JP2008506747A - 脈管形成に関連する疾患を診断するためのシアニン色素の使用 - Google Patents

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Abstract

本発明は、微小転移または小増殖性病変、特に脈管形成に関連する一次腫瘍、前癌、形成異常、化成、炎症性病変、例えば、乾癬、乾癬性関節炎および/または慢性関節リウマチ、子宮内膜病変および眼の疾患を診断するための、シアニン色素と脈管形成特異的結合性成分、好ましくはEB-Dフィブロネクチン特異的結合性成分との複合体の使用に関する。

Description

本発明は、微小転移または小増殖性病変、特に脈管形成に関連する一次腫瘍、前癌、形成異常、化成、炎症性病変、例えば、乾癬、乾癬性関節炎および/または慢性関節リウマチ、子宮内膜病変および眼の疾患を診断するための、シアニン色素と脈管形成特異的結合性成分、好ましくはEB-Dフィブロネクチン特異的結合性成分との複合体の使用に関する。
発明の背景
最近、医学的診断における光の使用は重要性を獲得した (例えば、下記の文献を参照のこと: Biomedical Photonics Handbook (編者: T. Vo-Dinh). CRC Press) 。種々の医学的制御、例えば、内視鏡検査、マンモグラフィ、外科手術または婦人科における適用のために広範な種類の診断法が実験的に試験されている。この目的のために、蛍光診断法および映像法のための外因的造影剤として色素を組織に供給し、そしてここにおいて特にスペクトル範囲700〜900 nmの吸収最大および蛍光最大を有する蛍光色素 (組織の診断窓) がin vivo 映像法のために使用されてきている。
この波長のフォトンは組織により比較的ほとんど吸収されず、したがって組織中に数センチメートル貫通することができ、その後吸収プロセス (主としてオキシヘモグロビンおよびデオキシヘモグロビンによる) は光輸送を終える。その上、組織の中に導入される蛍光色素により吸収が起こることがあり、しかしこれらの蛍光色素は吸収されたエネルギーをより長い波長の蛍光放射線の形態で放射する。この蛍光放射線を検出し、分光的に分離することができ、そしてこの蛍光放射線は色素の局在化および色素が結合した分子構造との相関を可能とする (また、これに関係して下記の文献を参照のこと: Licha K. (2002) Contrast Agents for Optical Imaging (Review). In: Topics in Current Chemistry - Contrast Agents II (編者: W. Krause) 、Vol. 222、Springer Heidelberg、pp. 1-31) 。
シアニン色素のクラスからの蛍光色素は有望な代表例のカテゴリーの中に入り、そして多数の異なる構造的幅で合成された。特に、インドカルボシアニン、インドジカルボシアニンおよびインドトリカルボシアニンの骨格を有するカルボシアニンは、高い吸光係数およびすぐれた蛍光量子効率を有する (Licha K. (2002) 前掲、およびその中に引用されている文献) 。
疾患構造と健康組織との間の診断的に有意な識別を達成するために、投与される色素は2つの組織型間の濃度差をできるだけ高くしなくてはならない。これは腫瘍-生理学的または形態学的特性 (血液供給、分布速度論、遅延除去、脈管構造) に基づき、ならびに腫瘍および脈管の細胞または隣接組織の分子の特性に基づいて実施することができる。疾患特異的構造を分子標識化するために、蛍光色素と標的に密接に関係のある性分子、例えば、タンパク質、ペプチドまたは抗生物質とから成る複合体を使用することができる。注射後、これらの複合体のある部分は分子標的構造、例えば、レセプター、細胞表面構造またはマトリックスタンパク質に結合するが、非結合部分は体液中で希釈または代謝されたままであるか、あるいは体から抽出される。この方法において、より高い濃度差および、こうして、より大きい像コントラスト (高いSN比) を蛍光診断の実行において発生させることができる。
多数の疾患、例えば、腫瘍 (Folkman J. (1974) Symp. Soc. Dev. Biol. 30: 43-52) 、関節炎 (Colville-Nash PR、Scott DL (1992) Ann. Rheum. Dis. 51: 919-25) 、乾癬 (Folkman J. (1972) J. Invest. Dermatol. 59: 40-43) 、眼の疾患 (Adamis AP 他 (1999) Angiogenesis 3: 9-14) は脈管形成に関連することが記載された。脈管形成に関連する種々の疾患は、例えば、下記の文献に概観されている: Longo R 他 (2002) Angiogenesis 5: 237-56。他方において、新しい血管の成形は健康な組織において稀に起こり、ただし創傷治癒および月経周期または妊娠間の子宮内膜組織の変化を包含するわずかの例外を除く。こうして、新脈管形成は重要な治療標的ならびに診断標的となった。
増殖する脈管細胞の中にまたはそれらの付近に優先的にまたは独占的に存在する分子構造は記載されてきている (概観については、例えば、下記の文献を参照のこと：Alessi P 他 (2004) Biochem. Biophys. Acta 1654: 39-49およびNanda AおよびSt. Croix B (2004) Curr. Opin. Oncol. 15: 44-49) 、これらは下記を包含する: 内皮細胞上のレセプター、例えば、脈管内皮増殖因子レセプター (VEGF-R) およびマトリックスタンパク質、例えば、外部ドメインB (ED-B) フィブロネクチン。フィブロネクチンのED-Bドメイン、すなわち、マウス、ラットおよびヒトにおいて同一である91アミノ酸配列 (これはオールタネイティブスプライシングによりフィブロネクチン分子中に挿入される) は、新脈管構造の回りに特異的に蓄積することが示された (Castellani 他 (1994) Int. J. Cancer 59:2-618) 。
微小転移は > 0.2 mmの悪性細胞の凝着クラスターであり、そして< 0.2 mmの悪性細胞のクラスターは準微小転移と呼ばれる (Van der Westhuizen N. (2002) Laboratory Report; Rampaul RS 他 (2001) Breast Cancer Res. 3: 113-116; Bitterman A 他 (2002) IMAJ 4: 803-809) 。現在顕微鏡でin vitroでのみ検出できる微小転移は、脈管形成的または非脈管形成的であることができる。一次腫瘍および転移を包含する大部分のヒト腫瘍は脈管形成活性なしで生じ、数ヶ月〜数年間直径0.2〜 < 2 mmの微視的病変としてin situに存在した後、小さい百分率は脈管形成的表現型にスイッチすることができる (Falkman JおよびBecker K (2000) Acad. Radiol. 7: 783-785; Falkman J (2001) Angiogenesis. In Braunwald E 他、Harrison’s Textbook of Internal Medicine 第15版、McGraw-Hill、517-530) 。
細胞レベルにおいて、脈管形成的スイッチの少なくとも4つの機構はヒトおよびマウスにおいて同定されてきている: (1) 無血管in situ癌腫は、隣接宿主脈管ベッドにおける新血管化を刺激することによって、それら自身の血液供給を漸増することができる‐ヒト腫瘍において最も普通のプロセス、(2) 骨髄から循環する前駆体内皮細胞は脈管形成焦点中に合併することができる、(3) 腫瘍は宿主繊維芽細胞および/またはマクロファージを腫瘍ベッドにおいて誘導して脈管形成因子 (例えば、脈管内皮増殖因子 (VEGF)) を過剰発現することができる; および (4) 先存する脈管は腫瘍細胞により占有されることがある。また、脈管形成スイッチは3つの機構の組合わせを含むことがある (Falkman J (2001) Angiogenesis. In Braunwald E 他、Harrison’s Textbook of Internal Medicine 第15版、McGraw-Hill、517-530) 。
プロ脈管形成分子の作用が抗脈管形成分子のそれと釣合うとき、「脈管形成スイッチ」は「オフ」となり、そして正味の釣合いが脈管形成の利益となるようにチップインされるとき、「オン」となる。このスイッチをトリガーする種々のシグナルが発見されてきている。脈管形成アクチベーターは、例えば、次のような分子構造である: VEGFファミリーメンバー、VEGFR、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BBおよびレセプター、TGF-β1、エンドグリン、TGF-βレセプター、FGF、HGF、MCP-1、インテグリン類 (αvβ3、αvβ5、α5β1) 、VE-カドヘリン、PECAM (CD31) 、エフリン類、プラスミノゲンアクチベーター、MMP類、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、ケモカイン類またはId1/Id3。
脈管形成インヒビターは、例えば、次のような分子構造である: VEGFR-1、Ang2、TSP-1、-2、アンギオスタチンおよび関係するプラスミノゲンクリングル類、エンドスタチン (コラーゲンXVIIフラグメント) 、バソスタチン、血小板因子4、TIMP類、MMPインヒビター、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、-β、-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、プロラクチン (M、16K) 、VBGI、SPARCのフラグメント、オステオポンチンフラグメントまたはマスピン (Carmeliet PおよびJain RK (2000) Nature 407: 249-257; Yancopoulos GD 他 (2000) Nature 407: 242-248; Bergers G. およびBenjamin LB (2002) Nature Reviews Cancer 3: 401-410; Hendrix MJC 他 (2002) Nature Reviews Cancer 3: 411-421) 。
Ntziachristos V 他 (2000) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 97：2767-2772には、インドシアニン緑増強を使用する線維腺腫の拡散光学的断層撮影法が記載されている。解明された腫瘍は、1 cmを超える大きさの一次腫瘍である。
WO 01/23005 A1には、ED-B特異的抗体および種々の色素および腫瘍周辺の描写におけるそれらの使用が記載されている。これらの複合体を使用して得ることができる空間的解像度について、教示されていない。
McDonald D. M. およびChoyke P. L. (2005) Nat. Med. 9: 713-25には、脈管形成の映像法における進歩が概観されている。上記文献において、磁気共鳴映像法 (MRI) 、コンピュータ断層撮影法 (CT) 、陽電子放射断層撮影法 (PET) 、超音波検査法および光学的映像法が、動物およびヒトにおける脈管形成の像を得る非侵襲性法を提供する方法が論じられている。前記文献において、これらの方法は保存された組織検体に関して最高の解像度を提供するが、臨床的方法は生きている組織の像を非常に低い解像度および特異性で与え、そしてミクロ循環の脈管を分解することができないことが教示されている。将来の問題はこの解像度のギャップを架橋しかつ脈管形成性脈管を特異的に同定できる新しい映像法を開発することを含むことが結論される。現在、このような方法は入手可能ではない。
発明の詳細な説明
微小転移および新しく血管化された構造または血管化する構造、すなわち、主として微小脈管を含んでなるか、あるいは微小脈管を発生するプロセスにある構造、を造影するための先行技術における困難が与えられると、脈管形成特異的結合性成分、特にED-Bフィブロネクチン特異的結合性成分と1種または2種以上のシアニン色素との複合体を使用する、光に基づく診断により、このような構造を区別できることが、本発明者らにより、驚くべきことには発見された。この観察により、小さい疾患構造の検出を必要とする新しい診断分野に対する近赤外線蛍光映像法の使用が開発された。したがって、第1の面において、本発明は、微小転移または小増殖性病変を診断する診断剤を製造するための下記一般式 (I) の複合体の使用に関する：
B-(D)n (I)
式中、
Bは脈管形成特異的結合性成分であり、
Dはシアニン色素であり、そして
nは1〜5である。
脈管形成特異的結合性成分は、新しく形成された微小血管の中または付近の微小転移中に優先的または独占的に存在する構造に結合するか、あるいは微小脈管構造の増殖前または増殖間に存在する構造に結合する。このような分子構造は、例えば、下記の文献に概観されている: WO 96/01653、Alessi P 他 (2004) およびNanda AおよびSt. Croix B (2004) 。上に指摘したように、微小転移を形成する細胞および同様に小増殖性病変の細胞は、脈管形成因子および抗脈管形成因子の両方を発現し、そして脈管形成インヒビターが脈管形成因子の作用と反作用するかぎり、抗脈管形成因子は脈管形成の抑制に導く。いったん脈管形成因子の作用が支配すると、脈管形成因子は脈管形成の開始に導く。こうして、両方の構造、すなわち、脈管形成のアクチベーターおよびインヒビターは、脈管形成の調節に関係し、本発明の意味の範囲内の脈管形成特異的結合性成分であることができる。
脈管形成アクチベーターは、限定なしに、例えば、次のような分子構造を包含する: ED-Bフィブロネクチン (ED-BF) 、エンドグリン (CD105) (Burrows FJ 他 (1995) Clin. Cancer Res. 1: 1623-1634) 、VEGFファミリーのメンバー、脈管内皮増殖因子 (VEGFR) 、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BBおよびレセプター。TGF-β1、TGF-βレセプター、FGF、HGF、MCP-1、インテグリン類 (αvβ3、αvβ5、α5β1) 、VE-カドヘリン、PECAM (CD31) 、エフリン類、プラスミノゲンアクチベーター、MMP類、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、ケモカイン類またはId1/Id3。
脈管形成インヒビターは、限定なしに、例えば、次のような分子構造を包含する: VEGFR-1、Ang2、TSP-1、-2、アンギオスタチンおよび関係するプラスミノゲンクリングル類、エンドスタチン (コラーゲンXVIIフラグメント) 、バソスタチン、血小板因子4、TIMP類、MMPインヒビター、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、-β、-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、プロラクチン (M、16K) 、VBGI、SPARCのフラグメント、オステオポンチンフラグメントまたはマスピン (Carmeliet PおよびJain RK (2000) Nature 407: 249-257; Yancopoulos GD 他 (2000) Nature 407: 242-248; Bergers G. およびBenjamin LB (2002) Nature Reviews Cancer 3: 401-410; Hendrix MJC 他 (2002) Nature Reviews Cancer 3: 411-421) 。
好ましい態様において、脈管形成特異的結合性成分はED-BF、VEGFRまたはエンドグリンを包含する。それらのうちで、ED-BFは特に好ましい標的構造である。ED-BFはフィブロネクチンのスプライス変異型であり、また、胎児腫瘍フィブロネクチンと呼ばれ、これは脈管形成間に新しく増殖した微小脈管構造中で特異的に成形される。
これらの構造に結合する成分は、ペプチド (2〜50アミノ酸残基を有するアミノ酸連鎖) 、タンパク質 (50より多いアミノ酸残基を有するアミノ酸連鎖) 、核酸、小分子または糖であることが好ましい。
好ましいタンパク質またはペプチドはレセプターのリガンドであり、これらは下記において優先的または独占的に発現される: 微小転移および/またはほぼ血管化したまたは血管化する構造、特に脈管内皮増殖因子 (VEGF) およびヒト、ヒト化およびキメラ抗体を包含する抗体; フラグメントを含んでなる抗体結合ドメイン、例えば、Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2、Fabc、Facb; 一本鎖抗体、例えば、一本鎖Fvs (seFvs); およびダイアボディー (diabodies) 。
広範な種類のこのような抗体は文献に記載されてきており、そして下記を包含する: ED-BF L19およびE8 (参照: Viti F. 他 (1999) Cancer Res. 59: 347-352) 、EP 0344 134 B1に記載されているBC-1モノクローナル抗体 (これはthe European Collection of Animal Cultures、英国サリスブリー州ポートンダウンにNo. 88042101で受託されたハイブリドーマから得ることができる) またはそのキメラまたはヒト化バージョン、WO 97/45544 A1に開示されている特異的VLおよびVH配列をもつED-BFに対する抗体、WO 99/5857 A2に開示されている特異的VLおよびVH配列をもつED-BFに対する抗体、WO 01/62800 A1に開示されている特異的VLおよびVH配列をもつED-BFに対する抗体、およびAP38およびAP39 (Marty C. 他 (2001) Protein Expr. Purif. 21: 156-64) 。
ED-BFに対して特異的である抗体は、Ebbinghaus C 他 (2004) Current Pharm. Des. 10: 1537-49において概観されている。すべてのこれらの抗体またはそれらの抗体結合性フラグメントは、本発明の好ましい使用において脈管形成特異的結合性成分として使用することができる。特に好ましい抗体はL19、E8、AP38およびAP39またはそれらのフラグメントを含んでなる結合性ドメインである。
VEGF-Rに対する抗体は下記を包含する:ベバシズマブ ( Bevacizumab) (Genentech and Rocheにより開発されたAvastinTM、rhumAb-VEGF) 、抗VEGFR-1抗体mAb 6.12、完全なヒト抗VEGFR-2抗体IMC-2C6およびIMC-1121、完全な抗VEGFR-3抗体mAb HF4-3C5 (すべてはImclone System Inc.から) およびKM-2550 (Kyowa Hakko Kogyo Co. Ltd.) 、抗VEGFR-1抗体 (Salgaller ML (2003) Current Opinion in Molecular Therapeutics 5(6): 657-667) 。エンドグリンに対する抗体は下記を包含する: SN6h、SN6、SN6a、SN6j、P3D1、P4A4、44G4、GRE、E-9、CLE-4、RMAC8、PN-E2、MAEND3、TEC4、TEC11、A11、8E11。
クローンSN6hは免疫組織化学において異なる腫瘍実在物中のエンドグリンの発現を研究するために広範に使用されてきている (Wikstroem P. 他 (2002) The Prostate 51: 268-275; Li C. 他 (2003) Br. J. Cancer 88: 1424-1431; Sead R. S. 他 (2004) Modern Pathol. 17: 197-203) 。同一SN6系列のうちで、抗体SN6、SN6aおよびSN6jが記載された (She X. 他 (2004) Int. J. Cancer 108: 251-257) 。抗体クローンP3D1、P4A4、44G4、GRE、E-9、CLE-4、RMAC8、PN-E2、MAEND3、TEC4、TEC11について、エンドグリンの結合性エピトープが決定された (Pichuantes S. 他 (1997) Tissue antigens 50: 265-276) 。
これらの抗体および抗体クローンA11のいくつかについて、エンドグリンの異なる発現がヒト由来の正常組織および腫瘍組織について研究された (Duff S. 他 (2003) FASEB J. 17: 984-992) 。WO 02/02614には、それ以上のエンドグリン特異的抗体、例えば、scFv C4が開示されている。CD105に対する抗体に関する過去の刊行物の1つにおいて、クローン8E11が免疫組織化学において乳癌患者における転移の危険性の予測について研究された (Dales J. P. 他 (2004) Br. J. Cancer 90: 1216-1221) 。すべてのこれらの抗体またはそれらの抗体結合性フラグメントは、本発明の好ましい使用において脈管形成特異的結合性成分として使用することができる。
核酸は特異的結合性を有することができることはこの分野において知られており、こうして、脈管形成特異的結合性成分もまた核酸であることができる。好ましくは、このような核酸はDNA、RNA、アプタマーおよびPNAを包含し、ここでアプタマーは特に好ましい。特異的結合性アプタマーを同定する方法はこの分野においてよく知られており、そして例えば、下記の文献に開示されている: WO 93/24508 A1、WO 94/08050 A1、WO 95/07364 A1、WO 96/27605 A1およびWO 96/34875 A1。これらの文献に開示されている方法はここで詳しく言及され、そして本発明において使用可能な脈管形成特異的結合性アプタマーを同定するために使用できる。本発明の使用において用いる好ましいアプタマーは、ED-BF、エンドグリンまたはVEGFRを特異的に認識する。
1,000 g/molより小さい、好ましくは500 g/molより小さい分子量の小分子、すなわち、非ペプチド、非核酸化合物の高い処理量のスクリーニング法が出現し、特定の結合性をもつ小分子を同定することが可能となった。このような小分子は、本発明に従い使用可能な複合体の1成分として等しく使用できる。好ましい小分子は2,2-ジフェニルエチルアミンであり、これはED-BFに特異的結合することが同定された (Scheuermann J. 他 (2002) Isolation of biding molecules to the EDB domain of fibronectin, a marker of angiogenesis. Dissertation submitted to Swiss Federal Inst. of Technology, Zurich) 。
本発明の好ましい使用において、シアニン色素はカルボシアニン、ジカルボシアニンおよびトリカルボシアニンから成る群から選択される。本発明に従い使用可能なシアニン色素の合成はこの分野において知られている方法を使用して実施することができ、例えば、下記において例示されている: Hamer F. M. The Cyanine Dyes and Related Compounds, John Wiley and Sons, New York 1964; Ernst LA 他 (1989) Cytometry 10: 3-10; Southwick PL 他 (1990) Cytometry 11: 418-430; Lansdorp PM 他 (1991) Cytometry 12: 723-730; Mujumdor RB 他 (1993) Bioconjugate Chem. 4: 105-11; Mujumdor RB 他 (1996) Bioconjugate Chem. 7: 356-62; Flanagan JH 他 (1997) Bioconjugate Chem. 8: 751-56; Keil D 他 (1991) Dyes and Pigments 17: 19-27; Terpetschnig EおよびLakowicz JR 他 (1993) Dyes and Pigments 21: 227-34; Terpetschnig E 他 (1994) Anal. Biochem. 217: 197-204; Lindsey JS 他 (1989) Tetrahedron 45: 4845-66; Goerecki T 他 (1996) J. Heterocycl. Chem. 33: 1871-6; Narayanan NおよびPatonay G (1995) J. Org. Chem. 60: 2391-5、1995; およびTerpetschnig E 他 (1993) J. Fluoresc. 3: 153-155。追加のプロセスは下記の特許刊行物に記載されている: 米国特許第4,981,977号、米国特許第5,688,966号、米国特許第5,808,044号、EP 0 591 820 A1、WO 97/42976、WO 97/42978、WO 98/22146、WO 98/26077およびEP 0 800 831。
その上、置換基が変更されたインドトリカルボシアニンが合成され、生体分子に対してカップリングされた (例えば、下記の文献に記載されている: Becker A 他、Photochem. Photobiol. 72: 234、2000; Licha K 他、Bioconjugate Chem. 12: 44、2001; Becker A 他、Nature Biotechnol. 19: 327、2001; Bugaj JE 他、J. Biomed. Optics 6: 122、2001; Achilefu S 他、J. Mol. Chem. 45: 2003、2002) 。他の例は特に下記の刊行物に記載されている: WO 00/61194 (“Short-Chain Peptide Dye Conjugate as Contrast Agents for Optical Diagnostics”) 、WO 00/71162、WO 01/52746、WO 01/52743およびWO 01/62156。インドトリカルボシアニン色素を製造する他の方法は、4-置換ピリジンを介する簡単なアクセスである。種々の4-置換ピリジンをジンケ (Zincke) 反応 (Zincke-Koenig reaction、参照: Roempps Chemie Lexikon [Roempps Chemical Dictionary] 、第10版、p. 5007) により高い収率でメソ-置換グルタコンアルデヒド-ジアニリド転化にすることができ、これらのジアニリドはシアニン色素に対する前駆体である。
本発明の特に好ましい態様において、シアニン色素は下記一般式 (II) を有する化合物、ならびにこれらの化合物の薬学上許容される塩および溶媒和物である:
Figure 2008506747
式中Cは下記基 (III) または (IV) であり、
Figure 2008506747
式中、
星印で標識された位置は基Aとの結合点を意味し、そしてAは基 (V) 、(VI) 、(VII) 、(VIII) または (IX) であることができ、
Figure 2008506747
式中、
R1およびR2は、互いに独立して、C1-C4スルホアルキル鎖、例えば、スルホメチル、スルホエチル、n-スルホプロピル、i-スルホプロピル、スルホブチル、i-スルホブチル、s-スルホブチル、t-イソブチル; または飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖、例えば、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H25、C13H27、C14H29、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63であり、前記アルキル鎖は必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されているか、あるいは必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基で中断され、および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されることができ、
R3はBまたはBに結合したリンカーであり、ここでリンカーは20までの炭素残基をもつ分枝鎖状または直鎖状炭水化物鎖、特にメチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、t-ブチル、ペンチル、ヘキシル、ペンチル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシル、トリデシル、テトラデシル、ペンタデシル、ヘキサデシル、ヘプタデシル、オクタデシル、ノナデシル、エイコシルであり、前記鎖は1または2個以上の-OH、-COOHまたは-SO3基で置換されており、および/または必要に応じて-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH、-NHCO-、NHCSNH-、-SO2-、-PO4--、-アリール-および/または-NH-基で1または2回以上 (好ましくは2、3、4、5または6回) 中断されており、
R4は基-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1または-E1であり、ここで
E1およびE2は、互いに独立して、水素原子、C1-C4スルホアルキル鎖、例えば、スルホメチル、スルホエチル、n-スルホプロピル、i-スルホプロピル、スルホブチル、i-スルホブチル、s-スルホブチル、t-イソブチル; または飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖、例えば、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H25、C13H27、C14H29、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63であり、前記アルキル鎖は必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基で中断されており、および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されており、
R5は水素原子、またはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり、
bは数2または3であり、そして
XおよびYは、互いに独立して、O、S、=C(CH3)2または-(CH=CH)-である。
それ以上の特定の態様 (i) において、本発明に従い使用可能なシアニン色素は下記一般式 (X) を有する化合物、ならびにこれらの化合物の薬学上許容される塩および溶媒和物である:
Figure 2008506747
式中C’は下記基 (XI) または (XII) を表し、
Figure 2008506747
式中、
星印で標識された位置は基A’との結合点を意味し、そしてA’は基 (XIII) 、(XIV) 、(XV) 、(XVI) または (XVII) であることができ、
Figure 2008506747
ここで基 (XV) または (XVII) は必要に応じてC1-C4アルキル基、例えば、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、s-ブチル、t-ブチルで置換されることができ、
式中、
R1’はC1-C4スルホアルキル鎖、例えば、スルホメチル、スルホエチル、n-スルホプロピル、i-スルホプロピル、スルホブチル、i-スルホブチル、s-スルホブチル、t-イソブチル; 飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖、例えば、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H25、C13H27、C14H29、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63であり、前記アルキル鎖は必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基で置換されており、および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されることができるか、あるいは必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基で中断され、および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されることができる; またはM’-R6’であり、
R2’はC1-C4スルホアルキル鎖、例えば、スルホメチル、スルホエチル、n-スルホプロピル、i-スルホプロピル、スルホブチル、i-スルホブチル、s-スルホブチル、t-イソブチル; 飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖、例えば、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H25、C13H27、C14H29、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63であり、前記アルキル鎖は必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基で置換されており、および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されることができるか、あるいは必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基で中断され、および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されることができる; またはM’-R7’であり、
R3’、R4’、R6’およびR7’は、互いに独立して、基-COOE1’、-CONE1’E2’、-NHCOE1’、-NHCONHE1’、-NE1’E2’、-OE1’、-OSO3E1’、-SO3E1’、-SO2NHE1’または-E1’であり、ここで
E1’およびE2’は、互いに独立して、水素原子、C1-C4スルホアルキル鎖、例えば、スルホメチル、スルホエチル、n-スルホプロピル、i-スルホプロピル、スルホブチル、i-スルホブチル、s-スルホブチル、t-イソブチル、または飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖、例えば、CH3、C2H5、C3H7、C4H9、C5H11、C6H13、C7H15、C8H17、C9H19、C10H21、C11H23、C12H25、C13H27、C14H29、C15H31、C16H33、C17H35、C18H37、C19H39、C20H41、C21H43、C22H45、C23H47、C24H49、C25H51、C26H53、C27H55、C28H57、C29H59、C30H61、C31H63であり、前記アルキル鎖は必要に応じて0〜15個、例えば、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14または15個の酸素原子および/または0〜3個、例えば、1、2または3個のカルボニル基で中断されており、および/または0〜5個、例えば、1、2、3、4または5個のヒドロキシル基で置換されており、
M’はCH2-CH2またはCH2-CH2-CH2であり、
R5’はQ’-CH2-R8’であり、
Q’はC1-C5アルキル、例えば、メチル、エチル、n-プロピル、i-プロピル、ブチル、i-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1-ジメチルプロピル、ネオペンチル (ここでC原子は必要に応じてOまたはSで置換されている) または
Figure 2008506747
であり、
R8’は-CO-NH-R9’-R10’、-NH-CS-NH-R9’-R10’または-NH-CO-R9’-R10’であり、ここで
R9’は非分枝鎖状C2-C13アルキル、例えば、エチル、プロピル、ブチル、ペンチル、ヘキシル、オクチル、ノニル、デシル、ウンデシル、ドデシルおよびトリデシル (ここで1または2以上、例えば、1、2、3または4個のC原子は必要に応じてOまたはSで置換されている) から成る群から選択され、そして
R10’はBまたはBに結合しているカップリング成分の残留部分であり、
b’は数2または3であり、そして
X’およびY’は、互いに独立して、O、S、=C(CH3)2、=C(C2H5)2 、=C(C3H7)2、=C(isoC3H7)2、=C(C4H9)2または-(CH=CH)-である。
本発明に従い使用可能なシアニン色素のより好ましい態様 (ii) において、R5’、R8’、R9’、R10’、E1’、E2’、M’およびQ’は態様 (i) について上に概説した意味を有し、そして
A’は基 (XVI) または (XVII) であり、ここで基 (XVII) は必要に応じてパラ位置においてC1-C4アルキル基、メチル、エチル、プロピル、イソプロピル、i-ブチル、s-ブチルまたはt-ブチルで置換されることができ、
C’は基 (XII) であり、
R1’はM-R6’であり、
R2’はM-R7’であり、
R3’、R4’、R6’およびR7’は、互いに独立して、-SO3HまたはHであり、ただしR3’、R4’、R6’およびR7’の少なくとも3つは-SO3Hであり、
X’およびY’は、互いに独立して、O、S、=C(CH3)2、=C(C2H5)2 、=C(C3H7)2、=C(isoC3H7)2または=C(C4H9)2であり、そして
b’は3である。
本発明に従い使用可能なシアニン色素のより好ましい態様 (iii) において、C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R6’、R7’、R8’、R9’、R10’、E1’、E2’、X’、Y’およびb’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; またはR5’、R8’、R9’、R10’、E1’およびE2’は態様 (i) について上に概説した意味を有し、そしてC’、R1’、R2’、R3’、R4’、R6’、R7’、X’、Y’およびb’は態様 (ii) について上に概説した意味を有し、そして
A’は式 (XVI) の基であり、
M’はCH2-CH2であり、そして
Q’はC1-C5アルキルであり、ここでC原子は必要に応じてOまたはSで置換されている。
本発明に従い使用可能なシアニン色素のより好ましい態様 (iv) において、A’、C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R6’、R7’、R8’、R9’、R10’、E1’、E2’、M’、X’、Y’およびb’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; R5’、R8’、R9’、R10’、E1’、E2’およびM’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; そしてA’、C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R6’、R7’、E1’、E2’、X’、Y’およびb’は態様 (ii) について上に概説した意味を有し; C ’、R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R6’、R7’、R8’、R9’、R10’、E1’、E2’、X’、Y’およびb’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; そしてA’およびM’は態様 (iii) について上に概説した意味を有し; またはR5’、R6’、R8’、R9’、R10’、E1’およびE2’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; C ’、R1’、R2’、R3’、R4’、R6’、R7’、X’、Y’およびb’は態様 (ii) について上に概説した意味を有し; そしてA’およびM’は態様 (iii) について上に概説した意味を有し; そして
Q’はC1-C5アルキル、例えば、メチル、エチル、プロピル、i-プロピル、ブチル、i-ブチル、s-ブチル、t-ブチル、n-ペンチル、1-メチルブチル、2-メチルブチル、3-メチルブチル、1-ジメチルプロピル、ネオペンチルである。
本発明に従い使用可能なシアニン色素のより好ましい態様 (v) において、C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R6’、R7’、R8’、R9’、R10’、E1’、E2’、M’、X’、Y’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; そしてR5’、R8’、R9’、R10’、E1’、E2’およびM’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; C ’、R1’、R2’、R3’、R4’、R6’、R7’、X’およびY’は態様 (ii) について上に概説した意味を有し; そして
A’は式 (XVII) の基であり、
b’は3であり、そして
Q’は
Figure 2008506747
 である。
本発明に従い使用可能なシアニン色素のより好ましい態様 (vi) において、A’、C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R6’、R7’、R9’、R10’、E1’、E2’、M’、Q’、X’、Y’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; R5’、R9’、R10’、E1’、E2’、M’およびQ’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; そしてA’、C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R6’、R7’、X’、Y’およびb’は態様 (ii) について上に概説した意味を有し; C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R5’、R6’、R7’、R9’、R10’、E1’、E2’、X’、Y’およびb’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; そしてA’、M’およびQ’は態様 (iii) について上に概説した意味を有し; またはR5’、R6’、R9’、R10’、E1’およびE2’は態様 (i) について上に概説した意味を有し; C’、R1’、R2’、R3’、R4’、R6’、R7’、X’、Y’およびb’は態様 (ii) について上に概説した意味を有し; そしてA’、M’およびQ’は態様 (iii) について上に概説した意味を有し; そして
R8’はCO-BまたはNH-Bである。
本発明に従い使用できる、特に好ましいインドトリカルボシアニンは、式 (XVIII) 〜 (XXXVI) を有する色素から選択され、これらはBに対するカップリング前の色素の構造を示す下記表1〜表7に列挙されており、そして脈管形成特異的結合性成分を含有するチオール基に対するカップリングを促進するマレインイミド (マレイミド) またはブロモアセチルカップリング成分を含んでなる。生ずる複合体において、いくつかの態様におけるそれぞれのカップリング成分が脱離基である場合、それは存在しないか、あるいはその一部分のみがカップリング成分の残留部分と呼ぶ複合体中に残留するであろう。
Bに対するカップリング反応を実施するために、下に描写するマレインイミド (マレイミド) またはブロモアセチルカップリング成分の代わりに他の成分を下記の構造において置換することができることは当業者にとって明らかであろう。このような成分は、例えば、クロロアセチル、ヨードアセチル、クロロアセトアミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、クロロアルキル、ブロモアルキル、ヨードアルキル、ピリジルジサルファイドおよびビニルスルホンアミドを包含する。
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シアニン色素の中央においてR5’を介してBにカップリングしたシアニン色素は特にすぐれた量子効率を示し、そしていったん脈管形成特異的結合性成分にカップリングすると、驚くほど低い量子効率の減少を示すか、あるいは量子効率の減少を示さないことさえある。したがって、態様 (i) 〜 (vi) に従うシアニン色素および構造 (XVIII) 〜 (XXXVI) に従う特定のシアニン色素の使用は、本発明の関係において、特に好ましい。
それぞれのシアニン色素およびそれぞれの脈管形成特異的結合性成分をカップリングする適当な方法は、脈管形成特異的結合性成分の化学的特質に主として依存する。広範な種類の残基または基はこの分野において知られており、そしてこれらは天然に存在するか、あるいは種々の脈管形成特異的結合性成分の中に導入することができ、例えば、-NH2、-COOH、-SH、-OHおよびその他である。次いで、これらは基はシアニン色素に結合した基と共有結合を形成し、これらは2つの成分のカップリングを生ずる他の基に対して、すぐれた反応性を示す。もちろん、また、順序を逆転すること、すなわち、反応可能な基をシアニン色素に結合しかつ反応性基を脈管形成特異的結合性成分に結合することが可能である。この教示に基づいて、当業者はシアニン色素および脈管形成特異的結合性成分の各それぞれの対のために適当な反応性基および反応可能な基を選択することができる。
多数のタンパク質またはペプチドは、シアニン残基の、例えば、チオール基を含んでなるか、あるいはチオール基を含んでなるように変更することができる。したがって、本発明において使用する複合体が (a) 1種または2種以上のシアニン色素のペプチドまたはタンパク質を含んでなる場合、前述のシアニン色素はタンパク質またはペプチドに対するカップリング前にチオール基反応性カップリング成分を含んでなることが好ましい。チオール基反応性官能価はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、マレインイミド (マレイミド) 、クロロアセチル、ブロモアセチル、ヨードアセチル、クロロアセトアミド、ブロモアセトアミド、ヨードアセトアミド、クロロアルキル、ブロモアルキル、ヨードアルキル、ピリジルジサルファイドおよびビニルスルホアミドを含んでなる。こうして、好ましい態様において、上記態様におけるR3またはR10’はBに対する結合前にこのようなカップリング成分を表す。R3がBに対して結合したリンカーである場合、リンカーはカップリング前にこのようなカップリング成分を含んでなる。
カップリング反応間に完全に置換されない、例えば、カップリング反応における脱離基ではない、いくつかのカップリング成分について、カップリング成分の一部分はR3、リンカーまたはR10’に結合したままであることができる。この部分は、シアニン色素および脈管形成特異的結合性成分の連結部に止まることができ、「カップリング成分の残留部分」と呼ぶ。
薬学上許容される塩は、上に概説したシアニン化合物と無毒の塩を形成するかぎり、任意の塩であることができる。それらの例は次の通りである: 金属塩、例えば、ナトリウム塩、カリウム塩、アルカリ土類金属の塩、例えば、マグネシウム塩、カルシウム塩およびその他、有機アンモニウム塩、例えば、トリエチルアンモニウム塩、トリブチルアンモニウム塩、ピリジニウム塩およびその他、アミノ酸の塩、例えば、リシン塩、アルギニン塩およびその他。好ましい塩はナトリウム塩である。
好ましい態様において、小増殖性病変は次の通りである: 一次腫瘍; 前癌; 形成異常; 化成; 例えば、自己免疫疾患による炎症性病変、例えば、乾癬、乾癬性関節炎、慢性関節リウマチまたは感染症; 子宮内膜症; 微小病変、好ましくは皮膚の微小病変および/または脈管形成に関連する眼の疾患。本発明の好ましい使用において、1種または2種以上の複合体を上に示した疾患および/または微小転移のin vivo診断に使用する。
本発明の使用は日常的診断のために、すなわち、それぞれ示した疾患についてスクリーニングするために適用することができる。しかしながら、好ましい態様において、いったん疾患が、例えば、標準X線手順、例えば、マンモグラフィ、全身走査またはMRIで診断されると、複合体は使用される。次いで、患者をそれ以上の微小転移および/または1または2以上の小さい (追加の) 一次腫瘍について検査する。このような検査は、疾患の重症度、例えば、段階をよりよく評価して、最良の治療オプションを決定するために、および/または治療手順 (例えば、薬物、放射線または外科手術) の前、間および/または後に、実施することができる。
本発明の診断の使用は、治療手順前に実行する場合、例えば、微小転移が一次腫瘍付近に既に成形しているかどうかの決定を可能とし、こうして、一例として乳癌における腫瘤摘出またはむしろ乳房切断を適用するかどうかの決定を可能とする。治療後、本発明の診断の使用は、治療手順成功の評価の決定を可能とし、そして引き続く治療養生法、例えば、放射線または化学療法の決定を可能とする。外科的手順の間に使用するとき、例えば、一次腫瘍を取り囲む組織、例えば、リンパ節中の微小転移を検出することが可能である。この態様において、本発明の使用は手順間の腫瘍または微小転移の完全な除去を可能とする。
本発明に従う使用は、脈管形成開始に先行する事象、脈管形成の開始または脈管形成、すなわち、既に成形した微小脈管の検出を、それが非常に小さい組織構造において起こるときでさえ、可能とする。本発明の好ましい態様において、本発明に従い検出される、微小転移および/または小増殖性病変、特に微小転移、前癌、形成異常、化成、子宮内膜症および/または1種または2種以上の一次腫瘍は、10 mmより小さい、好ましくは8 mmより小さい、より好ましくは6 mmより小さい、より好ましくは5 mmより小さい、より好ましくは4 mmより小さい、3 mmより小さい、より好ましくは2 mmより小さい、最も好ましくは1 mmより小さい直径を有する。
本発明に従い検出可能である、微小転移および/または小増殖性病変、特に微小転移、前癌、形成異常、化成、炎症性病変、子宮内膜症および/または1種または2種以上の一次腫瘍の特に好ましい範囲は、約10 mm〜約0.1 mm、より好ましくは約10 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約8 mm〜約0.1 mm、より好ましくは約8 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約6 mm〜約0.1 mm、より好ましくは約6 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約5 mm〜約0.1 mm、より好ましくは約5 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約4 mm〜約0.1 mm、より好ましくは約4 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約3 mm〜約0.1 mm、より好ましくは約3 mm〜約0.2 mm、最も好ましくは約2 mm〜約0.2 mmである。
好ましくは、本発明の使用に従い検出される微小転移は、医原性微小転移、造血性微小転移、腔微小転移、管腔内微小転移、リンパ性転移、局所的微小転移および/または領域的微小転移である。
診断される微小転移は下記を包含するが、これらに限定されない一次腫瘍に由来することが好ましい: 胃腸管または結腸直腸管、肝臓、膵臓、腎臓、膀胱、前立腺、子宮内膜、卵巣、精巣の悪性腫瘍 (例えば、癌腫、肉腫) 、黒色腫、形成異常性口腔粘膜癌、侵襲性口腔癌、小細胞および非小細胞肺癌腫、乳房腫瘍、例えば、ホルモン依存性乳癌、ホルモン独立性乳癌; 転移性および扁平上皮細胞癌; 神経学的悪性疾患、例えば、神経芽細胞腫、神経膠腫、星状膠細胞腫、骨肉腫; 柔軟組織肉腫; 血管腫および内分泌学的腫瘍。本発明の使用に従い検出可能な小一次腫瘍は上に示した腫瘍の1つであることが好ましい。本発明の特に好ましい態様において、小一次腫瘍または微小転移は乳癌、特にホルモン依存性乳癌またはホルモン独立性乳癌である。
本発明の使用に従い検出可能な前癌は下記から成る群から選択されることが好ましい: 皮膚の前癌、特にアクチン角化症、皮膚角質、日射性口唇炎、タール角化症、砒素角化症、X線角化症、ボーエン病、ボーウェノイド (bowenoid) 丘疹症、悪性ほくろ、硬化性萎縮性苔癬および粘膜紅色苔癬; 消化管の前癌、特に紅板症、白斑症、バレット食道、プラマー-ビンソン症候群、脚の潰瘍、胃疾患性肥厚性巨人症、ボーダーライン癌腫、新形成性腸管ポリープ、直腸性ポリープ、ポーセレン胆嚢; 婦人科前癌、特に上皮腺管癌 (CDIS) 、頸部上皮内新形成 (CIN) 、白斑症、子宮内膜過形成 (等級III) 、陰門ジストロフィー、陰門上皮内新形成 (VIN) 、胞状奇胎; 泌尿器の前癌、特に膀胱乳頭腫、ケーラー紅色肥厚症、睾丸上皮内新形成 (TIN) 、白斑症; 上皮内癌 (CIS); 慢性炎症により引き起こされる前癌、特に膿皮症、骨髄症、集蔟性挫瘡、尋常性狼瘡およびフィステル。
形成異常はしばしば癌の兆候であり、そして主として上皮において見出される; それは非新形成性細胞増殖の最も不規則な形態であり、個々の細胞の均一性の喪失および細胞の構築的配向の喪失を包含する。しばしば、形成異常細胞は異常に大きく、濃く染色された核を有し、そして多形性+を示す。慢性的刺激または炎症が存在する場合、形成異常は特徴的に起こる。
本発明に従い診断できる形成異常性障害は下記を包含するが、これらに限定されない：無発汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺形成異常、大脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋形成異常、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋手根骨足根骨形成異常、頭蓋骨幹端形成異常、ぞうげ質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル形成異常、脳眼形成異常、腫骨肥大症、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性線維性顎形成異常、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、鮮紅色骨性形成異常、遺伝性腎-網膜形成異常、発汗性外胚葉性形成異常、低発汗性外胚葉性形成異常、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、下顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディニ (Mondini) 形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、骨牙形成異常、眼下顎形成異常、根突端セメント質形成異常、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔眼呼吸困難、脊椎骨端形成異常および心室撓骨形成異常。
化成は、成体または完全に分化した細胞の1つの型が成体細胞の他の型と置換する、制御された細胞増殖の1形態である。本発明の使用に従い検出可能な化成性障害は下記から成る群から選択されることが好ましい: 脈管形成性骨髄化生、アポクリン化成、異型化生自己実質化成、結合組織化成、上皮化成、腸管化成、化生性貧血、変形骨形成、化成性ポリープ、骨髄性化成、一次骨髄性化成、二次骨髄性化成、扁形化成、羊膜の扁形化成、症候性骨髄様化成および再生化成。
本発明の使用に従い検出可能な眼の疾患は下記から成る群から選択されることが好ましい: トラコーマ、未熟の網膜症、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内症および年齢に関係する黄斑変性。
炎症性病変は、限定されずに、免疫細胞、特にT細胞およびマスト細胞の浸潤、サイトカインの放出および細胞増殖を包含する多数の病理学的プロセスにより特徴づけられる。例えば、乾癬において、免疫細胞による破壊から逃がれることを試みてケラチノサイトが増殖し始めることが示され、これは新脈管形成が伴うプロセスである。理論により拘束されたくないが、この新脈管形成は本発明によるこのような小病変の検出を可能とすると本発明者らは考える。
本発明に従い検出可能な炎症性病変は、炎症性病変の形成、感染、機械的刺激およびその他によりしばしば特徴づけられる自己免疫疾患を包含する、多数の刺激または疾患に対して応答することができる。このような小さい炎症性病変を検出する能力を使用して、一方において、発現する炎症が検出可能である場合、影響を受けた領域をいっそう正確に描写することができるか、あるいは他方において、それぞれの疾患の古典的症候、例えば、乾癬または関節疼痛について赤色化および密閉および/または関節炎について四肢の変形がまだ検出できない、病期における炎症性疾患の発生の早期診断が可能である。
本発明の使用により診断できる小さい炎症性病変は、下記から成る群から選択される疾患または症状により引き起こされる病変であることが好ましい: 慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血性ショック、オステオポローシス、骨関節炎、神経疾患性疼痛、ウイルス感染症、ウイルス性心筋炎、細菌感染症、インスリン依存性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、歯周疾患、再狭窄、円形脱毛症、乾癬、乾癬性関節炎、急性膵臓炎、異系移植片拒絶反応、アレルギー、肺におけるアレルギー性炎症、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、悪液質、アルツハイマー病、発作、クローン病、炎症性腸疾患、虚血、鬱血性心不全、肺性線維症、肝炎、グリア芽細胞腫、ギヤン-バレー症候群および全身性エリテマトーデス。
子宮内膜症は、子宮腔外の子宮内膜組織の増殖により規定される婦人科学的疾患である。増殖する子宮内膜細胞は身体全体を通して分布することができ、そして子宮内膜病変は肺および他の器官において既に見出され、それに関して、子宮内膜病変の分布は微小転移の分布に類似する。本発明の使用の好ましい態様において、検出される子宮内膜病変、例えば、子宮内膜細胞クラスターは、血液原性細胞クラスター、腔細胞クラスター、管腔内細胞クラスター、リンパ性細胞クラスター、局所的細胞クラスターおよび/または領域的細胞クラスターである。
本発明の方法の感度のために、先行技術において検出されたものよりも非常に小さい子宮内膜病変を検出することが可能である。本発明により検出される子宮内膜病変は、10 mmより小さい、好ましくは8 mmより小さい、より好ましくは6 mmより小さい、より好ましくは5 mmより小さい、より好ましくは4 mmより小さい、3 mmより小さい、より好ましくは2 mmより小さい、最も好ましくは1 mmより小さい直径を有する。本発明の使用に従い検出可能である子宮内膜病変の特に好ましい範囲は、約10 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約8 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約6 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約5 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約4 mm〜約0.2 mm、より好ましくは約3 mm〜約0.2 mm、最も好ましくは約2 mm〜約0.2 mmである。
複合体の投与量は、究極的に診断すべき部位の検出を可能とするかぎり、特に限定されない。投与量は、使用すべき化合物の種類、年齢、体重および標的器官または組織およびその他に依存して適当に調節することができる。典型的には、投与量は0.002〜100 mg/kg体重、好ましくは0.005〜10 mg/kg体重、より好ましくは0.01〜2 mg/kg体重、最も好ましくは0.02〜1 mg/kg体重である。
本発明の蛍光映像法は既知の方法に従い実施され、そして投与すべき各複合体について、各パラメーター、例えば、検出すべき励起波長および蛍光波長を適当に決定して、最適な映像および解像度を達成することができる。複合体投与から蛍光映像法による測定までの消費時間は、複合体および投与標的に依存して変化する。例えば、複合体を腫瘍映像法に使用するとき、経過時間は典型的には投与後約2〜120時間の範囲、好ましくは投与後約2〜約10時間であろう。経過時間が短すぎると、蛍光は強すぎるので、脈管形成組織および非脈管形成組織を明瞭に区別することができない (低いSN比) 。蛍光映像法のための装置はこの分野においてよく知られており、そして、例えば、下記の文献に記載されている: EP 0 868 143、EP 1 146 811 A1、EP 1 408 824 A2、EP 1 409 995 A1およびE1 410 330 A2。
上に概説したように、本発明は、また、外科的手順に関連して使用することができ、したがって、外科用顕微鏡、顕微鏡、拡大鏡およびその他を使用して蛍光を検出することができる。このような装置は、オープン手順および内視鏡手順を包含する種々の外科的手順において使用することができる。また、癌の日常的スクリーニングのために普通に使用される装置および手順、例えば、結腸鏡検査および胃鏡検査と組合わせて本発明を使用するすることができる。
実施例１〜１６．マレイミド基を有するインドトリカルボシアニンの合成
実施例１．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(2-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝エチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XVIII)
Figure 2008506747
a) 1-(2-スルホナトエチル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸、内部塩
10 g (0.04モル) の2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸 (Bioconjugate Chem. 1993、4、105) 、6.8 g (0.04モル) の2-クロロエタンスルホン酸クロライドおよび4.2 g (0.04モル) のトリエチルアミンを200 mlのアセトニトリル中で6時間還流する。沈殿物を吸引し、乾燥する。収量5.0 g (理論値の35%) 。Anal. Biochem. 1994、217、197。
b) 3-ピリジン-4-イル-プロピオン酸t-ブチルエステル
50 mlのTHF中の20 g (89ミリモル) のt-ブチル-P,P-ジメチルホスホノアセテートを、0℃において250 mlのTHF中の3.9 g (98ミリモル) の水素化ナトリウム (鉱物油中の60%) の懸濁液に滴下する。0℃において1時間攪拌した後、50 mlのテトラヒドロフラン中の10 g (93ミリモル) のピリジン-4-カルボアルデヒドの溶液を滴下し、この反応混合物を0℃において1時間攪拌し、そして室温において18時間攪拌する。沈殿した固体を濾過により除去し、溶液を蒸発により濃縮する。残留物をイソプロパノール中に加熱しながら溶解し、不溶性部分を濾去し、溶液を0℃に冷却して結晶化させる。生成する固体を濾過し、ヘキサンとともに攪拌し、濾過し、乾燥する。中間生成物 (15.3 g) を150 mlのエタノール中で0.15 gの10%パラジウム/活性炭で6時間水素化する。触媒を濾去し、溶液を蒸発により濃縮し、残留物をシリカゲルで濾過する (移動溶媒 ジエチルエーテル) 。13.0 gの淡黄色油 (理論値の71%) が得られる。
c) 3-[2-(t-ブチルオキシカルボニル)エチル]グルタコンアルデヒド-ジアニリド-臭化水素酸塩
150 mlのジエチルエーテル中の10 g (48ミリモル) の3-ピリジン-4-イル-プロピオン酸t-ブチルエステルの溶液を8.9 g (96ミリモル) のアニリンと混合し、次いで0℃において2 mlのジエチルエーテル中の5.4 g (48ミリモル) のブロモシアノゲンの溶液と混合する。0℃において3時間攪拌した後、生成する赤色固体を濾過し、エーテルで洗浄し、真空乾燥する。収量: 20.3 g (理論値の92%) 。
d) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(2-カルボキシエチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
20 mlの酢酸無水物および5 mlの酢酸中の1.0 g (2.2ミリモル) の3-[2-(t-ブチルオキシカルボニル)エチル]グルタコンアルデヒド-ジアニリド-臭化水素酸塩 (実施例1c)) および1.5 g (4.4ミリモル) の1-(2-スルホナトエチル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸 (実施例1a)) の懸濁液を0.75 g (9.1ミリモル) の酢酸ナトリウムと混合し、120℃において1時間攪拌する。冷却後、それをジエチルエーテルと混合し、沈殿した固体を濾去し、クロマトグラフィー (RP-C18-シリカゲル、移動溶媒 水/メタノール) により精製し、生成物を凍結乾燥する (0.5 g) 。中間生成物を4 mlのジクロロメタン/1 mlのトリフルオロ酢酸中で1時間攪拌することによって、保護基を切断する。蒸発により濃縮し、クロマトグラフィー (RP-C18-シリカゲル、移動溶媒 水/メタノール) により精製した後、0.45 g (理論値の23%) の青色凍結乾燥物が得られる。
e) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(2-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝エチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
0.4 g (0.45ミリモル) の実施例1d) の標題化合物および45 mg (0.45ミリモル) のトリエチルアミンを10 mlのジメチルホルムアミド中に溶解し、0℃において0.15 g (0.45ミリモル) のTBTUと混合し、10分間攪拌する。次いで、0.5 mlのジメチルホルムアミド中の0.17 g (0.68ミリモル) のN-(2-アミノエチル)マレイミド-トリフルオロアセテート (Int. J. Pept. Protein Res. 1992、40、445) および68 mg (0.68ミリモル) のトリエチルアミンの溶液を添加し、それを室温において1時間攪拌する。10 mlのジエチルエーテルを添加した後、固体を遠心し、乾燥させ、クロマトグラフィー (RP C-18-シリカゲル、勾配 メタノール/水) により精製する。
収量: 0.30 gの青色凍結乾燥物 (理論値の65%) 。
元素分析:
計算値: C 47.24 H 4.26 N 5.51 S 12.61 Na 6.78
実測値: C 47.74 H 4.47 N 5.40 S 11.99 Na 7.02
実施例２．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(2-｛[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキシル]カルバモイル｝エチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XIX)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.4 g (0.45ミリモル) の実施例1d) の標題化合物および0.21 g (0.68ミリモル) のN-(6-アミノヘキシル)マレイミド-トリフルオロアセテート (Int. J. Pept. Protein Res. 1992、40、445) から実施する。収量: 0.38 gの青色凍結乾燥物 (理論値の81%) 。
元素分析:
計算値: C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
実測値: C 48.96 H 4.92 N 5.32 S 11.88 Na 6.56
実施例３．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(2-｛[13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10-トリオキサトリデシル]カルバモイル｝エチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XX)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.4 g (0.45ミリモル) の実施例1d) の標題化合物および0.28g (0.68ミリモル) のN-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデシル)マレイミド-トリフルオロアセテート (Int. J. Pept. Protein Res. 1992、40、445) から実施する。収量: 0.27 gの青色凍結乾燥物 (理論値の51%) 。
元素分析:
計算値: C 48.97 H 5.05 N 4.76 S 10.89 Na 5.86
実測値: C 49.22 H 5.16 N 4.62 S 10.67 Na 5.66
実施例４．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(4-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝ブチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXI)
Figure 2008506747
a) (3-t-ブトキシカルボニル-プロピル)-トリフェニル-ホスホニウムブロミド
50 g (0.30ミリモル) の4-ブロモ酪酸を400 mlのTHF中で-40℃において187 g (0.89モル) のトリフルオロ酢酸無水物と滴々混合する。-40℃において30分間攪拌した後、400 mlのt-ブタノール/30 mlのTHFを1時間以内に滴下する。室温において16時間攪拌した後、この反応混合物を氷冷炭酸ナトリウム溶液上に注ぎ、水性相をジエチルエーテルで3回抽出し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発により濃縮する。残留物を真空蒸留する (沸点72℃/0.9ミリバール; 収量: 41 g) 。250 mlのアセトニトリル中で41 g (0.18 モル) の中間生成物、44.6 g (0.17モル) のトリフェニルホスフィンおよび32.5 g (0.36モル) の重炭酸ナトリウムを20時間還流加熱することによって、ホスホニウム塩を形成する反応を実施する。この反応混合物を濾過し、蒸発により濃縮し、残留物をジエチルエーテルとともに攪拌することによって、結晶化させる。収量: 58.5 g (4-ブロモ酪酸に関して、理論値の40%) の白色固体。
b) 5-ピリジン-4-イル-ペンタン酸-t-ブチルエステル
100 mlの無水THF中の14 g (28ミリモル) の (3-t-ブトキシカルボニル-プロピル)-トリフェニル-ホスホニウムブロミド (実施例4a)) の溶液を-40℃において無空気環境中で17.5 ml (28ミリモル) のブチルリチウム (ヘキサン中の1.6 M) と20分以内に混合し、-40℃において1時間攪拌する。20 mlのTHF中の2.78 g (26ミリモル) の4-ピリジンカルボアルデヒドの溶液を滴下し、室温において16時間攪拌し、次いで氷水上に注ぎ、水性相をジエチルエーテルで3回抽出し、有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発により濃縮する。クロマトグラフィー精製 (シリカゲル、移動溶媒 ヘキサン/酢酸エチル) 後、生成物がE,Z-混合物 (1H-NMR後4:1; 5.0 g) として得られる。二重結合を水素化するために、中間生成物を200 mlのメタノール中に溶解し、100 mgのPtO2触媒と水素下に室温において攪拌する。濾過し、蒸発により濃縮した後、黄色油が得られる。収量: 4.9 g (理論値の74%) 。
c) 3-[4-(t-ブトキシカルボニル)ブチル]グルタコンアルデヒド-ジアニリド-臭化水素酸塩
35 mlのジエチルエーテル中の4.0 g (17ミリモル) の5-ピリジン-4-イル-ペンタン酸-t-ブチルエステルの溶液を3.2 g (34ミリモル) のアニリンと混合し、次いで0℃において8 mlのジエチルエーテル中の1.9 g (17ミリモル) のブロモシアノゲンの溶液と混合する。0℃において3時間攪拌した後、生成する赤色固体を濾過し、エーテルで洗浄し、真空乾燥する。収量: 7.8 g (理論値の95%) 。
d) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(4-カルボキシブチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
合成を実施例1d) におけるように実施例4c) の標題化合物 (2.5ミリモル) および1-(2-スルホナトエチル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸 (5ミリモル) から実施する。収量: 0.85 g (理論値の37%) の青色凍結乾燥物。
e) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(4-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝ブチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
合成を実施例1e) におけるように0.4 g (0.43ミリモル) の実施例4d) の標題化合物から実施する。収量: 0.31 g (理論値の69%) の青色凍結乾燥物。
元素分析:
計算値: C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
実測値: C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81
実施例５．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(4-｛[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキシル]カルバモイル｝ブチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXII)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.4 g (0.43ミリモル) の実施例4d) の標題化合物および0.20g (0.66ミリモル) のN-(6-アミノヘキシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。収量: 0.35 gの青色凍結乾燥物 (理論値の74%) 。
元素分析:
計算値: C 50.17 H 5.03 N 5.09 S 11.65 Na 6.26
実測値: C 49.83 H 4.89 N 5.34 S 12.05 Na 6.42
実施例６．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(4-｛[13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10-トリオキシトリデシル]カルバモイル｝ブチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXIII)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.4 g (0.43ミリモル) の実施例1d) の標題化合物および0.30g (0.72ミリモル) のN-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。収量: 0.27 gの青色凍結乾燥物 (理論値の52%) 。
元素分析:
計算値: C 49.83 H 5.27 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
実測値: C 49.45 H 5.19 N 4.66 S 10.85 Na 5.80
実施例７．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝ヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXIV)
Figure 2008506747
a) (3-t-ブトキシカルボニル-ペンチル)-トリフェニル-ホスホニウムブロミド
製造を実施例4a) に記載するように実施し、ここで中間生成物6-ブロモヘキサン酸-t−ブチルエステルを粗生成物として反応させる。50 gの6-ブロモヘキサン酸から、79 gの生成物 (理論値の69%) が粘性無色油として得られる。
b) 7-ピリジン-4-イル-ヘプタン酸-t-ブチルエステル
製造を実施例4b) に記載するように実施する。25 g (48.7ミリモル) の (3-t-ブトキシカルボニル-ペンチル)-トリフェニル-ホスホニウムブロミド (実施例7a) から、7.5 gの7-ピリジン-4-イル-ヘプタン酸-t-ブチルエステル (理論値の65%) が黄色油状物として得られる。
c) 3-[6-(t-ブチルオキシカルボニル)ヘキシル]グルタコンアルデヒド-ジアニリド-臭化水素酸塩
30 mlのジエチルエーテル中の5.0 g (19ミリモル) の7-ピリジン-4-イル-ヘプタン酸-t-ブチルエステルの溶液を3.6 g (38ミリモル) のアニリンと混合し、次いで0℃において5 mlのジエチルエーテル中の2.1 g (19ミリモル) のブロモシアノゲンの溶液と混合する。0℃において2.5時間攪拌した後、生成する赤色固体を濾過し、エーテルで洗浄し、真空乾燥する。収量: 8.9 g (理論値の91%) 。
d) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-カルボキシヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
合成を実施例1d) におけるように実施例7c) の標題化合物 (3ミリモル) および1-(2-スルホナトエチル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸 (6ミリモル) から実施する。収量: 1.5 g (理論値の54%) の青色凍結乾燥物。
e) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝ヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
合成を実施例1e) におけるように0.4 g (0.43ミリモル) の実施例7d) の標題化合物から実施する。収量: 0.31 g (理論値の69%) の青色凍結乾燥物。
元素分析:
計算値: C 49.25 H 4.79 N 5.22 S 11.95 Na 6.43
実測値: C 48.98 H 4.86 N 5.12 S 11.76 Na 6.77
実施例８．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-｛[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキシル]カルバモイル｝ヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXV)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.5 g (0.53ミリモル) の実施例7d) の標題化合物および0.23g (0.75ミリモル) のN-(6-アミノヘキシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。収量: 0.42 gの青色凍結乾燥物 (理論値の70%)。
元素分析:
計算値: C 51.05 H 5.27 N 4.96 S 11.36 Na 6.11
実測値: C 50.74 H 5.55 N 4.76 S 11.38 Na 6.35
実施例９．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-｛[13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10-トリオキシトリデシル]カルバモイル｝ヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXVI)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.5 g (0.53ミリモル) の実施例7d) の標題化合物および0.44g (1.06ミリモル) のN-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。収量: 0.24 gの青色凍結乾燥物 (理論値の37%) 。
元素分析:
計算値: C 50.64 H 5.48 N 4.54 S 10.40 Na 5.59
実測値: C 50.30 H 5.56 N 4.34 S 10.15 Na 5.73
実施例１０．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(5-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝-3-オキサ-ペンチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXVII)
Figure 2008506747
a) 3-オキサ-6-(4-ピリジニル)ヘキサン酸-t-ブチルエステル
400 mlのトルエン/50 mlのTHF中の75g (0.4ミリモル) の3-(4-ピリジニル)-1-プロパノールの溶液を、10 gのテトラブチルアンモニウムサルフェートおよび350 mlの32%水酸化ナトリウム溶液と混合する。次いで、123 g (0.68モル) のブロモ酢酸-t-ブチルエステルを滴下し、室温において18時間攪拌する。有機相を分離し、水性相をジエチルエーテルで3回抽出する。一緒にした有機相をNaCl溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、蒸発により濃縮する。クロマトグラフィー精製 (シリカゲル、移動溶媒 ヘキサン/酢酸エチル) 後、56 gの生成物 (理論値の41%) が褐色油として得られる。
b) 3-[4-オキサ-5-(t-ブトキシカルボニル)ペンチル]グルタコンアルデヒド-ジアニリド-臭化水素酸塩
60 mlのジエチルエーテル中の5.0 g (20ミリモル) の3-オキサ-6-(4-ピリジニル)ヘキサン酸-t-ブチルエステルの溶液を3.7 g (40ミリモル) のアニリンと混合し、次いで0℃において8 mlのジエチルエーテル中の2.2 g (20ミリモル) のブロモシアノゲンの溶液と混合する。0℃において1時間攪拌した後、生成する赤色固体を濾過し、エーテルで洗浄し、真空乾燥する。収量: 8.5 g (理論値の85%) の紫色固体。
c) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-カルボキシ-4-オキサヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
50 mlの酢酸無水物および10 mlの酢酸中の3.0 g (6ミリモル) の3-[2-(t-ブチルオキシカルボニル)エチル]グルタコンアルデヒド-ジアニリド-臭化水素酸塩 (実施例10b)) および4.2 g (12ミリモル) の1-(2-スルホナトエチル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸 (実施例1a)) の懸濁液を2.5 g (30ミリモル) の酢酸ナトリウムと混合し、120℃において50分間攪拌する。冷却後、それをジエチルエーテルと混合し、沈殿した固体を濾過し、アセトン中で吸収的に沈殿させ、高真空下に乾燥させる。クロマトグラフィー (RP-C18-シリカゲル、移動溶媒 水/メタノール) により精製し、メタノールを真空除去し、標題化合物が直ちに得られる。収量: 2.3 g (理論値の41%) の青色凍結乾燥物。
d) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(5-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝-3-オキサ-ペンチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
合成を実施例1c) におけるように1.0 g (1.1ミリモル) の実施例10c) の標題化合物から実施する。収量: 0.85 g (理論値の73%) の青色凍結乾燥物。
元素分析:
計算値: C 47.54 H 4.46 N 5.28 S 12.09 Na 6.50
実測値: C 47.97 H 4.65 N 5.10 S 12.02 Na 6.68
実施例１１．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(5-｛[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキシル]カルバモイル｝-3-オキサ-ペンチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (XXVIII)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.5 g (0.55ミリモル) の実施例10c) の標題化合物および0.23g (0.75ミリモル) のN-(6-アミノヘキシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。収量: 0.42 gの青色凍結乾燥物 (理論値の68%) 。
元素分析:
計算値: C 49.46 H 4.96 N 5.01 S 11.48 Na 6.17
実測値: C 48.95 H 5.21 N 5.22 S 11.23 Na 6.60
実施例１２．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(5-｛[13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10-トリオキシトリデシル]カルバモイル｝-4-オキサペンチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXIX)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.5 g (0.55ミリモル) の実施例10c) の標題化合物および0.46g (1.06ミリモル) のN-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。収量: 0.34 gの青色凍結乾燥物 (理論値の56%) 。
元素分析:
計算値: C 49.17 H 5.20 N 4.59 S 10.50 Na 5.65
実測値: C 49.34 H 5.32 N 4.45 S 10.28 Na 5.56
実施例１３．3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]ビニレン｝-2-[4-(2-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝エチル)-フェノキシ]シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXX)
Figure 2008506747
a) 3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]ビニレン｝-2-クロロ-シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
5.0 g (14.4ミリモル) の1-(2-スルホナトエチル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸 (実施例1a)) および2.6 g (7.2ミリモル) のN-[(3-(アニリノメチレン)-2-クロロ-1-シクロヘキセン-1-イル)メチレン]アニリン塩酸塩 (Aldrich Company) を100 mlのメタノール中で2.5 g (30ミリモル) の無水酢酸ナトリウムと一緒に1時間還流させ、冷却し、150 mlのジエチルエーテルと混合し、一夜攪拌する。沈殿物を吸引濾過し、乾燥させ、クロマトグラフィー (シリカゲル、勾配 ジクロロメタン/メタノール) により精製する。収量: 3.8 g (理論値の58%) の青色固体。
b) 3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル] ビニレン｝-2-[4-(2-カルボキシエチル)フェノキシ]シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
30 mlのジメチルホルムアミド中の0.37 g (2.2ミリモル) の3-(4-ヒドロキシフェニル)プロピオン酸を0.18 g (4.5ミリモル) の水素化ナトリウム (60%鉱物油分散液) と混合する。室温において30分間攪拌した後、それを0℃に冷却し、100 mlのジメチルホルムアミド中の2.0 g (2.2ミリモル) の実施例12a) の標題化合物の溶液を滴下し、室温において2時間攪拌する。この混合物をドライアイスで急冷し、溶媒を真空除去する。残留物をメタノール中に溶解し、200 mlのエーテルとともに攪拌し、沈殿した固体を濾去する。クロマトグラフィー精製を実施する (シリカゲル、勾配 酢酸エチル/メタノール) 。収量: 1.9 gの青色固体 (理論値の83%) 。
c) 3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル] ビニレン｝-2-[4-(2-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝エチル)-フェノキシ]シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
0.1 mg (0.10ミリモル) の実施例12b) の標題化合物を実施例1e) におけるようにTBTUおよびN-(2-アミノエチル)マレイミド-トリフルオロアセテートとトリエチルアミンの存在下に反応させ、得られた生成物をクロマトグラフィーにより精製する。収量: 93 mgの青色凍結乾燥物 (理論値の81%) 。
元素分析:
計算値: C 51.21 H 4.47 N 4.88 S 11.16 Na 6.00
実測値: C 51.50 H 4.55 N 4.95 S 10.93 Na 6.15
実施例１４．3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]ビニレン｝-2-[4-(2-｛[6-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)ヘキシル]カルバモイル｝エチル)-フェノキシ]シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXXI)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.7 g (0.68ミリモル) の実施例14a) の標題化合物および0.53g (1.22ミリモル) のN-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。収量: 0.56 gの青色凍結乾燥物 (理論値の68%) 。
元素分析:
計算値: C 48.27 H 4.53 N 5.36 S 12.27 Na 6.60
実測値: C 48.01 H 4.44 N 5.56 S 12.10 Na 6.81
実施例１５．3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]ビニレン｝-2-[4-(2-｛[13-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)-4,7,10-トリオキサトリデシル]カルバモイル｝エチル)フェノキシ]シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXXII)
Figure 2008506747
合成を実施例1e) におけるように0.7 g (0.68ミリモル) の実施例14a) の標題化合物および0.59g (1.36ミリモル) のN-(13-アミノ-4,7,10-トリオキサトリデシル)マレイミド-トリフルオロアセテートから実施する。クロマトグラフィー精製を2回実施する。収量: 0.67 gの青色凍結乾燥物 (理論値の75%) 。
元素分析:
計算値: C 52.29 H 5.16 N 4.28 S 9.79 Na 5.27
実測値: C 51.88 H 5.40 N 4.34 S 9.53 Na 5.68
実施例１６．3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]ビニレン｝-2-[4-(2-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝エチル)-フェノキシ]-5-t-ブチル-シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXXIII)
Figure 2008506747
a) N-[(3-(アニリノメチレン)-2-クロロ-5-t-ブチル-1-シクロヘキセン-1-イル)メチレン]アニリン塩酸塩
6.7 ml (73.4ミリモル) のオキシ塩化リンを0℃において8 mlのジメチルホルムアミドに滴下する。次いで、30 mlのジクロロメタン中の5.0 g (32.4ミリモル) の4-t-ブチルシクロヘキサノンの溶液に滴下し、反応混合物を還流下に3時間攪拌する。0℃に冷却後、5.5 mlのエタノール中の6 g (64.8ミリモル) のアニリンをゆっくり滴下し、この混合物を200 gの氷上に注ぎ、5 mlの濃塩酸を攪拌しながら添加する。沈殿した固体を濾過し、エーテルで洗浄し、乾燥する。収量: 6.8 g (理論値の50%) の赤色固体。
b) 3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル] ビニレン｝-2-クロロ-5-t-ブチルシクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
5.0 g (14.4ミリモル) の1-(2-スルホナトエチル)-2,3,3-トリメチル-3H-インドレニン-5-スルホン酸 (実施例1a)) および3.0 g (7.2ミリモル) のN-[(3-(アニリノメチレン)-2-クロロ-5-t-ブチル-1-シクロヘキセン-1-イル)メチレン]アニリン塩酸塩 (実施例16a)) を100 mlのメタノール中の2.5 g (30ミリモル) の無水酢酸ナトリウムと一緒に1.5時間還流させ、冷却し、200 mlのジエチルエーテルと混合し、一夜攪拌する。沈殿物を吸引濾過し、乾燥させ、クロマトグラフィーにより精製する (シリカゲル、勾配: ジクロロメタン/メタノール) 。収量: 4.7 g (理論値の68%) の青色固体。
c) 3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル] ビニレン｝-2-[4-(2-カルボキシエチル)フェノキシ]-5-t-ブチルシクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
この反応は実施例13b) に記載するように2.0 g (2.1ミリモル) の実施例16b) の標題化合物から実施する。収量: 1.5g (理論値の66%) 。
d) 3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル] ビニレン｝-2-[4-(2-｛[2-(2,5-ジオキソ-2,5-ジヒドロ-1H-ピロール-1-イル)エチル]カルバモイル｝エチル)-フェノキシ]-5-t-ブチル-シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
この反応は実施例13c) に記載するように1.0 g (0.92ミリモル) の実施例16c) の標題化合物から実施する。クロマトグラフィー (RP-C18-シリカゲル、移動溶媒 アセトニトリル/水) による精製を2回実施する。収量: 0.24g (理論値の22%) 。
元素分析:
計算値: C 52.82 H 4.93 N 4.65 S 10.64 Na 5.72
実測値: C 52.23 H 5.20 N 4.31 S 10.30 Na 6.15
実施例１７〜１９．ブロモアセチルアミド基を有するインドトリカルボシアニン色素の合成
実施例１７．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(5-｛[6-(ブロモアセチルアミノ)ヘキシル]カルバモイル｝-4-オキサペンチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXXIV)
Figure 2008506747
a) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(5-｛[6-(アミノヘキシル)カルバモイル｝-4-オキサペンチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
合成を実施例1e) におけるように0.5 g (0.55ミリモル) の実施例10c) の標題化合物および0.15 g (0.70ミリモル) のN-boc-ヘキサンジアミン (Fluka) から実施する。反応生成物をクロマトグラフィー (RP C18-クロマトグラフィー、移動溶媒 メタノール/水) により精製し、凍結乾燥後、それを2 mlのトリフルオロ酢酸/8 mlのジクロロメタン中で氷冷しながら15分間攪拌する。真空中で回転した後、残留物をメタノール中に溶解し、ジエチルエーテルで沈殿させ、単離する。収量: 0.26 gの青色固体 (理論値の41%) 。
b) 3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(5-｛[6-(ブロモアセチルアミノ)ヘキシル]カルバモイル｝-4-オキサペンチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩
0.26 g (0.23ミリモル) の実施例18a) の標題化合物を5 mlのジメチルホルムアミド中で-20℃に冷却し、28 mg (0.28ミリモル) のトリエチルアミンおよび0.2 mlのジメチルホルムアミド中の0.10 g (0.46ミリモル) の臭化ブロモアセチルの溶液と混合する。最高0℃において5時間攪拌した後、生成物をジエチルエーテルの添加により沈殿させ、ジメチルホルムアミド/ジエチルエーテルから再沈殿させ、引き続いて乾燥させると、生成物が得られる。収量: 0.23 g (理論値の86%) の青色固体。
元素分析:
計算値: C 45.63 H 4.87 N 4.84 S 11.07 Na 5.96
実測値: C 45.13 H 4.66 N 4.67 S 10.83 Na 測定せず。
実施例１８．3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(3-｛[3-(ブロモアセチルアミノ)プロピル]カルバモイル｝-エチル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXXV)
Figure 2008506747
合成は実施例17におけるように実施例1d) の標題化合物 (0.5 g; 0.56ミリモル) およびN-boc-プロピレンジアミンから出発して実施する。すべての段階にわたる収量: 0.22 g (理論値の37%) 。
元素分析:
計算値: C 43.70 H 4.33 N 5.23 S 11.96 Na 6.43
実測値: C 43.21 H 4.14 N 5.53 S 10.89 Na 測定せず。
実施例１９．3,3-ジメチル-2-[2-(1-｛[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]ビニレン｝-2-[4-(2-｛[3-(ブロモアセチルアミノ)プロピル]カルバモイル｝-エチル)-フェノキシ]シクロヘキシ-1-エン-3-イリデン)エチリデン]-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (式XXXVI)
Figure 2008506747
合成は実施例17におけるように実施例13b) の標題化合物 (0.5 g; 0.49ミリモル) およびN-boc-プロピレンジアミンから出発して実施する。すべての段階にわたる収量: 0.31 g (理論値の53%) 。
元素分析:
計算値: C 47.88 H 4.52 N 4.65 S 10.65 Na 5.73
実測値: C 48.04 H 4.43 N 4.69 S 10.72 Na 5.84
実施例２０〜２３．生体分子との複合体の合成および複合体の光物理学的特性決定
実施例２０．実施例1〜16の標題化合物によるBSA (ウシ血清アルブミン) の標識化
一般的序論: 5 mlのリン酸塩緩衝液 (0.1 M Na2HPO4/NaH2PO4、pH 6.8) 中の5 mg (0.074μmol) のBSA (Sigma Company) の溶液を各場合において0.74μmolの実施例1〜16の標題化合物 (PBS中の0.5 mg/mlの貯蔵溶液) と混合し、25℃において30分間インキュベートする。複合体の精製はゲルクロマトグラフィー (カラム: Sephadex G50、直径 1.5 cm、Pharmacia、溶離液: PBS) により実施する。
実施例２１．実施例17〜19の標題化合物によるBSA (ウシ血清アルブミン) の標識化
一般的序論: 5 mlのリン酸塩緩衝液 (0.1 M ホウ酸塩緩衝液、pH 8.5) 中の5 mg (0.074μmol) のBSA (Sigma Company) の溶液を各場合において1.10μmolの実施例17〜19の標題化合物 (PBS中の0.5 mg/mlの貯蔵溶液) と混合し、25℃において5時間インキュベートする。複合体の精製はゲルクロマトグラフィー (カラム: Sephadex G50、直径 1.5 cm、Pharmacia、溶離液: PBS) により実施する。
実施例２２．実施例1〜16の標題化合物による抗ED-B-フィブロネクチンscFv抗体AP39 (一本鎖フラグメント) の標識化
AP39はC-末端システインを有するscFvであり、そして分子量約56,000g/molの共有結合S-S二量体として存在する (Curr. Opin. Drug Discov. Devel. 2002 Mar; 5(2): 204-13) 。ジサルファイド架橋の還元により、アクセス可能なSH基を有する2つのモノマーが製造される (分子量28,000 g/mol) 。
一般的序論: 0.3 ml のPBS中のAP39の溶液 (濃度0.93 mgの二量体/ml)を60μl のPBS中のトリス(カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP) の溶液 (2.8 mg/ml) と混合し、25℃において1時間インキュベートする。過剰のTCEPをNAP-5カラムのゲル濾過 (溶離液: PBS) により分離する。得られるAP39の量 (OD280nm = 1.4) は、測光により決定して、230〜250μg (容積0.5〜0.6 ml) である。この溶液を0.03μmolの実施例1〜16の標題化合物 (PBS中の0.5 mg/mlの貯蔵溶液) と混合し、25℃において30分間インキュベートする。この複合体をNAP-5カラムのゲルクロマトグラフィー (溶離液: PBS/10%グリセロール) により精製する。この複合体溶液の免疫反応性をアフィニティークロマトグラフィーにより測定する (ED-B-フィブロネクチン樹脂) (J. Immunol. Methods 1999、231、239) 。得られた複合体の免疫反応性は>80%であった (複合化前のAP39 >95%) 。
実施例２３．実施例17〜19の標題化合物による抗ED-B-フィブロネクチンscFv抗体AP39 (一本鎖フラグメント) の標識化
一般的序論: 0.3 ml のPBS中のAP39の溶液 (濃度0.93 mgの二量体/ml)を60μl のPBS中のトリス(カルボキシエチル)ホスフィン (TCEP) の溶液 (2.8 mg/ml) と混合し、25℃において1時間インキュベートする。過剰のTCEPをNAP-5カラムのゲル濾過 (溶離液: 50mmolのホウ酸塩緩衝液pH 8.5) により分離する。得られるAP39の量 (OD280nm = 1.4) は、測光により決定して、230〜250μg (容積0.5〜0.6 ml) である。この溶液を0.06μmolの実施例17〜19の標題化合物 (PBS中の0.5 mg/mlの貯蔵溶液) と混合し、25℃において4時間インキュベートする。この複合体をNAP-5カラムのゲルクロマトグラフィー (溶離液: PBS/10%グリセロール) により精製する。この複合体溶液の免疫反応性をアフィニティークロマトグラフィーにより測定する (ED-B-フィブロネクチン樹脂) (J. Immunol. Methods 1999、231、239) 。得られた複合体の免疫反応性は>75%であった (複合化前のAP39 >95%) 。
実施例２４．異なる色素構造およびAP39に対する標的特異的複合体の光物理学的性質および免疫反応性 (ELISA)
生体分子の負荷の程度 (色素/生体分子のモル比) を測光により決定し、そしてこれは短波吸収肩 (約690〜710 nm) における75,000 L/mol/cmの吸光係数に基づく; OD280nm = 1.4の抗体吸収 (抗CD105 IgG) を計算に使用する。ヨードシアニングリーンに関するSPEXフルオロログ (波長依存性感度について目盛り定めしたランプおよび検出器) を使用して、蛍光量子効率を決定する (DMSO中のQ = 0.12、J. Chem. Eng. Data 1977、22、379、Bioconjugate Chem. 2002、12、44) 。
ELISAにより免疫反応性を測定した。免疫反応性は、実施例1〜19の試料色素との複合化前の非標識化生体分子AP39に関して、標的 (ED-B-フィブロネクチン) に対して結合する生体分子の百分率 (%) を記載する。結果を下記表8に要約する。
Figure 2008506747
実施例２５．色素による抗CD105-抗体 (抗エンドグリンIgG) の標識化および光物理学的性質の決定
この実施例において、標的CD105 (エンドグリン) に対して向けられた異なる生体分子の型 (完全な大きさのIgG抗体) を記載する。
色素の合成: 抗体に対する複合化に使用する色素は、3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-カルボキシ-4-オキサヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (実施例10c) である。この色素をジメチルホルムアミド中で5当量のN-ヒドロキシスクシンイミジル、4当量のN,N’-ジシクロヘキシルカーボジイミドと室温において5時間反応させることによって、対応するN-ヒドロキシスクシニミジルエステルに転化した。ジエチルエーテルで沈殿させた後、粗製色素を抗CD105-抗体との複合化に直接使用した。
標識化反応: 1 mlのリン酸塩緩衝液 (pH 7.4) 中の抗体抗CD105 IgG溶液 (濃度 1 mg/ml) を0.17μlの前述のN-ヒドロキシスクシニミジルエステル (蒸留水中の貯蔵溶液0.2 mg/ml) で処理し、25℃において5時間インキュベートする。ゲル濾過 (すぐに使用できる脱塩カラムNAP10、溶離液: PBS) により精製し、10μmol/lの色素濃度/1.4μmol/lの抗体濃度の溶液が得られる。
物理化学的性質を前述したように測定し、下記表9に示す。
Figure 2008506747
実施例２６．Capan-1腫瘍を有するヌードマウスにおける微小転移の映像法
培養においてサブコンフルエントに増殖させたCapan-1腫瘍細胞をトリプシン処理し、遠心し、PBS中に再懸濁させた。トリパンブルーで染色し、細胞濃度を計算した後、細胞懸濁液を3×107/mlに設定した。細胞懸濁液を使用するまで氷冷した。3匹の雌ヌードマウス (NMRI-ヌード、24〜25 gの体重) を麻酔し、腹部切開後、30μl (1×106 細胞/動物) の細胞懸濁液を各動物の膵臓中の被膜下に接種した。各動物に0.05μmol/kg体重 (1.3 mg/kg体重) の実施例10に従うシアニン色素を含んでなる物質、すなわち、実施例22の方法に従いEB-DF抗体AP39に対して複合化した、式XXVIIに描写した構造を有する物質を投与した。
明らかな腫瘍増殖が明白である時点 (腫瘍細胞移植後約12〜14週) に、この物質を静脈内投与した。物質投与後6時間に動物を殺し、微小転移を含有する腸間膜を増強CCDカメラで蛍光シグナルについてex vivo映像化した。レーザーダイオード (0.5ワットの出力) で発生させた波長740 nmの近赤外線で腸間膜を照射することによって、物質の蛍光を励起させた。蛍光像をディジタル的に記憶させた。次いで、微小転移の大きさを低倍率顕微鏡 (Stemi 2000-C、Fa. Carl Zeis) で評価した。0.5〜2.0 mmの範囲の直径を有する微小転移およびより大きい微小転移から蛍光シグナルを受取った。蛍光シグナルは顕微鏡評価に対応する。色素複合体の有効性を1例に基づいて図1に描写する。
実施例２７．ヌードマウスにおける小さい子宮内膜病変のex vivo映像法
4匹のNMRIヌードマウスにおいて、子宮内膜症を外科的に誘発させた。マウスをキシラジン/ケタミン (容積比 2:10、1 ml/kg体重) で麻酔した。腹部を2 cmの中央切開で開き、ヒト子宮内膜症組織の2つの試料 (抗体1 mm3の試料大きさ) を腹腔の各側面の腹膜上に定着させた。子宮内膜症誘発後9日に、すべてのマウスにおいて映像法を実行した。映像のために、2匹のマウスに0.05μmol/kg体重 (1.3 mg/kg体重) の実施例20に従う複合体 (AP39 + 式XXVIIに描写する構造を有する実施例10の標題化合物) を静脈内投与した。他の2匹のマウスにBSAおよび3,3-ジメチル-2-｛7-[3,3-ジメチル-5-スルホナト-1-(2-スルホナトエチル)-3H-インドリウム-2-イル]-4-(6-カルボキシ-4-オキサヘキシル)ヘプタ-2,4,6-トリエン-1-イリデン｝-1-(2-スルホナトエチル)-2,3-ジヒドロ-1H-インドール-5-スルホン酸三ナトリウム、内部塩 (実施例10c) から合成した対照複合体を投与した。
すべてのマウスを物質投与後24時間に殺し、子宮内膜症を含有する腹膜を増強CCDカメラで蛍光シグナルについてex vivo映像化した。レーザーダイオード (0.5ワットの出力) で発生させた波長740 nmの近赤外線で子宮内膜病変を含有する腹膜を照射することによって、物質の蛍光を励起させた。蛍光像をディジタル的に記憶させた。対照物質で処置したマウスに投与しなかった実施例20に従う複合体 (AP39 + 式XXVIIに描写する構造を有する実施例10の標題化合物) で処置した両方のマウスの子宮内膜病変において、明瞭な蛍光シグナルの増強が観測された。病変を含有する蛍光の大きさは2 mmより小さかった。色素複合体の有効性を代表的例に基づいて図2に描写する。
実施例２８．ヌードマウスにおける皮膚の自発的微小病変の in vivo映像法
皮膚の自発的多発性微小病変を2匹のNMRI-ヌードマウスにおいて観察した。各マウスに0.05μmol/kg体重 (1.3 mg/kg体重) の実施例20に従う複合体 (AP39 + 式XXVIIに描写する構造を有する実施例10の標題化合物) を静脈内投与した。物質投与後6時間に麻酔した動物において、映像法を実施した。吸入麻酔剤イソフルレン (Isofluran Curamed、Curamed Pharma GmbH、ドイツ国カールスルヘ) を使用して、短時間麻酔を誘導させた。ダイオードレーザー (励起波長740 nm) により物質の蛍光を励起させ、増強CCDカメラで検出した。蛍光像をディジタル的に記憶させた。次いで、微小病変の大きさを低倍率顕微鏡 (Stemi 2000-C、Fa. Carl Zeis) で評価した。< 1 mmよりも小までの微小病変から蛍光シグナルを受取った。色素複合体の有効性を代表的例に基づいて図3に描写する。
それ以上詳しく説明しないで、当業者は先行する説明を使用して本発明をその最大な程度に利用することができと考えられる。したがって、下記の好ましい態様は単に例示であり、いかなる方法においても開示の残部を限定するものと解釈すべきではない。
前述の実施例において、特記しない限り、すべての温度 (セ氏度) は未補正で記載し、そしてすべての部は重量による。
本明細書において引用する、すべての出願、特許および刊行物は引用することによって本明細書の一部分とされる。
一般的にまたは特別に記載する反応成分および/または操作条件を先行する実施例において使用されているそれらと置換することによって、先行する実施例を同様な成功をもって反復することができる。
以上の説明から、当業者は本発明の本質的特徴を容易に確認することができ、そして本発明の範囲および趣旨から逸脱しないで、本発明の種々の変更および変化を種々の用途および条件に適合させることができる。
図1は、物質投与後6時間における月経Capan-1微小転移における色素複合体の有効性を示す。上のパネルAはもとの像を描写するが、下のパネルBは倒立像を描写する。白色および黒色のドットまたは領域は、それぞれ、微小転移を示す。両方の像はcmの大きさの目盛りを示す物差を含む。 図2は、物質投与後24時間における実験的子宮内膜病変のex vivo映像法の例を示す。パネルAはもとの像を示し、そしてパネルBは倒立像を示す。両方の像はcmの大きさの目盛りを示す物差を含む。 図3は、物質投与後6時間における自発的微小病変のin vivo映像法の例を示す。パネルAはもとの像を示し、そしてパネルBは倒立像を示す。両方の像はcmの大きさの目盛りを示す物差を含む。

Claims (29)

  1. 微小転移または小増殖性病変を診断する診断剤を製造するための下記一般式 (I) の複合体の使用：
    B-(D)n (I)
    式中、
    Bは脈管形成特異的結合性成分であり、
    Dはシアニン色素であり、そして
    nは1〜5である。
  2. 脈管形成特異的結合性成分がフィブロネクチンのED-Bドメイン (ED-BF) 、エンドグリン、脈管内皮増殖因子レセプター (VEGFR) 、VEGFファミリーメンバー、NRP-1、Ang1、Thie2、PDGF-BBおよびレセプター、TGF-β1、エンドグリン、TGF-βレセプター、FGF、HGF、MCP-1、インテグリン類 (αvβ3、αvβ5、α5β1) 、VE-カドヘリン、PECAM (CD31) 、エフリン類、プラスミノゲンアクチベーター、MMP類、PAI-1、NOS、COX-2、AC133、ケモカイン類、Id1/Id3、VEGFR-1、Ang2、TSP-1、-2、アンギオスタチンおよび関係するプラスミノゲンクリングル類、エンドスタチン (コラーゲンXVIIフラグメント) 、バソスタチン、血小板因子4、TIMP類、MMPインヒビター、PEX、Meth-1、Meth-2、IFN-α、-β、-γ、IP-10、IL-4、IL-12、IL-18、プロラクチン (M、16K) 、VBGI、SPARCのフラグメント、オステオポンチンフラグメントまたはマスピンのED-Bドメインに対して向けられている、請求項1に記載の使用。
  3. 脈管形成特異的結合性成分がペプチド、タンパク質、核酸、小分子および糖から成る群から選択される、請求項1または2に記載の使用。
  4. タンパク質が抗体、抗体フラグメントおよび一本鎖抗体から成る群から選択される、請求項1〜3のいずれかに記載の使用。
  5. 抗体がL19、E8、AP38およびAP39から成る群から選択される、請求項1〜4のいずれかに記載の使用。
  6. 核酸がDNA、RNA、アプタマーおよびPNAから成る群から選択される、請求項1〜5のいずれかに記載の使用。
  7. 小分子が2,2-ジフェニルエチルアミンである、請求項1〜6のいずれかに記載の使用。
  8. シアニン色素がカルボシアニン、ジカルボシアニンおよびトリカルボシアニンから成る群から選択される、請求項1〜7のいずれかに記載の使用。
  9. シアニン色素が下記一般式 (II) を有する化合物、ならびにこれらの化合物の塩および溶媒和物である、請求項1〜6のいずれかに記載の使用:
    Figure 2008506747
     式中Cは下記基 (III) または (IV) であり、
    Figure 2008506747
     式中、
    星印で標識された位置は基Aとの結合点を意味し、そしてAは基 (V) 、(VI) 、(VII) 、(VIII) または (IX) であることができ、
    Figure 2008506747
     式中、
    R1およびR2は、互いに独立して、C1-C4スルホアルキル鎖または飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖であり、これは必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されているか、あるいは必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基で中断され、および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されることができ、
    R3はBまたはBに結合したリンカーであり、ここでリンカーは20までの炭素残基をもつ分枝鎖状または直鎖状炭水化物鎖であり、前記鎖は1または2個以上の-OH、-COOHまたは-SO3基で置換されており、および/または必要に応じて-O-、-S-、-CO-、-CS-、-CONH、-NHCO-、NHCSNH-、-SO2-、-PO4--、-アリール-および/または-NH-基で1または2回以上中断されており、
    R4は基-COOE1、-CONE1E2、-NHCOE1、-NHCONHE1、-NE1E2、-OE1、-OSO3E1、-SO3E1、-SO2NHE1または-E1であり、ここで
    E1およびE2は、互いに独立して、水素原子、C1-C4スルホアルキル鎖または飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖であり、これは必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基で中断されており、および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されており、
    R5は水素原子、またはフッ素、塩素、臭素またはヨウ素原子、メチル、エチル、プロピルまたはイソプロピルであり、
    bは数2または3であり、そして
    XおよびYは、互いに独立して、O、S、=C(CH3)2または-(CH=CH)-である。
  10. シアニン色素が下記一般式 (X) を有する化合物、ならびにこれらの化合物の塩および溶媒和物である、請求項1〜8のいずれかに記載の使用:
    Figure 2008506747
     式中C’は下記基 (XI) または (XII) を表し、
    Figure 2008506747
     式中、
    星印で標識された位置は基A’との結合点を意味し、そしてA’は基 (XIII) 、(XIV) 、(XV) 、(XVI) または (XVII) であることができ、
    Figure 2008506747
     ここで基 (XV) または (XVII) は必要に応じてC1-C4アルキル基で置換されることができ、
    式中、
    R1’はC1-C4スルホアルキル鎖; 飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖であり、これは必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基で置換されており、および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されることができるか、あるいは必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基で中断され、および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されることができる; またはM’-R6’であり、
    R2’はC1-C4スルホアルキル鎖; 飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖であり、これは必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基で置換されており、および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されることができるか、あるいは必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基で中断され、および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されることができる; またはM’-R7’であり、
    R3’、R4’、R6’およびR7’は、互いに独立して、基-COOE1’、-CONE1’E2’、-NHCOE1’、-NHCONHE1’、-NE1’E2’、-OE1’、-OSO3E1’、-SO3E1’、-SO2NHE1’または-E1’であり、ここで
    E1’およびE2’は、互いに独立して、水素原子、C1-C4スルホアルキル鎖または飽和または不飽和、分枝鎖状または直鎖状C1-C50アルキル鎖であり、前記アルキル鎖は必要に応じて0〜15個の酸素原子および/または0〜3個のカルボニル基で中断されており、および/または0〜5個のヒドロキシル基で置換されており、
    M’はCH2-CH2またはCH2-CH2-CH2であり、
    R5’はQ’-CH2-R8’であり、
    Q’はC1-C5アルキル (ここでC原子は必要に応じてOまたはSで置換されている) または
    Figure 2008506747
     であり、
    R8’は-CO-NH-R9’-R10’、-NH-CS-NH-R9’-R10’または-NH-CO-R9’-R10’であり、ここで
    R9’は非分枝鎖状C2-C13アルキル (ここでC原子は必要に応じてOまたはSで置換されている) から成る群から選択され、そして
    R10’はBまたはBに結合しているカップリング成分の残留部分であり、
    b’は数2または3であり、そして
    X’およびY’は、互いに独立して、O、S、=C(CH3)2、=C(C2H5)2 、=C(C3H7)2、=C(isoC3H7)2、=C(C4H9)2または-(CH=CH)-である。
  11. 式中、
    A’が基 (XVI) または (XVII) であり、ここで基 (XVII) は必要に応じてパラ位置においてC1-C4アルキル基で置換されることができ、
    C’が基 (XII) であり、
    R1’がM-R6’であり、
    R2’がM-R7’であり、
    R3’、R4’、R6’およびR7’が、互いに独立して、-SO3HまたはHであり、ただしR3’、R4’、R6’およびR7’の少なくとも3つが-SO3Hであり、
    X’およびY’が、互いに独立して、O、S、=C(CH3)2、=C(C2H5)2 、=C(C3H7)2、=C(isoC3H7)2または=C(C4H9)2であり、そして
    b’が3である、
    請求項10に記載の使用。
  12. 式中、
    A’が式 (XVI) の基であり、
    M’がCH2-CH2であり、そして
    Q’がC1-C5アルキルであり、ここでC原子は必要に応じてOまたはSで置換されている、
    請求項10または11に記載の使用。
  13. 式中、
    Q’がC1-C5アルキルである、
    請求項10〜12のいずれかに記載の使用。
  14. 式中、
    A’が式 (XVII) の基であり、
    b’が3であり、そして
    Q’が
    Figure 2008506747
     である、
    請求項10または11に記載の使用。
  15. 式中、
    R8’がCO-BまたはNH-Bである、
    請求項10〜14のいずれかに記載の使用。
  16. 小増殖性病変が小さい一次腫瘍、前癌、形成異常、化成、炎症性病変、子宮内膜症および/または眼の疾患から成る群から選択される、請求項1〜15のいずれかに記載の使用。
  17. in vivo 診断のための、請求項1〜16のいずれかに記載の使用。
  18. 微小転移および/または小増殖性病変が治療手順の前、間および/または後において診断される、請求項1〜17のいずれかに記載の使用。
  19. 微小転移および/または小増殖性病変が10 mmより小さい、好ましくは8 mmより小さい直径を有する、請求項1〜18のいずれかに記載の使用。
  20. 微小転移および/または小増殖性病変が6 mmより小さい、好ましくは5 mmより小さい直径を有する、請求項1〜18のいずれかに記載の使用。
  21. 微小転移および/または小増殖性病変が4 mmより小さい、好ましくは3 mmより小さい直径を有する、請求項1〜18のいずれかに記載の使用。
  22. 微小転移および/または小増殖性病変が2.0〜0.2 mmの直径を有する、請求項1〜18のいずれかに記載の使用。
  23. 微小転移が医原性微小転移、造血性微小転移、腔微小転移、管腔内微小転移、リンパ性転移、局所的微小転移および/または領域的微小転移である、請求項1〜22のいずれかに記載の使用。
  24. 前癌が皮膚の前癌、特にアクチン角化症、皮膚角質、日射性口唇炎、タール角化症、砒素角化症、X線角化症、ボーエン病、ボーウェノイド (bowenoid) 丘疹症、悪性ほくろ、硬化性萎縮性苔癬および粘膜紅色苔癬; 消化管の前癌、特に紅板症、白斑症、バレット食道、プラマー-ビンソン症候群、脚の潰瘍、胃疾患性肥厚性巨人症、ボーダーライン癌腫、新形成性腸管ポリープ、直腸性ポリープ、ポーセレン胆嚢; 婦人科前癌、特に上皮腺管癌 (CDIS) 、頸部上皮内新形成 (CIN) 、白斑症、子宮内膜過形成 (等級III) 、陰門ジストロフィー、陰門上皮内新形成 (VIN) 、胞状奇胎; 泌尿器の前癌、特に膀胱乳頭腫、ケーラー紅色肥厚症、睾丸上皮内新形成 (TIN) 、白斑症; 上皮内癌 (CIS); 慢性炎症により引き起こされる前癌、特に膿皮症、骨髄症、集蔟性挫瘡、尋常性狼瘡およびフィステルから成る群から選択される、請求項1〜22のいずれかに記載の使用。
  25. 化成が脈管形成性化成、アポクリン化成、異形化成、自己実質化成、結合組織化成、上皮化成、腸管化成、化成性貧血、変形骨形成、化成性ポリープ、骨髄性化成、一次骨髄性化成、二次骨髄性化成、扁形化成、羊膜の扁形化成、症候性骨髄様化成および再生化成から成る群から選択される、請求項1〜22のいずれかに記載の使用。
  26. 形成異常が無発汗性外胚葉性形成異常、前後形成異常、窒息性胸郭形成異常、心房指形成異常、気管支肺形成異常、大脳形成異常、子宮頸部形成異常、軟骨外胚葉性形成異常、鎖骨頭蓋形成異常、先天性外胚葉性形成異常、頭蓋骨幹形成異常、頭蓋手根骨足根骨形成異常、頭蓋骨幹端形成異常、ぞうげ質形成異常、骨幹形成異常、外胚葉性形成異常、エナメル質形成異常、脳眼形成異常、腫骨肥大症、多発性骨端形成異常、点状骨端形成異常、上皮形成異常、顔面指趾生殖器形成異常、家族性線維性顎形成異常、家族性白色襞性形成異常、線維筋性形成異常、線維性骨形成異常、鮮紅色骨性形成異常、遺伝性腎-網膜形成異常、発汗性外胚葉性形成異常、低発汗性外胚葉性形成異常、リンパ球減少性胸腺形成異常、乳房形成異常、下顎顔面形成異常、骨幹端形成異常、モンディニ (Mondini) 形成異常、単発性線維性形成異常、粘膜上皮形成異常、多発性骨端形成異常、眼耳脊椎形成異常、眼歯指形成異常、眼脊椎形成異常、骨牙形成異常、眼下顎形成異常、根突端セメント質形成異常、多発性線維性骨形成異常、偽軟骨発育不全脊椎骨端形成異常、網膜形成異常、中隔眼呼吸困難、脊椎骨端形成異常および心室撓骨形成異常
    から成る群から選択される、請求項1〜22のいずれかに記載の使用。
  27. 炎症性病変が慢性関節リウマチ、炎症性腸疾患、敗血性ショック、オステオポローシス、骨関節炎、神経疾患性疼痛、ウイルス感染症、細菌感染症、インスリン依存性糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、歯周疾患、再狭窄、円形脱毛症、乾癬、乾癬性関節炎、急性膵臓炎、異系移植片拒絶反応、アレルギー、肺におけるアレルギー性炎症、アテローム性動脈硬化症、多発性硬化症、悪液質、アルツハイマー病、発作、クローン病、炎症性腸疾患、虚血、鬱血性心不全、肺性線維症、肝炎、ギヤン-バレー症候群および全身性エリテマトーデスから成る群から選択される疾患または症状により引き起こされる、請求項1〜22のいずれかに記載の使用。
  28. 子宮内膜症が血液原性細胞クラスター、腔細胞クラスター、管腔内細胞クラスター、リンパ性細胞クラスター、局所的細胞クラスターおよび/または領域的細胞クラスターを含んでなる、請求項1〜22のいずれかに記載の使用。
  29. 眼の疾患がトラコーマ、未熟の網膜症、糖尿病性網膜症、血管新生性緑内症および年齢に関係する黄斑変性から成る群から選択される、請求項1〜22のいずれかに記載の使用。
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