ) S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2, (46) S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6, and the numbers indicate time.
  • FIG. 21-1 shows the 3 pM results. Bars indicate the ratio of control reporter activity to miR-199a-3p reporter inhibitor activity. The higher the inhibitory effect of S-TuD, the higher the bar.
  • FIG. 21-1 and FIG. 21-2 show the results of performing a reporter assay similar to miR199a-3p with miR-200c.
  • FIG. 21-2 shows the result of 10 pM. Bars indicate the ratio of control reporter activity to miR-199a-3p reporter inhibitor activity. The higher the inhibitory effect of S-TuD, the higher the bar.
  • FIG. 22 shows the results showing the concentration dependency of the same reporter assay with miR-200c.
  • the diamond indicates S-TuD NC2, the square indicates the original, and the triangle indicates (45).
  • Stem is BNA NC (NMe)
  • the complementary sequence of the non-seed region of the MBS is further modified with BNA NC (NMe) (45) is modified with BNA NC (NMe)
  • BNA NC NMe
  • the effect was almost twice as high as that of original (41).
  • S-TuD could be adsorbed non-specifically on the tube, and S-TuD NC2 was added as a carrier, and 30 pM was also analyzed, but the effect of addition was not observed.
  • FIG. 23 shows the S-TuD structure of miR-21 used in the universality confirmation experiment.
  • FIG. 24 shows an electropherogram after treatment with mouse serum. 0h, 24h, 48h and 72h indicate the time of treatment in mouse serum at 37 ° C.
  • FIGS. 25-1 and 25-2 show the results of a similar reporter assay performed with miR-21.
  • FIG. 25-1 shows the result of 100 pM. Bars indicate the ratio of control reporter activity to miR-199a-3p reporter inhibitor activity. The higher the inhibitory effect of S-TuD, the higher the bar.
  • FIGS. 25-1 and 25-2 show the results of a similar reporter assay performed with miR-21.
  • FIG. 25-1 shows the result of 100 pM. Bars indicate the ratio of control reporter activity to miR-199a-3p reporter inhibitor activity. The higher the inhibitory effect of S-TuD, the higher the bar.
  • FIG. 25-1 and 25-2 show the results of a similar reporter assay performed with miR-21.
  • FIG. 25-2 shows the results at 300 pM. Bars indicate the ratio of control reporter activity to miR-199a-3p reporter inhibitor activity. The higher the inhibitory effect of S-TuD, the higher the bar.
  • FIG. 26 shows the results showing the concentration dependency of the same reporter assay with miR-21. Compared with Original No. 51 (square), No. 53 (triangle) in which the stem portion and MBS portion were modified with BNA NC (NMe) had an effect increased nearly 10 times. Even in the short type, the 55 (x) modified MBS part was more than 3 times more effective than the original 51, but about 2/3 times the long type 53. Diamonds indicate controls.
  • FIG. 51 square
  • No. 53 triangle
  • the stem portion and MBS portion were modified with BNA NC (NMe) had an effect increased nearly 10 times. Even in the short type, the 55 (x) modified MBS part was more than 3 times more effective than the original 51, but
  • FIG. 27 shows the structure of S-TuD used in in vivo experiments. From above, (51) S-TuD-21-1_17-10mut, (53) S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1 and (55) S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6- Indicates MBSB1.
  • FIG. 29 shows the mean value of miR-21 in the kidneys of three mice. The least amount of miR-21 is 53, followed by 55. The original S-TuD shows almost no reduction in miR-21, but a decrease is detected even at 53 and 55, although the degree is slightly reduced.
  • FIG. 30 shows a typical structure of the miRNA-inhibiting complex of the present invention, where two RNA strands containing MBS are sandwiched between two double stranded structures. The form in which each chain is bound is shown.
  • FIG. 31 also shows a typical structure of the miRNA inhibition complex of the present invention, where # 12 to # 16 are shown as typical examples.
  • FIG. 32 shows an exemplary arrangement used in Example 7.
  • the sequence used was the original, (5) S-Tud199a-3p-1_18-pf-U4BNA_SI-8; (1) 'S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10; (2)' S-TuD199a -3p-1_18-pf-S10-BT8; (6) 'S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6; (7)' S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-LT6; (8) 'Shows S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT12.
  • FIGS. 33-1 and 33-2 show the assay results of Example 7.
  • FIG. The 8 samples in FIG. 33-1 show the results at 100 pM. The left end of each is a control, and the 2nd to 8th from the left show the results of each sample.
  • FIGS. 33-1 and 33-2 show the assay results of Example 7.
  • FIG. The 8 samples in FIG. 33-2 show the results at 300 pM. The left end of each is a control, and the 2nd to 8th from the left show the results of each sample.
  • FIG. 34 shows an example of arrangement used in Example 8.
  • FIG. 35-1 and 35-2 show the assay results of Example 8.
  • FIG. The 8 samples in FIG. 35-2 show the results at 3 nM.
  • the left end of each is a control, and the 2nd to 8th from the left show the results of each sample.
  • FIG. 36 shows an example of arrangement used in Example 9.
  • FIGS. 37-1 and 37-2 show the assay results of Example 9.
  • FIG. The 8 samples in FIG. 37-1 show the results at 100 pM. The left end of each is a control, and the 2nd to 8th from the left show the results of each sample.
  • FIGS. 37-1 and 37-2 show the assay results of Example 9.
  • FIG. The 8 samples in Fig. 37-2 show the results at 300 pM. The left end of each is a control, and the 2nd to 8th from the left show the results of each sample.
  • FIG. 38 shows the results (HPLC purity analysis) of changing the partial base of the STEM region to a nucleotide species (BNA NC (NMe)) of a type that increases the ability to form double strands and performing physical property evaluation.
  • the upper row is the original one, and the lower row shows the result obtained in (1) ′ of the present invention.
  • FIG. 39-1 and 39-2 show the ability to form double strands when only the 2′-O-methyl body is the same as the original S-TuD when the STEM I region is cut to 10 bp.
  • FIG. 39-1 shows the results of (1) and (2) ′′ from above.
  • FIGS. 39-1 and 39-2 show the ability to form double strands when only the 2′-O-methyl body is the same as the original S-TuD when the STEM I region is cut to 10 bp.
  • FIG. 39-2 shows the results of (1) ′′ and (3) ′′ from above.
  • FIG. 40 is a continuation of FIG. 39-1 and FIG. 39-2, and shows the results of (4) ′′ and (5) ′′ from above.
  • the present invention relates to an improved form of a miRNA inhibition complex capable of efficiently and specifically inhibiting miRNA.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention comprises at least one double-stranded structure and an miRNA binding sequence (MBS), and the two strands of the miRNA binding sequence are at least two strands of the double-stranded structure (usually , One each), in addition, the miRNA-inhibiting complex is characterized in that it comprises at least one cross-linked nucleic acid (BNA).
  • BNA cross-linked nucleic acid
  • the inhibitory complex of the present invention may be referred to as “S-TuD”.
  • this double-stranded structure may be referred to as a “first” double-stranded structure so that it can be distinguished from a further double-stranded structure that can be included in the complex of the present invention.
  • the complex of the present invention may or may not be single-stranded (ie, a single molecule linked by a covalent bond). Good.
  • a complex composed of double-stranded RNA in which RNA strands containing MBS are bound to two strands at one end of a double-stranded structure, respectively, contains at least one cross-linked nucleic acid (BNA, for example, , BNA NC (NMe)) are included in the present invention.
  • one RNA strand containing at least one MBS may be bound to two strands at one end of a double-stranded structure.
  • the two strands at one end of the double-stranded structure are connected by the RNA strand containing MBS.
  • the RNA connecting two strands of a double-stranded structure contains at least one MBS, but may contain, for example, two, three, or more.
  • Double-stranded structures include stem loops or hairpins. That is, the double-stranded structure may be a double-stranded structure contained in a stem loop or hairpin.
  • the “seed region” refers to a region of about 2-8 bases from the 5 ′ end necessary for miRNA activity in the miRNA sequence, and the “stem region” refers to a double-stranded region.
  • Point to. “Original” refers to the conventional “All 2′-OMe RNA type”, that is, a type composed entirely of 2′-OMe RNA, and is exemplified in Patent Document 1 and the like .
  • the miRNA-inhibiting complex may be a structure having at least one RNA or an analog thereof having a double-stranded structure.
  • the complex preferably comprises one or two molecules comprising RNA or an analog thereof.
  • MBS miRNA binding sequence
  • MBS refers to a sequence that binds to miRNA.
  • the MBS contains at least a portion complementary to the miRNA so that it can bind to the miRNA.
  • MBS may or may not be a completely complementary sequence to miRNA.
  • MBS may be a sequence of natural RNA targeted by miRNA.
  • MBS is, for example, at least 10 bases for miRNA, such as 11 bases or more, 12 bases or more, 13 bases or more, 14 bases or more, 15 bases or more, 16 bases or more, 17 bases or more, 18 bases or more, 19 bases or more, Complementary bases of 20 bases or more, 21 bases or more, 22 bases or more, 23 bases or more, or 24 bases or more are included consecutively or discontinuously.
  • the complementary bases are continuous or have a gap of 3 or less, 2 or less, preferably 1 site.
  • the gap may be MBS-side and / or miRNA-side unpairing (bulge), or one gap may have bulge bases on only one strand, and both strands are unpaired. It may have a paired base.
  • the number of bulge and mismatch bases is, for example, 6 bases or less, preferably 5 bases or less, 4 bases or less, 3 bases or less, 2 bases or less, or 1 base per strand, per bulge or mismatch, respectively.
  • MBS capable of forming a bulge showed a higher miRNA inhibitory effect than MBS consisting of a completely complementary sequence (Patent Document 1). Therefore, in order to obtain a higher miRNA inhibitory effect, it is preferable to design MBS so as to form a bulge.
  • the 10th and / or 11th base from the 3 'end of MBS is not complementary to miRNA, or contains an extra base between 10th and 11th (or in miRNA
  • the 10th and / or 11th base from the 5 'end of the target sequence is not a complementary base to MBS, or is unpaired between the 10th and 11th nucleotides MBS containing a combined base is less susceptible to degradation and can be expected to have high activity.
  • the MBS may be designed so that bases including the 10th and 11th positions from the 5 ′ end of miRNA are unpaired, for example, 9th to 11th, 10th to 12th, or 9th to 12th
  • the MBS may be designed so that is unpaired. There is no unpaired base on the miRNA side, but on the MBS side, between the 10th and 11th positions from the 3 ′ end (or 5 ′ of the target sequence in miRNA (sequence that hybridizes with MBS)). An unpaired base may be present between the 10th and 11th sites from the end).
  • the unpaired base may be present on the miRNA side and / or MBS side, but is preferably present at least on the MBS side.
  • the number of unpaired nucleotides in each strand can be adjusted as appropriate, and is, for example, 1 to 6 nucleotides, preferably 1 to 5 nucleotides, more preferably 3 to 5, for example 3, 4 or 5 It is a nucleotide.
  • the miRNA-inhibiting RNA of the present invention has been shown to be able to effectively inhibit miRNA even if it has MBS that only matches the seed region and has only a low complementarity to other regions.
  • Patent Document 1 those in which the seed region of miRNA (bases 2 to 7 and / or 3 to 8 from the 5 ′ end of miRNA) are completely complementary are preferable.
  • G: U pairs (U: G pairs) may also be considered complementary, but preferably only G: C (C: G) and A: U (U: A) are considered complementary.
  • the MBS includes a miRNA seed region (2-7th and / or 3-8th base from the 5 ′ end of the miRNA) that is completely complementary and at least 8 bases relative to the miRNA. More preferably, those containing 9 bases, more preferably 10 bases of complementary bases in succession are preferred. Furthermore, the MBS in the present invention preferably contains a total of 11 bases or more, more preferably 12 bases or more, and more preferably 13 bases or more complementary bases for miRNA.
  • MBS is preferably a sequence that hybridizes with a miRNA sequence under physiological conditions.
  • Physiological conditions are, for example, 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0, 37 ° C. More preferably, the MBS is a sequence that hybridizes with the miRNA sequence under stringent conditions.
  • the stringent conditions are, for example, 1 ⁇ SSC (1 ⁇ SSC is 150 mM NaCl, 15 mM sodium citrate, pH 7.0) or 0.5 ⁇ SSC, 42 ° C., more preferably 1 ⁇ SSC or 0.5 ⁇ .
  • the conditions are SSC and 45 ° C., more preferably 1 ⁇ SSC or 0.5 ⁇ SSC and 50 ° C.
  • Hybridization for example, either RNA containing miRNA sequence or RNA containing MBS is labeled, the other is immobilized on a membrane, and both are hybridized.
  • Hybridization conditions include, for example, 5 ⁇ SSC, 7% (W / V) SDS, 100 ⁇ g / ml denatured salmon sperm DNA, 5 ⁇ Denhardt's solution (1 ⁇ Denhardt solution is 0.2% polyvinylpyrrolidone, 0.2% bovine serum albumin, and 0.2% Ficoll) For example, at 37 ° C., 45 ° C., or 50 ° C.
  • the nucleic acid After incubating for a sufficient period of time (eg, 3, 4, 5 or 6 hours or more), washing is performed under the above conditions, and by detecting whether the labeled nucleic acid is hybridized, the nucleic acid is hybridized under the condition. Or not.
  • a sufficient period of time eg, 3, 4, 5 or 6 hours or more
  • MBS preferably exhibits high homology with the complementary sequence of the miRNA sequence.
  • High homology means, for example, 70% or more, 75% or more, 76% or more, 77% or more, 78% or more, 79% or more, 80% or more, 81% or more, 82% or more, 83% or more, 84% or more, 85% or higher, 86% or higher, 87% or higher, 88% or higher, 89% or higher, 90% or higher, 93% or higher, 95% or higher, 96% or higher, 97% or higher, 98% or higher, or 99% or higher It is a base sequence having sex. The identity of the base sequence can be determined using, for example, the BLAST program (Altschul, S.F. et al., J.
  • MBS preferably consists of a sequence in which one or several bases are inserted, substituted, and / or deleted from the complementary sequence of the miRNA sequence.
  • MBS is within 8 bases, within 7 bases, within 6 bases, within 5 bases, within 4 bases, within 3 bases, within 2 bases, or insertion, substitution of 1 base with respect to the complementary sequence of miRNA sequence, And / or consisting of sequences with deletions.
  • the MBS has an insertion of within 8 bases, within 7 bases, within 6 bases, within 5 bases, within 4 bases, within 3 bases, within 2 bases, or 1 base relative to the complementary sequence of the miRNA sequence. Consists of an array.
  • MBS has a higher miRNA inhibitory activity in a sequence having a mismatch than in a sequence completely complementary to the miRNA sequence. This is considered to be due to the fact that MBS is completely complementary and is cleaved by RISC containing miRNA, thereby reducing the expression level of miRNA-inhibiting RNA.
  • MBS hybridizes with miRNA
  • the 10th and / or 11th bases from the 3 ′ end of MBS are unpaired (or the 5 ′ end of the target sequence on the miRNA side that hybridizes with MBS)
  • Such unpairing may be, for example, the bulge on the MBS side, and the base that forms the bulge is 1 to 6 bases, preferably 1 to 5 bases, more preferably 3 to 5 bases (eg 3, 4 or 5).
  • Base may consist of RNA, or may contain or consist of nucleic acid salts.
  • an increase in miRNA inhibitory effect can be expected by forming a nucleic acid salt at a site where MBS is cleaved (such as the 10th and / or 11th base from the 3 'end of MBS) so that cleavage does not occur.
  • a nucleic acid having a backbone or sugar such as phosphothioate or 2 "-O-methyl (Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al. ., 2006, Nucleic Acids Res. 34: 2294-2304).
  • the miRNA targeted by the miRNA inhibition complex of the present invention is not particularly limited. As long as it has an miRNA structure, it can be applied to any species such as plants, nematodes, vertebrates and the like.
  • the number of miRNA sequences is very well known in many organisms, including humans, mice, chickens, zebrafish, and Arabidopsis (see the miRBase :: Sequences web page: microrna.sanger.ac.uk / sequences /).
  • mammals such as mice, rats, goats, primates including monkeys, and human miRNAs can be targeted.
  • miR21 (Lagos-Quintana M et al., Science.
  • miR16 (Lagos-Quintana M et al., Science. 294: 853-858, 2001; Mourelatos Z et al., Genes Dev. 16: 720-728, 2002; Lim LP et al., Science. 299 : 1540, 2003; Calin GA et al., Proc Natl Acad Sci US A. 99: 15524-15529, 2002; Michael MZ et al., Mol Cancer Res. 1: 882-891, 2003), miR497 (Bentwich I et al., Nat Genet. 37: 766-770 , 2005; Landgraf P et al., Cell. 129: 1401-1414, 2007), etc., but is not limited thereto.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention further comprises a second double-stranded structure in addition to the first double-stranded structure, and the two strands at one end of the first double-stranded structure ,
  • Each of the RNA strands containing MBS is bonded to each other, and the other end of each RNA strand is sandwiched between the first double-stranded structure and the second double-stranded structure.
  • the double stranded structure may be double stranded, or may be four stranded like G-quadruplex.
  • the present invention further includes a second double-stranded structure in addition to the first double-stranded structure, and the two strands at the ends to which MBS is bound in the first double-stranded structure have MBS.
  • Each of the contained RNA strands is bonded to each other, and the other end of each RNA strand is inserted between the first double-stranded structure and the second double-stranded structure,
  • the present invention relates to a miRNA-inhibiting complex that binds to each of the two strands of the second double-stranded structure.
  • the RNA complex has, for example, at least two double-stranded structures, and each of the four RNA strands constituting the two double-stranded structures contains MBS without interposing any remaining three strands. It has a structure that binds to RNA.
  • the miRNA-inhibiting complex can be explained more simply by binding to each strand of the two double-stranded structures so that the two RNA strands containing MBS are sandwiched between the two double-stranded structures.
  • MiRNA inhibition complex (FIG. 30). That is, in the RNA complex having the structure of FIG.
  • RNA strands a and b are sandwiched between double-stranded structures I and II, and RNA containing one or more MBS in each of a and b Included in the invention. Since the two RNA strands containing MBS are bound to the respective strands of the double-stranded structure, the directions of the RNA strands are opposite to each other (Fig. 31, # 12 to # 16). . Thus, by adding MBS to each double-stranded chain, it is possible to exhibit higher miRNA inhibitory activity.
  • Two RNA strands including MBS present so as to be sandwiched between two double-stranded structures each contain one or more MBS. These MBSs may be the same sequence or different. Moreover, the same miRNA may be targeted and the sequence couple
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention may contain a total of two MBS, and the two MBS may be the same sequence or a sequence that binds to the same miRNA.
  • Each pair of duplexes included in the miRNA-inhibiting complex of the present invention is usually a separate RNA molecule as described above, but one or both ends of the duplex are connected to each other. It may be a chain or a ring.
  • the term “linear” is a term for a ring and only means that it has a terminal, and naturally does not mean that a secondary structure is not formed.
  • the miRNA inhibition complex composed of linear single-stranded RNA can be prepared, for example, by a single RNA synthesis. For example, when two double-stranded structures are included, two chains at one end of the second double-stranded structure (the side to which MBS is not bonded) can be connected by a loop to form a single strand as a whole. .
  • One or more MBS may be included in the sequence connecting the double strands (for example, FIG. 31, # 13, # 14, # 16).
  • the duplexes can be joined by short loops.
  • the double strand can be combined with a sequence of 1 to 10 bases, preferably 1 to 8 bases, 2 to 6 bases, 3 to 5 bases, for example 4 bases.
  • the arrangement is not particularly limited.
  • the present invention relates to RNA having the structure of FIG. 31 # 13, in which RNA strands a and b are sandwiched between double-stranded structures I and II, and double-stranded structure II is a hairpin (or stem loop). And a and b each contain an RNA containing one or more MBS.
  • the double-stranded structure contained in the miRNA-inhibiting complex of the present invention is not particularly limited in sequence, and may have an arbitrary base length.
  • the preferred embodiment will be described separately in detail below.
  • the sequence of base pairs forming a double-stranded structure can be appropriately designed so that a duplex can be specifically and stably formed in the miRNA-inhibiting complex.
  • sequences in which several base sequences are repeated in tandem such as double base repeat sequences and 3-4 base repeat sequences.
  • the GC content of the double-stranded portion may be adjusted as appropriate, for example, 12% to 85%, preferably 15% to 80%, 20% to 75%, 25% to 73%, 32% to 72%, 35% ⁇ 70%, 37% -68%, or 40% -65%.
  • the sequences of stem I and stem II shown in Patent Document 1 can be exemplified, but are not limited thereto.
  • the four strands include G-quadruplex, and specifically, a sequence of GGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGG can be used.
  • the sequence of the loop can be appropriately selected.
  • all three loops can be 1 base (for example, M (A or C)), or both can be 3 bases.
  • the MBS and the double-stranded structure may be linked directly or via other sequences.
  • MBS can be attached to the end of a double stranded structure via a suitable linker or spacer sequence. Even if MBS is directly linked to the double-stranded portion, significant inhibitory activity can be obtained, but the inhibitory effect on miRNA is further increased by adding a linker (also referred to as a spacer) (see Patent Document 1).
  • a linker or spacer sequence between the MBS sequence and the double-stranded structure may increase accessibility to miRNAs where MBS is present in RISC. The length of the linker or spacer may be appropriately adjusted.
  • 1 to 10 bases preferably 1 to 9 bases, 1 to 8 bases, 1 to 7 bases, 1 to 6 bases, 1 to 5 bases, 1 to 4 Base, or 1-3 bases.
  • the sequence of the linker or spacer is not particularly limited, and can be, for example, a sequence consisting of A and / or C, or a sequence containing A and / or C more than other bases.
  • it is preferable to consider that the linker or spacer sequence does not form a stable base pair with the opposing linker or spacer sequence or MBS.
  • AAC, CAA, ACC, CCA, or a sequence including any of them can be exemplified.
  • a pair of linker or spacer sequences added to both sides of MBS may be an inverted sequence (mirror image sequence).
  • AAC can be added to the 5 'side of the MBS and CAA can be added to the 3' side.
  • the nucleic acid constituting the miRNA-inhibiting complex of the present invention is characterized by being modified with the specific modified nucleic acid of the present invention, but may contain modified nucleic acids other than the specific modified nucleic acid.
  • the nucleotide constituting the nucleic acid may contain a natural nucleotide, a modified nucleotide, an artificial nucleotide, or a combination thereof, in addition to the specific modified nucleic acid of the present invention.
  • the nucleic acid contained in the miRNA-inhibiting complex of the present invention may be composed of RNA or may be an RNA / DNA chimera other than the specific modified nucleic acid as long as it contains the specific modified nucleic acid of the present invention.
  • nucleic acid includes not only those bound by a phosphodiester bond but also those having an amide bond or other backbone (such as peptide nucleic acid (PNA)).
  • Nucleic acid analogs include, for example, natural and artificial nucleic acids, and may be nucleic acid derivatives, nucleic acid analogs, nucleic acid derivatives, and the like.
  • Such nucleic acid analogs are well known in the art and include, but are not limited to, phosphorothioates, phosphoramidates, methylphosphonates, chiral methylphosphonates, 2 "-O-methylribonucleotides, peptide nucleic acids (PNA), and the like.
  • the PNA skeleton may include a skeleton composed of aminoethylglycine, polyamide, polyethyl, polythioamide, polysulfinamide, polysulfonamide, or a combination thereof (Krutzfeldt, J. et al., Nucleic Acids Res. 35: 2885-2892; Davis, S. et al., 2006, Nucleic Acids Res.
  • BNA Bandd nucleic acid used in the present invention
  • a specific type of modified nucleic acid includes a stabilized nucleic acid, that is, a modified nucleic acid that promotes double strand formation, including, for example, a broadly defined crosslinked nucleic acid (BNA).
  • BNA crosslinked nucleic acid
  • bridged nucleic acid (BNA) means both Bicyclic Nucleic Acid and Bridged Mucleic Acid. Also called “bridged nucleic acid”, “bicyclic nucleic acid” or “bridged / bicyclic nucleic acid”. .)) refers to any modified nucleic acid in which the 2′-position and 4′-position of the nucleic acid are linked (bridged) to form two (bicyclic) ring structures.
  • a crosslinked nucleic acid can be used as the stabilized nucleic acid (that is, a modified nucleic acid that promotes double-stranded formation) used in the present invention.
  • LNA locked nucleic acids
  • ethylene nucleic acids such as 2 "-O, 4" -C-ethylene bridged nucleic acid (2 "-O, 4" -C-ethylene bridged nucleic acid (ENA)
  • ENA locked nucleic acid
  • BNA nucleic acid
  • HNA hexitol nucleic acid
  • tcDNA tricyclo-DNA
  • tcDNA polyether nucleic acid
  • CeNA cyclohexene nucleic acid
  • substitution refers to replacement of a specific hydrogen atom in an organic compound such as a crosslinked nucleic acid (BNA) with another atom or atomic group.
  • BNA crosslinked nucleic acid
  • substituted refers to an atom or a functional group substituted with another in a chemical structure such as a crosslinked nucleic acid (BNA).
  • BNA crosslinked nucleic acid
  • substitution is the substitution of one or more hydrogen atoms in a certain organic compound or substituent with another atom or atomic group, or a double bond or triple bond. That means. It is possible to remove one hydrogen atom and replace it with a monovalent substituent, or combine with a single bond to form a double bond, and remove two hydrogen atoms to form a divalent substituent. It can be substituted or combined with a single bond to form a triple bond.
  • alkyl refers to a monovalent group formed by loss of one hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon (alkane) such as methane, ethane, or propane, and is generally represented by C n H 2n + 1 —. Where n is a positive integer.
  • Alkyl can be linear or branched. Specific examples thereof include C1-C2 alkyl, C1-C3 alkyl, C1-C4 alkyl, C1-C5 alkyl, C1-C6 alkyl, C1-C7 alkyl, C1-C8 alkyl, C1-C9 alkyl, C1-C10 alkyl.
  • C1-C11 alkyl or C1-C20 alkyl C1-C2 substituted alkyl, C1-C3 substituted alkyl, C1-C4 substituted alkyl, C1-C5 substituted alkyl, C1-C6 substituted alkyl C1-C7 substituted alkyl, C1-C8 substituted alkyl, C1-C9 substituted alkyl, C1-C10 substituted alkyl, C1-C11 substituted alkyl or C1-C20 substituted alkyl obtain.
  • C1-C10 alkyl means linear or branched alkyl having 1 to 10 carbon atoms.
  • substituted alkyl refers to an alkyl in which H of alkyl is substituted by a substituent as defined herein. Specifically, but not limited to these, CH 3 OCH 2 —, CH 3 OCH 2 CH 2 —, CH 3 OCH 2 CH 2 CH 2 —, HOCH 2 —, HOCH 2 CH 2 —, HOCH 2 CH 2 CH 2 —, NCCH 2 —, NCCH 2 CH 2 —, NCCH 2 CH 2 CH 2 —, FCH 2 —, FCH 2 CH 2 —, FCH 2 CH 2 CH 2 —, H 2 NCH 2 —, H 2 NCH 2 CH 2 —, H 2 NCH 2 CH 2 CH 2 —, HOOCCH 2 —, HOOCCH 2 CH 2 —, HOOCCH 2 CH 2 CH 2 —.
  • alkylene refers to a divalent group formed by losing two hydrogen atoms from an aliphatic hydrocarbon (alkane) such as methane, ethane, or propane, and is generally represented by —C n H 2n —. Where n is a positive integer.
  • alkane aliphatic hydrocarbon
  • the alkylene can be straight or branched.
  • substituted alkylene refers to alkylene in which H of alkylene is substituted with the above-described substituent.
  • C1-C10 alkylene means linear or branched alkylene having 1 to 10 carbon atoms.
  • C1-C10 substituted alkylene refers to C1-C10 alkylene in which one or more hydrogen atoms are substituted with a substituent.
  • alkylene may contain one or more atoms selected from an oxygen atom and a sulfur atom.
  • cycloalkyl refers to alkyl having a cyclic structure.
  • substituted cycloalkyl refers to a cycloalkyl in which H of the cycloalkyl is substituted by the above-described substituent. Specific examples include C3-C4 cycloalkyl, C3-C5 cycloalkyl, C3-C6 cycloalkyl, C3-C7 cycloalkyl, C3-C8 cycloalkyl, C3-C9 cycloalkyl, C3-C10 cycloalkyl, C3-C11.
  • alkenyl refers to a monovalent group formed by losing one hydrogen atom from an aliphatic hydrocarbon having one double bond in the molecule, and is generally represented by C n H 2n-1 —. (Where n is a positive integer greater than or equal to 2). “Substituted alkenyl” refers to alkenyl in which H of alkenyl is substituted by the above-described substituent.
  • C2-C10 alkyl means a straight-chain or branched alkenyl containing 2 to 10 carbon atoms.
  • C2-C10 substituted alkenyl refers to C2-C10 alkenyl, in which one or more hydrogen atoms are substituted with substituents.
  • aryl refers to a group formed by leaving one hydrogen atom bonded to an aromatic hydrocarbon ring, and is included in the present specification as a carbocyclic group. Phenyl group (C 6 H 5 —) from benzene, tolyl group (CH 3 C 6 H 4 —) from toluene, xylyl group ((CH 3 ) 2 C 6 H 3 —) from xylene, naphthyl from naphthalene The group (C 10 H 8 —) is derived.
  • aralkyl means an alkyl group in which one of the hydrogen atoms of the alkyl group is substituted with an aryl group.
  • Specific examples of the aralkyl group may be benzyl group, phenethyl group (phenylethyl group), 1-naphthylethyl and the like.
  • acyl refers to a monovalent group formed by removing OH from a carboxylic acid.
  • Representative examples of the acyl group include acetyl (CH 3 CO—), benzoyl (C 6 H 5 CO—), and the like.
  • “Substituted acyl” refers to acyl hydrogen substituted with the above-described substituents.
  • sulfonyl is a generic term for a substance including —SO 2 — which is a characteristic group. “Substituted sulfonyl” means sulfonyl substituted with the above-described substituents.
  • sil is a group generally represented by SiR 1 R 2 R 3 — (wherein R 1 , R 2 and R 3 are each independently hydrogen, alkyl, cycloalkyl, Selected from the group consisting of alkenyl, cycloalkenyl, alkynyl, cycloalkynyl, alkoxy, carbocyclic, heterocyclic. Specific examples thereof may be a trimethylsilyl group, a triethylsilyl group, a tri-n-propylsilyl group, a tert-butyldimethylsilyl group, a triisopropylsilyl group, or a tert-butyldiphenylsilyl group.
  • “functional molecular unit substituent” means a labeled molecule (for example, a fluorescent molecule, a chemiluminescent molecule, a molecular species containing a radioisotope, etc.), a DNA or RNA cleaving active molecule, intracellular or nuclear translocation. A group containing a signal peptide or the like.
  • the BNA is at least 1 selected from the group consisting of carbon, carbon and nitrogen on the 4 ′ position through at least one atom selected from the group consisting of oxygen and carbon on the 2 ′ position. It can be BNA bridged through one atom.
  • the BNA used in the present invention is
  • R 1 , R 1 ′, R 2 , R 2 ′, and R 3 each independently represents a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, substituted or non-substituted, Substituted cycloalkyl group, substituted or unsubstituted aryl group, substituted or unsubstituted aralkyl group, substituted or unsubstituted acyl group, substituted or unsubstituted sulfonyl group, substituted or unsubstituted silyl group, and functional molecule
  • a group selected from the group consisting of unit substituents such as, but not limited to, a substituted or unsubstituted phenoxyacetyl group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 5 carbon atoms, carbon A lower aliphatic or aromatic group such as a
  • Examples thereof include an aliphatic acyl group having 1 to 5 carbon atoms such as a phonyl group or an acetyl group, and an aromatic acyl group such as a benzoyl group, n is an integer of 1 to 3, and q is an integer of 0 or 1. 2), 4′-substituted cross-linked nucleic acid.
  • Base is a purin-9-yl group, a 2-oxo-pyrimidin-1-yl group, or a derivative thereof, for example, but is not limited thereto, and is exemplified in Japanese Patent No. 4731324.
  • 6-aminopurin-9-yl ie, adeninyl
  • 2-amino-6-chloropurin-9-yl 2-amino-6-fluoropurin-9-yl
  • 2-amino-6-bromopurine- 9-yl 2-amino-6-hydroxypurin-9-yl (ie, guaninyl)
  • adeninyl thyminyl, guaninyl, uracilyl, Inoshiniru, a cytosinyl and 5 Mechirushitoshiniru and derivatives.
  • the BNA used in the present invention is
  • R 3 is a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted aryl group, a substituted or unsubstituted aralkyl A group selected from the group consisting of a group, a substituted or unsubstituted acyl group, a substituted or unsubstituted sulfonyl group, a substituted or unsubstituted silyl group, and a functional molecular unit substituent, for example, but not limited thereto Is a phenoxyacetyl group, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 5 carbon atoms, an aryl group having 6 to 14 carbon atoms, a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups, a methane
  • Base is similar to that described for BNA-1, and may preferably be adenylyl, guaninyl, thyminyl, uracinyl, inosinyl, cytosynyl and 5-methylcytosynyl, and derivatives thereof.
  • the BNA used in the present invention is
  • R 2 and R 2 ′ are each independently a hydrogen atom, a substituted or unsubstituted alkyl group, a substituted or unsubstituted alkenyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, a substituted or unsubstituted cycloalkyl group, A group selected from the group consisting of aryl groups, substituted or unsubstituted aralkyl groups, substituted or unsubstituted acyl groups, substituted or unsubstituted sulfonyl groups, substituted or unsubstituted silyl groups, and functional molecular unit substituents Examples include, but are not limited to, a methyl group and an O-methoxyethyl group, and Base is the same as described for BNA-1, preferably adenyl, guanylyl, thyminyl, uracinyl, inosinyl.
  • BNA having a branch in the cross-linked chain is not limited to this.
  • BNA (CEt: 2 ', 4'-constrained ethyl).
  • BNA (cEt) has the same thermal stability and mismatch discrimination as conventional LNA, it is known to have improved stability against nucleases.
  • the BNA used in the present invention is
  • BNA NC (NMe) is displayed unless otherwise specified in the present specification, but “2 ′, 4′-BNANC” may also be displayed). Same definition as above, preferably selected from the group consisting of adenylyl, thyminyl, guaninyl, urasilyl, inosinyl, cytosynyl and 5-methylcytosinyl.
  • protecting group refers to a group used to protect a functional group from a specific chemical reaction.
  • the protecting group may be represented as “PG”.
  • BNA NC NMe
  • LNA LNA
  • BNA NC NMe
  • n is 1.
  • the oligonucleotide may be a DNA oligonucleotide or RNA oligonucleotide containing one or more species, or a pharmacologically acceptable salt thereof.
  • the bonding form between each nucleoside in the oligonucleotide is phosphorothioate bond [—OP (O) () in addition to the same phosphodiester bond [—OP (O 2 —) O—] as the natural nucleic acid. 1 or 2 or more of S-) O-] may be contained, and in the case of containing 2 or more of one or more of the above structures, Base may be the same or different between the structures.
  • a DNA or RNA oligonucleotide analog containing the artificial nucleic acid BNA NC (NMe) which is a kind of the present invention has the following excellent characteristics. This is because the ability to form double strands for complementary RNA strands is very high.
  • BNA NC (NMe) modified DNA oligonucleotides are extremely excellent in selective binding affinity to RNA strands.
  • BNA NC (NMe) modified DNA oligonucleotides also excel in triplex forming ability for double-stranded DNA strands.
  • the Tm value rises by 7 to 12 ° C. in triplex formation for a double-stranded DNA strand.
  • sequence selectivity is required such that the base sequence is strictly identified and bound only to the target sequence, but the Tm against the match sequence and mismatch sequence of the BNA NC (NMe) modified DNA oligonucleotide.
  • the difference in value is 25 ° C. or more, and the sequence selectivity is superior to that of the natural DNA oligonucleotide.
  • nuclease resistance is outstanding.
  • BNA NC (NMe) modified oligonucleotides are more nuclease resistant than natural DNA oligonucleotides, but much lower than S-oligos (phosphorothioate type oligonucleotides).
  • the BNA NC (NMe) -modified oligonucleotide of the present invention is superior in nuclease resistance to SNA-oligo, which is highly evaluated for its excellent nuclease resistance, as well as BNA-modified oligonucleotides, and it can be degraded in vivo. It has a strong resistance characteristic.
  • the N—O bond contained in the artificial nucleic acid BNA NC (NMe) molecule of the present invention can be selectively cleaved under a mild condition by a reducing reagent, and NH group and OH group are released. It is easy to obtain various complexes (conjugates) before and after the preparation of oligonucleotide analogues by binding other functional molecules based on these NH groups and OH groups.
  • Other functional molecules include fluorescent molecules, chemiluminescent molecules, labeling molecules such as molecular species containing radioisotopes, various DNA (RNA) cleavage active molecules, intracellular and nuclear signal peptide, etc. It is.
  • BNA NC (NMe) modified DNA and RNA oligonucleotide analogues modified in various forms are gene drugs by antisense method, antigene method, decoy method, gene homologous recombination method, RNA interference method, etc. Not only as a highly functional material created, but also as a base material for genetic diagnosis methods such as molecular beacons and DNA chips, and as a development material for research reagents for elucidating gene function analysis and the like, it is extremely useful.
  • R 3 is a hydrogen atom, an alkyl group having 1 to 5 carbon atoms, an alkenyl group having 1 to 5 carbon atoms, carbon An aryl group of 6 to 14; a methyl group substituted with 1 to 3 aryl groups; a lower aliphatic or aromatic sulfonyl group such as a methanesulfonyl group or p-toluenesulfonyl group; or an acetyl group such as an acetyl group.
  • Base is as described above, preferably an adenylyl group, thymine.
  • the nucleoside analogs and oligonucleotide analogs of the present invention can be synthesized based on the methods described in the Examples and the prior art in the field.
  • the compounds represented by the general formulas (BNA-1) and (BNA-2) can be synthesized based on the methods described in Examples and conventional techniques in this field.
  • the reaction conditions, the protecting group introduction reagent, and the reaction reagent can be specifically referred to the methods described in the examples, but are not limited thereto, reaction conditions that can be used based on the common general technical knowledge in the field, Reagents can be employed as appropriate. For example, methods described in Japanese Patent Application Laid-Open Nos.
  • Base is a nucleobase described herein, eg, adenine, guanine, cytosine, thymine, uracil.
  • a suitable reagent eg 40% aqueous methylamine (0.11 ml, 1.50 mmol)
  • a solution eg 3.5 ml THF solution
  • a suitable temperature eg ice-cold
  • an appropriate time eg 3 hours
  • extraction is performed with a suitable organic solvent (for example, ethyl acetate), and the organic layer is washed (for example, with water and saturated brine).
  • a suitable desiccant eg, anhydrous sodium sulfate
  • reaction is quenched (for example, by adding water to the reaction solution), extracted with an appropriate organic solvent (for example, ethyl acetate), the organic layer is washed (for example, with saturated aqueous sodium bicarbonate and saturated brine), and then an appropriate drying agent (for example, it is dried with anhydrous sodium sulfate).
  • an appropriate organic solvent for example, ethyl acetate
  • the organic layer is washed (for example, with saturated aqueous sodium bicarbonate and saturated brine), and then an appropriate drying agent (for example, it is dried with anhydrous sodium sulfate).
  • an appropriate drying agent for example, it is dried with anhydrous sodium sulfate.
  • the solvent is distilled off under reduced pressure to obtain compound A-3.
  • Compound A-3 can also be used in the next reaction without purification.
  • the organic layer is washed (eg, with water, saturated saline) and then dried with a suitable desiccant (eg, anhydrous sodium sulfate).
  • a suitable desiccant eg, anhydrous sodium sulfate.
  • reaction solution is extracted with a suitable organic solvent (for example, ether), and the organic layer is washed (for example, with water and saturated brine) and then dried with a suitable desiccant (for example, magnesium sulfate).
  • a suitable organic solvent for example, ether
  • desiccant for example, magnesium sulfate
  • a solution of compound A-7 (eg 0.29 g) (eg acetonitrile solution (3 ml)) at a suitable temperature (eg room temperature) (eg N-hydroxyphthalimide (67 mg, 0 .41 mmol), 1,8-diazabicyclo [5.4.0] -7-undecene (61 (1,0.41 mmol)) is added and stirred at an appropriate temperature (eg, room temperature) for an appropriate time (eg, 12 hours)
  • the reaction solution is extracted with a suitable organic solvent (for example, dichloromethane), and the organic layer is washed (for example, with water and saturated brine) and then dried with a suitable desiccant (for example, anhydrous sodium sulfate).
  • a suitable organic solvent for example, dichloromethane
  • the resulting crude product is purified (for example, by silica gel column chromatography (chloroform)) to obtain compound A-7 ′.
  • an appropriate reagent eg, hydrazine-hydrate (0.12 ml, 2.38 mmol
  • the mixture is stirred for an appropriate time (for example, 10 minutes) at an appropriate temperature (for example, room temperature), and then the solvent of the reaction solution is distilled off, followed by filtration, and the filtrate is extracted with an appropriate organic solvent (for example, ethyl acetate).
  • reaction is quenched (eg, with saturated aqueous sodium bicarbonate) and extracted with a suitable organic solvent (eg, ethyl acetate).
  • a suitable organic solvent eg, ethyl acetate
  • the organic layer is washed (eg with water, saturated saline) and dried over a suitable desiccant (eg magnesium sulfate).
  • the step of removing OPG 4 and the step of crosslinking the 2′-position and the 4′-position may be the same step or different steps.
  • a suitable organic solvent eg ethyl acetate
  • the organic layer is washed (eg, with water, saturated saline) and then dried with a suitable desiccant (eg, anhydrous sodium sulfate).
  • the amino group is substituted. Stir for an appropriate time (eg 1 hour).
  • the reaction solution is extracted with a suitable organic solvent (for example, ethyl acetate), washed with (for example, water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, saturated brine), and the organic layer is dried with a suitable desiccant (for example, anhydrous sodium sulfate).
  • a suitable organic solvent for example, ethyl acetate
  • washed with for example, water, saturated aqueous sodium hydrogen carbonate, saturated brine
  • a suitable desiccant for example, anhydrous sodium sulfate
  • BNA-3 The compound represented by the general formula BNA-3 can be synthesized based on the methods described in the Examples and the prior art in this field.
  • the reaction conditions, the protecting group introduction reagent, and the reaction reagent can be specifically referred to the methods described in the examples, but are not limited thereto, reaction conditions that can be used based on the common general technical knowledge in the field, Reagents can be employed as appropriate.
  • the method described in J. Org. Chem. 2010, 75, 1569-1581 can be referred to.
  • J. Org. Chem. 2010, 75 The raw material of the compound of the present invention can be synthesized with reference to the method described in 1569-1581.
  • PG 1 to PG 4 are independently protecting groups described herein, R 2 and R 2 ′ are substituents described herein, and Base is defined herein.
  • An appropriate reagent for example, potassium carbonate
  • a suitable temperature for example, under a nitrogen stream
  • the reaction is quenched (eg, by adding water to the reaction solution), extracted with a suitable organic solvent (eg, ethyl acetate), and the organic layer is washed (eg, with saturated brine).
  • the organic layer is dried with a suitable desiccant (for example, sodium sulfate), evaporated and then purified (for example, by silica gel column chromatography) to give compound B-2.
  • a suitable desiccant for example, sodium sulfate
  • Oligonucleotide analogs including the nucleoside analog of the present invention can be variously synthesized using a known DNA synthesizer. Then, the resulting oligonucleotide analog is purified using a reverse phase column, and the purity of the product is analyzed by reverse phase HPLC or MALDI-TOF-MS, thereby confirming the formation of a purified oligonucleotide analog.
  • One or more nucleoside analogs of the present invention can be present in an oligonucleotide analog.
  • oligonucleotide analog in which the nucleoside analog of the present invention is introduced in a required number (length) at a required position.
  • the total length of the oligonucleotide analog is 2 to 50 nucleotide units, preferably 8 to 30 nucleotide units.
  • the oligonucleotide analog of the present invention is hardly degraded by nuclease and can exist in the living body for a long time after administration to the living body. And, for example, it forms a duplex with sense RNA to inhibit transcription of in vivo components (proteins) that cause disease into mRNA. It is also thought to inhibit the growth of infected viruses.
  • the oligonucleotide analogue of the present invention is expected to be useful as a medicine for treating diseases by inhibiting the action of genes such as antitumor agents and antiviral agents. That is, according to the present invention, there are oligonucleotide analogues and production intermediates thereof that have stable and excellent antisense or antigene activity, or excellent activity as a detection agent for a specific gene or a primer for initiation of amplification. Nucleoside analogs are provided.
  • DNA and RNA oligonucleotide analogues obtained by modifying 2 ', 4'-BNANC monomer, which is one of the nucleoside analogues of the present invention, in various forms are various physiological and biologically active substances, Functional materials such as pharmaceutical materials, functional materials of double-stranded oligonucleotides for RNA interference and decoy methods, DNA chips that target single-stranded nucleic acids such as cDNA, molecular beacons, etc.
  • Anti-sense methods including ribozymes and DNAzymes
  • functional materials for anti-gene methods and gene homologous recombination methods materials for sensitive analysis of biological trace components by combination with fluorescent and luminescent substances, and gene function analysis It is useful as a development material for research reagents.
  • nucleoside analogs and oligonucleotide analogs of the present invention can be formulated into parenteral preparations by incorporating conventional auxiliaries such as buffers and / or stabilizers. Further, as a topical preparation, a conventional pharmaceutical carrier can be blended to prepare an ointment, cream, solution, salve or the like.
  • Oligonucleotides constituting S-TuD used in the present invention are synthesized by a synthesizer (eg, nS-8II synthesizer or AKTA oligopilot synthesizer).
  • a synthesizer eg, nS-8II synthesizer or AKTA oligopilot synthesizer.
  • a porous glassy solid support eg 2′-O-methyl-RNA CPG Link Technologies
  • a 2′-O-methyl-RNA phosphoramidite with standard protecting groups eg Although not, 5′-O-dimethoxytrityl N6-benzoyladenosine-2′-O-methyl-3′-ON, N′-diisopropyl phosphoramidite, 5′-O-dimethoxytrityl-N4- Acetylcytidine-2'-O-methyl-3'-ON, N'-diisopropyl phosphoramidite, 5'-O-dimethoxytrityl-N2-isobutyrylguanosine-2'-O-methyl-3'- ON, N'-diisopropyl phosphoramidite, and 5'-O-dimethoxytrityluridine-2'-O-methyl-3'-ON, N'-diisopro Le phosphoramidite (all manufactured by Sigma-Aldrich
  • phosphoramidites are used in a suitable solvent (eg acetonitrile (CH 3 CN)) at a suitable concentration (eg 0.1 M).
  • a suitable solvent eg acetonitrile (CH 3 CN)
  • a suitable concentration eg 0.1 M
  • Appropriate ligation / reuse times eg 15 minutes
  • the activator is, for example, but not limited to, 5-benzylmercapto-tetrazole (0.25M, manufactured by Wako Pure Chemical Industries), and the PO-oxidation is, for example, limited to this Although not iodine / water / pyridine is used.
  • PS-thioation for example, but not limited to, commercially available sulfurization reagents for automated synthesizers of oligonucleotides (ie, EIDTH, DDTT, PADS, Beucage reagents, etc.) together with appropriate reagents (eg, pyridine). use.
  • sulfurization reagents for automated synthesizers of oligonucleotides ie, EIDTH, DDTT, PADS, Beucage reagents, etc.
  • appropriate reagents eg, pyridine
  • the synthetic carrier is transferred to a suitable container (eg, a glass bottle).
  • Oligonucleotide is used in an appropriate amount of time (eg 13 hours) at an appropriate temperature (eg 45 ° C.) using an equal mixture of 40% methylamine aqueous solution and 33% methylamine ethanol solution 15 mL per gram of carrier,
  • the base and phosphate group are deprotected and cleaved from the support.
  • the step of deprotecting the base and the step of deprotecting the phosphate group may be the same or different.
  • the ethanol ammonia mixture is then filtered and placed in a suitable container (eg, a new 250 mL bottle).
  • the carrier is washed (eg with 2 ⁇ 40 mL of ethanol / water (1: 1 v / v)). Thereafter, the solvent is removed by evaporation (for example using a rotary evaporator).
  • Oligonucleotides are purified by HPLC (eg, reverse phase ion pair HPLC on a Source 15 RPC gel column).
  • the buffer include, but are not limited to, 5% CH 3 CN, 0.1M triethylamine acetate buffer (pH 7.0) (buffer A) and 90% CH 3 CN, 0.1M triethylamine. This is an acetate buffer (pH 7.0) (buffer B).
  • the oligonucleotide pool is then purified by HPLC (eg, Source 30Q anion pair HPLC).
  • solutions and buffers include, but are not limited to, 0.6% trifluoroacetic acid (solution A), 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) (buffer C), and 20 mM phosphate. 2M sodium chloride (buffer D) in sodium buffer.
  • solution A 0.6% trifluoroacetic acid
  • buffer C 20 mM sodium phosphate buffer
  • 2M sodium chloride buffer D
  • fractions containing the full-length oligonucleotide are pooled, desalted and lyophilized.
  • Compounds are finally analyzed on, for example, MALDI-TOF / MS and denaturing polyacrylamide gels.
  • the concentration of the oligonucleotide is determined (for example, by measuring the absorbance using an ultraviolet spectrophotometer). Using the determined concentration, the complementary strands are mixed at an equimolar concentration, heated at an appropriate temperature (eg, 95 ° C.) for an appropriate time (eg, 10 minutes), and then gradually cooled to form a double strand. Double strand formation is confirmed, for example, by non-denaturing gel electrophoresis.
  • the nucleic acid may contain a conjugate at the end.
  • the conjugate include lipophilic substances, terpenes, protein binding substances, vitamins, carbohydrates, retinoids, peptides, and the like.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention can be designed to be composed of linear single-stranded nucleic acids (FIG. 31).
  • the present invention is particularly concentrated on one side (right side in FIG. 31) of the double-stranded structure (stem I in FIG. 31) where all MBS is present, and each strand of the double-stranded structure is closed on that side.
  • a complex in which both ends of a single-stranded RNA are on opposite sides of the double-stranded structure (FIG. 31).
  • the sequence containing MBS may contain an additional double-stranded structure (eg, stem II or III in FIG. 31).
  • the length of the single-stranded RNA may be determined as appropriate, for example, within 500 bases, preferably within 450 bases, within 420 bases, within 400 bases, within 380 bases, within 360 bases, within 340 bases, within 320 bases, within 300 bases, 300 bases Within base, within 280 base, within 260 base, within 240 base, within 220 base, within 200 base, within 180 base, within 160 base, within 140 base, within 120 base, within 100 base, or within 80 base.
  • the length of a single-stranded RNA forming a complex having two double-stranded structures and two MBS is, for example, 60 to 300 bases, preferably 70 to 250 bases, 80 to 200 bases, 90 to 180 bases, Or 100 to 150 bases.
  • the first double-stranded structure (double-stranded structure close to both ends of the single-stranded RNA) is, for example, 15-30 bp, preferably 16-28 bp, preferably 17-25 bp, preferably 17-24 bp, such as 17 bp, 18 bp.
  • the second double stranded structure (an additional double stranded structure included in sequences containing MBS) to make the whole compact
  • the length may be shorter than the length of the first double-stranded structure, for example, 4 bp to 20 bp, such as 5 bp to 15 bp, 5 bp to 12 bp, 5 bp to 10 bp, 6 bp to 9 bp, or 7 bp to 8 bp.
  • the present invention also relates to RNA constituting the miRNA-inhibiting complex of the present invention (herein, RNA includes natural RNA and nucleic acid analogs) and includes RNA containing BNA.
  • RNA includes natural RNA and nucleic acid analogs
  • RNA containing BNA RNA containing BNA.
  • the miRNA-inhibiting RNA complex is composed of one molecule of RNA, by annealing the RNA within the molecule, or when composed of two or more RNA molecules, annealing those RNAs.
  • the complex of the present invention can be constructed. These RNAs can be appropriately synthesized. For example, desired RNA can be produced by chemical synthesis of RNA.
  • a nucleic acid encoding at least one MBS may contain more than one MBS, and may contain a set of one or more complementary sequences that can form a double-stranded structure in a stretch of sequences.
  • examples of the nucleic acid include a pair of complementary sequences forming at least one double-stranded structure and a nucleic acid containing at least one MBS at both ends of the pair of complementary sequences.
  • such a nucleic acid is a nucleic acid containing a pair of complementary sequences capable of forming a stem between two MBS. This stem corresponds to the second double-stranded structure.
  • a sequence that forms a G-quadruplex may be included instead of the second double-stranded structure.
  • the nucleic acid may contain two or more structural units including a pair of complementary sequences that can form a double-stranded structure between two MBS.
  • the structural unit can be included in multiple nesting structures, and between a pair of complementary sequences that can form a double-stranded structure between a pair of MBS, and another pair of MBS and a double-stranded structure between them.
  • a sequence including a pair of complementary sequences that can form (such as # 15 and # 16 in FIG. 31) can be included.
  • Multiple MBS sequences may be the same or different.
  • MBS a sequence forming a second double-stranded structure—is between a pair of complementary sequences forming a first double-stranded structure—
  • a nucleic acid having a structure in which a sequence having an MBS structure is inserted is obtained.
  • MBS a pair of complementary sequences forming a second double-stranded structure—a nucleic acid having a structure in which a sequence having the MBS structure is inserted.
  • a nucleic acid consisting of two double-stranded structures and a pair of opposing single strands (each containing MBS) is compact and exhibits sufficient miRNA inhibitory activity.
  • a pair of complementary sequences capable of forming a double-stranded structure and MBS can be appropriately linked via a linker or spacer.
  • the length of the linker or spacer is as described in the specification.
  • complementary sequences may be linked via a linker or spacer.
  • the linker or spacer becomes a loop, and the double strand is combined to form a stem loop.
  • the length of the loop may be appropriately adjusted, and details are as described in the specification.
  • a sequence forming a G-quadruplex can be appropriately used instead of the double strand.
  • the present invention is a miRNA inhibition complex comprising RNA or an analog thereof, wherein the miRNA inhibition complex comprises at least one double-stranded structure and a miRNA binding sequence, wherein the miRNA binding sequence Provided is a miRNA-inhibiting complex, wherein two strands are bound one by one to at least one strand of the double-stranded structure, and the miRNA-inhibiting complex comprises at least one cross-linked nucleic acid (BNA) .
  • BNA cross-linked nucleic acid
  • Such a complex is also called S-TuD
  • the present invention is a further improvement of this complex, and is also called improved S-TuD or modified S-TuD.
  • This improved S-TuD contains at least one cross-linked nucleic acid (BNA).
  • BNA cross-linked nucleic acid
  • the BNA is at least selected from the group consisting of carbon, carbon and nitrogen on the 4 ′ position via at least one atom selected from the group consisting of oxygen and carbon on the 2 ′ position.
  • the BNA used in the present invention is
  • R 1 , R 1 ′, R 2 , R 2 ′ and R 3 each independently represents a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl group, A group selected from the group consisting of a sulfonyl group, a silyl group, and a functional molecular unit substituent, m is an integer of 0 to 2, and Base is an adenylyl group, a thyminyl group, a urasilyl group, an inosinyl group, A cytosynyl group, a guaninyl group, a methylcytosynyl group or a derivative thereof, wherein n is an integer of 1 to 3 and q is an integer of 0 or 1. .
  • the BNA used in the present invention is
  • R 3 is selected from the group consisting of a hydrogen atom, an alkyl group, an alkenyl group, a cycloalkyl group, an aryl group, an aralkyl group, an acyl group, a sulfonyl group, a silyl group, and a functional molecular unit substituent.
  • Base represents an adenynyl group, a thyminyl group, a urasilyl group, an inosinyl group, a cytosynyl group, a guaninyl group, a methylcytosynyl group or a derivative thereof, m is an integer of 0 to 2, and n is an integer of 1 to 2 ', 4'-substituted cross-linked nucleic acid represented by 3).
  • the BNA used in the present invention is
  • LNA 2 ', 4' methano-bridged nucleic acid
  • BNA NC (NMe) is particularly preferable. Although not wishing to be bound by theory, using this particular nucleic acid increased stability, promoted duplex formation, and further improved biological activity was observed.
  • cEt can be used.
  • BNA (cEt) has the same thermal stability and mismatch discrimination as conventional LNA, but improves stability against nucleases.
  • the BNA used in the present invention is contained in at least one strand of the double-stranded structure moiety and at least one strand of the complementary strand of the miRNA binding sequence.
  • the BNA used in the present invention is contained in at least one chain of the double-stranded structure moiety. In another embodiment, the BNA used in the present invention is included in both strands of the double stranded structural moiety.
  • the complex of the present invention may include one or more “double-stranded structures” or a plurality of “double-stranded structures”, and may have an S-TuD structure similar to that in Patent Document 1 or the examples.
  • a double-stranded structure is in series, three or four can be included in succession, and it is understood that such embodiments are also included in the present invention.
  • the complex of the present invention comprises two or more of the double-stranded structures, and a strand comprising a miRNA binding sequence in two strands at one end of the first double-stranded structure of the double-stranded structure.
  • a strand comprising a miRNA binding sequence in two strands at one end of the first double-stranded structure of the double-stranded structure are connected to each other, and the other end of each of the strands is a second duplex of the two or more double-stranded structures, so that each of the strands is sandwiched between the two or more double-stranded structures.
  • Each is bound to two strands of the structure.
  • the ends of two strands containing miRNA binding sequences are bound to two strands at one end of the double-stranded structure one by one through a linker of 1 to 5 bases each.
  • each of the two strands is bonded to two strands at one end of the second multi-stranded structure via a linker of 1 to 5 bases, but the present invention is not limited to this.
  • the two strands comprising the miRNA binding sequence included in the complex of the present invention each strand comprising an miRNA binding sequence and two strands comprising the miRNA binding sequence, Is not limited to this.
  • the ends of two strands containing a miRNA binding sequence are linked via a linker.
  • the linker has a length of 1 to 10 bases, more preferably 1 to 9 bases, further preferably 1 to 8 bases, and more preferably The length is 1 to 7 bases, more preferably 1 to 5 bases, and may be 4 bases, 3 bases, 2 bases, 1 bases.
  • the length of the double-stranded structure in the miRNA inhibition complex of the present invention may be any length as described above, but preferably has a length of 4 base pairs or more.
  • at least one of the double-stranded structures included in the RNA complex of the present invention (that is, the first double-stranded structure) has an important function for nuclear export of the RNA complex.
  • the length of this double strand may be, for example, 10 to 50, 15 to 50 base pairs, and preferably 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, or 45 bases, Or any one or more thereof, 50, 49, 48, 47, 46, 45, 44, 43, 42, 41, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, or 18 bases, or any of them.
  • the length of the base pair of the double-stranded structure is, for example, 10-30, 15-30, preferably 16-28, preferably 17-25, preferably 17-24, such as 17, 18, 19 , 20, 21, 22, 23, or 24.
  • dsRNA exceeding 20 bp can be a potential target for cleavage by Dicer in the cytoplasm, so it is included in the complex of the present invention to avoid it.
  • the double-stranded structure can be 20 bp or less, such as 19 bp or less, or 18 bp or less.
  • the double-stranded structure contained in the miRNA inhibition complex is further described in the following preferred embodiments.
  • 5 bp to 15 bp, 5 bp to 12 bp, 5 bp to 10 bp, 6 bp to 9 bp, 7 bp to 8 bp, 10 bp to 12 bp may be used.
  • the lower limit length of the double-stranded structure in the complex of the present invention is not particularly limited as long as the activity is maintained, but it is at least 4 bases long, at least 5 bases long, at least 6 bases long, at least 7 bases Long, at least 8 bases long, preferably at least 9 bases long, more preferably at least 10 bases long.
  • their base lengths may be the same or different.
  • it has been confirmed that sufficient formation of a double strand is confirmed with a length of 10 bases and has a sufficient effect, but in some cases, for example, at least 11 bases, at least 12 bases, at least 13 bases , At least 14 bases long, at least 15 bases long, at least 16 bases long, at least 17 bases long, at least 18 bases long.
  • the upper limit length of the double-stranded structure in the complex of the present invention is not particularly limited as long as the activity is maintained.
  • the length is 100 bases or less, 90 bases or less, 80 bases or less, 70
  • the length may be not more than the base length, not more than 60 base length, not more than 50 base length, and the like.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention contains a second or more double-stranded structure
  • these double-stranded structures may be shorter than the length of the first double-stranded structure, for example, in order to make the entire miRNA inhibition complex compact.
  • the length of each double strand may be adjusted as appropriate, and is, for example, 4 bp to 20 bp, for example, 5 bp to 15 bp, 5 bp to 12 bp, 5 bp to 10 bp, 6 bp to 9 bp, or 7 bp to 8 bp.
  • the effect is expected to be obtained, but preferably 2 or more, 3 or more, 4 or more, 5 or more, 6 or more, 7 or more, 8 or more. More than 9, more than 9, more than 10 may be included. However, there are cases where about 6 pieces have a sufficient effect, and there are cases where the effect does not increase even if it is included more than that, it may be sufficient to include about 6 pieces (for example, 4-8 pieces, 4-6 pieces, etc.). .
  • the complex of the present invention has a stronger activity (acts at a low concentration) than the conventional complex.
  • the complex of the present invention is about 2 times or more, about 3 times or more, about 4 times or more, about 5 times or more, about 6 times or more, about 7 times that of the conventional complex.
  • the complex of the present invention acts at 10 nM or less, acts at 5 nM or less, acts at 3 nM or less, acts at 1 nM or less, acts at 500 pM or less, acts at 300 pM or less, and at 100 pM or less.
  • the complex of the invention comprises 2 to 5 miRNA binding sequences, preferably 2 miRNA binding sequences.
  • the complex of the present invention is
  • I and II of the structure are double stranded structures, and can take a structure containing one miRNA binding sequence in each of a and b of the structure.
  • the present invention provides each RNA or analog thereof (ie, each single strand) constituting the complex of the present invention, and each of these RNAs or analogs thereof is also of the present invention. Is in range. Preferred embodiments in the case of single strands are substantially the same as in the double stranded structure, and similar preferred embodiments can be employed.
  • the present invention provides a method for producing the complex of the present invention, comprising: A) protecting a single strand of RNA of interest or an analog thereof using ribonucleic acid and BNA by chemical synthesis. A step of synthesizing the body and its complement; B) a step of deprotecting the produced single-stranded protector and its complement respectively; and C) two steps of each of the deprotected single strands.
  • a method comprising the step of forming a duplex by placing it in a chain forming condition.
  • the present invention is a method for producing the RNA of the present invention or an analog thereof, comprising A) a single strand of the RNA of interest or an analog thereof using ribonucleic acid and BNA by chemical synthesis. And B) deprotecting each of the produced single-stranded protector and its complement, respectively.
  • the present invention provides a medicament comprising the complex of the present invention.
  • the miRNA-inhibiting complex of the present invention is a composition for inhibiting miRNA, Since the composition of the present invention can specifically and efficiently inhibit a target miRNA, the composition of the present invention is useful for controlling the function of a gene through inhibition of miRNA.
  • RNA includes natural RNA and analogs
  • the composition of the present invention is useful for controlling the function of a gene through inhibition of miRNA.
  • any desired pharmacologically acceptable carrier or vehicle including the desired solutions normally used for suspending nucleic acids, such as distilled water, phosphate buffered saline (PBS). ), Sodium chloride solution, Ringer's solution, culture solution, etc. It may also contain vegetable oils, suspending agents, surfactants, stabilizers, biocides, etc.
  • composition of the invention can also be combined with organic substances such as biopolymers, inorganic substances such as hydroxyapatite, specifically collagen matrices, polylactic acid polymers or copolymers, polyethylene glycol polymers or copolymers and chemical derivatives thereof as carriers.
  • the composition of the present invention can be used as a desired reagent or as a pharmaceutical composition, and the present invention also includes the composition of the present invention, the miRNA-inhibiting complex of the present invention, or the RNA constituting the complex or an analog thereof.
  • the use of the body to inhibit miRNA is also provided, and the present invention provides miRNA inhibitors comprising any of them.
  • the present invention provides a method of treating or preventing a disease or disorder comprising the step of administering an effective amount of a complex of the present invention or a medicament comprising the same to a subject in need thereof.
  • the present invention is not limited, but can be applied to, for example, use as an HCV therapeutic agent or a renal fibrosis therapeutic agent that has already been clinically developed.
  • the medicament of the present invention may be administered per se, or may be administered as an appropriate pharmaceutical composition.
  • the pharmaceutical composition used for administration may contain the medicament of the present invention and a pharmacologically acceptable carrier, diluent or excipient.
  • Such pharmaceutical compositions are provided as dosage forms suitable for oral or parenteral administration.
  • injections are dosage forms such as intravenous injections, subcutaneous injections, intradermal injections, intramuscular injections, infusions, and the like. May be included.
  • Such an injection can be prepared according to a known method.
  • a method for preparing an injection it can be prepared, for example, by dissolving, suspending or emulsifying the nucleic acid of the present invention in a sterile aqueous liquid or oily liquid usually used for injection.
  • an aqueous solution for injection for example, an isotonic solution containing physiological saline, glucose and other adjuvants, and the like are used, and suitable solubilizers such as alcohol (eg, ethanol), polyalcohol (eg, Propylene glycol, polyethylene glycol), nonionic surfactants (eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castoroil)) May be.
  • alcohol eg, ethanol
  • polyalcohol eg, Propylene glycol, polyethylene glycol
  • nonionic surfactants eg, polysorbate 80, HCO-50 (polyoxyethylene (50 mol) adduct of hydrogenated castoroil)
  • oily liquid for example, sesame oil, soybean oil and the like are used, and benzyl benzoate, benzyl alcohol and the like may be used in combination as a solubilizing agent.
  • the prepared injection solution is preferably filled in
  • compositions for oral administration include solid or liquid dosage forms, specifically tablets (including dragees and film-coated tablets), pills, granules, powders, capsules (including soft capsules), syrups Agents, emulsions, suspensions and the like.
  • Such a composition is produced by a known method and may contain a carrier, a diluent or an excipient usually used in the pharmaceutical field.
  • a carrier and excipient for tablets for example, lactose, starch, sucrose, and magnesium stearate are used.
  • the above parenteral or oral pharmaceutical composition is conveniently prepared in a dosage unit form suitable for the dose of the active ingredient.
  • dosage form of such a dosage unit include tablets, pills, capsules, injections (ampoules), and suppositories.
  • the medicament of the present invention has low toxicity and can be used as it is as a liquid or as a pharmaceutical composition of an appropriate dosage form for humans or mammals (eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, etc.). It can be administered orally or parenterally (eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.).
  • humans or mammals eg, rats, rabbits, sheep, pigs, cattle, cats, dogs, monkeys, etc.
  • parenterally eg, intravascular administration, subcutaneous administration, etc.
  • Introduction into cells can be performed in vitro, ex vivo or in vivo.
  • the cells When administered via cells, the cells are introduced into appropriate cultured cells or cells collected from the inoculated animal.
  • Examples of the introduction of nucleic acid include calcium phosphate coprecipitation method, lipofection, DEAE dextran method, a method of directly injecting a DNA solution into a tissue by an injection needle or the like, and introduction by a gene gun.
  • the dose varies depending on the disease, patient weight, age, sex, symptoms, administration purpose, administration composition form, administration method, transgene, etc., but it is adjusted appropriately according to the animal to be administered, administration site, administration frequency, etc. It can be determined appropriately by those skilled in the art.
  • the administration route can be appropriately selected.
  • the administration subject is preferably a mammal (including human and non-human mammals). Specifically, non-human primates such as humans and monkeys, rodents such as mice and rats, rabbits, goats, sheep, pigs, cows, dogs, cats, and other mammals are included.
  • the nucleoside analog and the oligonucleotide analog of the present invention were synthesized according to the following synthesis scheme. These syntheses are described in more detail in the examples. In addition, the properties of the synthesized oligonucleotide analogues were measured by experimental examples.
  • Long Type refers to the same STEM left 18 bp, right 10 bp as the original S-TuD (SEQ ID NOS: 1-2), and Short type refers to STEM left 10 bp, right 10 bp. Refers to things.
  • Oligonucleotides were synthesized with an nS-8II synthesizer or an AKTA oligopilot synthesizer.
  • Commercially available pore glassy solid phase support (2'-O-methyl-RNA CPG Link Technologies) and 2'-O-methyl-RNA phosphoramidite with standard protecting groups, ie 5'- O-dimethoxytrityl N6-benzoyladenosine-2'-O-methyl-3'-ON, N'-diisopropyl phosphoramidite, 5'-O-dimethoxytrityl-N4-acetylcytidine-2'-O-methyl -3'-O-N, N'-diisopropylphosphoramidite, 5'-O-dimethoxytrityl-N2-isobutyrylguanosine-2'-O-methyl-3'-O-N, N'-diisopropylphosphoramidite, 5'-O-dimethoxytrityl
  • phosphoramidites were used in acetonitrile (CH 3 CN) at a concentration of 0.1M.
  • CH 3 CN acetonitrile
  • BNA and LNA a 15 minute ligation / reuse time was used.
  • the activator was 5-benzylmercapto-tetrazole (0.25M, manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), and iodine / water / pyridine was used for PO-oxidation.
  • PS-phosphorothioation commercially available sulfurizing reagents for automated oligonucleotide synthesizers (ie, EIDTH, DDTT, PADS, Beucage reagents, etc.) were used with pyridine.
  • Oligonucleotides were purified by reverse phase ion pair HPLC on a Source 15 RPC gel column. Buffers are 5% CH 3 CN, 0.1 M triethylamine acetate buffer (pH 7.0) (buffer A) and 90% CH 3 CN, 0.1 M triethylamine acetate buffer (pH 7.0) (buffer B). there were. Fractions containing the full length oligonucleotide with the dimethoxytrityl group retained at the 5 ′ end were pooled and subjected to the next purification. The oligonucleotide pool was then purified by Source30Q anion pair HPLC.
  • the solution and buffer consisted of 0.6% trifluoroacetic acid (solution A), 20 mM sodium phosphate buffer (pH 7.5) (buffer C) and 2 M sodium chloride (buffer) in 20 mM sodium phosphate buffer. D). After removing the dimethoxytrityl group using solution A, fractions containing the full-length oligonucleotide were pooled, desalted and lyophilized. The compounds were finally analyzed on MALDI-TOF / MS and denaturing polyacrylamide gels.
  • HeLaS3 cells were plated at 1x10 5 cells per well in 6-well plates (1x10 5 cells per well), pLSP-miR199a viral vector after 24 hours ( ⁇ 1x10 4 TU), were introduced in the presence of polybrene 8 [mu] g / ml From 24 hours after the transduction, puromycin (1 ug / ml) was selected. After selection for one week, puromycin was removed from the medium, and HeLaS3-miR199a cells were obtained as HeLaS3 cells carrying the miR-199a reporter.
  • GLOMAX TM Promega
  • Example 1 Structural strengthening test
  • the miRNA inhibitor developed by the present inventors is attracting attention as a nucleic acid that inhibits miRNA activity at low concentrations, but its physical properties after being double-stranded due to its structural characteristics Is not stable. Therefore, in this example, in order to facilitate the stable mass production of S-TuD and the establishment of a physical property test method, a modification that improves the hybridization ability of the double-stranded region is a method for strengthening the double-stranded region.
  • a nucleic acid partially substituted with nucleic acid was used, and miRNA inhibitory activity was compared with conventional S-TuD (FIG. 1A).
  • FIG. 1B shows the result of reversed-phase HPLC analysis with conventional S-TuD.
  • FIG. 1B shows a comparison of S, AS, and double strands analyzed by reverse-phase HPLC (RP-HPLC) analysis of conventional S-TuD (C18 reverse-phase ion-pair HPLC, XBridge column).
  • RP-HPLC reverse-phase HPLC
  • 2′-O-methyl RNA was used for the basic structure of S-TuD, and BNA NC (NMe) was used as a modified nucleic acid.
  • BNA NC NMe
  • the LNA can be used similarly.
  • the structure of the oligonucleotide used is shown in FIGS. 2A and 2B.
  • the synthesized oligonucleotide was used.
  • both the 2'-O-methyl body as in the original S-TuD as shown in FIG. 39-1, FIG. 39-2 and FIG. While some strands remained as single strands, substitution with BNA improved the ability to form double strands.
  • the protocol for miR-199a inhibition assay is as follows.
  • the activity of the target miRNA was measured by taking the ratio of Renilla luciferase (RL) and firefly luciferase (FL).
  • HeLaS3 cells (Landgraf, P. et al. (2007) Cell, 129, 1401-1414) that express miR199a_3p and 5p endogenously only slightly and DMEM containing 10% fetal bovine serum (FBS) Medium was cultured at 37 ° C.
  • HeLaS3 cells were plated at 1x10 5 cells per well in 6-well plates (1x10 5 cells per well), 24 hours after pLSP-miR199a viral vector ( ⁇ 1x104 TU), were introduced in the presence of polybrene 8 [mu] g / ml, Selection was made with puromycin (1 ug / ml) from 24 hours after transduction. After selection for one week, puromycin was removed from the medium, and HeLaS3-miR199a cells were obtained as HeLaS3 cells carrying the miR-199a reporter.
  • FBS fetal bovine serum
  • the miRNA inhibition activity was further improved by modifying the MBS region.
  • the length of the STEM region was the same as the original, and part of the STEM region was replaced with BNA NC (NMe). This indicates that improvement in physical properties has a positive effect on the activity itself.
  • BNA NC NMe
  • STEM region shortened S-TuD having the same activity can be achieved, and the cost can be reduced.
  • Example 2 Replacement with MBS region
  • BNA NC NMe
  • FIGS. 8-1 and 8-2 The results obtained by substituting a part of the MBS region with BNA NC (NMe) for the structure obtained in this example are shown in FIGS. 8-1 and 8-2. As shown in FIG. 8-1 and FIG. 8-2, it was possible to obtain a structure in which the inhibitory activity was improved up to about 10 times compared to the original S-TuD. It was important to insert a part of BNA into the non-seed region of MBS region.
  • the original ( The effect was about 10 times lower than that of Long type (unmodified).
  • S-TuD having a STEM I region shortened to a minimum of 10 mer, in which a part of the STEM region is replaced with BNA further enhances the effect.
  • S-TuD partially substituted with BNA in the miS non-seed region of MBS has the same effect.
  • the stability in serum was improved compared to the conventional S-TuD of the present invention. Therefore, since the S-TuD of the present invention can be provided as a stable pharmaceutical, it is used as a therapeutic agent when miRNA overexpression causes pathogenesis, and of course, as a miRNA-related research reagent. It is expected that it can be utilized.
  • Example 3 STEM region shortening + confirmation of BNA insertion effect in MBS region
  • S-TuD (Structure used) The structure of S-TuD used in this example is shown in FIG. Original sequence of S-TuD199a-3p, (16) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2, (1) 'S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10, (6)' S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6, (17) S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1 (complementary sequence of the seed region into BNA NC (NMe)), (18) S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2 (complementary sequence of non-seed region was converted to BNA NC (NMe)) was used.
  • FIGS. 11-1 and 11-2 The results for individual S-TuD 100 pM and 300 pM are shown in FIGS. 11-1 and 11-2.
  • FIGS. 11A and 11B the effect of BNA modification was examined on the short type.
  • the original and long type Stem-BNA modifications (16) were added for comparison.
  • Short type-BNA unmodified (1) ' the effect of (6)' with BNA modification in the stem part was greatly enhanced.
  • BNA modification at the Seed equivalent site (17) did not enhance the effect.
  • the BNA modification was added to the non-seed equivalent site (18)
  • the effect was further enhanced and became equal to or higher than (16). It was found that the short type has an enhancing effect depending on the BNA modification site in MBS.
  • Example 4 stability in serum
  • stability in serum was confirmed using mouse serum.
  • FIGS. 12 to 13 The structure of the modified S-TuD used is shown in FIGS. 12 to 13 and FIG. That is, the original structure, (16) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2, (23) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2 (non- BNA complementary sequence of seed region NC (NMe) of), (23) - (1 ) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1 (the complementary sequence of the non-seed region BNA NC (NMe)), (23)-(2) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2 (complementary sequence of non-seed region is converted to BNA NC (NMe)) and (23 )-(3) S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2
  • the short type S-TuD was considerably degraded without modification, but showed some nuclease resistance.
  • the Stem part was modified with BNA, complete resistance was obtained. Even if MBS-BNA modification was further added here, no further effect was observed.
  • the BNA NC (NMe) substitution of S-TuD-200c-1_22-pf is improved in serum stability as in the case of S-TuD199a. I was able to confirm.
  • Example 5 Experiment of universality
  • the same kind of experiment was conducted targeting two types of miRNAs.
  • the assay method is the same as in Example 1 except that the construct used in the reporter assay is replaced with miR-200c and miR-21.
  • miR-200c The structure for miR-200c is shown in FIG.
  • the structure for miR-21 is shown in FIG.
  • miR-200c includes (41) S-TuD-200c-1_22-pf, (42) S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6, (43) S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1 ( BNA complementary sequence of seed region NC (NMe) of), (44) S-TuD -200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2 (BNA complementary sequence of the non-seed region NC (NMe) of), (45) S -TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2 (complementary sequence of non-seed region was converted to BNA NC (NMe)) was used.
  • miR-21 includes (51) S-TuD-21-1_17-10mut, (52) S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6, (53) S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1 (54) S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6 and (55) S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1 were used.
  • FIG. 20 shows the results of electrophoresis showing serum resistance.
  • FIGS. 21-1 and 21-2 show the results of the reporter assay.
  • the target miR-199a increased the inhibitory activity by about 10 times
  • the target miR-200c increased by about 2 times.
  • FIGS. FIG. 24 shows an electropherogram after treatment with mouse serum.
  • the main band did not appear in the unmodified long type (51), and smear was observed.
  • the modified S-TuD (52-55) showed a clear main band, confirming the improvement in serum stability. In all the results, it is considered that the band clearly appears at the upper part of the main band is non-specific binding with serum protein.
  • a graph of the reporter assay results with miR-21 is shown in FIGS. 25-1 and 25-2 (miR-21). Compared to S-TuD21 (Original; 51), the stem portion was modified with BNA NC (NMe) (52).
  • both the long type and the short type be modified with BNA NC (NMe) modification in both the Stem part and the non-seed equivalent part of MBS in terms of both effect and stability.
  • BNA NC (NMe) conversion of the stem part is considered desirable.
  • the degree of the effect of BNA NC (NMe) at the non-seed equivalent site of Long type MBS varies greatly depending on the type of miRNA.
  • stem length in vitro results, long type seemed to be slightly more effective than short type.
  • Example 6 In vivo experiment
  • miR-122 inhibitor LNA-ASO
  • PII miR-122 inhibitor
  • the miR-21 inhibitor (LNA-ASO) included in this study has been completed by non-clinical studies and Phase I as a therapeutic agent that suppresses renal fibrosis by Regulus, and is currently progressing to Phase II. From the above, the results of this example should be evaluated as in vivo data indicating that the S-TuD of the present invention can be used as a medicine.
  • Example 7 Comparative test of various cross-linked nucleic acids
  • the S-TuD basic structure is a 10-MBS-10 type with STEM I trimmed to 10 bp (indicated by (5)).
  • As the assay method the same technique as the miR199a luciferase reporter assay used in Example 1 and the like was used.
  • Example 8 STEM region shortening test
  • the same technique as the miR199a luciferase reporter assay used in Example 1 and the like was used.
  • Example 9 Activity correlation test between STEM region shortening and cross-linked nucleic acid substitution
  • the combination of STEM region shortening and cross-linked nucleic acid substitution was performed using the original S-TuD (STEM I18bp STEM II 10bp).
  • the structure of the sequence used is shown in FIG.
  • the assay method the same method as the miR199a luciferase reporter assay shown in Example 1 and the like was used.
  • FIGS. 37-1 and 37-2 The results are shown in FIGS. 37-1 and 37-2.
  • the miRNA inhibitory activity of S-TuD is 1 when the original is 1, S-TuD with BNA substitution in STEM I and II of the original S-TuD is more than 3 times, STEM I is shortened to 10 bp and BNA NC ( NMe) Substituted S-TuD improved activity about 3 times. This indicates that strengthening STEM duplex formation plays a major role in miRNA inhibitory activity of S-TuD.
  • the present invention is useful in the pharmaceutical industry and the reagent industry using nucleic acid drugs and the like.
  • SEQ ID NO: 1 Original sense sequence of FIG. 2A (same for FIG. 4-1)
  • SEQ ID NO: 2 Original antisense sequence of FIG. 2A
  • SEQ ID NO: 3 Sense sequence of FIG. 2A (1)
  • SEQ ID NO: 4 Antisense sequence of FIG. 2A (1)
  • SEQ ID NO: 5 Sense sequence of SEQ ID NO: 2A
  • 6 antisense sequence of FIG. 2A
  • SEQ ID NO: 7 sense sequence of FIG. 2A
  • SEQ ID NO: 8 antisense sequence of FIG. 2A
  • SEQ ID NO: 9 sense sequence of SEQ ID NO: 2A (4)
  • 10 antisense sequence SEQ ID NO: 11 in FIG. 2A (4): sense sequence SEQ ID NO: 12 in FIG.
  • Sense sequence SEQ ID NO: 24 antisense sequence SEQ ID NO: 25 in FIG. 7 (18): Sense sequence SEQ ID NO: 26 in FIG. 7 (23)-(1): Antisense sequence SEQ ID NO: in FIG. 7 (23)-(1) 27: Sense sequence SEQ ID NO: 28 in FIGS. 7 (23)-(2): Antisense sequence SEQ ID NO: 29 in FIGS. 7 (23)-(2): Sense sequence SEQ ID NO: 30 in FIGS. 7 (23)-(3) : Antisense sequence of FIG. 7 (23)-(3) SEQ ID NO: 31: sense sequence of FIG. 10 (1) ′ SEQ ID NO: 32: antisense sequence of FIG. 10 (1) ′ SEQ ID NO: 33: FIG.
  • Sense sequence SEQ ID NO: 46 FIG. 19 (45) antisense sequence SEQ ID NO: 47: FIG. 23 (51) sense sequence SEQ ID NO: 48: FIG. 23 (51) antisense sequence SEQ ID NO: 49: FIG. 23 (52) ) Sense sequence SEQ ID NO: 50: antisense sequence SEQ ID NO: 51 in FIG. 23 (52): sense sequence SEQ ID NO: 52 in FIG. 23 (53): antisense sequence SEQ ID NO: 53 in FIG. 23 (53) ) Sense sequence SEQ ID NO: 54: antisense sequence SEQ ID NO: 5 of FIG. 23 (54) : Sense sequence of Fig. 23 (55) SEQ ID NO: 56: antisense sequence of Fig.
  • SEQ ID NO: 57 sense sequence of S-TuD NC2 (Figs. 18 and 22)
  • SEQ ID NO: 58 S-TuD NC2 (Fig. 18, FIG. 22) antisense sequence
  • Antisense sequence SEQ ID NO: 75: psiCHECK2-T200c-3p-s (sense sequence) in FIG. SEQ ID NO: 76: psiCHECK2-T200c-3p-a (antisense sequence) of FIG. SEQ ID NO: 77: psiCHECK2-T199a-3px3-s of FIG. 17 (sense sequence) SEQ ID NO: 78: psiCHECK2-T199a-3px3-a of FIG. 17 (antisense sequence) SEQ ID NO: 79: psiCHECK2-T21-5p-s (sense sequence) in FIG. SEQ ID NO: 80: psiCHECK2-T21-5p-a (antisense sequence) of FIG.

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Abstract

本発明は、ｍｉＲＮＡ阻害剤（合成Ｔｏｕｇｈ　Ｄｅｃｏｙ，　Ｓ－ＴｕＤ）の改良に関する。本発明は、ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体を提供する。

Description

構造強化されたｍｉＲＮＡ阻害剤Ｓ－ＴｕＤ
　本発明は、構造強化されたｍｉＲＮＡ阻害剤に関する。
　マイクロRNA（miRNA）は内在性に発現される小さな（約20～24ヌクレオチド）調節性の非コードRNAであって、RNA誘導サイレンシング複合体（RNA-induced　silencing　complex;RISC）の成分として転写後レベルで数多くの標的遺伝子の発現を調節している。あるmiRNAとmRNA中にあるその標的配列とが完全に相補的である場合は、miRNAはそのmRNAの切断を誘導し、mRNAレベルの急速な減少を引き起こす。
　さらに最近本発明者らの一部は、miRNAを効率的に阻害するためのmiRNA阻害体、該阻害体を細胞内で発現させるためのベクター、該ベクターの構築方法、および該阻害体またはベクターを利用したmiRNAの阻害方法を開発した（特許第4936343号公報＝特許文献１）。
特許第4936343号公報
　従来の特許文献１に記載されるｍｉＲＮＡ阻害剤（合成Ｔｏｕｇｈ　Ｄｅｃｏｙ，　Ｓ－ＴｕＤ）は低濃度でｍｉＲＮＡの活性を阻害する核酸として注目されているが、その構造の特性上２本鎖化した後の物性には改良の余地がある。本発明者らは、鋭意工夫することにより、２本鎖を強固にする方法として２本鎖領域をハイブリダイゼーション能力が向上する修飾核酸に部分置換する方法を採用することにより、Ｓ－ＴｕＤの安定的な大量生産及び物性試験法を確立し本発明を完成させた。
　したがって、本発明は以下を提供する。
（１）ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体。
（２）前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡを含む、項目１に記載の複合体。
（３）前記ＢＮＡは
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000001
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０～２の整数であり、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｎは、１～３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、項目１～２のいずれか一項に記載の複合体。
（４）前記ＢＮＡは、
（式中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０～２の整数であり、ｎは、１～３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、項目１～３のいずれか一項に記載の複合体。
（５）前記ＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000003
または２’，４’メタノ架橋核酸（ＬＮＡ）を含む、項目１～４のいずれか一項に記載の複合体。
（６）前記ＢＮＡはＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）である、項目１～５のいずれか一項に記載の複合体。
（７）前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記ｍｉＲＮＡ結合配列の相補鎖の少なくとも一つの鎖に含まれる、項目１～６のいずれか一項に記載の複合体。
（８）前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる、項目１～７のいずれか一項に記載の複合体。
（９）前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる、項目１～８のいずれか一項に記載の複合体。
（１０）前記ＢＮＡは２つ以上含まれる、項目１～９のいずれか一項に記載の複合体。
（１１）前記ＢＮＡは４つ以上含まれる、項目１～１０のいずれか一項に記載の複合体。
（１２）前記ＢＮＡは６つ以上含まれる、項目１～１１のいずれか一項に記載の複合体。
（１３）前記複合体は、前記二本鎖構造を２つ以上含み、該二本鎖構造の第１の二本鎖構造の片端の２つの鎖にｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該２つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該２つ以上の二本鎖構造の第２の二本鎖構造の２つの鎖にそれぞれ結合している、項目１～１２のいずれか一項に記載の複合体。
（１４）前記ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している、項目１～１３のいずれか一項に記載の複合体。
（１５）前記リンカーの長さは１～５塩基長である、項目１４に記載の複合体。
（１６）前記二本鎖の構造は、少なくとも６塩基長である、項目１～１５のいずれか一項に記載の複合体。
（１７）前記二本鎖の構造は、少なくとも８塩基長である、項目１～１６のいずれか一項に記載の複合体。
（１８）前記二本鎖の構造は、少なくとも１０塩基長である、項目１～１７のいずれか一項に記載の複合体。
（１９）前記二本鎖の構造は、少なくとも１５塩基長である、項目１～１８のいずれか一項に記載の複合体。
（２０）前記二本鎖の構造は、少なくとも１８塩基長である、項目１～１９のいずれか一項に記載の複合体。
（２１）前記二本鎖の構造は、５０塩基長以下である、項目１～２０のいずれか一項に記載の複合体。
（２２）２から５つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、項目１～２１のいずれか一項に記載の複合体。
（２３）２つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、項目１～２２のいずれか一項に記載の複合体。
（２４）項目１～２３のいずれか一項に記載の複合体であって、以下
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000004
に示された構造を含み、該構造のＩおよびＩＩは二本鎖構造であって、該構造のａおよびｂにそれぞれ１つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む複合体。
（２４Ａ）前記二本鎖構造は各鎖の端部が互いに結合し一本鎖核酸の形態である、項目１～２４のいずれか一項に記載の複合体。
（２４Ｂ）直鎖状一本鎖RNAまたはその類縁体から構成される、項目１～２４または２４Ａのいずれか一項に記載の複合体。
（２４Ｃ）前記複合体は、前記二本鎖構造の片端の2つの鎖に、miRNA結合配列を含む２つの鎖の末端が、それぞれ１～５塩基のリンカーを介して１本ずつ結合しており、二本鎖または四本鎖から選択される第２の多重鎖構造を含み、該二本鎖構造と該第２の多重鎖構造とに挟まれるように、該miRNA結合配列を含む２つの鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の片端の2つの鎖に、それぞれ１～５塩基のリンカーを介して結合している、項目１～２４、２４Ａまたは２４Ｂのいずれか一項に記載の複合体。
miRNA阻害複合体であって、該miRNA結合配列を含む２つの鎖は、それぞれの鎖がmiRNA結合配列を含み、miRNA結合配列を含む鎖が２つあるものである
（２４Ｄ）前記ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖は、それぞれの鎖がｍｉＲＮＡ結合配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖が２つある、項目１～２４、２４Ａ、２４Ｂまたは２４Ｃのいずれか一項に記載の複合体。
（２５）項目１～２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体を構成するＲＮＡまたはその類縁体。
（２６）項目１～２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体または項目２５に記載のＲＮＡまたはその類縁体を製造する方法であって、
　Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；
　Ｂ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程；ならびに
　必要に応じてＣ）脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程
を包含する方法。
（２７）項目１～２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体を含む医薬。
（２７Ａ）医薬として使用するための、項目１～２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体。
（２７Ｂ）項目１～２４、２４Ａ、２４Ｂ、２４Ｃまたは２４Ｄのいずれか一項に記載の複合体をそれを必要とする被験者に投与する工程を包含する、疾患または障害の治療または予防の方法。
　なお上記の各項において、同一の項を引用する各項に記載の発明の２つまたはそれ以上を任意に組み合わせた発明は、それらに引用される上位の項に記載の発明において、既に意図されている。また、本明細書に記載した任意の発明要素およびその任意の組み合わせは、本明細書において意図されている。また、それらの発明において、本明細書に記載の任意の要素またはその任意の組み合わせを除外した発明も、本明細書に意図されている。また本明細書は、明細書中に例えば好ましいとしてある特定の態様を記載した場合、それを開示するのみならず、その態様を含むより上位の本明細書に開示された発明から、その態様を除外した発明も開示するものである。
　本発明の改良型Ｓ－ＴｕＤは、そのｍｉＲＮＡ阻害活性が従来型のＳ－ＴｕＤに比べて、安定しており予想外にも精製せず医薬品グレードに不純物が減少していることが見出された。２本鎖を強固にすることで、活性が同等なＳＴＥＭ領域短鎖化Ｓ－ＴｕＤとしてコストダウンが可能になる。また、本発明の改良型Ｓ－ＴｕＤは、従来型のＳ－ＴｕＤに比べて生物学的活性も顕著に改善していた。
図１Ａは従来型Ｓ－ＴｕＤおよび本発明の部分置換型Ｓ－ＴｕＤの模式図を示す。 図１Ｂは、従来型S-TuDの逆相HPLC（RP-HPLC）分析（C18の逆相イオン対HPLC、XBridgeカラムのもの）により分析したS鎖、AS鎖、2本鎖の比較を示す。 図２Ａは用いたオリゴヌクレオチドの構造を示す。最上段はオリジナルオリゴヌクレオチドを示し、二段目以降が修飾オリゴヌクレオチドである。上から(1)C,U　:　2'-F-C,　2'-F-U、(2)T　:　BNA-T（片側の鎖に４か所ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）のTを入れたもの）、(3)T　:　BNA-T（両方の鎖に２か所ずつＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）のTを入れたもの）、(4)T　:　BNA-T　A　:BNA-A（両方の鎖に４か所ずつＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）のTおよびAを対合するように入れたもの）、(5)T　:　BNA-T　A　:BNA-A（10塩基）（（４）をステムIについて１０ｂｐまで短縮したもの）を示す。本明細書において用いた配列は、特に示していない場合は２’－ＯＣＨ３（２’－ＯＭｅ）体を示す。フルオロ体（２’－F体）は、二重下線で表す。LNAは、存在する場合は斜体二重下線で示す。修飾核酸（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））は小文字で示す。ホスホロチオエート構造は下線で示す。以下同様である。 図２Ｂは用いたオリゴヌクレオチドの構造を示す。示される配列は以下のとおりである：(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4；(2)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT6；(3)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT4；(4)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT6；(5)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT4。 図３は、psiCHECK2-UT（上）およびpsiCHECK2-miRT（下）の構造を示す。 図４－１は、使用したオリゴの構造を示す。 図４－２は、図４－１のオリゴのmiR-199a-3pレポーターアッセイの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。 図５は、各種修飾S-TuD199a-3pの濃度依存性を示す。細胞はHeLaS3-miR199aを用いた。 図６は、MBS領域への置換実験において、使用されたS-TuD（S-TuD199a-3p）の構造を示す。上段はオリジナルのS-TuD199a-3p-1_18-pfの構造を示す。2段目からは本発明の修飾S-TuDである(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(22)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(24)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-3-MBSB2　(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。修飾核酸（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））は小文字で示す。 図７は、MBS領域への置換実験において、使用されたS-TuDの構造を示す。上から順番に、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。下線は、ホスホロチオエート構造を示す。 図８－１および図８－２は、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果を示す。図８－１および図８－２に示されるように、オリジナルのS-TuDに比較し３倍以上の阻害活性向上が見られる構造体を得ることができた。MBS領域の非シード領域にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を一部挿入することが重要であった。 図８－１および図８－２は、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果を示す。図８－１および図８－２に示されるように、オリジナルのS-TuDに比較し３倍以上の阻害活性向上が見られる構造体を得ることができた。MBS領域の非シード領域にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を一部挿入することが重要であった。 図９は、Short　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合（18）の結果を、濃度依存性試験を行った結果を示す。ひし形は、S-TuD　NC2（配列番号５７および５８）を示し、四角はオリジナルを示し、三角は(18)を示す。Short　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合（18）はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の全くないオリジナル(Long　type非修飾）の8倍弱程度効果が高かった。 図１０は、STEM領域短鎖化＋MBS領域へのＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）挿入効果確認実験において使用したS-TuDの構造を示す。上段にS-TuD199a-3pのオリジナル構造を示す。2段目以降は、それぞれ、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。 図１１－１および図１１－２は、個々のS-TuD　100ｐMおよび300ｐMでの結果（3xT199a-3p/UT(%)）を示す。図１１－１は、100ｐＭでの結果での結果を示す。Short　typeについてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の影響を検討した。オリジナルタイプとLong　typeのStem-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾(16)を比較に加えた。Short　type-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾無(1)’と比べて、stem部分にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れた(6)’は大きく効果が増強した。さらにSeed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(17)は効果を増強しなかった。しかし非seed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(18)はさらに効果が増強し、(16)と同等以上になった。Short　typeにおいてはMBS内のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾部位によっては増強効果があることが分かった。 図１１－１および図１１－２は、個々のS-TuD　100ｐMおよび300ｐMでの結果（3xT199a-3p/UT(%)）を示す。図１１－２は、300ｐＭでの結果を示す。Short　typeについてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の影響を検討した。オリジナルタイプとLong　typeのStem-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾(16)を比較に加えた。Short　type-ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾無(1)’と比べて、stem部分にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れた(6)’は大きく効果が増強した。さらにSeed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(17)は効果を増強しなかった。しかし非seed相当部位にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾をいれた(18)はさらに効果が増強し、(16)と同等以上になった。Short　typeにおいてはMBS内のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾部位によっては増強効果があることが分かった。 図１２は、血清中の安定性実験において使用した修飾S-TuDの構造を示す。上段はオリジナル構造である。2段目からはそれぞれ、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。 図１３は、血清中の安定性実験において使用した修飾S-TuDの構造を示す。上から、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。 図１４は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。0h、48h、72h、96hは37℃マウス血清中で処理した時間を示す。上段左からオリジナル構造、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、を示し、下段は左から(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。 図１５は、電気泳動図を示す。上段左から(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6を示し、下段左から(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。 図１６は、実施例で使用したルシフェラーゼレポーターベクターの模式図を示す。 図１７は、ルシフェラーゼレポーターベクターで使用されたpsiCHECK2-T200c-3p-s、psiCHECK2-T200c-3p-a、psiCHECK2-T199a-3px3-s、psiCHECK2-T199a-3px3-a、psiCHECK2-T21-5p-s、psiCHECK2-T21-5p-aの配列情報を示す。これらの配列（配列番号７５～８０）はいずれも修飾のないDNAである。 図１８は、実施例で使用されたS-TuD-NC2の配列を示す。 図１９は、普遍性の確認実験で使用したmiR-200cのS-TuD構造を示す。上からそれぞれ、(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。 図２０は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。0h、24h、48h、72hは37℃マウス血清中で処理した時間を示す。左から、(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2、(46)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6を示し、数字はそれぞれ時間を示す。 図２１－１および図２１－２は、miR-200cでmiR199a-3pと同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２１－１は３ｐMの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。 図２１－１および図２１－２は、miR-200cでmiR199a-3pと同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２１－２は１０ｐＭの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。 図２２は、miR-200cで同様のレポーターアッセイの濃度依存性を示した結果である。ひし形は、S-TuD　NC2を示し、四角はオリジナルを示し、三角は(45)を示す。Short　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合(45)はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の全くないoriginal（41）の2倍弱程度効果が高かった。0.1-10pMの投与では、S-TuDがチューブに非特異的に吸着する可能性も考え、担体としてS-TuD　NC2を30pM添加したものも解析したが、添加の効果は見られなかった。 図２３は、普遍性の確認実験で使用したmiR-21のS-TuD構造を示す。上からそれぞれ、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(52)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1、(54)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6、(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を示す。 図２４は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。0h、24h、48h、72hは37℃マウス血清中で処理した時間を示す。左から、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(52)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1、(54)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6、(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を示し、数字はそれぞれ時間を示す。 図２５－１および図２５－２は、miR-21で同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２５－１は100ｐＭの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。 図２５－１および図２５－２は、miR-21で同様のレポーターアッセイを行った結果を示す。図２５－２は300ｐＭの結果を示す。バーはコントロールレポーター活性とmiR-199a-3pレポーター阻害活性の比を示す。S-TuDの阻害効果が高いほどバーは高くなる。 図２６は、miR-21で同様のレポーターアッセイの濃度依存性を示した結果である。Original　51番（四角）と比較してstem部分およびMBS部分をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した53番（三角）では10倍近く効果が増大していた。Short　typeにおいてもMBS部分を修飾した55番（×）はOriginal　51番と比較して３倍以上効果が増大していたが、long　type53番と比較すると2/3倍程度であった。ひし形はコントロールを示す。 図２７は、インビボ実験で使用したS-TuDの構造を示す。上から、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、（53）S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1および(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を示す。 図２８は、腎臓でのmiR-21量をRT-PCR法で測定した結果を示す。マウスへ各S-TuDを1mg/kgで眼窩静脈に投与して（ｎ＝３）、24hr後に腎臓を採取し、RT-PCR法で(S-TuDと結合していないと考えられるフリーの）miR-21量を定量した。左からPBS、51、53および55の修飾S-TuDを使用した結果を示す。 図２９は、マウス三匹の腎臓内のmiR-21の平均値を示す。miR-21量が最も少ないのが５３、それに５５が続く。original　S-TuDではほとんどmiR-21の減少が見られないが、５３、および程度はやや落ちるものの５５でも、低下が検出される。 図３０は、本発明のｍｉＲＮＡ阻害複合体の典型的構造を示し、ここでは、MBSを含む２本のRNA鎖が、２つの二本鎖構造に挟まれるように、２つの二本鎖構造の各鎖にそれぞれ結合している形態が示される。 図３１もまた、本発明のｍｉＲＮＡ阻害複合体の典型的構造を示し、ここでは、典型例として、＃１２～＃１６が示される。ここでは、MBSを含む２本のRNA鎖は、二本鎖構造の対合しているそれぞれの鎖に結合しているので、RNA鎖の方向は互いに反対方向となっている。 図３２は、実施例７で使用した配列例を示す。使用した配列は、上段から、オリジナル、（５）S-Tud199a-3p-1_18-pf-U4BNA_SI-8；(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(2)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT8；(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6；(7)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-LT6；(8)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT12を示す。 図３３－１および図３３－２は、実施例７のアッセイ結果を示す。図３３－１の８サンプルは１００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２～８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。 図３３－１および図３３－２は、実施例７のアッセイ結果を示す。図３３－２の８サンプルは３００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２～８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。 図３４は、実施例８で使用した配列例を示す。上段からオリジナル、（6）’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4；(2)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT6；(3)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT4；(4)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT6；(5)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT4を示す。 図３５－１および図３５－２は、実施例８のアッセイ結果を示す。図３５－１の８サンプルは１ｎＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２～８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。 図３５－１および図３５－２は、実施例８のアッセイ結果を示す。図３５－２の８サンプルは３ｎＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２～８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。 図３６は、実施例９で使用した配列例を示す。上段からオリジナル、（４）S-TUD-miR-199a-1_18-pf＿U4BNA-ds；(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(2)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT8；(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4を示す。 図３７－１および図３７－２は、実施例９のアッセイ結果を示す。図３７－１の８サンプルは１００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２～８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。 図３７－１および図３７－２は、実施例９のアッセイ結果を示す。図３７－２の８サンプルは３００ｐＭでの結果を示す。それぞれの左端はコントロールであり、左から２～８番目はそれぞれのサンプルの結果を示す。 図３８は、STEM領域の一部塩基を2本鎖形成能が上昇するタイプのヌクレオチド種（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））に変更し、物性評価を実施した結果（ＨＰＬＣ純度分析）を示す。上段はオリジナルのものであり、下段は、本発明の（１）’で行った結果を示す。 図３９－１および図３９－２は、STEM　I領域を10bpまで削った場合は、オリジナルなS-TuDと同様の2’-O-メチル体のみの場合の2本鎖形成能を示す。図３９－１は、上からそれぞれ（１）、（２）”の結果を示す。 図３９－１および図３９－２は、STEM　I領域を10bpまで削った場合は、オリジナルなS-TuDと同様の2’-O-メチル体のみの場合の2本鎖形成能を示す。図３９－２は、上からそれぞれ（１）”、（３）”の結果を示す。 図４０は図３９－１および図３９－２の続きであり、上からそれぞれ（４）”、（５）”の結果を示す。
　以下、本発明を説明する。本明細書の全体にわたり、単数形の表現は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。従って、単数形の冠詞（例えば、英語の場合は「a」、「an」、「the」など）は、特に言及しない限り、その複数形の概念をも含むことが理解されるべきである。また、本明細書において使用される用語は、特に言及しない限り、当該分野で通常用いられる意味で用いられることが理解されるべきである。したがって、他に定義されない限り、本明細書中で使用されるすべての専門用語および科学技術用語は、本発明の属する分野の当業者によって一般的に理解されるのと同じ意味を有する。矛盾する場合、本明細書（定義を含めて）が優先する。
　（miRNA阻害複合体）
　本発明は、miRNAを効率的かつ特異的に阻害することができるmiRNA阻害複合体の改良型に関する。本発明のmiRNA阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびmiRNA結合配列（MBS）を含み、ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の2つの鎖に（通常、それぞれ一本ずつ）結合しており、そのうえで、ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含むことを特徴とするものである。本発明の阻害複合体は「S-TuD」と称することもある。なお本発明においては、この二本鎖構造を「第一の」二本鎖構造と呼ぶことで、本発明の複合体に含まれ得るさらなる二本鎖構造と区別できるようにすることがある。本発明の複合体は、一本鎖（すなわち共有結合で結合した１分子）であってもなくてもよく、例えば一本鎖、二本鎖、またはそれ以上の複数の鎖で構成されていてよい。例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、MBSを含むRNA鎖が、それぞれ一本ずつ結合した、二本鎖RNAからなる複合体は、複合体中に少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ、例えば、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））を含む限り、本発明に含まれる。また、例えば二本鎖構造の片端の2つの鎖に、少なくとも1つのMBSを含む一本のRNA鎖が結合していてもよい。この場合、MBSを含むRNA鎖により、二本鎖構造の片端の2つの鎖はつながれることになる。二本鎖構造の2つの鎖をつなぐRNAには、MBSが少なくとも１つ含まれているが、例えば2つ、3つ、またはそれ以上含まれていてもよい。二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンを含む。すなわち、二本鎖構造は、ステムループまたはヘアピンに含まれる二本鎖構造であってもよい。
　また、本発明において「seed領域」とはmiRNAの配列のうち、miRNAの活性に必要な5’末端から2-8塩基程度の領域を指し、「stem領域」とは二本鎖構造の領域を指す。「original（オリジナル）」とは、従来型の「All　2'－OMe　RNAタイプ」、すなわちすべて2'－OMe　RNAで構成されるタイプを指し、特許文献１等に記載されるものが例示される。
　本発明においてmiRNA阻害複合体は、二本鎖構造を持つ、少なくとも1本のRNAまたはその類縁体を含む構造体であってよい。該複合体は、好ましくはRNAまたはその類縁体を含む分子を1分子または2分子含む。
　本発明において「miRNA結合配列（MBS）」とは、miRNAに結合する配列を言う。MBSは、miRNAに結合できるように、miRNAに相補的な部分を少なくとも含んでいる。特許文献１に示す通り、MBSは、miRNAに完全に相補的な配列であってもなくてもよい。例えばMBSは、miRNAが標的とする天然のRNAの配列であってもよい。MBSは、例えばmiRNAに対して、少なくとも10塩基、例えば11塩基以上、12塩基以上、13塩基以上、14塩基以上、15塩基以上、16塩基以上、17塩基以上、18塩基以上、19塩基以上、20塩基以上、21塩基以上、22塩基以上、23塩基以上、または24塩基以上の相補的な塩基を連続または非連続に含む。好ましくは、該相補的な塩基は連続しているか、あるいは3箇所以下、2箇所以下、好ましくは1箇所のギャップを有する。ギャップは、MBS側および/またはmiRNA側の不対合（バルジ）であってよく、１箇所のギャップについても、片方の鎖のみにバルジ塩基があるものであってもよく、両方の鎖に不対合の塩基を有していてもよい。好ましくは、少なくともMBS側に不対合塩基を含むように設計する。バルジおよびミスマッチの塩基数は、それぞれ１箇所のバルジおよびミスマッチあたり、片鎖あたり例えば6塩基以下、好ましくは5塩基以下、4塩基以下、3塩基以下、2塩基以下、または1塩基である。本発明において、バルジを形成し得るMBSは、完全に相補的な配列からなるMBSよりも高いmiRNA阻害効果を示した（特許文献１）。従って、より高いmiRNA阻害効果を得るためには、バルジを形成するようにMBSを設計することが好ましい。例えば、MBSの3’末端から10番目および/または11番目の塩基が、miRNAと相補的になっていないか、あるいは10番目と11番目の間に余計な塩基を含むMBS（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5’末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSと相補的な塩基となっていないか、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むMBS）は、分解を受けにくく、高い活性が期待できる。この場合、例えばmiRNAの5’末端から10番目および11番目を含む塩基が不対合となるようにMBSを設計してもよく、例えば9～11番目、10～12番目、または9～12番目が不対合となるようにMBSを設計してもよい。また、miRNA側には不対合となる塩基はないが、MBS側に、3’末端から10番目と11番目の間（あるいは、miRNA中の標的配列（MBSとハイブリダイズする配列）の5’末端から10番目および11番目に相当する部位の間）に不対合となる塩基を有していてもよい。不対合となる塩基は、miRNA側および/またはMBS側に存在してよいが、好ましくは少なくともMBS側に存在する。各鎖で不対合になるヌクレオチドの数は適宜調整することができるが、例えば1～6ヌクレオチドであり、好ましくは1～5ヌクレオチドであり、より好ましくは3～5、例えば3、4または5ヌクレオチドである。
　また、miRNAのターゲットの認識には、miRNAの5’端から2～7番目あるいは3～8番目の塩基（seed領域と呼ばれる）がマッチすることが重要であることが知られている（Jackson　AL　et　al.,　RNA　12(7):1179-1187,　2006;　Lewis　BP　et　al.,　Cell　120:　15-20,　2005;　Brennecke　et　al.　PLoS　BIOLOGY　3,　0404-0418,　2005;　Lewis　et　al.　Cell　115,　787-798,2003;　Kiriakidou　et　al.　Genes　&　Development　18,　1165-1178,　2004）。実際、本発明のmiRNA阻害RNAは、seed領域しかマッチしておらず、他の領域とは低い相補性しか有さないMBSを持つものであっても、miRNAを効果的に阻害できることが示された（特許文献１）。本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5’端から2～7番目および/または3～8番目の塩基）が完全に相補的であるものが好ましい。この場合、G:U対（U:G対）も相補的とみなしてよいが、好ましくはG:C（C:G）およびA:U（U:A）のみを相補的とみなす。また本発明におけるMBSとしては、miRNAのseed領域（miRNAの5’端から2～7番目および/または3～8番目の塩基）が完全に相補的であって、miRNAに対して、少なくとも8塩基、より好ましくは9塩基、より好ましくは10塩基の相補的な塩基を連続して含むものが好ましい。さらに本発明におけるMBSは、miRNAに対して、合計11塩基以上、より好ましくは12塩基以上、より好ましくは13塩基以上の相補的な塩基を含むことが好ましい。
　MBSは、好ましくは、miRNA配列と生理的条件下でハイブリダイズする配列である。生理的条件下とは、例えば150　mM　NaCl、15　mM　クエン酸ナトリウム、pH　7.0、37℃である。より好ましくは、MBSは、miRNA配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズする配列である。ストリンジェントな条件とは、例えば1×SSC（1×SSCは150　mM　NaCl、15　mM　クエン酸ナトリウム、pH　7.0）または0.5×SSC、42℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、45℃の条件であり、より好ましくは1×SSCまたは0.5×SSC、50℃の条件である。ハイブリダイゼーションにおいては、例えばmiRNA配列を含むRNAまたはMBSを含むRNAのどちらかを標識し、他方を膜に固定して、両者をハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの条件は、例えば5xSSC、7%(W/V)SDS、100μg/ml変性サケ精子DNA、5xデンハルト液（１xデンハルト溶液は0.2%ポリビニールピロリドン、0.2%牛血清アルブミン、及び0.2%フィコールを含む）を含む溶液中、例えば37℃、または45℃、または50℃で行えばよい。十分な時間（例えば3、4、5または6時間以上）インキュベートした後、上記の条件で洗浄を行い、標識した核酸がハイブリダイズしているかを検出することにより、当該条件で核酸がハイブリダイズするか否かを決定することができる。
　あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列と高いホモロジーを示す。高いホモロジーとは、例えば70%以上、75%以上、76%以上、77%以上、78%以上、79%以上、80%以上、81%以上、82%以上、83%以上、84%以上、85%以上、86%以上、87%以上、88%以上、89%以上、90%以上、93%以上、95%以上、96%以上、97%以上、98%以上、または99%以上の同一性を有する塩基配列である。塩基配列の同一性は、例えばBLASTプログラム（Altschul,　S.F.　et　al.,　J.　Mol.　Biol.　215:　403-410,　1990）を用いて決定することができる。例えばNCBI（National　Center　for　Biotechnology　Information）のBLASTのウェブページにおいて、デフォルトのパラメータを用いて検索を行うことができる（Altschul　S.F.　et　al.,　Nature　Genet.　3:266-272,　1993;　Madden,　T.L.　et　al.,　Meth.　Enzymol.　266:131-141,　1996;　Altschul　S.F.　et　al.,　Nucleic　Acids　Res.　25:3389-3402,　1997;　Zhang　J.　&　Madden　T.L.,　Genome　Res.　7:649-656,　1997）。例えば２つの配列の比較を行うblast2sequencesプログラム（Tatiana　A　et　al.,　FEMS　Microbiol　Lett.　174:247-250,　1999）により、２配列のアライメントを作成し、配列の同一性を決定することができる。miRNA配列の塩基配列の外側のギャップは無視し、内側のギャップは例えばミスマッチと同様に扱い、アライメントにおけるmiRNA配列の塩基配列全体（配列の内側に入れたギャップを加算したトータルの塩基の長さ）に対する同一性の値を計算する。但し、特許文献１に示した通り、MBSとmiRNAとのミスマッチはmiRNAの阻害活性を上昇させ得る。従って、例えばアライメントの内側においてmiRNA配列に挿入したギャップは無視して同一性を算出することが好ましい。
　あるいはMBSは、好ましくは、miRNA配列の相補配列に対して、1または数個の塩基を挿入、置換、および/または欠失させた配列からなる。好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入、置換、および/または欠失を有する配列からなる。より好ましくは、MBSは、miRNA配列の相補配列に対して8塩基以内、7塩基以内、6塩基以内、5塩基以内、4塩基以内、3塩基以内、2塩基以内、または1塩基の挿入を有する配列からなる。本発明において、MBSは、miRNA配列と完全に相補的な配列よりも、ミスマッチを有する配列の方がmiRNAの阻害活性が高いことが示された。これはMBSが完全に相補的であると、miRNAを含むRISCにより切断を受け、それによりmiRNA阻害RNAの発現レベルが低下することに起因すると考えられる。特に、MBSがmiRNAとハイブリダイズしたときに、MBSの3’末端から10番目および/または11番目の塩基が不対合となる（あるいは、MBSとハイブリダイズするmiRNA側の標的配列の5’末端から10番目および/または11番目の塩基がMBSとハイブリダイズさせたときに不対合となる）か、あるいは10番目と11番目のヌクレオチドの間に不対合の塩基を含むように設計したMBSは高い活性が期待できる。このような不対合は、例えばMBS側のバルジであってよく、バルジを形成する塩基は1～6塩基、好ましくは1～5塩基、より好ましくは3～5塩基（例えば3、4または5塩基）である。MBSは、RNAからなっていてもよく、あるいは核酸類塩体を含んだり、または核酸類塩体からなっていてもよい。特にMBSの切断される部位（MBSの3’末端から10番目および/または11番目の塩基等）を、切断が起こらないように核酸類塩体することで、miRNA阻害効果の上昇が期待できる。また、ホスホチオエートや2"-O-メチルなどのバックボーンや糖を有する核酸を用いることも好適である（Krutzfeldt,　J.　et　al.,　Nucleic　Acids　Res.　35:　2885-2892;　Davis,　S.　et　al.,　2006,　Nucleic　Acids　Res.　34:　2294-2304）。
　本発明のmiRNA阻害複合体が標的とするmiRNAに特に制限はない。miRNA構造をとるものであれば、植物、線虫、脊椎動物等のいかなる種由来のものにも適用可能である。miRNAの配列は、ヒト、マウス、ニワトリ、ゼブラフィシュ、シロイヌナズナをはじめとする数多くの生物において、非常に多数が知られている（miRBase::Sequencesのウェブページを参照：microrna.sanger.ac.uk/sequences/）。例えば、マウス、ラット、ヤギ等の含む哺乳動物、サルを含む霊長類、およびヒトのmiRNAを標的とすることができる。例えば、miR21（Lagos-Quintana　M　et　al.,　Science.　294:853-858,　2001;　Mourelatos　Z　et　al.,　Genes　Dev.　16:720-728,　2002;　Michael　MZ　et　al.,　Mol　Cancer　Res.　1:882-891,　2003;　Dostie　J　et　al.　RNA.　9:180-186,　2003）、miR140（Lagos-Quintana　M　et　al.,　Curr　Biol.　12:735-739,　2002;　Cai　X　et　al.,　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　102:5570-5575,　2005）、miR1995（Lagos-Quintana　M　et　al.,　RNA.　9:175-179,　2003;　Landgraf　P　et　al.,　Cell.　129:1401-1414,　2007）、miR16（Lagos-Quintana　M　et　al.,　Science.　294:853-858,　2001;　Mourelatos　Z　et　al.,　Genes　Dev.　16:720-728,　2002;　Lim　LP　et　al.,　Science.　299:1540,　2003;　Calin　GA　et　al.,　Proc　Natl　Acad　Sci　U　S　A.　99:15524-15529,　2002;　Michael　MZ　et　al.,　Mol　Cancer　Res.　1:882-891,　2003）、miR497（Bentwich　I　et　al.,　Nat　Genet.　37:　766-770,　2005;　Landgraf　P　et　al.,　Cell.　129:1401-1414,　2007）等が例示できるが、これらに限定されない。
　１つの実施形態では、本発明のmiRNA阻害複合体は、第１の二本鎖構造に加え第２の二本鎖構造をさらに含み、第１の二本鎖構造の一端にある２つの鎖に、MBSを含むRNA鎖がそれぞれ１本ずつ結合する構造となっており、第１の二本鎖構造と第２の二本鎖構造の間に挟まれるように、該RNA鎖のそれぞれの他端が、該第２の二本鎖構造の一端にある2つの鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体に関する。二本鎖構造は2本鎖であってもよく、あるいはG-quadruplex（G-クアドルプレックス）のような4本鎖であってもよい。例えば本発明は、第１の二本鎖構造に加え第２の二本鎖構造をさらに含み、第１の二本鎖構造においてMBSが結合している方の末端の２つの鎖は、MBSを含むRNA鎖がそれぞれ１本ずつ結合する構造となっており、第１の二本鎖構造と第２の二本鎖構造の間に挟まれるように、該RNA鎖のそれぞれの他端が、該第２の二本鎖構造の2つの鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体に関する。当該RNA複合体は、例えば少なくとも２つの二本鎖構造を有し、該２つの二本鎖構造を構成する4つのRNA鎖のそれぞれが、残る3つのいずれの鎖も介することなく、MBSを含むRNAに結合している構造を有している。このようなmiRNA阻害複合体をより分かりやすく言えば、MBSを含む２本のRNA鎖が、２つの二本鎖構造に挟まれるように、２つの二本鎖構造の各鎖にそれぞれ結合しているmiRNA阻害複合体である（図３０）。すなわち図３０の構造を持つRNA複合体であって、二本鎖構造IおよびIIにRNA鎖aおよびbが挟まれており、該aおよびbにそれぞれ１つ以上のMBSを含むRNAは、本発明に含まれる。MBSを含む２本のRNA鎖は、二本鎖構造の対合しているそれぞれの鎖に結合しているので、RNA鎖の方向は互いに反対方向となる（図３１、#12～#16）。このように二本鎖の各鎖にそれぞれMBSを付加することにより、より高いmiRNA阻害活性を発揮させることが可能となる。
　２つの二本鎖構造に挟まれるように存在するMBSを含む2本のRNA鎖には、それぞれ１つ以上のMBSが含まれている。それらのMBSは同じ配列であってもよく、違っていてもよい。また同じmiRNAを標的とするものであってもよく、異なる標的miRNAに結合する配列であってもよい。例えば、１つの鎖に2つ以上、例えば2、3、4、または5個のMBSが含まれていてよい（図３１、#12～#16）。例えば、2つの二本鎖構造に挟まれた各鎖に1つまたは2つのMBSを含んでよい。例えば、本発明のmiRNA阻害複合体は、トータルで2つのMBSを含むものであってよく、それら2つのMBSは、同一の配列、または同一のmiRNAに結合する配列であってよい。
　本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる二本鎖の対合するそれぞれの鎖は、通常、上述の通り別々のRNA分子であるが、二本鎖の一方または両方の末端がつながっており、直鎖状または環状となっていてもよい。なお直鎖状とは環状に対する言葉であって、末端を有していることを意味するに過ぎず、当然のことながら、二次構造を形成していないことを意味するものではない。直鎖状一本鎖RNAにより構成されるmiRNA阻害複合体は、例えば一回のRNA合成により作製し得る。例えば、２つの二本鎖構造を含む場合、第２の二本鎖構造の一端（MBSが結合していない側）の２つの鎖をループにより連結して全体を一本鎖とすることができる。二本鎖をつなぐ配列中には、1つまたはそれ以上のMBSが含まれていてよい（例えば、図３１、#13、#14、#16）。配列をなるべくコンパクトにするには、二本鎖を短いループにより連結させることができる。例えば1～10塩基、好ましくは1～8塩基、2～6塩基、3～5塩基、例えば4塩基の配列で二本鎖を結合させることができる。配列は特に制限はない。例えば　5’-GUCA-3’　が挙げられる。例えば本発明は、図３１#13の構造を持つRNAであって、二本鎖構造IおよびIIにRNA鎖aおよびbが挟まれており、二本鎖構造IIはヘアピン（またはステム・ループ）を形成しており、該aおよびbにそれぞれ１つ以上のMBSを含むRNAが含まれる。
　本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる二本鎖構造は、配列に特に制限はなく任意の塩基長のものであり得る。好ましい実施形態については、以下に別途詳述する。二本鎖構造を形成する塩基対の配列は、miRNA阻害複合体の中で特異的かつ安定に二本鎖を形成できるように適宜設計することができる。例えば、同じ塩基が長く（例えば8塩基以上、好ましくは7塩基以上、より好ましくは5塩基以上、より好ましくは4塩基以上、より好ましくは3塩基以上）連続するホモポリメリックな配列は避けることが好ましい。また、二塩基繰り返し配列や3～4塩基繰り返し配列などの、数塩基の配列がタンデムに繰り返す配列も避けることが好ましい。二本鎖部分のGC含量は適宜調整してよいが、例えば12％～85％、好ましくは15％～80％、20％～75％、25％～73％、32％～72％、35％～70％、37％～68％、または40％～65％である。一例を挙げれば、特許文献１に示されているステムIおよびステムIIの配列を例示することができるが、それらに限定されるものではない。4本鎖としてはG-quadruplexが挙げられ、具体的にはGGG-loop-GGG-loop-GGG-loop-GGGという配列とすることができる。ここでloopの配列は適宜選択することができ、例えば3つのループを共に1塩基（例えばM(AまたはC)）としたり、共に3塩基としたりすることができる。
　MBSと二本鎖構造は、直接連結させてもよいし、他の配列を介して連結させてもよい。例えば、適当なリンカーまたはスペーサー配列を介して、MBSを二本鎖構造の端に結合させることができる。MBSを二本鎖部分に直接繋げても有意な阻害活性を得ることができるが、リンカー（またはスペーサーとも言う）を付加することにより、miRNAに対する阻害効果がより上昇する（特許文献１参照）。MBS配列と二本鎖構造との間のリンカーまたはスペーサー配列は、MBSがRISCに存在するmiRNAへのアクセシビリティーを増加させる可能性がある。リンカーまたはスペーサーの長さは適宜調整してよいが、例えば1～10塩基、好ましくは1～9塩基、1～8塩基、1～7塩基、1～6塩基、1～5塩基、1～4塩基、または1～3塩基である。例えば、2つ以上のMBSをつなげる場合であっても、リンカーまたはスペーサーを介して連結させるとよい。リンカーまたはスペーサーの配列は特に制限はないが、例えばAおよび/またはCからなる配列、あるいはAおよび/またはCをその他の塩基よりも多く含む配列とすることができる。またリンカーまたはスペーサー配列は、向かい合ったリンカーまたはスペーサー配列や、MBSとの間で安定な塩基対を形成しないよう配慮することが好ましい。一例を挙げれば、AAC、CAA、ACC、CCA、またはそれらのいずれかを含む配列等を例示できる。MBSに両側に付加する一対のリンカーまたはスペーサー配列は、インバートした配列（鏡像配列）にしてもよい。例えばMBSの5’側にAAC、3’側にCAAを付加することができる。
　本発明のmiRNA阻害複合体を構成する核酸は本発明の特定の修飾核酸で修飾されていることが特徴であるが、特定の修飾核酸以外の修飾核酸を含んでいてもよい。例えば核酸を構成するヌクレオチドは、本発明の特定の修飾核酸のほか、天然のヌクレオチド、修飾されたヌクレオチド、人工のヌクレオチド、またはそれらの組み合わせを含んでいてもよい。また本発明のmiRNA阻害複合体に含まれる核酸は、本発明の特定の修飾核酸を含む限り、その特定の修飾核酸以外は、RNAからなっていてもよく、またはRNA・DNAキメラであってよく、あるいはその他の核酸類縁体を含んでもよく、それらの任意のものを組み合わせて含んでよい。核酸には、本発明の特定の修飾核酸を含む限り、リン酸ジエステル結合により結合しているもののみならず、アミド結合やその他のバックボーンを有するもの（ペプチド核酸(PNA)等）が含まれる。核酸類縁体には、例えば天然および人工の核酸が含まれ、核酸誘導体、核酸アナログ、核酸派生体等であってよい。そのような核酸類縁体は当該分野において周知であり、例えばホスホロチオエート、ホスホアミデート、メチルホスホネート、キラルメチルホスホネート、2"-O-メチルリボヌクレオチド、ペプチド核酸（PNA）が含まれるが、これらに限定されない。PNAの骨格には、アミノエチルグリシン、ポリアミド、ポリエチル、ポリチオアミド、ポリスルフィナミド、ポリスルホンアミド、またはそれらの組み合わせからなる骨格を含んでよい（Krutzfeldt,　J.　et　al.,　Nucleic　Acids　Res.　35:　2885-2892;　Davis,　S.　et　al.,　2006,　Nucleic　Acids　Res.　34:　2294-2304;　Boutla,　A.　et　al.,　2003),　Nucleic　Acids　Res.　31:　4973-4980;　Hutvagner,　G.　et　al.,　2004,　PLoS　Biol.　2:　E98;　Chan,　J.A.　et　al.,　2005,　Cancer　Res.　65:　6029-6033;　Esau,　C.　et　al.,　2004,　J.　Biol.　Chem.　279:　52361-52365;　Esau,　C.　et　al.,　2006,　Cell　Metab.　3:　87-98）。
　（本発明で使用される架橋核酸（ＢＮＡ））
　本発明の特徴の一つに、特定の修飾核酸として安定化型核酸、すなわち、二本鎖形成が促進される修飾核酸が含まれることが特徴であり、例えば広義の架橋核酸（ＢＮＡ）を含めている点がある。
　本明細書において「架橋核酸（ＢＮＡ）」（BNAはBicyclic　Nucleic　AcidおよびBridged　Mucleic　Acidの両方を意味する。「架橋型核酸」、「二環式核酸」あるいは「架橋／二環式核酸」ともいう。）とは、核酸の２’位と４’位との間が連結され（架橋）され、環構造が２つ（二環式）となっている任意の修飾された核酸をいう。
　１つの例示的な実施形態では、本発明で用いられる安定化型核酸（すなわち、二本鎖形成が促進される修飾核酸）としては、架橋核酸を使用することができる。例えば、特許4731324号、Pradeep　S.　Pallan　et　al.,　Chem　Commun　(Camb).　2012　August　25;　48(66):　8195-8197.　doi:10.1039/c2cc32286bに記載される架橋核酸を用いることができ、これらには、Locked核酸（LNA）、2"-O,4"-C-エチレン架橋核酸(2"-O,4"-C-ethylene　bridged　nucleic　acid(ENA))などのエチレン核酸、その他の架橋核酸(BNA)、ヘキシトール核酸（hexitol　nucleic　acid;　HNA）、モルホリノ核酸、トリシクロ-DNA（tcDNA）、ポリエーテル核酸（米国特許第5,908,845号）、シクロヘキセン核酸（CeNA）、およびそれらの組み合わせが挙げられる。
　本明細書において「置換」とは、架橋核酸（ＢＮＡ）等の有機化合物のある特定の水素原子をほかの原子あるいは原子団で置き換えることをいう。
　本明細書において「置換基」とは、架橋核酸（ＢＮＡ）等の化学構造中で、他のものを置換した原子または官能基をいう。
　本発明における置換基としては、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基、ハロゲン、ヒドロキシ、チオール、シアノ、ニトロ、アミノ、カルボキシ、カルバモイル、アシル、アシルアミノ、チオカルボキシ、アミド、置換されたカルボニル、置換されたチオカルボニル、置換されたスルホニルまたは置換されたスルフィニルが挙げられるがそれらに限定されない。置換基は、すべてが水素以外の置換基を有していても良い。
　本明細書においては、特に言及がない限り、置換は、ある有機化合物または置換基中の１または２以上の水素原子を他の原子または原子団で置き換えるか、または二重結合もしくは三重結合とすることをいう。水素原子を１つ除去して１価の置換基に置換するかまたは単結合と一緒にして二重結合とすることも可能であり、そして水素原子を２つ除去して２価の置換基に置換するか、または単結合と一緒にして三重結合とすることも可能である。
　本明細書において「アルキル」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ＋１－で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキルは、直鎖または分枝鎖であり得る。これらの具体例は、Ｃ１～Ｃ２アルキル、Ｃ１～Ｃ３アルキル、Ｃ１～Ｃ４アルキル、Ｃ１～Ｃ５アルキル、Ｃ１～Ｃ６アルキル、Ｃ１～Ｃ７アルキル、Ｃ１～Ｃ８アルキル、Ｃ１～Ｃ９アルキル、Ｃ１～Ｃ１０アルキル、Ｃ１～Ｃ１１アルキルまたはＣ１～Ｃ２０アルキル、Ｃ１～Ｃ２置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ３置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ４置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ５置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ６置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ７置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ８置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ９置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ１０置換されたアルキル、Ｃ１～Ｃ１１置換されたアルキルまたはＣ１～Ｃ２０置換されたアルキルであり得る。ここで、たとえばＣ１～Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を１～１０個有する直鎖または分枝状のアルキルを意味する。本明細書において「置換アルキル」とは、本明細書に規定する置換基によってアルキルのＨが置換されたアルキルをいう。具体的には、これらに限定されるものではないが、ＣＨ３ＯＣＨ２－、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２－、ＣＨ３ＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、ＨＯＣＨ２－、ＨＯＣＨ２ＣＨ２－、ＨＯＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、ＮＣＣＨ２－、ＮＣＣＨ２ＣＨ２－、ＮＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、ＦＣＨ２－、ＦＣＨ２ＣＨ２－、ＦＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、Ｈ２ＮＣＨ２－、Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２－、Ｈ２ＮＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－、ＨＯＯＣＣＨ２－、ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２－、ＨＯＯＣＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２－が挙げられる。
　本明細書において「アルキレン」とは、メタン、エタン、プロパンのような脂肪族炭化水素（アルカン）から水素原子が二つ失われて生ずる２価の基をいい、一般に－ＣｎＨ２ｎ－で表される（ここで、ｎは正の整数である）。アルキレンは、直鎖または分枝鎖であり得る。本明細書において「置換アルキレン」とは、上述の置換基によってアルキレンのＨが置換されたアルキレンをいう。これらの具体例は、Ｃ１アルキレン、Ｃ１～Ｃ２アルキレン、Ｃ１～Ｃ３アルキレン、Ｃ１～Ｃ４アルキレン、Ｃ１～Ｃ５アルキレン、Ｃ１～Ｃ６アルキレン、Ｃ１～Ｃ７アルキレン、Ｃ１～Ｃ８アルキレン、Ｃ１～Ｃ９アルキレン、Ｃ１～Ｃ１０アルキレン、Ｃ１～Ｃ１１アルキレンまたはＣ１～Ｃ２０アルキレン、Ｃ１～Ｃ２置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ３置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ４置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ５置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ６置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ７置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ８置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ９置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ１０置換アルキレン、Ｃ１～Ｃ１１置換アルキレンまたはＣ１～Ｃ２０置換アルキレンであり得る。ここで、たとえばＣ１～Ｃ１０アルキレンとは、炭素原子を１～１０個有する直鎖または分枝状のアルキレンを意味する。また、たとえば、Ｃ１～Ｃ１０置換アルキレンとは、Ｃ１～Ｃ１０アルキレンであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。本明細書において「アルキレン」は、酸素原子および硫黄原子から選択される原子を１またはそれ以上含んでいてもよい。
　本明細書において「シクロアルキル」とは、環式構造を有するアルキルをいう。「置換シクロアルキル」とは、上述の置換基によってシクロアルキルのＨが置換されたシクロアルキルをいう。具体例としては、Ｃ３～Ｃ４シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ５シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ６シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ７シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ９シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ１０シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ１１シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ２０シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ４置換シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ５置換シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ６置換シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ７置換シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ８置換シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ９置換シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ１０置換シクロアルキル、Ｃ３～Ｃ１１置換シクロアルキルまたはＣ３～Ｃ２０置換シクロアルキルであり得る。
　本明細書において「アルケニル」とは、分子内に二重結合を一つ有する脂肪族炭化水素から水素原子が一つ失われて生ずる１価の基をいい、一般にＣｎＨ２ｎ－１－で表される（ここで、ｎは２以上の正の整数である）。「置換アルケニル」とは、上述の置換基によってアルケニルのＨが置換されたアルケニルをいう。具体例としては、Ｃ２～Ｃ３アルケニル、Ｃ２～Ｃ４アルケニル、Ｃ２～Ｃ５アルケニル、Ｃ２～Ｃ６アルケニル、Ｃ２～Ｃ７アルケニル、Ｃ２～Ｃ８アルケニル、Ｃ２～Ｃ９アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０アルケニル、Ｃ２～Ｃ１１アルケニルまたはＣ２～Ｃ２０アルケニル、Ｃ２～Ｃ３置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ４置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ５置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ６置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ７置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ８置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ９置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１０置換アルケニル、Ｃ２～Ｃ１１置換アルケニルまたはＣ２～Ｃ２０置換アルケニルであり得る。ここで、たとえばＣ２～Ｃ１０アルキルとは、炭素原子を２～１０個含む直鎖または分枝状のアルケニルを意味する。また、たとえば、Ｃ２～Ｃ１０置換アルケニルとは、Ｃ２～Ｃ１０アルケニルであって、そのうち１または複数の水素原子が置換基により置換されているものをいう。
　本明細書において「アリール」とは、芳香族炭化水素の環に結合する水素原子が１個離脱して生ずる基をいい、本明細書において、炭素環基に包含される。ベンゼンからはフェニル基（Ｃ６Ｈ５－）、トルエンからはトリル基（ＣＨ３Ｃ６Ｈ４－）、キシレンからはキシリル基（（ＣＨ３）２Ｃ６Ｈ３－）、ナフタレンからはナフチル基（Ｃ１０Ｈ８－）が誘導される。
　本明細書において「アラルキル」とは、アルキル基の水素原子の1個がアリール基で置換されているアルキル基を意味する。アラルキル基の具体例は、ベンジル基、フェネチル基（フェニルエチル基）、１－ナフチルエチルなどであり得る。
　本明細書において「アシル」とは、カルボン酸からＯＨを除いてできる１価の基をいう。アシル基の代表例としては、アセチル（ＣＨ３ＣＯ－）、ベンゾイル（Ｃ６Ｈ５ＣＯ－）などが挙げられる。「置換アシル」とは、アシルの水素を上述の置換基で置換したものをいう。
　本明細書において「スルホニル」とは、特性基である－ＳＯ２－を含むものを総称したものをいう。「置換スルホニル」とは、上述の置換基で置換されたスルホニルを意味する。
　本明細書において「シリル」とは、一般にＳｉＲ１Ｒ２Ｒ３－で表される基である（ここで、Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３は、それぞれ独立に、水素、アルキル、シクロアルキル、アルケニル、シクロアルケニル、アルキニル、シクロアルキニル、アルコキシ、炭素環基、ヘテロ環基からなる群から選択される）。これらの具体例は、トリメチルシリル基、トリエチルシリル基、トリｎ－プロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジメチルシリル基、トリイソプロピルシリル基、ｔｅｒｔ－ブチルジフェニルシリル基であり得る。
　本明細書において「機能性分子ユニット置換基」とは、標識分子（例えば、蛍光分子、化学発光分子、放射性同位原子を含む分子種等）、ＤＮＡやＲＮＡ切断活性分子、細胞内や核内移行シグナルペプチド等を含む基を指す。
　１つの実施形態では、前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択さ
れる少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡであり得る。
　代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000005
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、たとえば、これに限定されないが、置換または非置換のフェノキシアセチル基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルケニル基、炭素数６～１４のアリール基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、メタンスルホニル基やｐ－トルエンスルホニル基などの低級脂肪族あるいは芳香族スルホニル基又はアセチル基などの炭素数１～５の脂肪族アシル基やベンゾイル基などの芳香族アシル基が挙げられ、ｎは、１～３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸である。
　Ｂａｓｅは、プリン－９－イル基、２－オキソ－ピリミジン－１－イル基、またはその誘導体であり、たとえば、これに限定されないが、特許4731324号に例示されており、本発明では代表的に、６－アミノプリン－９－イル（即ち、アデニニル）、２－アミノ－６－クロロプリン－９－イル、２－アミノ－６－フルオロプリン－９－イル、２－アミノ－６－ブロモプリン－９－イル、２－アミノ－６－ヒドロキシプリン－９－イル（即ち、グアニニル）、６－アミノ－２－クロロプリン－９－イル、６－アミノ－２－フルオロプリン－９－イル、２，６－ジメトキシプリン－９－イル、２，６－ジクロロプリン－９－イル、６－メルカプトプリン－９－イル、２－オキソ－４－アミノ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル（即ち、シトシニル）、２－オキソ－４－アミノ－５－フルオロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル、４－アミノ－２－オキソ－５－クロロ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－メトキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－メルカプト－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル、２－オキソ－４－ヒドロキシ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル（即ち、ウラシリル）、２－オキソ－４－ヒドロキシ－５－メチル－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル（即ち、チミニル）、４－アミノ－５－メチル－２－オキソ－１，２－ジヒドロピリミジン－１－イル（即ち、５－メチルシトシニル）、９－β－Ｄ－リボフラノシルヒポキサンチニル（即ち、イノシニル）およびそれらの誘導体を挙げることができ、好ましくは、アデニニル、チミニル、グアニニル、ウラシリル、イノシニル、シトシニルおよび５－メチルシトシニルならびにこれらの誘導体を挙げることができる。
　別の代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000006
（式中、Ｒ３は、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、たとえば、これに限定されないが、フェノキシアセチル基、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルケニル基、炭素数６～１４のアリール基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、メタンスルホニル基やｐ－トルエンスルホニル基などの低級脂肪族あるいは芳香族スルホニル基又はアセチル基などの炭素数１～５の脂肪族アシル基やベンゾイル基などの芳香族アシル基が挙げられ、ｍは、０～２の整数であり、ｎは、１～３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む。Ｂａｓｅは、ＢＮＡ－１で説明したものと同様であり、好ましくは、アデニニル、グアニニル、チミニル、ウラシニル、イノシニル、シトシニルおよび５－メチルシトシニル、ならびにそれらの誘導体であり得る。
　別の代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000007
（式中、Ｒ２およびＲ２’は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、たとえば、これに限定されないが、メチル基、Ｏ－メトキシエチル基が挙げられ、Ｂａｓｅは、ＢＮＡ－１で説明したものと同様であり、好ましくは、アデニニル、グアニニル、チミニル、ウラシニル、イノシニル、シトシニル、５－メチルシトシニルおよびそれらの誘導体であり得る。ここで、ｎは、１～３の整数であるが、Ｒ２またはＲ２’のどちらかは水素ではない。）
　架橋鎖に分岐を持つＢＮＡは、これに限定されるものではないが、たとえばＢＮＡ（ｃＥｔ）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000008
（ｃＥｔ：２’，４’－ｃｏｎｓｔｒａｉｎｅｄ　ｅｔｈｙｌ）が挙げられる。ＢＮＡ（ｃＥｔ）は従来のＬＮＡと同様の熱的安定性およびミスマッチ識別を有するものの、ヌクレアーゼに対する安定性が向上していることが知られている。
　代表的な実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000009
であってもよく（本明細書において特に断らない限り「ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）」と表示するが、「２’，４’－ＢＮＡＮＣ」と表示されることもある。）、ここでは、Ｂａｓｅは上述と同じ定義であり、好ましくはアデニニル、チミニル、グアニニル、ウラシリル、イノシニル、シトシニルおよび５－メチルシトシニルからなる群より選択される。
　本明細書において「保護基」とは、特定の化学反応から官能基を保護するために使用される基をさす。本明細書において、保護基は、「ＰＧ」と表されることもある。
　好ましくは、ＢＮＡとしては、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）またはＬＮＡが使用され、より好ましくはＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）が使用される。
　好ましい実施形態では、ｍは０であり、ｎは１である。
　したがって、ｍｉＲＮＡに使用される場合は、一般式（ＢＮＡ－１）、（ＢＮＡ－２）、（ＢＮＡ－３）、ＢＮＡ（ｃＥｔ）又はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）で表されるヌクレオシドの単位構造の１種以上を１または２個以上含有するＤＮＡオリゴヌクレオチド又はＲＮＡオリゴヌクレオチドとしてのオリゴヌクレオチドまたはその薬理学上許容される塩であり得る。ここで、但し、オリゴヌクレオチド中の各ヌクレオシド間の結合形態は、天然核酸と同じリン酸ジエステル結合［－ＯＰ（Ｏ２－）Ｏ－］以外にホスホロチオアート結合［－ＯＰ（Ｏ）（Ｓ－）Ｏ－］を１又は２個以上含有していてもよく、また、前記の構造の１種以上を２個以上含有する場合は、当該構造間でＢａｓｅは同一または異なることができる。
　本発明の一種である人工核酸ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を含有するＤＮＡ若しくはＲＮＡオリゴヌクレオチド類縁体は下記のような優れた特性を有する。相補なＲＮＡ鎖に対する二重鎖形成能が非常に高いからである。
　（１）ＤＮＡオリゴヌクレオチド中にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）ユニットを１個導入する毎に（１修飾当たり）Ｔｍ値が３～６℃上昇する。しかも、相補なＤＮＡ鎖に対する二重鎖形成能の上昇（向上）はほとんどない。この特性は、相補なＲＮＡ鎖に対する結合親和性においてはＢＮＡ修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチド同様、飛躍的なＴｍ値の上昇（二重鎖形成能の格段の向上）がある一方で、相補なＤＮＡ鎖に対する二重鎖形成能においてはＢＮＡ修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドでは未修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドと比べて向上が観察される（１修飾当たりＴｍ値が２～４℃上昇）のとは対照的に、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドでは殆ど結合親和性の向上は認められない。従って、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドはＲＮＡ鎖への選択的結合親和性に極めて優れている。
　（２）また、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドは二本鎖ＤＮＡ鎖に対する三重鎖形成能にも卓越している。
　ＤＮＡオリゴヌクレオチド中にＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）ユニットを１個導入すると二本鎖ＤＮＡ鎖に対する三重鎖形成においてＴｍ値が７～１２℃上昇する。また、三重鎖形成には塩基配列を厳密に識別し、ターゲット配列にのみ結合するという配列選択性が必要とされるが、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾ＤＮＡオリゴヌクレオチドのマッチ配列とミスマッチ配列とに対するＴｍ値の差は２５℃以上あり、天然型ＤＮＡオリゴヌクレオチドを上回る優れた配列選択性を有している。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）の場合ヌクレアーゼ耐性が抜群である。
　ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾オリゴヌクレオチドは天然ＤＮＡオリゴヌクレオチドよりもヌクレアーゼ耐性が高いが、Ｓ－オリゴ（ホスホロチオアート型オリゴヌクレオチド）よりはるかに低い。本発明のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾オリゴヌクレオチドはBNA修飾オリゴヌクレオチドはもとより、ヌクレアーゼ耐性の優れていることで高く評価されているＳ－オリゴよりもヌクレアーゼ耐性に優れており、生体内での分解が強く抵抗する特性を有している。
　（３）本発明の人工核酸ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）分子中に含まれるＮ－Ｏ結合は還元試薬により緩和な条件下で選択的に開裂することができ、ＮＨ基とＯＨ基が遊離する。このＮＨ基やＯＨ基を足掛かりに別機能性分子を結合させることで、オリゴヌクレオチド類縁体調製の前後を問わず、様々な複合体（コンジュゲート体）を得ることが容易である。別機能性分子としては、蛍光分子や化学発光分子や放射性同位原子を含む分子種などの標識用分子、様々なＤＮＡ（ＲＮＡ）切断活性分子、細胞内や核内移行シグナルペプチド類等々、が可能である。
　（４）使用されるＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を様々な形態で修飾したＤＮＡやＲＮＡオリゴヌクレオチド類縁体は、アンチセンス法、アンチジーン法、デコイ法、遺伝子相同組み換え法、ＲＮＡ干渉法などによる遺伝子医薬品創製の高機能性素材としてのみならず、モレキュラービーコンやＤＮＡチップなどの遺伝子診断法の基材として、また、遺伝子機能解析解明等の研究用試薬の開発素材として、極めて有用性が高い。
　本発明の化合物（ＢＮＡ－１）及びその塩のうち、好適な化合物としては、（５）Ｒ３が、水素原子、炭素数１～５のアルキル基、炭素数１～５のアルケニル基、炭素数６～１４のアリール基、１～３個のアリール基で置換されたメチル基、メタンスルホニル基やｐ－トルエンスルホニル基などの低級脂肪族あるいは芳香族スルホニル基又はアセチル基などの炭素数１～５の脂肪族アシル基やフェノキシアセチル基およびベンゾイル基などの芳香族アシル基である化合物およびその塩、また、Ｒ３の機能性分子ユニット置換基が、蛍光あるいは化学発光標識分子、核酸切断活性官能基、又は細胞内若しくは核内移行シグナルペプチドであるものを挙げることができ、（６）Ｂａｓｅが、前述のとおりであり、好ましくはアデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、メチルシトシニル基あるいはそれらの誘導体である。
　本発明のヌクレオシド類縁体及びオリゴヌクレオチド類縁体は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。
＜１＞ヌクレオシド類縁体の合成
　（（ＢＮＡ－１）及び（ＢＮＡ－２））
　一般式（ＢＮＡ－１）及び（ＢＮＡ－２）で表される化合物は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。反応条件、保護基導入試薬、反応試薬は、具体的には実施例に記載の方法を参考にすることができるが、これに限定されず、本分野の技術常識に基づき使用可能な反応条件、試薬を適宜採用することができる。例えば、特開２０００－２９７０９７号公報、特開平１０－３０４８８９号公報に記載の方法を参考にすることができる。また、一般式（ＢＮＡ－１）及び（ＢＮＡ－２）におけるＢａｓｅとして種々の天然、非天然の核酸塩基およびその他の芳香族複素環や芳香族炭化水素環を有する場合についても、特開平１０－３０４８８９号公報に記載の方法を参考にして、本発明化合物の原料を合成することができる。
　（ヌクレオシド類縁体の一般合成例）
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000010
　（１）化合物Ａ－２の合成
　化合物Ａ－１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000011
（式中、ＰＧ１～ＰＧ４は、独立して本明細書に記載の保護基であり、Ｂａｓｅは、本明細書に記載の核酸塩基であり、たとえばアデニン、グアニン、シトシン、チミン、ウラシルである）の溶液（たとえばＴＨＦ溶液３．５ｍｌ）に適切な温度（たとえば氷冷下）で、適切な試薬（たとえば４０％メチルアミン水溶液（０．１１ｍｌ，１．５０ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば３時間）撹拌する。反応溶液の溶媒を留去後、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄する。有機層を適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒留去後、（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）により）精製し、化合物Ａ－２を得る（たとえば４５ｍｇ，９９％，白色固体）。
（２）化合物Ａ－３の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ－２（たとえば１４６ｍｇ，０．２３ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばピリジン溶液（１．５ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、ＰＧ５Ｘ（式中、ＰＧ５は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば塩化メチルスルホニル（４５．１ｍｌ，０．５９ｍｍｏｌ）である）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和重曹水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ａ－３を得る。化合物Ａ－３は精製せずに次の反応に用いることもできる。
（３）化合物Ａ－４の合成
　化合物Ａ－３（たとえば１７０ｍｇ）の溶液（たとえば水－エタノール溶液（１：２，６ｍｌ））に、適切な温度（たとえば室温）で適切な試薬（たとえば１Ｍ水酸化ナトリウム水溶液（０．７０ｍｌ，０．７０ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば１時間）撹拌することにより、２’位に（ＣＲ１Ｒ１’）ｍｚＯＨを導入する（Ｒ１およびＲ１’は、本明細書に記載の置換基である）。（たとえば１０％塩酸水溶液で）中和後、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝１５：１）により）精製し、化合物Ａ－４を得る（たとえば１３９ｍｇ，９５％（２段階），白色固体）。
（４）化合物Ａ－５の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ－４（たとえば０．８０ｇ，１．２８ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばエタノール溶液（１０ｍｌ））に、適切な試薬（たとえば２０％水酸化パラジウム－炭素粉末（０．６０ｇ）、シクロヘキセン（５．２ｍｌ，５１ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば５時間）、適切な温度条件（たとえば加熱還流）で撹拌することにより、ＰＧ２およびＰＧ３を除去する。ＰＧ２を除去する工程とＰＧ３を除去する工程は、同一の工程であっても、別々の工程であってもよい。反応溶液を濾過後、溶媒を減圧留去する。得られた粗生成物Ａ－５は、精製せずに次の反応に用いることができる。
（５）化合物Ａ－６の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ－５（たとえば０．４６ｇ）の溶液（たとえばＮ，Ｎ－ジメチルホルムアミド溶液（１０ｍｌ））に、ＰＧ６Ｘ（式中、ＰＧ６は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば１，３－ジクロロ－１，１，３，３－テトライソプロピルジシロキサン（０．４５ｍｌ，１．４１ｍｍｏｌ）である）、塩基（たとえばイミダゾール（０．３８ｇ，５．６３ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば５時間）撹拌することによりＰＧ６を導入する。反応液を適切な有機溶媒（たとえばエーテル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄した後、適切な乾燥剤（たとえば硫酸マグネシウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝２：１→１：１）により）精製し、化合物Ａ－６を得る（たとえば０．６０ｇ，６８％（２段階），白色固体）。
（６）化合物Ａ－７の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ－６（たとえば２００ｍｇ，０．２９ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばピリジン溶液（３ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、ＰＧ５Ｘ（式中、ＰＧ５は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば無水トリフルオロメタンスルホン酸（０．１５ｍｌ，０．８８ｍｍｏｌ））、塩基（たとえば４－（ジメチルアミノ）ピリジン（７ｍｇ，０．０６ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば７．５時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえばジクロロメタン）で抽出する。有機層を（たとえば飽和重曹水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ａ－７を得る。得られるＡ－７は精製せず、次の反応に用いることができる。
（７）化合物Ａ－８の合成
　化合物Ａ－７の２’位のヒドロキシ基にアミノ基を導入した化合物Ａ－８を合成する。その合成法は、これに限定されるものではないが、たとえば以下のようなものである。（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ－７（たとえば０．２９ｇ）の溶液（たとえばアセトニトリル溶液（３ｍｌ））に、適切な温度（たとえば室温）で適切な試薬（たとえばＮ－ヒドロキシフタルイミド（６７ｍｇ，０．４１ｍｍｏｌ）、１，８－ジアザビシクロ［５．４．０］－７－ウンデセン（６１（１，０．４１ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。反応溶液を適切な有機溶媒（たとえばジクロロメタン）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム）により）精製し、化合物Ａ－７’を得る。得られた化合物Ａ－７’（１．１６ｇ，１．４０ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばエタノール溶液（３５ｍｌ））に、適切な試薬（たとえばヒドラジン－水和物（０．１２ｍｌ，２．３８ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１０分間）撹拌する。反応溶液の溶媒を留去後、濾過し、濾液を適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒を減圧留去し、得られたＡ－８は精製せず、次の反応に用いることができる。
（８）化合物Ａ－９の合成
　（たとえば窒素気流下）化合物Ａ－８（０．９３ｇ）の溶液（たとえば塩化メチレン溶液（１５ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、適切な試薬（たとえば飽和重曹水（４．０ｍｌ，４．２ｍｍｏｌ））、ＰＧ７Ｘ（式中、ＰＧ７は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえばクロロギ酸ベンジル（０．３０ｍｌ，２．１ｍｍｏｌ）である）を加え、適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。反応を（たとえば飽和重曹水を加えて）クエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄し、適切な乾燥剤（たとえば硫酸マグネシウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝４：１）により）精製し、化合物Ａ－９を得る（たとえば０．９２ｇ，９４％（２段階），白色固体）。
（９）化合物Ａ－１０の合成
　（たとえば窒素気流下、）塩基（たとえば水素化ナトリウム（６０％　ｉｎ　ｏｉｌ，０．５５ｇ，１３．７ｍｍｏｌ）のテトラヒドロフラン懸濁液（２５ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、化合物Ａ－９（たとえば３．８１ｇ，４．５７ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばテトラヒドロフラン溶液（１５ｍｌ））を滴下し、適切な時間（たとえば１時間）撹拌後、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば５時間）撹拌することによりＯＰＧ４を除去するとともに２’位と４’位を架橋する。ＯＰＧ４を除去する工程と２’位と４’位を架橋する工程は同一の工程であっても、異なる工程であってもよい。（たとえば飽和シュウ酸水溶液で）中和後、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム→クロロホルム：メタノール＝１００：１）により）精製し、化合物Ａ－１０を得る（たとえば２．８７ｇ，９５％，白色固体）。
（１０）化合物Ａ－１１の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ａ－１０（たとえば０．３５ｍｇ，０．５３ｍｍｏｌ）の溶液（たとえば塩化メチレン溶液（１０ｍｌ））に適切な温度（たとえば氷冷下）、適切な試薬（たとえば１Ｍ三塩化ホウ素ヘキサン溶液（５．２９ｍｌ，５．２９ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に飽和重曹水を加えることにより）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄した後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（クロロホルム：メタノール＝５０：１）により）精製し、化合物Ａ－１１を得る（たとえば０．２７ｇ，９６％，白色固体）。
（１１）化合物Ａ－１２の合成
　化合物Ａ－１１（０．１９ｇ，０．３６ｍｍｏｌ）の溶液（たとえば１Ｍ　ｐ－トルエンスルホン酸ピリジニウム－メタノール溶液（３．６ｍｌ））に、適切な温度（たとえば室温）にて適切な試薬（たとえば２０％ホルムアルデヒド水溶液（０．０６ｍｌ，０．４０ｍｍｏｌ））を加え、適切な時間（たとえば１０分間）撹拌する。さらに、適切な温度（たとえば氷冷下）において適切な試薬（たとえばシアン化水素化ホウ素ナトリウム（４５ｍｇ，０．７２ｍｍｏｌ））を加えて置換基Ｒ３（Ｒ３は、本明細書に記載の置換基である）によりアミノ基を置換する。適切な時間（たとえば１時間）撹拌する。反応溶液を適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、（たとえば水、飽和重曹水、飽和食塩水）で洗浄し、有機層を適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝２：１）にて）精製し、化合物Ａ－１２を得る（たとえば０．１９ｇ，１００％，白色固体）。
（１２）化合物Ａ－１３の合成
　化合物Ａ－１２（４６ｍｇ，０．０８５ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばテトラヒドロフラン溶液（２ｍｌ））に適切な試薬（たとえばフッ化テトラ－ｎ－ブチルアンモニウム（１Ｍ　テトラヒドロフラン中，０．１７ｍｌ，０．１７ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば５分間）撹拌する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（酢酸エチル：メタノール＝１５：１により）精製し、化合物Ａ－１３を得る（たとえば２５ｍｇ，１００％，白色固体）。
（１３）化合物Ａ－１４の合成
　化合物Ａ－１３（たとえば０．１６ｇ，０．５４ｍｍｏｌ）の溶液（たとえばピリジン溶液（１０ｍｌ））に適切な試薬（たとえば塩化４，４’－ジメトキシトリチル（たとえば０．２２ｇ，０．６４ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。反応液に（たとえば飽和重曹水を加え、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥する。溶媒を減圧留去し、得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン含有ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：２→酢酸エチル：メタノール＝３０：１）にて）精製し、化合物Ａ－１４を得る（たとえば０．３０ｇ，９３％，白色固体）。
（１４）化合物Ａ－１５の合成
　化合物Ａ－１４（たとえば０．１７ｇ，０．２８ｍｍｏｌ）及び適切な試薬（たとえば４，５－ジシアノイミダゾール（４０ｍｇ，０．３４ｍｍｏｌ））の溶液（たとえばアセトニトリル溶液（６ｍｌ））に、適切な試薬（たとえば２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロアミダイト（０．１３ｍｌ，０．４２ｍｍｏｌ））を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば４時間）撹拌することにより３’位のヒドロキシ基をＰ（Ｏ）（ＯＰＧ９）（ＯＰＧ１０）（ＰＧ９およびＰＧ１０は、それぞれ独立して本明細書に記載の保護基である）により修飾する。（たとえば反応液に飽和重曹水を加えて）クエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出する。有機層を（たとえば飽和重曹水、水、飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒を減圧留去する。得られた粗生成物を（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィー（１％トリエチルアミン含有ｎ－ヘキサン：酢酸エチル＝１：１）、ついで再沈澱（酢酸エチル－ヘキサン）により）精製し、化合物Ａ－１５を得る（たとえば０．２０ｇ，８８％，白色固体）。
　（ＢＮＡ－３）
　一般式ＢＮＡ－３で表される化合物は、実施例に記載の方法および本分野の従来技術に基づいて合成できる。反応条件、保護基導入試薬、反応試薬は、具体的には実施例に記載の方法を参考にすることができるが、これに限定されず、本分野の技術常識に基づき使用可能な反応条件、試薬を適宜採用することができる。例えば、J.Org.Chem.2010,75,1569-1581に記載の方法を参考にすることができる。また、一般式（ＢＮＡ－３）におけるＢａｓｅとして種々の天然、非天然の核酸塩基およびその他の芳香族複素環や芳香族炭化水素環を有する場合についても、J.Org.Chem.2010,75,1569-1581に記載の方法を参考にして、本発明化合物の原料を合成することができる。
ＢＮＡ－３の一般合成例
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000012
　（１）化合物Ｂ－２の合成
　化合物Ｂ－１
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000013
 　
（式中、ＰＧ１～ＰＧ４は、独立して本明細書に記載の保護基であり、Ｒ２およびＲ２’は、本明細書に記載の置換基であり、Ｂａｓｅは、本明細書に記載の核酸塩基であり、たとえばアデニニル基、チミニル基、グアニニル基、またはメチルシトシニル基である）の溶液に（たとえば窒素気流下、）適切な温度で、適切な試薬（たとえば炭酸カリウム）を加え、適切な温度で適切な時間撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄する。有機層を適切な乾燥剤（たとえば硫酸ナトリウム）で乾燥し、溶媒留去後、（たとえばシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより）精製し、化合物Ｂ－２を得る。
　（２）化合物Ｂ－３の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ－２の溶液に適切な温度（たとえば室温）、適切な試薬（たとえば２，３－ジクロロ－５，６－ジシアノ－ｐ－ベンゾキノン（ＤＤＱ）である）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ－３を得る。
　（３）化合物Ｂ－４の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ－３の溶液に適切な温度（たとえば氷冷下）、適切な試薬（たとえばトリエチルアミン三フッ化水素酸塩）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ－４を得る。
　（４）化合物Ｂ－５の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ－４の溶液に適切な温度（たとえば室温）、ＰＧ５Ｘ（式中、ＰＧ５は、本明細書に記載の保護基であり、Ｘは、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉであり、たとえば塩化ジメトキシトリチルである）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば１２時間）撹拌する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ－５を得る。
　（５）化合物Ｂ－６の合成
　（たとえば窒素気流下、）化合物Ｂ－５の溶液に適切な温度（たとえば室温）、適切な試薬（たとえば２－シアノエチル－Ｎ，Ｎ，Ｎ’，Ｎ’－テトライソプロピルホスホロアミダイト）を加え、適切な温度（たとえば室温）で適切な時間（たとえば４時間）撹拌することにより３’位のヒドロキシ基をＰ（Ｏ）（ＯＰＧ６）（ＯＰＧ７）（ＰＧ６およびＰＧ７は、それぞれ独立して本明細書に記載の保護基である）により修飾する。（たとえば反応溶液に水を加えて）反応をクエンチし、適切な有機溶媒（たとえば酢酸エチル）で抽出し、有機層を（たとえば飽和食塩水で）洗浄後、適切な乾燥剤（たとえば無水硫酸ナトリウム）にて乾燥する。溶媒を減圧留去し、化合物Ｂ－６を得る。
　＜２＞オリゴヌクレオチド類縁体の合成
　本発明のヌクレオシド類縁体を含むオリゴヌクレオチド類縁体は、公知のＤＮＡシンセサイザーを用いて種々合成することができる。次いで、得られるオリゴヌクレオチド類縁体を、逆相カラムを用いて精製し、生成物の純度を逆相ＨＰＬＣやＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ－ＭＳで分析することにより、精製オリゴヌクレオチド類縁体の生成を確認できる。本発明のヌクレオシド類縁体は、オリゴヌクレオチド類縁体の中に１個以上存在させることができる。また、オリゴヌクレオチド類縁体の２カ所以上の位置に、１又は２以上の天然ヌクレオチドを介して隔離された状態で存在させてもよい。本発明によれば、本発明のヌクレオシド類縁体を必要な位置に必要な数（長さ）で導入したオリゴヌクレオチド類縁体を合成することができる。オリゴヌクレオチド類縁体全体の長さとしてヌクレオチド単位が２～５０、好ましくは８～３０個である。

　本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、ヌクレアーゼに対して分解されにくく、生体への投与後、長く生体内に存在することができる。そして、例えば、センスＲＮＡと二重鎖を形成して病因となる生体内成分（タンパク質）のｍＲＮＡへの転写を阻害する。また、感染したウイルスの増殖を阻害すると考えられる。
　これらのことから、本発明のオリゴヌクレオチド類縁体は、抗腫瘍剤、抗ウイルス剤とはじめとした遺伝子の働きを阻害して疾病を治療する医薬品としての有用性が期待される。即ち、本発明によれば、安定で優れたアンチセンスもしくはアンチジーン活性、又は特定遺伝子の検出薬若しくは増幅開始の為のプライマーとして優れた活性を有する、オリゴヌクレオチド類縁体及びその製造中間体であるヌクレオシド類縁体が提供される。
　本発明のヌクレオシド類縁体の一つである２’，４’－ＢＮＡＮＣモノマーを様々な形態で修飾したＤＮＡやＲＮＡオリゴヌクレオチド類縁体（オリゴヌクレオチド類縁体）は、各種の生理・生物活性物質類、医薬品類の材料、ＲＮＡ干渉法やデコイ法用などの二重鎖オリゴヌクレオチドの機能性材料、ｃＤＮＡなど一本鎖核酸を標的とするＤＮＡチップ、モレキュラービーコン（ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　ｂｅａｃｏｎ）などの機能性素材、様々なアンチセンス法（リボザイム、ＤＮＡザイムを含む）、アンチジーン法や遺伝子相同組み換え法用途への機能性素材、蛍光や発光物質との組合せによる生体微量成分の高感度分析用材料や遺伝子機能解析解明等の研究用試薬の開発素材として有用である。
　本発明のヌクレオシド類縁体やオリゴヌクレオチド類縁体は、例えば緩衝剤および／または安定剤等の慣用の助剤を配合して非経口投与用製剤とすることができる。また、局所用の製剤としては、慣用の医薬用担体を配合して軟膏、クリーム、液剤、または膏薬等に調剤できる。
　（Ｓ－ＴｕＤを構成するオリゴヌクレオチドの一般合成例）
　本発明で使用されるＳ－ＴｕＤを構成するオリゴヌクレオチドは、合成機（たとえばｎＳ－８ＩＩ　合成機もしくは、ＡＫＴＡ　ｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機）で合成する。細孔ガラス質固相担体（たとえば２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡ　ＣＰＧ　Ｌｉｎｋ　Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ社製）と、標準的な保護基を有する２’－Ｏ－メチル－ＲＮＡホスホロアミダイト、（たとえば、これに限定するものではないが、５’－Ｏ－ジメトキシトリチルＮ６－ベンゾイルアデノシン－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ４－アセチルシチジン－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ２－イソブチリルグアノシン－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルホスホロアミダイト、および５’－Ｏ－ジメトキシトリチルウリジン－２’－Ｏ－メチル－３’－Ｏ－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上シグマアルドリッチ社製）、並びに、２’，４’－ＢＮＡＮＣ（２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン架橋核酸）チミジンホスホロアミダイト、すなわち２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン－５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－チミジン－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルホスホロアミダイト、２’，４’－ＢＮＡＮＣアデノシンホスホロアミダイト、すなわち２’－Ｏ，４’－Ｃ－アミノメチレン－５’－Ｏ－ジメトキシトリチル－Ｎ６－ベンゾイルアデノシン－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上ＢＮＡ社製）、並びに、ＬＮＡ（Ｌｏｃｋｅｄ　ｎｕｃｌｅｉｃ　ａｃｉｄ）（２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンリボ核酸）チミジンホスホロアミダイト、すなわち２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレン－５’－Ｏ－ジメトキシトリチルチミジン－Ｎ，Ｎ’－ジイソプロピルホスホロアミダイト（エキシコン社製）が挙げられる）をオリゴヌクレオチド合成に使用する。ホスホロアミダイトは全て、適切な溶媒（たとえばアセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ））中、適切な濃度（たとえば０．１Ｍ）で使用する。２’－Ｏ－メチルＲＮＡ、ＢＮＡ及びＬＮＡについては適切な連結／再利用時間（たとえば１５分）を使用する。活性剤は、たとえば、これに限定されるものではないが、５－ベンジルメルカプト－テトラゾール（０．２５Ｍ、和光純薬社製）であり、ＰＯ－酸化については、たとえば、これに限定されるものではないが、ヨウ素／水／ピリジンを使用する。ＰＳ－チオエート化については、たとえば、これに限定されるものではないが、市販のオリゴヌクレオチド自動合成機用硫化試薬（すなわちＥＩＤＴＨ、ＤＤＴＴ、ＰＡＤＳ、Ｂｅｕｃａｇｅ試薬など）を適切な試薬（たとえばピリジン）とともに使用する。
　（脱保護の一般例（ヌクレオ塩基脱保護の一般例））
　合成が完了した後、合成担体を適切な容器（たとえばガラスボトル）に移す。オリゴヌクレオチドを、担体１ｇに対して１５ｍＬの、４０％メチルアミン水溶液と３３％メチルアミンエタノール溶液の等量混合物を用いて、適切な温度（たとえば４５℃）で適切な時間（たとえば１３時間）、塩基とリン酸基を脱保護して担体から切断する。塩基を脱保護する工程とリン酸基を脱保護する工程は、同一であっても、異なっていてもよい。その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、適切な容器（たとえば新しい２５０ｍＬのボトル）に入れる。担体を（たとえば２×４０ｍＬのエタノール／水（１：１　ｖ／ｖ）で）洗浄する。その後、（たとえばロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ－ｖａｐ）を用いて）溶媒を留去し乾固する。
　（ＨＰＬＣ精製の一般例）
　オリゴヌクレオチドを、ＨＰＬＣ（たとえばＳｏｕｒｃｅ　１５　ＲＰＣゲルカラムでの逆相イオンペアＨＰＬＣ）で精製する。緩衝液は、たとえば、これに限定されるものではないが、５％　ＣＨ３ＣＮ、０．１Ｍ　トリエチルアミン酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）（緩衝液Ａ）と９０％　ＣＨ３ＣＮ、０．１Ｍ　トリエチルアミン酢酸緩衝液（ｐＨ７．０）（緩衝液Ｂ）である。５’末端に保護基（たとえばジメトキシトリチル基）が保持された状態で全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし次の精製に供する。その後オリゴヌクレオチドプールを、ＨＰＬＣ（たとえばＳｏｕｒｃｅ　３０Ｑの陰イオンペアＨＰＬＣ）で精製する。溶液及び緩衝液は、たとえばこれに限定されるものではないが、０．６％のトリフルオロ酢酸（溶液Ａ）、２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．５）（緩衝液Ｃ）と２０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液中の２Ｍ塩化ナトリウム（緩衝液Ｄ）である。５’末端の保護基を脱離させた後、完全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩後凍結乾燥する。化合物を、最終的に、たとえばＭＡＬＤＩ－ＴＯＦ／ＭＳと変性ポリアクリルアミドゲルで分析する。
　（２本鎖化の一般例）
　精製の完了した１本鎖オリゴヌクレオチドを適切な溶媒（たとえば蒸留水）にて溶解後、（たとえば紫外分光光度計を用い吸光度測定することにより）オリゴヌクレオチド濃度を決定する。決定された濃度を用い相補鎖をそれぞれ等モル濃度になるように混合し適切な温度（たとえば９５℃）で適切な時間（たとえば１０分）加熱後徐冷し２本鎖形成させる。２本鎖形成はたとえば非変性ゲル電気泳動にて確認する。
　また、核酸は末端に結合体を含んでよい。結合体としては、例えば親油性物質、テルペン、タンパク質結合物質、ビタミン、炭水化物、レチノイド、およびペプチド等が挙げられる。
　（ＲＮＡの一本鎖他特殊形態）
　本発明のmiRNA阻害複合体は直鎖状の一本鎖核酸により構成されるように設計することができる（図３１）。本発明は特に、MBSの全てがある二本鎖構造（図３１のステムI）の片側（図３１においては右側）に集中しており、該二本鎖構造の各鎖は、その側で閉じた構造となっており（すなわちMBSを含む配列によりつながっており）、該二本鎖構造の反対側に一本鎖RNAの両端があるような複合体に関する（図３１）。MBSを含む配列中には、さらなる二本鎖構造（図３１のステムIIやIIIなど）を含んでもよい。一本鎖RNAの長さは適宜決めてよいが、例えば500塩基内、好ましくは450塩基以内、420塩基以内、400塩基以内、380塩基以内、360塩基以内、340塩基以内、320塩基以内、300塩基以内、280塩基以内、260塩基以内、240塩基以内、220塩基以内、200塩基以内、180塩基以内、160塩基以内、140塩基以内、120塩基以内、100塩基以内、または80塩基以内である。例えば２つの二本鎖構造と２つのMBSを持つ複合体を形成する一本鎖RNAの長さは、例えば60～300塩基、好ましくは70～250塩基、80～200塩基、90～180塩基、または100～150塩基である。第一の二本鎖構造（一本鎖RNAの両端に近い二本鎖構造）は、例えば15～30bp、好ましくは16～28bp、好ましくは17～25bp、好ましくは17～24bp、例えば17bp、18bp、19bp、20bp、21bp、22bp、23bp、または24bpとすることができ、第二の二本鎖構造（MBSを含む配列中に含まれるさらなる二本鎖構造）は、全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよく、例えば4bp～20bpであり、例えば5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp、または7bp～8bpとしてよい。
　また本発明は、本発明のmiRNA阻害複合体を構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび核酸類縁体を含む）であって、ＢＮＡを含むＲＮＡに関する。miRNA阻害RNA複合体が1分子のRNAにより構成されている場合は、そのRNAの分子内アニーリングにより、また2本以上のRNA分子により構成されている場合は、それらのRNAをアニールさせることにより、本発明の複合体を構築することができる。これらのRNAは適宜合成することができる。例えば、RNAの化学合成により所望のRNAを製造することができる。
　少なくとも１つのMBSをコードする核酸は、2つ以上のMBSを含んでもよく、また二本鎖構造を形成し得る１対またはそれ以上の相補配列のセットを一続きの配列中に含んでいてもよい。例えば、当該核酸としては少なくとも１つの二本鎖構造を形成する１対の相補配列と、該一対の相補配列の両端にそれぞれ少なくとも１つのMBSを含む核酸が例示できる。このような核酸は、具体的には、2つのMBSの間に、ステムを形成し得る一対の相補配列を含んでいる核酸である。このステムは、上記第二の二本鎖構造に相当する。あるいは第二の二本鎖構造に代えてG-quadruplexを形成する配列を含んでもよい。
　また当該核酸は、2つのMBSの間に二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列を含む構造単位を、2個以上含んでいてもよい。その構造単位は複数入れ子状に含むことができ、1対のMBSの間にある二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列の間に、さらに1対のMBSとその間に二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列を含む配列を含むことができる（図３１の#15や#16等）。複数含まれているMBSの配列は同一であっても異なっていてもよい。
　このような核酸を上記の1対の相補配列の間に挿入すると、第一の二本鎖構造を形成する一対の相補配列の間に、MBS－第二の二本鎖構造を形成する配列－MBSの構造を持つ配列が挿入された構造を持つ核酸が得られる。具体的には、例えばMBS－第二の二本鎖構造を形成する一対の相補配列－MBSの構造を持つ配列が挿入された構造を持つ核酸である。2つの二本鎖構造とその間の一対の対向する一本鎖（それぞれにMBSを含む）からなる核酸は、コンパクトでかつ十分なmiRNA阻害活性を示す。
　二本鎖構造を形成し得る１対の相補配列とMBSは、適宜リンカーやスペーサーを介して連結させることができる。リンカーやスペーサーの長さは明細書に記載した通りである。また、相補配列はリンカーやスペーサーを介して連結してよく、二本鎖を形成したときに、当該リンカーやスペーサーはループとなり、二本鎖を合わせてステムループを形成する。ループの長さも適宜調整してよく、詳細は明細書に記載した通りである。あるいは二本鎖に代えてG-quadruplexを形成する配列を適宜用いることができる。
　（好ましい実施形態）
　以下に本発明の好ましい実施形態を説明する。以下に提供される実施形態は、本発明のよりよい理解のために提供されるものであり、本発明の範囲は以下の記載に限定されるべきでないことが理解される。従って、当業者は、本明細書中の記載を参酌して、本発明の範囲内で適宜改変を行うことができることは明らかである。また、本発明の以下の実施形態は単独でも使用されあるいはそれらを組み合わせて使用することができることが理解される。
　1つの局面において、本発明は、ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体を提供する。このような複合体は、別名Ｓ－ＴｕＤと呼ばれ、本発明は、さらにこれを改良したものであり、改良型Ｓ－ＴｕＤまたは修飾Ｓ－ＴｕＤともいう。この改良型Ｓ－ＴｕＤ（ｍｉＲＮＡ阻害複合体）は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む。このようなＢＮＡを含ませることによって、本発明のｍｉＲＮＡ阻害複合体は、安定性を向上させ、精製過程の不純物の発生も抑えられ、さらには驚くべきことに生物学的活性も上昇していたことから、理想的な核酸医薬の原料または医薬そのものとして使用されることが理解される。
　１つの好ましい実施形態では、前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡを含む。理論に束縛されることを望まないが、オリゴヌクレオチドの合成も容易に行うことができ、しかもＲＮＡ二本鎖の形成促進が促進されることから、好ましいＢＮＡとして使用される。
　１つの好ましい実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000014
（式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０～２の整数であり、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、メチルシトシニル基あるいはそれらの誘導体を示し、ｎは、１～３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む。
　好ましい実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000015
（式中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、メチルシトシニル基あるいはそれらの誘導体を示し、ｍは、０～２の整数であり、ｎは、１～３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む。
　さらに好ましくは、本発明で使用されるＢＮＡは、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000016
または２’，４’メタノ架橋核酸（ＬＮＡ）を含む。
　特に、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）が好ましい。理論に束縛されることを望まないが、この特定の核酸を用いることで、安定性が増し、二本鎖の形成が促進され、さらには、生物学的活性の向上も観察されたからである。
　別の実施形態では、ｃＥｔを用いることができる。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000017
理論に束縛されることを望まないが、ＢＮＡ（ｃＥｔ）は従来のＬＮＡと同様の熱的安定性およびミスマッチ識別を有するものの、ヌクレアーゼに対する安定性が向上するからである。
　１つの実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記ｍｉＲＮＡ結合配列の相補鎖の少なくとも一つの鎖に含まれる。
　別の実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる。別の実施形態では、本発明で使用されるＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる。
　１つの実施形態では、本発明の複合体では「二本鎖構造」が1つ以上、あるいは複数含みうるものであり、特許文献１または実施例と同様のＳ－ＴｕＤ構造であってもよい。例えば、二本鎖構造は、直列であれば３つや４つでも連続して含まれることが可能であり、このような実施形態も本発明に包含されることが理解される。
　１つの実施形態では、本発明の複合体は、前記二本鎖構造を２つ以上含み、該二本鎖構造の第１の二本鎖構造の片端の２つの鎖にｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該２つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該２つ以上の二本鎖構造の第２の二本鎖構造の２つの鎖にそれぞれ結合している。好ましくは、本発明の複合体は、前記二本鎖構造の片端の2つの鎖に、miRNA結合配列を含む２つの鎖の末端が、それぞれ１～５塩基のリンカーを介して１本ずつ結合しており、二本鎖または四本鎖から選択される第２の多重鎖構造を含み、該二本鎖構造と該第２の多重鎖構造とに挟まれるように、該miRNA結合配列を含む２つの鎖のそれぞれの他端が、該第２の多重鎖構造の片端の2つの鎖に、それぞれ１～５塩基のリンカーを介して結合していることが好ましいが、これに限定されない。あるいは、本発明の複合体に含まれるｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖は、それぞれの鎖がｍｉＲＮＡ結合配列を含み、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖が２つあることが有利でありうるが、本発明はこれに限定されない。
　別の実施形態では、本発明では、ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している。好ましい実施形態では、本発明は、前記リンカーの長さは１～１０塩基長であり、より好ましくは、１～９塩基長であり、さらに好ましくは、１～８塩基長であり、さらに好ましくは、１～７塩基長であり、さらに好ましくは１～５塩基長であり、４塩基長、３塩基長、２塩基長、１塩基長であってもよい。
　本発明のmiRNA阻害複合体における二本鎖構造の長さは、上述のように任意の長さでよいが、好ましくは4塩基対以上の長さを有する。特に、本発明のRNA複合体に含まれる二本鎖構造の少なくとも１つ（すなわち第一の二本鎖構造）は、RNA複合体の核外輸送に重要な機能を持つ。この二本鎖の鎖長は、例えば10～50、15～50塩基対であってよく、好ましくは10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、または45塩基、あるいはそれらのいずれか以上であり、50、49、48、47、46、45、44、43、42、41、40、39、38、37、36、35、34、33、32、31、30、29、28、27、26、25、24、23、22、21、20、19、または18塩基、あるいはそれらのいずれか以下である。より好ましい態様では、二本鎖構造の塩基対の長さは、例えば10～30、15～30、好ましくは16～28、好ましくは17～25、好ましくは17～24、例えば17、18、19、20、21、22、23、または24である。20bpを超えても高い活性を発揮することはできるが、20bpを超えるdsRNAは、細胞質においてDicerによる切断の潜在的な標的となり得ることから、それを避けるために、本発明の複合体に含まれる二本鎖構造は20bp以下、例えば19bp以下、または18bp以下とすることができる。miRNA阻害複合体に含まれる二本鎖構造については、以下の好ましい実施形態においてさらに述べる。例えば5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp、7bp～8bp、10bp～12bpとしてよい。
　本発明の複合体中二本鎖の構造は、その下限の長さは、特に、活性が保持される限り限定されないが、少なくとも４塩基長、少なくとも５塩基長、少なくとも６塩基長、少なくとも７塩基長、少なくとも８塩基長であり、好ましくは、少なくとも９塩基長であり、さらに好ましくは少なくとも１０塩基長である。二本鎖は２つ以上ある場合は、それらの塩基長は同じであっても異なっていてもよい。また、１０塩基長で二本鎖の十分な形成が確認され、十分な効果があることが示されているが、場合によっては、例えば、少なくとも１１塩基長、少なくとも１２塩基長、少なくとも１３塩基長、少なくとも１４塩基長、少なくとも１５塩基長、少なくとも１６塩基長、少なくとも１７塩基長、少なくとも１８塩基長であってもよい。
　本発明の複合体中二本鎖の構造は、その上限の長さは、特に、活性が保持される限り限定されないが、例えば、１００塩基長以下、９０塩基長以下、８０塩基長以下、７０塩基長以下、６０塩基長以下、５０塩基長以下等であり得る。
　本発明のmiRNA阻害複合体に第二またはそれ以上の二本鎖構造が含まれる場合においては、これらの二本鎖構造の配列やその長さに特に制限はない。これらの二本鎖構造は、例えばmiRNA阻害複合体全体をコンパクトにするために、第一の二本鎖構造の長さよりも短くしてもよい。各二本鎖の鎖長は適宜調整してよいが、例えば4bp～20bpであり、例えば5bp～15bp、5bp～12bp、5bp～10bp、6bp～9bp、または7bp～8bpとしてよい。
　本発明では、ＢＮＡは１個あれば、その効果を奏することが期待されるが、好ましくは、２個以上、３個以上、４個以上、５個以上、６個以上、７個以上、８個以上、９個以上、１０個以上含んでいてもよい。ただし、６個程度で十分な効果を奏し、それ以上含めても効果が増加しない場合もあるため、６個前後（例えば、４～８個、４～６個等）含めることで十分であり得る。
　また、本発明の複合体は、従来の複合体よりも強い活性を有する（低濃度で作用する）ことが分かった。限定するものではないが、例えば、本発明の複合体は、従来の複合体よりも約２倍以上、約３倍以上、約４倍以上、約５倍以上、約６倍以上、約７倍以上、約８倍以上、９倍以上、約１０倍以上、約１５倍以上、約２０倍以上、約２５倍以上、約３０倍以上、約４０倍以上、約５０倍以上、約７５倍以上、約１００倍以上の効果を奏し得る。したがって、例えば、本発明の複合体は、１０ｎＭ以下で作用し、５ｎＭ以下で作用し、３ｎＭ以下で作用し、１ｎＭ以下で作用し、５００ｐＭ以下で作用し、３００ｐＭ以下で作用し、１００ｐＭ以下で作用し、５０ｐＭ以下で作用し、３０ｐＭ以下で作用し、１０ｐＭ以下で作用し、５ｐＭ以下で作用し、３ｐＭ以下で作用し、１ｐＭ以下で作用するという顕著な効果を奏する。
　別の実施形態では、本発明の複合体は、２から５つのｍｉＲＮＡ結合配列を含み、好ましくは２つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む。
　本発明の複合体は、
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000018
に示された構造を含み、該構造のＩおよびＩＩは二本鎖構造であって、該構造のａおよびｂにそれぞれ１つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む構造をとり得る。
　別の局面において、本発明は、本発明の複合体を構成する各々のRNAまたはその類縁体（すなわち、各々の一本鎖）を提供し、これらの各々のRNAまたはその類縁体も本発明の範囲内にある。一本鎖の場合の好ましい実施形態は、二本鎖構造におけるものと実質的に同様であり、同様の好ましい実施形態を採用することができる。
　別の局面において、本発明は、本発明の複合体を製造する方法であって、Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；Ｂ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程；ならびにＣ）脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程を包含する方法を提供する。
　さらなる局面において、本発明は、本発明のＲＮＡまたはその類縁体を製造する方法であって、Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；およびＢ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程を包含する方法を提供する。
　このような方法については、本明細書において別の節において詳述しており、実施例においても実証例を記載しており、これらを参考にして当業者は種々の複合体、ＲＮＡまたはその類縁体を製造することができることが理解される。
　（医薬および治療・予防法）
　別の局面において、本発明は、本発明の複合体を含む医薬を提供する。
　１つの「実施形態では、本発明のmiRNA阻害複合体、または該複合体を構成するRNA（ここでRNAとしては、天然のRNAおよび類縁体を含む）は、miRNAを阻害するための組成物とすることができる。本発明の組成物は、標的miRNAを特異的かつ効率的に阻害できるので、miRNAの阻害を介した遺伝子の機能制御に有用である。本発明の組成物は、必要に応じて薬理学的に許容される所望の担体または媒体と組み合わせることができる。それらには、通常核酸の懸濁に用いられる所望の溶液が挙げられ、例えば蒸留水、リン酸緩衝生理食塩水（PBS）、塩化ナトリウム溶液、リンゲル溶液、培養液等が例示できる。また植物油、懸濁剤、界面活性剤、安定剤、殺生物剤等が含有されていてもよい。また保存剤またはその他の添加剤を添加することができる。また本発明の組成物は、バイオポリマーなどの有機物、ハイドロキシアパタイトなどの無機物、具体的にはコラーゲンマトリックス、ポリ乳酸ポリマーまたはコポリマー、ポリエチレングリコールポリマーまたはコポリマーおよびその化学的誘導体などを担体として組み合わせることもできる。本発明の組成物は、所望の試薬として、または医薬組成物として使用できる。また本発明は、本発明の組成物、本発明のmiRNA阻害複合体、または該複合体を構成するRNAまたはその類縁体の、miRNAを阻害するための使用を提供する。また本発明は、それらのいずれかを含むmiRNA阻害剤を提供する。
　さらなる局面において、本発明は、有効量の本発明の複合体またはそれを含む医薬をそれを必要とする被験体に投与する工程を包含する、疾患または障害を治療または予防する方法を提供する。本発明は、限定されないが、例えば、すでに臨床開発が進んでいるHCV治療薬や腎臓の線維化治療剤としての利用等に応用することができる。
　本発明の医薬は、それ自体を投与してもよいし、または適当な医薬組成物として投与してもよい。投与に用いられる医薬組成物としては、本発明の医薬と薬理学的に許容され得る担体、希釈剤もしくは賦形剤とを含むものであってよい。このような医薬組成物は、経口または非経口投与に適する剤形として提供される。
　非経口投与のための組成物としては、例えば、注射剤、坐剤等が用いられ、注射剤は静脈注射剤、皮下注射剤、皮内注射剤、筋肉注射剤、点滴注射剤等の剤形を包含しても良い。このような注射剤は、公知の方法に従って調製できる。注射剤の調製方法としては、例えば、上記本発明の核酸を通常注射剤に用いられる無菌の水性液、または油性液に溶解、懸濁または乳化することによって調製できる。注射用の水性液としては、例えば、生理食塩水、ブドウ糖やその他の補助薬を含む等張液等が用いられ、適当な溶解補助剤、例えば、アルコール（例、エタノール）、ポリアルコール（例、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール）、非イオン界面活性剤〔例、ポリソルベート80、HCO-50（硬化ヒマシ油のポリオキシエチレン（50mol）付加物（polyoxyethylene（50mol）adduct　of　hydrogenated　castoroil））〕等と併用してもよい。油性液としては、例えば、ゴマ油、大豆油等が用いられ、溶解補助剤として安息香酸ベンジル、ベンジルアルコール等を併用してもよい。調製された注射液は、適当なアンプルに充填されることが好ましい。直腸投与に用いられる坐剤は、上記核酸を通常の坐薬用基剤に混合することによって調製されてもよい。
　経口投与のための組成物としては、固体または液体の剤形、具体的には錠剤（糖衣錠、フィルムコーティング錠を含む）、丸剤、顆粒剤、散剤、カプセル剤（ソフトカプセル剤を含む）、シロップ剤、乳剤、懸濁剤等が挙げられる。このような組成物は公知の方法によって製造され、製剤分野において通常用いられる担体、希釈剤もしくは賦形剤を含有していても良い。錠剤用の担体、賦形剤としては、例えば、乳糖、でんぷん、蔗糖、ステアリン酸マグネシウムが用いられる。
　上記の非経口用または経口用医薬組成物は、活性成分の投与量に適合するような投薬単位の剤形に調製されることが好都合である。このような投薬単位の剤形としては、例えば、錠剤、丸剤、カプセル剤、注射剤（アンプル）、坐剤が挙げられる。
　本発明の医薬は低毒性であり、そのまま液剤として、または適当な剤型の医薬組成物として、ヒトまたは哺乳動物（例、ラット、ウサギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、ネコ、イヌ、サルなど）に対して経口的または非経口的（例、血管内投与、皮下投与など）に投与することができる。
　細胞への導入はin　vitro、ex　vivoまたはin　vivoで行うことができる。細胞を介して投与する場合は、適当な培養細胞または接種対象動物から採取した細胞などに導入する。核酸の導入としては、リン酸カルシウム共沈殿法、リポフェクション、DEAEデキストラン法、注射針等により直接DNA溶液を組織に注入する方法、ジーンガンによる導入などが挙げられる。投与量は、疾患、患者の体重、年齢、性別、症状、投与目的、投与組成物の形態、投与方法、導入遺伝子等により異なるが、投与対象動物、投与部位、投与回数などに応じて適宜調整してよく、当業者であれば適宜決定することが可能である。投与経路は適宜選択することができる。投与対象は、好ましくは哺乳動物（ヒトおよび非ヒト哺乳類を含む）である。具体的には、ヒト、サル等の非ヒト霊長類、マウス、ラットなどのげっ歯類、ウサギ、ヤギ、ヒツジ、ブタ、ウシ、イヌ、ネコ、およびその他の哺乳動物が含まれる。
　本明細書において「または」は、文章中に列挙されている事項の「少なくとも1つ以上」を採用できるときに使用される。「もしくは」も同様である。本明細書において「2つの値の範囲内」と明記した場合、その範囲には2つの値自体も含む。
　本明細書において引用された、科学文献、特許、特許出願などの参考文献は、その全体が、各々具体的に記載されたのと同じ程度に本明細書において参考として援用される。
　以上、本発明を、理解の容易のために好ましい実施形態を示して説明してきた。以下に、実施例に基づいて本発明を説明するが、上述の説明および以下の実施例は、例示の目的のみに提供され、本発明を限定する目的で提供したのではない。従って、本発明の範囲は、本明細書に具体的に記載された実施形態にも実施例にも限定されず、特許請求の範囲によってのみ限定される。なお、本明細書中に引用された文献は、すべて本明細書の一部として組み込まれる。
　以下、本発明のヌクレオシド類縁体及びオリゴヌクレオチド類縁体を下記の合成スキームに従って、合成した。これらの合成は実施例において更に詳しく説明する。また、合成したオリゴヌクレオチド類縁体の特性を実験例によって測定した。なお、実施例中、特に断らない限り、Ｌｏｎｇ　ＴｙｐｅとはオリジナルのS-TuD（配列番号１～２）と同じSTEM左側18bp　右側10bpのものを指し、Short　typeとは、STEM左側10bp　右側10bpのものを指す。
　（製造例）
　（オリゴヌクレオチドの合成）
　オリゴヌクレオチドは、nS-8II合成機もしくはＡＫＴＡｏｌｉｇｏｐｉｌｏｔ合成機で合成した。市販の細孔ガラス質固相担体（２’-O-メチル-ＲＮＡ　CPG　Link　Technologies社製）と、標準的な保護基を有する２’-O-メチル-ＲＮＡホスホロアミダイト、すなわち、５’-Ｏ-ジメトキシトリチルＮ６-ベンゾイルアデノシン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ４-アセチルシチジン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ２-イソブチリルグアノシン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト、および５’-Ｏ-ジメトキシトリチルウリジン-2'-O-メチル-３’-Ｏ-Ｎ，Ｎ’-ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上シグマアルドリッチ社製）、並びに、2’,4’-BNANC(2’-O,4’-C-アミノメチレン架橋核酸)チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-アミノメチレン-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-チミジン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト、2’,4’-BNANCアデノシンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-アミノメチレン-５’-Ｏ-ジメトキシトリチル-Ｎ６-ベンゾイルアデノシン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト（以上BNA社製）、並びに、LNA（Locked　nucleic　acid）（2’-O,4’-C-メチレンリボ核酸）チミジンホスホロアミダイト、すなわち2’-O,4’-C-メチレン-５’-Ｏ-ジメトキシトリチルチミジン-N,N'-ジイソプロピルホスホロアミダイト(エキシコン社製)をオリゴヌクレオチド合成に使用した。ホスホロアミダイトは全て、アセトニトリル（ＣＨ３ＣＮ）中、０．１Ｍの濃度で使用した。2’-O-メチルRNA、BNA及びLNAについては１5分の連結／再利用時間を使用した。活性剤は、５-ベンジルメルカプト-テトラゾール（０．２５Ｍ、和光純薬社製）であり、ＰＯ-酸化については、ヨウ素／水／ピリジンを使用した。ＰS-ホスホロチオエート化については、市販のオリゴヌクレオチド自動合成機用硫化試薬（すなわちEIDTH、DDTT、PADS、Beucage試薬など）をピリジンとともに使用した。
　脱保護Ｉ（ヌクレオ塩基脱保護）
　合成が完了した後、合成担体をガラスボトルに移した。オリゴヌクレオチドを、担体１ｇに対して１５ｍLの、４０％メチルアミン水溶液と３３％メチルアミンエタノール溶液の等量混合物を用いて、４５℃で１３時間、塩基とリン酸基を同時に脱保護しながら担体から切断した。その後、エタノールアンモニア混合物を濾過して、新しい２５０ｍＬのボトルに入れた。担体を２×４０ｍＬのエタノール／水（１：１ｖ／ｖ）で洗浄した。その後、ロータリーエバポレーター（ｒｏｔｏ-ｖａｐ）で溶媒留去し乾固した。
　（ＨＰＬＣ精製）
　オリゴヌクレオチドを、Source　15　RPCゲルカラムでの逆相イオンペアＨＰＬＣで精製した。緩衝液は、５％　ＣＨ３ＣＮ、0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ａ）と９０％　ＣＨ３ＣＮ、0.1Mトリエチルアミン酢酸緩衝液（pH7.0）（緩衝液Ｂ）であった。５’末端にジメトキシトリチル基が保持された状態で全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし次の精製に供した。その後オリゴヌクレオチドプールを、Source30Qの陰イオンペアＨＰＬＣで精製した。溶液及び緩衝液は、０．６％のトリフルオロ酢酸（溶液A）、２０mMリン酸ナトリウム緩衝液（pH7.5）（緩衝液C）と２０mMリン酸ナトリウム緩衝液中の2M塩化ナトリウム（緩衝液D）であった。溶液Aを用い、ジメトキシトリチル基を脱離させた後、完全長のオリゴヌクレオチドを含む画分をプールし、脱塩後凍結乾燥した。化合物は、最終的に、MALDI-TOF/MSと変性ポリアクリルアミドゲルで分析した。
　（２本鎖化)
　精製の完了した１本鎖オリゴヌクレオチドを蒸留水にて溶解後、紫外吸光光度分析計を用い吸光度測定しオリゴヌクレオチド濃度を決定した。決定された濃度を用い相補鎖をそれぞれ等モル濃度になるように混合し、95℃で１０分加熱後徐冷し２本鎖形成させた。２本鎖形成は非変性ゲル電気泳動にて確認した。
（HeLaS3-miR199a細胞の作製および培養）
　HeLaS3細胞は10%ウシ胎児血清(FBS)を含むDMEM中、37℃で培養した。HeLaS3細胞を6ウェルプレートに１ウェルあたり1x105細胞（1x105　cells　per　well）でまき、24時間後にpLSP-miR199aウイルスベクター(<1x104　TU)を、8μg/mlのポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後からピューロマイシン（Puromycin）(1ug/ml)で選択した。1週間の選択の後、培地からピューロマイシン（Puromycin）を除去し、miR-199aレポーターを保持するHeLaS3細胞としてHeLaS3-miR199a細胞を得た。
　（ルシフェラーゼアッセイ）
　HeLaS3-miR199a細胞およびHCT-116細胞を、10%ウシ胎児血清（foetal　bovine　serum）(FBS)を含むDMEM中、それぞれ１ウェルあたり1x105細胞（1.0x105　cells　per　well）で導入の前日に24ウェルプレートにまき、Lipofectamine　2000　(LifeTechnologies)および100ngのレポータープラスミド(psiCHECKTM-2,psiCHECK2-T199a-3px3,psiCHECK2-T200c-3pまたはpsiCHECK2-T21-5p)（図１６および図１７を参照）および各種S-TuDをトリプリケートでトランスフェクトした。全てのアッセイはトランスフェクションの48時間後にdual　luciferase　assay(Promega)によりGLOMAXTM(Promega)で実施した。
　（実施例１：構造強化試験）
　本発明者らが開発したmiRNA阻害剤（合成Tough　Decoy,S-TuD）は低濃度でmiRNAの活性を阻害する核酸として注目されているが、その構造の特性上2本鎖化した後の物性が安定しない。そこで、本実施例では、S-TuDの安定的な大量生産及び物性試験法の確立を容易にするために、2本鎖を強固にする方法として2本鎖領域をハイブリダイゼーション能力が向上する修飾核酸に部分置換したものを使用し、miRNA阻害活性を従来型のS-TuDと比較した（図１Ａ）。
　従来型S-TuDで逆相HPLC分析をした結果を図１Ｂに示す。図１Ｂは、従来型S-TuDの逆相HPLC（ＲＰ－ＨＰＬＣ）分析（C18の逆相イオン対HPLC、XBridgeカラムのもの）により分析したS鎖、AS鎖、2本鎖の比較を示す。
　本実施例では、以下の修飾核酸を使用した。
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000019
２‘－Ｏ－メチルＲＮＡ
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000020
Figure JPOXMLDOC01-appb-C000021
　２’－Ｏ－メチルＲＮＡはＳ－ＴｕＤの基本構造に使用し、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を修飾核酸として使用した。ＬＮＡについても同様に使用可能である。
　(物性の改善実験)
　STEM領域の一部塩基を2本鎖形成能が上昇するタイプのヌクレオチド種（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））に変更し、物性評価を実施した。結果を図３８に示す。その結果、図１ＢのピークAが減少し、2本鎖の逆相HPLC純度分析精度が向上した。
　逆相HPLC純度分析のプロトコールは以下のとおりである。HPLC分析のカラムにはXBridgeC18　2.5μm　4.6nn　x　75mm　を用い、溶離液にはAとして5%アセトニトリル／0.1Mトリエチルアミン－酢酸緩衝液(pH7)を、Bとして90%アセトニトリル／0.1Mトリエチルアミン－酢酸緩衝液(pH7)を用いた。分析中のカラム温度は20℃で、流速は1mL/min、溶離液の濃度はA:B=100:0からA:B=75:25まで30分間かけて徐々に変化させた。検出はUV(260nm)の吸収により確認した。
　用いたオリゴヌクレオチドの構造を図２Aおよび図２Bに示す。合成は、上記オリゴヌクレオチドの合成したものを使用した。(1)C,U:　2'-F-C,　2'-F-U、(2)T　:　BNA-T、(3)T　:　BNA-T、(4)T　:　BNA-T　A　:　BNA-A、(5)T　:　BNA-T　A　:BNA-A（10塩基）が使用された。図２Bに示される配列は以下のとおりである：(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10；(1)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT4；(2)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT6；(3)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S8-BT4；(4)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT6；(5)”S-TuD199a-3p-1_18-pf-S6-BT4。
　またSTEM　I領域を10bpまで削った場合は、オリジナルなS-TuDと同様の2’-O-メチル体のみの場合、図３９－１、図３９－２および図４０に示すように、両方の鎖が一部1本鎖として残ってしまうのに対し、BNAで置換した場合は2本鎖形成能が向上した。
　また、STEM　I領域または両方のSTEM領域を８bpまで削っても、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化した場合は、図３９－１、図３９－２および図４０に示すように2本鎖形成が見られた。
　この物性改善が活性にどう影響するか、in　vitroのmiR-199a阻害アッセイで確認した。
　　miR-199a阻害アッセイのプロトコールは以下のとおりである。
　以下の実験1と実験2でウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）の比を取ることにより標的miRNAの活性を測定した。
　（実験１）
　miR199a_3p及び5pを内在性に僅かにしか発現しないHeLaS3細胞（Landgraf,　P.　et　al.　(2007)　Cell,　129,　1401-1414）を10%ウシ胎児血清（foetal　bovine　serum）(FBS)を含むDMEM中、37℃で培養した。HeLaS3細胞を6ウェルプレートに１ウェルあたり1x105細胞（1x105　cells　per　well）でまき、24時間後にpLSP-miR199aウイルスベクター(<1x104　TU)を、8μg/mlのポリブレンの存在下で導入し、トランスダクションの24時間後からピューロマイシン（Puromycin）(1ug/ml)で選択した。1週間の選択の後、培地からピューロマイシン（Puromycin）を除去し、miR-199aレポーターを保持するHeLaS3細胞としてHeLaS3-miR199a細胞を得た。
　（実験２）
　psiCHECK2-miRT（プロメガ社、XhoI-NotIサイトに、例えば、miR-199a-3pのような標的miRNAと相補な配列を挿入して作成；全体構造は図３に示す。）、図２に示された、合成S-TuD修飾体を用いて細胞（HeLaS3-miR199a）をトランスフェクションした。
　その後、トランスフェクションした細胞から発現するウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）がそれぞれの特異的な基質と反応することで生じる化学発光シグナルをルミノメーターで測定し、測定されたシグナルについてウミシイタケルシフェラーゼ（ＲＬ）とホタルルシフェラーゼ（ＦＬ）の比をとった。結果を図４－１、図４－２、および図５に示す。図４－１および図４－２の結果から、(2)～(4)の分子の効果を見ると、Ｔを十分に置換すれば、BNAはTだけでも十分であると思われる。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）を入れるとStem　Iの長さを短くできるようであるが、若干活性が下がるようであった。より短くするには、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）等のBNA量を増やす必要があるのではないかと考えられる。
　次に、実験1のコントロールレポーターの値で、実験2のmiR-199aレポーターの値を正規化したデータを作成した。図5に示す。図5に示されるように、S-TuDのmiR-199a阻害活性の強さがそのままルシフェラーゼ活性の高さになる。またS-TuD濃度は10-30-100-300-1000-3000pMの6点で行った。
　図９からもわかるように、MBS領域修飾による更なるmiRNA阻害活性の向上が見られた。STEM領域の長さはオリジナルと同一で一部をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果、オリジナルのS-TuDに比べ最大10倍程度阻害活性が向上した。このことは物性改善が活性そのものにも良い影響を与えることを示している。またSTEM　Iを10bpまで削った場合も最大3倍以上の活性向上が確認された。
　以上のように、2本鎖を強固にすることで、活性が同等なSTEM領域短鎖化S-TuDも達成することができるとしてコストダウンが可能になった。
　（実施例２：MBS領域への置換)
　本実施例ではMBS領域等種々の位置においてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した場合の影響を確認した。実施例１と同じレポーターアッセイ系を用いた。使用した配列は、図１０、１２および１３に示す。
　（使用した構造）
　本実施例では、まず、挿入部位の最適化のために、種々の構造の物を用いてＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した場合の影響を確認した、使用したS-TuDの構造は図６～７に示す。オリジナルのS-TuD199a-3p、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(22)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(24)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-3-MBSB2　(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を示す。修飾核酸（ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ））、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化及びMBS領域をホスホロチオエート化）、(23)-(2)　S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化及びSTEM領域をホスホロチオエート化）、(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化及び全配列ホスホロチオエート化）が使用された。
　（アッセイ手順）
　実施例１と同じレポーターアッセイを用いた。
　（結果）
　本実施例で得られた構造体について、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果を図８－１および図８－２に示す。図８－１および図８－２に示されるように、オリジナルのS-TuDに比較し最大10倍程度の阻害活性向上が見られる構造体を得ることができた。MBS領域の非シード領域にBNAを一部挿入することが重要であった。
　Long　type（Stem1=18,　Stem2=10)のStemをBNA化した場合（16）、そのMBSの非seed領域の相補配列にさらにBNA修飾を入れても抑制効果は増強しなかった(23）。この（16）のMBSのseed領域の相補配列にさらにBNA修飾を入れると抑制効果はやや減弱した（22）。Short　type　（Stem1=10,　Stem2=10)のStemをBNA化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合（18）、そのlong　type(23）とほぼ同程度にまで効果が増強された。PS修飾をStem構造に入れると大きく阻害効果が減弱し(23-2)、MBSに入れる(23-1)とさらに減弱した。両者に入れる(23-3)と阻害効果は消失した。バックボーンのホスホロチオエート化は活性にとってマイナスであったが、BNAの効果は保持されていた。
　次に、Short　type　（Stem1=10,　Stem2=10)のStemをBNA化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合（18）の濃度依存性についてみた結果を図９に示す。図９に示されるように、Short　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをBNA化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合（18）はBNA修飾の全くないoriginal(Long　type非修飾）の10倍弱程度効果が高かった。
　以上から、2本鎖形成が促進される修飾核酸（Bridged　Nucleic　Acid=BNA,　Locked　Nucleic　Acid=LNA、2本鎖化形成促進する修飾核酸であれば構造を問わない）をSTEM領域に含んだS-TuDが本発明で提供され、これらのS-TuDが顕著な構造安定性および効果の向上効果を有することが確認された。また、STEM領域の一部をBNAに置換した、最小10merまで短鎖化されたSTEM　I領域を有するS-TuDことで、より効果が増強されることが実証された。加えて、MBSのmiRNA非シード領域に一部BNA置換したS-TuDも同様の効果が奏されることが実証された。
　このような技術が提供されたことから、従来型で達成し得なかった安定的な物性評価が可能になり、逆相HPLC分析で純度分析が可能になった。また、このような安定化は複数のmiRNAターゲットで確認され普遍的に効果が示されることが確認された。従来型と同じ構造のSTEM領域の一部をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）もしくはLNA等の広義のBNAに置換すると、miRNA阻害活性がオリジナルS-TuDに比べ最大5倍程度向上していた。この効果は、複数のmiRNAターゲットで確認されており、普遍的に効果が示されることが確認された。
　また、最小10merまで短鎖化されたSTEM　Iを持つS-TuDは両方のSTEMを一部BNA化することでオリジナルS-TuDに比べ最大3倍程度活性向上することも確認された。この効果も、複数のmiRNAターゲットで確認されており、普遍的に効果が示されることが確認された。
　本発明の従来のS-TuDに比べ血清中での安定性が向上していることも確認された。したがって、本発明のS-TuDは、安定な医薬品として提供可能であることから、がんなどmiRNAの過剰発現が病因となる場合の治療薬として利用され、そして、もちろんmiRNA関連の研究試薬としての活用し得ることが期待される。
　（実施例３：STEM領域短鎖化＋MBS領域へのBNA挿入効果確認）
　次に本実施例では、実施例１～２の結果を受け、STEM領域短鎖化＋MBS領域へのBNA挿入効果確認を行った。
　(使用した構造)
　本実施例において使用したS-TuDの構造を図１０に示す。S-TuD199a-3pのオリジナル配列、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を使用した。
　（実験方法）
　実験方法は、実施例１～２に記載されているレポーターアッセイの方法と同様の手法で発現を確認した。
　（結果）
　個々のS-TuD　100ｐMおよび300ｐMでの結果を図１１－１および図１１－２に示す。図１１－１および図１１－２に示されるように、Short　typeについてBNA修飾の影響を検討した。オリジナルタイプとLong　typeのStem-BNA修飾(16)を比較に加えた。Short　type-BNA修飾無(1)’と比べて、stem部分にBNA修飾を入れた(6)’は大きく効果が増強した。さらにSeed相当部位にBNA修飾をいれた(17)は効果を増強しなかった。しかし非seed相当部位にBNA修飾を入れた(18)はさらに効果が増強し、(16)と同等以上になった。Short　typeにおいてはMBS内のBNA修飾部位によっては増強効果があることが分かった。
　（実施例４：血清中の安定性）
　次に、本実施例では、マウス血清を用いて血清中の安定性を確認した。
　（血清安定性の確認実験）
オリジナルのS-TuDと比較して、血清安定性が向上することを血清安定性試験により確認した。以下にプロトコールを示す。実験は、2μg　S-TuD／100%　20μlマウス血清の条件で、37℃中で0h、48h、72h、96h処理した。
　（構造）
　使用した修飾S-TuDの構造は、図１２～１３及び図１９に示す。すなわち、オリジナル構造、(16)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2、(23)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(1)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS1(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(23)-(2)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(23)-(3)S-TuD-miR-199a-3p-1_18-pf-L18B6-2-PS3(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(1)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10、(6)’S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6、(17)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）および(18)S-TuD199a-3p-1_18-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）である。
　（結果）
　結果を図１４～図１５及び図２０に示す。図１４～１５及び図２０で示されるように、MBS領域の一部ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）に置換した結果血清安定性の向上が見られた。
　マウス血清中での安定性についてみたところ、Long　type　S-TuDは未修飾でもヌクレアーゼ耐性を示したが、時間が経つにつれてスメアが多くなっていた。これは若干の分解をうけているためではないかと考えられる。Stem部分をBNA修飾するとこのスメアは消え、完全な耐性を獲得した。ここにさらにMBS-BNA修飾を入れても更なる効果は見られなかった。
　また、Short　type　S-TuDについてみたところ、Short　type　S-TuDは未修飾ではかなり分解を受けていたが、若干のヌクレアーゼ耐性を示した。Stem部分をBNA修飾すると完全な耐性を獲得した。ここにさらにMBS-BNA修飾を入れても更なる効果は見られなかった。
　さらに普遍性を検討したところ、図２０で示されるようにS-TuD-200c-1_22-pfのＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）置換体もS-TuD199aの場合と同様な、血清中での安定性の向上を確認することが出来た。
　以上から、S-TuD199a、S-TuD200cともにBNA修飾を加えることによりメインバンド上部のスメアが消え、安定性が増強していた。この効果はSTEM部分だけBNA修飾するよりも、Stem部分、MBS部分の両方にBNA修飾したものでより増強していた。特にS-TuD199aのshort　type((1)’(6)’(17)(18))において安定性増強効果は顕著でshort　typeにはBNA修飾は必須であると考えられる。S-TuD200cでは未修飾のlong　type(41)においてメインバンドが出現せず、スメアが見られた。S-TuD199aではメインバンドが見られたことから二次構造が関係しているものと推定される。また全ての結果でメインバンドの上部にはっきりとバンドが出ているのは血清タンパク質との非特異的結合と考えられる。
　（実施例５：普遍性の実験）
　本実施例では、普遍性を確認するために２種類のmiRNAを標的として同種の実験を行った。
　（普遍性の確認実験）
　実施例１におけるmiR-199aに代えて、miR-200c、miR-21に置換したものを用いて同様にレポーターアッセイ実験を行った。具体的には以下のとおりである。
　レポーターアッセイに使用したコンストラクトがmiR-200c、miR-21に置換されただけで、アッセイ方法は実施例１等と同一である。
　（使用した構造）
　miR-200cのための構造は、図19に示す。miR-21のための構造は図23に示す。miR-200cには(41)S-TuD-200c-1_22-pf、(42)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6、(43)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB1(seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(44)S-TuD-200c-1_22-pf-L18B6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）、(45)S-TuD-200c-1_22-pf-S10-BT6-MBSB2(非seed領域の相補配列をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化）を使用した。miR-21には、(51)S-TuD-21-1_17-10mut、(52)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6、(53)S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1、(54)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6、(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1を使用した。
　（結果）
　次に、普遍性の確認を確認した。普遍性は、miR-199a以外にmiR-200c、miR-21についても実施例１と同様の実験を行った。図２０には血清耐性を示す電気泳動の結果を示す。miR-200cでの結果をグラフ化したものを図２１－１および図２１－２（miR-200c）に示す。レポーターアッセイの結果を示す図２１－１および図２１－２に示されるように、Long　type（Stem1=18,Stem2=10)のStemをBNA化した場合（42）、そのMBSの非seed領域の相補配列にさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れても抑制効果は増強しなかった(44）。この42MBSのseed領域の相補配列にさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾を入れると抑制効果は減弱した（43）。Short　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した場合（45）、そのlong　type(44）とほぼ同程度にまで効果が増強された。また、図２２に示されるように、Short　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにBNA修飾した場合(45)はＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾の全くないoriginal（41）の2倍弱程度効果が高かった。0.1-10pMの投与では、S-TuDがチューブに非特異的に吸着する可能性も考え、担体としてS-TuD　NC2を30pM添加したものも解析したが、添加の効果は見られなかった。
　以上から、Short　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾したタイプは、Long　typeのいずれのものと比べても、活性は劣らないことが分かった。また、このShort　type（Stem1=10,Stem2=10)のStemをＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化しそのMBSの非seed領域の相補配列をさらにＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾したタイプは、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）非修飾のoriginalと比べ、標的miR-199aでは阻害活性が１０倍程度、また標的miR-200cでは２倍程度上昇した。
　このように、miR-199a以外にmiR-200cについても同程度の結果が確認された。
　miR-21で同様の効果を確認したところ、同様の効果が示された。結果を図２４～図２６に示す。図２４は、マウス血清処理後の電気泳動図を示す。S-TuD21の場合は、未修飾のlong　type(51)においてメインバンドが出現せず、スメアが見られた。修飾を行ったS-TuD(52-55)についてははっきりとしたメインバンドが得られたことから血清中での安定性の向上が確認された。なお全ての結果でメインバンドの上部にはっきりとバンドが出ているのは血清タンパク質との非特異的結合と考えられる。miR-21でのレポーターアッセイの結果をグラフ化したものを図２５－１および図２５－２（miR-21）に示す。S-TuD21（Original；51）と比較してstem部分をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した（52）では若干の効果増大が見られた。さらにMBSの非シード領域部分を修飾した53番では10倍近く効果が増大していた。Short　typeにおいてもMBSの非シード領域部分を修飾した（55）はOriginal（51）と比較して３倍以上効果が増大していたが、long　type（53）と比較すると若干弱かった。また、図２６で示すように濃度依存性を検討したところ、Original（51）と比較してstem部分およびMBSの非シード領域部分をＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾した（53）では10倍近く効果が増大していた。Short　typeにおいてもMBSの非シード領域部分を修飾した（55）はOriginal（51）と比較して３倍以上効果が増大していたが、long　type（53）と比較すると2/3倍程度であった。
　（阻害効果の強さの考察）
　199a、200c、21全てにおいてlong　typeかつBNA修飾をStem部分とMBSの非seed相当部位の両方にいれたもの（Aと略す）が最も効果が高かった。Short　typeのStem,MBS-BNA修飾型はAよりは効果が下がるが、originalよりは阻害効果が大きく高くなっていた。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾long　typeの増強程度は199a、21では従来型の10倍弱程度活性が高くなっていた。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾short　typeの増強程度は199a、21では従来型の3-8倍程度活性が高くなっていた。200cで増強程度が低いのはmiR-200cの発現量・活性が低いためか、すでにpMレベルで阻害効果が出ているので、差が出にくいのではないかと考えられる。
　以上から、Long　typeであれshort　typeであれ、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）修飾はStem部分とMBSの非seed相当部位の両方にいれることが効果、安定性の両面から推奨される。とくにshort　typeでは、stem部分のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）化は望ましいと考えられる。またLong　typeのMBSの非seed相当部位のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）の効果の程度にはmiRNAの種類により大きく違う。またstemの長さについては、in　vitroの結果ではlong　typeの方がshort　typeよりも少し効果が高いようであった。
　（実施例６：インビボ実験）
　次に、本実施例では、本発明のS-TuDが臨床応用できるかを確認した。
　（構造）
　使用した構造を図２７に示す。(51)S-TuD-21-1_17-10mut、（53）S-TuD-21-1_17-10mut-L18B6-MBSB1および(55)S-TuD-21-1_17-10mut-S10-BT6-MBSB1が使用された。
　（プロトコール）
　マウス（C57BL/6　6週齢　オス　）へ各S-TuDを1mg/kgで眼窩静脈に単回投与して（ｎ＝３）、24hr後にサクリファイスして腎臓を採取し、RT-PCR法で(S-TuDと結合していないと考えられるフリーの）miR-21量を定量した。
　（結果）
　結果を図２８～２９に示す。
　図２８に示されるように、腎臓でのmiR-21量をRT-PCR法で測定したところ、最も阻害活性の高いのは５３、それに５５が続いた。図２９に示されるように、マウス三匹の腎臓内のmiR-21の平均値を測定したところ、original　S-TuDではほとんどmiR-21の減少が見られないが、５３、および程度はやや落ちるものの５５でも、低下が検出される。
　なお、miR-122の阻害剤（LNA-ASO）はHCV治療薬としてPIIまで進んでいることが知られている。また本件実施試験に含まれているmiR-21の阻害剤（LNA-ASO）は、Regulus社により腎臓の線維化を抑える治療薬として非臨床試験およびPhaseIが完了し、現在PhaseIIまで進んでいる。以上から、本実施例の結果は、本発明のS-TuDが医薬として利用可能であることを示すin　vivoのデータと評価されるべきである。
　（実施例７：各種架橋型核酸の比較試験）
　次に本実施例では、実施例１～７の結果を受け、STEM領域へ2本鎖化形成能が高い修飾塩基置換を行うことがmiRNA阻害の活性を向上させることを確認するため、ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）と同位置に架橋構造が異なるLocked核酸（LNA；２’－Ｏ，４’－Ｃ－メチレンリボ核酸）置換を行い、活性を比較した。

　配列構造は図３２に示す。
　S-TuD基本構造はSTEM　Iを10bpに削った10-MBS-10タイプ（(5)で示される。）
　アッセイ方法としては、実施例１等で使用したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同じ手法を用いた。
　（結果）
　結果を図３３－１および図３３－２に示す。ＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）とLNAは同等の効果があり、構造普遍性を確認した。また10bpのSTEM領域に6カ所のＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）置換を実施しても活性は4ヵ所の置換と同等であった。
　（実施例８：STEM領域の短鎖化試験）
　次に本実施例では、STEM領域の短鎖化を行い、活性を比較した。
　用いた配列は図３４に示す。
　アッセイ方法としては、実施例1等で使用したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同様の手法を用いた。
　以下に、本実施例で使用した配列におけるＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）の数およびStem長の関係を示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　（結果）
　結果を図３５－１および図３５－２に示す。STEM領域を8bp以下にすると活性が5分の1以下に減少した。ただし6bpでも濃度依存的に活性上昇がみられることから、STEM領域は10bp以上あった方が望ましく、また図32の結果と合わせて考えるとSTEM長10bp以下の場合はBNA置換が望ましいことが確認された。
　（実施例９:STEM領域の短鎖化と架橋型核酸置換の活性相関試験
　本実施例では、STEM領域短鎖化と架橋型核酸置換の組み合わせを、オリジナルのS-TuD（STEM　I18bp　STEM　II　10bp）とオリジナルのS-TuDにSTEM　I及びIIそれぞれにBNA置換したS-TuDを比較して総合的に評価した。

　使用した配列の構造は図36に示す。アッセイ方法としては実施例1等において示したmiR199aのルシフェラーゼレポーターアッセイと同様の手法を用いた。
　（結果）
　結果を図３７－１および図３７－２に示す。S-TuDのmiRNA阻害活性は、オリジナルを１とすると、オリジナルのS-TuDにSTEM　I及びIIそれぞれにBNA置換したS-TuDが３倍以上、STEM　Iを10bpに短鎖化してＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）置換したS-TuDが約３倍の活性向上となった。このことによりSTEMの2本鎖形成を強固にすることがS-TuDのmiRNA阻害活性に大きな役割を果たすことが示された。
　以上、本発明を実施例に基づいて説明した。この実施例はあくまで例示であり、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業者に理解されるところである。
　以上のように、本発明の好ましい実施形態を用いて本発明を例示してきたが、本発明は、特許請求の範囲によってのみその範囲が解釈されるべきであることが理解される。本明細書において引用した特許、特許出願および文献は、その内容自体が具体的に本明細書に記載されているのと同様にその内容が本明細書に対する参考として援用されるべきであることが理解される。本願は2015年9月18日に出願された日本国出願特願2015-185365号に対して優先権主張をするものであり、その内容は、その全体が本願において参考として援用される。
　本発明は核酸医薬等を用いる製薬産業および試薬産業において有用である。
配列番号１：図２Aのオリジナルセンス配列（図４－１も同じ）
配列番号２：図２Aのオリジナルアンチセンス配列
配列番号３：図２A（１）のセンス配列
配列番号４：図２A（１）のアンチセンス配列
配列番号５：図２A（２）のセンス配列
配列番号６：図２A（２）のアンチセンス配列
配列番号７：図２A（３）のセンス配列
配列番号８：図２A（３）のアンチセンス配列
配列番号９：図２A（４）のセンス配列
配列番号１０：図２A（４）のアンチセンス配列
配列番号１１：図２A（５）のセンス配列
配列番号１２：図２A（５）のアンチセンス配列
配列番号１３：図６(16)のセンス配列
配列番号１４：図６(16)のアンチセンス配列
配列番号１５：図６(22)のセンス配列
配列番号１６：図６(22)のアンチセンス配列
配列番号１７：図６(23)のセンス配列
配列番号１８：図６(23)のアンチセンス配列
配列番号１９：図６(24)のセンス配列
配列番号２０：図６(24)のアンチセンス配列
配列番号２１：図７(17)のセンス配列
配列番号２２：図７(17)のアンチセンス配列
配列番号２３：図７(18)のセンス配列
配列番号２４：図７(18)のアンチセンス配列
配列番号２５：図７(23)-(1)のセンス配列
配列番号２６：図７(23)-(1)のアンチセンス配列
配列番号２７：図７(23)-(2)のセンス配列
配列番号２８：図７(23)-(2)のアンチセンス配列
配列番号２９：図７(23)-(3)のセンス配列
配列番号３０：図７(23)-(3)のアンチセンス配列
配列番号３１：図１０(1)’のセンス配列
配列番号３２：図１０(1)’のアンチセンス配列
配列番号３３：図１０(6)’のセンス配列
配列番号３４：図１０(6)’のアンチセンス配列
配列番号３５：図１２(23)のセンス配列
配列番号３６：図１２(23)のアンチセンス配列
配列番号３７：図１９(41)のセンス配列
配列番号３８：図１９(41)のアンチセンス配列
配列番号３９：図１９(42)のセンス配列
配列番号４０：図１９(42)のアンチセンス配列
配列番号４１：図１９(43)のセンス配列
配列番号４２：図１９(43)のアンチセンス配列
配列番号４３：図１９(44)のセンス配列
配列番号４４：図１９(44)のアンチセンス配列
配列番号４５：図１９(45)のセンス配列
配列番号４６：図１９(45)のアンチセンス配列
配列番号４７：図２３(51)のセンス配列
配列番号４８：図２３(51)のアンチセンス配列
配列番号４９：図２３(52)のセンス配列
配列番号５０：図２３(52)のアンチセンス配列
配列番号５１：図２３(53)のセンス配列
配列番号５２：図２３(53)のアンチセンス配列
配列番号５３：図２３(54)のセンス配列
配列番号５４：図２３(54)のアンチセンス配列
配列番号５５：図２３(55)のセンス配列
配列番号５６：図２３(55)のアンチセンス配列
配列番号５７：S-TuD　NC2（図１８、図２２）のセンス配列
配列番号５８：S-TuD　NC2（図１８、図２２）のアンチセンス配列
配列番号５９：図３２（２）’のセンス配列
配列番号６０：図３２（２）’のアンチセンス配列
配列番号６１：図３２（７）’のセンス配列
配列番号６２：図３２（７）’のアンチセンス配列
配列番号６３：図３２（８）’のセンス配列
配列番号６４：図３２（８）’のアンチセンス配列
配列番号６５：図３４（１）”のセンス配列
配列番号６６：図３４（１）”のアンチセンス配列
配列番号６７：図３４（２）”のセンス配列
配列番号６８：図３４（２）”のアンチセンス配列
配列番号６９：図３４（３）”のセンス配列
配列番号７０：図３４（３）”のアンチセンス配列
配列番号７１：図３４（４）”のセンス配列
配列番号７２：図３４（４）”のアンチセンス配列
配列番号７３：図３４（５）”のセンス配列
配列番号７４：図３４（５）”のアンチセンス配列
配列番号７５：図１７のpsiCHECK2-T200c-3p-s（センス配列）
配列番号７６：図１７のpsiCHECK2-T200c-3p-a（アンチセンス配列）
配列番号７７：図１７のpsiCHECK2-T199a-3px3-s（センス配列）
配列番号７８：図１７のpsiCHECK2-T199a-3px3-a（アンチセンス配列）
配列番号７９：図１７のpsiCHECK2-T21-5p-s（センス配列）
配列番号８０：図１７のpsiCHECK2-T21-5p-a（アンチセンス配列）

Claims (27)

  1. ＲＮＡまたはその類縁体を含むｍｉＲＮＡ阻害複合体であって、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は、少なくとも１つの二本鎖構造およびｍｉＲＮＡ結合配列を含み、該ｍｉＲＮＡ結合配列の２つの鎖が、該二本鎖構造の少なくとも片端の２つの鎖に一本ずつ結合しており、該ｍｉＲＮＡ阻害複合体は少なくとも１つの架橋核酸（ＢＮＡ）を含む、ｍｉＲＮＡ阻害複合体。
  2. 前記ＢＮＡは２’位側で酸素および炭素からなる群より選択される少なくとも1つの原子を介し、４’位側で炭素と炭素および窒素からなる群より選択される少なくとも１つ原子を介して架橋されたＢＮＡを含む、請求項１に記載の複合体。
  3. 前記ＢＮＡは
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000022
    （式中、Ｒ１、Ｒ１’、Ｒ２、Ｒ２’、およびＲ３は、それぞれ独立して、水素原子、置換または非置換のアルキル基、置換または非置換のアルケニル基、置換または非置換のシクロアルキル基、置換または非置換のアリール基、置換または非置換のアラルキル基、置換または非置換のアシル基、置換または非置換のスルホニル基、置換または非置換のシリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０～２の整数であり、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｎは、１～３の整数であり、ｑは０または１の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、請求項１に記載の複合体。
  4. 前記ＢＮＡは、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000023
    （式中、Ｒ３は、水素原子、アルキル基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、アラルキル基、アシル基、スルホニル基、シリル基、および機能性分子ユニット置換基からなる群より選択される基を示し、Ｂａｓｅは、アデニニル基、チミニル基、ウラシリル基、イノシニル基、シトシニル基、グアニニル基、およびメチルシトシニル基からなる群より選択される基を示し、ｍは、０～２の整数であり、ｎは、１～３の整数である。）で示される２’，４’置換架橋核酸を含む、請求項１に記載の複合体。
  5. 前記ＢＮＡは、
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000024
    または２’，４’メタノ架橋核酸（ＬＮＡ）を含む、請求項１に記載の複合体。
  6. 前記ＢＮＡはＢＮＡＮＣ（ＮＭｅ）である、請求項１に記載の複合体。
  7. 前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖および前記ｍｉＲＮＡ結合配列の相補鎖の少なくとも一つの鎖に含まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の複合体。
  8. 前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の少なくとも一方の鎖に含まれる、請求項１～６のいずれか一項に記載の複合体。
  9. 前記ＢＮＡは、前記二本鎖構造部分の両方の鎖に含まれる、請求項８に記載の複合体。
  10. 前記ＢＮＡは２つ以上含まれる、請求項１に記載の複合体。
  11. 前記ＢＮＡは４つ以上含まれる、請求項１に記載の複合体。
  12. 前記ＢＮＡは６つ以上含まれる、請求項１に記載の複合体。
  13. 前記複合体は、前記二本鎖構造を２つ以上含み、該二本鎖構造の第１の二本鎖構造の片端の２つの鎖にｍｉＲＮＡ結合配列を含む鎖がそれぞれ１本ずつ結合しており、該２つ以上の二本鎖構造に挟まれるように、該鎖のそれぞれの他端が、該２つ以上の二本鎖構造の第２の二本鎖構造の２つの鎖にそれぞれ結合している、請求項１～１２のいずれか一項に記載の複合体。
  14. 前記ｍｉＲＮＡ結合配列を含む２つの鎖の末端が、リンカーを介して結合している、請求項１～１３のいずれか一項に記載の複合体。
  15. 前記リンカーの長さは１～５塩基長である、請求項１４に記載の複合体。
  16. 前記二本鎖の構造は、少なくとも６塩基長である、請求項１～１５のいずれか一項に記載の複合体。
  17. 前記二本鎖の構造は、少なくとも８塩基長である、請求項１～１６のいずれか一項に記載の複合体。
  18. 前記二本鎖の構造は、少なくとも１０塩基長である、請求項１～１７のいずれか一項に記載の複合体。
  19. 前記二本鎖の構造は、少なくとも１５塩基長である、請求項１～１８のいずれか一項に記載の複合体。
  20. 前記二本鎖の構造は、少なくとも１８塩基長である、請求項１～１９のいずれか一項に記載の複合体。
  21. 前記二本鎖の構造は、５０塩基長以下である、請求項１６～２０のいずれか一項に記載の複合体。
  22. ２から５つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、請求項１～２１のいずれか一項に記載の複合体。
  23. ２つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む、請求項２２に記載の複合体。
  24. 請求項１３に記載の複合体であって、以下
    Figure JPOXMLDOC01-appb-C000025
    に示された構造を含み、該構造のＩおよびＩＩは二本鎖構造であって、該構造のａおよびｂにそれぞれ１つのｍｉＲＮＡ結合配列を含む複合体。
  25. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の複合体を構成するＲＮＡまたはその類縁体。
  26. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の複合体または請求項２５に記載のＲＮＡまたはその類縁体を製造する方法であって、
    　Ａ）化学合成により、リボ核酸およびＢＮＡを用いて、目的とするＲＮＡまたはその類縁体の一本鎖の保護体およびその相補体の保護体を合成する工程；
    　Ｂ）生成した該一本鎖の保護体およびその相補体をそれぞれ脱保護する工程；ならびに
    　必要に応じてＣ）脱保護した該一本鎖のそれぞれを二本鎖形成条件に配置して二本鎖を形成する工程
    を包含する方法。
  27. 請求項１～２４のいずれか一項に記載の複合体を含む医薬。
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