CN111925311A - 肿瘤造影化合物、其制备方法及在肿瘤诊断成像中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及肿瘤造影化合物、其制备方法及在肿瘤诊断成像中的应用。本发明的造影剂含有本文所述的式I化合物和阴离子表面活性剂。使用本发明的造影剂可实现高对比度、成像结果清晰可辨的近红外实时成像。

Description

肿瘤造影化合物、其制备方法及在肿瘤诊断成像中的应用
技术领域
本发明涉及肿瘤造影化合物、其制备方法及在肿瘤诊断成像中的应用。
背景技术
分子影像学是由分子生物学与医学影像学相互融合形成的跨领域交叉学科。分子影像技术与传统的影像学检查相比较具有灵敏度高、可定量等优点。分子影像技术或分子显像技术主要包括磁共振(MR)分子显像、核医学分子显像技术和光学分子显像。其中，光学分子显像技术中的近红外荧光(Near Infrared Fluorescence，NIRF)成像技术已经广泛应用于临床的外科手术中，其基本原理为：利用荧光示踪剂在激发后所发出的近红外光标识血管，淋巴结以及肿瘤病灶等部位，辅助临床医生进行外科手术。目前，吲哚菁绿(ICG)作为近红外荧光示踪剂已经广泛应用于临床领域。但是，由于ICG对肿瘤组织没有特异性识别，因此在外科肿瘤切除手术中使用ICG只能通过血管及组织差异性间接标记肿瘤病灶。其成像结果不佳，具体表现为：敏感度不足、肿瘤特异性差、成像时间短。
发明内容
本发明提供了一种全新的近红外荧光肿瘤标记技术。本发明发现，如图39所示，阴离子表面活性剂与荧光小分子共同溶解于水中后，形成稳定的成像试剂(本文也称为造影剂)；阴离子表面活性剂与荧光小分子在溶液中相结合，其结合作用可以产生较强的荧光淬灭作用，造成荧光小分子无法被激发，试剂本身无荧光信号；当该成像试剂接触到肿瘤细胞后，荧光小分子可以识别肿瘤细胞表面的有机阴离子转运蛋白(organic aniontransporting polypeptides，OATPs)，迅速进入肿瘤细胞内部，而阴离子表面活性剂无法选择性进入肿瘤细胞，因此荧光淬灭作用消失；由此荧光小分子在肿瘤细胞内被激发，发出近红外荧光信号，从而标记肿瘤病灶。利用上述发现，本发明可实现高对比度、成像结果清晰可辨的近红外实时成像。
因此，本发明第一方面提供一种造影剂，其含有下式I所示的化合物和阴离子表面活性剂：
Figure BDA0002655388500000021
式中，
X－为阴离子；
R1-R8各自独立为H、羟基、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基和任选取代的5-14元杂环基；或者，R1与R2、R2与R3或R3与R4分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环，R5与R6、R6与R7或R7与R8分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环；
R21和R22各自独立为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-SO3N(Ra)3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基；其中，Ra各自独立为H和C1-4烷基；
n1和n2各自独立选自0-12的整数，优选选自0-6的整数；和
L为键，或为接头基团。
在一个或多个实施方案中，L为键，n1和n2为相同的整数，R21和R22为相同的基团。
在一个或多个实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22的空间位阻大于-(CH2)n2-R21基团的空间位阻。
在一个或多个实施方案中，R1-R8均为氢。
在一个或多个实施方案中，L选自*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1选自NH、O、S，T2选自O、NH和S，*表示与-(CH2)n1-连接的位置。
在一个或多个实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21相同，均为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基。优选地，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21相同，均为任选被-COOH取代的C1-6烷基。
在一个或多个实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选为任选被-COOH取代的C1-6烷基；基团-(CH2)n2-R21为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选为任选被-COOH取代的C1-6烷基，且其碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度。优选地，基团-(CH2)n1-L-R22为任选被-COOH取代的C1-6烷基，基团-(CH2)n2-R21为任选被-COOH取代的C1-6烷基，且基团-(CH2)n2-R21的碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度。更优选地，基团-(CH2)n1-L-R22为被-COOH取代的C1-6烷基，基团-(CH2)n2-R21为未被取代的C1-6烷基，且基团-(CH2)n2-R21的碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度。
在一个或多个实施方案中，所述式I化合物不包括化合物8。
优选地，式I中，R1-R8以及R21和R22中，所述任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂环基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基各自可任选地被1-3个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基、羧基、氨基(包括-NH2和-NR’R”)、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
在一个或多个实施方案中，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、氨基、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基。
在一个或多个实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同；其中，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、-NH2、-NR’R”、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基；R21为H、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，且当R21为H时，n2不为0。优选地，R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基或卤代C1-6烷基。
在一个或多个实施方案中，R1-R8为氢；L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH、O和S；n1和n2各自为1-6的整数；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基；R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
在一个或多个实施方案中，所述阴离子选自：F-、Cl-、Br-、I-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3COO-和CH3SO3 -。
在一个或多个实施方案中，本发明所述式I化合物具有下式Ia、Ib或Ic所示的结构：
Figure BDA0002655388500000051
各式中，n1、n2、L、R21和R22如前述任一实施方案所述；
R9-R20各自独立选自H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C5-14杂芳基和C3-10杂环基。优选地，R9-R20各自独立为H、卤素和C1-6烷基，更优选均为H。
在一个或多个实施方案中，所述式I化合物选自以下化合物中的一个或多个：
Figure BDA0002655388500000061
在一个或多个实施方案中，造影剂中所述式I化合物与阴离子表面活性剂的摩尔比为1：(0.1～20)，如1：(0.1～10)或1：(0.2～5)。
在一个或多个实施方案中，所述阴离子表面活性剂选自：羧酸盐、磺酸盐、硫酸酯盐、磷酸酯盐和脂肽类阴离子表面活性剂；优选地，所述阴离子表面活性剂为磺酸盐类和脂肽类阴离子表面活性剂；更优选地，所述阴离子表面活性剂选自：表面活性素、十二烷基磺酸钠和十二烷基苯磺酸钠。
在一个或多个实施方案中，所述造影剂中式I化合物的终浓度在1～100μM的范围内，如5～50μM或10～30μM。
在一个或多个实施方案中，所述造影剂为冻干粉末。
在一个或多个实施方案中，所述造影剂为水溶液形式。
本发明第二方面提供如下所定义的式I’化合物：
Figure BDA0002655388500000071
式中，
X－为阴离子；
R1-R8各自独立为H、羟基、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基和任选取代的5-14元杂环基；或者，R1与R2、R2与R3或R3与R4分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环，R5与R6、R6与R7或R7与R8分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环；
R21和R22各自独立为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-SO3N(Ra)3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基；其中，Ra各自独立为H和C1-4烷基；
n1和n2各自独立选自0-12的整数，优选选自0-6的整数；和
L为键，或为接头基团；
其中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22的空间位阻大于-(CH2)n2-R21基团的空间位阻。
在本发明式I’化合物的一个或多个实施方案中，R1-R8均为氢。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，L选自*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1选自NH、O、S，T2选自O、NH和S，*表示与-(CH2)n1-连接的位置。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，R1-R8以及R21和R22中，所述任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂环基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基各自可任选地被1-3个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基、羧基、氨基(包括-NH2和-NR’R”)、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、氨基、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、-NH2、-NR’R”、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；R21为H、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，且当R21为H时，n2不为0。优选地，R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基或卤代C1-6烷基。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，R1-R8为氢；L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH、O和S；n1和n2各自为1-6的整数；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基；R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，所述阴离子选自：F-、Cl-、Br-、I-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3COO-和CH3SO3 -。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，本发明所述式I’化合物具有下式Ia’、Ib’或Ic’所示的结构：
Figure BDA0002655388500000091
各式中，n1、n2、L、R21和R22如本发明化合物的前述任一实施方案所述；
R9-R20各自独立选自H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C5-14杂芳基和C3-10杂环基。优选地，R9-R20各自独立为H、卤素和C1-6烷基，更优选均为H。
在本发明式I’化合物的前述一个或多个实施方案中，所述式I’化合物选自：
Figure BDA0002655388500000101
本发明还提供一种造影剂，其含有本发明式I’所示的化合物和任选的阴离子表面活性剂。优选地，所述阴离子表面活性剂选自：羧酸盐、磺酸盐、硫酸酯盐、磷酸酯盐和脂肽类阴离子表面活性剂；优选地，所述阴离子表面活性剂为磺酸盐类和脂肽类阴离子表面活性剂；更优选地，所述阴离子表面活性剂选自：表面活性素、十二烷基磺酸钠和十二烷基苯磺酸钠。优选地，所述造影剂中式I’化合物的终浓度在1～100μM的范围内，如5～50μM或10～30μM。优选地，所述造影剂含有阴离子表面活性剂，且造影剂中所述式I’化合物与阴离子表面活性剂的摩尔比为1：(0.1～20)，如1：(0.1～10)或1：(0.2～5)。优选地，所述造影剂为冻干粉末，或为水溶液形式。
本发明还提供一种检测试剂盒，其含有本发明式I’所示的化合物和任选的阴离子表面活性剂。优选地，所述阴离子表面活性剂如本文任一实施方案所述，更优选为表面活性素或十二烷基磺酸钠(SDS)。在一些实施方案中，所述检测试剂盒含有本文任一实施方案所述的造影剂。
本发明还提供式I’所示化合物和任选的本文任一实施方案所述的阴离子表面活性剂在制备肿瘤造影剂中的应用。
本发明还提供式I所示化合物和本文任一实施方案所述的阴离子表面活性剂在制备肿瘤造影剂中的应用。
本发明还提供一种肿瘤成像方法，该方法包括使待检组织与本发明所述的造影剂接触的步骤。
在一个或多个实施方案中，所述方法为体外方法，所述接触包括使用本发明造影剂浸泡、喷洒和/或涂抹待检组织。
在一个或多个实施方案中，所述方法为体内方法，所述接触包括给予待检患者所述造影剂。
本发明还提供一种造影剂或含有该造影剂的试剂盒所述造影剂含有化合物4和/或化合物6以及表面活性素或十二烷基磺酸钠：
Figure BDA0002655388500000111
其中，化合物4、化合物6、或化合物4和化合物6与表面活性素或十二烷基磺酸钠的摩尔比在1：(20～0.1)的范围内，优选1：(10～0.1)或1：(5～0.2)；
优选地，所述造影剂为溶液形式或冻干粉末形式。
附图说明
图1：化合物1在人肾癌细胞系786o中的荧光定位结果。
图2：化合物2在人肾癌细胞系786o中的荧光定位结果。
图3：化合物3在人肾癌细胞系786o中的荧光定位结果。
图4：化合物4在人肾癌细胞系786o中的荧光定位结果。
图5：化合物5在人肾癌细胞系786o中的荧光定位结果。
图6：化合物7在人肾癌细胞系786o中的荧光定位结果。
图7：化合物4在人肾癌细胞系A498中的荧光定位结果。
图8：化合物5在人肾癌细胞系A498中的荧光定位结果。
图9：化合物1-5、7与表面活性素按不同比例混合后的荧光成像结果(a)和ROI数值定量分析结果(b)。
图10：化合物1与表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物1与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物1与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图11：化合物2与表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物2与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物2与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图12：化合物3与表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物3与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物3与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图13：化合物4与阴离子表面活性剂表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物4与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物4与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图14：化合物5与表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物5与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物5与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图15：化合物6与表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物6与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物6与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图16：化合物7与表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物7与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物7与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图17：化合物8与表面活性素按不同比例混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)：(a)化合物8与表面活性素摩尔比为1:5的水溶液与化合物1的甲醇溶液的荧光发射光谱；(b)化合物8与表面活性素摩尔比为1:5、1:1、1:0.2的荧光发射光谱。
图18：化合物4与多种表面活性剂混合后的荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)，表面活性剂具体种类为：1为表面活性素(Surfactin)；2为人血清白蛋白；3为聚氧乙烯蓖麻油(Kolliphor)；4为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123)；5为十二烷基三甲基氯化铵；6为四丁基碘化铵；7为十二烷基磺酸钠；8为十二烷基苯磺酸钠。
图19：透射电子显微镜测试结果：(a)化合物4；(b)化合物5；(c)化合物7。
图20：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物1与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图21：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物2与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图22：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物3与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图23：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物4与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图24：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物5与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图25：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物6与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图26：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物7与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图27：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物8与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图28：小鼠皮下异种种植乳腺癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物4与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图29：小鼠皮下异种种植乳腺癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物6与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图30：小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的肿瘤组织在化合物4与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)及50倍磺溴酚酞钠竞争实验中的近红外成像结果：(a)近红外成像结果典型图；(b)肿瘤组织ROI数值定量分析结果。
图31：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物1与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(c)肿瘤组织与正常肠道组织ROI数值定量分析结果。
图32：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物2与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(c)肿瘤组织与正常肠道组织ROI数值定量分析结果。
图33：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物3与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(c)肿瘤组织与正常肠道组织ROI数值定量分析结果。
图34：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物4与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(c)肿瘤组织与正常肠道组织ROI数值定量分析结果。
图35：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物5与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)；(c)肿瘤组织与正常肠道组织ROI数值定量分析结果。
图36：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物6与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)。
图37：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物7与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)。
图38：小鼠原发肠癌肿瘤模型中发病的结肠组织在化合物8与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)中的近红外成像结果：(a)可见光下的成像结果；(b)红外成像结果(黄色箭头所指为肿瘤组织)。
图39：本发明造影剂的工作原理示意图。
具体实施方式
应理解，在本发明范围中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成优选的技术方案。
I.术语和定义
本文描述和公开的理论或机制，无论是对或错，均不应以任何方式限制本发明的范围，即本发明内容可以在不为任何特定的理论或机制所限制的情况下实施。
本文所描述的数值范围应视为已涵盖且具体公开所有可能的次级范围及范围内的任何单独的数值。例如，“含有1至20个碳原子”将包括含有1至10个碳原子、含有2至10个碳原子、含有5个碳原子等。
本文中，当描述实施方案、实施例或实例时，应理解，其并非用来将本发明限定于这些实施方案、实施例或实例。相反地，本发明所描述的方法及材料的所有的替代物、改良物及均等物，均可涵盖于权利要求书所限定的范围内。本领域技术人员将可确认许多可用于实施本发明的类似于或相当于本文中所描述的方法及材料。
本文中，为使描述简洁，未对各个实施方案、实施例或实例中的各个技术特征的所有可能的组合都进行描述。因此，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，各个实施方案、实施例或实例中的各个技术特征可以进行任意的组合，所有可能的组合都应当认为是本说明书记载的范围。
本文中，卤素包括F、Cl、Br和I。
术语“烷基”是指直链或支链单价饱和烃基，通常含有1-12个碳原子(C1-12烷基)，优选含有1-6个碳原子(C1-6烷基)。烷基的例子包括但不限于甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基及叔丁基。亚烷基至二价烷基，如-CH2-、-CH2CH2-等。亚烷基的碳原子数通常为1-6个。
术语“烯基”是指含有一个或多个双键的直链或支链单价烃基，通常含有2-12个碳原子(C2-12烯基)，优选含有2-6个碳原子(C2-6烯基)。烯基的例子包括但不限于乙烯基、丙烯基、烯丙基及1,4-丁二烯基。
术语“炔基”是指含有一个或多个三键的直链或支链单价烃基，通常含有2-12个碳原子(C2-12炔基)，优选含有2-6个碳原子(C2-6炔基)。炔基的例子包括但不限于乙炔基、1-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基及1-甲基-2-丁炔基。
术语“环烃基”或“碳环基”意指仅由碳原子和氢原子组成的稳定的非芳香族单环或多环烃基，其可包括稠合环体系、桥环体系或螺环体系，具有3至15个碳原子，优选具有3至10个碳原子，且其为饱和或不饱和并可经由任何适宜的碳原子通过单键与分子的其余部分连接。除非本说明书中另外特别指明，环烃基中的碳原子可以任选地被氧化。环烃基的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环戊烯基、环己基、环己烯基、环己二烯基、环庚基、环辛基、1H-茚基、2,3-二氢化茚基、1,2,3,4-四氢-萘基、5,6,7,8-四氢-萘基、8,9-二氢-7H-苯并环庚烯-6-基、6,7,8,9-四氢-5H-苯并环庚烯基、5,6,7,8,9,10-六氢-苯并环辛烯基、芴基、二环[2.2.1]庚基、7,7-二甲基-二环[2.2.1]庚基、二环[2.2.1]庚烯基、二环[2.2.2]辛基、二环[3.1.1]庚基、二环[3.2.1]辛基、二环[2.2.2]辛烯基、二环[3.2.1]辛烯基、金刚烷基、八氢-4,7-亚甲基-1H-茚基和八氢-2,5-亚甲基-并环戊二烯基等。示例性的环烃基或碳环基为环烷基，其环碳原子数通常为3-10个，优选为3-8个。环烷基的例子包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基及金刚烷基。示例性的环烃基或碳环基可以为环烯基，即含有非芳香族含双键的烃环的单价烃基。环烯基的环碳原子数通常为3-10个，如3-8个环碳原子。环烯基的例子包括但不限于环戊烯基、环己烯基及环庚烯基。
术语“芳基”或“芳环”是指含有芳香族烃环的单价烃基，通常为C6-14芳基。芳基的例子包括但不限于苯基、萘基及蒽基。
术语“杂芳基”或“杂芳环”指含有5-14个环原子，并且有6个、10个或14个电子在环体系上共用，且所含环原子是碳原子和从氧、氮、硫中任选的1-3个杂原子的基团。杂芳基的例子包括但不限于噻吩基、苯并异噻唑基、苯并噻吩基、萘并[2,3-b]噻吩基、噻蒽基、呋喃基、吡喃基、异苯并呋喃基、色烯基、夹氧蒽基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、吡啶基、吡嗪基、嘧啶基、哒嗪基、吲嗪基、异吲哚基、3H-吲哚基、吲哚基、吲唑基、嘌呤基、4H-喹嗪基、异喹啉基、喹啉基、酞嗪基、萘啶基、喹唑啉基、噌啉基、蝶啶基、咔唑基、β-咔啉基、菲啶基、吖啶基、萘嵌间二氮(杂)苯基、菲咯啉基、吩嗪基、异噻唑基、吩噻嗪基和异恶唑基等。
术语“杂环基”或“杂环”指饱和或部分饱和的3-7元单环，或7-10元双环体系，由碳原子和从O、N、S中任选1-3个杂原子组成。杂环基包括但不限于四氢呋喃基、吡喃基、哌啶基、哌嗪基、吡咯烷基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、异二氢吲哚基、奎宁环基、吗啉基、异色满基、色满基、吡唑烷基和吡唑啉基等。
本文所述的各基团可被取代。取代基的数量可以是一个或多个，例如1-4个。除非另有说明，否则当本文提及某个基团是可被“任选取代”时，其取代基通常包括但不限于卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷氧基、C2-6烯基、C2-6炔基、C6-14芳基、C5-14杂芳基、C3-10杂环基、C3-8环烷基、羟基、硝基、氰基、巯基、氨基、C1-6酰基中的一个或多个(如1、2、3或4个)。在优选的实施方案中，取代基选自卤素、羟基、氨基、C1-6烷基和C1-6烷氧基中的一个或多个。
本文中，“氨基”包括-NH2以及-NR’R”，其中，R’和R”各自独立为H、C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基；优选地，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
II.造影剂和检测试剂盒
本发明的造影剂含有下式I所示的一种或多种化合物：
Figure BDA0002655388500000191
式中，
X－为阴离子；
R1-R8各自独立为H、羟基、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基和任选取代的5-14元杂环基；或者，R1与R2、R2与R3、或R3与R4分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环，R5与R6、R6与R7、或R7与R8分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环；
R21和R22各自独立为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-SO3N(Ra)3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基；其中，Ra各自独立为H和C1-4烷基；
n1和n2各自独立选自0-12的整数，优选选自0-6的整数；和
L为键，或为接头基团。
在式I化合物的一些实施方案中，L为键，n1和n2为相同的整数，R21和R22为相同的基团。因此，在这些实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21相同，例如均可为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基。优选地，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21相同，均为任选被-COOH取代的C1-6烷基。进一步优选地，在这些实施方案中，R1-R8均为氢。
在式I化合物的另外一些实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22的空间位阻大于-(CH2)n2-R21基团的空间位阻。例如，R22选自任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基，而R21不是这些基团，如R21为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，优选为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，更优选为H或C1-6烷基。优选地，在这些实施方案中，R1-R8均为氢。优选地，在这些实施方案中，L选自*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1选自NH、O、S，T2选自O、NH和S，*表示与-(CH2)n1-连接的位置；更优选地，L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，T1优选为NH或O。
在一些实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选为任选被-COOH取代的C1-6烷基；基团-(CH2)n2-R21为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选为任选被-COOH取代的C1-6烷基，且其碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度。优选地，基团-(CH2)n1-L-R22为任选被-COOH取代的C1-6烷基，基团-(CH2)n2-R21为任选被-COOH取代的C1-6烷基，且基团-(CH2)n2-R21的碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度。更优选地，基团-(CH2)n1-L-R22为被-COOH取代的C1-6烷基，基团-(CH2)n2-R21为未被取代的C1-6烷基，且基团-(CH2)n2-R21的碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度。优选地，在这些实施方案中，L为键。
优选地，所述式I化合物不包括化合物8。
优选地，所述式I化合物中，R1-R8各自独立为H、卤素或C1-C4烷基。
优选地，所述式I化合物中，L选自*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1选自NH、O、S，T2选自O、NH和S，*表示与-(CH2)n1-连接的位置；更优选地，L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，T1优选为NH或O。
优选地，所述式I化合物中，R1-R8以及R21和R22中，所述任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂环基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基各自可任选地被1-3个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基、羧基、氨基(包括-NH2和-NR’R”)、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。R21和R22中的所述C3-15环烷基、6-14元芳基、5-14元杂芳基和5-14元杂环基的进一步优选的取代基为-NR’R”，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
优选地，所述式I化合物中，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、-NH2、-NR’R”、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基；更优选为任选被1个-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
在一些实施方案中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同；其中，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、-NH2、-NR’R”、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；R21为H、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，且当R21为H时，n2不为0。优选地，R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基或卤代C1-6烷基。
在一个或多个实施方案中，R1-R8为氢；L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH或O；n1和n2各自为1-6的整数；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基；R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
优选地，所述式I化合物中，所述阴离子选自：F-、Cl-、Br-、I-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3COO-和CH3SO3 -。
在一些实施方案中，本发明所述式I化合物具有下式Ia、Ib或Ic所示的结构：
Figure BDA0002655388500000221
各式中，n1、n2、L、R21和R22如前述任一实施方案所述；
R9-R20各自独立选自H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C5-14杂芳基和C3-10杂环基。优选地，R9-R20各自独立为H、卤素和C1-6烷基，更优选均为H。
优选地，造影剂中所述式I化合物选自以下化合物中的一个或多个：
Figure BDA0002655388500000231
优选地，本发明的造影剂中还含有选阴离子表面活性剂。合适的阴离子表面活性剂包括羧酸盐、磺酸盐、硫酸酯盐、磷酸酯盐和脂肽类阴离子表面活性剂。优选的阴离子表面活性剂包括磺酸盐类和脂肽类阴离子表面活性剂，如表面活性素、十二烷基磺酸钠和十二烷基苯磺酸钠等。在特别优选的实施方案中，本发明造影剂中的阴离子表面活性剂为表面活性素(CAS No.：24730-31-2)。本发明的造影剂中，式I化合物与表面活性剂的摩尔比可在1：(20～0.1)的范围内，如1：(10～0.1)或1：(5～0.2)。
本发明的造影剂中，式I化合物的终浓度可在1～100μM的范围内，如5～50μM或10～30μM。
因此，在特别优选的实施方案中，本发明的造影剂含有式I化合物和表面活性素，其中，所述式I化合物如前文任一实施方案所述。优选地，该造影剂中，式I化合物的R1-R8均为氢，L为键，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21相同，例如均可为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选均为任选被-COOH取代的C1-6烷基。优选地，该造影剂中，式I化合物的R1-R8均为氢；L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH或O；n1和n2各自为1-6的整数；R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、-NH2、-NR’R”、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；R21为H、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，且当R21为H时，n2不为0；优选地，R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基或卤代C1-6烷基。优选地，该造影剂中，式I化合物的R1-R8为氢；L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH或O；n1和n2各自为1-6的整数；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基；R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。优选地，该造影剂中，式I化合物为化合物1-7中的任意一个或多个，更优选为化合物3-7中的任意一个或多个，更优选为化合物4和/或化合物6。优选地，该造影剂中，式I化合物与表面活性剂的摩尔比为1：(10～0.1)，优选为1：(5～0.2)。优选地，该造影剂中，式I化合物的终浓度为5～50μM，优选为10～30μM。
优选地，本发明的造影剂还含有溶剂。该溶剂应能溶解本发明的式I化合物。优选地，所述溶剂为水。在一些实施方案中，本发明的造影剂为含有本发明所述表面活性剂的式I化合物的水溶液。
在特别优选的实施方案中，本发明造影剂溶液的粒径为10-200nm，更优选为30-150nm，更优选为50-100nm。
本发明的造影剂可以是溶液形式，也可以是冻干粉末形式。
在一些实施方案中，本发明还提供一种检测试剂盒，其含有本发明任一实施方案所述的式I化合物。试剂盒中本发明式I化合物可以水溶液的形式提供，也可以固体粉末的形式提供。优选地，试剂盒中还含有本文任一实施方案所述的阴离子表面活性剂。试剂盒中的各成分可单独包装，也可以混合物的形式提供。独立包装时，使用时可将本发明式I化合物和任选的表面活性剂于水中混合，形成造影剂。在一些实施方案中，本发明的检测试剂盒含有本发明式I化合物的造影剂。优选地，所述含本发明式I化合物的造影剂为本申请任一实施方案所述的造影剂。试剂盒中还可含有说明书，用以指示技术人员使用该试剂盒中的成分配制造影剂，和/或指示技术人员使用造影剂对肿瘤组织造影。
III.化合物
在一些实施方案中，本发明提供如下所定义的式I’化合物：
Figure BDA0002655388500000251
式中，
X－为阴离子；
R1-R8各自独立为H、羟基、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基和任选取代的5-14元杂环基；或者，R1与R2、R2与R3或R3与R4分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环，R5与R6、R6与R7或R7与R8分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环；
R21和R22各自独立为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-SO3N(Ra)3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基；其中，Ra各自独立为H和C1-4烷基；
n1和n2各自独立选自0-12的整数，优选选自0-6或1-6的整数；和
L为键，或为接头基团；
其中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22的空间位阻大于-(CH2)n2-R21基团的空间位阻。
优选地，式I’中，R1-R8各自独立为氢、卤素或C1-C4烷基，更优选均为H。
优选地，式I’中，L选自*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1选自NH、O、S，T2选自O、NH和S，*表示与-(CH2)n1-连接的位置。更优选地，L选自*-T1-C(O)-和*-C(O)-T1-，其中，T1选自NH和O。
优选地，式I’的R1-R8以及R21和R22中，所述任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂环基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基各自可任选地被1-3个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、羟基、羧基、氨基(包括-NH2和-NR’R”)、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
优选地，式I’中，R22选自任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基。优选地，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、氨基、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基。
优选地，式I’中，R21为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，优选为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，更优选为H或C1-6烷基。
优选地，式I’中，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、-NH2、-NR’R”、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；R21为H、卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基或C2-6炔基，且当R21为H时，n2不为0。优选地，R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基或卤代C1-6烷基。
优选地，式I’中，R1-R8为氢；L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH、O和S；n1和n2各自为1-6的整数；基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基；R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
优选地，式I’中，所述阴离子选自：F-、Cl-、Br-、I-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3COO-和CH3SO3 -。
在一些实施方案中，本发明所述式I’化合物具有下式Ia’、Ib’或Ic’所示的结构：
Figure BDA0002655388500000271
Figure BDA0002655388500000281
各式中，n1、n2、L、R21和R22如本发明式I’化合物的前述任一实施方案所述；
R9-R20各自独立选自H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C5-14杂芳基和C3-10杂环基。优选地，R9-R20各自独立为H、卤素和C1-6烷基，更优选均为H。
在本发明化合物的前述一个或多个实施方案中，所述式I’化合物选自：
Figure BDA0002655388500000282
Figure BDA0002655388500000291
IV.式I化合物的制备
本发明还提供制备本发明式I’的化合物的方法，包括将下式1所示化合物与化合物Z-R22反应，从而得到式I’所示的化合物：
Figure BDA0002655388500000292
式中，X-、R1-R8、n1-n2、R21和R22如前文式I’的任一实施方案所述；Y和Z的选择使得反应得到本发明的L，即*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1和T2如前文任一实施方案所述。例如，Y可以是-NH2、-COOH、-OH、-SH、-C(O)-X’、-S(O)2-X’或-S(O)2OH，Z可相应地为可与Y反应的基团，如-NH2、-COOH、-OH、-SH、-C(O)-X’、-S(O)2-X’或-S(O)2OH，以形成诸如-C(O)-NH-、-NH-(CO)-、-C(O)-O-、-O-C(O)-、-S(O)2-NH-、-NH-S(O)2-、-S(O)2-O-、-O-S(O)2-、-S(O)2-S-、-S-S(O)2-等基团，其中，X’为卤素。
反应可在低温(如20℃以下)和惰性气体保护下进行。可将式1化合物和Z-R22溶解于有机溶剂如二氯甲烷、四氢呋喃和/或乙醚中，然后缓慢加入溶解在该有机溶剂中的1当量的缩合剂(如1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐)酸盐及催化剂(如4-二甲氨基吡啶)。低速搅拌，待反应结束之后，加入二氯甲烷，洗涤，干燥，需要时纯化。
V.方法和用途
本发明的造影剂可用来对肿瘤组织造影，以将肿瘤组织与正常组织区分。与现有造影剂不同的是，本发明造影剂能用于体外处理组织，使肿瘤组织显影。在一些实施方案中，本发明的造影剂也可用于体内施用。
因此，本申请提供一种体外对肿瘤组织或癌组织造影的方法，该方法包括使待检测组织与本发明造影剂或式I’化合物接触的步骤。优选地，所述造影剂为本申请任一实施方案所述的造影剂。接触包括用本发明的造影剂浸泡、涂抹和/或喷洒待检组织，从而完成对肿瘤病灶的成像。通常，将肿瘤组织接触本发明造影剂或含式I’化合物的溶液中一段时间后，使用荧光成像仪成像，即可使肿瘤组织或癌组织显影。
本发明也提供本发明式I化合物和阴离子表面活性剂在制备肿瘤组织造影剂中的应用。本发明还提供本发明式I’化合物在支部肿瘤组织造影剂中的应用。
如本申请实施例所证实，本发明的其它化合物对肿瘤组织的靶向性识别是通过有机阴离子转运蛋白(OATP)实现的。因此，任何表达有机阴离子转运蛋白的肿瘤或癌组织(尤其是实体瘤)都可用造影剂或式I’化合物造影并于其周围的正常组织区分开。更具体而言，本发明式I和I’化合物、其造影剂以及本发明的方法可用于对选自以下的肿瘤组织或癌组织造影：肝癌、黑素瘤、成神经细胞瘤、乳腺癌、卵巢癌、肺癌(小细胞肺癌和非小细胞肺癌)、维尔姆斯瘤、子宫颈癌、睾丸癌、软组织肉瘤、膀胱癌、原发性脑癌、胃癌、结肠癌、恶性胰腺胰岛瘤、恶性类癌性癌症、绒毛膜癌、蕈樣肉芽腫、头颈癌、骨原性肉瘤、胰腺癌、横纹肌肉瘤、卡波西肉瘤、甲状腺癌、食管癌、肾癌、子宫内膜癌、肾上腺皮质癌、皮肤癌和前列腺癌等。
在一些实施方案中，本发明的化合物、造影剂和方法特别可用于(1)腔体类肿瘤的早期筛查，如口腔癌、食道癌、胃癌、肠癌、结直肠癌、膀胱癌等等；(2)所有已知实体肿瘤的手术中成像，检查手术切除是否完整，如乳腺癌、肾癌、脑癌等等；(3)对肿瘤病灶的光动力治疗(以腔体类肿瘤为主，如膀胱癌，结直肠癌等等)。
本发明具有以下优点：
(1)本发明产品可以完成高对比度的近红外活体实时成像，其成像结果清晰可辨；
(2)本发明的造影剂无需通过注射进行临床给药，可以进行体外诊断测试；
(3)本发明产品生产工艺简单，在生产成本上具有显著优势；
(4)本发明产品为小分子化合物，结构明确，稳定性高，易于保存运输。
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并不意图限制本发明。实施例中所用到的方法和试剂，除非另有说明，否则为本领域常规的方法和试剂。
实施例1：式II化合物的制备
Figure BDA0002655388500000311
式中，T可选自O、NH或S；R为本申请的R22。
式II化合物可通过以下步骤制备得到：
低温下，惰性气体保护下，化合物3与化合物9等当量溶解于二氯甲烷中低速搅拌，于2小时内缓慢滴加1当量1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐及催化量的4-二甲氨基吡啶的二氯甲烷溶液。低速搅拌24小时，待硅胶薄层色谱法监测反应结束之后，加入二氯甲烷，以食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥过夜。使用硅胶柱层析法纯化(甲醇/二氯甲烷)，最终提纯产品为绿色粉末状固体。
Figure BDA0002655388500000321
按照上述方法制备如下所示结构的化合物4。
Figure BDA0002655388500000322
化合物4化学结构表征：1H NMR(500MHz,CD3Cl,δ):8.37-8.31(m,2H),7.54-7.53(m,1H),7.41-7.35(m,7H),7.25-7.12(m,4H),7.03-7.01(m,1H),6.32-6.31(m,1H),6.30-6.29(m,1H),4.32-4.26(m,4H),2.76-2.73(m,4H),2.63-2.60(m,2H),1.96-1.83(m,8H),1.72-1.71(m,12H),1.47(t,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(125MHz,CD3Cl,δ):172.1,171.9,150.6,150.2,144.5,143.9,129.4,128.9,127.6,125.8,125.3,122.2,121.5,110.8,101.5,49.4,49.2,44.6,39.9,33.9,31.9,31.4,30.2,29.7,29.4,28.2,28.0,27.2,26.6,26.4,24.5,22.7,20.7,14.1,12.5。
HRMS:m/z[M]+calc for C44H50ClN2O2 +:673.3555；found:673.3550。
按照上述方法制备如下所示结构的化合物5。
Figure BDA0002655388500000323
化合物5化学结构表征：
1H NMR(500MHz,CD3Cl,δ):8.38-8.29(m,2H),7.43-7.37(m,7H),7.25-7.21(m,2H),7.15-7.14(m,1H),6.95-6.93(m,2H),6.38-6.35(m,1H),6.26-6.23(m,1H),4.36-4.32(m,2H),4.24-4.21(m,2H),2.76-2.70(m,4H),2.60-2.57(m,2H),1.93-1.85(m,8H),1.72-1.71(m,12H),1.51(s,9H),1.47(t,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(125MHz,CD3Cl,δ):172.4,172.0,171.6,152.9,150.2,145.8,144.8,143.6,136.4,128.9,128.0,127.6,125.6,125.0,122.2,121.7,110.8,110.5,101.9,101.1,49.5,49.1,44.4,40.0,33.8,31.2,29.7,28.3,28.1,28.0,27.1,26.6,26.3,24.5,22.7,20.7,14.4,12.5。
HRMS:m/z[M]+calc for C49H59ClN3O4 +:788.4189；found:788.4185。
按照上述方法制备如下所示结构的化合物6。
Figure BDA0002655388500000331
化合物6化学结构表征：
1H NMR(500MHz,CD3Cl,δ):10.69(s,1H),8.42-8.39(m,1H),8.28-8.24(m,1H),7.91-7.89(m,2H),7.43-7.35(m,5H),7.31-7.29(m,1H),7.24-7.17(m,3H),7.05-7.03(m,1H),6.43-6.40(m,1H),5.99-5.96(m,1H),4.28-4.25(m,2H),4.07-4.02(m,2H),2.75-2.73(m,2H),2.71-2.68(m,2H),2.62-2.59(m,2H),1.90-1.82(m,8H),1.71-1.70(m,12H),1.50(s,9H),1.43(t,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(125MHz,CD3Cl,δ):174.4,172.7,169.7,150.7,146.5,142.5,142.1,141.7,141.1,140.7,129.2,128.7,128.3,127.1,126.2,126.1,124.5,122.3,122.2,120.6,111.9,109.6,103.3,98.8,49.5,48.8,45.0,38.9,36.7,31.2,28.4,28.1,28.0,26.9,26.6,26.4,26.0,25.2,20.6,12.4,12.0。
HRMS:m/z[M]+calc for C49H60ClN4O3 +:787.4348；found:787.4346。
按照上述方法制备如下所示结构的化合物7。
Figure BDA0002655388500000341
化合物7化学结构表征：
1H NMR(500MHz,CD3Cl,δ):10.69(s,1H),8.42-8.39(m,1H),8.28-8.24(m,1H),7.91-7.89(m,2H),7.43-7.35(m,5H),7.31-7.29(m,1H),7.24-7.17(m,3H),7.05-7.03(m,1H),6.43-6.40(m,1H),5.99-5.96(m,1H),4.28-4.25(m,2H),4.07-4.02(m,2H),2.75-2.73(m,2H),2.71-2.68(m,2H),2.62-2.59(m,2H),1.90-1.82(m,8H),1.71-1.70(m,12H),1.50(s,9H),1.43(t,J＝7.0Hz,3H)。
13C NMR(125MHz,CD3Cl,δ):174.4,172.7,169.7,150.7,146.5,142.5,142.1,141.7,141.1,140.7,129.2,128.7,128.3,127.1,126.2,126.1,124.5,122.3,122.2,120.6,111.9,109.6,103.3,98.8,49.5,48.8,45.0,38.9,36.7,31.2,28.4,28.1,28.0,26.9,26.6,26.4,26.0,25.2,20.6,12.4,12.0。
HRMS:m/z[M]+calc for C49H60ClN4O3 +:787.4348；found:787.4346。
实施例中使用到的化合物1、2、3和8分别具有以下结构：
Figure BDA0002655388500000342
Figure BDA0002655388500000351
化合物1报道文献为：Near-infrared fluorescence imaging of cancermediated by tumor hypoxia and HIF1alpha/OATPs signalingaxis.Biomaterials2014,35,8175-8185；
化合物2报道文献为：A self-assembled“albumin-conjugate”nanoprobe fornear infrared optical imaging of subcutaneous and metastatic tumors.ACSAppl.Bio Mater.2020,3,327-334；
化合物3、8报道文献为：A novel"mosaic-type"nanoparticle for selectivedrug release targeting hypoxic cancer cells.Nanoscale 2019,11,2211-2222。
实施例2：化合物1-3、4、5和7在人肾癌细胞系786o中的荧光定位成像。
786o细胞(3×105/孔)提前接种于6孔板中，放置于细胞培养箱中48h，吸干培基，于实验孔中加入含有相应化合物(5μM)及Mito-tracker(0.2nM)的培基，孵育30min，PBS溶液清洗3次，使用配有红外相机及连续LED光源的荧光显微镜成像。近红外拍摄条件为Ex＝745nm，Em＝820nm；Mito-tracker拍摄条件为Ex＝488nm，Em＝520nm。
化合物1-3、4、5和7的实验结果分别如图1-6所示。
结果表明，化合物1-3、4、5和7可以被肿瘤细胞摄取，其在细胞内分布基本可以与Mito-tracker分布共定位，Mito-tracker可以标记细胞的线粒体，因此本实验在细胞层面证明此类化合物可以进入肿瘤细胞并富集于线粒体。
实施例3：化合物4，5在人肾癌细胞系A498中的荧光定位成像。
采用与实施例2相同的方法，但使用人肾癌细胞系A498来检测化合物4，5在细胞内的定位。
化合物4和5的实验结果如图7和8所示。结果表明，化合物4，5人肾癌细胞系A498中同样可以被肿瘤细胞摄取并富集于线粒体。
实施例4：化合物1-5、7与阴离子表面活性剂表面活性素(Surfactin)按不同比例混合后的荧光淬灭效果。
在相应化合物(终浓度20μM)的水溶液中加入不同浓度的表面活性素，被测化合物与表面活性素的摩尔比为1:5、1:1和1:0.2。以相应化合物(终浓度20μM)的甲醇溶液作为阳性对照。测试溶液震荡5分钟，加入到黑色96孔板中，每实验孔中加入50ul测试液。然后使用荧光成像仪成像。拍摄条件为Ex＝745nm，Em＝820nm。定量计算每孔的ROI(Region ofInterest)数值。
结果如图9所示。结果表明：(1)与甲醇溶液相比，在水溶液中化合物在表面活性素的作用下可以发生明显的荧光淬灭现象，即使在化合物与表面活性素的摩尔比下降为1:0.2的情况下，荧光淬灭效果依然明显。(2)化合物4、5、7的荧光淬灭效果好于化合物1、2、3，其中化合物1的荧光淬灭效果最差。
实施例5：化合物1-8与阴离子表面活性剂表面活性素(Surfactin)按不同比例混合后的荧光发射光谱测试。
相应化合物(终浓度20μM)的水溶液中加入不同浓度的表面活性素，被测化合物与表面活性素的摩尔比为1:5、1:1、1:0.2。以相应化合物(终浓度20μM)的甲醇溶液作为阳性对照。测试溶液震荡5分钟，使用荧光分光光度计检测其荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)。
化合物1-8的实验结果分别如图10-17所示。
结果表明：与甲醇溶液相比，化合物1在水溶液中化合物在表面活性素的作用下(化合物1与表面活性素摩尔比为1:5)可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光明显淬灭效果下降。与甲醇溶液相比，化合物2在水溶液中化合物在表面活性素的作用下(化合物2与表面活性素摩尔比为1:5)可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光淬灭效果明显下降。与甲醇溶液相比，化合物3在水溶液中化合物在表面活性素的作用下(化合物3与表面活性素摩尔比为1:5)可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光淬灭效果明显下降。与甲醇溶液相比，化合物4在水溶液中化合物在表面活性素的作用下可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光淬灭效果无明显下降。与甲醇溶液相比，化合物5在水溶液中化合物在表面活性素的作用下可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光淬灭效果无明显下降。与甲醇溶液相比，化合物6在水溶液中化合物在表面活性素的作用下可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光淬灭效果无明显下降。与甲醇溶液相比，化合物7在水溶液中化合物在表面活性素的作用下可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光淬灭效果无明显下降。与甲醇溶液相比，化合物8在水溶液中化合物在表面活性素的作用下可以发生明显的荧光淬灭现象；当减少表面活性素用量时，荧光淬灭效果无明显下降。
实施例6：化合物4与多种表面活性剂混合后的荧光发射光谱测试。
化合物4(终浓度20μM)的水溶液中加入不同的表面活性剂，被测化合物与表面活性素的质量比为1:1。另，化合物(终浓度20μM)的甲醇溶液作为阳性对照。测试溶液震荡5分钟，使用荧光分光光度计检测其荧光发射光谱(Ex＝730nm，Em＝760-960nm)。
实验结果如图18所示。图18中，各曲线从上到下依次代表：十二烷基三甲基氯化铵(5)、为聚环氧乙烷-聚环氧丙烷-聚环氧乙烷三嵌段共聚物(P123，4)、为聚氧乙烯蓖麻油(Kolliphor，3)、人血清白蛋白(2)、四丁基碘化铵(6)、十二烷基磺酸钠(7)、十二烷基苯磺酸钠(8)和表面活性素(1)，其中，7、8和1基本重合。
结果表明：人血清白蛋白、非离子表面活性剂(Kolliphor、P123)及阳离子表面活性剂(十二烷基三甲基氯化铵、四丁基碘化铵)与化合物4在水溶液中混合后会降低其荧光信号强度，但是溶液依然有荧光信号出现。阴离子表面活性剂(表面活性素、十二烷基磺酸钠、十二烷基苯磺酸钠)与化合物4在水溶液中混合后都会发生荧光淬灭效应，其溶液基本无荧光信号。
实施例7：化合物4、5、7在水溶液中与表面活性素(Surfactin)按摩尔比为1:5混合后的微观形态测试。
在相应化合物(终浓度20μM)的水溶液中加入表面活性素(终浓度100μM)，被测化合物与表面活性素的摩尔比为1:5。测试溶液震荡5分钟，使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)检测其微观形态。
实验结果如图19所示。结果表明：化合物4、5、7在水溶液中与表面活性素(Surfactin)按摩尔比为1:5混合后可以形成粒径在50-100nm的颗粒。
实施例8：化合物1-8在小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中的近红外成像
订购5周龄左右的雌性裸鼠，屏障环境中适应一周后进行皮下肾透明细胞癌细胞786o接种，具体位置是右下肢上方(3×106/只，混悬于200μl PBS溶液中)。待肿瘤体积达到50-150mm3大小(12-22天左右)，将裸鼠随机分组，每实验组3只，对小鼠进行剖杀，剖取肿瘤组织。
表面活性素的水溶液中分别加入化合物1-8，表面活性素的终浓度为100μM，各化合物的终浓度为20μM(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)。
将肿瘤组织浸泡于上述液体中。规定时间后使用荧光成像仪成像。
化合物1-8的实验结果分别如图20-27所示。如图20-27所示，肿瘤组织ROI数值定量分析的结果表明：(1)肿瘤组织对化合物1、2、3、8的摄取与浸泡时间无明显的正相关关系，因此对于化合物1、2、3、8的实验组，肿瘤组织近红外成像的原因更多的是组织对化合物的非特异性吸附，而非肿瘤靶向识别。(2)肿瘤组织对化合物5，7的摄取随浸泡时间而增加，具有一定的正相关关系，肿瘤组织近红外成像的原因是化合物对肿瘤组织的靶向性识别。但是肿瘤组织对化合物的摄取量较低。(3)肿瘤组织对化合物4、6的摄取随浸泡时间而增加，具有明显的正相关关系，肿瘤组织近红外成像的原因是化合物对肿瘤组织的靶向性识别。肿瘤组织对化合物的摄取量较高。因此，化合物4和6具有最优的肿瘤组织成像效果。
实施例9：化合物4，6在小鼠皮下异种种植乳腺癌肿瘤模型中的近红外成像
采用实施例8所述的方法构建小鼠皮下异种种植乳腺癌肿瘤模型，然后使用该小鼠模型检测化合物4，6(水溶液，化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)在肿瘤组织的近红外成像。
化合物4和6的实验结果如分别图28和29所示。如图28和29所示，肿瘤组织ROI数值定量分析结果表明：小鼠皮下异种种植乳腺癌肿瘤模型中，肿瘤组织同样对化合物4、6的摄取随浸泡时间而增加，具有明显的正相关关系，且肿瘤组织对化合物的摄取量较高。
实施例10：在小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型中，化合物4在过量竞争下的近红外成像
采用实施例8所述的方法构建小鼠皮下异种种植肾透明细胞癌肿瘤模型，然后使用该小鼠模型检测化合物4(水溶液，化合物与表面活性素的摩尔比为1:5，并加入终浓度为1mM的磺溴酚酞钠(Bromosulfophthalein)(50当量))在肿瘤组织的近红外成像。
实验结果如图30所示。磺溴酚酞钠是已报道的有机阴离子转运蛋白(organicanion transporting polypeptides，OATPs)的抑制剂。实验结果表明，使用过量的磺溴酚酞钠可以有效降低肿瘤组织对化合物4的摄取。因此可以推断化合物4以及本发明的其它化合物对肿瘤组织的靶向性识别是通过有机阴离子转运蛋白实现的。
实施例11：化合物1-8与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)在小鼠原发肠癌肿瘤模型中的近红外成像。
小鼠原发肠癌肿瘤模型的建立：APCmin/+小鼠模型，亲代C57BL/6J-APC min/+小鼠与C57BL/6J wt小鼠合笼繁殖，检测子代基因型并筛选出子代C57BL/6J-APC min/+小鼠(发病小鼠)。第20周处死子代C57BL/6J-APC min/+小鼠。对小鼠进行剖杀，剖取已发病的结肠组织，纵切结肠，进行后续试验。
表面活性素的水溶液中加入化合物1-8，表面活性素的终浓度为100μM，化合物的终浓度为20μM(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)。
小鼠已发病的结肠组织浸泡于上述液体中。12min后使用荧光成像仪成像。
化合物1-8的实验结果分别如图31-38所示。
实验结果表明，通过短时间的浸泡接触，化合物1、2、3与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)对于小鼠原发肠癌肿瘤模型中肿瘤病灶组织具有识别效果。化合物4、5、6与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)对于小鼠原发肠癌肿瘤模型中肿瘤病灶组织具有高特异性识别。肿瘤病灶组织的荧光强度明显高于正常肠组织，具有优良的信噪比，成像结果清晰可辨。化合物4与化合物6的成像效果最佳。化合物7与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)对于小鼠原发肠癌肿瘤模型中肿瘤病灶组织具识别效果。化合物8与阴离子表面活性剂表面活性素混合液(化合物与表面活性素的摩尔比为1:5)对于小鼠原发肠癌肿瘤模型中肿瘤病灶组织基本不具备识别效果。肿瘤病灶组织与正常肠组织的荧光信号都比较弱，其成像结果信噪比极差，无明显成像效果。

Claims (20)

1.一种造影剂，其含有下式I所示的化合物和阴离子表面活性剂：
Figure FDA0002655388490000011
式中，
X－为阴离子；
R1-R8各自独立为H、羟基、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基和任选取代的5-14元杂环基；或者，R1与R2、R2与R3或R3与R4分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环，R5与R6、R6与R7或R7与R8分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环；
R21和R22各自独立为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-SO3N(Ra)3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基；其中，Ra各自独立为H和C1-4烷基；
n1和n2各自独立选自0-12的整数，优选选自0-6的整数；和
L为键，或为接头基团。
2.如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，
基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21相同，均为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选均为任选被-COOH取代的C1-6烷基；和/或
R1-R8均为氢。
3.如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，
基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22的空间位阻大于-(CH2)n2-R21基团的空间位阻；优选地，R22选自任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基，R21为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，优选为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，更优选为H或C1-6烷基；和/或
R1-R8均为氢；和/或
L选自*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1选自NH、O、S，T2选自O、NH和S，*表示与-(CH2)n1-连接的位置；优选地，L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，T1优选为NH或O。
4.如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，
基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选为任选被-COOH取代的C1-6烷基；基团-(CH2)n2-R21为任选被1或2个选自卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH和-NH2的取代基取代的C1-6烷基，优选为任选被-COOH取代的C1-6烷基，且其碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度；优选地，基团-(CH2)n1-L-R22为任选被-COOH取代的C1-6烷基，基团-(CH2)n2-R21为任选被-COOH取代的C1-6烷基，且基团-(CH2)n2-R21的碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度；更优选地，基团-(CH2)n1-L-R22为被-COOH取代的C1-6烷基，基团-(CH2)n2-R21为未被取代的C1-6烷基，且基团-(CH2)n2-R21的碳链长度短于基团-(CH2)n1-L-R22的碳链长度；和
R1-R8均为氢。
5.如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，
R1-R8为氢；
L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH或O；
n1和n2各自为1-6的整数；
基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基；和
R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
6.如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述式I化合物具有下式Ia、Ib或Ic所示的结构：
Figure FDA0002655388490000031
Figure FDA0002655388490000041
各式中，n1、n2、L、R21和R22如权利要求1-6中任一项所述；
R9-R20各自独立选自H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C5-14杂芳基和C3-10杂环基；优选地，R9-R20各自独立为H、卤素和C1-6烷基，更优选均为H。
7.如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述阴离子选自：F-、Cl-、Br-、I-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3COO-和CH3SO3 -。
8.如权利要求1所述的造影剂，其特征在于，所述式I化合物选自以下化合物中的一个或多个：
Figure FDA0002655388490000042
Figure FDA0002655388490000051
9.如权利要求1-8中任一项所述的造影剂，其特征在于，
所述阴离子表面活性剂选自羧酸盐、磺酸盐、硫酸酯盐、磷酸酯盐和脂肽类阴离子表面活性剂，优选为磺酸盐类或脂肽类阴离子表面活性剂，更优选为表面活性素、十二烷基磺酸钠和/或十二烷基苯磺酸钠；和/或
所述式I化合物与所述阴离子表面活性剂的摩尔比在1：(20～0.1)的范围内，优选1：(10～0.1)或1：(5～0.2)；和/或
所述造影剂中，所述式I化合物的终浓度在1～100μM的范围内，优选5～50μM或10～30μM；和/或
所述造影剂溶液的粒径为10-200nm，优选为30-150nm，更优选为50-100nm；和/或
所述造影剂为溶液形式或冻干粉末形式。
10.一种检测试剂盒，其含有权利要求1-8中任一项所述的式I化合物和阴离子表面活性剂；优选地，所述阴离子表面活性剂如权利要求9所述；
优选地，所述检测试剂盒含有权利要求1-9中任一项所述的造影剂。
11.如下所定义的式I’化合物：
Figure FDA0002655388490000052
式中，
X－为阴离子；
R1-R8各自独立为H、羟基、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-10环烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的5-14元杂芳基和任选取代的5-14元杂环基；或者，R1与R2、R2与R3或R3与R4分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环，R5与R6、R6与R7或R7与R8分别与它们所连接的碳原子一起，形成任选取代的3-8元碳环、6-14元芳环、5-14元杂芳环或5-14元杂环；
R21和R22各自独立为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、-SO3N(Ra)3、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基；其中，Ra各自独立为H和C1-4烷基；
n1和n2各自独立选自0-12的整数，优选选自0-6的整数；和
L为键，或为接头基团；
其中，基团-(CH2)n1-L-R22与基团-(CH2)n2-R21不同，且基团-(CH2)n1-L-R22的空间位阻大于-(CH2)n2-R21基团的空间位阻。
12.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，
R1-R8均为氢；和/或
L选自*-T1-C(O)-、*-C(O)-T1-、*-S(O)2-T2-和*-T2-S(O)2-，其中，T1选自NH、O、S，T2选自O、NH和S，*表示与-(CH2)n1-连接的位置；优选地，L选自*-T1-C(O)-和*-C(O)-T1-，其中，T1选自NH和O；和/或
R22选自任选取代的C3-15环烷基、任选取代的C3-15环烷基C1-6烷基、任选取代的6-14元芳基、任选取代的6-14元芳烷基、任选取代的5-14元杂芳基、任选取代的5-14元杂芳基C1-6烷基、任选取代的5-14元杂环基和任选取代的5-14元杂环基C1-6烷基；优选地，R22为任选被1或2个选自卤素、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、氨基、C1-6烷氧基和卤代C1-6烷氧基的取代基取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基；更优选地，R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基；和/或
R21为H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，优选为H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2或C1-6烷氧基，更优选为H或C1-6烷基。
13.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，
R1-R8为氢；
L为*-T1-C(O)-或*-C(O)-T1-，其中T1选自NH、O和S；n1和n2各自为1-6的整数；
基团-(CH2)n2-R21为C1-6烷基；
R22为任选被-NR’R”取代的C6-14芳基或C3-15环烷基C1-6烷基，其中，R’选自C1-4烷基和C1-6烷氧基羰基，R”选自H和C1-4烷基。
14.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述阴离子选自：F-、Cl-、Br-、I-、NO3 -、SO4 2-、PO4 3-、HPO4 2-、H2PO4 -、CO3 2-、HCO3 -、SO3 2-、HSO3 -、CH3COO-和CH3SO3 -。
15.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述式I’化合物具有下式Ia’、Ib’或Ic’所示的结构：
Figure FDA0002655388490000071
Figure FDA0002655388490000081
各式中，X-、n1、n2、L、R21和R22如权利要求11-14中任一项所述；
R9-R20各自独立选自H、卤素、硝基、氰基、-SO3、-COOH、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6酰基、-NH2、C1-6烷氧基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C5-14杂芳基和C3-10杂环基。优选地，R9-R20各自独立为H、卤素和C1-6烷基，更优选均为H。
16.如权利要求11所述的化合物，其特征在于，所述式I’化合物选自：
Figure FDA0002655388490000082
Figure FDA0002655388490000091
17.一种造影剂，其含有权利要求11-16中任一项所述的式I’化合物和任选的阴离子表面活性剂；优选地，所述阴离子表面活性剂如权利要求9所述。
18.一种检测试剂盒，其含有权利要求11-16中任一项所述的式I’化合物和任选的阴离子表面活性剂；优选地，所述阴离子表面活性剂如权利要求9所述；优选地，所述检测试剂盒含有权利要求17所述的造影剂。
19.权利要求11-16中任一项所述的式I’化合物和任选的阴离子表面活性剂在制备肿瘤造影剂中的应用；权利要求1-8中任一项所述的式I所示化合物和阴离子表面活性剂在制备肿瘤造影剂中的应用；优选地，所述阴离子表面活性剂如权利要求9所述。
20.一种造影剂或含有该造影剂的检测试剂盒，其特征在于，所述造影剂含有化合物4和/或化合物6以及表面活性素或十二烷基磺酸钠：
Figure FDA0002655388490000092
其中，造影剂中所述化合物4、所述化合物6、或所述化合物4和化合物6与所述表面活性素或所述十二烷基磺酸钠的摩尔比在1：(20～0.1)的范围内，优选1：(10～0.1)或1：(5～0.2)；
优选地，所述造影剂为溶液形式或冻干粉末形式。
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