CN113845458B - 一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶i的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针及其制备方法与应用，方法包括：LXY、HATU和DIPEA混合，完全溶解在干燥的二氯甲烷溶液中，在0℃下搅拌反应；再加入TPAN溶液，进一步室温搅拌反应，结束后进行纯化，得到为深红色固体BH1‑BOC；将BH1‑BOC溶解在无水二氯甲烷中，在冰盐浴条件下，加入配好的三氟乙酸溶液，滴加完毕进行室温搅拌反应；旋干溶剂，再向其中加入二氯甲烷，反复多次，直到将三氟乙酸全部旋干；将粗产物纯化，得到红色固体BH1。

Description

一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针及其制备方法 与应用
技术领域
本发明属于小分子荧光探针分析检测领域，具体涉及一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I(PGP-1)的荧光探针及其制备方法与应用。
背景技术
焦谷氨酰氨基肽酶I(PGP-1，EC 3.4.19.3)是一种典型的胞质半胱氨酸肽酶。PGP-1广泛分布在细菌，植物和动物组织中，且可以从内源性蛋白质和生物活性肽(经降压素，促黄体激素释放激素，胃泌素，促甲状腺激素释放激素和免疫球蛋白，等)的氨基末端特异性水解L-焦谷氨酸(L-pGlu)残基。因此，在测定含L-pGlu残基的N-封闭肽和蛋白质的氨基末端序列时，PGP-1具有明显的效果。该酶催化产物L-pGlu同样具有多种药理学特性，主要包括兴奋性氨基酸拮抗剂、脑刺激剂和焦虑剂等。相关研究表明，PGP-1与细胞中免疫应答有关，并作为一种新的炎症因子参与了胞内炎症反应。然而，过去的研究仅限于细胞与活鼠层面，模型小鼠的病理和生理特性仍与人体存在较大差异，因此，缺少评估PGP-1在人员样本中的活性差异以及证明在人员样本中参与炎症反应。这将极大限制了对PGP-1在抗炎药物代谢中确切作用的理解。因此，迫切需要开发有效的小分子荧光探针来探究PGP-1与临床机体炎症及某些疾病的发病机制。目前，现有的PGP-1荧光探针，仅适用于短波激发的单光子荧光显微技术，由于受背景干扰较大，组织渗透能力弱，限制了该类探针在生物体内的应用。相比于传统单光子荧光探针，双光子激发(TPE)荧光探针的生物成像可以获得改进的三维空间定位和增加的成像深度，并且减少对生物样品的光毒性或光损伤，因此更有有利于在活组织中检测PGP-1活性。但是，具有特异性检测临床人源样本中的PGP-1的双光子荧光探针还尚未报道，目前亟需探究。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供了一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针及其制备方法与应用，通过将L-pGlu引入萘环荧光团的骨架，设计了一个新颖的双光子荧光探针(BH1)。该探针与PGP-1反应后不仅具有优异的有效双光子吸收截面(λex＝760nm；δΦ＝118GM),而且在生理条件下对PGP-1 表现出优越的选择性和响应性，并且还适用于PGP-1在不同生物样品中成像领域的研究。
为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现：
一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针，所述荧光探针的结构式为：
Figure GDA0003526110790000021
作为本发明的进一步改进，所述荧光探针与染料TPAN在PBS缓冲溶液中的最佳吸收/发射波长分别为300/408nm,321/513nm，以300nm作激发时，荧光探针表现出草青色发射，在0～408nm处达到峰值，双光子吸收截面为12.4 GM；染料在513nm处有绿色荧光发射，双光子吸收截面为188.0GM。
一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
LXY、HATU和DIPEA混合，完全溶解在干燥的二氯甲烷溶液中，在0℃下搅拌反应；再加入TPAN溶液，进一步室温搅拌反应，结束后进行纯化，得到为深红色固体BH1-BOC；
将BH1-BOC溶解在无水二氯甲烷中，在冰盐浴条件下，加入配好的三氟乙酸溶液，滴加完毕进行室温搅拌反应；旋干溶剂，再向其中加入二氯甲烷，反复多次，直到将三氟乙酸全部旋干；将粗产物纯化，得到红色固体BH1。
作为本发明的进一步改进，LXY、HATU和DIPEA的摩尔比为1:1:2.5；
所述TPAN溶液是TPAN溶解在二氯甲烷中得到，TPAN与二氯甲烷的用量比为1mmol：10mL。
作为本发明的进一步改进，所述结束后进行纯化，具体包括：
减压蒸馏，旋干溶剂，粗产物经硅胶色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，得到为BH1-BOC；所述石油醚/乙酸乙酯的体积比为(30～1)：1。
作为本发明的进一步改进，所述三氟乙酸溶液是三氟乙酸溶于二氯甲烷中得到，三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为2:3。
作为本发明的进一步改进，所述滴加完毕进行室温搅拌反应中，采用点板跟踪，确定保护基团完全脱去后，终止反应。
作为本发明的进一步改进，所述将粗产物纯化，具体包括：
将粗产物通过快速硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，得到红色固体BH1。
作为本发明的进一步改进，所述二氯甲烷/甲醇的体积比为10/1。
所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针在生物样品中PGP-1的检测与成像中的应用。
与现有技术相比，具有以下技术效果和优点：
本发明合成的小分子荧光探针BH1是一类光物理学性质优良、生物相容性好的生物传感材料；
本发明合成的目标产物原料易得、成本低、合成步骤简单、溶解性好，使其商业化成为可能。
本发明合成的目标产物带有双酯基官能团，具有很好的细胞膜通透性，另外，BH1还可以作为双光子荧光探针，其激发波长在760nm处的近红外区，具有更低的激发能量、更强的穿透性、对细胞的光损伤更小等优点；本发明的探针对PGP-1的响应呈线性关系，可以用于该酶的定量检测；本发明的探针对 PGP-1具有高灵敏度响应，可以用于该酶的痕量检测；本发明的探针对PGP-1 的响应不受生物体内的常见的无机盐、蛋白、氨基酸等干扰影响；本发明的探针溶解性好，可直接用于生物样品中PGP-1的检测与成像；
附图说明
图1为本发明化的合物BH1的化学反应方程式与合成路线图；
图2为本发明的探针和染料的单光子发射光谱(图2中的 A)和双光子荧光光谱(图2中的 B)对比图；
图3为本发明的探针BH1在体外测试中，随着PGP-1的浓度的变化而变化的荧光发射光谱；嵌入图为：在PGP-1一定的浓度范围内时，探针对其的线性关系示意图；
图4为本发明的探针对PGP-1的动力学研究；嵌入图为：拟合的 Linewearver-Burk曲线示意图；
图5为本发明的探针在吞噬RAW264.7胞内检测PGP-1，通过LPS诱导PGP-1胞内上调，通过siPGP-1诱导PGP-1表达下调示意图；
图6为本发明的探针通过双光子共聚焦荧光显微镜在临床炎症病人的皮肤组织内检测PGP-1表达示意图；
图7为用本发明的探针评估临床血清样本中PGP-1表达，以及测试血清样本中其他炎症因子(L-6,TNF-α和PCT)的表达示意图。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针及其制备方法与应用。
本发明提供了一种化合物BH1，所述化合物的结构式为：
Figure GDA0003526110790000051
首先，评价了该探针的光物理学性质。测得针BH1与染料TPAN在PBS 缓冲溶液中的最佳吸收/发射波长分别为300/408nm,321/513nm(图2中的A)。以300nm作激发时，BH1表现出草青色发射，在～408nm处达到峰值，双光子吸收截面为12.4GM；染料在513nm处有较强的绿色荧光发射，同时有较大的双光子吸收截面为188.0GM(图2中的B)。
一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，包括以下步骤：
LXY、HATU和DIPEA混合，完全溶解在干燥的二氯甲烷溶液中，在0℃下搅拌反应；再加入TPAN溶液，进一步室温搅拌反应，结束后进行纯化，得到为深红色固体BH1-BOC；
将BH1-BOC溶解在无水二氯甲烷中，在冰盐浴条件下，加入配好的三氟乙酸溶液，滴加完毕进行室温搅拌反应；旋干溶剂，再向其中加入二氯甲烷，反复多次，直到将三氟乙酸全部旋干；将粗产物纯化，得到红色固体BH1。
在体外评价了探针对PGP-1及分析检测能力；以350nm作为激发，添加 PGP-1后，探针的荧光光谱会发生明显变化。探针BH1在0.01-2.0μg/mL的 PGP-1范围内表现出良好的线性关系，方程为ΔF＝1641.9x C(μg/mL)+11.24(R ＝0.996)，计算出BH1对PGP-1的检测限为2.64ng/mL(图3)。
根据Michaelis–Menten方程，研究探针对PGP-1作用的动力学行为，并得到相应的米氏常数(Km＝8.996μM,kcat＝0.38min-1,Vmax＝0.11 nmol·mg-1·min-1)(图4)，从而说明了探针对PGP-1具有很高的亲和力。BH1 对PGP-1作用具有一种高选择性，高灵敏性，可以作为一种良好的PGP-1响应的双光子探针用于各种生物学领域研究。
通过探针BH1检测胞内PGP-1的变化，探究PGP-1与免疫过程之间的关系；通过用免疫增强剂脂多糖(LPS)和siRNA扰(siPGP-1)处理RAW264.7细胞，流式细胞术结果明显反映了胞内PGP-1浓度的上调和下调，并通过随后的蛋白免疫印迹(Western Blot,WB)和聚合酶链反应(Polymerase Chain Reaction, PCR)分析进一步证实了这一结果。在某种程度上来说，证实了PGP-1可作为一种新的炎症细胞因子指示炎症的发生。接下来，通过激光共聚焦明显观察到荧荧光强度明显高于对照组用LPS处理的RAW264.7细胞后；经过siRNA转染的RAW264.7细胞内荧光强度弱于对照组，用siRNA转染处理的细胞(图5)。这种荧光增强和减弱反映了内源性PGP-1表达水平，与WB和PCR的结果一致。与传统的需要物理分离PGP-1蛋白的常规PGP-1分析不同，BH1提供了一种高效的方法，借助共聚焦显微镜可视化报告内源性PGP-1活性表达。
在证明PGP-1可作为一种新的炎症因子和探针能够对胞内的PGP-1活性的高度特异性检测能力后，本发明非常希望通过一种高效的方法去评估探针是否可以用于临床相关炎症检测高水平的PGP-1活性。因此，本发明继续探究了探针BH1在临床活体组织内源性PGP-1检测中的应用。本发明用探针处理来自烧伤病人的皮肤组织(炎症发生)和同一患者正常皮肤组织，通过TPFM成像技术探究深部组织中的PGP-1活动。如图6所示，实验组(ID1-3)的荧光强度明显高于对照组，这意味着烧烧炎症的发生过程中确实会导致人皮肤组织中PGP-1表达上调。
血液流经全身各个脏器组织，是脏器组织的一面镜子。采一定量静脉血，通过有效地监控血液内炎症因子浓度变化可以作为诊断炎症的发生的依据之一，此方法快捷方便，具有临床实用性。为此，收集了临床七组脓毒症患者，通过探针BH1评估血清样本中PGP-1活性的可行性，按照标准检测方法进行了体外试验。如图7所示，探针检测到PGP-1的活性表达在脓毒症患者中明显高于正常组，重要的是，通过分析同样证实了IL-6,TNF-α和PCT的上调(其上调与脓毒炎症过程的增强有关)。
本发明合成的小分子荧光探针BH1是一类光物理学性质优良、生物相容性好的生物传感材料；
本发明合成的目标产物原料易得、成本低、合成步骤简单、溶解性好，使其商业化成为可能；
本发明合成的目标产物带有双酯基官能团，具有很好的细胞膜通透性，另外，BH1还可以作为双光子荧光探针，其激发波长在760nm处的近红外区，具有更低的激发能量、更强的穿透性、对细胞的光损伤更小等优点；
本发明的探针对PGP-1的响应呈线性关系，可以用于该酶的定量检测；
本发明的探针对PGP-1具有高灵敏度响应，可以用于该酶的痕量检测；
本发明的探针对PGP-1的响应不受生物体内的常见的无机盐、蛋白、氨基酸等干扰影响；
本发明的探针溶解性好，可直接用于生物样品中PGP-1的检测与成像；
本发明利用该探针首次评估了PGP-1在人源样本中的活性差异以及证明 PGP-1在临床样本中参与炎症反应。
以下将结合具体实例阐述本发明。特别说明，这些实例仅用于说明本发明，而不用于限定本发明的保护范围。在实际应用中技术人员根据本发明做出的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
实施例1
1.Dimethyl(R)-6-(1-(tert-butoxycarbonyl)-5-oxopyrrolidine-2-carboxamido)n aphthalene-2,3-dicarboxylate(BH1-BOC)的合成
向单口烧瓶中加入dimethyl 6-aminonaphthalene-2,3-dicarboxylate(LXY；115mg，0.5mmol)，2-(7-Azabenzotriazol-1-yl)-N,N,N',N'-tetramethyluroniumhexafluorophosphate(HATU；190mg，0.5mmol)和N,N-Diisopropylethylamine (DIPEA；200μL，1.25mmol)，使其完全溶解在干燥的二氯甲烷溶液(25mL) 中，上述反应物在0℃下搅拌反应30分钟。然后，再加入在二氯甲烷(5mL) 中溶解好的后TPAN(130mg，0.5mmol)，进一步室温搅拌4小时。反应结束后，减压蒸馏，旋干溶剂，粗产物经硅胶色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯 (15/1，v/v)作为洗脱剂，得到为深红色固体BH1-BOC(70mg)，产率：14％。BH1-BOC：1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm:10.80(s,1H),8.44(s, 1H),8.36(s,1H),8.24(s,1H),8.13(d,J＝8.7Hz,1H),7.85(d,J＝8.4Hz,1H), 4.75(d,J＝6.3Hz,1H),3.86(s,6H),2.38-2.17(m,2H),2.40-2.26(m,2H),1.98(s, 2H),1.36(s,9H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm:177.49,172.04,167.79, 167.13,139.19,133.80,129.89,129.72,129.37,129.23,128.78,126.05,122.51, 115.77,56.49,52.60,29.22,25.33.HRMS:m/z[M+H]+calcd:471.5263,found: 470.1689.
2.BH1的合成
将中间产物BH1-BOC(70mg，0.15mmol)溶解在无水二氯甲烷(5mL) 中，在冰盐浴条件下，将配好的三氟乙酸溶液(4mL的三氟乙酸溶于6mL干燥的二氯甲烷)缓慢滴加到上述体系中。滴加完毕，室温搅拌反应。点板跟踪，确定保护基团完全脱去后，终止反应。旋干溶剂，再向其中加入二氯甲烷，反复多次，直到将三氟乙酸全部旋干。并将粗产物通过快速硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇(10/1，v/v)作为洗脱剂，得到红色固体BH1(50mg)产率： 72％。BH1:1H NMR(500MHz,DMSO-d6)δppm:8.96(s,1H),8.17(s,1H),8.05 (s,1H),7.99(s,1H),7.69(d,J＝8.7Hz,1H),7.62(d,J＝8.6Hz,1H),7.09(s,1H), 4.39(dd,J＝8.3,5.5Hz,1H),3.94(s,3H),3.91(s,3H),2.66(s,1H),2.52(s,1H), 2.43(s,1H),2.34(s,1H).13C NMR(125MHz,DMSO-d6)δppm:177.49,172.04, 167.79,167.13,139.19,133.80,129.89,129.72,129.37,129.23,128.78,126.05, 122.51,115.77,56.49,52.60,29.22,25.33.MS:m/z[M+H]+calcd:370.3610,found: 371.2272.
3.吸收/发射光谱测试方法与条件
称取一定量的TPAN和BH1固体，并用DMSO配成浓度为5mM的探针储备液。使用酶测试缓冲溶液(成分为10mM PBS，5％DMSO，pH＝7.42) 将储备液稀释成1μM，用于后续测试。光谱测试时，将1μM探针与5μg/mL 的PGP-1反应30分钟后，测试280-600nm的吸收光谱，以及在325nm激发下400-700nm范围内的荧光发射光谱。
3.2.1灵敏度测试
将1μM的BH1与不同浓度的PGP-1(0，0.2，0.5，1，2，3，4，5，10， 15，20，30，40，50μg/mL)在酶缓冲溶液中，于37℃反应30分钟后，使用仪器记录400-700nm处的荧光发射光谱图(λex＝325nm)。
3.2.2检测限计算
计算PGP-1浓度(0.2-5μg/mL)与BH1(1μM)的荧光强度的线性关系，并得到线性方程(n＝3)。利用公式
LOD＝3σ/k (3-1)
得到检测限，其中σ为空白样品11次检测结果的标准偏差，k为PGP-1 浓度与荧光强度线性关系的斜率。
3.2.6特异性测试
实验组1：探针BH1(1μM)与PGP-1(5μg/mL)反应30分钟；
实验组2：使用抑制剂碘乙酰胺(150nM)预先与PGP-1(300ng/mL)反应1小时，再加入探针BH1(1μM)反应30分钟
同时设置空白组，每组平行三个样品，反应结束后，使用酶标仪记录λex＝ 325nm激发下4500nm处的荧光发射光谱图。
3.2.3抗干扰测试
使用十万分之一天平准确称取一定量的阴阳离子、氨基酸，使用超纯水配制成浓度10mM的储备液。测试时，使用酶缓冲溶液将储备液稀释成终浓度为100μM，与探针BH1(1μM)在37℃下反应30分钟后，记录探针在525nm 处的荧光强度(λex＝325nm)，与探针BH1(1μM)和PGP-1(5μg/mL)反应30分钟的荧光强度进行比较。
干扰物包括：NaCl；KNO3；Mg(NO3)2·6H2O；Al(NO3)3·9H2O； Cu(NO3)2·9H2O；Fe(NO3)3·9H2O；Mn(NO3)2·4H2O；Cd(NO3)2·4H2O； Zn(NO3)2·6H2O；Ni(NO3)2·6H2O；Cr(NO3)3·9H2O；FeCl2·4H2O；Ca(NO3)2·4H2O； CH3COONa；NaHCO3；NaF；NaBr；NaI；NaNO3；Na2CO3；Na2SO4； Na2HPO4·12H2O；NaH2PO4·2H2O；NaClO；Glycine；Alanine；Valine；Isoleucine；Phenylalanine；Tryptophan；Methionine；Proline；Serine；Threonine；Cysteine；Tyrosine；Histidine；Lysine；Arginine；Asparticacid；Glutamicacid.
3.2.4稳定性测试
(1)pH稳定性：配制不同pH(4.0～10.0)的PBS溶液(10mM，5％DMSO)，分别加入探针BH1(15μM)与PGP-1(0.5μg/mL)混合，于37℃下反应30 分钟(λex/em＝408/513nm)。
(2)温度稳定性：在酶缓冲溶液中，将探针BH1(15μM)与PGP-1(0.5 μg/mL)在不同温度(25℃，30℃，35℃，37.5℃，40℃，45℃)下反反应 30分钟(λex/em＝408/513nm)。
3.2.5酶动力学参数测试
使用酶测试缓冲溶液配制浓度分别为0，1，2，5，10，20，50μM的BH1，吸取50μL置于384孔板中。向溶液中立即加入50μL的GGT溶液(终浓度为25U/L)，置于酶标仪中，于37℃下，每隔10分钟测定一次荧光值(λex/em ＝360nm/500nm)，持续2小时。利用Michaelis-Menten公式：
V0＝Vmax([S])/(km+[S])
其中km值称为米氏常数，Vmax是酶被底物饱和时的反应速度，[S]为底物浓度。
3.2.6量子产率的测定
利用参比法，选择香豆素307(coumarin307)为标准物质，其在乙醇溶液中的量子产率0.56，利用公式：Φs＝Φr(Arηs 2Ds/Asηr 2Dr)计算得到量子产率。其中Φr为标准物质的量子产率，Ar为标准物质和待测物的吸光度，Dr和Ds为标准物质和待测物的荧光积分面积，ηr和ηs为标准物质和待测物溶液的折射率。 r和s分别代表标准物质和待测物。
3.2.7双光子吸收截面的测定
首先测定BH1和TPAN(溶液为10mM PBS，5％DMSO,pH＝7.42)在 690-820nm激发下400-600nm范围内的双光子荧光发射强度。同时测定具有相同激发波长的参比物Flu1的TPE荧光发射强度，其双光子性质已有报道。双光子吸收截面(δ)利用如下公式计算得到：
δ＝δref(ΦrefcrefηrefF)/(ΦcηFref)
其中ref代表参比分子，σ是双光子吸收截面，c是样品的浓度，η是溶液的折射率，F是样品的积分面积，Φ是荧光量子产率，σref是参比物的双光子吸收截面。
3.2.8细胞培养
人源性肿癌细胞Thp1，人源性肝癌细胞HepG-2，人大脑的神经瘤细胞SH-SY5Y和小鼠单核巨噬细胞白血病细胞RAW264.7在含有10％胎牛血清 (FBS)、1％链霉素和青霉素的Dulbecco’s Modified Eagle培养基(DMEM) 中培养，置于温度为37℃、含有5％CO2的培养箱中。
3.3.9细胞成像实验
将细胞接种于30mm的玻底培养皿中，待细胞融合度达到60-70％时，将细胞培养基替换成含有10μM TPAN-Glu和1％DMSO的新鲜培养基，在培养箱孵育不同的时间(0-60分钟)，同时将不含TPAN-Glu的细胞作为对照组。抑制剂组加入适当浓度的抑制剂预先孵育30分钟，除去培养基，用预热的 DMEM清洗细胞3次后，再加入含有BH1的培养基孵育。成像前，将含有探针BH1的培养基吸除，使用预热的DMEM清洗3次，重新加入1mL新鲜培养基，用于细胞成像。
细胞成像条件：单光子激发光λex＝405nm，发射光λem接收波段：450-550 nm；双光子激发光λex＝760nm，发射光λem接收波段：450-550nm。除非另有说明，数据均以三个独立测量值的平均值±标准差(SD)表示。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以作出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (9)

1.一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针的结构式为：
Figure 485982DEST_PATH_IMAGE001
。
2.根据权利要求1所述的一种用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针，其特征在于，所述荧光探针与染料TPAN在PBS缓冲溶液中的最佳吸收/发射波长分别为300/408 nm，321/513 nm，以300 nm作激发时，荧光探针表现出草青色发射，在0~ 408 nm处达到峰值，双光子吸收截面为12.4 GM；染料在513 nm处有绿色荧光发射，双光子吸收截面为188.0 GM；
TPAN结构式为：
Figure 677929DEST_PATH_IMAGE002
。
3.权利要求1所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，其特征在于，包括以下步骤：
LXY、HATU和DIPEA混合，完全溶解在干燥的二氯甲烷溶液中，在0℃ 下搅拌反应；再加入TPAN溶液，进一步室温搅拌反应，结束后进行纯化，得到为深红色固体BH1-BOC；
将BH1-BOC溶解在无水二氯甲烷中，在冰盐浴条件下，加入配好的三氟乙酸溶液，滴加完毕进行室温搅拌反应；旋干溶剂，再向其中加入二氯甲烷，反复多次，直到将三氟乙酸全部旋干；将粗产物纯化，得到红色固体BH1；
所述LXY的结构式为
Figure 226722DEST_PATH_IMAGE003
所述BH1-BOC的结构式为
Figure 845922DEST_PATH_IMAGE004
所述BH1的结构式为
Figure 847376DEST_PATH_IMAGE005
。
4.根据权利要求3所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，其特征在于，LXY、HATU和DIPEA的摩尔比为1:1:2.5；
所述TPAN溶液是TPAN溶解在二氯甲烷中得到，TPAN与二氯甲烷的用量比为1 mmol：10mL。
5.根据权利要求3所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述结束后进行纯化，具体包括：
减压蒸馏，旋干溶剂，粗产物经硅胶色谱法纯化，用石油醚/乙酸乙酯作为洗脱剂，得到为BH1-BOC；所述石油醚/乙酸乙酯的体积比为（30~1）：1。
6.根据权利要求3所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述三氟乙酸溶液是三氟乙酸溶于二氯甲烷中得到，三氟乙酸与二氯甲烷的体积比为2:3。
7.根据权利要求3所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述滴加完毕进行室温搅拌反应中，采用点板跟踪，确定保护基团完全脱去后，终止反应。
8.根据权利要求3所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，所述将粗产物纯化，具体包括：
将粗产物通过快速硅胶色谱法纯化，用二氯甲烷/甲醇作为洗脱剂，得到红色固体BH1。
9.根据权利要求8所述的用于检测焦谷氨酰氨基肽酶I的荧光探针的合成方法，其特征在于，所述二氯甲烷/甲醇的体积比为10:1。
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