JP6908276B2 - 極小ナノ粒子及びそれを製造する方法並びに使用する方法 - Google Patents
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Description
本願は、２０１５年５月４日に出願された米国仮出願62/156,380に基づく優先権を主張し、その開示は参照により本願に包含される。
この発明は、国立衛生研究所によって付与された認可番号CA161280-03の下、政府支援を受けて完成された。合衆国政府は本発明に所定の権利を有する。
本開示は、一般に、極小ナノ粒子及びそれを製造する方法並びに使用する方法に関する。より具体的には、本開示は、一般に、極小シリカ及びアルミノシリケートナノ粒子に関する。
シリカナノ粒子(ＳＮＰ)は、その大きな表面積、不活性及び高い生体適合性のため、潜在的な治療/診断用途について関心を集めている。しかしながら、たいていのＳＮＰは１０ｎｍを超える大きさである。
１２ｎｍを超える粒子は、インビボで生体から効率的に除去されず、不都合なことに肝臓及び他の器官/組織に分布し、これらの組織を有毒物質にさらす可能性がある(特に、これらの１０ｎｍを超えるＳＮＰは、薬物及び／又は放射能で改変される)。直径約８ｎｍの粒子は約１日間、１０〜１１ｎｍの粒子は約３〜５日間体内に存在し、１２ｎｍより大きい場合は、除去されないか非常にゆっくりと除去される。
現在、極小無機ナノ粒子は、癌セラノスティクス(theranostics)のためのナノ医療として急速に関心を集めている。いくつかの有機系ナノ医療は、多機能性及び多原子価効果に起因して、すでに従来の化学療法薬より競合的である。無機ナノ粒子は、さらに、ナノ医療の構築要素を多様化し、それらの内在的な物性に関連する利点及びより低い製造コストを提供するかもしれない。研究室からクリニックへのナノ粒子の安全な橋渡しには、実質的な科学及び制御に関する多数のハードルを克服することが必要になる。最も重要な判断基準は、好ましい体内分布であり、その経時的進化(薬物動態、ＰＫ)プロファイルである。腎クリアランスのための大きさの閾値は、１０ｎｍ未満である。今日まで、ごく少数の無機ナノ粒子プラットホームが、効率的な腎クリアランスを可能にする１０ｎｍ未満のサイズで合成されてきた。それらの中で、コーネルドット(Cornell dots)又は単にＣドット(C dots)と呼ばれる１０ｎｍ未満サイズのポリエチレングリコール被覆(ペグ化：ＰＥＧ化)蛍光コア-シェルシリカナノ粒子(ＳＮＰ)のみが、ヒトでの第一臨床試験のための治験薬(ＩＮＤ)として、米国食品医薬品局(ＦＤＡ)によって承認されている。メラノーマ患者での第一臨床試験の結果が後押ししているが、複数の合成の挑戦が、このような１０ｎｍ未満サイズの蛍光性有機-無機ハイブリッドＳＮＰのために続いている。
第一に、従前のＣドット-タイプのＳＮＰ合成の試みはすべて、修正Stober法に従っており、溶媒としてアルコールが使用されていた。しかしながら、生物学的又は臨床応用で使用する物質としては、反応媒体として水が好ましい。それは、合成と精製プロトコルを非常に簡素化し、揮発による無駄をより少なくし、それによって粒子製造を実質的により速くよりコスト効率良くするであろう。さらに、Stober法は直径が数十ｎｍ〜ミクロンのＳＮＰを製造するために広く使用されているが、アルコール中での反応速度論の制限のため、１０ｎｍ以下の粒子サイズが、この合成方法によるサイズ制御の限界である。
第二に、ＰＥＧで共有結合的に覆われたシリカ粒子の表面は、ペグ化の間の表面電荷の減少が、粒子凝集をもたらすか、または少なくとも広い粒径分布をもたらし得るため、扱いにくい可能性がある。この影響は、粒子表面エネルギーの増加に起因して極小粒子でより明白であり、それゆえ、粒子の単分散度とサイズ制御能力を制限する。
第三に、その等電点ｐＨ２〜３より上ではシリカが負の表面電荷を有するため、負に帯電した基を有するシラン-結合有機蛍光色素の、ＳＮＰへの共有結合性の封入効率は低い(シリカとフルオロフォアの間の静電反発力の結果として)。これは特に、生体組織のイメージング用途に最も望ましい近赤外線(ＮＩＰ)発光色素に当てはまる。ＮＩＲ色素は、大きな非局在化π-電子系を有し、水に可溶性である(一般的に、その周辺に複数の負の電荷を有する官能基を必要とする(例えば、硫酸塩))。それらの典型的なコストは、１ｍｇあたり２００〜３００ドルのオーダーであり、典型的に用いられているシラン-色素コンジュゲートの最初の合成後の再使用には問題があるため、低い取り込み効率はこれらの色素にとって問題である。
最後に、１０ｎｍ未満サイズの蛍光ＳＮＰ及びコア-シェルＳＮＰのために報告されている無機元素組成はシリカ以外にはない。特に、剛性の増加が、非放射レートの減少の結果として色素あたりの蛍光収量の増加と直接相関していたため、有機色素環境により高い剛性をもたらす組成は興味深い。ここで、アルミニウムアルコキシドを添加剤として派生するシリカ組成は、アルミニウムアルコキシドがアルコキシシラン由来のシリカにおける既知の硬化成分であり、かつ、アルミナが筋肉内及び皮下注射される高容積ワクチンに添加できる承認されたアジュバントであるため、特に興味深い。
これらの課題はすべて、サイズ制御の改善された１０ｎｍ未満の有機-無機ハイブリッドドットを得るための水ベースのアプローチ、これまで知られていない組成、および増強したパフォーマンス特性を系統的に開発するために、オリジナルの蛍光性コア-シェルＳＮＰ(Ｃドット)合成を再考することを提起する。
１ｎｍ未満の(すなわち、単原子層レベルでの)サイズ制御の正確性を有する、狭いサイズ分散を有する蛍光性シリカナノ粒子(ＳＮＰ)及びコア-シェルＳＮＰを調製するための水性合成方法論。近赤外線(ＮＩＲ)放射体を含む、様々な種類のフルオロフォアを、共有結合的に被包することができる。輝度は、追加のシリカシェルの添加によって増強できる。
この方法論はさらに、これまでに知られていない組成を有する、１０ｎｍ未満サイズの蛍光性コア-シェルＳＮＰの合成を可能にする。特に、アルミニウムゾル・ゲル前駆物質の添加は、蛍光性アルミノシリケートナノ粒子(ＡＳＮＰ)及びコア-シェルＡＳＮＰをもたらす。高度に負に帯電したＮＩＲフルオロフォアの封入効率と輝度は、アルミニウム無しの対応するＳＮＰに対して、増強される。得られた粒子は、〜０．８の量子収率を示す(すなわち、理論上の輝度限界に近付いている)。
全ての粒子が、立体的安定性を提供するためにペグ化されてもよい。ヘテロ二官能性ＰＥＧを、蛍光性ＳＮＰ、コア-シェルＳＮＰ、及びそれらのアルミニウム含有類似体のペグ化粒子表面上にリガンドを導入し、リガンドで機能化された１０ｎｍ未満のＮＩＲ蛍光性ナノプローブを製造するために、採用することができる。水ベースの合成から生じた物質を、コーネルドット又はＣドットと呼ばれる初期のアルコールベースの修正Stober法から生じた蛍光性コア-シェルＳＮＰと区別するために、本明細書に記載される水中で合成されたＳＮＰ及びＡＳＮＰを、コーネルプライムドット(Cornell prime dots)はＣ’ドット(C’dots)及びＡｌＣ’ドット(AlC’dots)と称する。
これらの有機-無機ハイブリッドナノ物質は、癌の診断及び治療(セラノスティクス)を含むナノ医療に応用され得る。
合成条件を変えることによって、Ｃ‘ドット及びＡｌＣ’ドットは、約２．４ｎｍ〜約７．３ｎｍ又はそれ以上の範囲となりうる。変更できる条件には、以下が含まれる：反応温度；ＴＭＯＳ又は同等化合物の濃度；塩基(例えば、水酸化アンモニウム)の濃度及び／又は粒子成長期間。これらの条件の例は、実施例１の表１に含まれている。
前記温度は、ほぼ室温から約８０℃あるいはそれ以上の範囲でもよい。ＴＭＯＳの濃度は、約０．０１１Ｍ〜約０．０４３Ｍあるいはそれ以上の範囲でもよい。水酸化アンモニウムの濃度は、約０．００２Ｍ〜約０．０６Ｍあるいはそれ以上の範囲でもよい。粒子成長期間は、約１０分〜約２０時間あるいはそれ以上の範囲でもよい。
本開示の本質及び対象をより完全に理解するために、以下の詳細な説明が、添付の図面とともに参照されるべきである。
［図１］図１は、水ベースの蛍光性ＳＮＰ成長経路とともに、製造された粒子の化学構造を示す図である。
［図２］図２は、ブランクのＳＮＰ(すなわち、フルオロフォア封入無し)の特徴を示す(ａ−ｊ)。(ａ−ｉ)は、水溶液中でＤＬＳにより測定された以下の平均径を有するブランクＳＮＰの２つの異なる拡大率(挿入図)でのＴＥＭ画像を示す：(ａ)２．４ｎｍ、(ｂ)３．１ｎｍ、(ｃ)３．７ｎｍ、(ｄ)４．２ｎｍ、(ｅ)４．５ｎｍ、(ｆ)５．２ｎｍ、(ｇ)５．９ｎｍ、(ｈ)６．５ｎｍ、及び(ｉ)７．３ｎｍ。(ｊ)水溶液中でＤＬＳにより測定された異なる平均径を有するブランクのＳＮＰの粒度分布。(ｋ−ｎ)異なる平均径を有するＣｙ５-被包蛍光性ＳＮＰ(Ｃ‘ドット)の特性：４．３ｎｍ、４．７ｎｍ、５．２ｎｍ、５．９ｎｍ、６．２ｎｍ、６．８ｎｍ、７．３ｎｍ、及び７．８ｎｍ。平均径は、ＦＣＳによって測定。(ｋ)はＦＣＳ自己相関曲線を示す。(ｌ)は、吸光度(マッチド)及び発光スペクトルを示す；(ｍ)は、粒子当たりのフルオロフォアの数(ＦＣＳによる)を示す；(ｎ)は、異なる平均径を有する蛍光性ＳＮＰ粒子当たりの、ＦＣＳ測定(棒)及び算出(点)による蛍光輝度を、水溶液中の遊離色素と比較して示す。
［図３］図３は、０(コア/シード)〜４シェル、及びＦＣＳによって測定された以下の平均径を有するＣｙ５-被包蛍光性コア-シェルＳＮＰ(Ｃ‘ドット)の２つの異なる拡大率(挿入図)でのＴＥＭ画像を示す：５．０ｎｍ(コア/シード)、６．１ｎｍ、６．８ｎｍ、７．８ｎｍ、及び８．７ｎｍ(ａ−ｅ)；(ｆ)吸光度(マッチド)及び発光スペクトル；(ｇ)ＦＣＳ自己相関曲線；(ｈ)粒子当たりのフルオロフォアの数(ＦＣＳによる)；(ｉ)０(コア/シード)〜４シェルを有するＣ’ドット粒子当たりのＦＣＳ測定(棒)及び算出(黒点)による蛍光輝度を、水溶液中の遊離色素と比較して示す(テキスト参照)。
［図４］図４は、異なる種類のフルオロフォア(ａ−ｆ)から生じたＣ‘ドットの吸光度(マッチド)及び発光スペクトル(左)及びＦＣＳ特性(右)を示す。(ａ)ＲｈＧ、 (ｂ)ＴＭＲ、(ｃ)Ｃｙ５、(ｄ)Ｃｙ５．５、(ｅ)ＤＹ７８２、及び(ｆ)ＣＷ８００。(ｇ)は、異なる色素/色を有するＣ’ドットの正規化吸光度及び発光スペクトル。(ｈ)異なる色の色素から派生したＣ‘ドットの溶液の外観を示す写真。左から右に；ＲｈＧ、ＴＭＲ、Ｃｙ５、Ｃｙ５．５、ＤＹ７８２、及びＣＷ８００。
［図５］ (ａ)シリカシェル有り及び無しのＡｌＣ‘ドットの固体29Ｓｉ ＣＰ/ＭＡＳ(上)及び27Ａｌ ＭＡＳ(下)ＮＭＲスペクトル；右側の挿入図は、共有結合的に被包されたＮＩＲ Ｃｙ５．５色素を有する対応アルミノシリケートネットワークの分子構造のモデルを示す。(ｂ)コアＡＳＮＰのＴＥＭ画像。(ｃ)コア-シェルＡＳＮＰのＴＥＭ画像。(ｄ)ＦＣＳ自己相関曲線、及び(ｅ)水溶液中の遊離Ｃｙ５．５色素と比べた、Ｃｙ５．５封入コアＡＳＮＰ及びコア-シェルＡｌＣ’ドットの吸光度(マッチド)及び発光スペクトル。(ｆ，ｇ)従来のＣ‘ドットと比べて、劇的に異なるｐＨ条件下で合成した、Ｃｙ５(ｆ)及びＣｙ５．５(ｇ)封入粒子バッチから得られたＧＰＣ溶出曲線(テキストの説明参照)。垂直のハッチング線は、ガイドとしてのモル質量標準物質(キロダルトン、ｋＤａ)の溶出時間を示す。
［図６］(ａ) ｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化ＰＥＧ-シランの共役化学。(ｂ) 遊離ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド、遊離Ｃｙ５色素、及び、ｃ(ＲＧＤｙＣ)表面機能化無し/有りのＣｙ５-Ｃ‘ドット(シリカシェル無し)を比較する吸光度スペクトルであって、成功したｃ(ＲＧＤｙＣ)表面改質を示唆している。(ｃ)遊離ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチドと、様々な種類のｃ(ＲＧＤｙＣ)表面機能化Ｃ‘ドットを比較する吸光度スペクトルであって、リガンドによるナノ粒子-ＰＥＧ-表面機能化の成功が、粒子構造(すなわち、追加のシリカシェル有り又は無し)、被包されたフルオロフォアの種類、又は粒子組成(すなわち、Ｃ’ドット／ＡｌＣ‘ドット)と無関係であることを示唆している。
［図７］図７は、Ｃｙ５-フルオロフォア、ＰＥＧ-シラン、マレイミド-機能化ＰＥＧ-シラン、ｃ(ＲＧＤｙＣ)ペプチド、ＳｉＯ2マトリクス(ａ)、及びｃ(ＲＧＤｙＣ)-ＰＥＧ-Ｃｙ５-Ｃ‘ドット(ｂ及びｃ)の分子画像レンダリングを示す。Ｃ’ドットモデルは、１つのＣｙ５フルオロフォアを封入する３ｎｍ以下のシリカコア、１ｎｍ以下のシリカシェル、１．５ｎｍ以下のＰＥＧ層、及び１６の容易にアクセス可能なｃ(ＲＧＤｙＣ)リガンドからなる。分子モデルは可視化のために異なる様式で表され、水素無しの分子フレームワーク(ｂ)、及び現実的な原子寸法を有する球ベースの分子モデル(ｃ)を含む。
［図８］図８は、インサイツ(in-situ)ＦＣＳ測定の結果を示す。(ａ)粒子径、及び(ｂ)反応と粒子成長の期間中の粒子濃度。
［図９］図９は、(ａ)室温で合成された粒子、及び(ｂ)まず室温で合成され、その後ＰＥＧ-シラン添加によって成長を停止させる前にさらに３日間８０℃の熱処理にかけた粒子のＴＥＭ画像を示す。
［図１０］図１０は、ＦＣＳ自己相関曲線のフィットの例として、６．２ｎｍのＣ‘ドットＦＣＳ特性評価結果を示す。
［図１１］図１１は、様々な平均径(ＦＣＳによって測定)を有するＣｙ５-被包蛍光性及びペグ化ＳＮＰ(Ｃｙ５-Ｃ’ドット、シェル無し)のＴＥＭ画像を示す。 (ａ)４．３ｎｍ、(ｂ)４．７ｎｍ、(ｃ)５．２ｎｍ、(ｄ)５．９ｎｍ、(ｅ)６．２ｎｍ、(ｆ)６．８ｎｍ、(ｇ)７．３ｎｍ、(ｈ)７．８ｎｍ。
［図１２］図１２は、０〜３層のシェルを有するブランクのペグ化コア-シェルＳＮＰ(フルオロフォア無し)のＴＥＭ画像を示す(ａ−ｄ)。(ａ)シェル無し(コア/シード)４．１ｎｍ、(ｂ)１つのシェル、５．６ｎｍ、(ｃ)２つのシェル、６．５ｎｍ、(ｄ)３つのシェル、７．８ｎｍ。平均径はＤＬＳで測定。(ｅ)ＤＬＳによって測定した、０〜３層のシェルを有するＳＮＰの粒径分布。
［図１３］図１３は、単一合成における粒子成長メカニズムの切り替えを示す。(ａ)の経路で強調されるように、形成粒子の成長は、まず制御された凝集を経て、その後モノマーの添加が続く。ＰＥＧ-シランの添加により異なる反応時点で粒子成長を停止させることにより、この合成から３セットの粒子が製造される。(ｂ)ＦＣＳ及び(Ｃ)光学的吸収/発光測定によって、得られた粒子の特性が明らかにされる。
［図１４］図１４は、３．５ｎｍ付近の平均径を有するＡＳＮＰのＤＬＳ粒度分布とＴＥＭを示す。
［図１５］図１５は、合成したままのＣｙ５ドープ・ペグ化ＳＮＰ(Ｃｙ５-Ｃ‘ドット、シェル無しのＧＰＣ溶出図(elugram)(下のグラフ)と、様々なフラクションの関連するＦＣＳ特性の結果(上の３つのグラフ)を示す。
［図１６］図１６は、遊離Ｃｙ５色素、Ｃｙ５-Ｃ’ドット(コアのみ)、及びｃ(ＲＧＤｙＣ)機能化Ｃｙ５-Ｃ’ドット[ｃ(ＲＧＤｙＣ)-Ｃｙ５-Ｃ’ドット]のＦＣＳ測定自己相関曲線の比較を示す。
［図１７］図１７は、６ｎｍ(ＤＬＳ測定)のブランクの非蛍光性ペグ化ＳＮＰ(フルオロフォア封入無し)のＴＧＡ曲線を示す。
本開示は、ナノ粒子(例えば、コア又はコア-シェルナノ粒子)を提供する。前記ナノ粒子は、本明細書で極小ナノ粒子とも呼ばれる。本開示は、前記ナノ粒子を製造する方法及び使用する方法も提供する。
本明細書で提示される範囲はすべて、別段の記載がない限り、少数第十位までの範囲内のすべての値を含む。
本明細書に開示される技術は、粒子サイズ、粒径分布、蛍光波長、蛍光輝度、組成、粒子ペグ化、粒子表面機能化、合成収量、生成物純度、及び製造信頼性を含む多面的に改善された制御を伴う、極小の機能性ペグ化蛍光性シリカナノ粒子に対する水性合成法を提供する。単一の有機-無機ハイブリッドナノ物質合成系においてこれらの面をすべてカバーする系統的で正確な制御は、これまでに達成されておらず、有機-無機ハイブリッドナノ物質の研究室からクリニックへの安全な橋渡しを妨げていた。それゆえ、本明細書に開示された技術は、ナノ医療用途に大きなポテンシャルを示す、詳細が明らかで系統的に高度に調節可能なシリカベースのナノ物質へのアクセスを提供する。
一面では、本開示は、極小ナノ粒子を製造する方法を提供する。この方法は、水性の反応媒体(例えば、水)の使用に基づいている。前記ナノ粒子は、ポリエチレングリコール基で表面機能化されることができる(例えば、ペグ化)。
本明細書に記載される方法は、生成物の質に実質的な変化を生じることなく、例えば、１０ｍＬの反応から１０００ｍＬ以上へ、直線的にスケールアップされてもよい。この拡張性は、ナノ粒子の大規模製造にとって重要である。
前記方法は、水性反応媒体(例えば、水)中で実施される。例えば、前記水性媒体は水を含む。ある反応物質が、極性非プロトン性溶媒(例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦ)中の溶液として、様々な反応混合物に添加される。様々な例において、前記水性媒体は、極性非プロトン性溶媒以外の有機溶媒（例えば、Ｃ1〜Ｃ6アルコールなどのアルコール）を、１０％以上、２０％以上、又は３０％以上含まない。ある例では、前記水性媒体は、アルコールを１％以上、２％以上、３％以上、４％以上、又は５％以上含まない。ある例では、前記水性媒体は、検出可能なアルコールを含まない。例えば、本明細書に開示される任意の方法の任意の工程の反応媒体は、本質的に水、及び任意で極性非プロトン性溶媒からなる。
前記方法の様々な時点で、ｐＨを所望の値又は所望の範囲内に調節することができる。前記反応混合物のｐＨは、塩基の添加によって増加できる。適切な塩基の例には、水酸化アンモニウムが含まれる。
例えば、ナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面(ポリエチレングリコール基で表面機能化[すなわち、ペグ化]されていてもよい)を作成する方法には、
ａ）室温(地域に応じて、例えば１５℃〜２５℃)で、水とＴＭＯＳ(シリカコア形成モノマー)を含む(例えば、１１ｍＭ〜２７０ｍＭの濃度で)反応混合物を形成すること、ここで、当該反応混合物のｐＨ(例えば、水酸化アンモニウムなどの塩基を使用して調整できる)は６〜９である(これが、平均径[例えば、最長寸法]が、例えば１ｎｍ〜２ｎｍであるコア前駆物質ナノ粒子の形成をもたらす)；
ｂ）ｉ）前記反応混合物を、ある時間(ｔ1)及び温度(Ｔ1)で保持(例えば、室温〜９５℃[Ｔ1]で０．５日〜７日[ｔ1])することにより、平均径(例えば、最長寸法)が２〜１５ｎｍであるナノ粒子(コアナノ粒子)を形成するか、又は
ii）前記反応混合物を、必要に応じて室温まで冷却し、及び、ａ）で得られた反応混合物に、シェル形成モノマー(例えば、オルトケイ酸テトラエチル、ＴＭＯＳ以外の、例えば、ＴＥＯＳ又はＴＰＯＳなど)を添加する(前記添加は、シェル形成モノマー濃度が二次核形成の閾値未満となるように行われる)ことによって、平均径(例えば、最長寸法)が２〜５０ｎｍ(例えば、２〜１５ｎｍ)のコア-シェルナノ粒子を形成すること；
ｃ）必要に応じて、ｂ）ｉ）で又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物のｐＨを、ｐＨ６〜１０に調節すること；及び
ｄ）任意で(コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子をペグ化する場合)、ｂ）ｉ）の又はｂ）ii）のコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に室温で、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(シラン成分に共有結合したＰＥＧ成分を含む)(例えば、１０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度で)(例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中に溶解されたＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を添加し、及び、得られた反応混合物をある時間(ｔ2)及び温度(Ｔ2)で保持(例えば、室温[Ｔ2]で０．５分〜２４時間[ｔ2])すること(これによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部がｂ）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着する)；
ｅ）ｄ）の混合物をある時間 (ｔ3)及び温度(Ｔ3)で加熱する(例えば、４０〜１００℃[Ｔ3]で１時間〜２４時間[ｔ3])ことによって、ポリエチレングリコール基で表面機能化(官能化)されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成すること、
が含まれる。
ａ）室温(地域に応じて、例えば１５℃〜２５℃)で、水とＴＭＯＳ(シリカコア形成モノマー)を含む(例えば、１１ｍＭ〜２７０ｍＭの濃度で)反応混合物を形成すること、ここで、当該反応混合物のｐＨ(例えば、水酸化アンモニウムなどの塩基を使用して調整できる)は６〜９である(これが、平均径[例えば、最長寸法]が、例えば１ｎｍ〜２ｎｍであるコア前駆物質ナノ粒子の形成をもたらす)；
ｂ）ｉ）前記反応混合物を、ある時間(ｔ1)及び温度(Ｔ1)で保持(例えば、室温〜９５℃[Ｔ1]で０．５日〜７日[ｔ1])することにより、平均径(例えば、最長寸法)が２〜１５ｎｍであるナノ粒子(コアナノ粒子)を形成するか、又は
ii）前記反応混合物を、必要に応じて室温まで冷却し、及び、ａ）で得られた反応混合物に、シェル形成モノマー(例えば、オルトケイ酸テトラエチル、ＴＭＯＳ以外の、例えば、ＴＥＯＳ又はＴＰＯＳなど)を添加する(前記添加は、シェル形成モノマー濃度が二次核形成の閾値未満となるように行われる)ことによって、平均径(例えば、最長寸法)が２〜５０ｎｍ(例えば、２〜１５ｎｍ)のコア-シェルナノ粒子を形成すること；
ｃ）必要に応じて、ｂ）ｉ）で又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物のｐＨを、ｐＨ６〜１０に調節すること；及び
ｄ）任意で(コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子をペグ化する場合)、ｂ）ｉ）の又はｂ）ii）のコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に室温で、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(シラン成分に共有結合したＰＥＧ成分を含む)(例えば、１０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度で)(例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中に溶解されたＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を添加し、及び、得られた反応混合物をある時間(ｔ2)及び温度(Ｔ2)で保持(例えば、室温[Ｔ2]で０．５分〜２４時間[ｔ2])すること(これによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部がｂ）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着する)；
ｅ）ｄ）の混合物をある時間 (ｔ3)及び温度(Ｔ3)で加熱する(例えば、４０〜１００℃[Ｔ3]で１時間〜２４時間[ｔ3])ことによって、ポリエチレングリコール基で表面機能化(官能化)されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成すること、
が含まれる。
前記ナノ粒子は、合成後の処理工程にかけられてもよい。例えば、合成後(例えば上記例のｅ)の後)、溶液を室温まで冷まし、その後透析膜チューブ(例えば、分子量カットオフ[分画分子量]が１０，０００であり、市場で入手可能な(例えば、Pierceから)透析膜チューブ)に移す。透析チューブに入れた溶液を、ＤＩ-水(水の容積は、反応容積より２００倍以上大きい、例えば、１０ｍＬの反応に対して２０００ｍＬの水)で透析し、水を１〜６日間毎日交換し、残存試薬、例えば水酸化アンモニウムと遊離シラン分子を洗い流す。前記粒子を、その後２００ｎｍのシリンジフィルター(fisher brand)を通してろ過し、凝集物又はダストを除去する。必要であれば、さらに高純度の合成粒子(例えば、未反応試薬又は凝集塊が１％以下)を保証するために、さらなる精製プロセス(ゲル浸透クロマトグラフィー及び高速液体クロマトグラフィーを含む)を、前記ナノ粒子に適用してもよい。任意の精製プロセス後、もし他の溶媒を更なるプロセスで使用するのであれば、精製されたナノ粒子を脱イオン水に戻してもよい。
前記コアはシリコンコアであってもよい。シリコンコア形成で使用される反応混合物は、唯一のシリコンコア形成モノマーとして、ＴＭＯＳを含んでもよい。
前記コアはアルミノシリケートコアであってもよい。アルミノシリケートコア形成で使用される反応混合物は、唯一のシリコンコア形成モノマーとしてＴＭＯＳを、及び一以上のアルミナコア形成モノマー(例えば、アルミニウムアルコキシド、例えば、アルミニウム-tri-sec-ブトキシド又は複数のアルミニウムアルコキシドの組み合わせなど)を含むことができる。
アルミノシリケートコア合成の場合、反応混合物のｐＨは、アルミナコア形成モノマーを添加する前に、ｐＨ１〜２に調節される。アルミノシリケートコア形成後、溶液のｐＨは、ｐＨ７〜９に調節され、そして任意で、１００〜１，０００ｇ/ｍｏＬの分子量(その間の全ての整数値及び範囲を含む)のＰＥＧを、１０ｍＭ〜７５ｍＭの濃度(その間の全ての整数値及び範囲を含む)で、前記反応混合物のｐＨをｐＨ７〜９に調節する前に前記反応混合物に添加する。
コアナノ粒子を形成するために使用される反応混合物は、色素(染料)前駆物質を含んでもよい。この場合、得られたコア又はコア-シェルナノ粒子は、その中に被包された又は取り込まれた一以上の色素分子を有する。例えば、コアナノ粒子は、その中に被包された、１，２，３，４，５，６，又は７つの色素分子を有する。色素前駆物質の混合物を使用してもよい。前記色素前駆物質は、シランにコンジュゲートした色素である。例えば、マレイミド官能基を有する色素が、チオール官能基を有するシランにコンジュゲートされる。別の例では、ＮＨＳエステル官能基を有する色素が、アミン官能基を有するシランにコンジュゲートされる。適切なシランと共役化学の例は、当該分野において既知である。前記色素は、波長４００ｎｍ(青)〜８００ｎｍ(近赤外)の発光(例えば、蛍光)を有してもよい。例えば、前記色素はＮＩＲ色素である。適切な色素の例には、ローダミングリーン(ＲＨＧ)、テトラメチルローダミン(ＴＭＲ)、シアニン５(Ｃｙ５)、シアニン５.５(Ｃｙ５.５)、シアニン７(Ｃｙ７)、ATTO647N、Dyomics DY800、Dyomics DY782及びIRDye 800CWが含まれるがこれらに限定されず、且つ、ポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子又はポリエチレングリコール基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子は、その中に被包された一以上の蛍光色素分子を有する。
シリカシェルは、前記コアナノ粒子上に形成されることができる。シリカシェルは、例えばコア形成が完了した後、形成される。シリカシェル形成前駆物質の例には、オルトケイ酸テトラアルキル(例えば、ＴＥＯＳ及びＴＰＯＳなど)が含まれる。シリカシェル形成前駆物質の混合物を使用してもよい。ＴＭＯＳは、シリカシェル形成前駆物質ではない。シリカシェル形成前駆物質は、極性非プロトン性溶媒中の溶液として、前記反応混合物に添加されてもよい。適切な極性非プロトン性溶媒の例には、ＤＭＳＯ及びＤＭＦが含まれる。
シリカシェル形成前駆物質は別々のアリコートで添加することが望ましい。例えば、前記シェル形成モノマー(単数又は複数)を、別個のアリコート(例えば、４０〜５００アリコート)で添加する。前記アリコートは、一以上のシェル形成前駆物質(例えば、ＴＥＯＳ及び／又はＴＰＯＳ)と極性非プロトン性溶媒(例えば、ＤＭＳＯ)を含むことができる。各アリコートは、１〜２０マイクロモルのシェル形成モノマーを有することができる。アリコートを添加する間隔は、１〜６０分(その間の全ての整数の分の値と範囲を含む)とすることができる。反応混合物のｐＨは、シリカシェル形成プロセスの間に変動し得る。ｐＨを７〜８に維持するためにｐＨを調節することが望ましい。
コア又はコア-シェルナノ粒子形成後、前記コア又はコア-シェルナノ粒子を、一以上のＰＥＧ-シラン・コンジュゲートと反応させてもよい。様々なＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを、一緒に又は様々な順番で添加することができる。このプロセスは本明細書においてペグ化とも称される。ＰＥＧ-シランの変換率は５％と４０％の間であり、ポリエチレングリコールの表面密度は、ｎｍ2あたり１．３〜２．１のポリエチレングリコール分子である。リガンド機能化ＰＥＧ-シランの変換率は４０〜１００％であり、各粒子と反応するリガンド機能化ＰＥＧ-シラン前記物質の数は３〜９０である。
ペグ化は様々な時間と温度で実施することができる。例えば、シリカコア又はコア-シェルナノ粒子の場合は、ペグ化は室温で０．５分から２４時間(例えば一晩)ナノ粒子と接触させることによって実施できる。例えば、アルミナ-シリケートナノ粒子(例えば、アルミナ-シリケートコアナノ粒子、又はシリカコア・シリカシェルナノ粒子)の場合、温度は８０℃で一晩である。
ＰＥＧ-シランのＰＥＧ成分の鎖長(すなわち、ＰＥＧ成分の分子量)は、３〜２４のエチレングリコールモノマー(例えば、３〜６、３〜９、６〜９、８〜１２、又は８〜２４のエチレングリコールモノマー)に調節されてもよい。ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長は、粒子を取り囲むＰＥＧ層の厚みとペグ化粒子の薬剤動態特性を調節するために選択できる。リガンド-機能化ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長は、粒子のＰＥＧ層の表面上のリガンド基のアクセス性(露出度)(これにより結合性能及び標的指向性能が変化する)を調節するために使用することができる。
ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートは、リガンドを含むことができる。リガンドは、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのＰＥＧ成分(ＰＥＧ部分)に共有結合する(例えば、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのヒドロキシ末端を通じて)。前記リガンドは、シラン成分にコンジュゲートした末端と反対側のＰＥＧ成分の末端にコンジュゲートできる。ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートは、ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物(例えば、マレイミド官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ、ＮＨＳエステル官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ、アミン官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧ、チオール官能基を有するヘテロ二官能性ＰＥＧなど)を使用して形成することができる。適切なリガンドの例には、ペプチド(天然の又は合成の)、放射標識(例えば、124Ｉ、131Ｉ、225Ａｃ又は177Ｌｕ)を含むリガンド、抗体、反応基(例えば、薬物分子、ゲフィチニブなどの分子にコンジュゲートできる反応基)を含むリガンドが含まれるが、これらに限定されない。
例えば、リガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを、ＰＥＧ-シランに加えて添加する(例えば、上記例のｄ)で)。この場合、リガンドを含むポリエチレングリコール基及びポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基及びリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子、が形成される。リガンド-機能化又は反応基-機能化ＰＥＧ-シランの変換率は４０〜１００％であり、各粒子と反応するリガンド-機能化ＰＥＧ-シラン前駆物質の数は３〜６００である。
例えば、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを添加(例えば、上記例のｄ)で) する前後(例えば、２０秒〜５分前又は後)に、リガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを(例えば、０．０５ｍＭ〜２．５ｍＭの間の濃度で)、室温で、前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物(例えば、上記例のｂ)ｉ)又はｂ)ii)から得られたもの)に添加する。得られた反応混合物を、ある時間(ｔ4)と温度(Ｔ4)で(例えば、室温[Ｔ4]で０．５分から２４時間[ｔ4])保持し、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部を、前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子(例えば、上記例のｂ)から得られたもの)の表面の少なくとも一部に吸着させる。続いて、前記反応混合物を、ある時間(ｔ5)と温度(Ｔ5)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ5]で１時間〜２４時間[ｔ5])加熱し、リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。任意で、その後に、得られた反応混合物(リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を含む反応混合物)に、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(リガンド無しのＰＥＧ-シランの濃度は１０ｍＭ〜７５ｍＭの間)(例えば、極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなど]に溶解したＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を室温で添加し、得られた反応混合物をある時間(ｔ6)と温度(Ｔ6)で(例えば、室温[Ｔ6]で０．５分〜２４時間[ｔ6])保持する (それによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部が、リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子の表面の少なくとも一部、又はリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子の少なくとも一部に吸着される)、及び、得られた混合物をある時間(ｔ7)と温度(Ｔ7)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ7]で１時間〜２４時間[ｔ7])加熱し、それによって、ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。
別の例では、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、それにより、反応基を有するポリエチレングリコール基、及び任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。任意で、ポリエチレングリコール基を、第二反応基(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び、任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び任意で、ポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。
別の例では、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を任意で有するポリエチレングリコール基、及び任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基、及び任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成した後、第二反応基(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び、任意でポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基、及び任意で、ポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成し、ここで、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部はＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を有するポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子、反応基を有するポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又は反応基を有するポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の形成後、前記反応基を、ある反応基で機能化された第二リガンド(ポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基とリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、ポリエチレングリコール基と第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基とで表面機能化されたナノ粒子、ポリエチレングリコール基と第二リガンドで機能化されたポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子、リガンドを含むポリエチレングリコール基で表面機能化されたナノ粒子、又はポリエチレングリコール基と第二リガンドで機能化されたリガンドを含むポリエチレングリコール基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する。
反応基で機能化されたＰＥＧ基を有するナノ粒子は、さらに一以上のリガンドで機能化されてもよい。例えば、機能化されたリガンドを、ＰＥＧ基の反応基と反応させることができる。ナノ粒子合成後の機能化の適切な反応化学及び条件の例は、当該分野で既知である。
前記ナノ粒子は、狭い粒度分布を有することができる。様々な例において、前記ナノ粒子の粒度分布(ペグ化の前又は後)(これは、外来性物質、例えば、未反応試薬、ダスト粒子/凝集物などを含まない)は、平均粒径(例えば、最長寸法)＋/−５，１０，１５，又は２０である。粒径は、当該分野で既知の方法で測定できる。例えば、粒径は、ＴＥＭ、ＧＰＳ、又はＤＬＳで決定される。ＤＬＳは、系統偏差を含み、それゆえ、ＤＬＳ粒度分布は、ＴＥＭ又はＧＰＳによって決定される粒度分布と相関しないかもしれない。
一面では、本開示は、本開示のナノ粒子を含む組成物を提供する。前記組成物は、一以上の種類を含むことができる(例えば、異なる平均径及び／又は一以上の異なる組成的特徴を有する)。
例えば、組成物は、複数のコアナノ粒子及び／又はコア-シェルナノ粒子(例えば、シリカコアナノ粒子、シリカコア-シェルナノ粒子、アルミノシリケートコアナノ粒子、アルミノシリケートコア-シェルナノ粒子)を含む。ナノ粒子は、１種以上のポリエチレングリコール基(例えば、ポリエチレングリコール基、機能化[例えば、一以上のリガンド及び／又は反応基で機能化された]ポリエチレングリコール基、又はそれらの組み合わせ)で表面機能化されていてもよい。ナノ粒子は、その中に被包された一つの色素又は複数の色素の組み合わせ(例えば、ＮＩＲ色素)を有していてもよい。色素分子は、ナノ粒子に共有結合される。前記ナノ粒子は、本開示の方法によって作成できる。
組成物中のナノ粒子は、様々な大きさを有することができる。前記ナノ粒子は、２〜１５ｎｍのコアサイズ(その間の全ての０．１ｎｍの値及び範囲を含む)を有することができる。様々な例において、前記ナノ粒子は、２，２．５，３，３．５，４，４．５，５，５．５，６，６．５，７，７．５，８，８．５，９，９．５，１０，１０．５，１１，１１．５，１２，１２．５，１３，１３．５，１４，１４．５又は１５ｎｍのコアサイズを有する。様々な例において、前記コア及び／又はコア-シェルナノ粒子の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％が、２〜１５ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有する。様々な例において、前記コア-シェルナノ粒子の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％が、２〜５０ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有する。様々な例において、前記コア及び／又は前記コア-シェルナノ粒子のコアの少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、９９．９％又は１００％が、２〜１５ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有する。代表的な粒度分布の場合、前記組成物は、粒径判別(粒径選択/除去)プロセス(例えば、ろ過、透析、クロマトグラフィー(例えば、ＧＰＣ)、遠心分離など)にかけられなくてよい。例えば、本開示のナノ粒子は、前記組成物の唯一のナノ粒子である。
前記組成物は、さらなる成分を含んでもよい。例えば、前記組成物は、個体(例えば、哺乳類、例えばヒト)に投与するために適切なバッファーも含むことができる。前記バッファーは、薬学的に許容できるキャリアでもよい。
前記組成物は、合成された際、そして合成後の加工/処理の前に、ナノ粒子、粒子(２〜１５ｎｍ)、ダスト粒子/凝集物(＞２０ｎｍ)、未反応試薬(＜２ｎｍ)を有してもよい。
一面では、本開示は、本開示のナノ粒子及び組成物の使用を提供する。例えば、ナノ粒子又はナノ粒子を含む組成物は、送達及び／又はイメージング方法で使用される。
ナノ粒子によって運ばれるリガンドは、診断及び／又は治療薬(例えば、薬物)を含んでもよい。治療薬の例には、化学療法剤、抗生物質、抗真菌剤、抗寄生虫剤、抗ウイルス剤、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。親和性リガンドが前記ナノ粒子にコンジュゲートされ、ナノ粒子の標的化送達を可能にしてもよい。例えば、前記ナノ粒子は、特定の細胞種に関連する細胞成分(例えば、細胞膜上の又は細胞内区画内の)に結合する能力のあるリガンドにコンジュゲートされる。標的にされる分子は、腫瘍マーカー又はシグナル経路の分子であってもよい。前記リガンドは、ある細胞種(例えば、腫瘍細胞など)に特異的に結合する親和性を有してもよい。ある例では、前記リガンドは、ナノ粒子を特定のエリア、例えば、肝臓、脾臓、脳などに導くために使用されてもよい。個体におけるナノ粒子の位置を決定するためにイメージングが使用できる。
前記ナノ粒子又はナノ粒子を含む組成物は、例えば、薬学的に許容できるキャリア(前記ナノ粒子を体の一つの器官又は部分から体の別の器官又は部分に輸送するのを促進するもの)内に含まれて、個体に投与されてもよい。個体の例には、ヒト及び非ヒト動物などの動物が含まれる。個体の例には哺乳類も含まれる。
薬学的に許容できるキャリアは、一般的に水性である。薬学的に許容できるキャリアで使用できる物質の例には、糖(例えば、ラクトース、グルコース及びスクロース)；デンプン(例えば、コーンスターチ及びポテトスターチ)；セルロース、及びその誘導体(例えばカルボキシメチル・セルロース・ナトリウム、エチルセルロース、及び酢酸セルロース)；粉末トラガント；麦芽；ゼラチン；タルク；賦形剤(例えば、ココアバター及び坐剤ワックス)；油(例えば、ピーナツ油、綿実油、サフラワー油、セサミ油、オリーブ油、コーン油、大豆油)；グリコール(例えば、プロピレングリコール)；ポリオール(例えば、グリセリン、ソルビトール、マンニトール、ポリエチレングリコール)；エステル(例えば、オレイン酸エチル及びラウリン酸エチル)；アガー；緩衝剤(例えば、水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウム)：アルギン酸；発熱物質非含有水；等張食塩水；リンゲル液；エチルアルコール；リン酸緩衝液；及び製薬処方で採用される他の非毒性の適合物質が含まれる(REMINGTON'S PHARM. SCI., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975)参照)。
本ナノ粒子を含む組成物は、任意の適切なルートで、単独で又は他の剤と組み合わせて、個体に投与できる。投与は、任意の手段、例えば、非経口的、粘膜、肺、局所、カテーテルを使用した、又は経口的手段の送達などによって、達成できる。非経口的送達には、例えば、皮下、静脈内、筋肉内、動脈内、及び臓器の組織への注射が含まれる。粘膜送達には、例えば、鼻腔内送達が含まれる。肺送達には、薬物の吸入が含まれる。カテーテルを使用する送達には、イオン注入カテーテル系送達による送達が含まれる。経口送達には、腸溶性剤による送達、又は経口での液体の投与が含まれる。経皮送達には、皮膚パッチの使用による送達が含まれる。
本ナノ粒子を含む組成物の投与後、ＮＰの経路、位置、及びクリアランスを、一以上の画像処理技術を使用してモニターできる。適切な画像処理技術の例には、Artemis Fluorescence Camera Systemが含まれる。
本開示は、細胞、細胞外成分又は組織などの生物材料をイメージング(画像処理)する方法を提供し、当該方法は、前記生物材料を、一以上の色素を含むナノ粒子あるいは当該ナノ粒子を含む組成物と接触させること；励起電磁(ｅ/ｍ)放射線(例えば、光)を、組織又は細胞に照射し、それによって、前記色素分子を励起させること；前記励起色素分子によって放射されるｅ/ｍ放射線を検出すること；及び検出されたｅ/ｍ放射線を捕獲し処理して、前記生物材料の一以上のイメージを提供することを含む。これらの工程の一以上を、インビトロ又はインビボで実施できる。例えば、細胞又は組織は個体に存在してもよく、培地中に存在してもよい。ｅ/ｍ放射線への細胞又は組織の暴露は、インビトロで(例えば、培養条件下で)達成されてもよく、又はインビボで達成されてもよい。個体内又は個体の体の一部内にあり、容易に到達できない細胞、細胞外物質、組織、器官などにｅ/ｍ放射線を照射するために、光ファイバー装置が使用できる。
例えば、個体内の領域をイメージングする方法は、（ａ）前記個体に、一以上の色素分子を含む本開示のナノ粒子又は組成物を投与すること；（ｂ）被検者に励起光を照射し、それによって、前記一以上の色素分子の少なくとも一つを励起すること；（ｃ）励起された光を検出すること(検出された光は、励起光による励起の結果として個体中の前記色素分子によって放射されたものである)；及び（ｄ）検出された光に対応するシグナルを処理して前記被検者内の領域のイメージを一以上提供すること(例えば、リアルタイムのビデオストリーム)；を含む。
蛍光粒子は、遊離色素より明るいので、蛍光粒子は、組織画像処理のため、及び、転移腫瘍を画像化するために使用できる。加えて、又はその代わりに、リガンド-機能化粒子のリガンド基(例えば、チロシン残基又はキレート剤)に、又は特定のリガンド機能化がないペグ化粒子のシリカマトリクスに、光誘起電子移動イメージングのために、放射性同位体をさらに付着させることができる。前記放射性同位体が治療のために選択される場合 (例えば、225Ａｃ又は177Ｌｕ)、これは付加的な放射線治療特性を有する粒子をもたらすであろう。
例えば、薬物-リンカー・コンジュゲート(このリンカー基は、薬物放出のために、腫瘍内の酵素又は酸性条件で特異的に切断されることができる)を、薬物送達用の粒子上の機能的リガンドに共有結合的に付着することができる。例えば、薬物-リンカー-チオール・コンジュゲートは、マレイミド-ＰＥＧ-粒子の合成後、チオール-マレイミド・コンジュゲーション反応を通じて、マレイミド-ＰＥＧ-粒子に付着できる。さらに、薬物-リンカー・コンジュゲートと癌を標的とするペプチドの両方を、腫瘍に特異的に薬物送達するために、粒子表面に付着することができる。
本明細書に開示された様々な実施形態と例で記載する方法の工程は、本開示の
方法を実施し、本開示の組成物を製造するのに十分である。このように、一実施形態では、前記方法は本質的に、本明細書に開示の方法の工程の組み合わせからなる。別の実施形態では、前記方法は、そのような工程のみからなる。
方法を実施し、本開示の組成物を製造するのに十分である。このように、一実施形態では、前記方法は本質的に、本明細書に開示の方法の工程の組み合わせからなる。別の実施形態では、前記方法は、そのような工程のみからなる。
以下の説明では、本開示の方法と組成物の様々な例が開示される。
１．任意でポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基で表面機能化された(すなわち、ペグ化)ナノ粒子、又は任意でＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）室温(地域に応じて、例えば１５℃〜２５℃)で、水とＴＭＯＳ(シリカコア形成モノマー)を含む(例えば、１１ｍＭ〜２７０ｍＭの濃度で)反応混合物を形成すること、ここで、当該反応混合物のｐＨ(例えば、水酸化アンモニウムなどの塩基を使用して調整できる)は６〜９である(これが、平均径[例えば、最長寸法]が、例えば１ｎｍ〜２ｎｍであるコア前駆物質ナノ粒子の形成をもたらす)；
ｂ）ｉ）前記反応混合物を、ある時間(ｔ1)及び温度(Ｔ1)で保持(例えば、室温〜９５℃[Ｔ1]で０．１時間〜７日[ｔ1]、例えば１０〜１５分)することにより、平均径(例えば、最長寸法)が２〜１５ｎｍであるナノ粒子(コアナノ粒子)を形成すること、又は
ii）前記反応混合物を、必要に応じて室温まで冷却し、及び、ａ）で得られた反応混合物に、シェル形成モノマー(例えば、オルトケイ酸テトラエチル、ＴＭＯＳ以外の、例えば、ＴＥＯＳ又はＴＰＯＳなど)を添加する(前記添加は、シェル形成モノマー濃度が二次核形成の閾値未満となるように行われる)ことによって、コアサイズ(例えば、最長寸法)が２〜１５ｎｍ及び／又は平均径(例えば、最長寸法)が２〜５０ｎｍのコア-シェルナノ粒子を形成すること；
ｃ）必要に応じて、ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物のｐＨをｐＨ６〜１０に調節すること；及び
ｄ）任意で(コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子をペグ化する場合)、ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に室温で、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(シラン成分に共有結合したＰＥＧ成分を含む)(例えば、１０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度で)(例えば、必要に応じて、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中に溶解されたＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を添加し、及び、得られた反応混合物をある時間(ｔ2)及び温度(Ｔ2)で保持(例えば、室温[Ｔ2]で０．５分〜２４時間[ｔ2])すること(これによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部が、ｂ）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着する)；
ｅ）任意で、ｄ）で得られた混合物をある時間(ｔ3)及び温度(Ｔ3)で加熱する(例えば、４０〜１００℃[Ｔ3]で１時間〜２４時間[ｔ3])ことによって、ＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成すること；
を含む方法。
２．前記反応混合物が、さらにアルミナ又はアルミナ-シリケートコア形成モノマー(例えば、アルミニウムアルコキシド、例えばアルミニウム-tri-sec-ブトキシドなど)を含み、前記アルミナ又はアルミナ-シリケートコア形成モノマーの添加前に、前記反応混合物のｐＨがｐＨ１〜２に調節され、及び任意で、ｐＨをｐＨ７〜９に調節する前に、ＰＥＧ(例えば、０．１ｋと１ｋの間の分子量と１０ｍＭと７５ｍＭの間の濃度を有するＰＥＧ)が前記反応混合物に添加され、前記コアがアルミノシリケートコアである、前記１に記載の方法。
３．前記反応混合物が、さらに色素前駆物質(例えば、シラン-ＮＩＲ色素コンジュゲートなどのシラン-色素コンジュゲート)を含み、及びＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子が、その中に共有結合的に封入された一以上の蛍光色素分子を有する、前記１又は２に記載の方法。
４．１〜７(平均１〜７、例えば２)の色素分子(例えば、蛍光色素分子、例えば、ＮＩＲ色素分子など)が、ＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子それぞれの中に存在する、前記３に記載の方法。
５．前記コアがアルミノシリケートコアであり、粒子当たりの前記色素分子(例えば、蛍光色素分子、例えば、ＮＩＲ色素分子など)の数が１〜７(平均１〜７、例えば２)である、前記４に記載の方法。
６．ｂ）ii）で、シェル形成モノマーが別々のアリコート(例えば、４０〜５００の別個のアリコート、例えば、ＴＥＯＳ又はＴＰＯＳと極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ]の混合物、ここで、各アリコート中のシェル形成モノマーのモル量は２〜２０マイクロモルの間であり、１〜６０分で区切られる)で添加され、及び、必要であれば、ｐＨを７〜８に維持するためにｐＨを定期的に調節する、前記いずれか１つに記載の方法。
７．前記ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートが、シラン成分にコンジュゲートした末端とは反対側のＰＥＧ成分の末端にコンジュゲートした、リガンド(例えば、ペプチド[天然又は合成])、放射標識(例えば、124Ｉ、131Ｉ、225Ａｃ又は177Ｌｕ)含有成分を含むリガンド、抗体、反応基(例えば、薬物分子のような分子にコンジュゲートできる反応基)を含むリガンドを有する(ヘテロ二官能性化合物を使用して形成できる)、前記いずれか１つに記載の方法。
８．リガンドを有しているＰＥＧ-シラン・コンジュゲートが、ｄ）でＰＥＧ-シランに加えて添加され、それによって、ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成する、前記いずれか１つに記載の方法。
９．ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートをｄ）で添加する前又は後に、リガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(例えば、０．０５ｍＭ〜２．５ｍＭの間の濃度で)(例えば、極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなど]に溶解したリガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を、室温で、ｂ)ｉ)又はｂ)ii)から得られた前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に添加し、得られた反応混合物を、ある時間(ｔ4)と温度(Ｔ4)で(例えば、室温[Ｔ4]で０．５分から２４時間[ｔ4])保持し(それによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部を、ｂ)で得られた前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着させ)、続いて得られた反応混合物を、ある時間(ｔ5)と温度(Ｔ5)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ5]で１時間〜２４時間[ｔ5])加熱し、それによってリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成し、任意で、続いて、リガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を含む得られた反応混合物に、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(リガンド無しのＰＥＧ-シランの濃度は１０ｍＭ〜７５ｍＭの間)(例えば、極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなど]に溶解したＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を室温で添加し、得られた反応混合物をある時間(ｔ6)と温度(Ｔ6)で(例えば、室温[Ｔ6]で０．５分〜２４時間[ｔ6])保持する (それによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部が、リガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子の表面の少なくとも一部、又はリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子の少なくとも一部に吸着される)、及び、得られた混合物をある時間(ｔ7)と温度(Ｔ7)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ7]で１時間〜２４時間[ｔ7])加熱し、それによって、ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する、前記いずれか１つに記載の方法。
１０．前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を有するＰＥＧ基、及び任意にＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基、及び任意でＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成後、第二反応基(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び、任意でＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び任意で、ＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する、前記いずれか１つに記載の方法。
１１．前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を任意で有するＰＥＧ基、及び任意でＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基、及び任意でＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成した後、第二反応基(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び、任意でＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び任意で、ＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成し、ここで、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部はＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を有するＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又は反応基を有するＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の形成後、前記反応基を、ある反応基で機能化された第二リガンド(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、ＰＥＧ基と第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、ＰＥＧ基と第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子、リガンドを含むＰＥＧで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基と第二リガンドで機能化されたリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する、前記８又は９に記載の方法。
１２．前記方法が、一以上の合成後の処理をさらに含む、前記のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＰＥＧ基で表面機能化された複数のコア又はコア-シェルナノ粒子、又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を含む組成物であって、前記コア-ナノ粒子の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％が、２〜１５ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有するか、コア-シェルナノ粒子が、２〜１５ｎｍのコアサイズ(例えば、最長寸法)、及び／又は２〜５０ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有し、前記組成物がいかなる粒径判別(粒径選択/除去)プロセス(例えば、ろ過、透析、又は遠心分離)にもかけられていない、組成物。
１４．前記コアはシリカコアであり、前記コア-シェルナノ粒子のコアとシェルがシリカシェルである、前記１３に記載の組成物。
１５．前記コアがアルミノシリケートコアであり、前記コア-シェルナノ粒子のコアがアルミノシリケートコアであり、前記コア-シェルナノ粒子のシェルがシリカシェルである、前記１３に記載の組成物。
１６．前記ＰＥＧ基の少なくとも１部又は全てが、一以上のリガンドを含む、前記１３〜１５のいずれか１つに記載の組成物。
１７．前記ＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子、又は、ＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子が、その中に被包された一以上の色素分子(例えば、ＮＩＲ色素分子)を有する、前記１３〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
１８．前記コアがアルミノシリケートコアである、前記１８に記載の組成物。
１９．コア当たりの色素分子の数が１〜７である、前記１８又は１９に記載の組成物。
２０．リガンド-ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長が、ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長より長く、それによって、機能的リガンドのアクセス性(露出度)が確保される(例えば、６〜９のＥＯモノマーを有するＰＥＧ-シランを使用する場合、リガンド-ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖は、少なくとも１２ＥＯモノマーを有する、あるいは１２のＥＯモノマーを有するＰＥＧ-シランを使用する場合、リガンド-ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖は、少なくとも１６のＥＯモノマーを有する)、前記１２に記載の組成物。
２１．光誘起電子移動イメージングのために、前記リガンド基(例えば、リガンド-機能化粒子のチロシン残基又はキレート剤)、又は特定のリガンド機能化がないペグ化粒子のシリカマトリクスに付着した放射性同位体をさらに含む、前記１２に記載の組成物。
２２．前記放射性同位体が治療のために選択され(例えば、225Ａｃ又は177Ｌｕ)、それによって、放射線治療特性を有するナノ粒子が形成される、前記２１に記載の組成物。
２３．前記組成物が、薬物送達用のナノ粒子上の機能的リガンドに共有結合的に付着した薬物-リンカー・コンジュゲートを含み、前記リンカー基が、薬物放出のために、腫瘍内の酵素又は酸性条件で切断されるように構成されている、前記１２に記載の組成物。
２４．個体内の領域をイメージングする方法であって、
（ａ）前記個体に、本開示の前記１３〜２３のいずれかに記載の組成物を投与すること(ここで、ナノ粒子は一以上の色素分子を含む)；（ｂ）被検者に励起電磁放射線(例えば、光)を照射し、それによって、前記一以上の色素分子の少なくとも一つを励起すること；（ｃ）励起された電磁放射線(例えば、光)を検出すること、ここで、検出された電磁放射線は、励起電磁放射線による励起の結果として個体中の前記色素分子によって放射されたものである；及び（ｄ）検出された電磁放射線に対応するシグナルを処理して前記被検者内の領域のイメージを一以上提供すること(例えば、リアルタイムのビデオストリーム)；
を含む方法。
１．任意でポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基で表面機能化された(すなわち、ペグ化)ナノ粒子、又は任意でＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）室温(地域に応じて、例えば１５℃〜２５℃)で、水とＴＭＯＳ(シリカコア形成モノマー)を含む(例えば、１１ｍＭ〜２７０ｍＭの濃度で)反応混合物を形成すること、ここで、当該反応混合物のｐＨ(例えば、水酸化アンモニウムなどの塩基を使用して調整できる)は６〜９である(これが、平均径[例えば、最長寸法]が、例えば１ｎｍ〜２ｎｍであるコア前駆物質ナノ粒子の形成をもたらす)；
ｂ）ｉ）前記反応混合物を、ある時間(ｔ1)及び温度(Ｔ1)で保持(例えば、室温〜９５℃[Ｔ1]で０．１時間〜７日[ｔ1]、例えば１０〜１５分)することにより、平均径(例えば、最長寸法)が２〜１５ｎｍであるナノ粒子(コアナノ粒子)を形成すること、又は
ii）前記反応混合物を、必要に応じて室温まで冷却し、及び、ａ）で得られた反応混合物に、シェル形成モノマー(例えば、オルトケイ酸テトラエチル、ＴＭＯＳ以外の、例えば、ＴＥＯＳ又はＴＰＯＳなど)を添加する(前記添加は、シェル形成モノマー濃度が二次核形成の閾値未満となるように行われる)ことによって、コアサイズ(例えば、最長寸法)が２〜１５ｎｍ及び／又は平均径(例えば、最長寸法)が２〜５０ｎｍのコア-シェルナノ粒子を形成すること；
ｃ）必要に応じて、ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物のｐＨをｐＨ６〜１０に調節すること；及び
ｄ）任意で(コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子をペグ化する場合)、ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に室温で、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(シラン成分に共有結合したＰＥＧ成分を含む)(例えば、１０ｍＭ〜６０ｍＭの濃度で)(例えば、必要に応じて、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなどの極性非プロトン性溶媒中に溶解されたＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を添加し、及び、得られた反応混合物をある時間(ｔ2)及び温度(Ｔ2)で保持(例えば、室温[Ｔ2]で０．５分〜２４時間[ｔ2])すること(これによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部が、ｂ）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着する)；
ｅ）任意で、ｄ）で得られた混合物をある時間(ｔ3)及び温度(Ｔ3)で加熱する(例えば、４０〜１００℃[Ｔ3]で１時間〜２４時間[ｔ3])ことによって、ＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成すること；
を含む方法。
２．前記反応混合物が、さらにアルミナ又はアルミナ-シリケートコア形成モノマー(例えば、アルミニウムアルコキシド、例えばアルミニウム-tri-sec-ブトキシドなど)を含み、前記アルミナ又はアルミナ-シリケートコア形成モノマーの添加前に、前記反応混合物のｐＨがｐＨ１〜２に調節され、及び任意で、ｐＨをｐＨ７〜９に調節する前に、ＰＥＧ(例えば、０．１ｋと１ｋの間の分子量と１０ｍＭと７５ｍＭの間の濃度を有するＰＥＧ)が前記反応混合物に添加され、前記コアがアルミノシリケートコアである、前記１に記載の方法。
３．前記反応混合物が、さらに色素前駆物質(例えば、シラン-ＮＩＲ色素コンジュゲートなどのシラン-色素コンジュゲート)を含み、及びＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子が、その中に共有結合的に封入された一以上の蛍光色素分子を有する、前記１又は２に記載の方法。
４．１〜７(平均１〜７、例えば２)の色素分子(例えば、蛍光色素分子、例えば、ＮＩＲ色素分子など)が、ＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子それぞれの中に存在する、前記３に記載の方法。
５．前記コアがアルミノシリケートコアであり、粒子当たりの前記色素分子(例えば、蛍光色素分子、例えば、ＮＩＲ色素分子など)の数が１〜７(平均１〜７、例えば２)である、前記４に記載の方法。
６．ｂ）ii）で、シェル形成モノマーが別々のアリコート(例えば、４０〜５００の別個のアリコート、例えば、ＴＥＯＳ又はＴＰＯＳと極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ]の混合物、ここで、各アリコート中のシェル形成モノマーのモル量は２〜２０マイクロモルの間であり、１〜６０分で区切られる)で添加され、及び、必要であれば、ｐＨを７〜８に維持するためにｐＨを定期的に調節する、前記いずれか１つに記載の方法。
７．前記ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートが、シラン成分にコンジュゲートした末端とは反対側のＰＥＧ成分の末端にコンジュゲートした、リガンド(例えば、ペプチド[天然又は合成])、放射標識(例えば、124Ｉ、131Ｉ、225Ａｃ又は177Ｌｕ)含有成分を含むリガンド、抗体、反応基(例えば、薬物分子のような分子にコンジュゲートできる反応基)を含むリガンドを有する(ヘテロ二官能性化合物を使用して形成できる)、前記いずれか１つに記載の方法。
８．リガンドを有しているＰＥＧ-シラン・コンジュゲートが、ｄ）でＰＥＧ-シランに加えて添加され、それによって、ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成する、前記いずれか１つに記載の方法。
９．ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートをｄ）で添加する前又は後に、リガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(例えば、０．０５ｍＭ〜２．５ｍＭの間の濃度で)(例えば、極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなど]に溶解したリガンドを含むＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を、室温で、ｂ)ｉ)又はｂ)ii)から得られた前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に添加し、得られた反応混合物を、ある時間(ｔ4)と温度(Ｔ4)で(例えば、室温[Ｔ4]で０．５分から２４時間[ｔ4])保持し(それによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部を、ｂ)で得られた前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着させ)、続いて得られた反応混合物を、ある時間(ｔ5)と温度(Ｔ5)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ5]で１時間〜２４時間[ｔ5])加熱し、それによってリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成し、任意で、続いて、リガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、又はリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を含む得られた反応混合物に、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート(リガンド無しのＰＥＧ-シランの濃度は１０ｍＭ〜７５ｍＭの間)(例えば、極性非プロトン性溶媒[例えば、ＤＭＳＯ又はＤＭＦなど]に溶解したＰＥＧ-シラン・コンジュゲート)を室温で添加し、得られた反応混合物をある時間(ｔ6)と温度(Ｔ6)で(例えば、室温[Ｔ6]で０．５分〜２４時間[ｔ6])保持する (それによって、ＰＥＧ-シラン・コンジュゲート分子の少なくとも一部が、リガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子の表面の少なくとも一部、又はリガンドを含むＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子の少なくとも一部に吸着される)、及び、得られた混合物をある時間(ｔ7)と温度(Ｔ7)で(例えば、４０℃〜１００℃[Ｔ7]で１時間〜２４時間[ｔ7])加熱し、それによって、ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する、前記いずれか１つに記載の方法。
１０．前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を有するＰＥＧ基、及び任意にＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基、及び任意でＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成後、第二反応基(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び、任意でＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び任意で、ＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する、前記いずれか１つに記載の方法。
１１．前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を任意で有するＰＥＧ基、及び任意でＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基、及び任意でＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成した後、第二反応基(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の反応基と同じであっても異なっていてもよい)で機能化された第二リガンド(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び、任意でＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基、及び任意で、ＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成し、ここで、前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部はＰＥＧ成分の末端(ＰＥＧ-シラン・コンジュゲートのシラン成分コンジュゲート末端とは反対側の末端)に反応基を有し(ヘテロ二官能性ＰＥＧ化合物から形成される)、反応基を有するＰＥＧ基で表面機能化されたナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基で表面機能化されたコアシェルナノ粒子、反応基を有するＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又は反応基を有するＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子の形成後、前記反応基を、ある反応基で機能化された第二リガンド(ＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基とリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子のリガンドと同じであっても異なっていてもよい)と反応させ、それによって、ＰＥＧ基と第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基とで表面機能化されたナノ粒子、ＰＥＧ基と第二リガンドで機能化されたＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子、リガンドを含むＰＥＧで表面機能化されたナノ粒子、又はＰＥＧ基と第二リガンドで機能化されたリガンドを含むＰＥＧ基とで表面機能化されたコアシェルナノ粒子を形成する、前記８又は９に記載の方法。
１２．前記方法が、一以上の合成後の処理をさらに含む、前記のいずれか１つに記載の方法。
１３．ＰＥＧ基で表面機能化された複数のコア又はコア-シェルナノ粒子、又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を含む組成物であって、前記コア-ナノ粒子の少なくとも９０％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．５％、又は９９．９％が、２〜１５ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有するか、コア-シェルナノ粒子が、２〜１５ｎｍのコアサイズ(例えば、最長寸法)、及び／又は２〜５０ｎｍの大きさ(例えば、最長寸法)を有し、前記組成物がいかなる粒径判別(粒径選択/除去)プロセス(例えば、ろ過、透析、又は遠心分離)にもかけられていない、組成物。
１４．前記コアはシリカコアであり、前記コア-シェルナノ粒子のコアとシェルがシリカシェルである、前記１３に記載の組成物。
１５．前記コアがアルミノシリケートコアであり、前記コア-シェルナノ粒子のコアがアルミノシリケートコアであり、前記コア-シェルナノ粒子のシェルがシリカシェルである、前記１３に記載の組成物。
１６．前記ＰＥＧ基の少なくとも１部又は全てが、一以上のリガンドを含む、前記１３〜１５のいずれか１つに記載の組成物。
１７．前記ＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子、又は、ＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子が、その中に被包された一以上の色素分子(例えば、ＮＩＲ色素分子)を有する、前記１３〜１７のいずれか１つに記載の組成物。
１８．前記コアがアルミノシリケートコアである、前記１８に記載の組成物。
１９．コア当たりの色素分子の数が１〜７である、前記１８又は１９に記載の組成物。
２０．リガンド-ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長が、ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖長より長く、それによって、機能的リガンドのアクセス性(露出度)が確保される(例えば、６〜９のＥＯモノマーを有するＰＥＧ-シランを使用する場合、リガンド-ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖は、少なくとも１２ＥＯモノマーを有する、あるいは１２のＥＯモノマーを有するＰＥＧ-シランを使用する場合、リガンド-ＰＥＧ-シランのＰＥＧ鎖は、少なくとも１６のＥＯモノマーを有する)、前記１２に記載の組成物。
２１．光誘起電子移動イメージングのために、前記リガンド基(例えば、リガンド-機能化粒子のチロシン残基又はキレート剤)、又は特定のリガンド機能化がないペグ化粒子のシリカマトリクスに付着した放射性同位体をさらに含む、前記１２に記載の組成物。
２２．前記放射性同位体が治療のために選択され(例えば、225Ａｃ又は177Ｌｕ)、それによって、放射線治療特性を有するナノ粒子が形成される、前記２１に記載の組成物。
２３．前記組成物が、薬物送達用のナノ粒子上の機能的リガンドに共有結合的に付着した薬物-リンカー・コンジュゲートを含み、前記リンカー基が、薬物放出のために、腫瘍内の酵素又は酸性条件で切断されるように構成されている、前記１２に記載の組成物。
２４．個体内の領域をイメージングする方法であって、
（ａ）前記個体に、本開示の前記１３〜２３のいずれかに記載の組成物を投与すること(ここで、ナノ粒子は一以上の色素分子を含む)；（ｂ）被検者に励起電磁放射線(例えば、光)を照射し、それによって、前記一以上の色素分子の少なくとも一つを励起すること；（ｃ）励起された電磁放射線(例えば、光)を検出すること、ここで、検出された電磁放射線は、励起電磁放射線による励起の結果として個体中の前記色素分子によって放射されたものである；及び（ｄ）検出された電磁放射線に対応するシグナルを処理して前記被検者内の領域のイメージを一以上提供すること(例えば、リアルタイムのビデオストリーム)；
を含む方法。
以下の実施例は、本開示を説明するために提示される。これらは、いかなる方法による限定も意図していない。
本開示のナノ粒子の合成と特性評価の実施例
ポリエチレングリコール(PEG)と、特異的表面リガンドとで表面機能化され、全体的なSNPサイズが10nm未満である極小蛍光性シリカナノ粒子(SNP)及びコア-シェルSNPは、それらの好ましい体内分布と安全特性のため、臨床応用のために急速に関心が高まっている。ここでは、1nm未満にサイズ制御された(例えば、単原子層のレベルで)、狭い粒径分散を有するSNPとコア-シェルSNPを調製するための水中合成方法論が提示される。近赤外(NIR)放射体を含む、様々なタイプのフルオロフォアを、共有結合的に被包できる。輝度は、追加のシリカシェルの添加により増強できる。この方法論は、さらに、以前には知られていない組成を有する、10nm未満の大きさの蛍光性コア及びコア-シェルSNPの合成を可能にする。特に、アルミニウムゾル-ゲル前駆物質の添加は、蛍光性アルミノシリケートナノ粒子(ASNP)及びコア-シェルASNPをもたらす。高度に負に帯電したNIRフルオロフォアの封入効率と輝度は、アルミニウムを含まない対応SNPに対して増強される。その結果生じた粒子は、〜0.8の量子収率を示す(例えば、理論上の輝度限界に近づき始める)。全ての粒子が、ペグ化されて立体的安定性を提供してもよい。最後に、蛍光性SNP、コア-シェルSNP、及びそれらのアルミニウム含有類似体のペグ化粒子表面上にリガンドを導入するために、ヘテロ二官能性PEGを使用することができ、リガンドで機能化された10nm未満のNIR蛍光性ナノプローブを製造することができる。これらの水系合成から生じた物質を、初期のアルコール系修正Stober法から生じた蛍光性コア-シェルSNP(Cornell dots又はC dotsと呼ばれる)と区別するために、本明細書で記載される水中合成SNPとASNPを、コーネルプライムドット(Cornell prime dots)又はC'ドット(C’dots)及びAlC’ドット(AlC’dots)と称する。これらの有機-無機ハイブリッドナノ物質は、癌の診断及び治療(セラノスティクス)を含む、ナノ医療に応用されてもよい。
反応媒体として水を使用する極小SNPの合成研究の結果が提示される。速い加水分解、遅い凝縮、粒子成長の効率的なPEG-シラン誘導終結を組み合わせると、極小の正確なサイズ制御、10nm未満の直径、1nm未満の段階的な、狭い粒径分布を有するSNPが実証される。様々なシラン-結合フルオロフォアをシリカマトリクスに共凝縮することにより、この合成プロセスは、光学スペクトルが可視からNIR部に調整された光学特性を有する、直径10nm未満の蛍光性SNPを製造するのに使用できる。全体的な粒子径を10nm未満に保ちながら、さらにシリカシェルをこの合成手順に添加することができる。このコア-シェル構築は、親のコアと比べて蛍光輝度の改善をもたらす。水系合成アプローチは、かなり万能であり、粒径制御を損なうことなく、これまで知られていなかった無機組成の粒子を可能にする。その目的に向けて、シリカと、ゾル-ゲル前駆物質としてアルミニウムアルコキシドを添加して得られた混合組成物の例を調査した。これらの混合無機NPの結果的な成長条件は、単純なシリカベース粒子と比べて、高度に負に帯電したNIR発光フルオロフォアのより効率の良い取込みを可能にする。同時に、得られたNPは、アルミニウムアルコキシドを添加せず合成した粒子と比較して、被包色素の量子効率の増加を示す。これらのアルミニウム含有蛍光性SNPは、AlC'ドットと称される。蛍光性SNP、コア-シェルSNP、及びそれらのアルミニウム含有類似体は、立体安定性を提供するためにペグ化される。最後に、蛍光性SNP及びコア-シェルSNP、並びにそれらのアルミニウム含有類似体のペグ化粒子表面にリガンドを導入するために、ヘテロ二官能性PEGが使用され、診断及び治療用途における前臨床及び臨床のために使用される、リガンド-機能化＜10nm NIR蛍光性ナノプローブが製造される。これは、動物モデル及び第一ヒト臨床試験においてメラノーマ腫瘍を標的にするために先の研究で使用されたαvβ3インテグリン-ターゲティング・シクロ(アルギニン-グリシン-アスパラギン酸-D-チロシン-システイン)、c(RGDyC)ペプチドを使用して実証される。バイオテクノロジー及び臨床応用のための、サイズ制御された高蛍光性シリカベースのナノプローブを合成する能力の他に、水ベースの粒子成長経路と、従来のStober法のそれらを比較することは、SNP及び他のシリカベースのナノ物質の正確な形成メカニズムのより良い基礎的理解に寄与するかもしれない。
実験の項
2.1 材料
全ての化学物質は入手したままの状態で使用される。ジメチルスルホキシド(DMSO)、イソプロパノール、(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(MPTMS)、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)、テトラメチルオルトシリケート(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)、ポリエチレングリコール鎖(PEG、モル質量約400)、アルミニウム-tri-sec-ブトキシド、2.0 Mのアンモニア(エタノール中)、及び、 27wt％の水酸化アンモニウムは、Sigma Aldrichから購入する。メトキシ-末端ポリ(エチレングリコール)鎖(PEG-シラン、モル質量約500)は、Gelestから購入する。マレイミドとNHSエステル基を有するヘテロ二官能性PEG(mal-PEG-NHS、モル質量約800)は、Quanta BioDesignから購入する。酢酸は、Mallinckrodtから購入する。Cy5及びCy5.5蛍光色素は、GEから購入する。ローダミングリーン(RhG)及びテトラメチルローダミン(TMR)蛍光色素は、Life Technologiesから購入する。DY782蛍光色素は、Dyomicsから購入し、CW800蛍光色素は、Li-corから購入する。無水99.5％エタノールは、Pharmco-Aaperから購入する。シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)ペプチド、c(RGDyC)は、Peptide Internationalから購入する。脱イオン水(DI水)は、Millipore Milli-Q systemを使用して作る。
全ての化学物質は入手したままの状態で使用される。ジメチルスルホキシド(DMSO)、イソプロパノール、(3-メルカプトプロピル)トリメトキシシラン(MPTMS)、(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APTES)、テトラメチルオルトシリケート(TMOS)、オルトケイ酸テトラエチル(TEOS)、ポリエチレングリコール鎖(PEG、モル質量約400)、アルミニウム-tri-sec-ブトキシド、2.0 Mのアンモニア(エタノール中)、及び、 27wt％の水酸化アンモニウムは、Sigma Aldrichから購入する。メトキシ-末端ポリ(エチレングリコール)鎖(PEG-シラン、モル質量約500)は、Gelestから購入する。マレイミドとNHSエステル基を有するヘテロ二官能性PEG(mal-PEG-NHS、モル質量約800)は、Quanta BioDesignから購入する。酢酸は、Mallinckrodtから購入する。Cy5及びCy5.5蛍光色素は、GEから購入する。ローダミングリーン(RhG)及びテトラメチルローダミン(TMR)蛍光色素は、Life Technologiesから購入する。DY782蛍光色素は、Dyomicsから購入し、CW800蛍光色素は、Li-corから購入する。無水99.5％エタノールは、Pharmco-Aaperから購入する。シクロ(Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys)ペプチド、c(RGDyC)は、Peptide Internationalから購入する。脱イオン水(DI水)は、Millipore Milli-Q systemを使用して作る。
反応条件を一晩と記載する場合、反応時間は、約8時間〜約24時間(又はそれ以上)の範囲にわたってもよい。
2.2 10nm以下のペグ化シリカナノ粒子の合成
4.2nmのペグ化シリカナノ粒子(SNP)を合成するために、100μLの2.0Mのアンモニア(エタノール中)と10mLのDI水を混合して調製した、1mLの0.02Mアンモニア水溶液を、9mLのDI水に添加する(得られたアンモニア水酸化物の濃度は0.002M、表１参照)。この溶液を、室温で10分間撹拌し、その後、0.43mmolのTMOSを、勢いよく撹拌しながら添加し(得られたTMOSの濃度は0.043M、表１参照)、この溶液を室温で一晩(12〜24時間)撹拌する。その後、0.21mmolのPEG-シランを添加し、この溶液を室温で一晩(12〜24時間)撹拌する。次の工程で、温度を80℃まで高め、撹拌を停止する。溶液をその後80℃で一晩静置する。その後、この溶液を室温まで冷まし、透析膜チューブ(Pierce、分子量カットオフは10.000)に移す。透析チューブ内の溶液を、2000mLのDI-水で透析し、６日間毎日水を替えて残留試薬を洗い流す。その後、粒子を200nmのシリンジフィルター(Fisher brand)でろ過して、粒子溶液に存在する凝集物又はダストを取り除く。得られた粒子溶液をその後、室温で長期間保存し、TEM、DLS、TGA及びNMRを含めた特性評価を行う。この反応のモル比は、1 TMOS：0.093 アンモニア：0.49 PEG-シラン：1292 H2Oである。粒子サイズは、合成条件を調整することで変化した。詳細を表１にまとめる。
同じサイズ分散度と構造制御を有する同じ粒子は、水酸化アンモニウム源として2.0M アンモニア(エタノール中)の代わりに、27wt％の水酸化アンモニウム溶液を使用して合成することもできる(溶液のpHが約8に調整されるのであれば)。これは、このC'ドット粒子合成の鍵が、最適化されたシリカ反応キネティクスのための正確なpH＋水環境であることを示す。少量のエタノール汚染(10mLの反応中約10μLのエタノール)は、反応キネティクスを大きく妨害しないので、粒子合成に検出可能な影響を与えない。
4.2nmのペグ化シリカナノ粒子(SNP)を合成するために、100μLの2.0Mのアンモニア(エタノール中)と10mLのDI水を混合して調製した、1mLの0.02Mアンモニア水溶液を、9mLのDI水に添加する(得られたアンモニア水酸化物の濃度は0.002M、表１参照)。この溶液を、室温で10分間撹拌し、その後、0.43mmolのTMOSを、勢いよく撹拌しながら添加し(得られたTMOSの濃度は0.043M、表１参照)、この溶液を室温で一晩(12〜24時間)撹拌する。その後、0.21mmolのPEG-シランを添加し、この溶液を室温で一晩(12〜24時間)撹拌する。次の工程で、温度を80℃まで高め、撹拌を停止する。溶液をその後80℃で一晩静置する。その後、この溶液を室温まで冷まし、透析膜チューブ(Pierce、分子量カットオフは10.000)に移す。透析チューブ内の溶液を、2000mLのDI-水で透析し、６日間毎日水を替えて残留試薬を洗い流す。その後、粒子を200nmのシリンジフィルター(Fisher brand)でろ過して、粒子溶液に存在する凝集物又はダストを取り除く。得られた粒子溶液をその後、室温で長期間保存し、TEM、DLS、TGA及びNMRを含めた特性評価を行う。この反応のモル比は、1 TMOS：0.093 アンモニア：0.49 PEG-シラン：1292 H2Oである。粒子サイズは、合成条件を調整することで変化した。詳細を表１にまとめる。
2.3 10nm以下のペグ化蛍光性シリカナノ粒子の合成
マレイミド官能基を有するCy5、Cy5.5、RhG、TMR、DY782及びCW800色素を、まず、DMSO中でMPTMSにコンジュゲートした(フルオロフォア：MPTMSのモル比＝1：25)。シラン-結合フルオロフォアをその後、TMOSとともに、合成溶液中に添加し、粒子へと共凝縮する。シラン-結合フルオロフォアとTMOSのモル比は約1：1000である。合成手順の残りは、セクション2.2で4.2nmの粒子の合成のために記載したものと同じである。
マレイミド官能基を有するCy5、Cy5.5、RhG、TMR、DY782及びCW800色素を、まず、DMSO中でMPTMSにコンジュゲートした(フルオロフォア：MPTMSのモル比＝1：25)。シラン-結合フルオロフォアをその後、TMOSとともに、合成溶液中に添加し、粒子へと共凝縮する。シラン-結合フルオロフォアとTMOSのモル比は約1：1000である。合成手順の残りは、セクション2.2で4.2nmの粒子の合成のために記載したものと同じである。
蛍光性粒子の最も正確な蛍光特性評価を得るために、この研究で調製したフルオロフォア標識粒子を、ろ過工程の後さらにGPCで精製し、FCSと発光スペクトル測定を妨害し得る残留遊離色素分子をさらに除去し、蛍光性粒子生成物の純度を最大化する。詳しくは、浄化した粒子溶液を、スピンフィルター(GE healthcare Vivaspin；MWCF 30k)を使用して約30倍に濃縮し、その後GPCカラムで精製した(詳細については、セクション2.8参照)。GPC装置で使用した溶媒は、0.9wt％のNaCl溶液であるため、精製粒子は、さらなる特性評価と長期間保存のために、最終的にスピンフィルターを使用してDI水に戻された。粒子をDI水に戻すために、精製粒子はまずスピンフィルター(GE healthcare Vivaspin；MWCF 30k)を使用して30倍に濃縮される。その後DI水を濃縮粒子溶液に添加し、それを希釈して通常の体積に戻す。このプロセスを、少なくとも８回繰り返して、NaClの濃度をゼロ近くまで低下させる。この精製粒子試料を、その後40℃で長期保存し、さらなる特性評価を行う。
2.4 10nm以下のペグ化コア-シェルシリカナノ粒子、及び10nm以下のペグ化蛍光性コア-シェルシリカナノ粒子の合成
ペグ化コア-シェルSNPの合成手順は、粒子形成後、PEG-シランの添加前に、シェル添加工程が追加されたことを除いて、4.2nm粒子の合成手順と同じである。室温より高い温度がコア粒子形成のために使用された場合は(表１参照)、TMOS(及び、ペグ化蛍光性コア-シェルSNPの合成のためのシラン-結合フルオロフォア)の添加の翌日、反応を室温まで冷却する。
ペグ化コア-シェルSNPの合成手順は、粒子形成後、PEG-シランの添加前に、シェル添加工程が追加されたことを除いて、4.2nm粒子の合成手順と同じである。室温より高い温度がコア粒子形成のために使用された場合は(表１参照)、TMOS(及び、ペグ化蛍光性コア-シェルSNPの合成のためのシラン-結合フルオロフォア)の添加の翌日、反応を室温まで冷却する。
この溶液を、その後DI水で５倍に希釈する。その後、TEOSとDMSOの混合物(体積比＝1：4)を、室温で勢いよく撹拌しながら、この溶液に用量ごとに添加する。各用量の体積は10μLであり、用量間の時間差は30分である。一層のシリカシェルを追加するために、50用量を添加し、結果的にシェルの厚みを0.5nm近くにする(粒径は約1nm増加)。このプロセスを、所望のシェル層(例えば、1〜4)が追加されるまで繰り返す。シェル添加の間、溶液のpHは、追加のTEOSの添加及びケイ酸の形成の結果として低下する。最適化反応キネティクスのためにpHを中性に保つため、シリカシェルを二層成膜するごとに、約2mLの0.02M水酸化アンモニウム溶液を反応溶液に添加する。その後、4.2nmの粒子合成のために記載したのと同じ手順の後、1.05mmolのPEG-シラン(コア粒子のペグ化と同じPEG-シラン濃度)を添加し、80℃の熱処理を行う。精製工程は、セクション2.3で上述したように行う。
2.5. 10nm以下のペグ化アルミノシリケートナノ粒子、及びペグ化アルミノシリケートコア-シリカシェル・アルミノシリケートナノ粒子の合成
10nm以下のペグ化アルミノシリケートナノ粒子(ASNP)の合成のために、1mLの0.5N HCl溶液を、9mLのDI水に添加し、この溶液を10分間撹拌する。その後、0.43mmolのTMOSと0.043mmolのアルミニウム-tri-sec-ブトキシド(体積比1：9で、イソプロパノールに溶解)を、室温で勢いよく撹拌しながら添加する。10〜15分後、0.21mmolのPEG-シランを添加し、続いて、約140μLの27wt％の水酸化アンモニウムを添加することにより、容器のpHをもう一度中性に切り替える。最終pHをpH紙でダブルチェックする。その後、溶液を撹拌しながら一晩80℃に保つ。合成手順の残りは、セクション2.2で4.2nm粒子の合成のために記載したのと同じ手順に従う。
10nm以下のペグ化アルミノシリケートナノ粒子(ASNP)の合成のために、1mLの0.5N HCl溶液を、9mLのDI水に添加し、この溶液を10分間撹拌する。その後、0.43mmolのTMOSと0.043mmolのアルミニウム-tri-sec-ブトキシド(体積比1：9で、イソプロパノールに溶解)を、室温で勢いよく撹拌しながら添加する。10〜15分後、0.21mmolのPEG-シランを添加し、続いて、約140μLの27wt％の水酸化アンモニウムを添加することにより、容器のpHをもう一度中性に切り替える。最終pHをpH紙でダブルチェックする。その後、溶液を撹拌しながら一晩80℃に保つ。合成手順の残りは、セクション2.2で4.2nm粒子の合成のために記載したのと同じ手順に従う。
コア-シェルASNPの合成のために、0.21mmolのPEG(分子量約400)を、反応pHを中性に切り替える前に、PEG-シランの代わりに添加する。反応pHを中性に戻した後、TEOSとDMSOの混合物(体積比＝1：8)を、室温で勢いよく撹拌しながら、この溶液に用量ごとに添加する。各用量の体積は10μLであり、用量間の時間差は30分である。一層のシリカシェルを追加するために、50用量を添加し、結果的にシェルの厚みを0.5nm近くにする(粒径は約1nm増加)。このプロセスを、所望のシェル層(例えば、２)が追加されるまで繰り返す。その後、0.21mmolのPEG-シランを添加し、撹拌無しで80℃の熱処理を行う。合成手順の残りは、セクション2.2で4.2nm粒子の合成のために記載したのと同じ手順に従う。溶液のpHを中性に切り替える前のPEG-シランの添加は必須ではないが、これは、合成ASNPの単分散度を向上させ、pH変更プロセスの間のその凝集を防止する。
2.6. Cy5又はCy5.5フルオロフォアを共有結合的に被包する、10nm以下のペグ化蛍光性アルミノシリケートナノ粒子、及び、10nm以下のペグ化蛍光性アルミノシリケートコア-シリカシェル・アルミノシリケートナノ粒子の合成
ASNP中にフルオロフォアを共有結合的に被包するために、セクション2.3で記載したのと同じコンジュゲーション条件と色素濃度を使用してTMOSとアルミニウム-tri-sec-ブトキシドを添加した直後に、シラン-結合Cy5又はCy5.5フルオロフォアを添加する。合成手順の残りは、セクション2.5でブランクASNPの合成のために記載したのと同じであり、精製工程は、セクション2.3で上述したものを使用する。
ASNP中にフルオロフォアを共有結合的に被包するために、セクション2.3で記載したのと同じコンジュゲーション条件と色素濃度を使用してTMOSとアルミニウム-tri-sec-ブトキシドを添加した直後に、シラン-結合Cy5又はCy5.5フルオロフォアを添加する。合成手順の残りは、セクション2.5でブランクASNPの合成のために記載したのと同じであり、精製工程は、セクション2.3で上述したものを使用する。
2.7. 容易にアクセスできるリガンドを用いたペグ化粒子の表面改質
この研究における任意のペグ化粒子の表面を機能化するために(例えば、c(RGDyC)ペプチドリガンドで)、ヘテロ二官能性NHS-PEG-malをまず、DMSO中のAPTESとコンジュゲートさせ、mal-PEG-シランを製造する。NHS-PEG-malの濃度(DMSO中)は、約0.22Mである。この反応混合物を窒素下で一晩、室温で放置する。次の工程時に、c(RGDyC)をDMSO溶液に添加し、この溶液を窒素下で一晩、室温で放置する。c(RGDyC)：NHS-PEG-mal：APTESのモル比＝1.1：1.0：0.9は、粒子表面上に縮合した全てのヘテロ二官能性PEGが、c(RGDyC)付着されることを確実にする。その後、製造されたc(RGDyC)-PEG-シランを添加し、続いて、ナノ粒子合成中のペグ化工程でPEG-シランを添加する。粒子表面上のリガンドの量を変えるために、c(RGDyC)-PEG-シラン：PEG-シランの様々なモル比を使用することができる。例えば、約1：40のc(RGDyC)-PEG-シラン：PEG-シランのモル比は、直径7nmの粒子当たり、約22のc(RGDyC)リガンドを与える一方、この比を1：400に減らすと、7nmの粒子当たりのc(RGDyC)リガンドは約5になる。合成の残りは、セクション2の通常のペグ化のために記載したものと同じである。同じ方法論は、表面機能化プローブを製造するために、この研究で記載する全ての粒子に適用可能であり、これには、ブランク及び蛍光性SNP、コア-シェルSNP、及びそれらのアルミニウム含有類似体、様々な種類の共有結合的に被包されたフルオロフォアを有するもの全て、が含まれる。この方法で使用できる他のリガンドには、他の線状及び環状ペプチド、抗体フラグメント、様々なDNA及びRNAセグメント(例えば、siRNA)、薬物及び放射性同位体並びにそれらの各キレート成分を含む治療分子、並びにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
この研究における任意のペグ化粒子の表面を機能化するために(例えば、c(RGDyC)ペプチドリガンドで)、ヘテロ二官能性NHS-PEG-malをまず、DMSO中のAPTESとコンジュゲートさせ、mal-PEG-シランを製造する。NHS-PEG-malの濃度(DMSO中)は、約0.22Mである。この反応混合物を窒素下で一晩、室温で放置する。次の工程時に、c(RGDyC)をDMSO溶液に添加し、この溶液を窒素下で一晩、室温で放置する。c(RGDyC)：NHS-PEG-mal：APTESのモル比＝1.1：1.0：0.9は、粒子表面上に縮合した全てのヘテロ二官能性PEGが、c(RGDyC)付着されることを確実にする。その後、製造されたc(RGDyC)-PEG-シランを添加し、続いて、ナノ粒子合成中のペグ化工程でPEG-シランを添加する。粒子表面上のリガンドの量を変えるために、c(RGDyC)-PEG-シラン：PEG-シランの様々なモル比を使用することができる。例えば、約1：40のc(RGDyC)-PEG-シラン：PEG-シランのモル比は、直径7nmの粒子当たり、約22のc(RGDyC)リガンドを与える一方、この比を1：400に減らすと、7nmの粒子当たりのc(RGDyC)リガンドは約5になる。合成の残りは、セクション2の通常のペグ化のために記載したものと同じである。同じ方法論は、表面機能化プローブを製造するために、この研究で記載する全ての粒子に適用可能であり、これには、ブランク及び蛍光性SNP、コア-シェルSNP、及びそれらのアルミニウム含有類似体、様々な種類の共有結合的に被包されたフルオロフォアを有するもの全て、が含まれる。この方法で使用できる他のリガンドには、他の線状及び環状ペプチド、抗体フラグメント、様々なDNA及びRNAセグメント(例えば、siRNA)、薬物及び放射性同位体並びにそれらの各キレート成分を含む治療分子、並びにそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。
2.8. ゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)による特性評価
GPC特性評価は、275nm UV検出器と、resin Superdex 200を備えたBioLogic LPシステム(GE healthcare)を使用して行う。ブランクのSNPが、シリカの低い吸光度のため275nm UV検出器ではほとんど検出できないのに対して、蛍光性SNPは、被包されたフルオロフォアが275nm検出チャネルと重なる吸光度を有するため、前記GPC装置で強いシグナルを示す。結果として、GPCは、特性評価とさらなる臨床応用のために、精製されたC'ドット生成物の純度をさらに増加するために使用できる。使用前に、GPCシステムを、Bio-Radのタンパク質標準物質(既知のモル質量を有する、チログロブリン、ウシγ-グロブリン、トリ卵白アルブミン、ウマミオグロビン、及びビタミンB12の混合物)を用いて較正する。その後、約400μLの粒子溶液を、GPC装置に注入し、BioFracフラクション収集器を用いて、フラクションを集める。様々なGPCフラクションの詳細な分析を図１５に示す。粒子フラクションの収集により、粒子生成物の純度をさらに最大化できる。
GPC特性評価は、275nm UV検出器と、resin Superdex 200を備えたBioLogic LPシステム(GE healthcare)を使用して行う。ブランクのSNPが、シリカの低い吸光度のため275nm UV検出器ではほとんど検出できないのに対して、蛍光性SNPは、被包されたフルオロフォアが275nm検出チャネルと重なる吸光度を有するため、前記GPC装置で強いシグナルを示す。結果として、GPCは、特性評価とさらなる臨床応用のために、精製されたC'ドット生成物の純度をさらに増加するために使用できる。使用前に、GPCシステムを、Bio-Radのタンパク質標準物質(既知のモル質量を有する、チログロブリン、ウシγ-グロブリン、トリ卵白アルブミン、ウマミオグロビン、及びビタミンB12の混合物)を用いて較正する。その後、約400μLの粒子溶液を、GPC装置に注入し、BioFracフラクション収集器を用いて、フラクションを集める。様々なGPCフラクションの詳細な分析を図１５に示す。粒子フラクションの収集により、粒子生成物の純度をさらに最大化できる。
2.9. 粒子形態の特性評価
透過型電子顕微鏡(TEM)画像を、FEI Tecnai T12 Spirit顕微鏡を使用して撮像する(120kVの加速電圧で操作)。流体力学粒径及び粒度分布を、Malvern Zetasizer Nano-SZ(200℃で操作)を使用する動的光散乱(DLS)によって測定する。各DLS試料は三回測定し、結果をこの文書のそれぞれの図に重ねる。百分率曲線を、測定結果を提示するために使用する。各試料の平均径は、三回の測定からの百分率曲線の平均径を平均することにより算出する。
透過型電子顕微鏡(TEM)画像を、FEI Tecnai T12 Spirit顕微鏡を使用して撮像する(120kVの加速電圧で操作)。流体力学粒径及び粒度分布を、Malvern Zetasizer Nano-SZ(200℃で操作)を使用する動的光散乱(DLS)によって測定する。各DLS試料は三回測定し、結果をこの文書のそれぞれの図に重ねる。百分率曲線を、測定結果を提示するために使用する。各試料の平均径は、三回の測定からの百分率曲線の平均径を平均することにより算出する。
2.10. フルオロフォア被包粒子の特性評価
Varian Cary 5000分光光度計によって、試料の吸光度スペクトルを測定する。試料濃度を変えることによって、様々な試料の吸光度スペクトルをマッチさせる、すなわち、様々な試料の光学密度を同じに調節する。その後、吸光度をマッチさせた試料を、Photon Technologies International Quantamaster分光蛍光光度計を使用して発光スキャンにかける。量子効率増大計算のために、粒子の発光スペクトルのピーク強度を、遊離色素の吸収マッチ溶液のピーク強度で割る。
Varian Cary 5000分光光度計によって、試料の吸光度スペクトルを測定する。試料濃度を変えることによって、様々な試料の吸光度スペクトルをマッチさせる、すなわち、様々な試料の光学密度を同じに調節する。その後、吸光度をマッチさせた試料を、Photon Technologies International Quantamaster分光蛍光光度計を使用して発光スキャンにかける。量子効率増大計算のために、粒子の発光スペクトルのピーク強度を、遊離色素の吸収マッチ溶液のピーク強度で割る。
蛍光性自己相関分光(FCS)測定は、FCS装置を使用して行う。488nmの固体レーザーを、RhGフルオロフォア用のレーザー源として使用する。543nm HeNeレーザーを、TMRフルオロフォア用のレーザー源として使用する。633nmの固体レーザーを、Cy5及びCy5.5フルオロフォア用のレーザー源として使用する。785nmの固体レーザーを、DY782及びCW800フルオロフォア用のレーザー源として使用する。流体力学的サイズ、粒子当たりの輝度、及び粒子濃度は、FCS自己相関曲線のフィットから得る。FCSから得られた粒子濃度を吸光度測定から得られたフルオロフォア濃度で分ることで、粒子当たりのフルオロフォアの数を、記載したように計算する。
2.11. 29Si及び27Al固体NMR特性評価
29Si CP(cross-polarization)/マジック角回転(MAS)NMR実験を、Bruker Advance NMR分光計(直径4mmのローター用のプローブヘッドを使用する9.4Tマグネットを有する)で実施する。29Si CP/MAS NMR実験の間、試料をマジック角で7.00kHz回転数で回転させる。最終スペクトルのために、最大で3200のスキャンを、CP(5ミリ秒のCP接触時間の間の勾配プロトンパワー、及びTPPMプロトン・デカップリングを用いた検出を有する)を使用して集積する。29Si CP/MAS NMRスキャンは、プローブ・デューティサイクルのため、3秒の繰り返し時間で集積する。
29Si CP(cross-polarization)/マジック角回転(MAS)NMR実験を、Bruker Advance NMR分光計(直径4mmのローター用のプローブヘッドを使用する9.4Tマグネットを有する)で実施する。29Si CP/MAS NMR実験の間、試料をマジック角で7.00kHz回転数で回転させる。最終スペクトルのために、最大で3200のスキャンを、CP(5ミリ秒のCP接触時間の間の勾配プロトンパワー、及びTPPMプロトン・デカップリングを用いた検出を有する)を使用して集積する。29Si CP/MAS NMRスキャンは、プローブ・デューティサイクルのため、3秒の繰り返し時間で集積する。
27Al NMR実験を、Bruker Advance NMR分光計(直径2.5 mmのローター用のプローブヘッドを使用する16.45Tマグネット[182.47 MHz 27Al Larmor frequency]を有する)で実施する。カリウムミョウバンは、外部27Al NMR化学シフト第二参照として(-0.033 ppmにて)、及び90度パルス長及びrfパワーの較正のために役立つ。最終の27Al NMR MASスペクトルは、試料をマジック角で15.00kHzで回転させながら、95kHz rf場の強度で名目10度直接励起パルスを用いて獲得する(100ミリ秒の繰り返し時間で合計して6144スキャンになる)。プローブヘッドとローターの27Alバックグラウンドは、同一条件下で空のローターのスペクトルを獲得することによって評価し、試料のスペクトルからそれを差し引く。
2.12. 熱重量分析(TGA)
粒子溶液をまず液体窒素中で冷凍し、その後三日にわたり -200℃で真空下に放置し、乾燥させる。凍結乾燥後の粉末をさらに、一晩600℃で真空下に放置する。乾き切った粒子試料をその後、TGAにかける。TGAは、TA Instruments Q500熱重量分析器を使用して行う。測定の間、温度を100℃／分の勾配で室温から1000℃まで上昇し、その後、1000℃のまま2時間置き、残留水を完全に排除する。その後、温度をさらに100℃／分の勾配で6000℃まで上昇させ、有機成分を除去し、純粋な無機シリカ又はアルミノシリケートを残す。粒子上のPEG鎖の平均量を、その後、これらのTGA結果に従って推定する。
粒子溶液をまず液体窒素中で冷凍し、その後三日にわたり -200℃で真空下に放置し、乾燥させる。凍結乾燥後の粉末をさらに、一晩600℃で真空下に放置する。乾き切った粒子試料をその後、TGAにかける。TGAは、TA Instruments Q500熱重量分析器を使用して行う。測定の間、温度を100℃／分の勾配で室温から1000℃まで上昇し、その後、1000℃のまま2時間置き、残留水を完全に排除する。その後、温度をさらに100℃／分の勾配で6000℃まで上昇させ、有機成分を除去し、純粋な無機シリカ又はアルミノシリケートを残す。粒子上のPEG鎖の平均量を、その後、これらのTGA結果に従って推定する。
2.13. c(RGDyC)機能化C'ドットの分子モデル
C'ドット構造の完全な分析(例えば、コアサイズ、シェル厚、PEG表面密度、表面リガンドの数、被包されたフルオロフォアの数)に基づいて、模式的な分子モデルを作製し、現実的なスケールにて原子レベルでC'ドット構成を示した。これを行うために、我々はまず、SiとO原子の連続的なランダムネットワークをなす4nmのSiO2球を構築した。ネットワーク内の各SiとO原子の座標は、シリカガラスのリバースMonte Carloシミュレーションにより作成した。コア粒子の内側に存在する合計で約800のSiO2単位を使用し、これはアモルファスのシリカ密度を使用する計算とよく合致する。この後、このコア粒子内の容積を手動で作成し、そこに一つの被包されたCy5フルオロフォアを描く。その後、シリカ粒子表面に共有結合した約100のPEG鎖と16のc(RGDyC)機能化PEG鎖を手動で加える。最終的な図は、3nm以下のコア、0.5nm以下のシェル、被包された一つのCy5フルオロフォア、表面上の約100のPEG鎖及び16のc(RGDyC)リガンドを有する一つのC'ドット粒子を表す。このモデルは、真実のシミュレーションの結果ではなく、むしろ一つのC'ドット粒子の異なる構成要素の相対的サイズスケールの現実的な可視化を提供する尺度模式図であることに注意すべきある。
C'ドット構造の完全な分析(例えば、コアサイズ、シェル厚、PEG表面密度、表面リガンドの数、被包されたフルオロフォアの数)に基づいて、模式的な分子モデルを作製し、現実的なスケールにて原子レベルでC'ドット構成を示した。これを行うために、我々はまず、SiとO原子の連続的なランダムネットワークをなす4nmのSiO2球を構築した。ネットワーク内の各SiとO原子の座標は、シリカガラスのリバースMonte Carloシミュレーションにより作成した。コア粒子の内側に存在する合計で約800のSiO2単位を使用し、これはアモルファスのシリカ密度を使用する計算とよく合致する。この後、このコア粒子内の容積を手動で作成し、そこに一つの被包されたCy5フルオロフォアを描く。その後、シリカ粒子表面に共有結合した約100のPEG鎖と16のc(RGDyC)機能化PEG鎖を手動で加える。最終的な図は、3nm以下のコア、0.5nm以下のシェル、被包された一つのCy5フルオロフォア、表面上の約100のPEG鎖及び16のc(RGDyC)リガンドを有する一つのC'ドット粒子を表す。このモデルは、真実のシミュレーションの結果ではなく、むしろ一つのC'ドット粒子の異なる構成要素の相対的サイズスケールの現実的な可視化を提供する尺度模式図であることに注意すべきある。
結果と考察
3.1. ブランクシリカナノ粒子の制御成長
図１は、この研究で探究した水性粒子合成経路を、生成物の化学的及び物理的構造とともに提示する。本明細書に詳述するように、直径10nm未満のSNPを純水中で、典型的には室温で、シリカ源としてテトラメチルオルトシリケート(TMOS)と塩基触媒として水酸化アンモニウムを用いて合成する。粒子の形成にあたり、モル質量約500g/molのPEG-シランを、反応容器中に添加して、粒子成長を終了させる。続いて温度を上昇させて熱処理(80℃)が適用され、粒子表面上のPEG-シランの凝縮度を増加させる。合成された粒子は、反応試薬を除去するために、透析により浄化され、その後、さらなる特性評価前に凝集物とダストを取り除くために200nmのシリンジフィルターでろ過される。粒子成長期間は、TMOS添加とPEG-シラン添加の間の時間窓によって定義される。粒子ペグ化は合成の一部であるため、粒子はいったん合成されるとPEG鎖ですでに表面改質されており、安定である(例えば、高濃度の塩を含有する緩衝液中で)。粒径は、TMOSの濃度、水酸化アンモニウムの濃度、粒子成長期間の長さ、及び反応温度を含む反応パラメーターを変えることで制御される。
図１は、この研究で探究した水性粒子合成経路を、生成物の化学的及び物理的構造とともに提示する。本明細書に詳述するように、直径10nm未満のSNPを純水中で、典型的には室温で、シリカ源としてテトラメチルオルトシリケート(TMOS)と塩基触媒として水酸化アンモニウムを用いて合成する。粒子の形成にあたり、モル質量約500g/molのPEG-シランを、反応容器中に添加して、粒子成長を終了させる。続いて温度を上昇させて熱処理(80℃)が適用され、粒子表面上のPEG-シランの凝縮度を増加させる。合成された粒子は、反応試薬を除去するために、透析により浄化され、その後、さらなる特性評価前に凝集物とダストを取り除くために200nmのシリンジフィルターでろ過される。粒子成長期間は、TMOS添加とPEG-シラン添加の間の時間窓によって定義される。粒子ペグ化は合成の一部であるため、粒子はいったん合成されるとPEG鎖ですでに表面改質されており、安定である(例えば、高濃度の塩を含有する緩衝液中で)。粒径は、TMOSの濃度、水酸化アンモニウムの濃度、粒子成長期間の長さ、及び反応温度を含む反応パラメーターを変えることで制御される。
図２ａ〜ｉは、異なる条件下で成長した粒子の、２つの異なる拡大率における透過型電子顕微鏡(TEM)画像を示し、サイズと粒度分布制御を明らかにする。例えば、図２ｄは、以下のパラメータを使用して合成した直径4.2nmのSNPを示す：室温、0.043M TMOS、0.002M 水酸化アンモニウム、及び12〜24時間の生長期間。4.2nmの直径は、動的光散乱(DLS)で測定され、他方、TEM画像分析から得られた粒子径はわずか2〜3nmほどである。DLSで測定した粒径は、TMEによる粒径よりわずかに大きいが、これはDLSがPEG鎖と水和層を含む流体力学的サイズを測定する一方、TEMは投射されたシリカコアの直径についての情報を提供するだけであるためである。粒子成長期間を24時間から10分に短縮すると、合成される粒子の直径は、4.2nmから3.7nmに減少する(図２ｃ)。生長期間のさらなる減少は、粒径の減少をもたらさないが、粒度分布の制御が損なわれる。このことは、高い前駆物質の濃度に起因して、粒子が最初の10分の間に急速な成長期間を経ること、その後存在するシリカクラスターの制御された凝縮(図８及び９参照)に起因してゆっくりした成長モードが続くことを示唆する。さらに粒径を小さくするために、粒子の成長期間を20時間として、しかしシリカ源であるTMOSの濃度を0.043Mから0.011Mに減らす。結果として、合成粒子の直径は、4.2nmから2.4nmに減少する(図２ａと２ｂ参照)。これは、TMOS濃度の減少が、より低い加水分解シリカ前駆物質の濃度を導き、これが今度はより遅い粒子成長をもたらすからである。水酸化アンモニウム濃度を0.002Mから0.06Mに増加させた(それにより、pHは8以下から約10以下に変わる)こと以外は、 4.2nmの粒子合成パラメーターを適用すると、平均粒径は4.2nmから5.2nmに増加する(図２ｅ及び２ｆ)。pHの増加は、一般的に加水分解速度の増加と、凝縮速度の減少を生じさせる。水中でのTMOSの加水分解は常に速いので、凝縮速度の減少は、優性効果である可能性が高く、これはより低い粒子濃度とより大きい粒径につながる。粒径をさらに増加させるために、粒子成長期間の反応温度を変化させる。反応温度を室温から80℃に増加させた以外は、4.2nm粒子合成のパラメータを適用すると、平均粒径は4.2nmから7.3nmへとさらに増加する(図２ｇ〜２ｉ)。これは、２つの影響(図８も参照)の結果かもしれない(他のメカニズムの可能性もあるが)。まず、小粒子の高い表面エネルギーに起因して、より高温では、前駆物質としてのケイ酸が消耗するまで、ケイ酸は急速に、より大きなシリカクラスター(より低い濃度を有する)に凝集する。その後、より小さい粒子は高温でより安定性が低いため、粒子はさらにゆっくりとより大きなものに凝集し、粒径がさらに増加する。
反応の間の粒子形成をモニターするため、シラン-結合Cy5フルオロフォアをTMOSとともに添加して、シリカ粒子へと共凝集させる。結果として、FCSを用いてCy5フルオロフォアからの蛍光シグナルを追跡することにより、インサイツ粒子径と粒子濃度をモニターできた。図８ａと８ｂに示すように、シリカ源(単数又は複数)を添加すると、TMOSとシラン-結合Cy5フルオロフォアは加水分解して、粒子に凝集し、粒径の増加とフルオロフォア濃度の減少をもたらす。室温と80℃合成の両方において、反応混合物中に存在する高濃度のケイ酸に起因して、粒子は最初の10分以内に急速な成長期間を経験する。その後、初期の粒子核形成と成長バーストに起因してケイ酸濃度が枯渇するため、粒子はさらなる制御凝集を通じてよりゆっくり成長する。粒子径と濃度の結果の両方が、以下の方程式にフィットしうる。
指数部は、反応開始時の急速な粒子形成キネティクスを表し、直線部は、その後の制御凝集工程のキネティクスを表す。粒径(直径)方程式において、ｙは時間ｔにおける平均粒径であり、Ａは特性時間ｔRの速い粒子形成キネティクスからの粒子成長の相対振幅であり、Ｂは後の制御凝縮プロセスの粒子成長速度であり、ｙ0＋Ａは、シリカ前駆物質の最初の大きさである。FCSは、流体力学的サイズが約1.2〜1.5nmであるCy5-シランを追跡するため、ｙ0＋Ａの適合値(fitted value)は、予想と一致する(表２)。粒子濃度方程式において、ｙは時間ｔにおける前駆物質濃度(Cy5-標識シリカクラスター)であり、Ａは特性時間ｔRの速い粒子形成キネティクスからの粒子成長寄与の相対振幅であり、Ｂは後の制御凝縮プロセスの粒子濃度の減少速度であり、ｙ0＋Ａは、Cy5-シランの初期濃度である。フィットさせたパラメーターを、以下の表に示す。
室温合成と比べて、80℃での粒子形成は、急速成長期間の直後の約10分で、より大きなサイズとより低い濃度を有する。これは、粒子表面エネルギーが高温でより高いという事実が原因かもしれない。これは、粒径と濃度方程式の両方においてｔRの適合値が高温でより小さい(これは、より速い速度を示す)という発見とも一致する。10分後、80℃では、粒径は持続的に増加し、粒子濃度はわずかに減少する一方、室温では両方の変化はより小さい。これは、より高温では、表面エネルギーの増加に起因して、制御凝集を通じて粒子がより大きなものに凝集しやすい傾向があることを示唆する。適合値Ｂから、異なる温度における凝集速度が推定できる。それは、室温では約0.03nm/hrであり、80℃では0.06nm/hrである。
高温での制御凝集を通じた粒子成長をさらに実証するために、室温合成反応を、TMOSと色素-シランの添加後16時間目に、二つに分ける(コア粒子が形成される時間)。共通の合成手順後、二つの粒子バッチの一つをPEG-シラン添加により終結させ、最終生成物のTEM画像を図９ａに示す。他方のバッチは、さらに3日間80℃の熱処理にかけ、続いてPEG-シラン添加により反応を終結させる。図９ｂに示すように、高温処理後の粒子は、高温処理なしの粒子(図９ａ)より大きなサイズを有する。反応の初日にほとんどのシリカ源がすでに粒子上に凝縮されていることを考えると、高温でのこのさらなる粒子成長は、小さいシリカ粒子の凝集によるさらなる成長の結果である可能性が高い。この制御凝集は、高温では小粒子の表面エネルギーが、それらがより大きなものに凝集しそれにより全体的な自由エネルギーを低下させる傾向があるほど高いという事実によって生じるのかもしれない。
異なる平均径を有する９つの粒子バッチについてDLSで測定したサイズと粒度分布の比較を図２ｊに示す。このデータは、正確な粒径制御(1nm未満で段階的な)を実証する。単一のSiO2原子層が大体0.4nm厚であることを考えると、これは、粒子の周りに単原子層を形成するレベルで粒子成長をコントロールできることに等しい。４つの反応パラメータの組み合わせを変えることによってこのコントロールを達成できるため、この合成系は、高度の化学的多用途性に恵まれている。これは、狭い粒径分散の極小SNPを、大きく異なる条件下で合成でき、それは他の粒子改質化学に適合するはずであることを暗示する。
通常のStober法と比べたこのプロセスの違いは、反応溶媒がアルコールから水に切り替わっており、これが極小SNP成長のための明確な反応キネティクスを導くことである。水中でのテトラアルコキシシラン、及び特にTMOSの加水分解速度は、アルコールと比べて大きく増加し、それゆえ、たとえ中性に近いpHでの加水分解でもなお、均一なケイ酸前駆物質溶液を生成するのに十分なほど速い。
速い加水分解後、水と中性付近のpHはさらに、高濃度で、均一な大きさのSNPシードを生み出す速い凝集を導く。他の全てを一定に保つと、TMOSの濃度の増加/減少は、より多い/より少ないモノマーのシードへの添加を通じて、より大きい/より小さい粒子をもたらす。シード形成後、加水分解によってさらなるモノマーが提供されないので、溶液中の残留ケイ酸の濃度は低く、存在するシード粒子上に凝集できるケイ酸モノマーの量は多くはなく、結果として小さな粒子が製造される。温度が高くなるにつれ、小さな粒子はより大きなものにさらに凝集する(より大きい粒子の低い表面エネルギーが原因で)。最終的に、PEG-シラン添加による粒子成長終結が、もう一つの合成パラメータを追加し、それにより粒子サイズは正確に制御され、最終的な粒子安定性が大きく増加する。
3.2. 蛍光性シリカナノ粒子の制御成長
実験において、蛍光色素は、蛍光性ペグ化SNPを製造するために、共有結合的に被包される。この目的のために、4.2nm粒子合成条件を適用し、追加でシラン-結合Cy5フルオロフォアを反応に添加し、TMOSとともにシリカマトリクスへ共凝縮させる。Cy5フルオロフォアが、高塩基濃度では溶液によってクエンチされうることを考慮して、Cy5ドープ粒子のサイズ制御は、水酸化アンモニウム濃度ではなく、単に温度を変えることによって達成される。合成された粒子は、通常の浄化ステップ後、粒子純度を最大にし、残留遊離フルオロフォアを完全に除去するために(さもないと、それは光学的粒子特性評価の結果を改ざんし得る)、最終的にゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって精製される。反応温度を室温から90℃に上昇させた８つのバッチの蛍光性粒子のサイズを、蛍光相関分光法(FCS)によって評価する(図２ｋ)。DLSと比べると、FCSは、類似する測定メカニズム(粒子拡散情報をシグナル強度変動の自己相関から抽出する)を共有する。しかしながら、FCSは、散乱光の代わりに蛍光を使用し、それゆえ、その散乱が弱い小さい粒子又は分子への感受性がより高い。
実験において、蛍光色素は、蛍光性ペグ化SNPを製造するために、共有結合的に被包される。この目的のために、4.2nm粒子合成条件を適用し、追加でシラン-結合Cy5フルオロフォアを反応に添加し、TMOSとともにシリカマトリクスへ共凝縮させる。Cy5フルオロフォアが、高塩基濃度では溶液によってクエンチされうることを考慮して、Cy5ドープ粒子のサイズ制御は、水酸化アンモニウム濃度ではなく、単に温度を変えることによって達成される。合成された粒子は、通常の浄化ステップ後、粒子純度を最大にし、残留遊離フルオロフォアを完全に除去するために(さもないと、それは光学的粒子特性評価の結果を改ざんし得る)、最終的にゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)によって精製される。反応温度を室温から90℃に上昇させた８つのバッチの蛍光性粒子のサイズを、蛍光相関分光法(FCS)によって評価する(図２ｋ)。DLSと比べると、FCSは、類似する測定メカニズム(粒子拡散情報をシグナル強度変動の自己相関から抽出する)を共有する。しかしながら、FCSは、散乱光の代わりに蛍光を使用し、それゆえ、その散乱が弱い小さい粒子又は分子への感受性がより高い。
FCS自己相関曲線は、以下の方程式によりフィットされる。
式中、Ｓは構造因子(FCS装置の楕円形の焦点の短い軸と長い軸の間の比)であり、Ｎは焦点に存在する粒子の平均数であり、Ａは三重項状態補正の振幅であり、τRは三重項状態の特性時間であり、τDは拡散時間である。構造因子Ｓはセットアップ較正から得られ、フィットで固定され、他方、Ｎ，Ａ、τR及びτDの値は、フィットから得られる。図１０は、このタイプのカーブフィッテイングの例を示す。フィットさせたパラメーターに基づいて、粒子の平均流体力学径、粒子あたりの蛍光輝度及び蛍光性粒子の濃度が得られる。
図２ｋにおいて、FCS自己相関曲線の右へのシフト、特に、遊離色素から色素被包SNPへの動きは、より大きい粒子の拡散時間がより遅いことを示す。平均粒径は、カーブフィッティングによって得られ(例は図１０参照)、1nm未満で段階的に4.3nm〜7.8nmに変化し、DLSで測定したブランクSNP(図２ｊ)と比べると、よく似たサイズ範囲と単原子層のサイズ制御をカバーする。TEMで得られた蛍光粒子の画像を図１１に示す。遊離色素と比べた、これらの様々な大きさのドットの水中での吸収及び発光スペクトルを図２ｌに示す。吸光度をマッチさせた全ての溶液は、シリカに被包されたCy5色素が遊離色素より明るいこと、及び、被包されたCy5色素輝度が粒径とともに増加することを明らかにする。水からシリカに動く誘電率の変化、及びシリカ環境中での色素の剛性の増加に起因して、この輝度の増加は、量子収率の増加と相関があった。全体的な粒径が増大するにつれて、Cy5フルオロフォアは、シリカマトリクスで十分に被包される可能性がより高くなり、観察されたより高い量子増大につながる。粒子当たりのフルオロフォアの数及び粒子当たりの輝度は、吸光度データと組み合わせてFCSによる溶液濃度から得ることができる。この結果をそれぞれ、図２ｍ及び２ｎに示す。図２から示唆されるように、異なる合成バッチの合成粒子はそれぞれ、約１〜２のフルオロフォアを含み、粒子当たりのフルオロフォアの数は、粒径が増加するにつれてわずかに多くなる。１つのCy5フルオロフォアの流体力学径が約1.2nmであり、負電荷を１つ有し(図１の分子構造参照)、負に帯電したシリカと反発することを考えると、粒子当たり平均１〜２のフルオロフォアは妥当な数である。図２ｍに示すように、FCSによって直接的に測定された(色素/粒子あたり、アバランシェ検出器にヒットする光子の数から)粒子当たりの輝度は、水中の単一のCy5フルオロフォアあたりの輝度より少なくとも２倍高く、粒径が増加するにつれて増加する。粒子当たりの輝度は、フルオロフォアあたりの輝度、及び粒子当たりのフルオロフォアの数の結果から推定することもできる(図２ｍの黒点参照)。挙動の全体的な傾向は同じであるものの、FCSで直接測定された粒子当たりの輝度が、全ての試料について、一貫してこの計算輝度値を過大評価することは興味深い。これは、Stober法により合成された粒子との違いであり、Stober法ではFCSの結果は輝度を過小評価した。挙動のこの差は、この研究で使用したGPCカラムによる、遊離色素からの粒子浄化手順の改善に起因しているのかもしれず、又は異なる種類の被包フルオロフォアに起因しているのかもしれない(他のメカニズムもあり得るが)。図２ｎの全体的な偏差は小さく、しかしながら、FCSと計算による粒子当たりの輝度の傾向は一致している。
3.3. 蛍光性コア-シェルシリカナノ粒子の制御成長
反応中に追加のシリカ源を用量ずつさらに添加することによって、ペグ化前にさらにシリカシェルを粒子に追加する(図１)。温度変化による粒径制御(粒子成長が制御された凝集経路をたどる)と比べて、シリカシェル追加による粒子成長は、モノマー添加経路をたどる。加水分解された前駆物質であるケイ酸の濃度は、常に、二次粒子核形成の臨界濃度未満にとどまる。これは所定の時間に添加されるシリカ源の用量と、用量間の間隔を最適化することによって達成できる。しかしながら、単なるTMOSの用量投与は、採用した用量と間隔幅に依存せず、常に最終粒子のさらに小さい平均径をもたらす。これは、追加したシリカ源が、既存の粒子の表面に凝縮するよりはむしろ、二次粒子を形成することを示唆する。これは、水中でのTMOSの加水分解と凝縮の両方が速いためである；単一用量を添加すると、単なる撹拌による混合は十分に速くない可能性があるため、二次粒子形成を抑制することは困難である。二次粒子核形成を回避するため、シェル追加で使用するシリカ源をTMOSからTEOSに切り替える(そのより遅い加水分解速度のため)。pHと希釈を最適化することによって、TEOSの加水分解を、単一用量が全溶液と完全に混ざるために必要な時間より、ほんの少し遅くに調節できる。このようにして、各用量のTEOSが拡散するとすぐ、それは加水分解し、既存の粒子上にかなり早く凝縮する。結果として、二次粒子核形成無しで、追加のシリカシェルを効率的に追加でき、平均粒径の増加が生じる。これは、純粋なSNP(色素添加なし)を使用して最初に成功的に実証され、約4nmのコアサイズから出発し、３つの連続的なシェルを追加し、粒径5.6nm(１つのシェル)、6.5nm(２つのシェル)、及び7.8nm(３つのシェル)をもたらす(TEMとDLSデータについては、図１２参照)。
反応中に追加のシリカ源を用量ずつさらに添加することによって、ペグ化前にさらにシリカシェルを粒子に追加する(図１)。温度変化による粒径制御(粒子成長が制御された凝集経路をたどる)と比べて、シリカシェル追加による粒子成長は、モノマー添加経路をたどる。加水分解された前駆物質であるケイ酸の濃度は、常に、二次粒子核形成の臨界濃度未満にとどまる。これは所定の時間に添加されるシリカ源の用量と、用量間の間隔を最適化することによって達成できる。しかしながら、単なるTMOSの用量投与は、採用した用量と間隔幅に依存せず、常に最終粒子のさらに小さい平均径をもたらす。これは、追加したシリカ源が、既存の粒子の表面に凝縮するよりはむしろ、二次粒子を形成することを示唆する。これは、水中でのTMOSの加水分解と凝縮の両方が速いためである；単一用量を添加すると、単なる撹拌による混合は十分に速くない可能性があるため、二次粒子形成を抑制することは困難である。二次粒子核形成を回避するため、シェル追加で使用するシリカ源をTMOSからTEOSに切り替える(そのより遅い加水分解速度のため)。pHと希釈を最適化することによって、TEOSの加水分解を、単一用量が全溶液と完全に混ざるために必要な時間より、ほんの少し遅くに調節できる。このようにして、各用量のTEOSが拡散するとすぐ、それは加水分解し、既存の粒子上にかなり早く凝縮する。結果として、二次粒子核形成無しで、追加のシリカシェルを効率的に追加でき、平均粒径の増加が生じる。これは、純粋なSNP(色素添加なし)を使用して最初に成功的に実証され、約4nmのコアサイズから出発し、３つの連続的なシェルを追加し、粒径5.6nm(１つのシェル)、6.5nm(２つのシェル)、及び7.8nm(３つのシェル)をもたらす(TEMとDLSデータについては、図１２参照)。
続いて、Cy5色素含有コアを用いて実験を行う(図３)。約1nm厚の１〜４のシリカシェルをそれぞれ、5nmサイズのCy5ドープ粒子コア(シード)に追加することによって、FCSで明らかにされるように(図３ｇ)、Cy5標識蛍光性コア-シェルSNPが合成される。これらの粒子のTEM画像を、親のコア粒子とともに、図３ａ〜ｅに示し、これらは単原子層レベルでの改善されたサイズ制御を再び明らかにする。図３ｆで、これらの粒子の吸光度マッチドスペクトル及び対応する発光スペクトルを、遊離色素と比較する。結果は、遊離Cy5色素を超える量子増大が、コア粒子についての〜1.3から、シリカシェルの数が０から４に増えるにつれて、〜1.7に増加することを示唆する。追加のシェル無しで粒径が増加する場合と同様に、この輝度の増加は、シェル数の増加を伴うCy5フルオロフォアのより緊密なシリカ封入、及び局所のシリカ環境を通じた付随する剛性の増加に起因する可能性が最も高い。シェルの数が増加すると、粒子当たりのフルオロフォアの数(FCSによる)は、明確な傾向を示さず(図３ｈ)、これは図２ｍに示す異なるサイズに成長した粒子挙動とは異なる。これは、シェル追加実験では、制御凝集よりむしろモノマー添加により粒子が成長することをさらに裏付ける。粒子当たりのフルオロフォアの数は同じままであるが、色素あたりの輝度の増強は、結果的に、FCSで観察される粒子輝度の増加に寄与する(図３ｉ参照)。
本明細書に記載の水系合成プロセスを用いると、SNPコアのサイズは、凝集の制御により調節することができ、他方、モノマーの添加によって、追加のシリカシェルを加えることができる(図１)。これらの２つの粒子成長経路を、蛍光性コア-シェルSNPの単一合成中で切り替えることができる原理を示すために、あるバッチの粒子を、まず反応温度を変えることによる制御凝集により、その後、追加のシリカ源をさらに用量添加することによるモノマー添加を通じて、成長させる。少量の粒子を、様々な合成時点でペグ化のために分取し、その後特性評価する。結果は、合成期間中に、粒径が及び被包された色素量子増大が一貫して増加することを示す(詳細は図１３参照)。結果は、10nm未満の蛍光性コア-シェルSNPの構築が、コアの直径及びシェルの厚みにより、本明細書に記載した粒子成長条件によって、ナノメートル以下の単原子層レベルで調節できることを実証する。
これらの２つの粒子成長経路(例えば、凝集の制御とモノマーの添加)を、単一合成の中で切り替えることができる原理を証明するために、あるバッチの粒子を、まず反応温度を変えることによる制御凝集により、その後、追加のシリカ源をさらに用量添加することによるモノマー添加を通じて処理する。少量の試料溶液を、様々な合成時点で、ペグ化により粒子成長をクエンチするために分取する。合成経路として、図１３ａの経路が参照される。異なる時点でクエンチした成長粒子を特性評価することにより、粒子成長プロセスの詳細を明らかにすることができる。ここで、5nm以下の粒子のための合成条件が最初に適用される(室温)。TMOSの添加後24時間目に、反応溶液の1/3を分取し、ペグ化して粒子#1を製造する(図１３ａ)。反応溶液の残りの2/3をその後80℃に加熱し、この温度で48時間維持し、続いて室温まで冷却する。その後、残りの反応溶液の半分を分取し、ペグ化して粒子#2を製造する。反応溶液の残りの半分は、さらに、２つの追加的なシリカシェル層の堆積処理にかける。粒子をその後ペグ化して粒子#3を製造する。表３ａに示すように、粒子#1の直径は5.9nmであり、粒子#2の直径は、熱処理後に9nmに増加する。粒径のこの増加は、高温での小粒子の制御凝集に起因する。この凝集は、粒子当たりの色素の数も、1.4から2.6に増加させる。反応溶液への追加のシリカ源の添加後、薄いシリカシェルが、モノマー添加を通じて既に存在する粒子の表面上に添加され、粒径がさらに11.4nmに増える。結果として、粒子#3は、9nmよりわずかに小さい推定コアサイズと、厚さ約1nmのシリカシェルを有する。それは、粒子#2と同じコアサイズを有するため、粒子当たりの色素の数は、ほぼ同じにとどまる。しかしながら、追加のシリカ源が、コアマトリクスをさらに密にし、シリカシェルが、コア内部の色素をさらに保護するという事実に起因して、被包色素の量子増大は、1.7から1.8にわずかに増える。結果として、粒子当たりの色素の数は、コアサイズの膨張により増加する可能性があり、他方、量子効率は、ブランクのシリカシェル薄層の添加によって増加しうる。10nm未満の粒子の輝度は、所望の粒子成長経路を選択することを通じて、コアサイズとシェル厚みの両方を正確に調節することによって最適化できる。
Cy5色素に加えて、他の種類のフルオロフォア[ローダミングリーン(RhG)、テトラメチルローダミン(TMR)、Cy5.5、Dyomics 782(DY782)、及びIRDye 800CW(CW800)を含む]を被包して、色の異なるコア-シェルC’ドットを製造する。それぞれの定常状態スペクトルとFCS特性評価結果を図４ａ〜ｆに示し、結果を表４に要約する。これらのC'ドットは、4.2nmサイズのコアの手順と、1nm厚のシリカシェルの添加に従って合成する。表４に示すように、最終粒径は、5.2nm(DY782)と6.7nm(Cy5.5)の間で変動し、それぞれの粒子種は約１〜２のフルオロフォアを含む。図４ｇと４ｈは、異なるC'ドットの吸収/発光スペクトルと溶液の外観をそれぞれ比較する。この粒子合成が、光学スペクトルの青領域からNIRまでの光学特性を有する様々な種類のフルオロフォアに適合することは興味深い。特に、650〜800nmにおいて、多色NIR画像処理及びNIR多重化を可能にする、異なる色のNIR C’ドットを合成できる。
3.4. 異なる無機組成を有する蛍光性シリカナノ粒子の制御成長
さらにNIRにずれる発光スペクトルを有するフルオロフォアは、通常、より大きいモル質量とサイズを有し、それゆえ、所望の水溶性を生じるためには、それらの非局在化π-電子系の周辺に、より負に帯電した硫酸基を必要とする。例えば、図１のCy5とCy5.5の分子構造を比較。シリカもその等電点pH＞2.7より上で負に帯電するため、そのように高度に負に帯電したNIRフルオロフォアをSNPに共有結合的に被包することは、静電気的な反発相互作用の増加により、困難と考えられる。ここで、水性のSNP成長溶液のpHは、シリカの等電点(pH〜2.7)よりわずかに低い値(pH〜1.5)に調節される。これらの条件下でSNPは低い(正の)電荷密度を有し、それゆえ水溶液中の粒子懸濁物は不安定であるため、アルミニウムアルコキシドをシリカ源(TMOS)とともに反応混合物に添加する。低pHでは、アルミニウム系反応中間体は正に帯電する(他方、ネットワーク内で、インフレームワーク(in-framework)アルミニウム代替シリコンは、負電荷を有する)。実験結果から、これは凝集を妨げるのに十分なのほど成長粒子を安定化する。本明細書に示すように、同時に、pH〜1.5で弱く正に帯電したシリカは、負に帯電したフルオロフォアに誘引性の相互作用を提供し、それにより、それらの取込みを促進する。アルミニウムアルコキシドは、そのアルコキシドから派生するアルミナが、最も一般的な免疫化アジュバントの一つとして注射のためにすでに承認されているため、この目的のための良い選択であり得る。それゆえ、その結果生じた極小のNIR蛍光性アルミニウム含有SNPは、臨床に応用される可能性も有する。
さらにNIRにずれる発光スペクトルを有するフルオロフォアは、通常、より大きいモル質量とサイズを有し、それゆえ、所望の水溶性を生じるためには、それらの非局在化π-電子系の周辺に、より負に帯電した硫酸基を必要とする。例えば、図１のCy5とCy5.5の分子構造を比較。シリカもその等電点pH＞2.7より上で負に帯電するため、そのように高度に負に帯電したNIRフルオロフォアをSNPに共有結合的に被包することは、静電気的な反発相互作用の増加により、困難と考えられる。ここで、水性のSNP成長溶液のpHは、シリカの等電点(pH〜2.7)よりわずかに低い値(pH〜1.5)に調節される。これらの条件下でSNPは低い(正の)電荷密度を有し、それゆえ水溶液中の粒子懸濁物は不安定であるため、アルミニウムアルコキシドをシリカ源(TMOS)とともに反応混合物に添加する。低pHでは、アルミニウム系反応中間体は正に帯電する(他方、ネットワーク内で、インフレームワーク(in-framework)アルミニウム代替シリコンは、負電荷を有する)。実験結果から、これは凝集を妨げるのに十分なのほど成長粒子を安定化する。本明細書に示すように、同時に、pH〜1.5で弱く正に帯電したシリカは、負に帯電したフルオロフォアに誘引性の相互作用を提供し、それにより、それらの取込みを促進する。アルミニウムアルコキシドは、そのアルコキシドから派生するアルミナが、最も一般的な免疫化アジュバントの一つとして注射のためにすでに承認されているため、この目的のための良い選択であり得る。それゆえ、その結果生じた極小のNIR蛍光性アルミニウム含有SNPは、臨床に応用される可能性も有する。
アルミニウムをSNPに組み込むために、溶液のpHをHClを使用して1.5付近に調節する。アルミニウム-tri-sec-ブトキシド/イソプロパノール混合物とTMOS(モル比は約1：10)をその後同時に添加して、続いて、10分の反応時間後、粒子成長を終結させるためにPEG-シランを添加する。水酸化アンモニウムを使用して溶液のpHを中性に戻す調節を行った後、80℃の熱処理を適用して、共有結合性の粒子ペグ化を強化する。TEMとDLSの組み合わせにより証明されるように(図１４)、約3nmで狭い粒径分散のNPが、この方法で順調に合成できる。
ここで使用する強い酸性条件ではピュアなSNPが産生できないことに気をつけるべきである。アルミニウム組成物が無いと、強い酸性条件下で、シリカナノ粒子は安定ではない。シリカの等電点(すなわち、pH2.7)未満のpHを有する条件(高度に負に帯電した近赤外色素の封入のために所望される)で、シリカナノ粒子を合成するためには、粒子安定性のためにアルミニウムを使用する必要がある。シリカの等電点(2.7)に溶液のpHが近づく結果として、SNPの表面電荷密度は、粒子を静電気的に安定化するのに十分なほど高くはなくなり、結果的に粒子凝集が生じる。これに対して、酸性条件でのアルミニウムアルコキシドの加水分解生成物は、強く正に帯電した[Al(OH2)6]3+であり、インフレームワークアルミニウムは負に帯電しているため、我々は、アルミニウムがシリカと共凝縮すると、十分な電荷を成長粒子に与える(静電気的反発相互作用が、未制御の粒子凝集を防止できるように)と仮定する。他のメカニズムも考えられる。この合成手順における成長粒子の減少した負電荷密度が、負に帯電したNIRフルオロフォアへの反発を減らすのに役立ち、それによりNP内へのそれらの封入が促進されるかもしれない。この原理を証明するために、極小の10nm未満のCy5.5標識NPを、反応混合物中に色素結合シランを添加することによって合成した。これらの粒子のシリカへのアルミニウムの順調な取込みを、まず固体NMRで調べる。図５ａの29Si NMRスペクトルは、ＴとＱグループが、粒子表面上のシリカ-系粒子マトリクス(Ｑグループ)、及び粒子表面のPEG-シラン凝縮(Ｔグループ)を実証する従前の研究と一致することを証明する。27Al NMRスペクトルは、-56ppm付近に一つのシャープなピークを示すだけであり、これは四配位のインフレームワークアルミニウムを示す。共有結合的に被包されたNIR色素を有する、対応するアルミノシリケートネットワークの分子構造の図説を図５ａに示す。粒子形成をさらに、TEM並びにFCSの組み合わせで確認すると(図５ｂ及び５ｄ)、FCSで測定された粒径は4.2nmである。吸収と発光スペクトルの未変化の形状は、強い酸性の合成条件にもかかわらず、Cy5.5フルオロフォアの生存を示唆する(図５ｅ)。
この合成手順が、高度に負に帯電したフルオロフォアの封入を増強することをより定量的に証明するために、アルミニウム含有Cy5.5標識SNP、及び様々な対照反応の結果物を、合成直後且つ浄化工程前に、GPCで特性評価した。図５ｆと５ｇに示すように、弱塩基性条件を使用して合成した通常のCy5とCy5.5標識SNPのエルグラム(elugram)は、３つのメインピークを有する。
GPCエルグラムのピークを帰属させるために、Cy5をドープしたペグ化SNP合成バッチを、GPCによって異なるフラクションに分け、その後各フラクションを、FCS特性評価にかける。各フラクションの粒子の平均濃度、粒子輝度及び粒子径を、図１５の上の３つのグラフに示す。18分辺りのGPCピークは、直径約1〜2nmの溶液中の物体に対応し、これは、遊離Cy-5シランコンジュゲート又は小さな自己凝縮Cy5-シランコンジュゲート・クラスターの大きさとよく一致する。さらに、18分のピークに対応する物質当たりの輝度は、単一のCy5フルオロフォアの輝度に近い。このピークは、粒子内に被包されていない遊離Cy-5シラン色素コンジュゲート又はCy5-コンジュゲート・クラスターに由来する可能性がある。12分辺りのGPCメインピークは、約6nmの直径を有する溶液中の物体に対応し、輝度レベルは、遊離Cy5フルオロフォアの輝度より二倍以上大きい。両方のパラメータは、目的とする蛍光性Cy5被包SNPのために予想されるものと良く一致している。12分辺りのメインピークは、所望のC'ドットに由来するかもしれない。6〜7分辺りのGPCピークは、20nm以下のかなり大きな直径を有する溶液中の物質に対応する。興味深いことに、このピークに対応する物質当たりの輝度は、単一蛍光性SNPのものと同様である。このピークはそれゆえ、純粋にSNP凝集物に由来する物質に帰属されるべきではない。さらに、明確な小さなピークが、275nmの検出器を備えたGPCで観察できるが、このピークは、FCSで観察される非常に低濃度の溶液中の物質に対応する。これは、275nmで小さな吸光度と低い蛍光を有するこのピークを生じさせている溶液中のより大きな物体(最大で20nm)が、合成で使用する化学物質(例えば、PEG-シラン)の不純物に由来するかもしれないこと、しかし粒子合成反応とはあまり関係が無いことを示唆する。
図１５に示される、7分辺りのピークは、通常はクリーニングによりろ過で取り除かれるより大きな凝集物に由来する。18分辺りのピークは、未反応色素分子に由来し、これは透析を通じて洗い流される。12分辺りのピークが主要な粒子ピークである。未反応のフルオロフォアと粒子のピーク面積を比較することによって、被包されたフルオロフォアの割合を推定できる。まず第一に、データは、封入の程度が、フルオロフォアに、及びその色素あたりの荷電数に大きく依存することを明らかにする。約60％のシラン-結合Cy5色素(一つの負電荷を有する)は、弱塩基性条件で、粒子内に被包されるが、この割合は、Cy5.5(分子あたり三つの負電荷を有する)ではわずか40％以下まで減少する。反応のpHを1.5まで低下させると、遊離粒子のピークはCy5又はCy5.5について観察されないが、エルグラムは、強い粒子凝集を示唆し、これは粒子表面電荷の損失に起因する可能性が最も高い。これに対して、アルミニウムアルコキシドをTMOSとともに、低pHで反応混合物に添加すると、両方の色素について、明確な粒子ピークがエルグラム中に再出現し、他方凝集ピークは強く抑制される。興味深いことに、強酸性合成条件下で、両方の色素それぞれのピーク下面積により明らかにされる封入効率は増加する。この影響は、Cy5.5でより強く、効率は40％以下から70％以上に増加する。
２つの追加のシリカシェルを、フルオロフォア量子効率をさらに増大するために、ペグ化前に、Cy5.5被包アルミノシリケートコアに追加する(図１に図示する)。その結果得られたアルミニウム含有コア-シェルナノ粒子の29Si及び27Al 固体NMRスペクトルは(図５ａ)、シェル無しの粒子と比べて一致する特性を示し、四配位インフレームワーク(in-framework)・アルミニウムの存在を実証する。29Siスペクトル中のＴグループが、粒子表面上に凝縮しているPEG-シランに由来することを考えると、シェル添加後の29Siスペクトル中のＱグループに対するＴグループの強度の減少は、減少した表面/体積比と一致し、これは成功的なシリカシェル堆積を示唆する。コア-シェル・アルミニウム含有ドットの平均径は、TEM(図５ｃ)から得られるのは約5nmであり(硬い粒子の直径のみ)、他方FCS(図５ｄ)測定では7.6nm(硬い粒子＋柔らかいPEGシェル＋水和層)であり、これは4.2nmのコア粒子への成功的なシェル追加をさらに示唆する(表５：定常状態の吸収とFCS濃度分析によって測定されるように、これらのドットは、遊離色素に対して2.6の量子増大を有し、これはコアのみから得られる1.7の値よりはるかに大きい)(図５ｅ、表５)。表５に示すように、これは、コアシェル粒子がコア粒子より約1.5倍大きいことを示唆するFCSによって確認される。さらに、合成された単純なCy5.5 C’ドット(すなわち、アルミニウムアルコキシドの添加無し)の最大量子増大は、数nm厚のシリカシェルを有する場合でさえ、約1.7〜2.2である。シリカネットワーク内へのアルミニウムの取込みが、その剛性を増加させることが知られているため、遊離色素に対して2.6のこの高い量子増大は、色素を取り囲むマトリクスの剛性が増加した結果かもしれない。Cy5.5遊離色素の水中での量子収率が約0.3であることを考えると、観察された2.6の増大は、被包色素の量子収率である約0.8に相当し、これはかなり高く、理論上の輝度限界に近づきつつある。
水中で合成されたこれらのアルミニウム含有蛍光性SNPと、C'ドットを区別するために、それらをAlC'ドットと称する。アルミニウムはコア内にのみ存在すると予期される一方、シェルは、C'ドットの場合のようにPEG鎖で共有結合的に装飾された単純なシリカからなるため、最終的には、アルミニウムアルコキシドの速い反応速度の結果として、最終的なコア-シェルAlC'ドット表面は、通常のC'ドットの表面と区別できないはずである。
3.5. リガンドで機能化された蛍光性シリカナノ粒子
蛍光性SNP及びコア-シェルSNP、並びにそれらのアルミニウム含有類似体のペグ化粒子表面上に、アクセス容易なリガンドを導入するために、ヘテロ二官能性PEGを使用する。これは、診断及び治療用途における、例えば前臨床並びに臨床使用のための、リガンドで機能化された10nm未満のNIR蛍光性ナノプローブを製造する。そのような用途のために関心の高いリガンドには、ペプチド、抗体フラグメント、様々なDNA及びRNAセグメント(例えば、siRNA)、薬物及びそれらの放射性同位体並びにそれらの各キレート成分を含む治療分子、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ここで、原理の証明は、αvβ3インテグリン-標的指向性環状(アルギニン-グリシン-アスパラギン酸, チロシン-システイン)ペプチド、c(RGDyC)を使用して実証され、これは、放射性同位体、例えば124Iに結合するチロシン(Y)残基、及びマレイミド-機能化ヘテロ二官能性PEGに結合するシステイン(C)残基を含んでいる。図６ａに示すように、この目的のために、鎖の端部にNHSエステルとマレイミド基を有するヘテロ二官能性PEG(モル質量約800g/mole のNHS-PEG-mal)を、まずアミノシランでコンジュゲートする(アミンとNHSエステル基との反応を通じて)。第二工程で、チオールマレイミド反応を通じて、得られたシラン-PEG-マレイミドをさらにc(RGDyC)とコンジュゲートし、c(RGDyC)機能化PEG-シラン(c(RGDyC)-PEG-シラン)を製造する。ヘテロ二官能性PEGは、PEG-シランと比べて少し長いものを選択する(500g/moleに対して、800g/mole)。これは、表面リガンドが、PEG-シランコーティングの表面を少し超えて突出することを確実にし、それにより容易にアクセスできるようになる(図７のモデルも参照)。最終的なc(RGDyC)-PEG-シランを、ペグ化工程において、一官能性PEG-シランとともに、ナノドット合成溶液に添加する。結果として、合成されたナノドットの表面は、通常のPEG鎖とより長いc(RGDyC)機能化PEG鎖の両方で共有結合的に被覆される(図１)。図６ｂは、遊離c(RGDyC)ペプチド、遊離Cy5色素、及びc(RGDyC)表面機能化が有る又は無いCy5被包C’ドットコア(Cy5-C’ドット、シリカシェル無し)の吸光度スペクトルを比較する。c(RGDyC)ペプチドは、チロシン残基に由来する、275nmの吸光度ピークを有するが、Cy5遊離色素もCy5-C’ドットも、この波長範囲で検出可能なシグナルを示さない。この吸光度ピークはそれゆえ、成功した粒子表面機能化を検証するために使用できる。実際に、c(RGDyC)機能化PEG-Cy5-C’ドット(c(RGDyC)-PEG-Cy5-C’ドット)は、650nmのCy5吸光度ピークに加えて、275nm付近に吸光度ピークを示す。さらに、図１６に示すように、FCSによって、c(RGDyC)表面改質無しのドットと比べてわずかに右にシフトするc(RGDyC)-PEG-Cy5-C’ドットの自己相関曲線が測定され、これは、粒子表面へc(RGDyC)リガンドが付着した後の1nm以下の粒径増加を示す(表６)。これらのデータは、c(RGDyC)ペプチドが、粒子表面にうまく付着したことを示唆する。吸光度とFCS特性評価を組み合わせると、C'ドットあたりのc(RGDyC)リガンドの数が算出できる。表６に示すように、この合成バッチから、平均で約16のc(RGDyC)ペプチドが、単一のCy5-C’ドット(シリカシェル無し)に付着している。末端のリガンドの数は、合成条件により、例えば、粒子合成工程において添加するリガンド担持PEG-シランと、単なるPEG-シランの比を変えることによって、変更可能である。
蛍光性SNP及びコア-シェルSNP、並びにそれらのアルミニウム含有類似体のペグ化粒子表面上に、アクセス容易なリガンドを導入するために、ヘテロ二官能性PEGを使用する。これは、診断及び治療用途における、例えば前臨床並びに臨床使用のための、リガンドで機能化された10nm未満のNIR蛍光性ナノプローブを製造する。そのような用途のために関心の高いリガンドには、ペプチド、抗体フラグメント、様々なDNA及びRNAセグメント(例えば、siRNA)、薬物及びそれらの放射性同位体並びにそれらの各キレート成分を含む治療分子、及びそれらの組み合わせが含まれるが、これらに限定されない。ここで、原理の証明は、αvβ3インテグリン-標的指向性環状(アルギニン-グリシン-アスパラギン酸, チロシン-システイン)ペプチド、c(RGDyC)を使用して実証され、これは、放射性同位体、例えば124Iに結合するチロシン(Y)残基、及びマレイミド-機能化ヘテロ二官能性PEGに結合するシステイン(C)残基を含んでいる。図６ａに示すように、この目的のために、鎖の端部にNHSエステルとマレイミド基を有するヘテロ二官能性PEG(モル質量約800g/mole のNHS-PEG-mal)を、まずアミノシランでコンジュゲートする(アミンとNHSエステル基との反応を通じて)。第二工程で、チオールマレイミド反応を通じて、得られたシラン-PEG-マレイミドをさらにc(RGDyC)とコンジュゲートし、c(RGDyC)機能化PEG-シラン(c(RGDyC)-PEG-シラン)を製造する。ヘテロ二官能性PEGは、PEG-シランと比べて少し長いものを選択する(500g/moleに対して、800g/mole)。これは、表面リガンドが、PEG-シランコーティングの表面を少し超えて突出することを確実にし、それにより容易にアクセスできるようになる(図７のモデルも参照)。最終的なc(RGDyC)-PEG-シランを、ペグ化工程において、一官能性PEG-シランとともに、ナノドット合成溶液に添加する。結果として、合成されたナノドットの表面は、通常のPEG鎖とより長いc(RGDyC)機能化PEG鎖の両方で共有結合的に被覆される(図１)。図６ｂは、遊離c(RGDyC)ペプチド、遊離Cy5色素、及びc(RGDyC)表面機能化が有る又は無いCy5被包C’ドットコア(Cy5-C’ドット、シリカシェル無し)の吸光度スペクトルを比較する。c(RGDyC)ペプチドは、チロシン残基に由来する、275nmの吸光度ピークを有するが、Cy5遊離色素もCy5-C’ドットも、この波長範囲で検出可能なシグナルを示さない。この吸光度ピークはそれゆえ、成功した粒子表面機能化を検証するために使用できる。実際に、c(RGDyC)機能化PEG-Cy5-C’ドット(c(RGDyC)-PEG-Cy5-C’ドット)は、650nmのCy5吸光度ピークに加えて、275nm付近に吸光度ピークを示す。さらに、図１６に示すように、FCSによって、c(RGDyC)表面改質無しのドットと比べてわずかに右にシフトするc(RGDyC)-PEG-Cy5-C’ドットの自己相関曲線が測定され、これは、粒子表面へc(RGDyC)リガンドが付着した後の1nm以下の粒径増加を示す(表６)。これらのデータは、c(RGDyC)ペプチドが、粒子表面にうまく付着したことを示唆する。吸光度とFCS特性評価を組み合わせると、C'ドットあたりのc(RGDyC)リガンドの数が算出できる。表６に示すように、この合成バッチから、平均で約16のc(RGDyC)ペプチドが、単一のCy5-C’ドット(シリカシェル無し)に付着している。末端のリガンドの数は、合成条件により、例えば、粒子合成工程において添加するリガンド担持PEG-シランと、単なるPEG-シランの比を変えることによって、変更可能である。
FCSと光学的吸光度測定を組み合わせることによって、C’ドットあたりの色素の数の計算と同様の方法で、C'ドットあたりのc(RGDyC)リガンドの数が、推定できる。例えば、c(RGDyC)-C’ドットの光学スペクトル中の、275nmのc(RGDyC)ピークの高さは(図６ｂ)、それから、c(RGDyC)リガンド非含有C'ドットから得られた吸光度スペクトル・バックグラウンドを差し引くことによって、推定できる。その後、得られたc(RGDyC)のピーク高さを、チロシンの吸光係数(例えば、約1400 M-1cm-1)で割ることによって、溶液中に存在するc(RGDyC)リガンドの総数の濃度を計算できる。一方、溶液中のC'ドットの濃度は、FCSによって測定できる。最終的に、c(RGDyC)濃度とC'ドット粒子濃度の比をとることによって、粒子当たりのc(RGDyC)リガンドの数を推定できる。この結果は、この研究で合成した様々なC'ドット上のc(RGDyC)リガンドの数が12〜22であることを示唆する(表６参照)。
この表面改質方法論が、C'ドットファミリーの他の粒子プラットホームに適用できることを証明するために、同様の反応条件下で、c(RGDyC)ペプチドを様々な種類のC'ドットに付着させる。詳しくは、これらには、追加のシリカシェルを有する、異なる種類のフルオロフォア(Cy5.5 vs. Cy5)を有する、及び異なる組成(AlC’ドット vs. C’ドット)を有するC'ドットが含まれる。図６ｃに示すように、これらの全ての合成粒子は、275nm付近にc(RGDyC)特有の吸光度ピーク示し、全てのケースにおける、成功的なc(RGDyC)表面改質を示す。粒子当たりのc(RGDyC)ペプチドの数は、FCSの結果と組み合わせたこれらの光学測定から導き出され、12から22までわずかに変化する(表６)。
6nmのC’ドットがそれぞれ、熱重量分析(TGA；図１７参照)によりその表面におおよそ100のPEG鎖を有すること(数は粒径とともに変化する)を考慮すると、5〜10のPEG鎖のうち一つが、c(RGDyC)リガンドで機能化されると推定できる。リガンドの絶対数に加えて、リガンド密度は、生物学的反応を制御すると予測されるもう一つのパラメータであり、これはこの研究で論じた合成パラメータによって調節できる。合成された〜7nmのC’ドットの一官能性PEG鎖とc(RGDyC)-機能化PEG鎖の表面密度はそれぞれ、およそ1.7/nm2及び0.2/nm2であると推定される。単なる(プレーンな)PEG鎖にとって、これは、約0.6nm2のPEG-シラン頭部基あたりのエリアに相当する。ちなみに、高曲率のC'ドット表面上のPEG鎖の総合的な表面密度が、平面状シリカ上のより短い機能性アルキル-シランモノマーについて報告されているリガンド密度と非常に近いことは興味深い(頭部基当たりのエリアで表すと、1.2/nm2と2.2/nm2の間、又は0.83nm2と0.45nm2の間)。
6nmのブランクの非蛍光性ペグ化SNP(フルオロフォア封入無し)のTGA曲線を図１７に示す。6nmの平均径は、DLSで測定した流体力学径である。温度600℃までの重量損失は、粒子試料中の有機含有物の存在を示す。この試料合成は、蛍光色素の封入工程を含まなかったので、粒子の有機含有物は粒子表面のPEG鎖から生じるだけである。TGA曲線は600℃付近で平らになり、有機含有物のほとんどが、残留構成物としての無機シリカを残して燃焼によって消滅したことを示唆する。このデータから、シリカとPEGの間の重量比は約52％：48％であると推定できる。6nmの流体力学径のペグ化SNPが、〜4nmの純粋なシリカコアと〜1〜2nmのPEG層を有することを考えると、粒子当たりのPEG鎖の数は、シリカ密度を約1.9〜2.2g/cm3と仮定することによって推定できる。結果は、このシンプルなSNPについて、粒子表面に約80〜100のPEG鎖があることを示唆する。これは、約1.7鎖/nm2の粒子表面上のPEG密度に変換され、これは約0.6nm2のPEG-シラン頭部基あたりのエリアに相当する。粒径が増加するにつれ、粒子当たりのPEGの数が増える。このPEGの表面密度と、粒子当たりのc(RGDyC)の数を比較すると、ここで合成されたc(RGDyC)-PEG-C’ドットの表面上には、およそ5〜10の非機能化PEG鎖ごとに一つのc(RGDyC)-標識PEG鎖があると推定できる。
3.6. リガンド-機能化ペグ化蛍光性コア-シェルシリカナノ粒子の分子モデル
完全な分析結果に基づいて、c(RGDyC)による表面改質を有するリガンド-機能化Cy5封入ペグ化コア-シェルC’ドットの(すなわちc(RGDyC)-PEG-Cy5-C’ドットの)現実的スケールの分子モデルを図７に示す。大きさの比較のため、左側(図７ａ)の上から下へ、この粒子を構成する個々の成分：Cy5色素、PEG-シラン(約500g/mole), マレイミド-機能化(すなわち、ヘテロ二官能性)PEG-シラン(約800g/mole)、c(RGDyC)ペプチド、及びシリカのモデルを示す。図７ｂ及び７ｃのモデルは、一つのCy5フルオロフォアを被包する直径3nm以下のシリカコア(図７ｂ、上側の挿入図)、0.5nm以下の厚みのシリカシェル、1.5nm以下の厚みのPEG層、及びPEG-シランより少し長いヘテロ二官能性PEGの末端にある16のc(RGDyC)リガンド(図７ｂ、下側の挿入図)を有するC'ドットを縦断した図を表す。1.9〜2.2g/cm3付近のアモルファスシリカ密度に照らすと、このシリカナノ粒子は、約800のSiO2ユニットと、粒子表面上の約100のPEG鎖からなる。全体的な粒径は約7.5nmであり、全体的な粒子モル質量は約110kDaである。FCSによって測定されるその流体力学径は1nmよりわずかに大きいだけだが(表３) 、図７ａに示すように、Cy5フルオロフォアの長さは2〜3nmである。図７に基づくと、共有結合したCy5フルオロフォアの位置が3nmのシリカコアの厳密に内側であることは、封入プロセスの確率的性質、及び、Cy5と負に帯電した脱プロトン化シリカ表面水酸基との間の静電反発力を考えると、ありそうにないないと結論できる。シリカによって完全に覆われる/被包されるためには、余分なシリカシェルがさらなる量子収率増大をもたらすという事実と一致して、むしろ追加のシリカシェルが必要である(図３ｇ及び３ｉ)。C'ドットのシリカコア-シェル部分にわたるSiO2構造単位がわずか約10であることは、さらに、これらのナノ粒子のニア分子(near-molecular)又はマクロ分子サイズを強調する。
完全な分析結果に基づいて、c(RGDyC)による表面改質を有するリガンド-機能化Cy5封入ペグ化コア-シェルC’ドットの(すなわちc(RGDyC)-PEG-Cy5-C’ドットの)現実的スケールの分子モデルを図７に示す。大きさの比較のため、左側(図７ａ)の上から下へ、この粒子を構成する個々の成分：Cy5色素、PEG-シラン(約500g/mole), マレイミド-機能化(すなわち、ヘテロ二官能性)PEG-シラン(約800g/mole)、c(RGDyC)ペプチド、及びシリカのモデルを示す。図７ｂ及び７ｃのモデルは、一つのCy5フルオロフォアを被包する直径3nm以下のシリカコア(図７ｂ、上側の挿入図)、0.5nm以下の厚みのシリカシェル、1.5nm以下の厚みのPEG層、及びPEG-シランより少し長いヘテロ二官能性PEGの末端にある16のc(RGDyC)リガンド(図７ｂ、下側の挿入図)を有するC'ドットを縦断した図を表す。1.9〜2.2g/cm3付近のアモルファスシリカ密度に照らすと、このシリカナノ粒子は、約800のSiO2ユニットと、粒子表面上の約100のPEG鎖からなる。全体的な粒径は約7.5nmであり、全体的な粒子モル質量は約110kDaである。FCSによって測定されるその流体力学径は1nmよりわずかに大きいだけだが(表３) 、図７ａに示すように、Cy5フルオロフォアの長さは2〜3nmである。図７に基づくと、共有結合したCy5フルオロフォアの位置が3nmのシリカコアの厳密に内側であることは、封入プロセスの確率的性質、及び、Cy5と負に帯電した脱プロトン化シリカ表面水酸基との間の静電反発力を考えると、ありそうにないないと結論できる。シリカによって完全に覆われる/被包されるためには、余分なシリカシェルがさらなる量子収率増大をもたらすという事実と一致して、むしろ追加のシリカシェルが必要である(図３ｇ及び３ｉ)。C'ドットのシリカコア-シェル部分にわたるSiO2構造単位がわずか約10であることは、さらに、これらのナノ粒子のニア分子(near-molecular)又はマクロ分子サイズを強調する。
この例では、1nm未満に大きさを制御された(例えば、単原子層のレベルで)、狭い粒径分散を有するペグ化SNPを製造するための水中合成方法論が提示される。NIR発光色素を含む、様々なタイプのフルオロフォアを、粒子内に被包して、蛍光性プローブを製造でき、その輝度は、ペグ化前の追加のシリカシェルの添加によりさらに増強できる。この方法論は、さらに、他の組成を有する、10nm未満の大きさの蛍光性SNPの合成を可能にする。特に、アルミニウムゾル-ゲル前駆物質の添加は、アルミニウム含有蛍光性コア及びコア-シェルナノ粒子をもたらし、そのために、高度に負に帯電したNIRフルオロフォアの封入効率が、シリカ粒子に対して増大されるだけでなく、個々のフルオロフォアの量子増大が、理論上の輝度限界に近づき始める。最後に、蛍光性SNP、コア-シェルSNP、及びそれらのアルミニウム含有類似体のペグ化粒子表面上に、容易にアクセスできるリガンドを導入するために、ヘテロ二官能性PEGを使用することができ、診断及び治療用途において前臨床及び臨床使用するための10nm未満のNIR蛍光性ナノプローブを製造することができる。本明細書に記載されるNP構造相関性は、SNPの初期成長状態のメカニズムの基礎的理解を向上させるのに役立つかもしれない。
本開示を、一以上の特定の実施形態及び／又は例を参照して説明してきたが、本開示の他の実施形態及び／又は例が、本開示の範囲を逸脱することなく作られることが理解されるであろう。
Claims (9)
- ポリエチレングリコール(ＰＥＧ)基で表面機能化されたコアナノ粒子、又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）室温で、水、テトラメチルオルトシリケート(ＴＭＯＳ)、及びアルミナコア形成モノマーを含む反応混合物を形成すること、ここで、前記アルミナコア形成モノマーの添加前に、溶液のｐＨをｐＨ１〜２に調節する；
ｂ）ｉ）前記コアナノ粒子を製造する場合は、前記反応混合物を、１０分〜７日及び室温〜９５℃で撹拌しながら保持することにより、平均径が２〜１５ｎｍであるアルミノシリケートコア（以下、コアナノ粒子）を形成すること、
又は、
ｂ）ii）前記コア-シェルナノ粒子を製造する場合は、前記ｂ）ｉ）を行い、その後、ｂ）ｉ）で得られた反応混合物のｐＨをｐＨ７〜９に調節し、シェル形成モノマーを添加すること、ここで、二次粒子形成が生じないよう、前記シェル形成モノマーは、別々のアリコートで添加され、それにより、平均径２〜５０ｎｍのコア-シェルナノ粒子が形成される；
ｃ）任意で、ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物のｐＨをｐＨ６〜１０に調節すること；及び
ｄ）ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に室温で、ＰＥＧ-シランを添加し、及び、得られた反応混合物を０．５分〜２４時間及び室温で撹拌しながら保持すること；
ｅ）任意で、ｄ）で得られた混合物を１時間〜２４時間及び４０℃〜１００℃の温度で加熱する
ことによって、ＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子、又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成すること；
を含む方法。 - ｂ）ii）において、ｐＨを７〜９に調節する直前に、０．１ｋと１ｋの間の分子量と１０ｍＭと７５ｍＭの間の濃度を有するＰＥＧを前記反応混合物に添加する、請求項１に記載の方法。
- 前記ａ）の反応混合物が、さらに色素前駆物質を含み、及びＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子が、その中に共有結合的に封入された一以上の蛍光色素分子を有する、請求項１に記載の方法。
- １〜７の蛍光色素分子が、ＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子又はＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子それぞれの中に存在する、請求項３に記載の方法。
- ｂ）ii）で、シェル形成モノマーの添加の間、ｐＨを７〜８に維持するためにｐＨを定期的に調節することをさらに含む、請求項１に記載の方法。
- リガンドの結合したＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子、又はリガンドの結合したＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を製造する方法であって、
ａ）室温で、水、テトラメチルオルトシリケート(ＴＭＯＳ)、及びアルミナコア形成モノマーを含む反応混合物を形成すること、ここで、前記アルミナコア形成モノマーの添加前に、溶液のｐＨをｐＨ１〜２に調節する；
ｂ）ｉ）前記コアナノ粒子を製造する場合は、前記反応混合物を、１０分〜７日及び室温〜９５℃で撹拌しながら保持することにより、平均径が２〜１５ｎｍであるアルミノシリケートコア（以下、コアナノ粒子）を形成すること、
又は、
ｂ）ii）前記コア-シェルナノ粒子を製造する場合は、前記ｂ）ｉ）を行い、その後、ｂ）ｉ）で得られた反応混合物のｐＨをｐＨ７〜９に調節し、シェル形成モノマーを添加すること、ここで、二次粒子形成が生じないよう、前記シェル形成モノマーは、別々のアリコートで添加され、それにより、平均径２〜５０ｎｍのコア-シェルナノ粒子が形成される；
ｃ）任意で、ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物のｐＨをｐＨ６〜１０に調節すること；及び
ｄ）ｂ）ｉ）又はｂ）ii）で得られたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に室温で、ＰＥＧ成分にリガンドが結合しているＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを添加し、及び、得られた反応混合物を０．５分〜２４時間及び室温で撹拌しながら保持すること；
ｅ）任意で、ｄ）で得られた混合物を１時間〜２４時間及び４０℃〜１００℃の温度で加熱する
ことによって、リガンドの結合したＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子、又はリガンドの結合したＰＥＧ基で表面機能化されたコア-シェルナノ粒子を形成すること；
を含む方法。 - ＰＥＧ成分にリガンドが結合しているＰＥＧ-シラン・コンジュゲートが、ｄ）でＰＥＧ-シランに加えて添加され、それによって、ＰＥＧ基とリガンドの結合したＰＥＧ基とで表面機能化されたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を形成する、請求項１に記載の方法。
- ＰＥＧ-シランをｄ）で添加する前に、ＰＥＧ成分にリガンドが結合しているＰＥＧ-シラン・コンジュゲートを、室温で、ｂ)ｉ)又はｂ)ii)から得られた前記コアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む反応混合物に添加し、
得られた反応混合物を、０．５分〜２４時間及び室温で撹拌しながら保持し、続いて
得られた反応混合物を、１時間〜２４時間及び４０℃〜１００℃の温度で加熱し、それによってリガンドの結合したＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を形成し、
続いて、
ｄ）リガンドの結合したＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を含む得られた反応混合物に、ＰＥＧ-シランを室温で添加し、
得られた反応混合物を０．５分〜２４時間及び室温で撹拌しながら保持し、それによって、ＰＥＧ-シランの少なくとも一部が、リガンドの結合したＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子の表面の少なくとも一部に吸着され、及び、
ｅ）得られた混合物を１時間〜２４時間及び４０℃〜１００℃の温度で加熱し、それによって、ＰＥＧ基とリガンドの結合したＰＥＧ基とで表面機能化されたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を形成する、
請求項１に記載の方法。 - 前記ＰＥＧ-シランの少なくとも一部又は全てが、ＰＥＧ-シランのシラン成分と結合している末端とは反対側のＰＥＧ成分の末端に第一反応基を有し、ｅ）において、第一反応基を有するＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を形成した後、第二反応基で機能化されたリガンドと反応させ、第一反応基と第二反応基の反応よって、リガンドで機能化されたＰＥＧ基で表面機能化されたコアナノ粒子又はコア-シェルナノ粒子を形成する、請求項１に記載の方法。
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