KR20180033126A - 초미세 나노입자 및 이의 제조방법 및 이용 방법 - Google Patents

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울리히 비. 와이즈너
카이 마
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코넬 유니버시티
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Abstract

실리카 나노입자(SNP), 코어-쉘 SNP, 예를 들면 2 내지 15 nm의 크기 및 1 nm 미만의, 즉 단일 원자 층 수준에서 크기 조절의 좁은 크기-분산를 갖는 실리카 나노입자(SNP), 코어-쉘 SNP의 제조를 위한 수용성 합성 방법론. 근 적외선(NIR) 에미터를 포함하는 상이한 종류의 염료는 초과 실리카 쉘 내에 공유결합적으로 캡슐화될 수 있고 밝기는 초과 실리카 쉘의 첨가를 통해 강화될 수 있다. 표면은 폴레에틸렌 글리콜 (PEG) 기, 및 임의로 특정 표면 리간드로 작용화될 수 있다. 이러한 수용성 합성 방법론은 2 내지 15 nm 크기된 형광성 코어 및 코어-쉘 알루미노실리케이트 나노입자(ASNP)의 합성을 또한 가능하게 하며, 이는 표면 작용화가 또한 될 수 있다. 크게 음으로 하전된 NIR 형광단의 캡슐화 효율 및 밝기가 알루미늄 없는 대응하는 SNP에 비해 강화된다.

Description

초미세 나노입자 및 이의 제조방법 및 이용방법
연방에서 후원된 연구와 관련된 언급
본 발명은 미국국립보건원에 의해 수여된 등록번호 제CA161280-03호 하에서 정부 지원에 의해 만들어졌다. 미국 정부(United States Government)는 본 발명의 일부 권리를 갖는다.
개시의 분야
본 개시는 주로 초미세 나노입자 및 이를 제조하고 이용하는 방법에 관한 것이다. 더 구체적으로 본 개시는 주로 초미세 실리카 및 알루미노실리케이트 나노입자에 관한 것이다.
실리카 나노입자(Silica nanoparticles, SNP)는 이들의 큰 표면-면적, 비활성성(inertness) 및 생체-적합성으로 인해 잠재적인 치료의/진단의 적용에 대한 관심을 모아왔다. 그러나, 대부분 SNP는 크기 면에서 >10nm이다.
>12nm 입자는 생체 내 몸체로부터 효과적으로 내보내지지(cleared) 않고 간 및 다른 기관/조직에 불리하게 분포하여, 잠재적으로 이러한 조직을 독성 성분에 노출시킨다 (특히 이러한 >10nm SNP는 약물 및/또는 방사능으로 변형된다면). 직경 내 약 8nm 입자가 약 1일 동안 몸체에 잔류하고, 10-11nm는 약 3-5 일이지만, 12nm 초과의 경우 내보내지 않거나 매우 느리게 내보낸다.
현재, 초미세 무기 나노입자는 암 테라노스틱스(theranostics)를 위한 나노의학(nanomedicine)로서의 관심이 빠르게 증가되고 있다. 일부 유기 기반의 나노의학은 다기능성(multifunctionality) 및 다원자가(multivalency) 효과로 인해 종래의 화학요법제보다 이미 더 경쟁력 있다. 무기 나노입자는 나노의학의 쌓는 성분(building element)을 더 다각화하고, 이들의 본질적인 물리적 특성과 관련된 이점을 제공하고 제조 비용을 낮출 수 있다. 실험실부터 임상까지의 나노입자의 안전한 변형은 다수의 상당한 과학적 및 규정 장애(hurdle)을 극복하는 것이 필요하다. 가장 중요한 기준은 유리한 생물학적 분배(biodistribution) 및 이의 시간 변화(약물동력학, PK) 프로파일이다. 신장 클리어런스(renal clearance)에 대한 크기 역치는 10 nm 미만이다. 오늘날까지 오직 소수의 무기 나노입자 플랫폼만이 효과적인 신장 클리어런스를 허용하는 10 nm 미만의 크기로 합성되었다. 이들 중에서 오직 코넬 닷(Cornell dots) 또는 단순히 C 닷으로 언급되는 <10nm 크기의 폴리에틸렌 글리콜 코팅된(페길화된 (PEGylated)) 형광 코어-쉘 실리카 나노입자 (SNP)이 인간 임상 시험에서 최초로 시험용 신약 (IND)로서 미국식품의약국(FDA)에 의해 승인되었다. 흑색종 환자에 대한 첫번째 임상 시험 결과가 고무적이었음에도 불구하고, 이러한 10nm 이하의 (sub 10nm) 크기의 형광 유기-무기 하이브리드 SNP에 대한 일부 합성 과제가 남아있다.
첫째로, 모든 이전의 C 닷-형태 SNP 합성 노력은 알코올이 용매로 사용되었던 변형된 스퇴버(Stober) 공정을 따랐다. 그러나, 생물학적 또는 임상적 적용 내의 이용을 위한 물질에서 반응 매체로서 물이 선호될 것이다. 합성 및 청소(cleaning) 프로토콜(protocol)을 크게 단순화시켜 덜 휘발성인 폐기물로 이어지고, 그로 인해 상당히 빠르고 더 비용 효율적인 입자를 생성시킨다. 또한, 스퇴버 공정이 수십 nm 내지 수십 마이크론의 직경을 갖는 SNP를 생성시키는 데 넓게 이용되어 왔음에도 불구하고, 10 nm 이하의 입자 크기는 알코올 내의 반응 속도론 제한으로 인해 이 합성 공정의 크기 조절의 제한이 있다.
두 번째로, 페길화 동안의 표면 전하의 손실은 입자 응집 또는 적어도 입자 크기 분포를 넓히는 것(broading)을 초래할 수 있기 때문에, PEG로 공유결합적으로 덮은 실리카 입자 표면이 곤란할 수 있다. 이 효과는 입자 표면 에너지의 증가로 인해 초미세 입자에서 더 표명되고, 그 결과 입자 단분산성 및 크기 조절 능력을 제한한다.
세 번째로, pH 2-3에서 이의 등전점 초과의 실리카의 음의 표면 전하의 결과로서, 실리카 및 형광단 사이의 정전기적 반발력의 결과 때문에 SNP 내로의 음으로 하전된 기를 갖는 실란-컨쥬게이트된 유기 형광 염료의 공유결합의 캡슐화 효율성이 낮다. 이는 살아있는 조직 내의 이미지화 적용에서 가장 바람직한 근-적외선(NIR) 발광 염료에서 특히 사실이다. NIR 염료는 큰 비편재화된 π-전자 시스템을 갖고 물 중에 용해되기 위해 이들의 둘레 상의 다수의 음으로 하전된 작용기(예를 들면, 설페이트)를 주로 필요로 한다. 이들의 전형적인 가격이 mg 당 $200-$300이고 초기 합성 후 주로 사용된 실란-염료 컨쥬게이트의 재사용이 문제가 되기 때문에, 낮은 결합 효율성은 이들 염료의 문제이다.
마지막으로, 실리카 이외에 다른 무기 성분의 조성물이 < 10 nm 크기의 형광 SNP 및 코어-쉘 SNP에서 보고된 적이 없다. 특히, 강성률의 증가는 비-방사성률의 감소의 결과로서 염료당 형광 수율의 증가와 직접 연관되기 때문에, 조성물은 유기 염료 환경의 강성률을 높이는데 관심이 있다. 여기서, 첨가제로서 알루미늄 알콕사이드로부터 유도된 실리카 조성물이 특히 흥미로운데, 이는 이들이 알콕시실란으로부터 유도된 실리카 내 경화 성분으로 알려져 있고 알루미나는 근육 내 및 피하 내로 주사되는 고-체적 백신접종에 첨가되는 승인된 보조제이기 때문이다.
모든 이러한 과제는, 개선된 크기 조절, 이전에 알려지지 않은 조성물, 및 강화된 수행 특성을 갖는, 물 기반의 <10 nm 유-무기 하이브리드 닷에 접근을 조직적으로 개발하기 위해, 원래 형광 코어-쉘 SNP (C 닷) 합성의 재탐색을 제시한다.
1 nm 미만, 즉 단일 원자 층의 수준에서 1 nm 미만의 크기 조절 정확성을 갖는, 좁게 크기-분포된 형광 실리카 나노입자(SNP) 및 코어-쉘 SNP의 제조를 위한 수용액 합성 방법론. 근 적외선 (NIR) 발광체를 포함하는, 형광단의 다른 형태는 공유결합적으로 캡슐화될 수 있다. 밝기는 초과 실리카 쉘의 첨가를 통해 강화될 수 있다.
이러한 방법론은 이전에 알려지지 않은 조성물의 <10 nm 크기의 형광 코어 및 쉘 SNP의 합성을 추가로 가능하게 한다. 특히 알루미늄 졸-겔 전구체의 첨가는 형광 알루미노실리케이트 나노입자(ASNP) 및 코어-쉘 ASNP로 이어진다. 크게 음으로 하전된 NIR 형광단의 캡슐화 효율성 및 밝기는 알루미늄 없는 대응되는 SNP에 비해 강화된다. 생성된 입자는 ~0.8의 양자 수율을 나타낸다, 즉 이론적인 밝기 제한에 접근하기 시작한다.
모든 입자는 페길화되어 입체적 안정성을 제공할 수 있다. 이종이작용성(Heterobifunctional) PEG는 형광 SNP, 코어-쉘 SNP, 및 이들의 알루미늄 함유 유사체의 페길화된 입자 표면상에 리간드를 도입하는 데에 사용되어 리간드 작용화된 <10 nm NIR 형광 나노프로브를 생산할 수 있다. 초기 알코올-기반의 변형된 스토버 공정으로 유도된 코넬 닷 또는 C 닷으로 인용되는 형광 코어-쉘 SNP로부터, 물 기반의 합성으로 유도된 물질을 구별하기 위하여, 본 명세서에서 설명되고 물 중에서 합성된 SNP 및 ASNP은 코넬 프라임 닷 또는 C'닷 및 AlC'닷으로 인용될 것이다.
이러한 유-무기 하이브리드 나노물질은 암 진단 및 치료(테라노스틱스)을 포함하는 나노의학 내 적용을 찾을 수 있다.
합성 조건을 변화시킴으로써, C' 닷 및 AIC' 닷은 약 2.4nm로부터 약 7.3nm 또는 초과까지 범위일 수 있다. 변화할 수 있는 조건은 다음을 포함한다: 반응의 온도; TMOS 또는 비교될 만한 화합물의 농도; 염기(예를 들면, 암모늄 하이드록사이드)의 농도 및/또는 입자 성장 기간. 이러한 조건의 예시는 실시예 1의 표 1 내에 포함된다.
온도는 실온에서 약 80℃ 이상까지의 범위일 수 있다. TMOS의 농도는 약 0.011M로부터 약 0.043M 또는 그 초과까지의 범위일 수 있다. 암모늄 하이드록사이드의 농도는 약 0.002M로부터 약 0.06M 또는 그 초과까지의 범위일 수 있다. 입자 성장 기간은 약 10분으로부터 약 20시간 또는 그 초과까지의 범위일 수 있다.
본 개시의 진의 및 목적의 완전한 이해를 위해, 동반된 도면과 함께 다음의 자세한 설명을 참고해야 한다.
도 1은 생산된 입자의 화학적 구조와 함께 물 기반의 형광성 SNP 성장 경로의 예시이다.
도 2는 빈 SNP의 특성화를 나타낸다(즉 형광단 캡슐화 없음) (a-j). (a-i)는 수용성 용액 내 DLS에 의해 측정된 다음의 평균 직경의 빈 SNP의 2가지 상이한 배율(삽도)에서 TEM 이미지를 나타낸다: (a) 2.4 nm, (b) 3.1 nm, (c) 3.7 nm, (d) 4.2 nm, (e) 4.5 nm, (f) 5.2 nm, (g) 5.9 nm, (h) 6.5 nm 및 (i) 7.3 nm. (j) 수용성 용액 내 DLS에 의해 측정된 변화하는 평균 직경의 빈 SNP의 크기 분포. (k-n) 다음의 상이한 평균 직경의 Cy5-캡슐화된 형광성의 SNP(C' 닷)의 특성화: 4.3 nm, 4.7 nm, 5.2 nm, 5.9 nm, 6.2 nm, 6.8 nm, 7.3 nm 및 7.8 nm. 평균 직경이 FCS에 의해 측정된다. (k)는 FCS 자기상관 곡선을 나타낸다; (l)는 흡광도(매치된) 및 방출 분광을 나타낸다; (m)는 FCS 유도된 입자당 형광단의 숫자를 나타낸다; (n)는 수용성 용액 내 해리 염료와 비교할 때, FCS 측정된(열) 및 계산된 (닷), 변화하는 평균 직경을 갖는 형광성 SNP 입자당 형광 밝기를 나타낸다.
도 3은 0 (코어/씨드) 내지 4개의 쉘의 Cy5-캡슐화된 형광성 코어-쉘 SNP(C' 닷) 및 FCS에 의해 측정된 다음의 평균 직경의 2가지 상이한 배율(삽도)에서 TEM 이미지를 나타낸다: 5.0 nm (코어/씨드), 6.1 nm, 6.8 nm 7.8 nm 및 8.7 nm (a-e). (f) 흡광도(매치된) 및 발광 분광; (g) FCS 자기상관 곡선; (h) FCS 유도된 입자당 형광단의 숫자; (i) 수용성 용액 내 해리 염기에 대한 0 (코어/씨드) 내지 4개의 쉘을 갖는 C' 닷의 입자당 FCS 측정된 (열) 및 계산된 (흑색 닷) 형광성 밝기 (본문 참조).
도 4는 형광단의 상이한 종류로부터 유도된 C' 닷의 흡광도(매치된) 및 발광 분광(왼쪽)뿐 아니라 FCS 특성화(오른쪽)를 나타낸다(a-f). (a) RhG, (b) TMR, (c) Cy5, (d) Cy5.5, (e) DY782 및 (f) CW800. (g) 상이한 염료/색을 갖는 C' 닷의 정규화된 흡광도 및 발광 분광. (h) 상이한 색 염료로부터 유도된 C' 닷의 용액 출현을 나타내는 사진. 왼쪽부터 오른쪽: RhG, TMR, Cy5, Cy5.5, DY782 및 CW800.
도 5는 다음을 나타낸다 (a) 실리카 쉘과 및 실리카 쉘 없는 AlC' 닷의 고체상태 29Si CP/MAS (상단) 및 27Al MAS (하단) NMR 분광; 오른쪽 삽도가 공유결합적으로 캡슐화된 NIR Cy5.5 염료와 함께 대응되는 알루미노실리케이트 네트워크의 분자적 구조의 모델을 나타낸다. (b) 코어 ASNPs의 TEM 이미지. (c) 코어-쉘 ASNPs의 TEM 이미지. (d) FCS 자기상관 곡선 및 (e) 수용성 용액 내 해리 Cy5.5 염료에 대해 Cy5.5 캡슐화된 코어 ASNP 및 코어-쉘 AlC' 닷의 흡광도 (매치된) 및 발광 분광. (f, g) Cy5 (f) 및 Cy5.5 (g)를 캡슐화하는 종래의 C' 닷에 대한 극적으로 상이한 pH 조건 하에서 합성된 입자 배치로부터 얻은 GPC 용리 곡선, 본문 내 설명 참조. 수직적인 해치드(hatched) 선은 안내로서 몰 질량 표준(킬로 달턴, kDa 내)의 용리 시간을 가리킨다.
도 6은 다음을 나타낸다 (a) c(RGDyC) 작용화된 PEG-실란의 컨쥬게이션 화학. (b) 성공적인 c(RGDyC) 표면 변형을 제시하는 c(RGDyC) 표면 작용화와/없는 해리 c(RGDyC) 펩타이드, 해리 Cy5 염료 및 Cy5-C' 닷 (실리카 쉘 없음)을 비교하는 흡광도 분광. (c) 해리 c(RGDyC) 펩타이드 및 리간드로 나노입자-PEG- 표면 작용화의 성공을 나타내는 c(RGDyC) 표면 작용화된 C' 닷의 상이한 종류를 비교하는 흡광도 분광은 입자 구조(즉 초과 실리카 쉘과 또는 없이), 캡슐화된 형광단의 종류, 또는 입자 조성물(즉 C' 닷 대 AlC' 닷)에 비의존적이다.
도 7은 Cy5 형광단, PEG-실란, 말레이미도-작용화된 PEG-실란, c(RGDyC) 펩타이드, SiO2 매트릭스 (a) 및 c(RGDyC)-PEG-Cy5-C' 닷 (b 및 c)의 분자적-그래프 랜더링(rendering)을 나타낸다. C' 닷 모델은 하나의 Cy5 플루오로-포어, ~1 nm 실리카 쉘, ~1.5 nm PEG 층 및 16개의 용이하게 접근가능한 c(RGDyC) 리간드를 캡슐화하는 ~3nm 실리카 코어로 구성된다. 분자적 모델이 수소 없는 분자적 구조(b) 및 현실적인 원자적 치수의 구-기반의 분자적 모델 (c)을 포함하는 시각화를 위한 상이한 모드 내에서 보여진다.
도 8은 인시츄 FCS 측정 결론을 나타낸다. (a) 입자 직경 및 (b) 반응 및 입자 성장 동안 입자 농도.
도 9는 (a) 실온에서 합성된 입자 및 (b) 실온에서 먼저 합성되고, 이어서 성장이 PEG-실란 첨가에 의해 종결되기 전에 또 다른 3일 동안 80℃ 열 처리를 거쳐진 입자의 TEM 이미지를 나타낸다.
도 10은 FCS 자기상관 곡선의 피트의 일 실시예로서 6.2 nm C' 닷 FCS 특성화 결과를 나타낸다.
도 11은 FCS에 의해 측정된 변화된 평균 직경의 Cy5-캡슐화된 형광성 및 페길화된 SNP(Cy5-C' 닷, 쉘 없음)의 TEM 이미지를 나타낸다. (a) 4.3 nm, (b) 4.7 nm, (c) 5.2 nm, (d) 5.9 nm, (e) 6.2 nm, (f) 6.8 nm, (g) 7.3 nm, (h) 7.8 nm.
도 12는 (a-d) 쉘의 0-3개 층의 빈 페길화된 코어-쉘 SNP(형광단 없는)의 TEM 이미지를 나타낸다. (a) 쉘 없음 (코어/씨드) 4.1 nm, (b) 1개 쉘, 5.6 nm, (c) 2개 쉘, 6.5 nm, 및 (d) 3개 쉘, 7.8 nm. 평균 직경은 DLS에 의해 측정된다. (e) DLS에 의해 측정된 쉘의 0-3개 층의 SNP의 직경 분포.
도 13은 단일 합성 내 입자 성장 메커니즘을 변경하는 것을 보여준다. (a) 내 경로에 의해 강조되는 것과 같이, 형성하는 입자의 성장이 먼저 제어된 응집을 거쳐 단량체 첨가가 잇따른다. 입자의 3개의 세트는 PEG-실란의 첨가를 통한 상이한 반응 시간에서 입자 성장을 퀀칭을 통해 이러한 합성으로부터 생성된다. 생성된 입자는 (b) FCS 및 (c) 흡광도/발광 측정에 의해 특성화된다.
도 14은 평균 직경 약 3.5 nm의 ASNP의 DLS 크기 분포 및 TEM을 나타낸다.
도 15은 합성된 그대로의 Cy5 투여된 페길화된 SNP의 GPC 엘루그램(Cy5-C' 닷, 쉘 없음, 하단 그래프) 및 상이한 분획의 관련된 FCS 특성화 결과(상단 3개 그래프)를 나타낸다.
도 16은 해리 Cy5 염료, Cy5-C'(코어만), 및 c(RGDyC) 작용화된 Cy5-C'(c(RGDyC)-Cy5-C' 닷)의 FCS 측정된 자가상간 곡선의 비교를 나타낸다.
도 17은 6 nm (DLS에 의해 측정된) 빈 비-형광성 페길화된 SNP (형광단 캡슐화 없는)에 대한 TGA 곡선을 나타낸다.
본 개시는 나노입자(예를 들면, 코어 또는 코어-쉘 나노입자)를 제공한다. 상기 나노입자는 또한 본 명세서에서 초미세 나노입자를 가리킨다. 본 개시는 또한 나노입자를 제조하고 사용하는 방법을 제공한다.
본 명세서에서 제공되는 모든 범위는, 반대되는 지시가 없는 한, 소수점첫번째 자리(0.1 단위; tenth decimal place)까지의 상기 범위 내에 속하는 모든 값을 포함한다.
본 명세서에서 개시된 기술은 입자 크기, 입자 크기 분포, 형광 파장, 형광 밝기, 조성물, 입자 페길화, 입자 표면 작용성화, 합성 수율, 생성물 순도 및 제조 신뢰성을 포함하는, 다양한 양상에서 향상된 조절을 갖는 초미세 작용화된 페길화된 형광 실리카 나노입자에 접근하는 수용성 합성을 제공한다. 단일 유-무기 하이브리드 나노물질 합성 시스템 내의 이러한 모든 양태를 포함하는 체계적이고 정확한 조절은, 실험실로부터 임상까지의 유-무기 하이브리드 나노물질의 안전한 변형을 방지하기 전에는, 결코 달성되지 않았다. 그러므로, 본 명세서에서 개시된 기술은 나노의학 적용에서 현저하게 가능성 있는 것으로 나타나는, 잘-정의되고 체계적으로 크게 조절가능한 실리카-기반의 나노물질에의 접근을 제공한다.
일 양태에서, 본 개시는 초미세 나노물질을 제조하는 방법을 제공한다. 상기 방법은 수용성 반응 매체(예를 들면 물)의 사용에 기반된다. 상기 나노물질은 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된(예를 들면 페길화) 표면일 수 있다.
본 명세서에서 설명된 방법은 직선적으로 확대될 수 있다, 예를 들면 생성물 품질에 어떠한 실질적 변화 없이 예를 들면 10 ml 반응으로부터 1000 ml 또는 그 초과로 직선적으로 확대될 수 있다. 이 확장성은 나노입자의 확대 규모 제조에서 중요하다.
상기 방법은 수용성 반응 매체(예를 들면 물) 내에서 수행된다. 예를 들면, 상기 수용성 매체는 물을 포함한다. 특정 반응물은 극성 비양성자성 용매(예를 들면, DMSO 또는 DMF) 중에서 용액으로서 다양한 반응 혼합물에 첨가된다. 다양한 실시예에서, 상기 수용성 매체는 극성 비양성자성 용매와 다른 특정 유기 용매(예를 들면, 알코올 예를 들면 C1 내지 C6 알코올)를 10% 이상, 20% 이상, 또는 30% 이상에서 함유하지 않는다. 일 실시예에서, 상기 수용성 매체는 알코올을 1% 이상, 2% 이상, 3% 이상, 4% 이상, 또는 5% 이상에서 함유하지 않는다. 일 실시예에서, 상기 수용성 매체는 어떠한 탐지할 수 있는 알코올을 함유하지 않는다. 예를 들면, 본 명세서에서 개시된 어떠한 방법의 어떠한 단계의 반응 매체는 물, 임의로, 극성 비양성자성 용매로 필수적으로 구성된다.
상기 방법 내의 다양한 지점에서 pH는 바람직한 값 또는 바람직한 범위 내로 조절될 수 있다. 반응 혼합물의 pH는 염기의 첨가에 의해 증가될 수 있다. 적절한 염기의 예시는 암모늄 하이드록사이드를 포함한다.
예를 들면, 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자 표면을 제조하는 방법으로서, 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된(즉, 페길화된) 표면일 수 있는 것인, 방법은 다음을 포함한다: a) 실온(예를 들면 위치에 의존하는 15℃ 내지 25℃)에서 물 및 TMOS(실리카 코어 형성 단량체)(예를 들면 11mM 내지 270mM의 농도에서)을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 반응 혼합물 (염기, 예를 들면 암모늄 하이드록사이드를 이용하여 조절될 수 있음)의 pH는 6 내지 9(예를 들면 1nm 내지 2nm의, 평균 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 갖는 코어 전구체 나노입자의 형성을 초래함)인, 단계; b) 다음 i) 또는 ii)의 단계: i) 시간 (t1) 및 온도 (T1)에서(예를 들면 (t1) 0.5일 내지 7일 및 실온 내지 95℃에서(T1)) 반응 혼합물을 유지시키는 단계로서, 이에 의해 2 내지 15 nm의 평균 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 갖는 나노입자(코어 나노입자)가 형성되는 것인, 단계, 또는 ii) 경우에 따라 실온으로 반응 혼합물을 냉각시키는 단계, 및 단계 a)로부터의 반응 혼합물에 쉘 형성 단량체(예를 들면, 테트라에틸 오르쏘실리케이트, TMOS과 다른, 예를 들면 TEOS 또는 TPOS)(쉘 형성 단량체 농도가 2차 핵형성을 위한 역치 이하가 되도록 상기 첨가가 수행됨)를 첨가하는 단계로서, 이에 의해 2 내지 50 nm(예를 들면 2 내지 15nm)의 평균 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 갖는 코어-쉘 나노입자가 형성되는 것인, 단계; c) 경우에 따라 단계 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물의 pH를 6 내지 10의 pH로 조절하는 단계; 및 d) 임의로 (코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 페길화하는 단계에 의해) 실온에서 단계 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물에, PEG-실란(실란 모이어티에 공유결합적으로 결합된 PEG 모이어티를 포함함)(예를 들면 10mM 내지 60mM의 농도에서)(예를 들면, 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMSO 또는 DMF 내에서 용해된 PEG-실란 컨쥬게이트)을 첨가하는 단계 및 시간 (t2) 및 온도 (T2)에서(예를 들면 (t2) 0.5 분 내지 24 시간 실온(T2)에서) 생성된 반응 혼합물을 유지시키는 단계 (이에 의해 PEG-실란 컨쥬게이트 분자의 적어도 일부는 단계 b)로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자의 표면의 적어도 일부에 흡수됨); e) 단계 d)로부터의 혼합물을 시간 (t3) 및 온도 (T3)에서 가열하는 단계로서(예를 들면 (t3) 1시간 내지 24시간 40℃ 내지 100℃(T3)에서), 이에 의해 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되는 것인, 단계.
나노입자는 후-합성(post-synthesis) 공정 단계를 거칠 수 있다. 예를 들면, 합성(예를 들면 상기 실시예 내 단계 e)의 후) 후 용액을 실온으로 냉각시키고 이어서 투석 멤브레인 튜브로 이동된다 (예를 들면, 상업적으로 이용가능한 (예를 들면 피어스(Pierce)로부터) 분획분자량 10,000을 갖는 투석 멤브레인 튜브). 투석 튜브 내 용액은 탈이온증류수 중에 투석되고 (물의 부피는 반응 부피의 200 배 이상임, 예를 들면 10ml 반응에 대한 2000ml 물) 물은 1 내지 6일 동안 매일 교체되어 나머지 반응물, 예를 들면 암모늄 하이드록사이드 및 유리 실란 분자를 씻어낸다. 그리고 나서 입자는 200nm 실린지 필터(피셔 브랜드(fisher brand))를 통해 여과되어 응집 또는 먼지를 제거한다. 바람직하다면, 겔 투과 크로마토그래피 및 고속액체크로마토그래피를 포함하는, 추가적인 정제 공정이 적용되어 합성된 입자의 높은 순도를 추가적으로 보증할 수 있다(예를 들면 1% 이하의 비반응된 반응물 또는 응집). 어떠한 정제 공정 후, 다른 용매가 추가적인 공정 내에서 사용된다면 정제된 나노입자는 탈이온된 물로 다시 이송될 수 있다
코어는 실리콘 코어일 수 있다. 실리콘 코어 형성에 사용된 반응 혼합물은 오직 실리콘 코어 형성 단량체로서 TMOS를 포함할 수 있다.
코어는 알루미노실리케이트 코어일 수 있다. 알루미노실리케이트 코어 형성에 사용된 반응 혼합물은 오직 실리콘 코어 형성 단량체로서 TMOS 및 하나 이상의 알루미나 코어 형성 단량체(예를 들면, 알루미늄 알콕사이드, 예를 들면 알루미늄-트리-세크-부톡사이드 또는 알루미늄 알콕사이드의 조합)를 포함할 수 있다.
알루미노실리케이트 코어 합성의 경우에서, 반응 혼합물의 pH는 알루미나 코어 형성 단량체의 첨가 전에 1 내지 2의 pH로 조절된다. 알루미노실리케이트 코어 형성 후, 용액의 pH는 7 내지 9의 pH로 조절되고, 임의로 이들 사이의 모든 정수 mM 값 및 범위을 포함하는 10mM 내지 75mM의 농도에서, 이들 사이의 모든 정수 값 및 범위을 포함하는 100 내지 1,000 g/mol의 분자량을 갖는 PEG는, 반응 혼합물의 pH를 7 내지 9의 pH로 조절하기 이전에 반응 혼합물에 첨가된다.
코어 나노입자를 형성하는 데 사용된 반응 혼합물은 또한 염료 전구체를 포함할 수 있다. 이러한 경우, 생성된 코어 또는 코어-쉘 나노입자는 그 안에 캡슐화된 또는 포함된 하나 이상의 염료 분자를 갖는다. 예를 들면, 코어 나노입자는 그 안에 캡슐화된 1, 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7개의 염료 분자를 갖는다. 염료 전구체의 혼합물이 사용될 수 있다. 염료 전구체는 실란에 컨쥬게이트된 염료이다. 예를 들면, 말레이미도 작용성을 갖는 염료는 싸이올-작용화된 실란에 컨쥬게이트된다. 또 다른 실시예에서, NHS 에스터 작용성을 갖는 염료는 아민-작용화된 실란에 컨쥬게이트된다. 적절한 실란 및 컨쥬게이션 화학의 예시는 당해 업계에 알려져 있다. 상기 염료는 400nm(청색) 내지 800 nm(근-적외선)의 방출(예를 들면, 형광) 파장을 가질 수 있다. 예를 들면, 염료는 NIR-염료이다. 적절한 염료의 예시는 로다민 그린 (RHG), 테트라메틸로다민 (TMR), 시아닌 5 (Cy5), 시아닌 5.5 (Cy5.5), 시아닌 7 (Cy7), ATTO647N, Dyomics DY800, Dyomics DY782 및 IRDye 800CW을 포함하나, 이에 제한되지 않고, 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 그 안에 캡슐화된 하나 이상의 형광 염료 분자를 가진다.
실리카 쉘은 코어 나노입자 상에 형성될 수 있다. 실리카 코어는 예를 들면 코어 형성이 완료된 후 형성된다. 실리카 쉘 형성 전구체의 예시는 테트라알킬오르쏘실리케이트, 예를 들면 TEOS 및 TPOS를 포함한다. 실리카 쉘 형성 전구체의 혼합물이 사용될 수 있다. TMOS는 실리카 쉘 형성 전구체가 아니다. 실리카 쉘 형성 전구체는 극성 비양성자성 용매 내 용액으로서 반응 혼합물에 첨가될 수 있다.
별개의 분획들(aliquot) 내로 실리카 쉘 형성 전구체를 첨가하는 것이 바람직하다. 예를 들면 쉘 형성 단량체(들)은 분리된 분획(예를 들면, 40 내지 500 분획) 내에 첨가된다. 상기 분획들은 하나 이상의 쉘 형성 전구체(예를 들면 TEOS 및/또는 TPOS) 및 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMSO를 포함할 수 있다. 각 분획들은 1 내지 20 마이크로몰의 쉘 형성 단량체를 가질 수 있다. 분획 첨가 사이의 간격은 이들 사이의 모든 정수 분 값 및 범위를 포함하는, 1 내지 60 분일 수 있다. 반응 혼합물의 pH는 실리카 쉘 형성 공정 동안 변화할 수 있다. 7-8의 pH로 유지하도록 pH를 조절하는 것이 바람직하다.
코어 또는 코어-쉘 나노입자 형성 후, 코어 또는 코어-쉘 나노입자는 하나 이상의 PEG-실란 컨쥬게이트와 반응될 수 있다. 다양한 PEG-실란 컨쥬게이트는 함께 또는 다양한 순서로 첨가될 수 있다. 이러한 공정은 또한 본 명세서에서 페길화로 지칭된다. PEG-실란의 전환 퍼센트는 5% 내지 40%이고 폴리에틸렌 글리콜 표면 밀도는 nm2 당 1.3 내지 2.1 폴리에틸렌 글리콜 분자이다. 리간드-작용화된 PEG-실란의 전환 퍼센트는 40% 내지 100%이고 각 입자와 반응하는 리간드-작용화된 PEG-실란 전구체의 숫자는 3 내지 90개이다.
페길화는 시간 및 온도의 다양성에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 실리카 코어 또는 코어-쉘 나노입자의 경우에서, 페길화는 0.5분 내지 24시간(예를 들면, 밤새도록) 동안 실온에서 나노입자를 접촉함에 의해 수행될 수 있다. 예를 들면, 알루미나-실리케이트 나노입자(예를 들면, 알루미나-실리케이트 코어 나노입자 또는 실리카 코어 실리카 쉘 나노입자)의 경우에서, 온도는 밤새도록 80 ℃이다.
PEG-실란의 PEG-모이어티의 체인 길이(즉 PEG 모이어티의 분자량)은 3 내지 24개의 에틸렌 글리콜 단량체(예를 들면 3 내지 6, 3 내지 9, 6 내지 9, 8 내지 12, 또는 8 내지 24개의 에틸렌글리콜 단량체)로 조절될 수 있다. PEG-실란의 PEG 체인 길이는 입자를 둘러싸는 PEG 층의 두께 및 페길화된 입자의 약물동력학을 조절하기 위해 선택될 수 있다. 리간드-작용화된 PEG-실란의 PEG 체인 길이는 다양한 결합 및 표적화 수행을 초래하는 입자의 PEG 층의 표면 상 리간드 기의 접근성을 조절하기 위해 사용될 수 있다.
PEG-실란 컨쥬게이트는 리간드를 포함할 수 있다. 리간드는 PEG-실란 컨쥬게이트의 PEG 모이어티에 공유결합적으로 결합된다(예를 들면 PEG-실란 컨쥬게이트의 하이드록시 말단을 통해). 리간드는 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단에 컨쥬게이트될 수 있다. PEG-실란 컨쥬게이트는 이종이작용성의 PEG 화합물(예를 들면 말레이미도-작용화된 이종이작용성의 PEG, NHS 에스터-작용화된 이종이작용성의 PEG, 아민-작용화된 이종이작용성의 PEG, 싸이올-작용화된 이종이작용성의 PEG, 등)을 이용하여 형성될 수 있다. 적절한 리간드의 예시는 펩타이드 (천연 또는 합성의), 방사성 동위원소를 포함하는 리간드(예를 들면, 124I, 131I, 225Ac 또는 177Lu), 항체, 반응성 기(예를 들면, 약물 분자, 제피티닙, 등 같은 분자에 컨쥬게이트될 수 있는 반응성 기)를 포함하는 리간드들을 포함하나, 이에 제한되지 않는다.
예를 들면, PEG에 더하여 리간드 포함하는 PEG-실란 컨쥬게이트가 첨가된다(예를 들면 상기 실시예 내의 d)내에서). 이 경우에, 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성된다. 리간드-작용화된 또는 반응성 기-작용화된 PEG-실란의 전환 퍼센트는 40% 내지 100%이고 각 입자와 반응하는 리간드-작용화된 PEG-실란 전구체의 숫자는 3 내지 600이다.
예를 들면, PEG-실란 컨쥬게이트가 첨가되기(예를 들면 상기 실시예 내 단계 d) 에서) 전 또는 후(예를 들면 20 초 내지 5분 전 또는 후), 리간드를 포함하는 PEG-실란 컨쥬게이트(예를 들면 0.05 mM 내지 2.5 mM 농도에서)는 실온에서 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물에 첨가된다(예를 들면 상기 실시예 내 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터). 생성된 반응 혼합물은 시간(t4) 및 온도 (T4)(예를 들면, (t4) 0.5 분 내지 24 시간 실온에서 (T4))에서 유지되며, 여기서 PEG-실란 컨쥬게이트 분자의 적어도 일부는 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자의 표면의 적어도 일부 상에 흡수된다(예를 들면 상기 실시예 내 b)로부터). 이어서, 반응 혼합물은 시간(t5) 및 온도(T5)(예를 들면 (t5) 1 시간 내지 24 시간 40℃ 내지 100℃(T5)에서)에서 가열되며, 여기서 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성된다. 임의로, 이어서 실온에서 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 포함하는 생성된 반응 혼합물에 PEG-실란 컨쥬게이트를 가하고 (리간드 없는 PEG-실란의 농도는 10mM 내지 75mM임) (예를 들면, 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMSO 또는 DMF 내에 용해된 PEG-실란 컨쥬게이트), 시간 (t6) 및 온도 (T6)에서 생성된 반응 혼합물을 유지시키고 (예를 들면 (t6) 0.5 분 내지 24 시간 실온에서 (T6)) (이에 의해 PEG-실란 컨쥬게이트 분자의 적어도 일부가 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면의 적어도 일부 또는 리간드 PEG-실란 컨쥬게이트를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 적어도 일부에 흡수됨), 시간 (t7) 및 온도 (T7)에서 생성된 혼합물을 가열하고(예를 들면, (t7) 1시간 내지 24 시간 40℃ 내지 100℃에서(T7)), 이에 의해 리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성된다.
또 다른 실시예에서, PEG-실란의 적어도 일부 또는 전부는 PEG-실란 컨쥬게이트(이종이작용성 PEG 화합물로부터 형성됨)의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에, 그리고 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기, 및 임의로 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면, 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 형성 후 반응성 기를 갖는다. 임의로, 폴리에틸렌 글리콜 기는 제2 반응성 기로 작용화된(리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 반응성 기와 동일하거나 상이할 수 있음) 제2 리간드(리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 리간드와 동일하거나 상이할 수 있음)와 반응됨으로써, 제2 리간드 및, 임의로 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, 제2 리간드 및 폴리에틸렌 글리콜 기, 및 임의로 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성한다.
또 다른 실시예에서, PEG-실란의 적어도 일부 또는 전부는 PEG-실란 컨쥬게이트(이종이작용성 PEG 화합물로부터 형성됨)의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖는다. 폴리에틸렌 글리콜 기 및 임의로 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기, 및 임의로 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면의 형성 후 반응성 기를 갖고, 폴리에틸렌 글리콜 기 및 임의로 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 제2 반응성 기(리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 반응성 기와 동일하거나 상이할 수 있음)로 작용화된 제2 리간드(리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 리간드와 동일하거나 상이할 수 있음)와 반응함으로써 제2 리간드, 및 임의로 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, 제2 리간드 및 폴리에틸렌 글리콜 기, 및 임의로 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 폴레에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자를 형성하며, 여기서 PEG-실란의 적어도 일부는 PEG-실란 컨쥬게이트(이종이작용성 PEG 화합물로부터 형성됨)의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖고 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면, 반응성 기를 가진 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면, 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기 및 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기 및 반응성 기를 갖는 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 형성 후 반응성 기는 반응성 기(리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 리간드와 동일하거나 상이할 수 있음)로 작용화된 제2 리간드와 반응됨으로써 제2 리간드로 작용화된 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면, 제2 리간드로 작용화된 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면, 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 제2 리간드로 작용화된 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 폴리에틸렌 글리콜 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성한다.
반응성 기로 작용화된 PEG 기를 갖는 나노입자는 하나 이상의 리간드로 추가로 작용화될 수 있다. 예를 들면, 작용화된 리간드는 PEG 기의 반응성 기와 반응될 수 있다. 후-나노입자 합성 작용화를 위한 적절한 반응 화학 및 조건의 예시는 당업계에 알려져 있다.
나노입자는 좁은 크기 분포를 가질 수 있다. 다양한 실시예에서, 관련 없는 물질, 예를 들면 비반응된 시약, 먼지 입자/응집물를 포함하지 않는, 나노입자 크기 분포(페길화 전 또는 후)는 평균 입자 크기(예를 들면 가장 긴 치수)의 +/- 5, 10, 15, 또는 20%이다. 입자 크기는 당업계에 알려진 방법에 의해 결정될 수 있다. 예를 들면, 입자 크기는 TEM, GPS, 또는 DLS에 의해 결정된다. DLS는 시스템 편차(systematic deviation)를 함유하고, 그러므로 DLS 크기 분포는 TEM 또는 GPS에 의해 결정된 크기 분포와 일치하지 않을 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 나노입자를 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 하나 이상의 종류(상이한 평균 크기 및/또는 하나 이상의 상이한 조성물적 특징을 가짐)를 포함할 수 있다.
예를 들면, 조성물은 다수의 코어 및/또는 코어-쉘 나노입자(예를 들면, 실리카 코어 나노입자, 실리카 코어-쉘 나노입자, 알루미노실리케이트 코어 나노입자, 알루미노실리케이트 코어-쉘 나노입자)를 포함한다. 임의의 나노입자는 하나 이상의 종류의 폴리에틸렌 글리콜 기(예를 들면 폴리에틸렌 글리콜 기, 작용화된(예를 들면 하나 이상의 리간드 및/또는 반응성 기로 작용화된) 폴리에틸렌 글리콜 기, 또는 이들의 조합)로 작용화된 표면일 수 있다. 임의의 나노입자는 그 안에 캡슐화된 염료 또는 염료의 조합(예를 들면 NIR 염료)을 가질 수 있다. 상기 염료 분자는 나노입자에 공유결합적으로 결합된다. 나노입자는 본 개시의 방법에 의해 제조될 수 있다.
조성물 내 나노입자는 다양한 크기를 가질 수 있다. 나노입자는 2 내지 15 nm의 코어 크기를 가질 수 있으며, 그 안의 모든 0.1 nm 값 및 범위를 포함한다. 다양한 실시예에서, 나노입자는 2, 2.5, 3, 3.5, 4, 4.5, 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5, 9, 9.5, 10, 10.5, 11, 11.5, 12, 12.5, 13, 13.5, 14, 14.5, 또는 15 nm의 코어 크기를 가진다. 다양한 실시예에서, 코어 및/또는 코어-쉘 나노입자의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 99.9%, 또는 100%는 2 내지 15 nm의 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 가진다. 다양한 실시예에서, 코어-쉘 나노입자의 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 99.9%, 또는 100%는 2 내지 50 nm의 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 가진다. 다양한 실시예에서, 코어 및/또는 코어-쉘 나노입자의 코어는 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5% 99.9%, 또는 100%는 2 내지 15 nm의 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 가진다. 예시적인 크기 분포를 위해, 조성물은 어떠한 입자-크기 식별하는(입자 크기 선택/제거) 공정(예를 들면 여과, 투석, 크로마토그래피(예를 들면, GPC), 원심분리 등)에 거쳐지지 않을 수 있다. 예를 들면, 본 개시의 나노입자는 조성물 내에서 오직 나노입자이다.
조성물은 추가적인 구성성분을 포함할 수 있다. 예를 들면, 조성물은 또한 개체(예를 들면 포유류, 예를 들면 인간)에 투여를 위한 버퍼를 포함할 수 있다. 버퍼는 약학적으로-허용가능한 담체일 수 있다.
합성된 후, 그리고 후-합성 공정/처리 전의 조성물은 나노입자, 입자(2-15 nm), 먼지 입자/응집(>20nm), 비반응된 시약(<2 nm)을 가질 수 있다.
일 양태에서, 본 개시는 본 개시의 나노입자 및 조성물의 용도를 제공한다. 예를 들면, 나노입자 또는 나노입자를 포함하는 조성물은 전달 및/또는 이미지화 방법에서 사용된다.
나노입자에 의해 운반되는 리간드는 진단적 및/또는 치료적 제제(예를 들면 약물)을 포함할 수 있다. 치료적 제제의 예시는 화학요법 제, 항생제, 항진균제, 항기생충제, 항바이러스제, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 친화성 리간드는 나노입자에 컨쥬게이트되어 나노입자의 표적화된 전달을 허용할 수 있다. 예를 들면, 나노입자는 특정한 세포 종류에 연관된 세포질 성분(예를 들면 세포 멤브레인 상 또는 세포내 구획 내)에 결합할 수 있는 리간드에 컨쥬게이트될 수 있다. 표적화된 분자는 시그널링 통로 내 종양 마커 또는 분자일 수 있다. 리간드는 특정 세포 종류, 예를 들면 종양 세포에 특정 결합하는 친화성을 가질 수 있다. 특정 실시예에서, 리간드는 특정 분야, 예를 들면 간, 비장, 뇌 또는 그와 유사한 것에 나노입자를 인도하기 위해 사용될 수 있다. 이미자화는 개체 내 나노입자의 위치를 결정하기 위해 사용될 수 있다.
나노입자 또는 나노입자를 포함하는 조성물은 개체에, 예를 들면 하나의 조직 또는 몸체의 일부에서 또다른 조직 또는 몸체의 일부로의 나노입자의 이송을 촉진하는, 약학적으로-허용가능한 담체 내에서, 투여될 수 있다. 개체의 예시는 인간 및 비-인간 동물가 같은 동물을 포함한다. 개체의 예시는 또한 포유류를 포함한다.
약학적으로 허용가능한 담체는 주로 수용성 기반이다. 약학적으로 허용가능한 담체 내에 사용될 수 있는 물질의 일부 예시는 다음을 포함한다: 당(sugar), 예를 들면 락토오스, 글루코스 및 수크로오스; 전분, 예를 들면 옥수수 녹물 및 감자 전분; 셀룰로오스 및 이의 유도체, 예를 들면 소듐 카복시메틸 셀룰로오스, 에틸 셀룰로오스 및 셀룰로오스 아세테이트; 분말화된 트래거캔스 고무(tragacanth); 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예를 들면 코코아 버터 및 좌약 왁스(suppository waxes); 오일, 예를 들면 땅콩 오일, 목화씨 오일, 홍화 오일, 참깨 오일, 올리브olive 오일, 옥수수 오일 및 콩 오일; 글리콜, 예를 들면 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들면 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스터, 예를 들면 에틸 올레이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들면 마그네슘 하이드록사이드 및 알루미늄 하이드록사이드; 알긴산; 발열물질-없는 물; 등장성 식염수(isotonic saline); 링거액; 에틸 알코올; 포스페이트 버터 용액; 및 약학적 제형 내에서 실시된 다른 비-독성 융화성 물질. (REMINGTON'S PHARM. SCI., 15th Ed. (Mack Publ. Co., Easton (1975)).
본 나노입자를 포함하는 조성물은 임의의 적절한 방법에 의해 개체에 투여될 수 있다 - 단독 또는 다른 제제와 결합하여. 투여는 어떠한 수단에 의해, 예를 들면 비경구적, 점막의, 폐의, 국소의, 카테터-기반의, 또는 전달의 경구 수단에 의해 동반될 수 있다. 비경구적 전달은 예를 들면 피하의, 정맥 내의, 근육 내의, 동맥 내의, 및 장기의 조직 내로 주입을 포함할 수 있다. 점막 전달은 예를 들면 비강 내 전달을 포함할 수 있다. 폐의 전달은 제제의 흡입을 포함할 수 있다. 카테터-기반의 전달은 이온영동의 카테터-기반의 전달에 의한 전달을 포함할 수 있다. 경구저거 전달은 장 코팅된(enteric coated) 정제의 알약(pill), 또는 입을 통한 액체의 투여를 포함할 수 있다. 경피 전달은 진피 패치의 사용을 통한 전달을 포함할 수 있다.
본 나노입자를 포함하는 조성물의 투여 후, NP의 경로, 위치 및 클리어런스(clearance)는 하나 이상의 이미지화 기술을 이용하여 모니터될 수 있다. 적절한 이미지화 기술의 예시는 아르테미스 형광 카메라 시스템(Artemis Fluorescence Camera System)을 포함한다.
본 개시는 하기 단계를 포함하는 생물학적 물질, 예를 들면 세포, 세포외 구성요소 또는 조직을 이미지화 하는 방법을 제공한다: 생물학적 물질을 하나 이상의 염료를 포함하는 나노입자, 또는 상기 나노입자를 포함하는 조성물과 접촉시키는 단계; 빛과 같은 여기 전자기(e/m) 방사선을 조직 또는 세포에 유도함으로써 염료 분자를 여기시키는 단계; 여기된 염료 분자에 의해 방출된 e/m 방사선을 감지하는 단계; 및 감지된 e/m 방사선을 포집하고 처리하여 생물학적 물질의 하나 이상의 이미지를 제공하는 단계. 이러한 단계들 중의 하나 이상은 시험관 내 또는 생체 내에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 세포 또는 조직은 개체 내에 존재할 수 있거나 배양 내에 존재할 수 있다. e/m 방사선에 대한 세포 또는 조직의 노출은 시험관 내(예를 들면 배양 조건 하)에서 이뤄지거나 생체 내에서 이뤄질 수 있다. 세포, 개체 내의 세포외 물질, 조직, 기관 및 이와 유사한 것 또는 용이하게 접근할 수 없는 개체의 몸체의 어떠한 일부에 e/m 방사선을 유도하기 위해, 섬유 광학 장치가 사용될 수 있다.
개체 내의 영역을 이미지화하는 방법은 다음 단계를 포함한다: (a) 개체에게 본 개시의 하나 이상의 염료 분자를 포함하는 나노입자 또는 조성물을 투여하는 단계; (b) 여기 전자기방사선(electromagnetic radiation)을 개체에 조사하여 하나 이상의 염료 분자의 적어도 하나를 여기시키는 단계; (c) 여기된 빛을 감지하는 단계로서, 상기 감지된 빛은 여기 빛에 의한 여기의 결과로서 개체 내의 상기 염료 분자에 의해 방출된 것을 가지는, 단계; 및 (d) 감지된 빛에 대응하는 신호를 처리하여 개체 내의 영역에 대한 하나 이상의 이미지(예를 들면 실시간 비디오 스트림)를 제공하는 단계.
형광 입자가 해리 염료보다 밝기 때문에, 형광 입자가 조직 이미지화를 위해 사용될 뿐 아니라 전이 종양을 이미지화하기 위해 사용될 수 있다. 부가적으로 또는 대안적으로, 방사선동위원소는, 광유도된 전자 수송 이미징을 위한 특정 리간드 작용화 없이, 리간드-작용화된 입자의 리간드 기(예를 들면 티로신 잔기 또는 킬레이트제)에, 또는 페길화된 입자의 실리카 매트릭스에 추가로 접합될 수 있다. 방사선동위원소가 치료를 위해 선택된다면, 예를 들면 225Ac 또는 177Lu, 결국 이는 추가적인 방사선동위원소 특성을 갖는 입자를 초래할 것이다.
예를 들면, 약물-연결기 컨쥬게이트, 상기 연결기 기는 약물 방출을 위한 종양 내 효소 또는 산 조건에 의해 특별히 쪼개질(cleaved) 수 있다. 예를 들면, 약물-연결기-싸이올 컨쥬게이트는 말레이미도-PEG-입자의 합성 후 싸이올-말레이미도 컨쥬게이션 반응을 통해 말레이미도-PEG-입자에 접합될 수 있다. 추가적으로, 약물-연결기 컨쥬게이트 및 암 표적화 펩타이드 모두는 종양에 특별히 약물 전달을 위한 입자 표면에 접합될 수 있다.
본 명세서에 개시된 다양한 구현예 및 실시예 내에서 설명된 방법의 단계는 상기 방법을 수행하기 위해 충분하고 본 개시의 조성물을 생성한다. 따라서, 일 구현예에서, 상기 방법은 본 명세서에서 개시된 방법의 단계의 조합으로 필수적으로 구성된다. 또 다른 구현예에서, 상기 방법은 이러한 단계로 구성된다.
다음의 언급 내에서, 본 개시의 방법 및 조성물의 다양한 실시예가 설명된다:
1. 하기 단계를 포함하는, 임의로 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기로 작용화된(즉 페길화된), 나노입자 표면, 또는 임의로 PEG 기로 작용화된, 코어-쉘 나노입자 표면을 제조하는 방법: a) 실온(예를 들면 위치 상 15℃ 내지 25℃)에서 물 및 TMOS(실리카 코어 형성 단량체) (예를 들면 11mM 내지 270mM의 농도에서)을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 반응 혼합물의 pH는(염기 예를 들면 암모늄 하이드록사이드를 이용하여 조절될 수 있음) 6 내지 9인(평균 크기(예를 들면 가장 긴 치수), 예를 들면 1 nm 내지 2 nm의 평균 크기를 갖는 코어 전구체 나노입자의 형성을 초래함), 단계; b) 다음 i) 또는 ii)의 단계: i) 시간 (t1) 및 온도 (T1)에서(예를 들면 (t1) 0.1 내지 7일 및 실온 내지 95℃에서(T1), 예를 들면 10-15분) 반응 혼합물을 유지시키는 단계로서, 이에 의해 2 내지 15 nm의 평균 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 갖는 나노입자(코어 나노입자)가 형성되는 것인, 단계, 또는 ii) 경우에 따라 실온으로 반응 혼합물을 냉각시키는 단계, 및 단계 a)로부터의 반응 혼합물에 쉘 형성 단량체(예를 들면 TMOS과 다른, 테트라에틸 오르쏘실리케이트, 예를 들면 TEOS 또는 TPOS)(쉘 형성 단량체 농도가 2차 핵형성을 위한 역치 이하가 되도록 상기 첨가가 수행됨)를 첨가하는 단계로서, 이에 의해 2 내지 15nm의 코어 크기(예를 들면 가장 긴 치수) 및/또는 2 내지 50 nm의 평균 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 갖는 코어-쉘 나노입자가 형성되는 것인, 단계; c) 경우에 따라 단계 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물의 pH를 6 내지 10의 pH로 조절하는 단계; 및 d) 임의로 (코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 페길화하는 단계에 의해) 실온에서 단계 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물에, PEG-실란 컨쥬게이트(실란 모이어티에 공유결합적으로 결합된 PEG 모이어티를 포함함)(예를 들면 10mM 내지 60mM의 농도에서)(예를 들면, 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMSO 또는 DMF 내에서 용해된 PEG-실란 컨쥬게이트)를 첨가하는 단계 및 시간 (t2) 및 온도 (T2)에서 생성된 반응 혼합물을 유지시키는 단계 (예를 들면 (t2) 0.5 분 내지 24 시간 실온(T2)에서) (이에 의해 PEG-실란 컨쥬게이트 분자의 적어도 일부는 단계 b)로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자의 표면의 적어도 일부에 흡수됨); e) 임의로 d)로부터의 혼합물을 시간 (t3) 및 온도 (T3)에서 가열하는 단계로서 (예를 들면 (t3) 1시간 내지 24시간 40℃ 내지 100℃(T3)에서), 이에 의해 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되는 것인, 단계.
2. 언급 1의 방법에 있어서, 상기 반응 혼합물은 알루미나 또는 알루미나실리케이트 코어 형성 단량체(예를 들면 알루미늄 알콕사이드 예를 들면 알루미늄-트리-세크-부톡사이드)를 추가로 포함하고, 알루미나 또는 알루미나실리케이트 코어 형성 단량체의 첨가 전에 반응 혼합물의 pH는 1 내지 2의 pH로 조절되고, 용액의 pH가 7 내지 9로 조절되며, 임의로, PEG(예를 들면 0.1k 내지 1k의 분자량 및 10mM 내지 75mM의 농도를 갖는 PEG)는 7 내지 9의 pH로 조절하기 직전에 반응 혼합물에 첨가되고, 코어는 알루미노실리케이트 코어인, 방법.
3. 언급 1 또는 2 중 하나의 방법에 있어서, 상기 반응 혼합물 내에 염료 전구체(예를 들면 실란-염료 컨쥬게이트 예를 들면 실란-NIR 염료 컨쥬게이트)를 추가로 포함하고, PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 그 안에 공유결합적으로 캡슐화된 하나 이상의 형광 염료 분자를 갖는 것인, 방법.
4. 언급 3의 방법에 있어서, 1 내지 7개(평균 1 내지 7개, 예를 들면 2개)의 염료 분자들(예를 들면 형광 염료 분자, 예를 들면 NIR 염료 분자)이 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면 각각에 존재하는 것인, 방법.
5. 언급 4의 방법에 있어서, 상기 코어는 알루미노실리케이트 코어이고 입자당 염료 분자(예를 들면 형광 염료 분자, 예를 들면 NIR 염료 분자)의 숫자는 1 내지 7(평균 1 내지 7, 예를 들면 2)인, 방법.
6. 전술한 언급들 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 b) ii)에서, 쉘-형성 단량체가 별개의 분획들(aliquots)로 첨가되고(예를 들면 40 내지 500개의 별개의 분획들, 예를 들면 TEOS 또는 TPOS 및 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMSO의 혼합물, 여기서 각 분획들 내 쉘 형성 단량체의 몰량이 1 내지 60분에 의해 구분된, 2 내지 20 마이크로몰임), 필요하다면, 7 내지 8의 pH를 유지하기 위해 주기적으로 pH를 조절하는 것인, 방법.
7. 전술한 언급들 중 어느 하나의 방법에 있어서, PEG-실란 컨쥬게이트는 리간드(천연 또는 합성의 펩타이드), 방사성 동위원소(예를 들면 124I, 131I, 225Ac 또는 177Lu)를 포함하는 모이어티를 포함하는 리간드, 항체, 실란 모이어티(이종이작용성 PEG 화합물을 이용하여 형성될 수 있음)에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단에 컨쥬게이트된 반응성 기(예를 들면 약물 분자와 같은 분자에 컨쥬게이트될 수 있는 반응성 기, 예를 들면)를 포함하는 리간드를 포함하는 것인, 방법.
8. 전술한 언급들 중 어느 하나의 방법에 있어서, 리간드를 포함하는 PEG-실란 컨쥬게이트는 단계 d)에서 PEG-실란에 더하여 첨가되는 것이고, 이에 의해 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 PEG기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되는 것인, 방법.
9. 전술한 언급들 중 어느 하나의 방법에 있어서, PEG-실란 컨쥬게이트가 단계 d)에서 첨가되기 전 또는 후에, 리간드를 포함하는 PEG-실란 컨쥬게이트(예를 들면 0.05 mM 내지 2.5 mM의 농도에서)(예를 들면 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMSO 또는 DMF 내에 용해된 리간드를 포함하는 PEG-실란 컨쥬게이트)가 실온에서 단계 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물에 첨가되고, 시간 (t4) 및 온도 (T4) (예를 들면 (t4) 0.5 분 내지 24 시간 실온(T4)에서) 에서 생성된 반응 혼합물을 유지시키고(이에 의해 PEG-실란 컨쥬게이트 분자의 적어도 일부는 단계 b) 로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자의 표면의 적어도 일부 상에 흡수됨), 이어서 생성된 반응 혼합물을 시간 (t5) 및 온도 (T5) (예를 들면 (t5) 1 시간 내지 24 시간 40℃ 내지 100℃(T5)에서)에서 가열하고, 이에 의해 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되고, 임의로, 이어서 실온에서 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 포함하는 생성된 반응 혼합물에 PEG-실란 컨쥬게이트를 가하고(리간드 없는 PEG-실란의 농도가 10mM 내지 75mM임) (예를 들면 극성 비양성자성 용매, 예를 들면 DMSO 또는 DMF 내에 용해된 PEG-실란 컨쥬게이트), 시간 (t6) 및 온도 (T6) (예를 들면 (t6) 0.5 분 내지 24 시간 실온 (T6)에서)에서 생성된 반응 혼합물을 유지시키고 (이에 의해 PEG-실란 컨쥬게이트 분자의 적어도 일부가 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면의 적어도 일부 또는 리간드 PEG-실린 컨쥬게이트를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 적어도 일부에 흡수되고),
시간 (t7) 및 온도 (T7) (예를 들면 (t7) 1 시간 내지 24 시간 40℃ 내지 100℃(T7)에서)에서 생성된 혼합물을 가열하고, 이에 의해 리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 PEG기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되는 것인, 방법.
10. 전술한 언급들 중 어느 하나의 방법에 있어서, PEG-실란의 적어도 일부 또는 전부는 PEG-실란 컨쥬게이트(이종이작용성 PEG 화합물로부터 형성됨)의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖고, 반응성 기를 갖는 PEG기 및 임의로 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면의 형성 후에, 반응성 기를 갖는 PEG기 및 임의로 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 제2 반응성 기(리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 반응성 기와 동일하거나 상이할 수 있음)로 작용화된 제2 리간드(리간드를 포함하는 PEG기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 리간드와 동일하거나 상이할 수 있음)와 반응됨으로써 제2 리간드 및 임의로, 및 PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 제2 리간드 및 PEG 기, 및 임의로, PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성하는 것인, 방법.
11. 언급 8 또는 9의 어느 하나의 방법에 있어서, PEG-실란의 적어도 일부 또는 전부는 PEG-실란 컨쥬게이트(이종이작용성 PEG 화합물로부터 형성됨)의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖고, PEG 기 및 임의로 반응성 기를 갖는 PEG기, 및 임의로 PEG기로 작용화된 나노입자 표면의 형성 후,
반응성 기를 갖는 PEG기 및 임의로 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 제2 반응성 기(리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 반응성 기와 동일하거나 상이할 수 있음)로 작용화된 제2 리간드(리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 반응성 기와 동일하거나 상이할 수 있음)와 반응됨으로써 제2 리간드 및 임의로 PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, 제2 리간드 및 PEG 기, 및 임의로 PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성하고, PEG-실란의 적어도 일부는 PEG-실란 컨쥬게이트(이종이작용성 PEG 화합물로부터 형성됨)의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖고, 반응성 기를 가지는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면, 반응성 기를 가지는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면, 반응성 기 및 리간드를 포함하는 PEG기를 가지는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 반응성 기 및 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기를 갖는 PEG기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 형성 후, 반응성 기(리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기 및 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 리간드와 동일하거나 상이할 수 있음)로 작용화된 제2 리간드와 반응됨으로써 PEG 기 및 제2 리간드로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, PEG 및 제2 리간드로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면, 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 PEG 기, 및 제2 리간드로 작용화된 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성하는 것인, 방법.
12. 전술한 언급들 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 후-합성 공정을 추가로 포함하는 것인, 방법.
13. PEG 기로 작용화된, 다수의 코어 또는 코어-쉘 나노입자 표면, 또는 PEG 기로 작용화된 다수의 코어-쉘 나노입자 표면을 포함하는 조성물로서, 적어도 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99.5%, 또는 99.9%의 코어 나노입자는 2 내지 15 nm의 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 갖거나 코어-쉘 나노입자는 2 내지 15 nm의 코어 크기(예를 들면 가장 긴 치수)를 갖고/갖거나 2 내지 50 nm의 크기(예를 들면 가장 긴 치수) 갖고 상기 조성물은 어떠한 입자-크기 식별하는(입자 크기 선별/제거) 공정(예를 들면 여과, 투석, 또는 원심분리)을 거치지 않은 것인, 조성물.
14. 언급 13의 조성물에 있어서, 상기 코어는 실리카 코어이거나 상기 코어-쉘 나노입자의 코어 및 쉘은 실리카 쉘인, 조성물.
15. 언급 13의 조성물에 있어서, 상기 코어는 알루미노실리케이트 코어이거나 코어-쉘 나노입자의 코어는 알루미노실리케이트 코어이고 코어-쉘 나노입자의 쉘은 실리카 쉘인 것인, 조성물.
16. 언급 13 내지 15의 어느 하나의 조성물에 있어서, 폴리에틸렌 기의 적어도 일부 또는 전부는 하나 이상의 리간드를 포함하는 것인, 조성물.
17. 언급 13 내지 17의 어느 하나의 조성물에 있어서, PEG 기로 작용화된 코어 나노입자 표면, 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 그 안에 캡슐화된 하나 이상의 염료 분자(예를 들면 NIR 염료 분자)를 갖는 것인, 조성물.
18. 언급 18의 조성물에 있어서, 상기 코어는 알루미노실리케이트 코어인, 조성물.
19. 언급 18 또는 19의 어느 하나의 조성물에 있어서, 코어당 염료 분자의 숫자는 1 내지 7인, 조성물.
20. 언급 12의 조성물에 있어서, 리간드-PEG-실란의 PEG 체인 길이는 PEG-실란의 PEG 체인 길이보다 더 길어서 작용성 리간드(예를 들면 6-9개의 EO 단량체의 PEG-실란이 사용된다면 리간드-PEG-실란의 PEG 체인이 적어도 12개의 EO 단량체를 갖거나 20개의 EO 단량체의 PEG-실란이 사용된다면 리간드-PEG-실란의 PEG 체인이 적어도 16개의 EO 단량체를 가짐)를 접근가능하게 하는 것인, 조성물.
21. 언급 12의 조성물에 있어서, 광유도된 전자 수송 이미지화(photoinduced electron transfer imaging)를 위한, 리간드 기(예를 들면 리간드-작용화된 입자의 티로신 잔기 또는 킬레이터 또는 특정 리간드 작용화 없는 페길화된 입자의 실리카 매트릭스에)에 접합된 방사성동위원소를 추가로 포함하는, 조성물.
22. 언급 21의 조성물에 있어서, 상기 방사성동위원소는 치료(예를 들면 225Ac 또는 177Lu)를 위해 선택됨으로써, 방사선치료적(radiotherapeutic) 특성을 갖는 나노입자를 형성하는 것인, 조성물.
23. 언급 12의 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약물 전달을 위한 나노입자 상의 작용성 리간드에 공유결합적으로 접합된 약물-연결기 컨쥬게이트를 포함하고, 상기 연결기 기는 약물 방출을 위해 종양 내 효소 또는 산 조건에 의해 쪼개지도록 구성되는 것인, 조성물.
24. 다음 단계를 포함하는, 개체 내의 영역을 이미지화하는 방법: (a) 개체에게 본 개시의 언급 13-23 중 하나의 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 나노입자는 하나 이상의 염료 분자를 포함하는 것인, 단계; (b) 여기 전자기방사선(electromagnetic radiation(예를 들면 빛))를 개체에 조사하여 적어도 하나 이상의 염료 분자를 여기시키는 단계; (c) 여기된 전자기방사선(예를 들면 빛)을 감지하는 단계로서, 상기 감지된 전자기방사선은 여기 전자기방사선에 의한 여기의 결과로서 개체 내의 상기 염료 분자에 의해 방출된 것인, 단계; 및 (d) 감지된 전자기방사선에 대응하는 신호를 처리하여 개체(subject) 내의 영역에 대한 하나 이상의 이미지(예를 들면 실시간 비디오 스트림)를 제공하는 단계.
다음의 실시예는 본 개시를 설명하기 위해 나타난다. 이들은 어떤 주제를 제한하기 위한 목적이 아니다.
실시예 1
본 개시의 나노입자의 합성 및 특성화의 다음의 일 실시예.
폴리에틸렌 글리콜(PEG)로 작용화된 초미세 형광 실리카 나노입자(SNP) 및 코어-쉘 SNP 표면, 특정 표면 리간드, 및 10 nm 미만의 체제(regime) 내의 전반적인 SNP 크기는 이들의 유리한 생물학적 분배 및 안전성 프로파일로 인해 임상적 적용에 관심이 빠르게 증가된다. 여기, 1 nm 미만(예를 들면 단일 원자 층 수준에서)의 크기 조절을 갖는 좁게 크기-분포된 SNP 또는 코어-쉘 SNP의 제조를 위한 수용성 합성 방법론이 제시된다. 근 적외선(NIR) 에미터(emitter)를 포함하는 형관단의 다른 종류가 공유결합적으로 캡슐화될 수 있다. 밝기는 추가의 실리카 쉘의 첨가를 통해 강화될 수 있다. 이 방법론은 추가로 이전에 알려지지 않은 조성물의 <10 nm 크기의 형광 코어 및 코어-쉘 SNP의 합성을 가능하게 한다. 특히 알루미늄 졸-겔 전구체의 첨가는 형광 알루미노실리케이트 나노입자(ASNP) 및 코어-쉘 ASNP로 이어진다. 크게 음으로 하전된 NIR 형광단의 캡슐화 효율 및 밝기는 알루미늄 없는 대응되는 SNP에 비해 강화된다. 생성된 입자는 ~0.8의 양자 수율을 나타낸다 (예를 들면 이론적인 밝기에 접근하기 시작함). 모든 입자가 페길화되어 입체적 안정성을 제공할 수 있다. 마지막으로, 형광 SNP, 코어-쉘 SNP, 및 이들의 알루미늄 함유 유사체의 페길화된 입자 표면에 리간드를 도입하여, 리간드 작용화된 <10 nm 형광 나노프로브를 생성하기 위해 실시될 수 있다. 코넬 닷 또는 C 닷으로 인용되는 초기 알코올-기반의 변형된 스토버 공정으로부터 유도된 형광 코어-쉘 SNP로부터의 유도된 물질로부터 이러한 물 기반의 합성 유도된 물질을 구별하기 위해, 본 명세서에서 설명되고 물 중의 합성되는 SNP 및 ASNP는 코넬 프라임 닷 또는 C' 닷 및 AlC' 닷으로 인용될 것이다. 이러한 유-무기 하이브리드 나노물질은 암 진단 및 치료(테라노스틱스)를 포함하는, 나노의학 내 적용을 찾을 수 있다.
반응 매질로서 물을 이용하여 초미세 SNP의 합성 연구의 결과가 제시된다. 초미세의 정확한 크기 조절, <10nm 직경, 1 nm 미만의 단계 별 SNP, 좁은 입자 크기 분포를 갖는 입자 성장의 빠른 가수분해, 느린 축합 및 효율적인 PEG-실란 유도된 종결을 결합하는 것이 증명된다. 실리카 매트릭스 내로 상이한 실리카-컨쥬게이트된 형광단을 공-축합함에 의해서 이 합성 공정은 광학 스펙트럼의 가시광선부터 NIR 영역 내로 조절된 광학적 특성을 갖는 <10 nm 직경 형광 SNP를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 10 nm 미만의 전반적인 입자를 유지시키는 동안 추가적인 실리카 쉘은 합성 프로토콜에 첨가될 수 있다. 이러한 코어-쉘 건축은 모 코어(parent core)에 비해 개선된 형광 밝기로 이어진다. 물 기반의 합성 접근은 꽤 다재다능하고(versatile) 입자 크기 조절의 손실 없이, 입자의 이전의 알려지지 않은 무기 조성물을 가능하게 한다. 실시예로서 목적을 달성하기 위해 졸-겔 전구체로서 알루미늄 알콕사이드의 첨가로부터 유도된 실리카 및 혼합된 조성물이 조사된다. 이러한 혼합된 무기 NP의 얻어진 성장 조건이 평면의 실리카 기반의 입자에 비해 크게 음으로 하전된 NIR을 방출하는 형광단을 더 효율적으로 포함되게 한다. 동시에 생성된 NP는 알루미늄 알콕사이드 첨가 없이 합성된 입자에 비해 캡슐화된 염료의 강화된 양자 효율 나타난다. 이러한 알루미늄 함유 형광 SNP는 AlC'닷으로 인용될 것이다. 형광 SNP, 코어-쉘 SNP, 및 이들의 알루미늄 함유 유사체는 페길화되어 입체적 안정성을 제공한다. 마지막으로, 이종이작용성 PEG는 형광 SNP 및 코어-쉘 SNP뿐 아니라 이들의 알루미늄 함유 유사체의 페길화된 입자 표면에 리간드를 도입하여 진단적 및 치료적 적용 내 전임상적 및 임상적 용도를 위한 리간드 작용화된 <10 nm NIR 형광 나노프로브를 생산하기 위해 실시된다. 이는 동물 모델 및 제1 인간 임상 시험 내 흑색종 종양을 표적화하기 위해 초기의 연구에서 사용된 αvβ3 인테그린-표적화 사이클로(아르기닌-글라이신-아스파트산-D-티로신-시스테인), c(RGDyC) 펩타이드를 이용하여, 증명되었다. 생명공학적 및 임상적 적용을 위한 크기 조절되고 큰 형광 실리카-기반의 나노프로브을 합성하기 위한 능력에 더하여, 종래의 스토버 공정의 것과 물-기반의 입자 성장 경로의 비교는, SNP 및 다른 실리카-기반 나노물질의 정확한 형성 메커니즘의 더 좋은 기초적인 이해를 기여할 수 있다.
실험적 부분
2.1. 물질. 모든 화학물질은 수취된 대로 사용된다. 디메틸 설폭사이드 (DMSO), 이소프로판올, (3-머캅토프로필) 트리메톡시실란 (MPTMS), (3-아미노프로필)트리에톡시실란 (APTES), 테트라메틸 오르쏘실리케이트 (TMOS), 테트라에틸 오르쏘실리케이트 (TEOS), 폴리에틸렌 글리콜 체인 (PEG, 몰 질량 약 400), 알루미늄-트리-세크-부톡사이드, 에탄올 중 2.0 M 암모니아 및 27wt% 암모늄 하이드록사이드가 Sigma Aldrich로부터 구매된다. 메톡시-종결된 폴리(에틸렌 글리콜) 체인(PEG-실란, 몰 질량 근처 500)이 Gelest로부터 구매된다. 말레이미도 및 NHS 에스터 기를 갖는 이종이작용성 PEG (mal-PEG-NHS, 몰 질량 근처 800)기가 Quanta BioDesign로부터 구매된다. 아세트산은 Mallinckrodt로부터 구매된다. Cy5 및 Cy5.5 형광 염료는 GE로부터 구매된다. 로다민 그린 (RhG) 및 테트라메틸로다민 (TMR) 형광 염료는 Life Technologies로부터 구매된다. DY782 형광 염료는 Dyomics로부터 구매되고 CW800 형광 염료는 Li-cor로부터 구매된다. 완전 무수 99.5% 에탄올은 Pharmco-Aaper로부터 구매된다. 사이클로 (Arg-Gly-Asp-D-Tyr-Cys) 펩타이드, c(RGDyC)는 Peptide International로부터 구매된다. 탈이온수 (DI 수)는 Millipore Milli-Q 시스템을 이용하여 생성된다.
반응 조건이 하룻밤 동안 발생하는 것으로 나열될 때, 반응이 일어날 수 있는 시간은 약 8 시간 내지 약 24 시간 또는 훨씬 더 큰 범위일 수 있다.
2.2. 10nm 이하(sub-10nm) 페길화된 실리카 나노입자의 합성. 4.2nm 페길화된 실리카 나노입자(SNP)의 합성을 위해, 100 μl의 에탄올 중 2.0M 암모니아 및 10ml 탈이온수를 혼합함에 의해 제조된 1ml의 0.02M 암모니아 수용성 용액을, 9ml의 DI 수에 첨가한다(암모니아 하이드록사이드의 생성된 농도 0.002M, 표 1 참조). 용액을 실온에서 10분 동안 교반하고 이어서 0.43mmol의 TMOS을 격렬한 교반 하에서 첨가하고(TMOS의 생성된 농도 0.043M, 표 1 참조) 용액을 실온에서 밤새도록(12-24시간) 교반한다. 이어서 0.21mmol의 PEG-실란을 첨가하고 용액을 실온에서 밤새도록(12-24 시간) 교반한다. 다음 단계에서, 온도를 800℃로 증가하고 교반을 중단한다. 이어서 용액을 800℃에서 밤새도록 정적으로 둔다. 그 뒤에, 용액을 실온으로 냉각하고 이어서 투석 멤브레인 튜브로 이송한다(Pierce, 분획 분자량 10.000). 투석 튜브 내 용액을 2000ml DI-수 중에 투석하고 물을 6일 동안 매일 교체하여 임의의 잔여 시약을 씻어낸다. 이어서 입자를 200nm 실린지 필터(피셔 브랜드)를 통해 여과하여 입자 용액 내 존재하는 어떠한 응집 또는 먼지를 제거한다. 생성된 입자 용액을 실온에서 장 기간 저장 및 TEM, DLS, TGA 및 NMR를 포함하는 특성화를 거친다. 반응의 몰 비율은 1 TMOS : 0.093 암모니아 : 0.49 PEG-실란 : 1292 H2O이다. 입자 크기를 합성 조건을 변화시킴에 의해 변화시켰다. 자세한 사항은 표 1 내에 요약된다.
표 1. 상이한 크기의 입자의 합성 조건
DLS 직경 온도 TMOS의 농도 암모니아 하이드록사이드의 농도 입자 성장 기간
2.4nm 실온(RT) 0.011M 0.002M 20 시간
3.1nm 실온 0. 022M 0.002M 20 시간
3.7nm 실온 0. 043M 0.002M 10 분
4.2nm 실온 0. 043M 0.002M 20 시간
4.5nm 실온 0.043M 0.02M 20 시간
5.2nm 실온 0. 043M 0.06M 20 시간
5.9nm 50 0. 043M 0.002M 20 시간
6.5nm 65 0. 043M 0.002M 20 시간
7.3nm 80 0. 043M 0.002M 20 시간
동일한 크기 분산 및 구조 조절을 갖는 동일한 입자는 또한 pH를 9 근처로 조절할 수 있는 동안 암모늄 하이드록사이드 원천으로서 2.0M 암모니아 대신에 에탄올 중 27wt% 암모늄 하이드록사이드 용액을 이용하여 합성될 수 있음을 유의해야 한다. 이건은 이 C' 닷 입자 합성의 중요한 점이 최적화된 실리카 반응 속도론을 위한 정확한 pH 플러스 물 환경이라는 것을 가리킨다. 에탄올(10ml 반응 중 약 10 ul 에탄올)의 작은 용기는 반응 속도론을 크게 분포하지 않기 때문에 입자 합성에서 어떠한 감지될 수 있는 효과를 갖지 않는다.
2.3. 10nm 이하 페길화된 형광 실리카 나노입자의 합성. 말레이미도 작용화를 갖는 Cy5, Cy5.5, RhG, TMR, DY782 및 CW800 염료는 몰 비율 형광단: MPTMS = 1 : 25로, DMSO 중의 MPTMS에 먼저 컨쥬게이트된다. 이어서 실란-컨쥬게이트된 형광단을 TMOS와 함께, 입자 내로 공-농축하기 위해 합성 용액 내로 첨가한다. TMOS에 대한 실란-컨쥬게이트된 형광단의 몰 비율은 1: 1000 근처이다. 합성 프로토콜의 나머지는 2.2 부분 하에서 4.2nm 입자의 합성을 위해 설명된 것과 같다.
형광 입자의 가장 정확한 형광 특성을 얻기 위해, 본 연구 내 제조된 어떠한 형광단-표지된 입자는, FCS 및 방출 분광 측정을 방해할 수 있는 어떠한 잔여 유리 염료 분자를 추가로 제거하기 위해, 및 형광 입자 생성물 순도를 최대화하기 위해, 여과 단계 후, GPC에 의해 추가로 정제된다. 자세히 보면, 청소된 입자 용액은 스핀-필터(MWCF 30k의 GE 헬스케어 Vivaspin)를 이용하여 약 30배로 농축되고 이어서 GPC 칼럼(자세한 사항은 2.8 부분 참조)으로 정제된다. GPC 장치 내에서 사용된 용매가 0.9wt% NaCl 용액이기 때문에, 정제된 입자는 추가 특성화 및 장기간 저장을 위한 스핀-필터를 이용하여 최종적으로 다시 DI 수로 이동된다. 입자를 DI 수로 다시 이동하기 위해, 정제된 입자는 스핀-여과기(MWCF 30k의 GE 헬스케어 Vivaspin)를 이용하여 먼저 약 30 배로 농축된다. DI 수는 이어서 정상 부피로 다시 희석하기 위해 농축된 입자 용액 내로 첨가된다. 이 공정은 NaCl의 농도를 0에 가깝게 감소시키기 위해 최소 8번 동안 반복된다. 이어서 정제된 입자 샘플은 추가 특성화를 위해 40℃에서 장기간 저장을 거친다.
2.4. 10nm 이하 페길화된 코어-쉘 실리카 나노입자 및 서브-10nm 페길화된 형광 코어-쉘 실리카 나노입자의 합성. 페길화된 코어-쉘 SNP의 합성 프로토콜이, 입자의 형성 후 및 PEG-실란의 첨가(addition) 전에 쉘 첨가 단계가 추가되는 것을 제외하고는, 4.2nm 입자의 합성과 같다. TMOS (및 페길화된 형광 코어-쉘 SNP의 합성을 위한 실란-컨쥬게이트된 형광단)의 첨가 후 1 일에 반응은, 실온 초과의 온도가 코어 입자 형성에서 적용되었다면(표 1 참조), 실온으로 냉각된다.
상기 용액은 이어서 DI 수로 5 배 희석된다. 그 후, TEOS 및 DMSO의 혼합물(부피비 1:4)이 실온에서 격렬한 교반 하에 용액 내로 투여된다(dosed). 각 투여(dose)의 부피는 10ul이고 투여들 간의 시간 간격은 30분이다. 50번의 투여들이 0.5nm에 가까운 쉘 두께(입자 크기가 1nm 근처로 증가됨)로 생성되는 실리카 쉘 한 층의 첨가를 위해 첨가된다. 이 공정은 쉘의 바람직한 층(예를 들면 1-4개)이 첨가될 때까지 반복된다. 쉘 첨가 동안, 용액 pH는 추가 TEOS의 첨가 및 규산의 형성의 결과로 감소된다. 최적화된 반응 속도론을 위한 중성에서 pH를 유지하기 위해, 2ml 근처의 0.02M 암모늄 하이드록사이드 용액이 실리카 쉘의 모든 2 층의 침적 후 반응 용액 내로 추가로 첨가된다. 그 후에, 1.05mmol의 PEG-실란(코어 입자의 페길화와 동일한 PEG-실란 농도)이 첨가되고 800℃ 열 처리는 4.2 nm 입자 합성을 위해 설명된 것과 동일한 절차를 따라 적용된다. 정제 단계는 2.3 부분 내 상기에서 설명된 것이 적용된다.
2.5. 10nm 이하 페길화된 알루미노실리케이트 나노입자 및 페길화된 알루미노실리케이트 코어-실리카 쉘 알루미노실리케이트 나노입자의 합성. 10nm 이하 페길화된 알루미노실리케이트 나노입자(ASNP)의 합성을 위해, 1ml의 0.5N HCl 용액이 9ml의 DI 수 내로 첨가되고 용액이 10분 동안 교반된다. 이어서, 0.43 mmol의 TMOS 및 0.043 mmol의 알루미늄-트라이-세크-부톡사이드(부피비 1:9를 갖는 이소프로판올 중에 용해됨)가 실온에서 격렬한 교반 하에 첨가된다. 10-15 분 후, 0.21 mmol PEG-실란이 첨가되고 이어서 약 140 μl의 27 wt% 암모늄 하이드록사이드이 첨가를 통해 중성으로 용액 pH가 다시 변경된다. 최종 pH는 pH 페이퍼로 이중 체크된다. 그 이후에, 용액이 교반없이 800℃에서 밤새도록 유지된다. 합성 프로토콜의 나머지는 2.2 부분 내에 4.2 nm 입자의 합성을 위해 설명된 것과 동일한 절차를 따른다.
코어-쉘 ASNP의 합성을 위해, 0.21 mmol PEG (몰 질량 400 근처)가 반응 pH가 중성으로 다시 변경되기 전에 PEG-실란 대신에 첨가된다. 반응 pH는 중성으로 다시 변경된 후, TEOS 및 DMSO의 혼합물(부피비 1:8)이 실온에서 격렬한 교반 하에 용액 내로 투여된다. 각 투여의 부피는 10 ul이고 투여들 간의 시간 간격은 30 분이다. 50 투여들이 0.5nm에 가까운 쉘 두께(입자 크기가 1nm로 증가됨)를 생성하는 실리카 쉘의 한 층의 첨가를 위해 첨가된다. 이 공정은 쉘의 바람직한 층(예를 들면 2층)이 첨가될 때까지 반복된다. 그 이후에, 0.21 mmol PEG-실란이 첨가되고 800℃ 열 처리가 교반 없이 적용된다. 합성 프로토콜의 나머지는 2.2 부분 내 4.2 nm 입자의 합성을 위해 설명된 것과 같은 동일한 절차를 따른다. 용액 pH를 중성으로 다시 변경하기 전 PEG-실란의 첨가는 필수가 아니지만, 이는 합성된 ASNP의 단분산성으르 향상시키고 pH를 변경하는 공정 동안 이 응집을 예방할 수 있다.
2.6. Cy5 또는 Cy5.5 형광단과 공유결합적으로 캡슐화하는 10nm 이하 페길화된 형광 알루미노실리케이트 나노입자 및 10nm 이하 페길화된 형광 알루미노실리케이트 코어-실리카 쉘 알루미노실리케이트 나노입자의 합성. ASNP 내로 형광단을 공유결합적으로 캡슐화하기 위해, 실란-컨쥬게이트된 Cy5 또는 Cy5.5 형광단이, 2.3 부분 내 설명된 것과 같은 동일한 컨쥬게이션 조건 및 염료 농도를 이용하여 TMOS 및 알루미늄-트리-세크-부톡사이드의 첨가 직후, 첨가된다. 합성 프로토콜의 나머지는 2.5 부분 내 빈 ASNP의 합성을 위해 설명된 것과 같고 정제 단계는 2.3 부분 내 상기에서 설명된 것과 같이 적용된다.
2.7. 용이하게 접근가능한 리간드를 갖는 페길화된 입자 표면 변경. 예를 들면 c(RGDyC) 펩타이드 리간드로, 본 연구 내에서 어떠한 페길화된 입자의 표면을 작용화하기 위해, 이종이작용성 NHS-PEG-mal은 먼저 DMSO 중 APTES로 컨쥬게이트되어 mal-PEG-실란을 생산한다. DMSO 중 NHS-PEG-mal의 농도는 0.22M 근처이다. 반응 혼합물을 실온에서 질소 하에 밤새도록 둔다. 다음 단계로서 c(RGDyC)는 이어서 DMSO 용액 내로 첨가되고 용액이 실온에서 질소 하에서 밤새도록 둔다. c(RGDyC) 접합된 입자 표면 상에 농축된 모든 이종이작용성 PEG를 보장하기 위해, c(RGDyC) : NHS-PEG-mal : APTES의 몰 비율이 1.1: 1.0 : 0.9이다. 그 이후에, 생성된 c(RGDyC) -PEG-실란이 첨가되고 나노입자 합성 동안 페길화 단계 내 PEG-실란의 첨가가 이어진다. c(RGDyC)-PEG-실란 : PEG-실란의 상이한 몰 비율은 입자 표면 상의 리간드의 양을 다양화하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, 약 1 : 40의 c(RGDyC)-PEG-실란 : PEG-실란의 몰 비율이 7nm 직경 입자 당 22개 근처의 c(RGDyC) 리간드를 주는 반면, 1:400로의 비율의 감소는 7nm 입자 당 5개 근처의 c(RGDyC) 리간드를 초래할 것이다. 합성의 나머지는 2 부분 내 종래의 페길화를 위해 설명된 것과 같다. 동일한 방법론은, 빈(blank) 및 형광 SNP, 코어-쉘 SNP 및 공유결합적으로 캡슐화된 형광단의 상이한 종류의 모든, 이들의 알루미늄을 함유하는 유사체를 포함하는, 표면 작용화된 프로브를 생산을 위한 본 연구 내에서 설명된 모든 입자에 적용될 수 있다. 본 방법에서 사용될 수 있는 다른 리간드는 다른 직선 및 고리형 펩타이드, 항체 조각, 다양한 DNA 및 RNA 부분(예를 들면 siRNA), 약물 및 방사성 동위원소를 포함하는 치료적 분자 및 이들의 각각의 킬레이팅 모이어티뿐만 아니라 이들의 조합을 포함하나 이에 제한되지 않는다.
2.8. 겔 투과 크로마토그래피 특성화 (GPC). GPC 특성화는 275nm UV 감지기 및 수지 Superdex 200 (GE 헬스케어)를 갖춘 BioLogic LP 시스템을 이용하여 수행된다. 빈 SNP가 실리카의 낮은 흡광도로 인해 275nm UV 감지기에 의해 어렵게 감지될 수 있는 반면, 형광 SNP는, 캡슐화된 형광단이 275nm 감지하는 채널과 중첩하는 흡광도를 갖기 때문에, 장치 내 강한 시그널을 나타낸다. 결론적으로, GPC는 특성화 및 추가적인 임상적 적용을 위한 다수의 청소된 C' 닷 생성물을 추가로 증가시키기 위해 사용될 수 있다. 사용 전에, GPC 시스템은 알려진 몰 질량의, 티로글로불린, 소의(bovine) γ-글로불린, 닭의(chicken) 오브알부민, 말의(equine) 미오글로빈, 및 비타민 B12의 혼합물인 Bio-Rad로부터의 단백질 스탠다드에 의해 보정된다. 그 이후에, 400 μl 근처의 입자 용액이 GPC 장치 내로 주입되고 분획(fraction)이 BioFrac 분획 수집기에 의해 수집된다. 상이한 GPC 분획의 자세한 분석은 도 15 내에 보여진다. 입자 분획을 수집함에 의해, 입자 생성물의 순도는 추가적으로 최대화될 수 있다.
2.9. 입자 방법론의 특성화. 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지는 120kV의 가속 전압에서 작동된 FEI Tecnai T12 Spirit 현미경을 이용하여 취해진다. 수력학(Hydrodynamic) 입자 크기 및 크기 분포는 200℃에서 작동된 Malvern Zetasizer Nano-SZ를 이용하여 동적 광 산란(DLS)에 의해 측정된다. 각 DLS 샘플은 3번 측정되고 결과는 이 페이지 내 각 도면 내에 겹쳐 놓여진다(superimposed). 숫자 퍼센트 곡선은 측정 결과를 나타내기 위해 사용된다. 각 샘플의 평균 직경은 3번 측정의 숫자 퍼센트 곡선의 평균 직경을 평균화함으로써 계산된다.
2.10. 형광단을 캡슐화하는 입자의 특성화. 샘플의 흡광 분광이 Varian Cary 5000 분광계에 의해 측정된다. 샘플 농도를 변화시킴으로써, 상이한 샘플의 흡광 분광이 일치되고 따라서 상이한 샘플의 광학 밀도가 동일하게 되도록 조절된다. 그 이후에, 흡광도-일치 샘플은 Photon Technologies International Quantamaster 분광형광계를 이용하여 방출 스캔에 주입된다. 입자의 방출 분광의 피크 강도는 양자 수율 강화 계산을 위한 해리 염료의 흡광-일치 용액의 피크 강도로 나눠진다.
형광 자동-상관 분광기 (FCS) 측정은 FCS 장치를 이용하여 수행된다. 488nm 고체-상 레이저는 RhG 형광단을 위한 레이저 공급원으로 사용된다. 543nm HeNe 레이저는 TMR 형광단을 위한 레이저 공급원으로 사용된다. 633nm 고체-상 레이저는 Cy5 및 Cy5.5 형광단을 위한 레이저 공급원으로 사용된다. 785nm 고체-상 레이저는 DY782 및 CW800 형광단을 위한 레이저 공급원으로 사용된다. 수력학 크기, 입자 당 밝기 및 입자 농도는 FCS 자가-상관 곡선의 맞춤(fit)로부터 얻어진다. FCS로부터 수득된 입자 농도를 흡광 측정으로부터 수득된 형광단 농도로 나눔으로써, 입자 당 형광단의 숫자가 설명된 것과 같이 계산된다.
2.11. 29Si 및 27Al 고체 상 NMR 특성화. 29Si 교차-편파 (CP)/ 매직 앵글 스피닝(magic angle spinning; MAS) NMR 실험이, 4 mm 직경의 로터의 프로브 헤드를 이용하여 9.4T 마그넷의 Bruker Advance NMR 분광기로 수행된다. 29Si CP/MAS NMR 실험 동안 샘플은 매직 앵글에서 7.00 kHz 회전 주파수에서 회전된다. 최종적인 분광을 위해, 3200 이하의 스캔은 5 ms CP 접촉 시간 및 TPPM 양성자 디커플링의 감지 동안 증가된 양성자 파워의 CP를 이용하여 축적된다. 29Si CP/MAS NMR 스캔은 프로브 듀티 사이크로 인해 3 s의 반복시간에 축적된다.
27Al NMR 실험은, 2.5 mm 직경의 로터의 프로브 헤드를 이용하여 16.45T 마그넷((182.47 MHz 27Al Larmor 주파수))의 Bruker Advance NMR 분광기로 수행된다. 포타슘 알룸은 외부의 27Al NMR 화학적 이동 이차 기준(-0.033 ppm에서)로 및 90 도(degree) 펄스 길이 및 rf 파워의 교정을 위해 역할한다. 최종적인 27Al NMR MAS 분광이, 매직 앵글에서 15.00 kHz에서 샘플을 회전시키는 동안, 100 ms 반복 시간의 6144 이하의 스캔을 더하여, 95 kHz rf 전계 강도에서 명목적으로 10 도 직접 여기 펄스로 얻어진다. 프로브 헤드 및 로터의 27Al 배경은 동일한 조건 하의 빈 로터의 분광을 얻고 이를 샘플 분광으로부터 뺌으로써 특성화된다.
2.12. 열무게 분석 (TGA). 입자 용액은 먼저 액체 질소 내에 동결되고 이어서 건조되도록 3일 밤동안 -200℃ 진공 하에서 유지된다. 동결-건조 후 분말은 추가로 600℃ 진공 하에서 밤새도록 유지된다. 건조된 입자 샘플은 이어서 TGA를 거치게 된다. TGA는 TA Instruments Q500 열무게 분석기를 이용하여 수행된다. 측정 동안, 온도가 100℃/분의 경사로 실온에서 1000℃로 증가되고 이어서 어떠한 나머지 물을 완전히 배제하기 위해 1000℃에서 2시간 동안 유지된다. 그 이후로, 온도가 추가로 100℃/분의 경사로 6000℃로 증가되어 어떠한 유기 모이어티를 제거하고 순수한 무기 실리카 또는 알루미노실리케이트를 뒤에 남긴다. 입자 상의 PEG 체인의 평균 양은 이어서 이러한 TGA 결과에 따라 추정된다.
2.13. c(RGDyC) 작용화된 C' 닷의 분자 모델. C' 닷 구조의 완전한 분석, 예를 들면 코어 크기, 쉘 두께, PEG 표면 밀도, 표면 리간드의 숫자, 및 캡슐화된 형광단의 숫자에 기초하여, 도식적인 분자 모델은 생성되어 현실적인 규모의 원자 수준에서 C' 닷의 구조를 나타냈다. 이를 하기 위해서, 우리는 먼저 Si 및 O 원자의 연속적이고 무작위적 네트워크인 4nm SiO2 구를 건설했다. 네트워크 내부의 각 Si 및 O 원자의 배위는 실리카 유리의 역 Monte Carlo 시뮬레이션에 의해 생성된다. 코어 입자 내부의 총 약 800개의 SiO2 단위는, 비정질 실리카의 밀도를 이용한 계산에 잘 일치하는 것에, 사용된다. 이 다음에, 이러한 코어 입자 내부의 부피는 하나의 캡슐화된 Cy5 형광단이 끌어당겨지는 곳에서 수공으로 생성된다. 그 이후에, 실리카 입자 표면에 공유결합적으로 결합된 100개 근처의 PEG 체인 및 16개의 c(RGDyC)-작용화된 PEG 체인이 수공으로 첨가된다. 최종적인 도면은 ~3 nm 코어, ~0.5 nm 쉘, 하나의 캡슐화된 Cy5 형광단, 100개 근처의 PEG 체인, 및 표면 상의 16개의 c(RGDyC) 리간드를 갖는 하나의 C' 닷 입자를 나타낸다. 모델이 실제 시뮬레이션의 결과가 아니지만, 하나의 C' 닷 입자의 상이한 빌딩 블록의 상대적인 크기 치수의 현실적인 시각화를 제공하는 상당히 확대된(scaled) 도식적인 도면이라는 점을 주목해야 함이 중요하다.
결론 및 고찰
3.1. 제어된 빈 실리카 나노입자 성장. 도 1은 생성물의 화학적 및 물리적 구조와 함께 본 연구 내에서 추구되는 수용성 입자 합성 경로를 나타낸다. 본 명세서에서 자세히 설명된 것과 같이, <10 nm 직경 SNP는 순수한 물 중에서, 주로 실온에서, 실리카 공급원으로서 테트라메틸 오르쏘실리케이트(TMOS) 및 염기 촉매로서 암모늄 하이드록사이드와 함께 합성된다. 입자가 형성되자, 500 g/몰 근처의 몰 질량의 PEG-실란이 입자 성장을 종결시키기 위해 반응 용기 내에 첨가된다. 그 다음의 증가된 온도에서 열 처리(80℃)는 이어서 입자 표면 상의 PEG-실란의 농축 정도를 강화하기 위해 적용된다. 합성된 입자는 반응 시약을 제거하기 위해 투석을 통해 청소되고 이어서 추가적인 특성화 전에 어떠한 응집 또는 먼지를 제거하기 위해 200 nm 실린지 필터에 의해 여과된다. 입자 성장 기간은 TMOS의 첨가 및 PEG-실란의 첨가 사이의 시간 윈도우(time window)에 의해 정의된다. 입자 페길화가 합성의 부분이기 때문에, 입자는 이미 합성되자마자 PEG 체인으로 변형된 표면이고 안정하다(예를 들면 고염 함유 완충 용액 중에서). 입자 크기는 TMOS의 농도, 암모늄 하이드록사이드의 농도, 입자 성장 기간의 길이 및 반응 온도를 포함하여 반응 파라미터를 변화시킴으로써 조절된다.
도 2a-i는 크기 및 크기 분포 조절을 드러내는, 상이한 조건 하에서 성장된 입자의 2가지 상이한 배율에서 투과 전자 현미경 (TEM) 이미지는 나타낸다. 예를 들면, 도 2d는 다음의 변수들을 이용하여 합성된 4.2 nm 직경 SNP를 나타낸다: 실온, 0.043M TMOS, 0.002M 암모늄 하이드록사이드, 및 12-24 시간 성장 기간. 4.2 nm의 직경은 동적 광 산란(DLS)에 의해 결정되는 반면, TEM 이미지 분석으로부터 얻어진 것과 같은 입자 직경은 오직 2-3 nm 근처이다. DLS에 의해 측정된 입자 크기는, DLS는 PEG 체인 및 수화 층을 포함하는 수력학 크기를 측정하기 때문에, TEM에 의한 것보다 살짝 더 큰 반면, TEM은 단지 투영된 실리카 코어의 직경 근처의 정보를 제공한다. 입자 성장 기간이 24 시간에서 10분으로 짧아짐에 따라 합성된 입자 직경은 4.2 nm에서 3.7 nm으로 감소된다(도 2c). 또한 성장 기간의 감소는 입자 크기의 감소를 초래하지 않지만, 초과 크기 분포의 제어의 손실을 초래한다. 이는 높은 전구체 농도로 인해 먼저 10분 동안 입자가 빠른 성장 기간을 거치고 이어서 존재하는 실리카 클러스터의 제어된 응집(도 8 및 9 참조)으로 인해 느린 성장 모드를 거친다는 것을 제시한다. 추가로 입자 크기를 감소시키기 위해, 입자의 성장 기간은 20 시간에서 유지되고, 실리카 공급원, TMOS의 농도가 0.043M에서 0.011M로 감소된다. 결론적으로, 합성된 입자 직경이 4.2 nm에서 2.4 nm로 감소된다(도 2a 및 2b). 이는 TMOS 농도의 감소가 낮은 가수분해된 실리카 전구체 농도로 이어지고, 이는 결국 느린 입자 성장으로 이어지기 때문이다. 암모늄 하이드록사이드의 농도가 0.002M로부터 0.06M로 증가하는 것(이에 의해 ~8 내지 약~10로 pH를 변경함)을 제외하고, 4.2 nm 입자 합성 변수를 적용함에 따라, 평균 입자 직경이 4.2 nm로부터 5.2 nm로 증가된다(도 2e 및 2f). 일반적으로 pH 증가는 가수분해율의 증가 및 농축률의 감소를 유발한다. 물 중 TMOS의 가수분해가 항상 빠르기 때문에, 필시 농축률의 감소가 지배적인 효과여서, 낮은 입자 농도 및 큰 입자 크기로 이어진다. 입자 크기를 추가로 증가시키기 위해, 입자 성장 기간의 반응 온도가 변화된다. 4.2 nm 입자 합성 변수를 적용하지만 반응 온도를 실온에서 80℃로 증가시킴에 따라, 평균 입자 지경은 4.2 nm부터 7.3 nm로 추가로 증가된다(도 2g 및 2i). 이는, 다른 메커니즘이 가능할 수 있음에도 불구하고, 2가지 효과의 결론일 수 있다(또한 도 8 참조). 먼저, 작은 입자의 높은 표면 에너지로 인해, 높은 온도에서 규산이 빠르게 전구체로서 규산이 고갈될 때까지 낮은 농도의 큰 실리카 클러스터로 농축된다. 그 이후로, 작은 입자가 높은 온도에서 덜 안정하기 때문에, 입자는 추가로 큰 입자로 느리게 응집되고 입자 크기는 추가로 증가된다.
반응 동안 입자 형성을 모니터하기 위해, 실란-컨쥬게이트된 Cy5 형광단은 실리카 입자 내로 공-농축하기 위해 TMOS와 함께 첨가된다. 결론적으로, FCS를 이용하여 Cy5 형광단으로부터 형광 시크널을 추적함을 통해, 인-시츄 입자 직경 및 입자 농도가 모니터될 수 있다. 도 8a 및 8b 내에 나타난 것과 같이, 실리카 공급원(들)의 첨가 상에, TMOS 및 실란-컨쥬게이트된 Cy5 형광단이 가수분해하고 입자 내로 농축되어 입자 크기 증가 및 형광단 농도 감소를 초래한다. 실온 및 800℃ 합성 모두에서, 입자가 반응 혼합물 내 존재하는 규산의 고농도로 인해 먼저 10분 내 빠른 성장 기간을 거친다. 그 이후로, 규산 농도가 초기 입자 핵형성 및 성장 파열로 인해 고갈되기 때문에, 입자는 추가로 제어된 응집을 통해 느리게 성장한다. 입자 직경 및 농도 결과는 모두 다음의 식에 의해 맞춰진다:
y=y0+Ae^(-t/tR )+Bt
지수 부분은 반응의 시작에서 빠른 성장 형성 속도론을 나타내고 선형 부분은 차후의 제어된 응집 단계의 속도론을 나타낸다. 입자 직경 방정식에서, y는 시간 t에서 평균 입자 직경이고, A는 특유의 시간 tR의 빠른 입자 형성 속도론에 대한 입자 성장의 상대적 진폭이고, B는 최후의 제어된 응집 공정의 입자 성장률이고, y0+A는 실리카 전구체의 초기 크기이다. FCS는 수력학 크기가 약 1.2-1.5nm인 Cy5-실란을 추적하기 때문에, y0+A의 맞춰진 값이 기대와 일치한다. (표 2) 입자 농도 방정식에서, y는 시간 t에서 전구체 농도(Cy5-표지된 실리카 클러스터)이고, A는 특유의 시간 tR의 빠른 입자 형성 속도론에 대한 입자 성장 기여의 상대적 진폭이고, B는 최후의 제어된 응집 공정 내 입자 농도의 감소율이고, y0+A는 Cy5-실란의 초기 농도이다. 맞춰진 변수가 다음의 표 내에 보여진다.
표 2. 상이한 크기의 입자의 합성 조건
y 0 A t R B
직경 실온(RT) 2.74 ± 0.07 nm -1.30 ± 0.11 nm 0.29 ± 0.05 시간 0.03 ± 0.01 nm/hr
80℃ 3.56 ± 0.11 nm -2.39 ± 0.16 nm 0.17 ± 0.03 시간 0.06 ± 0.01 nm/hr
농도 실온 18.36 ± 1.17 μM 18.36 ± 1.70 μM 0.18 ± 0.04 시간 -0.09 ± 0.06 μM/hr
80℃ 15.97 ± 0.64 μM 23.76 ± 2.35 μM 0.06 ±0.01 시간 -0.30 ± 0.05 μM/hr
실온 합성에 비해, 80℃에서 형성하는 입자는 빠른 성장 기간 직후 10분 근처에서 더 큰 크기 및 낮은 농도를 갖는다. 이는 입자 표면 에너지가 더 높은 온도에서 더 높다는 사실로 인한 것일 수 있다. 이는 또한 직경 및 농도 방정식 모두에서 tR의 맞춘 값이 더 큰 속도를 가리키는 더 높은 온도에서 더 작다는 것을 발견한 것과 일치한다. 10분 후, 입자 크기가 연속적으로 증가하고 입자 농도가 80℃에서 살짝 감소하는 반면, 실온에서는 모든 변화가 더 작다. 이는 더 높은 온도에서 입자가 표면 에너지의 증가로 인해 제어된 응집을 통해 더 큰 입자 내로 더 응집하는 경향이 있다는 것을 제시한다. 맞춰진 값 B로부터, 하나는 상이한 온도에서 응집률을 측정할 수 있다; 이는 실온에서 0.03 nm/hr 근처이고 80℃에서 0.06 nm/hr이다.
입자가 고온에서 제어된 응집을 통해 성장한다는 것을 추가로 증명하기 위해, 실온 합성 반응은 코어 입자가 형성된 모멘트에서 TMOS 및 염료-실란의 첨가 후 16시간을 2 부분으로 나뉜다. 2 입자 배치의 하나가 PEG-실란 첨가로 종결되고 이어서 최종적인 생성물의 공동적인 합성 절차 및 TEM 이미지가 도 9a 내로 보여진다. 다른 배치는 또 다른 3일 동안 80℃ 열 처리에 주입되어 PEG-실란의 첨가를 통한 반응 종결이 잇따른다. 도 9b 내에 보여진 것과 같이, 고온 처리 후 입자는 고온 처리 없는 입자보다 큰 크기를 갖는다(도 9a). 실리카 공급원의 대부분이 반응의 1일 동안 이미 입자 상에 농축되는 것을 고려하여, 이러한 추가적인 고온에서 입자 성장은 필시 더 작은 실리카 입자의 응집을 통한 추가적인 성장의 결과일 것이다. 이러한 제어된 응집은, 이들이 더 큰 입자 내로 응집되는 경향이 있어서 전반적인 자유 에너지를 낮출 정도로 고온에서 더 작은 입자의 표면 에너지는 높다는 사실에 의해 유발될 수 있다.
상이한 평균 직경을 갖는 9개의 입자 배치의 DLS에 의해 측정된 크기 및 크기 분포의 비교는 도 2j 내에 보여진다. 데이터는 1 nm 미만의 단차가 있는 정확한 입자 크기 조절을 증명한다. 단일 SiO2 원자 층이 대충 0.4 nm 근처의 두께임을 고려하면, 이는 입자의 단일 원자 층 근처의 침적의 수준에서 입자 성장을 조절하는 것과 동일하다. 이러한 조절은 4개의 반응 변수의 조합을 변화시킴으로써 성취되기 때문에, 합성 시스템은 높은 정도의 화학적 융통성을 부여한다. 이는 좁게 크기-분포된 초미세 SNP는 다른 입자 변형 화학과 친화적인 매우 상이한 조건 하에서 합성될 수 있다는 것을 암시한다.
종래의 스퇴버 방법에 비해, 이 공정의 차이점은 반응 용매가 알코올에서 물로 변경되어 초미세 SNP 성장을 위한 더 잘-정의된 반응 속도론으로 이어진다는 것이다. 물에서 테트라알콕시실란, 및 특히 TMOS의 가수분해율이 알코올에 비해 크게 증가되고, 따라서 심지어 중성에 가까운 pH에서 조차 가수분해가 동종의 규산 전구체 용액을 생성하기에 충분할 정도로 꽤 빠르다.
빠른 가수분해에 따라, 물 및 중성 근처 pH는 추가로 고 농도에서 균일하게 크기된 SNP 씨드를 생성하는 빠른 농축으로 이어진다. 그 밖의 모든 것을 일정하게, 증가하게/감소하게 유지함에 따라, TMOS의 농도는 씨드에 대한 더 많은/더 적은 단량체를 통해 더 큰/더 작은 입자로 이어진다. 씨드 형성 후 추가적인 단량체가 가수분해에 의해 제공되지 않기 때문에, 용액 중에 유지되는 규산의 농도가 낮고 규산 단량체의 현저하지 않은 양이 존재하는 씨드 입자 상에 농축되어, 소 입자의 생성을 초래할 수 있다. 온도가 증가되기 때문에, 소 입자가 더 큰 입자를 위한 감소된 표면 에너지로 인해 더 큰 입자 내로 추가로 응집될 수 있다. 최종적으로, PEG-실란에 의해 입자 성장을 종결하는 것은 입자 크기가 정확하게 제어될 수 있고 최종적인 입자 안정성이 크게 강화되는 추가의 합성 변수를 더한다.
3.2. 제어된 형광 실리카 나노입자 성장. 실험에서 형광 염료는 형광 페길화된 SNP의 생성을 위해 공유결합적으로 캡슐화된다. 마지막까지, 4.2 nm 입자 합성 조건을 적용함에 따라, 추가적인 실란-컨쥬게이트된 Cy5 형광단이 반응 내로 첨가되어 실리카 매트릭스 내로 TMOS와 공 농축된다. Cy5 형광단이 고 염기 농축에서 용액에 의해 퀀칭될 수 있음을 고려하면, Cy5 투여된 입자의 크기 조절이 암모늄 하이드록사이드 농도보다, 간단히 온도를 변화함에 따라 달성된다. 합성된 입자는 최종적으로 입자 순도를 최대화하고, 어떠한 잔여 해리 형광단, 그렇지 않으면 광학적 입자 특성 결과를 변조할 수 있는 잔여 해리 형광단을 완전히 제거하기 위해 규칙적인 청소 단계 후, 겔 투과 크로마토그래피 (GPC)를 통해 정제된다. 반응 온도가 실온에서 90℃로 증가된 8개의 배치로부터의 형광 입자의 크기는, 형광 상관 분광기(FCS)에 의해 특성화된다(도 2k). DLS에 비해, FCS는 신호 강도 변동의 자기상관으로부터의 입자 확산 정보를 추출하는 유사한 측정 메커니즘은 공유한다. 그러나, 산란된 광 대신에 FCS는 형광을 사용하고 따라서 산란이 약한 소 입자 또는 분자에 더 민감하다.
FCS 자기상관 곡선이 다음의 방정식에 일치된다:
G(τ)=1+1/N·1/(1-A)·(1-A+A·e^(-τ/τR ))·1/(1+τ/τD )*1/√(1+S^2·τ/τD ),
상기 식에서, S는 구조 인자(FCS 장치의 타원의 초점의 더 짧은 축 및 더 긴 축 사이의 비율)이고, N는 초점 내 존재하는 입자의 평균 숫자이고, A는 삼중항 상관관계의 진폭이고, τR는 삼중항의 특정한 시간이고 τD는 확산 시간이다. N, A, τR 및 τD의 값이 피트로부터 얻어지는 반면, 구조 인자 S는 장치 보정으로부터 얻어지고 피트 내에 고정된다. 도 10은 이러한 종류의 곡선에 맞는 예시이다. 맞는 변수에 기반하여, 입자의 평균 수력학 직경, 입자 당 형광 밝기 및 형광 입자의 농도가 얻어질 수 있다.
도 2k 내에서 FCS 자기상관 곡선의 오른쪽으로의 이동, 특히 해리 염료로부터 염료-캡슐화하는 SNP로 이동하는, 이동은 더 큰 입자의 느린 확산 시간을 가리킨다. 평균 입자 직경은 곡선 피팅(일 실시예의 도 10 참조)을 통해 얻어지고 1 nm 미만의 단계 내 4.3 nm로부터 7.8 nm로 변화하여 도 2j 내 DLS에 의해 측정된 빈 SNP에 비해 유사한 크기 범위 및 단일 원자 층 크기 조절을 포함한다. TEM에 의해 얻어진 형광 입자의 이미지는 도 11에 보여진다. 해리 염료에 비해 이러한 상이하게 크기된 닷의 물 중의 흡광 및 방출 분광이 도 21 내에 보여진다. 모든 용액에 일치하는 흡광도는 실리카 캡슐화된 Cy5 염료가 해리 염료보다 밝다는 것과, 캡슐화된 Cy5 염료 밝기는 입자 크기가 증가된다는 것을 드러낸다. 이러한 밝기 강화는 물로부터 실리카까지 이동하는 유전 상수의 변화뿐 아니라 실리카 환경 내 염료의 증가된 강직으로 인해 양자 수율의 증가에 연관성이 있다. 전반적인 입자 크기가 증가함에 따라, Cy5 형광단이 실리카 매트릭스에 의해 잘 캡슐화되는 것의 더 큰 확률을 가져서 더 높은 양자 강화의 관측으로 이어진다. 입자 당 형광단의 숫자뿐 아니라 입자 당 밝기는 흡광 데이터와 함께 FCS 유도된 용액 농도로부터 수득될 수 있다. 결론이 도 2m 및 2n 각각에 보여진다. 도 2n에 의해 제시된 것과 같이, 상이한 합성 배치의 각 합성된 입자는 2개의 형광단 중 약 하나를 포함하고, 입자 당 형광단의 숫자는 입자 크기가 증가함에 따라 살짝 증가한다. 하나의 Cy5 형광단이 수력학 직경 내 1.2 nm 근처이고 음으로 하전된 실리카로부터 반발되는 하나의 음의 전하(도 1 내의 분자 구조를 참조)를 가짐을 고려하면, 입자 당 평균 1-2개의 형광단이 합리적인 숫자이다. 도 2m 내에 보여진 것과 같이, 직접 FCS에 의해 측정된(염료/입자 당 사태 감지기(avalanche detector)를 치는 광자의 숫자로부터) 입자 당 밝기는 물 중의 단일 Cy5 형광단 당 밝기보다 적어도 2배 높고, 입자 크기가 증가함에 따라 증가된다. 입자 당 밝기는 또한 형광단 당 밝기 및 입자 당 형광단의 숫자의 결과물로부터 추정될 수 있다(도 2m 내 빈 닷 참조). 행동 내에 전반적인 경향이 동일한 반면, 직접 FCS에 의해 측정된 입자 당 밝기는 모든 샘플의 이러한 계산된 밝기 값을 일관적이게 과대평가한다는 것을 주의해야 함이 흥미롭다. 이는 FCS 결과가 밝기를 과소평가하는 스토버 방법을 통해 합성된 입자의 차이점이다. 다름 메커니즘이 가능함에도 불구하고, 행동 내 이러한 차이점은 본 연구 내에서 사용된 GPC 칼럼을 통해 해리 염료로부터 향상된 입자 청소 절차로 인한 또는 캡슐화된 형광단의 상이한 종류로 인한 것일 수 있다. 도 2n 내에 전반적인 편차가 작지만, FCS로부터 입자 당 밝기의 경향 및 계산이 일관적이다.
3.3. 제어된 형광 코어-쉘 실리카 나노입자 성장. 추가적인 실리카 쉘이 반응 내로 추가 실리카 공급원을 추가로 투여함에 의해 페길화 전에 입자에 첨가된다(도 1). 입자 성장이 제어된 응집 경로를 따르는, 온도를 변화함을 통해 입자 크기 조절에 비해, 실리카 쉘 첨가에 의한 입자 성장은 단량체 첨가 경로를 따른다. 가수분해된 전구체, 규산의 농도는 항상 2차 입자 핵형성을 위한 임계 농도 미만에서 머문다. 이는 어떠한 주어진 시간 및 투여들 간의 시간 간격에서 투여된 실리카 공급원의 양을 최적화함에 의해 달성될 수 있다. 그러나, 단순히 TMOS를 투여하는 것은 항상 실시된 투여 및 간격 너비에 무관한 최종 입자의 더 작은 평균 크기를 초래한다. 이는 추가적인 실리카 공급원이 존재하는 것의 표면 상에 농축하는 것보다 2차 입자를 형성한다는 것을 제시한다. 이는 물 중의 TMOS의 가수분해 및 농축 모두 빠르기 때문이다; 단일 투여의 첨가에, 단일 교반을 통한 혼합이 충분히 빠르지 않기 때문에, 2차 입자 형성이 억제되기에 어렵다. 2차 입자 핵형성을 피하기 위해, 쉘 첨가 내에서 사용된 실리카 공급원은, 이의 느린 가수분해율 때문에, TMOS로부터 TEOS로 변경된다. pH 및 희석을 최적화함으로써, TEOS의 가수분해는 전체 용액과 완전히 혼합되기 위한 단일 투여를 위해 필요한 시간보다 조금 느리게 조절될 수 있다. 이러한 방식으로, 각 투여의 TEOS가 퍼져나가자 마자, 이는 가수분해되고 상당히 빠르게 존재하는 입자 상에 농축한다. 결론적으로, 추가적인 실리카 쉘은 2차 입자 핵형성 없이 효과적으로 첨가되어 평균 입자 크기의 증가를 초래할 수 있다. 순수한 SNP(염료 첨가 없이)를 사용하고, 4 nm 근처의 코어 크기로부터 시작하고, 5.6 nm(하나의 쉘), 6.5 nm(2번째 쉘) 및 7.8 nm(세번째 쉘)의 입자 크기로 이어지는 3개의 성공적인 쉘을 첨가한다는 것을 최초로 성공적으로 증명하였으며, 도 12의 TEM 및 DLS 데이터를 참고한다.
그 이후에, 실험이 Cy5 염료 함유 코어로 수행된다(도 3). 약 1 nm 두께의 1 내지 4개의 실리카 쉘을 5 nm 크기된 Cy5 도핑된 입자 코어(씨드) 각각에 첨가함으로써, FCS에 의해 밝혀진 것과 같이(도 3g), Cy5 표지된 형광 코어-쉘 SNP가 합성된다. 모 코어 입자와 함께, 이러한 입자의 TEM 이미지가 도 3a-e 내에서 보여지며, 단일 원자 층 수준에서 다시 개선된 크기 조절을 드러낸다. 흡광도 매치된 분광뿐만 아니라 이러한 입자들의 일치하는 방출 분광이 도 3f 내 해리 염료에 비교된다. 결론은 실리카 쉘의 입자가 0에서 4로 증가함에 따라 코어 입자에 대한 ~1.3 로부터 ~1.7로 증가하는 해리 Cy5 염료 동안 양자 상승을 제시한다. 초과 쉘 없는 입자 크기를 증가하는 경우와 유사하게, 이러한 밝기 증가는 쉘 숫자를 증가시키는 Cy5 형광단의 단단한 실리카 캡슐화 및 국소적인 실리카 환경을 통한 강직을 수반하는 증가가 원인일 것이다. 쉘의 숫자가 증가함에 따라, FCS 유도된 입자 당 형광단의 숫자가 도 2m 내에 상이한 크기로 성장된 입자의 행동과 상이한, 어떠한 자명한 경향을 나타내지 않는다(도 3h). 이는 쉘 첨가 실험에서 입자는 제어된 응집보다 단량체 첨가를 통해 성장한다는 것을 추가로 제공한다. 입자 당 형광단의 숫자가 동일하게 유지된다고 하더라도, 염료 당 강화의 결론으로 밝기가 FCS에 의해 관찰된 입자 밝기의 증가에 공헌한다(도 3i 참조).
본 명세서에서 설명된 물-기반의 합성 공정과 함께, 초과 실리카 쉘이 단량체 첨가를 통해 첨가되는 동안, SNP 코어의 크기는 제어된 응집을 통해 조절될 수 있다(도 1). 이러한 2개의 입자 성장 경로가 코어-쉘 SNP의 단일 합성 내에서 변경될 수 있음을 보여주기 위해, 입자의 배치가 먼저 반응 온도를 변화시킴에 의해 제어된 응집을 통해, 이어서 초가 실리카 공급원을 추가로 투여함에 의해 단량체 첨가를 통해 성장된다. 입자의 소량이 상이한 합성 모멘트에서 페길화를 위해 분획되고 이어서 특성화된다. 결론은 합성 동안에 입자 크기의 일관된 증가뿐 아니라 캡슐화된 염료 양자 증대를 나타낸다(자세한 사항은 도 13 참조). 결론은 코어 직경 및 쉘 두계를 통해, <10 nm 형광 코어-쉘 SNP의 구조가, 본 명세서에서 설명된 입자 성장 조건에 의해 서브 나노미터 단일 원자 층 수준에서 조절될 수 있다는 것을 증명한다.
이러한 2가지 입자 성장 경로(예를 들면 제어된 응집 및 단량체 첨가)는 단일 합성 내에서 변경될 수 있다는 원리를 증명하기 위해, 입자의 배치가 먼저 반응 온도를 변화시킴으로써 제어된 응집을 통해, 이어서 초과 실리카 공급원을 추가로 투여함에 의해 단량체 첨가를 통해, 처리된다. 샘플 용액의 소량이 페길화를 통해 입자를 퀀칭하기 위해 상이한 합성 지점에서 분획된다. 합성 경로로서 도 13a의 경로를 참조한다. 상이한 시간 지점에서 퀀칭된 성장하는 입자를 특성화함에 의해, 입자 성장 공정의 자세한 사항이 밝혀질 수 있다. 여기서, ~5 nm 입자에 대한 합성 조건이 먼저 적용된다(실온). TMOS의 첨가 후 24시간, 1/3의 반응 용액이 분획되고 페길화되어 입자 #1를 성장시킨다 (도 13a). 나머지 2/3의 반응 용액이 이어서 80℃로 가열되고 48시간 동안 이 온도에서 유지되고 실온으로의 냉각이 잇따른다. 그 이후에, 남은 반응 용액의 절반이 분획되고 페길화되어 입자 #2를 생성한다. 반응 용액의 나머지 절반이 추가로 실리카 쉘의 2개의 추가 층의 침적에 도입된다. 입자가 이어서 페길화되어 입자 #3을 생성시킨다. 표 3 내에 보여진 것과 같이, 입자 #1의 직경이 5.9 nm인 반면, 입자 #2의 직경이 열 처리 후 9 nm로 증가된다. 이러한 입자 크기의 증가는 고온에서 소입자의 제어된 응집으로 인한 것이다. 이러한 응집은 또한 입자당 염료의 숫자가 1.4 에서 2.6으로 증가된다. 추가 실리카 공급원을 반응 용액 내로 투여한 후, 얇은 실리카 쉘은 단량체 첨가를 통해 존재하는 입자 표면 상에 첨가되고 입자 직경은 추가로 11.4 nm로 증가된다. 결론적으로, 입자 #3이 9 nm보다 살짝 더 작은 추정된 코어 크기 및 1 nm 근처의 두께를 갖는 실리카 쉘을 가진다. 입자 #2로서 동일한 코어 크기를 갖기 때문에, 입자 당 염료의 숫자는 거의 동일하게 유지된다. 그러나, 캡슐화된 염료의 양자 증대는 1.7에서 1.8로 살짝 증가되고, 이는 초과 실리카 공급원이 코어 매트릭스를 추가로 밀도를 높이고 실리카 쉘이 코어 내부로 염료를 추가로 보호한다는 사실로 인한 것이다. 결론적으로, 입자 당 염료의 숫자가 코어 크기를 확장함에 의해 증가될 수 있는 반면, 양자 효율이 빈 실리카 쉘의 얇은 층의 첨가에 의해 강화될 수 있다. <10 nm 입자의 밝기는 바람직한 입자 성장 경로를 선택함을 통해, 코어 크기 및 쉘 두게 모두를 정확하게 조절함으로써 최적화될 수 있다.
Table 3. 상이한 합성 시간 지점에서 퀀칭된 입자의 3개 세트의 특성화 결과. 직경 및 밝기가 FCS 측정으로부터 유도되는 동안, 입자 당 염료의 #은 정상-상태 흡광도 측정 및 FCS 농도 결과로부터 계산된다.
FCS 직경 입자 당 염료의 # 상대적인
양자 강화		 해리 염료에 대하나 상대적인 밝기
Cy5 1.3nm 1.2 1 1
Cy5 1.3nm 1.2 1 1
입자 #1 5.9nm 1.4 1.3 2.2 배
입자 #2 9.0nm 2.6 1.6 3.3 배
Cy5 염료뿐 아니라, 로다민 그린 (RhG), 테트라메틸로다민 (TMR), Cy5.5, Dyomics 782 (DY782) 및 IRDye 800CW (CW800)을 포함하는, 형광단은 캡슐화되어 다양한 색의 코어-쉘 C' 닷을 생성한다. 상대적인 정상 상태 분광 및 FCS 특성화 결과는 도 4a-f 내에 도시되고 결과가 표 4에 요약된다. 이러한 C' 닷은 1 nm 두께 실리카 쉘의 첨가에 더하여 4.2 nm 크기된 코어 프로토콜에 따라 합성된다. 표 4 내에 나타난 것과 같이, 최종적인 입자 크기가 5.2 nm (DY782) 및 6.7 nm (Cy5.5) 사이에서 변화하여, 각 입자형태가 약 1-2개의 형광단을 함유한다. 도 4g 및 4h는 흡광도/방출 분광 및 상이한 C' 닷 각각의 용액 흡광도를 비교한다. 입자 합성이 광학 스펙트럼의 청색 부분에서 NIR로 변화하는 모든 광학 특성의 형광단의 상이한 종류와 양립할 수 있다는 것을 주의해야한다는 것이 흥미롭다. 650-800 nm 제도에서 특히, 상이한 색의 NIR C' 닷이 합성되어 다-색 NIR 및 NIR 멀티플렉싱을 가능하게 할 수 있다.
표 4. 형광단의 상이한 종류와 C' 닷의 비교. 입자 당 염료의 숫자는 상이한 C' 상의 정상-상태 흡광도 측정 및 FCS에 의해 측정된 입자 농도로부터 계산되는 동안, 직경 및 밝기가 FCS 측정으로부터 측정된다.
직경 입자 당 염료의 # 양자 강화 해리 염료에 대한 밝기 Abs./Emi. 파장
RhG C' 닷 6.2nm 1.8 1.4 2.6 배 506/528nm
TMR C' 닷 6.5nm 2.0 1.7 2.2 배 556/576nm
Cy5 C' 닷 6.1nm 1.4 1.5 2.4 배 649/668nm
Cy5.5 C' 닷 6.7nm 1.5 1.5 2.4 배 678/695nm
DY782 C' 닷 5.2nm 1.3 5.6 6.2 배 780/799nm
CW800 C' 닷 5.5nm 1.2 1.1 1.2 배 792/808nm
3.4. 상이한 무기 조성의 제어된 형광 실리카 나노입자 성장. NIR 내로 추가로 이동하는 발광 분광의 형광단이 주로 큰 몰 질량 및 크기를 가지므로, 이들의 편재화된 π-전자 시스템의 주변 상의 더 음으로 하전된 설페이트 기를 필요로 하여 바람직한 물 용해성, 예를 들면 도 1 내 Cy5 및 Cy5.5의 몰 구조와 비교하여, 바람직한 물 용해성을 생성시킨다. pH>2.7에서 이의 등전점 초과의 실리카가 또한 음으로 하전되기 때문에, 이는 정전기적으로 반발하는 상호작용의 증가로 인해, SNP 내로 이러한 크게 음으로 하전된 NIR 형광단을 공유결합적으로 캡슐화하는 것이 도전이 될 수 있다. 여기서, 수용성 SNP 성장 용액 pH는 실리카의 등전점(pH ~2.7)보다 살짝 아래인 값 (pH ~ 1.5)에 조절된다. 이러한 조건 하에서 SNP는 낮은(양의) 전하 밀도를 가질 수 있으므로 수용성 용액 내 입자 현탁액이 불안정하기 때문에, 알루미늄 알콕사이드가 실리카 공급원(TMOS)와 함께 반응 혼합물에 첨가된다. 낮은 pH에서, 알루미늄 기반의 반응 중간체가 양으로 하전된다(네트워크 내에서 실리콘을 대체하는 구조 내(in-framework) 알루미늄이 음 전하를 운반한다). 실험적 결과로부터, 이는 성장하는 입자가 응집을 충분히 방지할 정도로 안정화시킨다. 본 명세서에서 보여진 것과 같이, 동일한 시간에서 pH~1.5에서 약하게 양으로 하전된 실리카는 음으로 하전된 형광단에 인력의 상호작용을 제공함으로써 이들의 포함을 촉진한다. 이의 알콕사이드로부터 유도된 알루미나가 이미 모든 공통적인 면역 보조제의 하나로서 주입을 허여하기 때문에, 알루미늄 알콕사이는 이러한 목적에서 좋은 기회일 수 있다. 그러므로 생성된 초미세 NIR 형광 알루미늄 함유하는 SNP는 또한 임상적 이동의 가능성을 가진다.
SNP 내로 알루미늄을 포함하기 위해, 용액 pH는 HCl을 이용하여 1.5 근처로 조절된다. 알루미늄-트리-세크-부톡사이드/이소프로판올 혼합물 및 TMOS(몰 질량 약 1:10)이 이어서 즉시 첨가되고 입자 성장을 종결시키기 위해 10 분의 반응 시간 후 PEG-실란의 첨가가 잇따른다. 암모늄 하이드록사이드를 이용하여 중성으로 용액 pH를 다시 조절한 후, 80℃ 열처리가 공유결합적인 입자 페길화를 강화하기 위해 적용된다. TEM 및 DLS의 조합에 의해 입증된 것과 같이(도 14), 13 nm 근처 및 좁게 크기-분포된 NP가 이 방법 내에서 성공적으로 합성될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 강산 조건에서 순수한 SNP가 생성될 수 없다는 것을 주목해야 한다. 알루미늄 조성물 없이, 실리카 나노입자는 강산 조건에서 안정하지 않다. 크게 음으로 하전된 근-IR 염료의 캡슐화에 바람직한, 실리카의 등전점(즉 pH 2.7) 미만의 pH 조건에서 실리카 나노입자를 합성하기 위해, 알루미늄은 입자 안정성을 위해 사용되어야 한다. 용액 pH를 2.7에서 실리카의 등전점으로의 근접성의 결론으로, SNP의 표면 전하 밀도가 입자를 정전기적으로 안정화시킬 만큼 충분히 높지 않고 차후에 입자 응집이 일어난다. 반대로, 산 조건에서 알루미늄 알콕사이드의 가수분해 생성물이 강하게 양으로 하전되고, [Al(OH2)6]3+, 구조 내 알루미늄이 음으로 하전되기 때문에, 알루미늄이 실리카와 공-농축되기 ‹š문에 정전기적 반발 상호작용이 비제어된 입자 응집을 예방하도록 충분히 성장하는 입자가 전하가 더해진다는 것을 가정한다. 다른 메커니즘 또한 가능하다. 이 합성 프로토콜 내 성장하는 입자의 감소된 음 전하 밀도가 또한 음으로 하전된 NIR 형광단에 대한 반발을 감소시키는 것을 도와서, NP 내로 이들의 캡슐화를 촉진할 수 있다. 이런 원리를 증명하기 위해, 초미세 <10 nm Cy5.5 표지된 NP가 반응 혼합물에 염료 컨쥬게이트된 실란의 첨가에 의해 합성된다. 이러한 입자의 실리카 내로 알루미늄의 성공적인 포함은 먼저 고체상 NMR로 확인된다. 도 5a 내 29Si NMR 분광은 실리카-기반의 입자 매트릭스(Q 기) 및 입자 표면 상 PEG-실란 농축(T 기)을 증명하는 이전의 연구와 일치하는 T 및 Q 기의 증거가 된다. 27Al NMR 스펙트럼은 4-번의 배위된 구조 내 알루미늄을 가리키는 -56ppm 근처의 하나의 날카로운 피크를 단지 보여준다. 공유결합적으로 캡슐화된 NIR 염료와 함께 대응하는 알루미노실리케이트 네트워크의 분자 구조의 도식이 또한 도 5a 내에 보여진다. 입자 형성은 TEM뿐만 아니라 FCS의 조합에 의해 추가로 확인되고(도 5b 및 5d) FCS에 의해 결정된 입자 크기가 4.2 nm이다. 흡광도 및 발광 분광의 비변형된 형태가 강한 산 합성 조건에도 불구하고 Cy5.5 형광단의 생존을 제시한다(도 5e).
이러한 합성 프로토콜이 크게 음으로 하전된 형광단의 캡슐화를 강화시킨다는 것을 더 정량적으로 증명하기 위해, 알루미늄을 함유하는 Cy5.5 표지된 SNP뿐만 아니라 다양한 조절 반응의 결과가, 합성 후 및 어떠한 청소 단계의 전에 즉시 GPC 특성화에 도입된다. 도 5f 및 5g에 나타난 것과 같이, 약염기 조건을 이용하여 합성된 종래의 Cy 5 및 Cy5.5 표지된 SNP의 엘러그램(elugram)은 3개의 주요한 피크를 갖는다.
GPC 엘러그램 내 피크들을 배정하기 위해, Cy5 투여된 페길화된 SNP 합성 배치가 GPC에 의해 상이한 분획 내로 분류되고 각각의 분획은 이어서 FCS 특성화에 도입된다. 각 분획의 입자의 평균 농도, 입자 밝기 및 입자 직경이 도 15 내 상단의 3개 그래프 내에서 보여진다. 약 18분에서 GPC 피크는 약 1-2 nm 직경의 용액 내 물체와 일치하고, 이는 결국 해리 Cy5-실란 컨쥬게이트의 크기 또는 작은 자가-농축된 Cy5-실란 컨쥬게이트 클러스터에 잘 대응된다. 또한, 18분 피크에 대응하는 물체 당 밝기는 단일 Cy5 형광단의 밝기에 가깝다. 이러한 피크는 입자 내로 캡슐화되지 않은 해리 Cy5-실란 염료 컨쥬게이트 또는 Cy 컨쥬게이트 클러스터에 유래된 것일 수 있다. 약 12분에서 주요한 GPC 피크는 약 6 nm 직경의 용액 내 물체에 대응되고 밝기는 해리 Cy5 형광단의 2배 이상의 밝기의 수준이다. 두 변수는 표적된 형광 Cy5 캡슐화하는 SNP에 대해 기대되는 것에 잘 대응된다. 약 12분에서 주요한 피크는 바람직한 C' 닷에서 유래된 것일 수 있다. 약 6-7 분에서 GPC 피크는 20 nm 이하의 꽤 큰 직경의 용액 내 물체에 대응된다. 흥미롭게도, 이 피크에 대응하는 물체 당 밝기는 단일 형광 SNP의 것과 유사하다. 그러므로 이 피크는 SNP 응집으로부터 순수하게 오는 물체에 배정되지 않아야 한다. 또한, 잘-정의된 작은 피크가 275nm 감지기를 갖춘 GPC 내에서 관찰될 수 있음에도 불구하고, 이 피크는 FCS에 의해 관찰된 매우 낮은 농도의 용액 내 물체에 대응된다. 이는 275nm에서 낮은 흡광도 및 낮은 형광의 이 피크를 생기게 하는 용액 내 큰 물체(20 nm 이하)는, 예를 들면 PEG-실란의, 합성 내에서 사용된 화학의 불순물로부터 유래될 수 있으나, 입자 합성 반응에 해야 할 일이 많지 않을 수 있다.
도 15 내에 나타난 것과 같이, 약 7분에서 피크는 청소를 통해 주로 여과될 것인, 큰 응집에 기인한다. 약 18에서 피크는 투석을 통해 세척될 것인, 비반응된 염료 분자에서 유래된다. 약 12분에서 피크는 주요한 입자 피크이다. 비반응된 형광 및 입자의 피크 면적을 비교함에 의해서, 캡슐화된 형광단의 퍼센트는 추정될 수 있다. 우선, 데이터는 캡슐화의 정도는 형광단 및 염료 당 전하의 숫자 상에 형광단에 크게 의존한다는 것을 증명한다. 한 음 전하를 포함하는, 60% 근처의 실란-컨쥬게이트된 Cy5 염료는, 약 염기 조건에서 입자 내로 캡슐화되는 반면, 이 퍼센트는 분자 당 3개의 음 전하를 함유하는, Cy5.5의 단지 ~40%로 감소한다. 반응 pH는 1.5로 감소되기 때문에, 해리 입자의 피크가 Cy5 또는 Cy5.5 중 하나에서도 관찰되지 않는 반면, 엘루그램은 강한 입자 응집을 나타내며 아마 입자 표면 전하의 손실로 인한 것일 것이다. 반대로, 알루미늄 알콕사이드는 낮은 pH에서 TMOS와 함께 반응 혼합물에 첨가되기 때문에, 모든 염료에서 선명한 입자 피크가 엘러그램 내 재출현하는 반면, 응집 피크는 강하게 억제된다. 흥미롭게도, 강한 산 합성 조건 하에서 모든 염료에서 상대적인 피트 하에서 면적에 의해 밝혀진 캡슐화 효율이 증가한다. 효과는 Cy5.5에서 더 강하고 여기서 효율이 ~40%에서 >70%로 증가한다.
표 5. Cy5.5 캡슐화하는 알루미노실리케이트 나노-입자의 비교. 직경 및 밝기는 FCS에 의해 측정되는 반면 입자 당 염료의 숫자는 상이한 C' 닷 상의 정상상태 흡광도 측정 및 FCS에 의해 측정된 입자 농도로부터 계산된다.
직경 입자 당 염료의 # 양자 강화 해리 염료에 대한 입자 밝기
Cy5.5 1.3nm 1.0 - -
Cy5.5 코어 4.2nm 1.4 1.7 2.1 배
Cy5.5 코어-쉘 7.6nm 1.3 2.6 3.0 배
2개의 추가적인 실리카 쉘은 페길화 전 Cy5.5 캡슐화된 알루미노실리케이트 코어에 첨가되어 형광 양자 효율을 추가로 강화된다(도 1 내에 나타난 도시). 생성된 알루미늄 함유 코어-쉘 나노입자(도 5a)의 29Si 및 27Al 고체상 NMR 분광이 쉘 없는 입자에 비해 일관적인 특성을 나타내어, 4-배의 배위된 구조 내 알루미늄의 존재를 제공한다. 29Si 스펙트럼 내 T 기가 입자 표면 상에 농축된 PEG-실란으로부터 유래되었다는 점을 고려하면, 쉘 첨가 후 29Si 스펙트럼 내 Q 기에 대하나 T 기 강도의 감소가 감소된 표면/부피 비율이 일정하며, 이는 성공적인 실리카 쉘 침적이 제시한다. TEM으로부터 얻은 (도 5c) 코어-쉘 알루미늄 함유 닷의 평균 직경이 약 5 nm인 반면(오직 단단한 입자 직경), FCS(도 5d)은 7.6 nm (단단한 입자 및 부드러운 PEG 쉘 및 수화 층)로 측정되어 4.2 nm의 코어 입자에 더하여 성공적인 쉘을 추가로 제시한다 (Table 5). 정상 상태 흡수 및 FCS 농도 분석에 의해 측정된 것과 같이, 이러한 닷은 2.6개의 해리 염료 동안 양자 강화를 가지며, 이는 단지 코어로 수득된 1.7의 값보다 더 높다(도 5e, 표 5). 표 5에서 나타난 것과 같이, 이는 코어 쉘 입자가 코어 입자보다 약 1.5배 밝다는 것을 제시하는 FCS에 의해 확인된다. 또한, 합성된 평평한 Cy5.5 C' 닷(알루미늄 알콕사이드의 첨가 없이)의 가장 높은 양자 강화는 심지어 수 nm 두께 실리카 쉘이 있는 경우에도, 약 1.7-2.2이다. 실리카 네트워크 내로 알루미늄의 포함은 이의 강직을 강화시키기 위해 알려지기 때문에, 2.6의 해리 염료 동안 이러한 양자 강화는 염료를 둘러싸는 증가된 매트릭스 강직의 결과일 수 있다. 물 중의 Cy5.5 해리 염료의 양자 수율이 약 0.3이라는 것을 고려하면, 2.6의 관찰된 강화는 약 0.8의 캡슐화된 염료의 양자 수율과 동일하고, 이는 꽤 높고 이론적인 밝기 제한에 근접하기 시작한다.
물 중에서 합성된 이러한 알루미늄 함유 형광 SNP와 C' 닷을 구별하기 위해, 이들은 AlC'로 언급될 수 있다. 마지막으로, 알루미늄 알콕사이드의 빠른 반응 속도의 결론으로 최종적인 코어-쉘 AlC' 닷 표면은, 알루미늄이 코어 내에서 오직 위치할 것으로 예상되기 때문에, 알루미늄으로서 종래의 C' 닷의 것으로부터 구별되지 않아야 하는 반면, C' 닷의 경우에서 쉘은 PEG 체인으로 공유결합적으로 꾸며진 평평한 실리카로 만들어진다.
3.5. 리간드 작용화된 형광 실리카 나노입자. 형광 SNP 및 코어-쉘 SNP뿐만 아니라 이들의 알루미늄 함유 유사체의 페길화된 입자 표면 상에 용이하게 접근가능한 리간드를 도입하기 위해 실시된다. 이는 리간드 작용화된 <10 nm NIR 형광 나노입자, 예를 들면 진단적 및 치료적 적용 내에 임상전 및 임상적 용도를 위해, 생산한다. 이러한 적용을 위해 관심을 끄는 리간드는 펩타이드, 항체 조각, 다양한 DNA 및 RNA 부분 (예를 들면 siRNA), 약물뿐만 아니라 방사성동위원소 및 이들의 상대적인 킬레이팅 모이어티를 포함하는 치료적 분자, 및 이들의 조합을 포함하나, 이에 제한되지 않는다. 여기서 원리증명(proof-of-principle)은, 방사성동위원소에 결합하는, αvβ3 인테그린-표적하는 사이클릭(아르기닌-글라이신-아스파트산, 티로신-시스테인) 펩타이드, c(RGDyC)을 함유하는 티로신 (Y) 잔여, 예를 들면 124I, 및 말레이미도-작용화된 이종이작용성 PEG에 결합하는 시스테인 (C)을 이용하여 증명된다. 도 6a 내에 나타난 것과 같이, 목적을 달성하기 위해 이들의 체인 말단에서 NHS 에터 및 말레이미도 기의 이종이작용성 PEG(몰 질량 약 800 g/몰의 NHS-PEG-mal)는 먼저 NHS 에스터 기를 갖는 아민의 반응을 통해 아미노 실란과 컨쥬게이트된다. 두번째 단계에서 생성된 실란-PEG-말레이미도는 싸이올 말레이미도 반응을 통해 c(RGDyC)와 추가로 컨쥬게이트되어 c(RGDyC) 작용화된 PEG-실란 (c(RGDyC)-PEG-silane)을 생성한다. 이종이작용성 PEG는 PEG-실란(각각 500 g/몰에 비해 800g/몰)에 비해 살짝 더 긴 것으로 선택된다. 이는 표면 리간드는 PEG-실란의 코팅의 표면을 약간 넘어서 튀어나오고 그러므로 용이하게 접근되게 한다(또한 도 7 내 모델 참조). 최종적인 c(RGDyC)-PEG-실란은 페길화 단계 내 단일작용화의 PEG-실란와 함께 나노-닷 합성 용액 내로 첨가된다. 결론적으로, 합성된 나노-닷의 표면이 공통적인 PEG 체인 및 더 긴 c(RGDyC) 작용화된 PEG 체인에 의해 공유결합적으로 덮힌다(도 1). 도 6b는 c(RGDyC) 표면 작용화와/없이 해리 c(RGDyC) 펩타이드, 해리 Cy5 염료, 및 Cy5 캡슐화된 C' 닷 코어 (Cy5-C' 닷, 실리카 쉘 없음)의 흡광 분광을 비교한다. c(RGDyC) 펩타이드는 티로신 잔기로부터 275 nm에서 흡광도 피크를 가지는 반면, Cy5 잔여 염료나 Cy5-C' 닷이 이 파장 범위 내에서 감지될 수 있는 신호를 나타내지 않는다. 따라서 이러한 흡광도 피크는 성공적인 입자 표면 작용화를 확인하기 위해 사용될 수 있다. 실제로, c(RGDyC) 작용화된 PEG-Cy5-C' 닷(c(RGDyC) -PEG-Cy5-C' 닷)은 650 nm Cy5 흡광도 피크에 더하여 약 275 nm에서 흡광도 피크를 나타낸다. 또한, 도 16 내에 나타난 것과 같이, FCS 측정된, c(RGDyC) -PEG-Cy5-C'닷의 자기상관(autocorrelation) 곡선이 c(RGDyC) 표면 변형 없이 닷에 비해 오른쪽으로 이동하여, 입자 표면에 c(RGDyC)에 접합한 후 ~1 nm 입자 크기 증가를 가리킨다(표 6). 이러한 데이터는 c(RGDyC) 펩타이드는 입자 표면에 성공적으로 접합되었음을 제시한다. 흡광도 및 FCS 특성화를 결합함으로써, C'닷 당 c(RGDyC) 리간드의 숫자가 계산될 수 있다. 표 6 내에 보여진 것과 같이, 이러한 합성 배치로부터 평균적으로 약 16개의 c(RGDyC) 펩타이드가 단일 Cy5-C' 닷 (실리카 쉘이 없음) 에 접합된다. 말단 리간드 숫자는 합성 조건을 통해 변화될 수 있다, 예를 들면 입자 합성 단계 내에 첨가된 리간드-발생의 및 단순한 PEG-실란의 비율의 변경에 의해 변화될 수 있다.
표 6. 형광 SNPs (C' 닷, 코어만), 코어-쉘 SNPS (코어-쉘-C'닷), 및 이들의 알루미늄 함유 유사체를 포함하는, 다양한 c(RGDyC) 작용화된 C' 닷의 특성화.
FCS 직경 입자 당 염료의 # 입자 당 c(RGDyC)의 #
Cy5 1.3nm - -
Cy5-C'닷 5.4nm 1.8 -
c(RGDyC)-Cy5-C' 닷 6.5nm 1.8 16
c(RGDyC)-코어-쉘-Cy5-C' 닷 7.4nm 1.8 22
c(RGDyC)- Cy5.5-C' 닷 6.2nm 1.7 19
c(RGDyC)- Cy5.5-AlC' 닷 6.1nm 1.4 12
FCS 및 광학 흡광 측정을 결합함에 의해, C' 닷 당 c(RGDyC) 리간드의 숫자는 C' 닷당 염료의 숫자의 계산으로 유사한 방법으로 추정될 수 있다. 예를 들면, c(RGDyC)-C' 닷 광학 스펙트럼(도 6b) 내 275nm c(RGDyC) 피크의 높이는 비-c(RGDyC) 리간드 함유 C' 닷에서 흡광도 스펙트럼 배경의 뺄셈을 통해 추정될 수 있다. 이어서, 생성된 c(RGDyC) 피크 높이를 티로신의 소멸 계수, 예를 들면 약 1400 M-1cm-1로 나누는 것에 의해, 용액 내 존재하는 c(RGDyC) 리간드의 전체 숫자의 농도가 계산될 수 있다. 반면에, 용액 내 C' 닷의 농도는 FCS에 의해 측정될 수 있다. 마지막으로, 에 대한 C' 닷 입자 농도의 c(RGDyC) 농도의 비율을 취하는 것에 의해 입자 당 c(RGDyC) 리간드의 숫자가 추정될 수 있다. 결과는 본 연구 내에서 합성된 다양한 C' 닷 상의 c(RGDyC) 리간드의 숫자가 12 내지 22라는 것을 제시한다(표 6 참조).
이러한 표면 변형 방법론은 C' 닷 패밀리 내 다른 입자 플랫폼에 적용될 수 있다는 것을 증명하기 위해, c(RGDyC) 펩타이드는 유사한 반응 조건 하에 C' 닷의 종류에 접합된다. 자세히 보면, 이는 추가적인 실리카 쉘, 상이한 종류의 형광단(Cy5.5 대 Cy5) 및 상이한 조성(AlC' 닷 대 C' 닷)와 함께, C' 닷을 포함한다. 도 6c 내에 보여진 것과 같이, 모든 이러한 합성된 입자는 c(RGDyC)에 대한 특징적인 275 nm에서 흡광도 피크를 나타내며 모든 경우에서 성공적인 c(RGDyC) 표면 변형을 가리킨다. FCS 결과와 함께 이러한 광학 측정으로부터 유도된 것과 같은 입자 당 c(RGDyC) 펩타이드의 숫자는 12에서 22로 살짝 변한다(표 6).
각 6 nm C' 닷이 열무게 분석(TGA; 도 17 참조)에 따라 표면 상에 대략적으로 100개의 PEG 체인을 가진다는 것을 고려하면, 입자 크기로 변경되는 숫자는, 5-10개의 PEG 체인의 하나는 c(RGDyC) 리간드로 작용화된다는 것이 추정될 수 있다. 절대적인 리간드 숫자 외에, 리간드 밀도는 생물학적 반응을 제어할 것으로 예상되는 또 다른 변수이고, 본 연구에서 논의된 합성 변수를 통해 조절될 수 있다. 합성된 ~7 nm C' 닷의 단일작용성의 PEG 체인 및 c(RGDyC)-작용화된 PEG 체인의 표면 밀도는 대략적으로 각각 1.7/nm2 및 0.2/nm2로 추정된다. 단순한 PEG 체인을 위해 이는 약 0.6 nm2의 PEG-실란 머리 기 당 면적과 동일하다. 높은 곡률 C' 닷 표면 상의 PEG 체인의 전반적인 표면 밀도가 단순한 실리카 상의 짧은 작용화의 알킬-실란 단일층의 보고된 리간드 밀도에 매우 근접하며, 이는 머리 기 당 면적으로 표현될 때 1.2/nm2 내지 2.2/nm2, 또는 0.83 nm2 내지 0.45 nm2 w이다.
6 nm 빈 비-형광성 페길화된 SNP(형광단 캡슐화 없는)에 대한 TGA 곡선이 도 17 내에 보여진다. 6 nm 평균 크기는 DLS에 의해 측정된 수력학적 직경이다. 600℃의 온도까지의 무게 손실은 입자 샘플 내 유기 성분의 존재를 가리킨다. 이러한 샘플 합성은 형광성 염료의 캡슐화 단계를 포함하지 않기 때문에, 입자의 오직 유기 함량이 입자 표면 상의 PEG 체인으로부터 기인한다. TGA 곡선은 약 600℃에서 평평해지며 유기 함량의 대부분이 타서 제거되어 남은 구성성분으로 무기 실리카를 남긴다는 것을 제시한다. 이러한 데이터로부터 이는 이어서 실리카 및 PEG간의 무게 비율이 약 52%:48%라는 것이 추정될 수 있다. 6 nm 수력학 직경 페길화된 SNP가 4 nm 및 ~1-2 nm PEG 층의 순수한 실리카 코어를 가진다는 것을 고려하면, 입자 당 PEG 체인의 숫자가 약 1.9-2.2 g/cm3의 실리카 밀도를 가정함으로써 추정될 수 있다. 결론은 이러한 단순한 SNP에 입자 표면 상의 약 80-100개의 PEG 체인이 있다는 것을 제시한다. 이는 약 1.7 체인/nm2의 입자 표면 상의 PEG 밀도로 이동하며, 이는 약 0.6 nm2의 PEG-실란 헤드 기 당 면적과 동일하다. 입자 크기가 증가됨에 따라 입자 당 PEG의 숫자는 올라간다. 입자 당 c(RGDyC)의 숫자에 대한 PEG의 이러한 표면 밀도를 비교하면, 본 명세서에서 합성된 c(RGDyC)-PEG-C'닷의 표면 상에, 모든 5-10개의 비작용화된 PEG 체인 중에 대략 하나의 c(RGDyC)-표지된 PEG 체인이 있다는 것이 추정될 수 있다.
3.6. 리간드 작용화된 페길화된 형광성 코어-쉘 실리카 나노입자의 분자적 모델. 완전한 분석 결과에 기초하여, 리간드 작용화된 Cy5 캡슐화하는, c(RGDyC) 표면 변형으로(즉 c(RGDyC) -PEG-Cy5-C'닷의) 페길화된 코어-쉘 C' 닷의 현실적으로 치수된 분자적 모델이 도 7 내에 보여진다. 크기 비교를 위해, 위에서 아래로 왼쪽(도 7a)은 다음의 입자를 구성하는 개별적인 구성 성분의 모델을 나타낸다: Cy5 염료, PEG-실란 (약 500 g/몰), 말레이미도-작용화된 (즉 이종이작용성의) PEG-실란 (약 800 g/몰), c(RGDyC) 펩타이드뿐 아니라 실리카. 도 7b 및 7c 내 모델은 PEG-실란보다 살짝 더 긴 이종이작용성의 PEG의 말단에서 ~3 nm 직경 실리카 코어 캡슐화하는 하나의 Cy5 형광단 (도 7b, 상단 삽도), ~0.5 nm 두께 실리카 쉘, ~1.5 nm 두께 PEG 층, 및 16개 c(RGDyC) 리간드 (도 7b, 하단의 삽도)의 C' 닷을 통한 컷(cut)을 나타낸다. 약 1.9-2.2 g/cm3의 비정질의 실리카 밀도에 따라, 이러한 실리카 나노입자는 약 800개의 SiO2 단위 및 입자 표면 상의 약 100개의 PEG 체인으로 구성된다. 전반적인 입자 크기는 약 7.5 nm이고 전반적인 입자 몰 질량은 약 110 kDa이다. 도 7a 내에 보여진 것과 같이, Cy5 형광단의 FCS에 의해 측정된 수력학 직경은 단지 1nm보다 살짝 큼에도 불구하고(표 3), Cy5 형광단의 길이가 2 내지 3 nm이다. 도 7에 기초하여, 3nm 실리카 코어 정확하게 내부에 공유결합적으로 결합된 Cy5 형광단의 위치는 캡슐화 공정의 확률적 본성 및 Cy5 및 음으로 하전되고 탈양성자화된 실리카 표면 하이드록실 기간의 정전기적 반발로 주어지지 않을 것 같다고 결론지어질 수 있다. 실리카에 의해 완전히 덮히기/캡슐화되기 위해, 오히려 부가적인 실리카 쉘은 추가 실리카 쉘이 추가적인 양자 수율 강화를 초래한다는 사실은 반드시 일관성 있다(도 3g 및 3i). C' 닷의 실리카 코어-쉘 부분 전체에 걸쳐 오직 약 10개의 SiO2 구조적 단위가 있으며, 이러한 나노입자의 근-분자적 또는 거대분자적 크기를 추가로 강조한다.
이 실시예에서 1 nm 미만의 크기 조절의 좁게 크기-분산된 페길화된 SNP의 생성을 위한 수용성 합성 방법론이 나타난다(예를 들면 단일 원자 층의 수준에서). NIR 발광 염료를 포함하는 형광단의 상이한 종류는 입자 내로 캡슐화되어 형광 프로프를 생성할 수 있으며, 이의 밝기는 페길화 전 초과 실리카 쉘의 첨가의 통해 추가로 강화될 수 있다. 이러한 방법론은 다른 조성의 <10 nm 크기된 형광성의 SNP의 합성을 추가로 가능하게 한다. 특히 알루미늄 졸-겔 전구체의 첨가는 알루미늄 함유하는 형광성 코어 및 코어-쉘 나노입자로 이어지며, 이는 크게 음으로 하전된 NIR 형광단의 캡슐화 효능이 실리카 입자에 비해 강화되었을 뿐 아니라, 개별적인 형광단의 양자 강화는 이론적인 밝기 한계에 접근하기 시작한다. 마지막으로, 이종이작용성 PEG는 형광성 SNP 및 코어-쉘 SNP뿐 아니라 이들의 알루미늄 함유하는 유사체의 페길화된 입자 표면 상에 용이하게 접근가능한 리간드를 도입하여, 진단적 및 치료적 적용 내 임상전 및 임상적 용도를 위한 <10 nm NIR 형광성 나노프로브를 생성하기 위해 사용될 수 있다. 본 명세서에서 설명된 NP 구조 상관관계는 또한 SNP의 초기 성장 상태의 메커니즘의 기초적인 이해의 향상을 도울 수 있다.
본 개시는 하나 이상의 특정 구현예 및/또는 실시예에 대하여 설명되었음에도 불구하고, 본 개시의 다른 구현예 및/또는 실시예는 본 개시의 범위를 벗어나지 않고 만들어질 수 있다는 것이 이해될 것이다.

Claims (18)

  1. 하기 단계를 포함하는, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 제조하는 방법:
    a) 실온에서 물 및 TMOS을 포함하는 반응 혼합물을 형성하는 단계로서, 상기 반응 혼합물의 pH는 6 내지 9인, 단계;
    b) 다음 i) 또는 ii)의 단계:
    i) 시간 (t1) 및 온도 (T1)에서 반응 혼합물을 유지시키는 단계로서 이에 의해 2 내지 15 nm의 평균 크기를 갖는 나노입자가 형성되는 것인, 단계, 또는
    ii) 경우에 따라 실온으로 반응 혼합물을 냉각시키는 단계, 및 단계 a)로부터의 반응 혼합물에 쉘 형성 단량체를 첨가하는 단계로서, 상기 첨가는 상기 쉘 형성 단량체 농도가 이차 핵형성을 위한 역치 이하가 되도록 수행되는 것이고, 이에 의해 2 내지 50 nm의 평균 크기를 갖는 코어-쉘 나노입자가 형성되는 것인, 단계;
    c) b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물의 pH를, 필요하다면, 6 내지 10의 pH로 조절하는 단계; 및
    d) 실온에서 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물에, PEG-실란을 첨가하는 단계 및 시간 (t2) 및 온도 (T2)에서 생성된 반응 혼합물을 유지시키는 단계;
    e) 임의로, d)로부터의 혼합물을 시간 (t3) 및 온도 (T3)에서 가열하는 단계로서, 이에 의해 PEG로 작용화된 나노입자 표면 또는 PEG로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되는 것인, 단계.
  2. 제1항에 있어서, 상기 반응 혼합물은 알루미나 또는 알루미나실리케이트 코어 형성 단량체를 추가로 포함하고, 알루미나 또는 알루미나실리케이트 코어 형성 단량체의 첨가 전에 반응 혼합물의 pH는 1 내지 2의 pH로 조절되고, 용액의 pH가 7 내지 9로 조절되며, 임의로, 0.1k 내지 1k의 분자량 및 10mM 내지 75mM의 농도를 갖는 PEG는 7 내지 9의 pH로 조절하기 직전에 반응 혼합물에 첨가되고, 코어는 알루미노실리케이트 코어인, 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 반응 혼합물 내에 염료 전구체를 추가로 포함하고, PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 그 안에 공유결합적으로 캡슐화된 하나 이상의 형광 염료 분자를 갖는 것인, 방법.
  4. 제3항에 있어서, 1 내지 7개의 염료 분자들이 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면 각각에 존재하는 것인, 방법.
  5. 제4항에 있어서, 상기 코어는 알루미노실리케이트 코어이고 입자당 염료 분자의 숫자는 1 내지 7인, 방법.
  6. 제1항에 있어서, 단계 b) ii)에서, 쉘-형성 단량체가 별개의 분획들(aliquots)로 첨가되고, 필요하다면, 상기 쉘-형성 단량체의 첨가 동안 7 내지 8의 pH를 유지하기 위해 주기적으로 pH를 조절하는 것인, 방법.
  7. 제1항에 있어서, PEG-실란 컨쥬게이트의 적어도 일부 또는 전부는 리간드를 포함하는 것인, 방법.
  8. 제1항에 있어서, 리간드를 포함하는 PEG-실란 컨쥬게이트는 단계 d)에서 PEG-실란에 더하여 첨가되는 것이고, 이에 의해 리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되는 것인, 방법.
  9. 제1항에 있어서, PEG-실란 컨쥬게이트가 단계 d)에서 첨가되기 전 또는 후에, 리간드를 포함하는 PEG-실란 컨쥬게이트가 실온에서 단계 b) i) 또는 b) ii) 각각으로부터의 코어 나노입자 또는 코어-쉘 나노입자를 포함하는 반응 혼합물에 첨가되고,
    시간 (t4) 및 온도 (T4)에서 생성된 반응 혼합물을 유지시키고, 이어서 생성된 반응 혼합물을 시간 (t5) 및 온도 (T5)에서 가열하고, 이에 의해 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되고,
    임의로, 이어서 실온에서 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 포함하는 생성된 반응 혼합물에 PEG-실란 컨쥬게이트를 가하고,
    시간 (t6) 및 온도 (T6)에서 생성된 반응 혼합물을 유지시키고, 이에 의해 PEG-실란 컨쥬게이트 분자의 적어도 일부가 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면의 적어도 일부 또는 리간드 PEG-실린 컨쥬게이트를 포함하는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면의 적어도 일부에 흡수되고,
    시간 (t7) 및 온도 (T7)에서 생성된 혼합물을 가열하고, 이에 의해 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면 또는 리간드를 포함하는 PEG 기 및 PEG기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면이 형성되는 것인, 방법.
  10. 제1항에 있어서, PEG-실란의 적어도 일부 또는 전부는 PEG-실란 컨쥬게이트의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖고, 반응성 기를 갖는 PEG기 및 임의로 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면의 형성 후에 반응성 기를 갖는 PEG기 및 임의로 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 제2 반응성 기로 작용화된 제2 리간드와 반응됨으로써 제2 리간드 및 임의로, 및 PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 제2 리간드 및 PEG 기, 및 임의로, PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성하는 것인, 방법.
  11. 제8항 또는 제9항에 있어서, PEG-실란의 적어도 일부 또는 전부는 PEG-실란 컨쥬게이트의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖고, PEG 기 및 임의로 반응성 기를 갖는 PEG기, 및 임의로 PEG기로 작용화된 나노입자 표면의 형성 후, 반응성 기를 갖는 PEG기 및 임의로 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 제2 반응성 기로 작용화된 제2 리간드와 반응됨으로써 제2 리간드 및 임의로 PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, 제2 리간드 및 PEG 기, 및 임의로 PEG 기로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성하고,
    PEG-실란의 적어도 일부는 PEG-실란 컨쥬게이트의 실란 모이어티에 컨쥬게이트된 말단에 반대되는 PEG 모이어티의 말단 상에 반응성 기를 갖고, 반응성 기를 가지는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면의 형성 후, 반응성 기를 가지는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면, 반응성 기 및 리간드를 포함하는 PEG기를 가지는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 반응성 기를 갖는 PEG기 및 리간드를 포함하는 PEG로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 반응성 기로 작용화된 제2 리간드와 상기 반응성 기가 반응되어, PEG 기 및 제2 리간드로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 나노입자 표면, PEG 및 제2 리간드로 작용화된 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면, 리간드를 포함하는 PEG 기로 작용화된 나노입자 표면, 또는 PEG 기, 및 제2 리간드로 작용화된 리간드를 포함하는 폴리에틸렌 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면을 형성하는 것인, 방법.
  12. PEG 기로 작용화된, 다수의 코어 또는 코어-쉘 나노입자 표면, 또는 PEG 기로 작용화된 다수의 코어-쉘 나노입자 표면을 포함하는 조성물로서, 적어도 95%의 코어 또는 코어-쉘 나노입자는 2 내지 15 nm의 크기 또는 2 내지 15 nm의 코어 크기를 갖고 상기 조성물은 어떠한 입자-크기 식별하는 공정을 거치지 않은 것인, 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 코어는 실리카 코어이거나, 코어-쉘 나노입자의 코어 및 쉘이 실리카 쉘인, 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 코어는 알루미노실리케이트 코어이거나 코어-쉘 나노입자의 코어는 알루미노실리케이트 코어이고 코어-쉘 나노입자의 쉘은 실리카 쉘인 것인, 조성물.
  15. 제12항에 있어서, 폴리에틸렌 기의 적어도 일부 또는 전부는 하나 이상의 리간드를 포함하는, 조성물.
  16. 제12항에 있어서, PEG 기로 작용화된 코어 또는 코어-쉘 나노입자 표면, 또는 PEG 기로 작용화된 코어-쉘 나노입자 표면은 그 안에 캡슐화된 하나 이상의 염료 분자를 갖는 것인, 조성물.
  17. 제14항에 있어서, 코어는 알루미노실리케이트 코어이고 코어 당 염료 분자의 숫자는 1 내지 7개인, 조성물.
  18. 다음 단계를 포함하는, 개체 내의 영역을 이미지화하는 방법:
    (a) 개체에게 제12항의 조성물을 투여하는 단계로서, 상기 나노입자는 하나 이상의 염료 분자를 포함하는 것인, 단계;
    (b) 여기 전자기방사선(electromagnetic radiation)를 개체에 조사하여 적어도 하나 이상의 염료 분자를 여기시키는 단계;
    (c) 여기된 전자기방사선을 감지하는 단계로서, 상기 감지된 전자기방사선은 여기 전자기방사선에 의한 여기의 결과로서 개체 내의 상기 염료 분자에 의해 방출된 것인, 단계; 및
    (d) 감지된 전자기방사선에 대응하는 신호를 처리하여 개체(subject) 내의 영역에 대한 하나 이상의 이미지를 제공하는 단계.
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