CN112189014B - 具有开关核磁共振造影增强的膀胱癌光动力治疗剂 - Google Patents

具有开关核磁共振造影增强的膀胱癌光动力治疗剂 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种作为有效治疗诊断剂的卟啉–镧系元素复合物；以及其制备与使用方法。前述卟啉–镧系元素复合物在癌症的治疗及成像上为有效。

Description

具有开关核磁共振造影增强的膀胱癌光动力治疗剂
相关申请的交叉引用
本申请要求主张2018年4月3日提交的美国临时申请第62/652,302号及2019年4月2日提交的美国申请第16/372,492号的优先权，其内容通过引用整体并入本文。
技术领域
本发明提供一种可用作治疗诊断剂的卟啉–镧系元素复合物；以及其制备与使用方法。
背景技术
尽管光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)提供一种有效的医学治疗策略，科学家仍热衷于从单一功能的PDT药剂发展更精细的药物。近期所采用的词汇“治疗诊断学”描述一新类型的同时具有治疗及诊断功能的多功能化合物。PDT与核磁共振造影(magneticresonance imaging,MRI)的组合特别是具有发展潜力的候选者，尤其是能够进行双光子激发的药剂。
以卟啉为基础的复合物是用于PDT的熟知的光敏剂。当激发时，以卟啉为基础的复合物会经历电子跃迁，通过系间跨越从单重基态跃迁到三重激发态。当三重激发态的光敏剂与存在于肿瘤位置的分子氧反应时会产生杀死癌细胞的单态氧(1O2)。已报道许多以卟啉为基础的光敏剂具有杀死癌细胞的性质。然而，光敏剂在空间与时间上的控制仍限制以卟啉为基础的复合物用于PDT的用途。再者，需求具有降低的暗细胞毒性、但具有高度光细胞毒性且对癌细胞有高选择性的光敏剂。
核磁共振造影(MRI)是早期疾病诊断最有效的成像技术之一。其于检测肿瘤具有诸多优势，例如提供高空间分辨率成像及清楚的组织对比度。其另一重要优势为相较于其他成像方法，例如：正子放射断层造影(positron emission tomography,PET)、单光子发射计算机断层扫描(single-photon emission computed tomography,SPECT)、X射线计算机断层扫描(X-ray computer tomography)，MRI不须使用有害的高能量辐射。使用显影剂可以提升MRI的信号噪声比。临床上已使用基于钆的显影剂数十年。然而，临床上合格且表现高度纵向弛缓时间(T1信号)的基于钆的显影剂非常有限。再者，对于基于钆的显影剂的安全性的顾虑日益增加。因此，有必要研发更安全且更有效的可低剂量施给的基于钆的显影剂。
基于钆的双功能治疗诊断剂得到许多关注。然而，基于钆的双功能治疗诊断剂在成像及治疗功能之间所需剂量上需要取得一个平衡，因为基于Gd(III)的治疗诊断剂在成像上需要的剂量，通常比治疗诊断剂在治疗用途上需要的剂量更高。
减少治疗剂量的目标可以通过提升药物选择性来达成。整合素是由二聚体非共价结合的跨膜α-v及β-3(αVβ3)亚单位所组成的细胞黏着分子。其作为各种细胞外基质蛋白的受体。由于αVβ3-整合素会在膀胱癌的新生血管而不是在正常组织的血管过度表现，αVβ3-整合素成为膀胱癌的分子成像及PDT治疗的理想目标。
膀胱癌的诊断及局部分期为抗癌治疗期间另一个重要课题。MRI在提供高分辨率影像以准确地诊断膀胱癌上具有许多优势。除了多面成像，MRI还可以对比软组织，使其成为监控膀胱癌的一个实用技术，例如藉由清楚分辨膀胱组织的璧层。该技术还被用于揭示肿瘤的壁内侵入及肿瘤的膀胱外扩张。除此之外，传统MRI显影剂的主要缺点为缺乏标靶性，且证据显示部分先前市售的线性含钆显影剂会在成像过程时对于肾功能不全患者产生副作用。
发明内容
本发明提供一种卟啉–镧系元素金属复合物，其可以选择性地与αVβ3整合素靶向肽缀合，作为癌症的成像及/或治疗剂。本发明所提供的金属复合物可表现高度T1信号增强和T1弛缓率、低暗细胞毒性、高光毒性以及高光动力治疗指数。
在第一方面，本文提供了一种金属复合物，其包含式I的化合物：
Figure GDA0004160853130000031
或其药学上可接受的盐，其中，
M为2H或Zn2+；或M具有结构：
Figure GDA0004160853130000032
A为可选择性地被取代的苯基；
X为不存在或
Figure GDA0004160853130000033
Y为-(CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-(OCH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-或
Figure GDA0004160853130000034
Z为-(C＝O)NHR3或
Figure GDA0004160853130000041
n为选自1-10的整数；
Ln对于各实例独立地为顺磁性的金属离子；
R1各自独立地为可选择性地被取代的芳基；
R2各自独立地为烷基
R3为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；
R4各自独立地为O-、N(R5)2或NHR3；以及
R5各自独立地为H或烷基，前提为M或Z至少其一包含Ln。
在第一方面的第一实施方式中，本文提供一种第一方面的金属复合物，其中，Ln选自Gd(III)。
在第一方面的第二实施方式中，本文提供一种第一方面的金属复合物，其中，M具有结构：
Figure GDA0004160853130000042
X为
Figure GDA0004160853130000043
Y为-(CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-；且
Z为-(C＝O)NHR3；或
M为2H或Zn2+；X为不存在或
Figure GDA0004160853130000044
Y为-(OCH2CH2)n-或
Figure GDA0004160853130000051
且Z为/>
Figure GDA0004160853130000052
在第一方面的第三实施方式中，本文提供一种第一方面的金属复合物，其中，M具有结构：
Figure GDA0004160853130000053
X为
Figure GDA0004160853130000054
Y为-(CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-；且
Z为-(C＝O)NHR3。
在第一方面的第四实施方式中，本文提供一种第一方面的第三实施方式的金属复合物，其中，X为
Figure GDA0004160853130000055
Y为-(CH2CH2O)nCH2-；且R2为C1-C4烷基。
在第一方面的第五实施方式中，本文提供一种第一方面的第三实施方式的金属复合物，其中，X为
Figure GDA0004160853130000056
Y为-(CH2CH2O)n-；且R2为C1-C4烷基。
在第一方面的第六实施方式中，本文提供一种第一方面的金属复合物，其中，式I的化合物选自由
Figure GDA0004160853130000061
及
Figure GDA0004160853130000062
所组成的组，
其中Ln为Gd(III)。
在第一方面的第七实施方式中，本文提供一种第一方面的第六实施方式的金属复合物，其中，M为2H或Zn2+；X为不存在或
Figure GDA0004160853130000063
Y为-(OCH2CH2)n-或
Figure GDA0004160853130000064
且Z为/>
Figure GDA0004160853130000065
在第一方面的第八实施方式中，本文提供一种第七方面的第六实施方式的金属复合物，其中，X不存在；Y为
Figure GDA0004160853130000066
且R4为O-或NHR5。
在第一方面的第九实施方式中，本文提供一种第七方面的第六实施方式的金属复合物，其中，X不存在；Y为-(OCH2CH2)n-；R4的两个实例各自为N(R5)2；且R4的一个实例为NHR3。
在第一方面的第十实施方式中，文本提供一种第一方面的金属复合物，其中，式I的化合物选自由
Figure GDA0004160853130000071
及
Figure GDA0004160853130000072
所组成的组，
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
第二方面中，本文提供一种药学组合物，其包含第一方面的金属复合体，及至少一种药学上可接受的赋形剂。
第三方面中，本文提供一种使用核磁共振造影(MRI)成像一受试者的方法，前述方法包括：对受试者施用治疗有效量的第一方面的金属复合物；以及通过MRI成像所述受试者的至少一部分。
在第三方面的第一实施方式中，本文提供一种第三方面的方法，其中，所述金属复合物选自由
Figure GDA0004160853130000081
Figure GDA0004160853130000082
及
Figure GDA0004160853130000083
所组成的组，
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
在第三方面的第二实施方式中，本文提供一种第三方面的方法，其中进一步包括对受试者施用治疗有效量的癌症治疗剂的步骤。
第四方面中，本文提供一种治疗有需求的受试者的癌症的方法，所述方法包括：施用治疗有效量的第一方面的金属复合物；以及以电磁辐射照射含有癌的靶组织，前述电磁辐射具有在所述金属复合物的活化波长内的波长。
在第四方面的第一实施方式中，本文提供一种第三方面的方法，其中，所述癌症是膀胱癌。
在第四方面的第二实施方式中，本文提供一种第三方面的方法，其中，所述金属复合物选自由
Figure GDA0004160853130000091
Figure GDA0004160853130000101
及
Figure GDA0004160853130000102
所组成的组，
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
第五方面中，本文提供一种通过核磁共振造影(MRI)成像一受试者及治疗受试者的癌症的方法，所述方法包括：对受试者施用治疗有效量的权利要求1的金属复合物；以电磁辐射照射含有癌的靶组织，所述电磁辐射具有在所述金属复合物的活化波长内的波长；并通过MRI成像所述受试者的至少一部分。
在第五方面的第一实施方式中，本文提供一种第五方面的方法，其中，所述金属复合物选自由
Figure GDA0004160853130000111
Figure GDA0004160853130000112
及
Figure GDA0004160853130000113
所组成的组，
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
附图说明
结合附图，根据下述的对本发明的描述，本发明上述及其他目的与特征将更显见，其中：
图1表示11个用于膀胱癌标靶核磁共振造影(MRI)及光动力疗法(PDT)的合成的钆复合物。
图2表示玻连蛋白-αvβ3整合素的净结合率与NLPor-Gd-L1R3的浓度间的关系。
图3表示NLPor-Gd-L1R3(n＝1-3)在人类膀胱癌细胞(T24)、正常细胞(MRC-5)及子宫颈癌细胞(HeLa)中的体外(in vitro)成像。(药剂浓度：5μM、培养时间：24小时、λex＝561nm)。
图4显示在T24细胞内利用绿色溶酶体探针(lysotracker green)共同染色的NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的亚细胞定位。(药剂浓度：5μM、培养时间：24小时、λex＝561nm)。
图5(a)表示用550nm长通滤波器照射10J cm-2下T24细胞中NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的体外光细胞毒性；(b)表示用550nm长通滤波器照射10J cm-2下HeLa细胞中NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的体外光细胞毒性；(c)表示用550nm长通滤波器照射10J cm-2下MRC-5细胞中NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的体外光细胞毒性；及(d)以NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在T24、HeLa、MRC-5细胞中的暗及光IC50值表示的NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的体外光细胞毒性。
图6表示弛缓率(1/T1)与Gd(III)(3％ DMSO的H2O)在GdDOTA(对照组)、NLPor-Gd-L1R3及结合αvβ3整合素的NLPor-Gd-L1R3中的浓度之间的关系。
图7(a)表示Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在HeLa及MRC5细胞中的共聚焦成像。在正常细胞MRC5中，Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的发射发现于细胞外，然而在HeLa癌症细胞中，Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的发射发现于细胞膜及细胞质内；及(b)表示HeLa细胞中的Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2发射的共同定位已通过绿色溶酶体及粒线体探针实现。(λex＝488nm、Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2浓度为10μM、溶酶体或粒线体探针浓度为50nM，Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在细胞中孵育24小时并成像。加入溶酶体或粒线体探针后再多孵育30分钟。)
图8以Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An(n＝1或2)在HeLa、HK1及MRC-5细胞中的暗及光IC50值表示其体外光细胞毒性。
图9表示弛缓率(1/T1)与Gd(III)(含有3％ DMSO的H2O)在GdDOTA(对照组)、Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A1及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2中的浓度之间的关系。
图10表示藉由尾静脉注射通过NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)及Zn-NLPorB2-Cyc-L2An(n＝1或2)所诱发之1O2的体内肿瘤抑制作用。
图11通过ICP-MS研究表示NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An(n＝1或2)在膀胱癌肿瘤及非膀胱癌肿瘤中的离体(ex vivo)生物分布(ppm/g，组织内)。
图12表示(a)在不同时间点注射GdDOTA前及注射后，小鼠肿瘤模型的体内T1加权MR(核磁共振)成像；(b)在不同时间点注射NLPor-Gd-L1前及注射后，小鼠肿瘤模型的体内T1加权MR成像；及(c)在不同时间点注射NLPor-Gd-L1R3前及注射后，小鼠肿瘤模型的体内T1加权MR成像。
图13表示随着时间经过，NLPor-Gd-L1R3在pH7缓冲液(黑色)及pH5缓冲液(红色)的峰面积积分的变化。
图14(a)表示NLPor-Gd-L1R3在pH7缓冲液中随时间经过的RP-HPLC色谱；及(b)表示NLPor-Gd-L1R3在pH5缓冲液中随时间经过的RP-HPLC色谱。
图15表示NLPor-Gd-L1Rn的结构，n＝3：AhxRRrKcGRLKEKKC(SEQ ID NO:3)。
图16表示(a)NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的分子结构；(b)玻连蛋白-αvβ3整合素的净结合率在不同NLPor-Gd-L1Rn浓度下的置换百分比；(c)200μM的NLPor-Gd-L1R3在pH 7及pH5的PBS缓冲液中的稳定性的RP-HPLC分析结果。
图17表示下述所列者的体外成像：(a)在人类膀胱癌细胞(T24)、正常细胞(MRC-5)及子宫颈癌细胞(HeLa)中的NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)及(b)在T24细胞内藉由绿色溶酶体探针共同染色的NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的亚细胞定位。剂量：5μM、孵育时间：24小时、λex＝561nm。
图18表示(a)T1弛缓率与Gd(III)(含有3％ DMSO的H2O)在Gd-DOTA(对照组)或结合/未结合αvβ3整合素的NLPor-Gd-L1R3中的浓度之间的关系；(b)在体内PDT过程中T24肿瘤的体积变化，数据以平均值±SEM表示。*指P<0.005，与PBS-激光对照相比，统计上具显著性差异；(c)体内PDT后所切除的肿瘤代表图；(d)膀胱癌异体移植──T24；及(e)非膀胱癌异体移植──HeLa小鼠(□：无光、+：有光；λex＝808nm、剂量＝50J/cm2)。
图19描述(a)NLPor-Gd-L1R1、NLPor-Gd-L1R2和NLPor-Gd-L1R3对T24、HeLa、MRC-5细胞系的光IC50、暗IC50及光动力治疗指数的表；及(b)描述表示Er-R1、Yb-R1、Er-R2、Yb-R2、Er-R3、Yb-R3(揭露于PCT申请号PCT/CN2017/104492，其通过引用并入本文)、ALA对T24、HeLa、MRC-5细胞系的光IC50、暗IC50及光动力治疗指数的表。
图20显示在不同时间点注射(a)GdDOTA；(b)NLPor-Gd-L1；(c)NLPor-Gd-L1R3后，对小鼠T24肿瘤模型的体内T1加权MR成像。(d)藉由ICP-MS研究的NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在膀胱癌肿瘤及非膀胱癌肿瘤的中的离体生物分布。
图21描述卟啉镧系元素复合物NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的合成路径的示例性示意图。
图22表示化合物2的400MHz-1H-NMR(CDCl3)谱。
图23表示化合物2的400MHz-13C-NMR(CDCl3)谱。
图24表示化合物3的400MHz-13C-NMR(CDCl3)谱。
图25表示化合物4的400MHz-1H-NMR(CDCl3)谱。
图26表示化合物4的400MHz-13C-NMR(CDCl3)谱。
图27表示Gd-1的MS谱(MALDI-TOF)。
图28表示Gd-2的MS谱(MALDI-TOF)。
图29表示在298K时NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在水溶液(浓度：1μM)中的吸收光谱。
图30表示在298K时NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在水溶液(浓度：1μM，λex＝430nm)中的发射光谱。
图31表示NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)及标准品四苯基卟啉(H2TPP)在CHCl3(Abs＝0.05,λex＝425nm)中的近红外1O2磷光光谱。
图32表示显示能量从卟啉转移到Yb3+及Gd3+离子的简易图。
图33表示在光敏剂(10μM)(a)对照、(b)RB、(c)NLPor-Gd-L1R1、(d)NLPor-Gd-L1R2及(e)NLPor-Gd-L1R3存在下，9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(9,10-anthracenediylbis(methylene)dimalonic acid；ABDA，200μM)在PBS缓冲液中于不同照射时间下的吸收光谱(功率密度为6mW·cm-2的LED灯，其配备有550nm长通滤波器)。
图34表示在RB及NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的存在下，ABDA在LED灯光(功率密度为6mWcm-2)照射下于402nm的吸光度变化与照射时间关系图。
图35描述NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的光物理测量的总结表格。a在298K时于水溶液中评估的吸收及发射光谱。b通过在无水DCM(Φem＝0.120)中与四苯基卟啉(H2TPP)进行比较来测量发射量子产率。c通过评估ABDA在402nm处的吸光度变化在PBS缓冲液中测量单态氧量子产率。d通过在无水CHCl3(Φ△＝0.55)中与四苯基卟啉(H2TPP)的发射进行比较来测量单态氧量子产率。
图36描述NLPor-Gd-L1R3及Gd-DOTA的T1弛缓率的图表。a以ICP-MS校正Gd(III)的浓度。b对每个样品测量纵向弛缓时间两次，并在0.17T时取平均值。c纵向弛缓率，R1＝(1/T1-1/T0)。
图37显示未加入αvβ3的NLPor-Gd-L1R3的T2弛缓率。
图38显示加入αvβ3的NLPor-Gd-L1R3的T2弛缓率。
图39显示NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在T24中孵育3小时及24小时的流式细胞术结果。
图40(a)、(b)及(c)显示NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在T24中孵育3小时及24小时的流式细胞术结果。
图41显示NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的分析型HPLC谱。
图42显示NLPor-Gd-L1R1的LC-MS谱。
图43显示NLPor-Gd-L1R2的LC-MS谱。
图44显示NLPor-Gd-L1R3的LC-MS谱。NLPor-Gd-L1R1：LC-MS：计算C112H124CoF15N22O27P3S3Gd[M+H]+2901.5212得到：2901.5530。[M+3H]3+967.1950，得到：967.5291。HPLC特征：滞留时间＝20.777分钟。NLPor-Gd-L1R2：LC-MS：计算C116H143CoF15N23O27P3S2Gd[M+2H]2+1474.3525得到：1474.3752。[M+3H]3+983.9225得到：983.9171。HPLC特征：滞留时间＝21.401分钟。NLPor-Gd-L1R3：LC-MS：计算C146H202CoF15N38O32P3S2Gd[M+2H]2+1829.1728得到：1829.1979。[M+3H]3+1219.3333得到：1219.4145。HPLC特征：滞留时间＝20.751分钟。
图45显示评估不同pH值下稳定性的分析型HPLC的溶剂梯度。
图46显示NLPor-Gd-L1R3在pH 5及pH 7水溶液中的分析型HPLC谱。
图47显示小鼠在体内PDT施用NLPor-Gd-L1R3中的体重变化。
图48显示使用550nm长通滤波器，在10J cm-2照射下在T24、HeLa及MRC-5细胞中NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的体外光细胞毒性。
图49显示(a)Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的结构；(b)Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及Gd-DOTA在1.4T、37℃时的T1弛缓率。
图50描述表示在1J/cm2光照射下(λex＝430nm)，Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的光物理特性、单态氧量子产率，Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2、Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及ALA对癌症细胞株HeLa、T24及正常细胞株MRC-5的光细胞毒性与暗细胞毒性的总结表格，MTT试验系在37℃孵育24小时后进行。
图51显示在480nm激光激发下的HeLa及MRC5细胞在绿色溶酶体探针(LysoTrackerGreen)及不同浓度的Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2下的共同染色共聚焦成像。(Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在各细胞系中孵育24小时；50nM的绿色溶酶体探针(LysoTracker Green)在各细胞系中孵育30分钟)。
图52显示(a)肿瘤经过PDT后的代表图。(b)肿瘤在PDT治疗期间的体积变化。(c)Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在不同时间点的体内生物分布。
图53显示(a)在尾静脉注射Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及Gd-DOTA后随时间经过的S18异体移植小鼠横切面的核磁共振代表图。(b)Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及Gd-DOTA随时间经过所产生的T1信号增强。(c)S18异体移植小鼠及正常小鼠随时间经过的体内荧光代表图。
图54显示(a)Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的分子结构，(b)Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的吸收光谱，(c)Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在430nm激发下的发射光谱，(d)Gd-DOTA及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的T1弛缓率图(1.4T、37℃)。
具体实施方式
定义
本说明书所使用用语的定义应结合该用语在生物科技领域中所被认可的当前现有技术的定义。在适当时，提供举例。除非另限定于特定实例，前述用语的定义通用于整份说明书，不论是单独适用或作为较大组的部分而适用。
当本说明书使用商品名时，申请人意欲独立地包含商品名产品的制剂、学名药、商品名产品的活性药物成分。
用语“杂原子”为先前技术所习知并指除了碳或氢以外的任一元素的原子。示例性的杂原子包含硼、氮、氧、磷、硫及硒。
用语“烷基”为先前技术所习知，并包含：饱和脂肪族基团，其包含直链烷基、支链烷基、环烷基(脂环基)，烷基取代的环烷基及环烷基取代的烷基。在特定实施例中，直链烷基或支链烷基在其主链中具有约30个或更少的碳原子(例如：直链为C1-C30，支链为C3-C30)，或者20个或以下。同样地，环烷基在其环结构中具有约3至10个碳原子，或者在环结构中具有约5、6或7个碳原子。
除非对碳数另有说明，“低级烷基”指如前述的烷基，但在其主链结构中有1至约10个碳原子，或有1至约6个碳原子。同样地，“低级烯基”及“低级炔基”有相似的链长。
用语“芳烷基”为先前技术所习知并指被芳基(例如：芳香族或杂芳香族基团)所取代的烷基。
用语“烯基”及“炔基”为先前技术所习知并指长度相似的不饱和脂肪族基团以及前述烷基可能的取代物，但至少分别包含一个双键或三键。
用语“芳基”为先前技术所习知并指5、6及7元单环芳香族基团，其可包含0至4个杂原子，例如：苯、萘、蒽、芘、吡咯、呋喃、噻吩、咪唑、恶唑、噻唑、三唑、吡唑、吡啶、吡嗪、哒嗪及嘧啶等。此等在环结构中具有杂原子的芳基基团也可称为“芳基杂环”或“杂芳族”。芳香环可以在一个或多个环位置被上述取代基取代，例如：卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、硅基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。用语“芳基”也包含具有两个或更多个环的多环系统，其中两个或更多个碳原子为两个相邻的环所共享(前述环为“稠环”)，其中至少一个所述环为芳香族，例如：其他环可以为环烷基、环烯基、环炔基、芳基及/或杂环基。
用语“邻位”、“间位”、“对位”为先前技术所习知并分别指1,2-、1,3-及1,4-二取代的苯。例如：名称1,2-二甲苯与邻二甲苯为同义词。
用语“杂环基”、“杂芳基”或“杂环基团”为先前技术所习知并指3至约10元环结构，或可以为3至约7元环，其中环结构包含1至4个杂原子。杂环还可以为多环。杂环基包含，例如：噻吩、噻嗯、呋喃、吡喃、异苯并呋喃、苯并吡喃(chromene)、二苯并吡喃、苯氧蒽(phenoxanthene)、吡咯、咪唑、吡唑、异噻唑、异恶唑、吡啶、吡嗪、嘧啶、哒嗪、吲哚嗪(indolizine)、异吲哚、吲哚、吲唑、嘌呤、喹嗪(quinolizine)、异喹啉、喹啉、酞嗪(phthalazine)、萘啶、喹喔啉、喹唑啉、噌啉、喋啶、咔唑、咔啉、菲啶、吖啶、嘧啶、菲咯啉、啡嗪(phenazine)、吩吡嗪(phenarsazine)、吩噻嗪、呋咱、吩恶嗪(phenoxazine)、吡咯烷、氧杂环戊烷、硫杂环戊烷、恶唑、哌啶、哌嗪、吗啉、内酯、内酰胺例如氮杂环丁酮及吡咯烷酮、磺内酰胺、磺内酯等。杂环可以在一个或多个位置被前述的取代基取代，例如：卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、硅基、醚、烷硫基、磺酰基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。
用语“选择性取代”指一化学基团，例如：烷基、环烷基、芳基等，其中一个或多个氢可以被如本文所述的取代基取代，例如：卤素、叠氮化物、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、烷氧基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、硅基、醚、烷硫基、磺酰基、磺酰胺基、酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。
用语“多环”或“多环基团”为先前技术所习知并指二个或更多个环(例如：环烷基、环烯基、环炔基、芳基及/或杂环基)，其中二个或更多碳原子为两个相邻的环所共享，例如：所述环为“稠环”。通过非相邻原子所连接的环称为“桥”环。多环的各环均可被上述取代基所取代，例如：卤素、烷基、芳烷基、烯基、炔基、环烷基、羟基、氨基、硝基、巯基、亚氨基、酰胺基、膦酸酯、亚膦酸酯、羰基、羧基、硅基、醚、烷硫基、磺酰基，酮、醛、酯、杂环基、芳香族或杂芳族部分、-CF3、-CN等。
用语“碳环”为先前技术所习知并指芳香环或非芳香环，其中环的每一原子都为碳原子。
用语“硝基”为先前技术所习知并指-NO2；用语“卤素”为先前技术所习知并指-F、-Cl、-Br或-I；用语“巯基”为先前技术所习知并指-SH；用语“羟基”意指-OH；以及用语“磺酰基”及“砜”为先前技术所习知并指-SO2-。“卤化物”表示卤素相对应的阴离子。
用语“药学上可接受的盐”或“盐”是指一个或多个化合物的盐。适合的化合物的药学上可接受的盐包含酸加成盐，例如通过将化合物的溶液与药学上可接受的酸的溶液混合制作而成，所述药学上可接受的酸例如：盐酸、氢溴酸、硫酸、富马酸、草酸、马来酸、琥珀酸、苯甲酸、乙酸、柠檬酸、酒石酸、磷酸、碳酸等。当化合物携带一个或多个酸性部分时，药学上可接受的盐可以通过用药学上可接受的碱的溶液处理化合物的溶液而制成，所述药学上可接受的碱包含氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化四烷基铵、碳酸锂、碳酸钠、碳酸钾、氨、烷基胺等。
本说明书中所使用的用语“受试者”是指动物，通常是即将成为或已经成为治疗、观察及/或实验对象的哺乳动物或人类。当该用语与本说明书所述的金属复合物及/或其他治疗剂的施用一起使用时，该受试者即为治疗、观察及/或本说明书的金属复合物或药物的给药的对象。
用语“共同给药”及“共同施用”是指同时施用(同时间点施用两种或更多治疗剂)及不同时间点施用(一种或多种治疗剂的施用时间不同于额外一种或多种治疗剂的施用)，只要所述治疗剂在一定程度上同时存在于患者体内。
本说明书中所使用的“治疗有效量”的用语是指在细胞培养物、组织系统、受试者、动物或人类中引起研究人员、兽医、临床人员或医生所欲得的生物学、药学或成像反应的活性化合物或药的剂量，其包括减轻治疗中的疾病、病症或失调的症状及/或达成所期望的核磁共振成像对比度增强程度。
用语“组合物”旨在涵盖包含特定量的特定成分的产品，以及由特定量的特定成分的组合直接或间接产生的任何产品。
用语“药学上可接受的载体”是指用于制备所期望的化合物剂型的基质。药学上可接受的载体可包含一种或多种溶剂、稀释剂或其他液体载体；分散或悬浮助剂；表面活性剂；等渗剂；增稠剂或乳化剂；防腐剂；固体黏合剂；润滑油等。Remington'sPharmaceutical Sciences,Fifteenth Edition,E.W.Martin(Mack Publishing Co.,Easton,Pa.,1975)及Handbook of Pharmaceutical Excipients,Third Edition,A.H.Kibbe ed.(American Pharmaceutical Assoc.2000)公开了用于配制药物组合物的各种载体及用于其制备的已知技术。
本发明提供一种金属复合物，其包含式I的化合物：
Figure GDA0004160853130000211
/>
或其药学上可接受的盐，其中，
M为2H或Zn2+；或M具有结构：
Figure GDA0004160853130000212
A为可选择性地被取代的苯基；
X为不存在、
Figure GDA0004160853130000213
Y为-(CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-(OCH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)nCH2CH2-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-或
Figure GDA0004160853130000221
Z为-(C＝O)NHR3或
Figure GDA0004160853130000222
n选自1-10的整数；
Ln对于各实例独立地为顺磁性的金属离子；
R1各自独立地为可选择性地被取代的芳基；
R2各自独立地为烷基；
R3为SEQ ID NO:1(Ahx D-Cys Gln Asp Gly Arg Met Gly Phe D-Cys，其中Ahx为胺基己酸，D-Cys为半胱胺酸的D-异构物)、SEQ ID NO:2(Ahx D-Cys Gly Arg Leu Lys GluLys Lys D-Cys)或SEQ ID NO:3(Ahx Arg Arg D-Arg Lys Xaa D-Cys Gly Arg Leu LysGlu Lys Lys D-Cys)；
R4各自独立地为O-、N(R5)2或NHR3；以及
R5各自独立地为H或烷基，前提为M或Z中的至少一个包含Ln。
在某些实施方式中，式I的化合物可具有整体电荷，例如：+1、+2、+3或+4。在此等例子中，可以存在一个或多个平衡阴离子，从而产生电中性金属复合盐。任何实质上无毒的阴离子均可被用于电中性金属复合盐。合适的平衡离子的选择为本领域普通技术人员的技术范围内。示例性阴离子包含但不限于：氯化物、溴化物、碘化物、硝酸盐、硫酸盐、磷酸盐、碳酸盐、碳酸氢盐、酒石酸盐、马来酸盐、乳酸盐、草酸盐、甲酸盐、乙酸盐、富马酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、甲苯磺酸盐、己二酸盐、癸酸盐、己酸盐、辛酸盐、十二烷基硫酸盐、戊二酸盐、月桂酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、柠檬酸盐、己酸盐、乙醇酸盐、琥珀酸盐等。在某些实施方式中，金属复合物为草酸盐。
在某些实施方式中，Ln的每个实例皆为顺磁性金属离子，其独立地选自镧系元素所组成的组，例如具有原子序数57-70的镧系元素以及原子序数为21-29、42或44的过渡金属。
在某些实施方式中，Ln的每个实例均独立地选自由铬(III)、锰(II)、铁(III)、铁(II)、钴(II)、镍(II)、铜(II)、镨(III)、钕(III)、钐(III)、镱(III)、钆(III)、铽(III)、镝(III)、钬(III)、铒(III)、镧(III)、金(III)、铅(II)、铋(III)、及铕(III)所组成的组。在某些实施方式中，Ln为钆(III)。
在某些实施方式中，n为一选自1-9、1-8、1-7、1-6、2-6、3-6或3-5的整数。
A可以为一个二价的可选择性地被取代的苯基，其与卟啉部分及X在苯基的1及2(邻)、1及3(间)或1及4(对)位置共价键合。在某些实施方案中，A为选择性地被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基，所述取代基选自氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硝基、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-N(R)2、-OR、-SR、-(S＝O)R、-SO2R、SO2N(R)2、-(C＝O)R、-O(C＝O)R、-(C＝O)OR、-O(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2及-N(R)(C＝O)(R)所组成的组，其中R为氢、烷基或芳基。在某些实施方案中，A选自
Figure GDA0004160853130000231
及
Figure GDA0004160853130000232
在X不存在的情况下，式I的金属复合物可以由以下所示的结构表示：
Figure GDA0004160853130000233
在某些实施方案中，R1各自独立地选自选择性地被取代的苯基、选择性地被取代的萘基、选择性地被取代的呋喃、选择性地被取代的吡咯、选择性地被取代的咪唑、选择性地被取代的噻唑、选择性地被取代的吡啶、选择性地被取代的吡嗪等。在某些实施方案中，R1为选择性地被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基，前述取代基选自由氟化物、氯化物、溴化物、碘化物、硝基、氰基、羟基、烷基、烯基、炔基、环烷基、杂环基、芳基、杂芳基、-N(R)2、-OR、-SR、-(S＝O)R、-SO2R、-(C＝O)R、-O(C＝O)R、-(C＝O)OR、-O(C＝O)OR、-(C＝O)N(R)2及-N(R)(C＝O)(R)，其中R为氢、烷基或芳基组成的组。在某些实施方案中，R1为选择性地被1、2、3、4或5个取代基取代的苯基，前述取代基选自由氟化物及–OR所组成的组，其中R为C1-C6烷基或C1-C3烷基。
在某些实施方案中，R2独立地为C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基。
R3可为多肽序列，其选自SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:3所组成的组。前述多肽通过末端胺基共价结合。
在某些实施方案中，R5各自独立地为氢、C1-C6烷基、C1-C5烷基、C1-C4烷基或C1-C3烷基。
在某些实施方案中，M具有结构：
Figure GDA0004160853130000241
A为选择性地被取代的对苯基；
R2为C1-C3烷基；
X为
Figure GDA0004160853130000242
Y为-(CH2)n-；-(CH2CH2O)nCH2-；-(CH2CH2O)n-；-(OCH2CH2)n-，其中n选自3-5的整数；及
Z为-(C＝O)NHR3。
在某些实施方案中，M为2H或Zn2+；A为选择性地被取代的对苯基；
X为不存在或
Figure GDA0004160853130000251
Y为-(OCH2CH2)n-或/>
Figure GDA0004160853130000252
及Z为
Figure GDA0004160853130000253
其中R4为O-、N(R5)2或NHR3；及R5各自独立地为氢或C1-C3烷基。
在某些实施方案中，式I的化合物选自
Figure GDA0004160853130000254
Figure GDA0004160853130000261
及
Figure GDA0004160853130000262
所组成的组。
本发明还提供一药物组合物，其包含本文所述的金属复合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
本文所述的金属复合物及其药学上可接受的盐可以单独施用在哺乳动物受试者，或根据标准药学方法与药学上可接受的载体或稀释剂结合为药学组合物而施用。该金属复合物可以由口服给药或肠胃外给药。肠胃外给药包含静脉内、肌肉内、腹膜内、皮下及局部给药，理想方式为静脉给药。
因此，本公开提供一药学上可接受的组合物，其包含治疗有效量的本文所述的一种或多种金属复合物，其与一种或多种药学上可接受的载体(添加剂)及/或稀释剂一起配制。本公开的药物组合物可以特别配制以用于固体或液体形态的给药，包含适用于下述者：(1)肠胃外给药，例如通过皮下、肌肉内、静脉内或硬膜外注射例如无菌溶液或悬浮液、或缓释制剂；及(2)口服给药，例如灌药(水溶液或非水溶液或悬浮液)、片剂、大丸剂、粉末、颗粒剂、用于舌头的糊剂，前述片剂例如靶向口腔、舌下及全身性吸收的那些。在某些实施方案中，本发明的金属复合物的给药方法为肠胃外给药(静脉内给药)。
如本说明书所述，本文所述的金属复合物的某些实施方案可包含阳离子复合物，且因此可与药学上可接受的阴离子形成药学上可接受的盐。此情况下的用语“药学上可接受的盐”是指本发明的化合物的相对无毒性、无机及有机的盐。这些盐可在给药载体或剂型制造过程中原位制备，或另外制备。代表性的盐包含：溴化物、氯化物、硫酸盐、硫酸氢盐、硝酸盐、乙酸盐、戊酸盐、油酸盐、棕榈酸盐、硬脂酸盐、月桂酸盐、苯甲酸盐、乳酸盐、磷酸盐、甲苯磺酸盐、柠檬酸盐、草酸盐、马来酸盐、富马酸盐、琥珀酸盐、酒石酸盐、萘磺酸盐、甲磺酸盐、葡庚糖酸盐、乳糖酸盐及月桂基磺酸盐等。
本发明的金属复合物的药学上可接受的盐包含金属复合物的常规无毒盐或季铵盐，例如源自无毒有机酸或无机酸。举例而言，此常规无毒盐包含从无机酸所衍生的那些，前述无机酸例如：盐酸、氢溴酸、硫酸、胺基磺酸、磷酸、硝酸等；及由有机酸所制备的盐，前述有机酸例如：乙酸、丙酸、琥珀酸、乙醇酸、硬脂酸、乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、抗坏血酸、棕榈酸、马来酸、羟基马来酸、苯乙酸、谷氨酸、苯甲酸、水杨酸、磺胺酸、2-乙酰氧苯甲酸、富马酸、甲苯磺酸、甲磺酸、乙烷二磺酸、草酸、2-羟乙磺酸等。
在其他情形下，本文所述的金属复合物可包含一个或多个酸性官能团，因此可与药学上可接受的碱形成药学上可接受的盐。在此等情形下，“药学上可接受的盐”的用语是指本发明的化合物的相对无毒性、无机及有机碱加成的盐。此等盐可同样地在给药载体或剂型制造过程中原位制备，或另外通过使经纯化的金属复合物以游离酸形态与合适的碱、氨或药学上可接受的有机一级、二级或三级胺反应而制备，前述合适的碱例如：药学上可接受的金属阳离子的氢氧化物、碳酸盐或碳酸氢盐。代表性的碱金属盐或碱土金属盐包含：锂盐、钠盐、钾盐、钙盐、镁盐及铝盐等。可用于形成碱加成盐的代表性的有机胺包含：乙胺、二乙胺、乙二胺、乙醇胺、二乙醇胺、哌嗪等。
润湿剂、乳化剂及润滑剂，例如十二烷基硫酸钠及硬脂酸镁，以及着色剂、脱模剂、包衣剂、甜味剂、调味剂及芳香剂、防腐剂、助溶剂、缓冲剂及抗氧化剂也可存在于组合物中。
制备这些制剂或组合物的方法包括使本文所述的金属复合物与载体及──选择性地──一种或多种副成分结合的步骤。一般而言，通过使本发明的化合物与液体载体(液体制剂)、与液体载体然后冻干(粉剂，用于与无菌水等重构)、或细分化的固体载体、或上述两者均匀且紧密地结合以制备所述制剂，接着，如必要，将产物成形或包装。
适用于肠胃外给药的本发明的药物组合物包含一种或多种本发明的金属复合物与一种或多种药学上可接受的无菌等渗水溶液或非水溶液、分散液、悬浮液或乳化液、或无菌粉末的组合，前述无菌粉末可在即使用前重构为无菌注射溶液或分散液；其可含有糖类、醇类、抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂、螯合剂、使制剂与预期接受者的血液等渗透压的溶质、或者悬浮剂或增稠剂。在实施例中，将活性成分与药学上可接受的载体一起置于溶液中，接着进行冷冻干燥以生产干燥粉末。将干燥粉末包装为单位剂型，接着通过在粉末中加入无菌溶液如水或生理食盐水而重构以用于肠胃外给药。
可用于本发明的药物组合物的合适的水溶液或非水溶液载体的实例包括水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇、聚乙二醇等)及其合适的混合物、植物油例如橄榄油、及可注射的有机酯例如油酸乙酯。适当的流动性，例如可通过使用例如卵磷脂的包材来保持、若为分散剂时则通过保持所需的粒度来保持、以及通过使用界面活性剂来保持。
这些组合物还可含有佐剂，例如防腐剂、润湿剂、乳化剂及分散剂。通过包含各种抗细菌剂及抗真菌剂，例如对羟基苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚山梨酸等，可确保防止微生物对本发明的化合物的作用。还可期望的是在组合物中包含等渗剂，例如糖类、氯化钠等。此外，通过包含延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝及明胶，可延长可注射药物形式的吸收。
本文中所使用的用语“肠胃外给药(parenteral administration)”及“肠胃外施用(administered parenterally)”是指除了消化道及局部给药之外的给药方式，通常为注射，其包含但不限于静脉内(intravenous)、肌肉内(intramuscular)、动脉(intraarterial)、鞘内(intrathecal)、囊内(intracapsular)、眶内(intraorbital)、心内(intracardiac)、皮内(intradermal)、腹膜内(intraperitoneal)、经气管(transtracheal)、皮下(subcutaneous)、表皮下(subcuticular)、关节内(intraarticulare)、囊下(subcapsular)、蛛网膜下(subarachnoid)、脊椎内(intraspinal)及胸骨内(intrasternal)注射以及输注。
本文中所使用的用语“全身给药(systemic administration)”、“全身施用(administered systemically)”、“周边给药(peripheral administration)”及“周边施用(administered peripherally)”指非直接进入中枢神经系统的化合物、药物或其他物质的给药，使其进入患者的系统，并因此受新陈代谢及其他过程的影响，例如皮下给药。
本发明还提供一种使用核磁共振造影(MRI)对受试者进行成像的方法，该方法包含：施用治疗有效量的本文所述的金属复合物；并通过MRI对受试者的至少一部分进行成像。在某些实施方案中，怀疑所述受试者的至少一部分患有癌症。在某些实施方案中，前述受试者的至少一部分为受试者的膀胱。
在某些实施方案中，受试者为犬科、猫科、牛科、马科、非人类的灵长类动物或人类。在某些实施方案中，受试者为人类。
根据所搜集的MRI数据，临床医生可以诊断受试者是否患有癌症，例如：膀胱癌。若受试者根据MRI数据被诊断为患有癌症，该受试者可以接受治疗，或由临床医生监控该癌症进展。癌症可以通过任何本领域中所知的方法治疗，包含但不限于：放射治疗、化学治疗、手术及其组合。
因此，在某些实施方案中，对受试者进行成像的方法进一步包含施用治疗有效量的癌症治疗剂的步骤。在某些实施方案中，该癌症治疗剂为可有效治疗膀胱癌的癌症治疗剂。可用于治疗膀胱癌的示例性癌症治疗剂包含但不限于丝裂霉素、噻替派(thiotepa)、顺铂、卡铂、多柔比星(doxorubicin)、吉西他滨(gemcitabine)、戊柔比星(valrubicin)、甲氨蝶呤(methotrexate)、长春花碱(vinblastine)、阿霉素及其组合。
在某些实施方案中，对受试者进行成像的方法进一步包括以手术方式移除膀胱癌的步骤。
本文所提供的金属复合物还可被用于癌症的PDT相关用途。因此，本发明还提供一种治疗有需求的受试者的癌症的方法，该方法包含施用治疗有效量的本文所述的金属复合物；并用电磁辐射照射含有癌的靶组织，所述电磁辐射具有所述金属复合物的活化波长内波长。
可以从受试者体外邻近靶组织的位置照射所述受试者中的靶组织。
活化波长是这样的波长，在所述波长，金属复合物吸收电磁辐射且能将至少部分所吸收的能量转移至金属复合物周围的氧分子，并将氧分子转换成活性单态氧的波长。在某些实施方案中，所述活化波长为800至1,000nm。
本说明书所记载的金属复合物可根据所属技术领域中所熟知的治疗及/或成像方法施用。对于本领域技术人员来说显然的是本文所记载的化合物的施用可根据所治疗的疾病而改变。同样，根据技术临床医师的知识，治疗方法(例如：剂量及施用次数)可以因金属复合物施用于受试者所观察到的效果而不同，还可因所观察到的疾病对所施用治疗药物的反应而不同。
本文还提供一种本文所述的金属复合物的用途，其用于制备用于增强受试者的核磁共振成像对比度的药物。
本文还提供一种本文所述的金属复合物的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物。
本文还提供一种本文所述的金属复合物的用途，其用于制备用于治疗癌症的药物，及用于制备增强受试者的磁共振成像对比度的药物。
在某些实施方式中，受试者为犬科、猫科、牛科、马科、非人类的灵长类动物或人类。在某些实施方式中，受试者为人类。
制备11个示例性的钆复合物并针对膀胱癌标靶性核磁共振成像及PDT对其进行测试(图1)。其光物理特性及对膀胱癌受体──αvβ3整合素/阴离子膜－磷脂酰胆碱(DOPC)的结合亲和力示于表1。
表1：图1所提出的复合物对于膀胱癌PDT的光物理特性及结合亲和力评估。
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将0.4μg/mL的纯化重组人类αvβ3整合素(源自CHO细胞，R&DSystems公司)吸附到96孔ELISA板。加入NLPor-Gd-L1R1──候选的ITG结合化合物以取代重组αvβ3整合素中0.25μg/mL的生物素化玻连蛋白(一个已知的ITGαvβ3配体，英国、剑桥、Abcam公司)。NLPor-Gd-L1Rn与NLPor-Gd-L2Rn(n＝1-3)(图1及15)对玻连蛋白与αvβ3整合素的净结合率的影响，通过评估其混合物在不同Rn浓度下的吸光度来进行研究。一般而言，吸光度越低表示Rn在阻碍玻连蛋白与αvβ3整合素之间结合上的效果越大。因净结合率随着NLPor-Gd-L1R3的浓度增加而减少(图2)，这表示NLPor-Gd-L1R3可能会与αvβ3整合素相互作用，并从而抑制αvβ3整合素与生物素化玻连蛋白之间的结合。
选择5种示例性钆复合物以测验2种标准。(1)水溶性；(2)根据与αvβ3整合素(通过免疫印迹法及NLPor-Gd-L1Rn与NLPor-Gd-L2Rn的整合素(ITG)结合活性分析来评估)及阴离子膜(通过与DOPC-M-NLPorBx-Cyc-Gd-Ly的响应信号)的结合的高度癌症选择性。
通过下述方法在体外测试所选的5种示例性钆复合物的膀胱癌细胞选择性：(1)共聚焦成像；(2)光动力指数(膀胱癌细胞相比正常细胞)以及对癌细胞受体/标记物(即αvβ3整合素或DOPC)的t1弛缓率响应信号的选择性。在三种不同的细胞系上进行体外成像的综合研究(T24：人类膀胱癌细胞系；HeLa：子宫颈癌细胞系；MRC-5：正常肺细胞系)。根据图3，从膀胱癌细胞T24观察到红色发射，其发射可能系由卟啉的发色团部分所产生。相反地，从HeLa细胞及MRC-5细胞并未得到任何光信号。此状况更进一步确认NLPor-Gd-LxRn(n＝1-3)在膀胱癌细胞中的特定定位。NLPor-Gd-L1Rn对T24膀胱癌细胞的选择性可能归于所述化合物与T24膀胱癌细胞上αvβ3整合素的过度表达的结合。
膀胱癌肽R3比R1及R2更具亲水性。因此，NLPor-Gd-L1R3的红光发射比NLPor-Gd-L1R2及NLPor-Gd-L1R1发射强度更高，其趋势为：NLPor-Gd-L1R3>NLPor-Gd-L1R2>NLPor-Gd-L1R1。
在研究NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在膀胱癌细胞中的特定定位后，通过共同染色实验进一步确定NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在膀胱癌细胞中的细胞内定位。如图4中所示(已由彩图转换为黑白图)，红色发射(现为白色)源自NLPor-Gd-L1Rn复合物，而绿色发射(现为白色)源自溶酶体探针。值得注意的为，显示于重叠区域的合并的黄色(红加绿)(现为白色)共同染色发射仅发现于与NLPor-Gd-L1R2及NLPor-Gd-L1R3反应的膀胱细胞中。此观察证实NLPor-Gd-L1R2/NLPor-Gd-L1R3与溶酶体探针的染色位置相同，这表示所述两个复合物定位在膀胱癌细胞T24的溶酶体中。相对地，对于NLPor-Gd-L1R1没有观察到明显的重叠，这进一步表示NLPor-Gd-L1R1定位在膀胱癌细胞T24的细胞膜上。
在有光照或无光照下分别评估NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)复合物在T24、HeLa及MRC-5细胞内的细胞毒性(图5)。NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在T24中的光细胞毒性比在HeLa及MRC-5细胞中有利地更有效10倍(对于NLPor-Gd-L1R3，为更强效50倍)。此外，随着NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)复合物浓度的提升，光细胞毒性也增加。由于NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)复合物在T24细胞中的IC50值比在HeLa及MRC-5细胞中的低，所述复合物对膀胱癌细胞的选择性由它们的细胞毒性的差异显示。在光照射后，所述复合物可以选择性地杀死膀胱癌细胞而不破坏正常细胞。NLPor-Gd-L1R3的光细胞毒性比NLPor-Gd-L1R2及NLPor-Gd-L1R1高。此观察结果可以归因于NLPor-Gd-L1R3在水溶液中具备更佳的溶解度，此可增强其细胞渗透性。如图5所示，NLPor-Gd-L1R3在所有最终产物中表现最高的PTI值，其后接着为NLPor-Gd-L1R2>NLPor-Gd-L1R1。
鉴于NLPor-Gd-L1R3具有最有效的光细胞毒性(IC50＝8.2μM)，并具有最高的光动力疗法指数(PTI，光IC50/暗IC50)值(199)，其在所有测试样品中，可被认为是最具前瞻性的膀胱癌特异性PDT剂。
测量所提出MR可用的PDT剂──NLPor-Gd-L1Rn(n＝1至3)的t1弛缓率。NLPor-Gd-L1Rn(n＝1至3)在1.5T、水(3％DMSO)中的弛缓率为0.2847mM-1s-1，其比Gd-DOTA的更低。此弛缓率的差异可能归因于其不同的配位数：对于NLPor-Gd-L1Rn(n＝1至3)，中心Gd3+离子的配位保护优于Gd-DOTA的，因此NLPor-Gd-L1Rn(n＝1至3)的Gd3+离子相较于Gd-DOTA具有更少与水质子交换的机会。已在加入不同浓度的αvβ3整合素的情况下评估了NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的响应性t1。因NLPor-Gd-L1R3在水溶液中的溶解度比NLPor-Gd-L1R2及NLPor-Gd-L1R1高，响应性t1弛缓率仅能从NLPor-Gd-L1R3与αvβ3整合素观察到(图6)。当αvβ3整合素(标靶)结合可能容易地与两个分子相互作用并影响来自第二或外配位层的t1弛缓率时。NLPor-Gd-L1R3的t1弛缓率在αvβ3整合素的加入后，由0.2847mM-1s-1提高到3.225mM-1s-1。
已在三种不同细胞系(HK1：人鼻咽癌细胞系；HeLa：子宫颈癌细胞系；MRC-5：正常肺细胞系)上进行体外成像综合研究。根据图7a，从癌细胞阴离子膜及细胞质观察到红色发射，其中发射可能产生自卟啉的发色团部分。相反地，光信号仅在MRC-5正常细胞外得到。此情况进一步证实因电荷及立体阻碍所导致的Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在癌细胞的特定定位。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A1在癌细胞及正常细胞表现相同的亚细胞定位。又，如图7b所示(已从彩图转换成黑白图)，在第一排共聚焦影像的红色荧光(现为白色)是源自HeLa细胞里的化合物Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2。第二排共聚焦影像的绿色荧光(现为白色)源自溶酶体探针(LysoTracker)或粒线体探针(MitoTracker)，其表示HeLa细胞中溶酶体及粒线体的位置。重叠图像显示出某些黄色区域(现为白色)。黄色区域表示红色荧光及绿色荧光的重叠。黄色区域表示所述化合物定位在HeLa细胞的溶酶体及粒线体中。
在有光照或无光照下分别评估M-NLPor-Cyc-L2An(n＝1或2)复合物在HK1、HeLa及MRC-5细胞中的细胞毒性(图8)。NL-ZnPor-Cyc-Gd-A3的光细胞毒性1000倍优于FDA认证的PDT剂──ALA(图8)。
测量所提出MR可用的PDT剂──M-NLPor-Cyc-L2An(n＝1或2)的t1弛缓率。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A1及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在1.5T、水(3％DMSO)中的弛缓率分别为15.267及19.278mM-1s-1，其比Gd-DOTA的高得多。该弛缓率的差异可能归因于水溶液中卟啉环的堆积，其导致表观分子量的增加及整个复合物的旋转运动减慢，同时提高t1弛缓率。(Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An(n＝1或2)的q值)(图9)。然而，当Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An(n＝1或2)与DOPC结合时并无响应性t1弛缓率。
通过下述方法在体外测试所选的5种示例性钆复合物的膀胱癌细胞选择性：(1)共聚焦成像；(2)光动力指数(膀胱癌细胞与正常细胞相比)以及对于癌细胞受体/标记物即αvβ3整合素或DOPC的t1弛缓率响应信号的选择性。选择一个对膀胱癌具高度选择性的示例性钆复合物进行MRI。已在100只小鼠身上进行NLPor-Gd-L1Rn及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An的药物动力学及生物分布研究(每个含钆复合物各20只)。
给具有异体移植肿瘤的小鼠尾静脉注射NLPor-Gd-L1Rn及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An(2.0mg/kg体重)，并允许整体循环6小时。接着使用如前述的860nm光照射肿瘤。将另一侧肿瘤作为对照组(未经光照)。在接续几天以每天一次的频率对各处理重复3次。一致地，发现相较于肿瘤的相反侧对照组或NLPor-Gd-L1Rn(n＝1或2)及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An(n＝1或2)组，在膀胱癌细胞中NLPor-Gd-L1R3加光照处理的肿瘤受到抑制。药物动力学分析还显示NLPor-Gd-L1R3在动物体内停留更长时间，具有更大的MRT(平均滞留时间)值，而NLPor-Gd-L1Rn(n＝1、2)及Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2An(n＝1或2)则被快速消除(MRT为3.49小时)(图10)。
经过前期所有研究之后，NLPor-Gd-L1R3是有潜力的用于膀胱癌特异性MRI剂及PDT剂的双重生物探针。核磁共振造影(MRI)为一个先进的成像技术，其可提供深层组织的高分辨率图像。此外，MRI可以提供3D时空解析图像。因钆的顺磁特性，基于钆的材料常被用作MRI的显影剂。为了研究NLPor-Gd-L1R3在活体内的作用机制，在荷载T24膀胱癌异体移植的BALB/c裸鼠上进行实验，并选择普遍使用的MRI显影剂Gd-DOTA作为对照。分别尾静脉注射NLPor-Gd-L1R3及Gd-DOTA至荷载T24肿瘤的小鼠。通过在3只荷载T24膀胱癌异体移植的BALB/c裸小鼠身上进行体内MRI测量，评估MRI信号的增强。通过在皮下注射T24膀胱癌细胞来形成三个肿瘤模型。NLPor-Gd-L1R3、NLPor-Gd-L1(无R3，仅有COOH基团作为对照)及GdDOTA的注射剂量为100μmol/kg(2μmol/小鼠)。在尾静脉注射200μl的各样品之前和之后的不同时间点获得MR图像。在注射NLPor-Gd-L1R3后0.5小时观察到强烈的MRI信号增强并维持至注射后1小时，直到信号降至注射前的水平(图12c)。与NLPor-Gd-L1R3相比，NLPor-Gd-L1显示为在注射2小时后，几乎无信号增强的情形(图12b)，其证实R3的αvβ3整合素标靶功能对于提供MRI信号增强为必须的。在Gd-DOTA注射的MR图像(图12a)所观察到的微弱的注射后信号增强可能与小鼠肿瘤模型中Gd-DOTA的快速消除特性有关。注射NLPor-Gd-L1R3的MRI信号增强比Gd-DOTA强烈。此同时证实NLPor-Gd-L1R3可能有比Gd-DOTA更长的消除时间，其可能归因于R3与αvβ3整合素在膀胱癌细胞中的相互作用。结果显示NLPor-Gd-L1R3可作为用于T24膀胱癌的有前景的MRI显影剂。
基于钆的MRI显影剂的稳定性始终是一个重要参数，因为自由Gd3+离子有毒，因为其具有与Ca2+相似的离子半径。因此，自由Gd3+离子可能会影响体内各种电压门控型钙离子通道。因癌细胞的微环境为酸性，使用RP-HPLC分析NLPor-Gd-L1R3在pH7及pH5的缓冲水溶液中的动力稳定性。准备200μM的NLPor-Gd-L1R3并分别溶解在pH7及pH5的缓冲水溶液中。两个样本的RP-HPLC分析以每24小时为间隔进行5天。获得在不同时间间隔的tr＝23分钟的峰值的积分面积，以确定NLPor-Gd-L1R3的稳定性。结果显示在pH7及pH5缓冲溶液中24小时后的峰值面积积分皆略有下降。(图13及14)。因此，可以推知NLPor-Gd-L1R3在pH7及pH5缓冲溶液中的稳定性可以维持24小时。
合成11个卟啉钆复合物且NLPor-Gd-L1R3显示靶向癌细胞内的αvβ3整合素。NLPor-Gd-L1R3可应用于膀胱癌治疗及MR成像。3个αvβ3同种型靶标肽与卟啉镧系复合物共轭，NLPor-Gd-L1展现强大的单态氧量子产率──43％。通过共聚焦成像发现NLPor-Gd-L1R3可以进入整合素αvβ3(+)表达型的T24细胞，而不能进入αvβ3(-)表达型HeLa及MRC-5细胞。NLPor-Gd-L1R3对T24细胞表现极度的抑制作用(IC50＝8.2μM)，具有最高PTI值(199)，这比市面可获得的PDT剂ALA高20倍以上。NLPor-Gd-L1R3被视为所有测试样品中最具前景的膀胱癌特异性PDT剂。应强调NLPor-Gd-L1R3是新颖的膀胱癌细胞高度特异性治疗剂，其通过卟啉部分产生1O2以杀死肿瘤细胞，并提供强大的双模式成像(荧光及MRI对比成像)。通过一系列体外及体内研究对NLPor-Gd-L1R3的成像效果进行评估。结果显示NLPor-Gd-L1R3是具有高度特异性的用于MRI引导的膀胱癌PDT的良好候选者。
在水溶液中测量Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及其无钆的前体Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2的吸收及发射光谱(图54b及54c)。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2在420nm显示索雷(Soret)谱带，其对应到从基态到第二激发态的跃迁(S0→S2)；及在554nm显示Q带，其涉及从基态到第一激发态的微弱跃迁(S0→S1)。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在430nm的激发下于水溶液中显示从600nm到750nm的强烈发射(图54c)。位于650nm及750nm左右的发射峰分别源自卟啉的第二激发态到基态的跃迁(S2→S0)及第一激发态到基态的跃迁(S1→S0)。在CHCl3中测量Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2的单态氧量子产率(ΦΔ)，并通过与参考化合物四苯基卟啉H2TPP(于CHCl3中ΦΔ＝0.55)进行比较来计算所述单态氧量子产率。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及Zn-NLPorB2-Cyc-L2A2的单态氧量子产率分别为0.21及0.27(图50)。在Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的T1弛缓率的研究中，使用临床的MRI显影剂Gd-DOTA作为对照以用于比较。在1.4T、含3％ DMSO的水中，Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2具有15.06mM-1s-1的较高的T1弛缓率，而Gd-DOTA仅显示为2.92mM-1s-1(图49)。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的高T1弛缓率可能归因于Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2中卟啉部分的堆积(图54a)。其导致复合物的旋转运动减慢，并因而提高Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的T1弛缓率。
在三种不同的细胞系HeLa(人子宫颈癌细胞)、T24(人膀胱癌细胞)及MRC5(人正常肺细胞)上进行Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的细胞毒性分析。如图50所示，在无光的情况下，3个细胞系中Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的细胞毒性都非常低(暗IC50>200μM)。然而，3个细胞系在光照射下，前述复合物的细胞毒性都大幅提升。例如：HeLa细胞中Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的IC50值在黑暗中与光照下分别为337及0.25μM。这证实该复合物在无光照下为高度安全，而其在光照下为有效的PDT剂，特别是在癌细胞系中。这促成HeLa及T24细胞的高光动力治疗指数(PDI)(PDI分别为1348及324)。这还显示Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2与市售PDT前药5-氨基酮戊酸(ALA)相比，为更有效的PDT剂。细胞毒性分析显示Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2除可作为MRI显影剂外，还可以成为有潜力的PDT前药。
为了理解Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在癌细胞及正常细胞中的细胞定位及选择性，在癌细胞(HeLa)及正常细胞(MRC5)进行共聚焦成像及共同染色实验。如图51所示(已由彩图转换成黑白图)，即使在低浓度下，复合物Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在HeLa细胞中与MRC5细胞相比时仍展现强烈得多的红色发射(现为白色)。第一行的共聚焦图像中的红色荧光源自HeLa细胞中的化合物Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2。第二行的共聚焦图像中的绿色荧光(现为白色)来自溶酶体探针(LysoTrackeror)和粒线体探针(MitoTracker)，其表示HeLa细胞中的溶酶体及粒线体的位置。重叠图像显示出某些黄色区域(现为白色)。黄色区域表示红色及绿色荧光的重叠。黄色区域表示化合物在进入细胞后定位在HeLa细胞中的溶酶体及粒线体。HeLa癌细胞图像中另一重要讯息为：当Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的浓度从1.25μM增加到2.5μM时，会发现更大量且强度更强的黄色区域。而在MRC5正常细胞中，在1.25μM的低浓度下发现少得多的黄色区域。此结果显示在HeLa癌细胞中化合物Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的摄取远大于MRC5正常细胞。其表示Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2对癌细胞的选择性。
其表示癌细胞对Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的细胞摄取比正常细胞系更快且更强烈。进行共同染色实验以进一步评估Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的定位。与Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2及绿色溶酶体探针(LysoTracker Green)二者孵育的HeLa细胞中显示的合并的黄色发射表示该复合物定位于HeLa细胞的溶酶体。然而，当MRC5细胞中仅加入2.5及1.25μM的Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2时，前述细胞中极少或没有红色发射出现。在MRC5细胞中仅出现绿色发射，其代表溶酶体探针(LysoTracker)的发射。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的浓度依赖性细胞摄取表示本发明的复合物可以在低浓度下选择性地进入癌细胞而不进入正常细胞。因为低浓度(<2.5μM)足以定位在癌细胞中，这可对其他正常细胞造成较少伤害，并因而于施用上更为安全。
在Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在癌细胞及正常细胞的体外研究后，即进行查明Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的肿瘤抑制效果的体内实验。将HeLa异体移植小鼠模型分为6组进行肿瘤抑制研究(图52a)。以肿瘤内注射将Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2(3.46mg/kg)及5-氨基酮戊酸(ALA)(60mg/kg)注射进不同组的Hela肿瘤，其大小为200–350mm3，并通过注射PBS缓冲液作为对照。PDT治疗组的肿瘤在注射后对其照射808nm的激光2小时，而另一侧肿瘤作为无光照的对照。连续20天每天进行一次PDT治疗。总体光剂量为50J/cm2。在20天治疗后，与ALA的PDT治疗相比，与体内MRI相同剂量的3.46mg/kg体重的Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2展现显著的体内肿瘤抑制效果(图52b)。使用Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2对HeLa肿瘤进行PDT治疗，经过20天治疗后显示62％的体积减小。在整个治疗过程中所有组别的小鼠体重的维持证实该化合物在体内的安全性。使用ICP-MS研究Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在不同时间点的体内生物分布。Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在尾静脉注射后，在3小时于HeLa肿瘤位点展现快速的堆积并维持12小时(图11及52c)。在注射后的48小时后观察到Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2从小鼠体内彻底消除。
除了Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的肿瘤抑制功效，还通过在S18异体移植小鼠模型中进行体内MRI来评估Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2的MRI性能。通过尾静脉注射将Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2(0.025mmol/kg，Gd-DOTA的1/4剂量)注射进S18异体移植小鼠。T1图像显示Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在体内表现强大的对比效果，肿瘤位置在注射后第1小时转亮(图53a)。最强的信号增强记录于注射Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2后2小时。与剂量为0.1mmol/kg体重的Gd-DOTA相比，Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2于注射后48小时期间在肿瘤位置显示显著的信号增强(图53b)。与Gd-DOTA相比，Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2可以在更低的剂量下产生更强的信号。因此，可以获得由强信号增强的更清晰的MR图像，以协助监测抗癌治疗。已进行体内荧光成像以进一步验证Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2在肿瘤位置的累积现象。结果与体内生物分布结果一致(图53c)，即在注射后2至3小时在肿瘤位置观察到最高量的Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2累积，而在正常小鼠中则未检测到明显的信号(图53c)。这解释了T1图像在相同时间内的最强信号增强。
综上所述，本发明提供一新颖的基于卟啉－四氮杂环十二烷(cyclen)钆的双功能生物探针Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2。与临床上认证的MRI显影剂Gd-DOTA(T1弛缓率2.92mM- 1s-1，1.4T)相比之下具有出色的T1信号增强及更高的T1弛缓率(15.06mM-1s-1，1.4T)，使Zn-NLPorB2-Cyc-Gd-L2A2被相信可在MRI显影剂中作为Gd-DOTA的良好替代品。此外，其在非常低的浓度下对癌细胞的选择性使其成为使用上安全得多的药剂。其高PDT指数还使其能够成为可进行光动力治疗的良好的光敏剂。相信该新开发的双功能生物探针将帮助我们进入癌症治疗的新时代。
首先，进行整合素结合活性分析以评估NLPor-Gd-L1Rn(图16a)对αVβ3整合素的结合亲和力。该缀合物作为竞争配体，从重组αVβ3整合素中置换生物素化玻连蛋白。通过评估在不同浓度的NLPor-Gd-L1Rn下混合物在405nm处的吸光度，得到NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)对玻连蛋白及αVβ3整合素的净结合率的作用。降低的吸光度表示NLPor-Gd-L1Rn从αvβ3整合素对玻连蛋白的竞争作用。玻连蛋白被任一化合物置换的百分比(图16b)明显指出随着NLPor-Gd-L1Rn浓度增加，净结合率降低，R3的效果明显更大。此结果与NLPor-Gd-L1Rn与αVβ3整合素相互作用并抑制αVβ3整合素与生物素化玻连蛋白的间的结合一致。自由Gd3+离子与生物学上普遍存在的Ca2+离子具有相似的离子半径，因此自由Gd3+离子可能会影响体内各种电压门控型钙离子通道而可能具有毒性，因此基于钆的MRI显影剂的稳定性始终为一重要参数。因为癌细胞的微环境属弱酸性(pH 5-7)，使用反相高效液相层析法分析NLPor-Gd-L1R3在pH 7及pH 5缓冲水溶液中的动力稳定度；准备200μM的NLPor-Gd-L1R3并将其溶解在pH 7及pH 5磷酸盐缓冲生理盐水溶液中，连续4天每24小时进行一次分析。测定不同时间间隔的峰值面积(滞留时间tr＝23分钟)以评估NLPor-Gd-L1R3的稳定性。结果显示在pH 7及pH5溶液在24小时后，峰值面积皆没有明显的减少(图16c)。因此，可以推知NLPor-Gd-L1R3在pH7及pH 5缓冲溶液中的稳定性都可以维持超过24小时。
接着，在人膀胱癌(T24)、子宫颈癌(HeLa)及正常肺(MRC-5)细胞系上进行体外NLPor-Gd-L1Rn成像的研究。根据图17(a)(已由彩图转为黑白图)，在T24膀胱癌细胞中观察到由卟啉发色团所产生的红色发射(现为白色)，而在HeLa及MRC-5细胞中则未获得任何信号。这与NLPor-Gd-L1Rn在膀胱癌细胞中的特异定位一致。因肽R3比R1及R2更具亲水性，R3共轭化合物具有更佳的溶解性及生物兼容性。因此，从NLPor-Gd-L1R3观察到更强的红色发射。用绿色发射溶酶体探针染剂进行共同染色实验，以进一步研究NLPor-Gd-L1Rn的细胞内定位。如图17所示(重叠区域)，同时观察到红色及绿色发射(现为白色)，且值得注意的是合并的图像显示对于R2及R3的部分重叠(重叠区域中的黄点(现为白色))：(皮尔森系数(Pearson’scoefficients)(从-1到1)：NLPor-Gd-L1R2＝0.394；NLPor-Gd-L1R3＝0.279)。
NLPor-Gd-L1Rn(n＝2、3)增强MR成像的能力通过测定其在1.5T、水中(3％ DMSO)的T1及T2弛缓率来评估，并且这些数据用对于Gd-DOTA
Figure GDA0004160853130000411
的那些来确认。观察到NLPor-Gd-L1R3的T1及T2弛缓率为r1＝0.182mM-1s-1(图18a)及r2＝0.6289mM-1s-1(图37)。NLPor-Gd-L1R3的T1弛缓率比Gd-DOTA(2.92mM-1s-1)的明显更低(图18a)。因为NLPor-Gd-L1Rn复合物可能缺乏配位水，因此水合数的差异可能导致该弛缓率的变化。然而，发现NLPor-Gd-L1R3在与αvβ3整合素结合后表现出响应性T1弛缓率，其r1弛缓率增加到3.225mM-1s-1(图18a，三角形数据点)。响应性T1弛缓率仅能对于该复合物检测到，因其具有比NLPor-Gd-L1R1及NLPor-Gd-L1R2更高的水溶性。αVβ3整合素可同时容易地与Gd复合物的两个分子相互作用，并因此通过第二或外配位层相互作用正向地影响T1弛缓率。T1弛缓率增强还可能是因NLPor-Gd-L1R3的表观分子量增加所致，前述增加是通过与αVβ3整合素相互作用而使NLPor-Gd-L1R3的分子旋转减慢所致。
在光照射后，NLPor-Gd-L1Rn复合物选择性地杀死膀胱癌细胞，且更重要地，通过使用及不使用光照射(λex＝430nm，剂量＝10J/cm2)所进行的T24、HeLa及MRC-5细胞的细胞毒性研究所证明，所述复合物不影响正常细胞。结果如图19所示。对T24的暗IC50值仅比HeLa或MRC-5细胞小1.1-3.0，但在照射下，对T24的IC50值变得明显更小：R1为10-13倍、R2为9-20倍、R3为突出的55倍。此结果再次与复合物对膀胱癌细胞的高度选择性相一致。与NLPor-Gd-L1R2及NLPor-Gd-L1R1相比，NLPor-Gd-L1R3对T24细胞的光细胞毒性明显更高(IC50＝8.2μM)，这可能归因于其较佳的溶解度。NLPor-Gd-L1R3还在所有三种复合物中展现最高的光动力治疗指数(PTI，暗IC50/光IC50)，即：惊人的值199，其比已知且市面可取得的PDT剂5-氨基酮戊酸(ALA)高20倍。因此，此R3共轭复合物为所测试样本中最具前景的膀胱癌特异性PDT剂。
在注射复合物后，通过照射808nm的激光(双光子激发)3小时已进行体内PDT研究；光总剂量为50J/cm2，对每组3只荷有T24膀胱癌异体移植的裸鼠每周三次进行治疗。结果显示，与相反侧黑暗对照及PBS注射的T24肿瘤对照组相比，与用于体内MRI(100μmol/kg体重)相同浓度的NLPor-Gd-L1R3对经光照的T24肿瘤具有显著的抑制作用(图18b及18c)。在另一个体内PDT实验中，NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3；100μmol/kg体重)显示明显的T24肿瘤抑制作用，但在HeLa肿瘤中几乎未观察到抑制效果(图18d及18e)。如对照Yb-PEG-R3所证实，NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)所吸收的大部分光能用于产生细胞毒性1O2(1-光子量子产率：0.39-0.40，λex＝425nm，PBS缓冲液)，所述对照Yb-PEG-R3具有可忽视的细胞毒性作用，因其激发能量主要转移到Yb(III)中心以诱发NIR发射，因此其不产生1O2(图18e)。在所有样本中，NLPor-Gd-L1R3对膀胱T24肿瘤展现最高的抑制效果。此现象可以通过NLPor-Gd-L1R3的大1O2量子产率及强αVβ3整合素结合亲和性等特性来解释。
上述深入研究显示NLPor-Gd-L1R3可被视为具潜力的用于膀胱癌PDT治疗的治疗诊断剂。为了研究NLPor-Gd-L1R3作为体内MRI显影剂的可能性，在荷有T24膀胱癌异体移植的BALB/c裸鼠身上进行实验，而普遍使用的MRI显影剂Gd-DOTA作为对照。NLPor-Gd-L1R3、Gd-PEG-COOH(羧酸基团代替R3作为对照)及Gd-DOTA的注射剂量为0.1mmol/kg钆(约2μmol/小鼠)。在各个受试者的200μL尾静脉注射前及后的不同时间点获取MR图像。在注射后0.5小时观察到强烈的MRI信号增强并维持到1小时(图20c)。根据图20，与Gd-PEG-COOH及Gd-DOTA对照相比，用NLPor-Gd-L1R3处理过的肿瘤的边缘在0.5小时及1小时后可相对清楚观测；Gd-PEG-COOH在2小时内显示几乎无注射后信号增强(图20b及图20c)，其证实R3的αvβ3整合素标靶功能对于提供MRI信号增强为必须的。在注射有Gd-DOTA的小鼠的MRI图像中所观察到的微弱的注射后信号增强可能归因于Gd-DOTA在此肿瘤模型的快速消除。NLPor-Gd-L1R3与Gd-DOTA相比的更长的消除时间，可能源于R3肽与αVβ3整合素在膀胱癌细胞中的相互作用，而此特性可以使得能够在长时间内进行MRI研究。
在荷有T24膀胱癌的BALB/c裸鼠中进行NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的生物分布研究。当肿瘤异体移植大小到达约0.1cm3时，将复合物(100μmol/kg)注射进尾静脉。在注射后2天收集不同的组织，并用ICP-MS将NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的浓度进行定量。结果显示在肿瘤中NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)有最大的富集。须强调，NLPor-Gd-L1R2及NLPor-Gd-L1R3均不存在于大脑中(图11及20d)。这与某些已公布的基于Gd(III)的治疗诊断剂包括Gd-N相比是明显优势，所述治疗诊断剂虽然表现出具有前景的抗癌作用及成像能力，但其显示为穿过血脑屏障(脑中浓度～1ppm)，可能导致严重的副作用。
综上所述，在三种合成的卟啉-钆复合物中，广泛研究显示NLPor-Gd-L1R3为具有潜力的用于治疗膀胱癌的αVβ3整合素特异性治疗诊断剂。该化合物确实有效用于PDT膀胱癌治疗，并作为适度有效的开关型MRI显影剂。NLPor-Gd-L1R3的PDT能力来自(i)其因包含所谨慎筛选的标靶肽而具有很大的特异性；特别是该新药剂不会进入脑，确切的优势；(ii)其水溶性(R3取代基)；(iii)其具有高度光细胞毒性，而在黑暗(PTI＝199)及正常细胞中则保持无细胞毒性。该化合物还表现出“开关”响应性弛缓率，其初始T1弛缓率低，在与αVβ3结合后增加10倍以上。增加的弛缓率虽略低于用市售的MRI显影剂所观察到的值，但在相同的实验条件下，NLPor-Gd-L1R3表现出比Gd-DOTA更佳的膀胱癌成像。近期内，我们设想将该定制治疗诊断剂纳入各种载体中，以测试其在临床上的应用。
详细实验步骤
I NLPor-Gd-L1R3的合成
图21表示NLPor-Gd-L1R3的合成路径，图22-28为中间化合物与最终产物的NMR谱。该谱证明化合物的纯度且谱中所显示的特征峰提供证据显示所欲得到的化合物已成功合成。
II NLPor-Gd-L1R3的光物理特性
a)NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的电子吸收及发射谱
图29及30分别表示NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在水溶液中的吸收谱及发射谱。三个Gd复合物在425nm表现出强的索雷谱带，其归因于S0→S2卟啉的允许跃迁，及在554nm表现出Q带，其归因于S0→S1卟啉的禁止跃迁。在水溶液中以430nm激发下测量NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的发射谱，在660nm及720nm所观察到的强烈发射带代表卟啉的S(0,0)及S(1,0)发射。
b)单态氧量子产率
单态氧为评估PDT药剂有效性的主要因素之一。考虑文献中关于单线态氧量子产率的许多研究，有两种方法可用以测定单态氧量子产率：与标准品相比较：(1)所产生的单态氧的发射；(2)光敏剂的吸光度。然而，很少有把前述两种手段结合以测定单态氧的例子，特别是在水溶液中。在此，本发明分别在CHCl3及水溶液中，用两种方法检测单态氧量子产率。
(1)通过比较CHCl3中的NLPor-Gd-LxRn(n＝1-3)及标准品H2TPP的1O2发射来测量单态氧量子产率。
在CHCl3中测量NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的单态氧量子产率(ФΔ)，并通过与参考化合物H2TPP(在CHCl3中ΦΔ＝0.55)比较来计算。
NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的单态氧量子产率分别为0.47、0.47、0.48(图31)。与Yb-Rn(n＝1-3)相比，NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的单态氧量子产率明显更高，因为Gd(III)的第一激发态远比卟啉的三重态高(图32)，且卟啉所吸收的能量仅有较低的机会转移到Gd(III)离子上。因此，在卟啉中，大部分所吸收的能量都用以协助将3O2转换到1O2。
(2)通过评估水溶液中ABDA分别与NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)及标准品孟加拉红(Rose Bengal，RB)混合时的吸光度变化来测量单态氧量子产率。
9,10-蒽基-双(亚甲基)二丙二酸(9,10-Anthracenediyl-bis(methylene)dimalonic acid；ABDA)──活性氧类的化学敏感探针，其常用于监测单态氧的生成。在光照射后，ABDA的吸光度降低，因为在1O2存在下形成其内过氧化物。可以通过ABDA吸光度在402nm处所减少的量来估计由光敏剂所产生的单态氧量子产率。
在本发明中，分别使用ABDA及RB(在PBS缓冲溶液中ФRB＝0.75)作为1O2清除剂及参考品以获得NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在磷酸盐缓冲盐水中的单态氧量子产率(Ф△)。将NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)与ABDA反应，通过功率密度为6mWcm-2的LED灯对混合物进行光活化。通过记录402nm处的ABDA吸光度的变化来评估单态氧的生成。通过下述公式计算NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)(ΦPS)的单态氧量子产率：
Figure GDA0004160853130000451
其中，KPS为ABDA与NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)混合时ABDA的分解率。KRB为ABDA与RB混合并经光照射后ABDA的分解率。通过NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的吸收积分计算APS，而通过RB在400–700nm范围的吸收积分确定ARB。
如图33a所示，作为对照的ABDA在光照射(550nm长通滤波器，6mW·cm-2)下显示无吸收量变化。ABDA的吸光度持续降低，因为在分别由孟加拉红及NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)所产生的单态氧(图33b、33c、33d及33e)的存在下，其内过氧化物于不同光照量下形成。图34总结在LED灯照射下ABDA在402nm处的吸光度变化。如图35所示，NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)在PBS缓冲液中的Ф△值分别为0.39、0.39及0.40。此外，光敏剂在水溶液中的单态氧量子产率的评估至关重要，因为生物系统主要由水组成。因为光敏剂在水溶液中容易聚集，水溶液中的单态氧量子产率比有机溶剂中的低。此外，水分子还会在某些方面淬灭单态氧。
III MR弛缓特性测量
在3.0特斯拉MRI仪器(MAGNETOM Verio；德国，埃朗根，西门子医疗)上用头部线圈进行体外T1加权MR弛缓率测量。使用T1图谱序列测量不同Gd(III)浓度(0、0.05、0.1、0.2、0.4、0.8mM)的T1弛缓时间。T1测量参数如下：TR＝2250ms、TE＝13ms及TI＝948.6ms。通过弛缓率1/T1(S-1)与Gd3+(mM)浓度的曲线拟合得到r1弛缓率值，拟合线的斜率提供r1值。图36为结果的总结。
使用Mini Bruker Mq60 NMR分析仪在37℃、1.4T下进行体外T2加权MR弛缓率测量。将NLPor-Gd-L1R3的储存液溶解于含有2％DMSO的水中使浓度为1.23mM，将αvβ3溶解于PBS缓冲液(pH7.4)中使浓度为100μg/mL(图37及38)。
IV细胞摄取的流式细胞术测量
将T24膀胱癌细胞接种到35mm培养皿上。接着将卟啉复合物分别在细胞中孵育3及24小时。用胰蛋白酶收集细胞并用PBS缓冲液将细胞冲洗两次。使用流式细胞术评估于T24细胞内所述复合物的摄取。选择488nm作为细胞的激发波长，并使用FL-3通道用于发射(图40)。
V NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的表征
a)NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)的HPLC表征分析
洗涤条件：柱Agilent ZORBAXSB-C18(4.6×150mm,颗粒大小5；流速：1.0mL/分钟；梯度洗脱；检测波长：430nm。滞留时间：NLPor-Gd-L1R1 20.777分钟、NLPor-Gd-L1R2 21.401分钟、NLPor-Gd-L1R3 20.751分钟)(图41)。图39总结运行HPLC的方法。
b)NLPor-Gd-LxRn(n＝1-3)的LC-MS分析
NLPor-Gd-L1R1：LC-MS：计算C112H124CoF15N22O27P3S3Gd[M+H]+2901.5212得到：2901.5530。[M+3H]3+967.1950得到：967.5291。HPLC表征：滞留时间＝20.777分钟。(图42)
NLPor-Gd-L1R2：LC-MS：计算C116H143CoF15N23O27P3S2Gd[M+2H]2+1474.3525得到：1474.3752。[M+3H]3+983.9225得到：983.9171。HPLC表征：滞留时间＝21.401分钟。(图43)
NLPor-Gd-L1R3：LC-MS：计算C146H202CoF15N38O32P3S2Gd[M+2H]2+1829.1728得到：1829.1979。[M+3H]3+1219.3333得到：1219.4145。HPLC表征：滞留时间＝20.751分钟。(图44)
c)使用HPLC所进行的在不同pH下NLPor-Gd-L1R3稳定性测试
图45表示运行稳定性测试的方法，而图46-47表示NLPor-Gd-L1R3在pH 5及pH 7下的HPLC结果。结果显示NLPor-Gd-L1R3在不同pH下非常稳定且因此使用上非常安全，因为其对不同pH值呈现惰性且金属Gd并不会从复合物中解离。
VI光动力疗法(PDT)分析
将3种细胞系(HeLa、T24及MRC-5)(1x 104cells/mL)接种在96孔板过夜，并在隔天加入不同浓度的NLPor-Gd-L1Rn(n＝1-3)。孵育24小时后，使细胞曝露于功率密度为6mWcm-2的LED灯所产生的蓝光(1、5、10J/cm2)下。接着，在PDT后24小时加入MTT并在37℃培养3小时。将其所形成的甲
Figure GDA0004160853130000471
溶解在二甲亚砜(DMSO)中，并在酶标仪中、540nm波长下测量溶液的吸光度(参考波长＝690nm)(图48)。/>
序列表
<110> 香港浸会大学
<120> 具有开关核磁共振造影增强的膀胱癌光动力治疗剂
<130> P20658PCT00
<150> 62/652,302
<151> 2018-04-03
<150> 16/372,492
<151> 2019-04-02
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含实验室合成的非天然氨基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 第一位的Xaa是6-氨基己酸
<220>
<221> 二硫化物
<222> (2)..(10)
<223> 第二位的C的侧链与第十位的C的侧链连起来形成二硫键
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 第二位的C是D-氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 第十位的C是D-氨基酸
<400> 1
Xaa Cys Gln Asp Gly Arg Met Gly Phe Cys
1 5 10
<210> 2
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含实验室合成的非天然氨基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 第一位的Xaa是6-氨基己酸
<220>
<221> DISULFID
<222> (2)..(10)
<223> 第二位的C的侧链与第十位的C的侧链连起来形成二硫键
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (2)..(2)
<223> 第二位的C是D-氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (10)..(10)
<223> 第十位的C是D-氨基酸
<400> 2
Xaa Cys Gly Arg Leu Lys Glu Lys Lys Cys
1 5 10
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 包含实验室合成的非天然氨基酸的肽序列
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (1)..(1)
<223> 第一位的Xaa是6-氨基己酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (4)..(4)
<223> 第四位的Xaa是D-氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (6)..(6)
<223> 第六位的Xaa是6-氨基己酸
<220>
<221> 二硫化物
<222> (7)..(15)
<223> 第七位的C的侧链与第十五位的C的侧链连起来形成二硫键
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (7)..(7)
<223> 第七位的C是D-氨基酸
<220>
<221> MISC_FEATURE
<222> (15)..(15)
<223> 第十五位的C是D-氨基酸
<400> 3
Xaa Arg Arg Xaa Lys Xaa Cys Gly Arg Leu Lys Glu Lys Lys Cys
1 5 10 15

Claims (19)

1.一种金属复合物，其包含式I的化合物：
Figure FDA0004089323950000011
或其药学上可接受的盐，其中，
M具有结构：
Figure FDA0004089323950000012
X为不存在或
Figure FDA0004089323950000013
Y为-(CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)n-或-(OCH2CH2)n-；和
Z为-(C＝O)NHR3；或者
M为2H或Zn2+；
X为不存在；
Y为-(OCH2CH2)n-或
Figure FDA0004089323950000014
和
Z为
Figure FDA0004089323950000021
A为可选择性地被取代的苯基；
n为选自1-10的整数；
Ln对于各实例独立地为顺磁性的金属离子；
R1各自独立地为可选择性地被取代的芳基；
R2各自独立地为烷基
R3为SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3；
R4各自独立地为O-、N(R5)2或NHR3；以及
R5各自独立地为H或烷基，前提为M或Z至少其一包含Ln并且如果M为2H或Zn2+；X为不存在；和Y为-(OCH2CH2)n-，那么R4的两个实例各自为N(R5)2；并且R4的一个实例为NHR3。
2.权利要求1所述的金属复合物，其中，Ln选自Gd(III)。
3.权利要求1所述的金属复合物，其中，M具有结构：
Figure FDA0004089323950000022
X为
Figure FDA0004089323950000023
Y为-(CH2)n-、-(CH2CH2O)nCH2-、-(CH2CH2O)n-、-(OCH2CH2)n-；且
Z为-(C＝O)NHR3。
4.权利要求3所述的金属复合物，其中，X为
Figure FDA0004089323950000031
Y为-(CH2CH2O)nCH2-；且R2为C1-C4烷基。
5.权利要求3所述的金属复合物，其中，X为
Figure FDA0004089323950000032
Y为-(CH2CH2O)n-；且R2为C1-C4烷基。
6.权利要求1所述的金属复合物，其中，式I的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004089323950000033
及
Figure FDA0004089323950000034
其中Ln为Gd(III)。
7.权利要求1所述的金属复合物，其中，M为2H或Zn2+；X为不存在；Y为-(OCH2CH2)n-或
Figure FDA0004089323950000035
且Z为/>
Figure FDA0004089323950000036
8.权利要求7所述的金属复合物，其中，Y为
Figure FDA0004089323950000041
且R4为O-或NHR5。
9.权利要求7所述的金属复合物，其中，Y为-(OCH2CH2)n-；R4的两个实例各自为N(R5)2；且R4的一个实例为NHR3。
10.权利要求1所述的金属复合物，其中，式I的化合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004089323950000042
及
Figure FDA0004089323950000043
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
11.一种药学组合物，其包含权利要求1的金属复合物以及至少一种药学上可接受的赋形剂。
12.权利要求1的金属复合物在制备用于通过核磁共振造影(MRI)成像受试者的药物中的用途，其中所述成像包括：向所述受试者施用治疗有效量的所述金属复合物；以及通过MRI成像所述受试者的至少一部分。
13.权利要求12所述的用途，其中，所述金属复合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004089323950000051
Figure FDA0004089323950000052
及
Figure FDA0004089323950000061
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
14.权利要求12所述的用途，其中所述成像进一步包括向受试者施用治疗有效量的癌症治疗剂的步骤。
15.权利要求1的金属复合物在制备用于治疗有需求的受试者的癌症的药物中的用途，所述治疗包括施用治疗有效量的所述金属复合物；以及用电磁辐射照射含有癌的靶组织，所述电磁辐射具有在所述金属复合物的活化波长内的波长。
16.权利要求15所述的用途，其中所述癌是膀胱癌。
17.权利要求15所述的用途，其中所述金属复合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004089323950000062
Figure FDA0004089323950000071
Figure FDA0004089323950000072
及
Figure FDA0004089323950000073
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
18.权利要求1的金属复合物在制备用于通过核磁共振造影(MRI)成像受试者以及治疗受试者的癌症的药物中的用途，所述成像以及治疗包括：向所述受试者施用治疗有效量的所述金属复合物；以电磁辐射照射含有癌的靶组织，所述电磁辐射具有在所述金属复合物的活化波长内的波长；并且通过MRI成像所述受试者的至少一部份。
19.权利要求18所述的用途，其中所述金属复合物选自由以下组成的组：
Figure FDA0004089323950000081
Figure FDA0004089323950000082
及
Figure FDA0004089323950000083
其中Ln为Gd(III)；且R4为O-或NH(tBu)。
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US16/372,492 2019-04-02
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US20190298832A1 (en) 2019-10-03
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