JP2022554336A - 婦人科腫瘍の初代細胞の培養方法及びその支援培地 - Google Patents
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Abstract
Description
(1)婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を温和な細胞解離用試薬で処理して、組織中の腫瘍細胞の活力を最大限に保障すること、(2)特殊な無血清培地を調製し、懸濁培養系を用いて婦人科腫瘍の初代細胞を体外で培養し、腫瘍細胞の正常な増殖を確保すると同時に、正常細胞による妨害を最大限に排除すること。
前記培地Bは、前記抗菌-抗真菌剤三重抗体(ペニシリン・ストレプトマイシン・アンホテリシンB)、前記HEPES、前記GlutaMax、前記ヒト組換えタンパク質EGF、前記ヒト組換えタンパク質bFGF、前記ヒト組換えタンパク質HGF、前記ヒト組換えタンパク質MSP、前記N-アセチル-L-システイン(N-acetyl-L-cysteine)、前記N-2 Supplement、前記Y-27632、前記プロゲステロン(Progesterone)、前記β-エストラジオール(β-EstradioL)及び前記ヒト細胞培養用基礎培地(例えばAdvanced DMEM/F12培地)を含む溶液である。
1.サンプル保存液(100mL)
サンプル保存液(100mL)の具体的な配合を表1に示す。
サンプル洗浄液(100mL)の具体的な配合を表2に示す。
サンプル解離液(10mL)の具体的な配合を表3に示す。
細胞消化液(10mL)の具体的な配合を表7に示す。
消化停止液(100mL)の具体的な配合を表8に示す。
婦人科腫瘍の初代細胞の培地(100mL)には2種類があり、それぞれ、培地A及び培地Bと表記した。前記培地Aの具体的な配合を表9に示す。前記培地Bの具体的な配合を表10に示す。
細胞凍結保存液の具体的な配合は表21に示すとおりである。
細胞単離緩衝液(100mL)の具体的な配合を表24に示す。
1、三級・一流の病院との連携、連携は、正規の医学倫理審査を経て実施した。
2、主治医は、医学ガイドラインに規定された臨床徴候に従って患者群を選択し、手術中の臨床徴候に従って体外培養のために適切なサンプルを選択する。サンプルの選択基準は以下のとおりである:原発乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、又はそれらの転移病巣であり;また、手術標本の重量が20mgを超えたサンプル、胸腔液サンプルが100mLを超えたサンプル、又は穿刺生検の標本が4本を超えたサンプルである。
3、主治医は、患者の性別、年齢、病歴、家族歴、喫煙歴、病理病期分類、臨床診断などの基本的な臨床情報を提供する。患者の氏名、身分証明書の番号等の患者のプライバシーに関する情報を秘匿し、統一された実験番号に置き換える。また、実験番号の命名規則は、採集されたサンプルの8桁の数字である日付+患者の院内番号の下4桁である。例えば、2018年1月1日に提供されたサンプルの場合、患者の院内番号がT001512765であれば、サンプルの実験番号は201801012765である。
4、手術中に、外科医は、手術室の無菌環境で、新鮮な術後の標本/生検穿刺の標本を採集し、予め準備したサンプル保存液(実施例1参照)に入れた。サンプルは、体から離れた後、氷で一時的に保管され、2時間以下をかけて実験室に輸送され、次の操作に用いられた。胸腔液サンプルを、48時間以下をかけて実験室に輸送され、次の操作に用いられた。
以下の操作は氷上で行うことが必要であり、また、全部の操作は10分間以内に完了する必要がある。
1.サンプルを秤量した。
2.サンプルの表面を75%(体積百分率)のエタノールで10~30秒間洗浄した。
3.サンプルをサンプル洗浄液で5回、無菌PBS溶液で5回洗浄した。
4.眼科用ハサミ、眼科用ピンセット、メスなどの器具を用いて、サンプル中の脂肪組織、結合組織、壊死組織を慎重に剥離した。
下記の実施例に使用する手術器具は、いずれも高温高圧で滅菌され、乾燥しておく必要がある。
2.1mg組織当たり0.1mLのサンプル解離液の量で、切断した組織サンプルを、事前に37℃に予熱したサンプル解離液により処理して、37℃、15分間~3時間の解離時間の条件で、サンプル解離を行った。単一細胞が大量に観察されたまでに、サンプルの解離状態を15分間ごとに顕微鏡下で観察した。
3.解離反応を10倍の体積の消化停止液(実施例1参照)で停止させ、細胞懸濁液を収集した。
4.細胞懸濁液を100μmの無菌の細胞ろ過網で濾過し、組織残片及び接着細胞を除去した。
5.800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
6.細胞を5mLの無菌PBSで再懸濁し、800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
7.細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地(実施例1参照)で再懸濁し、顕微鏡下で細胞状態を観察し、細胞数をカウントした。
以下の操作は氷上で行うことが必要であり、また、全部の操作は10分間以内に完了する必要がある。
2.上清を50mLの無菌遠心分離管に慎重に移し、1倍の体積の予冷されたPBSを加えて均一に混合した;
3.2000gで、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した;
4.細胞単離緩衝液(実施例1参照)で細胞ペレットを再懸濁させ、2000gで、4℃で5分間遠心分離し、上清を廃棄した;
5.細胞単離緩衝液(実施例1参照)で細胞ペレットを再懸濁させ、細胞の濃度を107/mLに調整した。
1.50mLの無菌遠心分離管を用いて、細胞懸濁液と同じ体積のFicoll細胞分離液(MP#50494)を採取した。
2.細胞懸濁液を、細胞分離液の上層に、両者の間に明確な界面が形成されるように慎重に加えた。
3.2000gで、水平方向に常温の遠心分離を20分間行った。
4.中間層の白色膜を新しいチューブに吸引して取った。
5.細胞ペレットを20mLの無菌PBSで再懸濁させ、1500gで、常温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
6.細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地(実施例1参照)で再懸濁させ、細胞状態を顕微鏡で観察し、細胞数をカウントした。
1.低付着性表面(low-attachment-surface)を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の懸濁培養を行った。用いられた培地は、実施例1における婦人科腫瘍の初代細胞の培地A又はBである。また、6ウェルプレートを例として、1ウェル当たり106個の細胞という密度で敷いて、37℃、5%CO2という培養条件で、細胞インキュベーターにおいて培養した。
1.培養皿から細胞塊を収集し、800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
2.細胞塊を無菌PBS溶液で洗浄し、800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
3.細胞塊を細胞消化液(実施例1参照)で再懸濁させ、37℃で消化した。細胞塊の消化状況を5分間毎に顕微鏡で観察し、細胞塊がすべて消化されて単一細胞になるまで観察した。
4.解離反応を10倍の体積の消化停止液(実施例1参照)で停止し、細胞懸濁液を収集した。
5.800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
6.細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地(実施例1参照)で再懸濁させ、細胞数をカウントした。
7.低付着性表面(low-attachment-surface)を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の培養を行った。用いられた培地は、実施例1における婦人科腫瘍の初代細胞の培地である。また、6ウェルプレートを例として、1ウェル当たり106個の細胞という密度で敷いて、37℃、5%CO2という培養条件で、細胞インキュベーターにおいて培養した。
懸濁培養された婦人科腫瘍の初代細胞を、2~3回継代して増殖させた後、凍結保存することができる。
2.細胞塊を無菌PBS溶液で洗浄し、800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
3.細胞塊を細胞消化液(実施例1参照)で再懸濁させ、37℃で消化した。細胞塊がすべて消化されて単一細胞になるまで、細胞塊の消化状況を15分間毎に顕微鏡で観察した。
4.解離反応を10倍の体積の消化停止液(実施例1参照)で停止し、細胞懸濁液を収集して細胞数をカウントした。
5.800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
6.細胞ペレットを細胞凍結保存液(実施例1参照)で106/mLの密度で再懸濁させ、2mLの凍結保存チューブの1管当たり、1mLの細胞懸濁液を入れ、また、それを勾配降温カセットで一晩凍結保存した後、液体窒素へ転移して長期保存する。
液体窒素中に保存された婦人科腫瘍の初代細胞に対して蘇生を行うことができる。
2.凍結保存チューブを液体窒素から取り出し、細胞を37℃の無菌水において急速に溶けた。
3.800gで、室温で10分間遠心分離し、上清を廃棄した。
4.細胞ペレットを婦人科腫瘍の初代細胞の培地(実施例1参照)で再懸濁させ、低付着性表面を用いて婦人科腫瘍の初代細胞の培養を行い、1チューブ当たりの細胞を3.5cmの培養皿へ蘇生し、細胞培養箱により37℃、5%CO2という培養条件で培養した。
下記の実施例で使用された試薬・消耗品に対する説明は、以下のとおりである。
カチオン脱離防止スライドガラス(ZSGB-BIO Technology Co., Ltd.);
キシレン、メタノール、アセトン(北京化学試薬社、分析純度);
中性の樹脂ガム(Beijing Yili Fine Chemicals Co., Ltd.)。
2.風乾された細胞に、4℃で予冷されたメタノール/アセトン混合液(体積比1:1) 50μLを慎重に滴下し、その後、スライドガラスを4℃の冷蔵庫に入れ、10分間固定した。
3.細胞が固定されたスライドガラスを取り出し、室温で自然乾燥させた。
4.スライドガラスを200μLのPBSで2回洗浄した。
5.スライドガラス上の水分が微乾燥したところ、100μLのヘマトキシリン染色液を加えて1分間染色した。
6.ヘマトキシリン染色液を吸引して除去し、スライドガラスを水道水200μLで3回洗浄した。
7.100μLの分化液を滴下して1分間分化した。
8.分化液を吸引して除去し、スライドガラスを、水道水で2回、蒸留水で1回、順番に洗浄した。
9.スライドガラス表面の水分を吸引して除去し、200μLのエオシン染色液を滴下して40秒間染色した。
10.エオシン染色液を吸引して除去し、順に、75%、80%、90%、100%のエタノールで、20秒間、20秒間、40秒間、40秒間のリンスで脱水した。
11.エタノールが乾燥した後、キシレン50μLを滴下して細胞の透過を行った。
12.キシレンが完全に乾燥した後、中性の樹脂ガムを1滴滴下し、カバーガラスでシールし、顕微鏡で観察し、写真を撮った。
下記の実施例で使用された試薬に対する説明は、以下の通りである。
過酸化水素(北京化学試薬社、35%);
ブロッキング用正常ヤギ血清(Solarbio、SL038);
免疫組織化学一次抗体(福建邁新生物技術開発有限公司、kit-0012);
免疫組織化学二次抗体(Abcam、ab205719);
EDTA修復液(Abcam、ab93684);
DAB発色液(SignalStain(登録商標) DAB Substrate Kit,8059S)
供試培地:実施例1における2種の婦人科腫瘍の初代細胞の培地:すなわち、培地A又は培地B。
1.切片を、キシレンI、キシレンIIの順でそれぞれ10分間浸漬した。
2.無水エタノールI(5分間)-無水エタノールII(5分間)-95%アルコール(5分間)-80%アルコール(5分間)-70%アルコール(5分間)に再度浸漬し、次いで、脱イオン水で、各回ずつ2分間、2回リンスした。
3.組織切片を修復カセットに入れ、次いで、組織が浸漬されるように、適量の希釈されたEDTA修復液(pH9.0)を添加した。
4.マイクロ波におけるミッドレンジで、10分間修復し(液体が沸騰した時点で時間をカウントし始めた)した。なお、この過程において、組織が切片の上で乾燥することを防止するべきである。
5.修復カセットを電子レンジから取り出し、自然冷却下で降温し、修復液は室温に降温した後、スライドカラスを取り出し、PBS(pH7.4)で毎回ずつ3分間、3回リンスした(リンスの過程において、組織を破壊しないように組織に当てリンスしてはいけない)。
6.調製された3%の過酸化水素(脱イオン水で希釈した30%の過酸化水素)を切片組織へ滴下して内因性ペルオキシダーゼを遮断し、室温で15分間インキュベートし、PBSで毎回ずつ3分間、3回リンスした。
7.吸水紙でPBSを乾燥して、10%のヤギ血清(二次抗体の種属の由来と同一又は類似)をスライドカラスへ滴下し、37℃で60分間ブロッキングした。
8.吸水紙でスライドカラス上の組織の周囲にある液体を乾燥し、組織の周囲に油性ペンで輪を描き、次いで、希釈された一次抗体を滴下し、湿潤カセットにおいて4℃で一晩インキュベートした。
9.切片をPBSで毎回ずつ3分間、3回リンスした。切片に対して吸水紙で乾燥した後、ホースラディッシュ・ペルオキシダーゼを滴下して二次抗体を標識し、室温で60分間インキュベートした。
10.切片をPBSで毎回ずつ3分間、3回リンスした。PBS液体を振り落とした後、切片に対して吸水紙で干し、また、新鮮に調製したDAB発色液を切片ごとに滴下し、顕微鏡で観察し、陽性シグナルになった後に水道水で切片をリンスして発色を終了させた。
11.ヘマトキシリンで1分間再度染色し、水洗した後、酸性エタノール分化液で分化し、水道水でさらにリンスして青色に戻した。
12.切片を水に置いてリンスした後、切片を、70%アルコール-80%アルコール-90%アルコール-95%アルコール-無水エタノールI-無水エタノールII-キシレンI-キシレンIIの順に、投入して脱水させ、透明にした。各試薬において2分間ずつ放置し、最後に、切片をドラフトチャンバーに置いて風乾させた。
13.中性の樹脂ガムを用いて切片をシールし、カバーガラスで蓋をした。ドラフトチャンバーに置いて乾燥させた。
14.干した切片に対して、顕微鏡下で観察してもよいか、写真を撮ってもよい。
本実施例において、全てのサンプルの初代培養の操作方法及びプロセスは、完全に一致しているが(前述のとおり)、サンプルの病理タイプのみが異なっている。テストを行った各サンプルの状況を表26に示す。
本実施例において、全てのサンプルの初代培養の操作方法及びプロセスは完全に一致し(前述のとおり)、CYTOP修飾の方法は完全に一致しているが、細胞培養の消耗品の材質のみが異なっている(表27)。
本実施例では、射出成形の加工方式を用い、PMMA材料(或いはPS、PC、COC、COP、LAS等の材料)で加工して本発明に係る婦人科腫瘍の初代細胞を培養するためのマイクロプレートチップを得た。当該チップは、初代の婦人科腫瘍細胞の培養及び体外の薬剤感受性試験に使用することができる。マイクロプレートチップの設計図を図5に示す。
1.組織サンプルの用量が少なく、婦人科腫瘍における固形腫瘍の手術サンプル20mg程度のみが必要である;
2.培養サイクルが短く、107オーダーの初代腫瘍細胞を得るのに、3~10日しか必要ない;
3.培養安定性が高く、本方法により、合格した婦人科腫瘍における固形腫瘍の手術標本を体外培養する成功率が最大70%である;
4.細胞の純度が高く、本方法により得られた婦人科腫瘍の初代細胞の培養物において、腫瘍細胞の割合は70%~95%に達したが、他の細胞による妨害が少ない。
Claims (29)
- 培地A又は培地Bである培地であって、
前記培地Aは、抗菌-抗真菌剤三重抗体、HEPES、GlutaMax、ヒト組換えタンパク質EGF、ヒト組換えタンパク質bFGF、ヒト組換えタンパク質HGF、ヒト組換えタンパク質MSP、ヒドロコルチゾン、N-2 Supplement、Y-27632、プロゲステロン、β-エストラジオール、及びヒト細胞培養用基礎培地の組成を有するとともに、
前記抗菌-抗真菌剤三重抗体におけるペニシリンの最終濃度が100~200U/mLであり、前記抗菌-抗真菌剤三重抗体におけるストレプトマイシンの最終濃度が100~200μg/mLであり、前記抗菌-抗真菌剤三重抗体におけるアンホテリシンBの最終濃度が250~250ng/mLであり、前記HEPESの最終濃度が8~12mMであり、前記GlutaMaxの最終濃度が0.8~1.2%(体積百分率)であり、前記ヒト組換えタンパク質EGFの最終濃度が10~100ng/mLであり、前記ヒト組換えタンパク質bFGFの最終濃度が10~50ng/mLであり;ヒト組換えタンパク質HGFの最終濃度が5~25ng/mLであり、前記ヒト組換えタンパク質MSPの最終濃度が5~25ng/mLであり、前記ヒドロコルチゾンの最終濃度が1~10μg/mLであり、前記N-2 Supplementの最終濃度が1%(体積百分率)であり、前記Y-27632の最終濃度が5~20μMであり、前記プロゲステロンの最終濃度が50~100nMであり、前記β-エストラジオールの最終濃度が10~50nMであり、残部がヒト細胞培養用基礎培地であり、
前記培地Bは、抗菌-抗真菌剤三重抗体、HEPES、GlutaMax、ヒト組換えタンパク質EGF、ヒト組換えタンパク質bFGF、ヒト組換えタンパク質HGF、ヒト組換えタンパク質MSP、N-アセチル-L-システイン、N-2 Supplement、Y-27632、プロゲステロン、β-エストラジオール、及びヒト細胞培養用基礎培地の組成を有するとともに、
前記抗菌-抗真菌剤三重抗体におけるペニシリンの最終濃度が100~200U/mLであり、前記抗菌-抗真菌剤三重抗体におけるストレプトマイシンの最終濃度が100~200μg/mLであり、前記抗菌-抗真菌剤三重抗体におけるアンホテリシンBの最終濃度が250~250ng/mLであり、前記HEPESの最終濃度が8~12mMであり、前記GlutaMaxの最終濃度が0.8~1.2%(体積百分率)であり、前記ヒト組換えタンパク質EGFの最終濃度が10~100ng/mLであり、前記ヒト組換えタンパク質bFGFの最終濃度が10~50ng/mLであり、ヒト組換えタンパク質HGFの最終濃度が5~25ng/mLであり、前記ヒト組換えタンパク質MSPの最終濃度が5~25ng/mLであり、前記N-アセチル-L-システインの最終濃度が0.5~2mMであり、前記N-2 Supplementの最終濃度が1%(体積百分率)であり、前記Y-27632の最終濃度が5~20μMであり、前記プロゲステロンの最終濃度が50~100nMであり、前記β-エストラジオールの最終濃度が10~50nMであり、残部がヒト細胞培養用基礎培地であることを特徴とする、培地。 - 前記培地Aは、前記抗菌-抗真菌剤三重抗体、前記HEPES、前記GlutaMax、前記ヒト組換えタンパク質EGF、前記ヒト組換えタンパク質bFGF、前記ヒト組換えタンパク質HGF、前記ヒト組換えタンパク質MSP、前記ヒドロコルチゾン、前記N-2 Supplement、前記Y-27632、前記プロゲステロン、前記β-エストラジオール、及び前記ヒト細胞培養用基礎培地を含む溶液であり、
前記培地Bは、前記抗菌-抗真菌剤三重抗体、前記HEPES、前記GlutaMax、前記ヒト組換えタンパク質EGF、前記ヒト組換えタンパク質bFGF、前記ヒト組換えタンパク質HGF、前記ヒト組換えタンパク質MSP、前記N-アセチル-L-システイン、前記N-2 Supplement、前記Y-27632、前記プロゲステロン、前記β-エストラジオール、及び前記ヒト細胞培養用基礎培地を含む溶液であることを特徴とする、請求項1に記載の培地。 - 前記培地における各成分は、単独で存在していることを特徴とする、請求項1に記載の培地。
- 前記培地Aにおいて、前記ヒト組換えタンパク質EGF、前記ヒト組換えタンパク質bFGF、前記ヒト組換えタンパク質HGF、前記ヒト組換えタンパク質MSP、前記ヒドロコルチゾン、前記Y-27632、前記プロゲステロン、及び前記β-エストラジオールは、母液として存在しており、
前記培地Bにおいて、前記ヒト組換えタンパク質EGF、前記ヒト組換えタンパク質bFGF、前記ヒト組換えタンパク質HGF、前記ヒト組換えタンパク質MSP、前記N-アセチル-L-システイン、前記Y-27632、前記プロゲステロン、及び前記β-エストラジオールは、母液として存在していることを特徴とする、請求項3に記載の培地。 - 前記母液は、1000~100000倍の母液であり:
1000×ヒト組換えタンパク質EGFストック液は、ヒト組換えタンパク質EGF、BSA及びPBSの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質EGFの最終濃度は20μg/mLであり、前記BSAの最終濃度は0.01g/mLであり、残部はPBSであり;
1000×ヒト組換えタンパク質bFGFストック液は、ヒト組換えタンパク質bFGF、BSA及びPBSの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質bFGFの最終濃度は20μg/mLであり、前記BSAの最終濃度は0.01g/mLであり、残部はPBSであり;
1000×ヒト組換えタンパク質HGFストック液は、ヒト組換えタンパク質HGF、BSA及びPBSの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質HGFの最終濃度は20μg/mLであり、前記BSAの最終濃度は0.01g/mLであり、残部はPBSであり;
1000×ヒト組換えタンパク質MSPストック液は、ヒト組換えタンパク質MSP、BSA及びPBSの組成を有し、前記ヒト組換えタンパク質MSPの最終濃度は20μg/mLであり、前記BSAの最終濃度は0.01g/mLであり、残部はPBSであり;
1000×N-アセチル-L-システインストック液は、N-アセチル-L-システイン及び水の組成を有し、前記N-アセチル-L-システインの濃度は0.5Mであり、残部は水であり;
1000×Y-27632は、Y-27632及び水の組成を有し、Y-27632の最終濃度は10mMであり、残部は水であり;
100000×プロゲステロンストック液は、プロゲステロン及び無水エタノールの組成を有し、プロゲステロンの最終濃度は1mMであり、残部は無水エタノールであり;
100000×β-エストラジオールストック液は、β-エストラジオール及び無水エタノールの組成を有し、β-エストラジオールの最終濃度は1mMであり、残部は無水エタノールであり;
1000×ヒドロコルチゾンは、ヒドロコルチゾン及び水の組成を有し、前記ヒドロコルチゾンの最終濃度は0.5Mであり、残部は水であることを特徴とする、請求項4に記載の培地。 - 前記BSAは、前記1000×ヒト組換えタンパク質EGFストック液、前記1000×ヒト組換えタンパク質bFGFストック液、前記1000×ヒト組換えタンパク質HGFストック液、前記1000×ヒト組換えタンパク質MSPストック液において、母液として存在していることを特徴とする、請求項5に記載の培地。
- 前記BSAは100倍の母液として存在し、100×BSA溶液はBSA及びPBSの組成を有し、BSAの最終濃度は0.1g/mLであり、残部はPBSであることを特徴とする、請求項6に記載の培地。
- 前記ヒト細胞培養用基礎培地は、Advanced DMEM/F12培地であることを特徴とする、請求項1~7のいずれか一項に記載の培地。
- 前記培地は、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための培地であることを特徴とする、請求項1~8のいずれか一項に記載の培地。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の培地と、サンプル解離液、サンプル保存液、細胞単離緩衝液、細胞消化液、サンプル洗浄液、消化停止液、細胞凍結保存液及び1% CYTOP溶液のうちの少なくとも1種の試薬とを含む、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための支援試薬であって、
前記サンプル解離液は、コラゲナーゼI、コラゲナーゼIII、コラゲナーゼIV及びPBSの組成を有し、前記コラゲナーゼIの前記サンプル解離液における最終濃度は150~250U/mLであり、前記コラゲナーゼIIIの前記サンプル解離液における最終濃度は250~350U/mLであり、前記コラゲナーゼIVの前記サンプル解離液における最終濃度は150~250U/mLであり、残部はPBSであり、
前記サンプル保存液は、ウシ胎児血清、二重抗体P/S、HEPES及びHBSSの組成を有し、前記ウシ胎児血清の最終濃度は1~5%(体積百分率)であり、前記二重抗体P/Sにおけるペニシリンの最終濃度は100~200U/mLであり、前記二重抗体P/Sにおけるストレプトマイシンの最終濃度は100~200μg/mLであり、前記HEPESの最終濃度は8~12mMであり、残部はHBSSであり;
前記細胞単離緩衝液は、二重抗体P/S、ヘパリンナトリウム、及びPBSの組成を有し、前記二重抗体P/Sにおけるペニシリンの最終濃度は100~200U/mLであり、前記二重抗体P/Sにおけるストレプトマイシンの最終濃度は100~200μg/mLであり、前記ヘパリンナトリウムの最終濃度は10IU/mLであり、残部はPBSであり;
前記細胞消化液は、Accutase、EDTA、TrypLE Express及びPBSの組成を有し、Accutaseは前記細胞消化液10mL当たりにおいて4~6mLであり、EDTAの最終濃度は5mMであり、TrypLE Expressは1.5~2.5mLであり、残部はPBSであり、
前記サンプル洗浄液は、二重抗体P/S及びPBSの組成を有し、前記二重抗体P/Sにおけるペニシリンの最終濃度は100~200U/mLであり、前記二重抗体P/Sにおけるストレプトマイシンの最終濃度は100~200μg/mLであり、残部はPBSであり;
前記消化停止液は、ウシ胎児血清、二重抗体P/S、及びDMEM培地の組成を有し、前記ウシ胎児血清の最終濃度は8~12%であり、前記二重抗体P/Sにおけるペニシリンの最終濃度は100~200U/mLであり、前記二重抗体P/Sにおけるストレプトマイシンの最終濃度は100~200μg/mLであり、残部はDMEM培地であり;
前記細胞凍結保存液は、Advanced DMEM/F12培地、DMSO、及び1%メチルセルロース溶液の組成を有し、前記Advanced DMEM/F12培地、前記DMSO、及び前記1%メチルセルロース溶液は、それらの体積比が20:2:(0.8~1.2)であり、前記1%メチルセルロース溶液は、濃度が1g/100mlであるメチルセルロース水溶液であり;
前記1% CYTOP溶液は、CYTOP及びフッ素オイルの組成を有し、前記1% CYTOP溶液100mL当たりにおいてCYTOPを1mL含み、残部はフッ素オイルであることを特徴とする、支援試薬。 - 請求項1~9のいずれか一項に記載の培地又は請求項10に記載の支援試薬の、婦人科腫瘍の初代細胞を培養するための使用。
- 請求項1~9のいずれか一項に記載の培地を用いて婦人科腫瘍の初代細胞を懸濁培養する工程を含む、婦人科腫瘍の初代細胞を培養する方法。
- 前記婦人科腫瘍の初代細胞は、婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞又は婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞であることを特徴とする、請求項12に記載の方法。
- 前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の初代細胞は、請求項10に記載のサンプル解離液を用いて婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を解離処理して得られたものであることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 1mg組織当たり0.1~0.3mLの前記サンプル解離液の量で、切断した前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を、事前に37℃に予熱した前記サンプル解離液により処理して、37℃、15分間~3時間の解離時間という条件で、サンプル解離を行う工程を含む方法において、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織を前記サンプル解離液で解離することを特徴とする、請求項14に記載の方法。
- 前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞は、請求項8に記載の細胞単離緩衝液を用いて婦人科腫瘍における胸腔液サンプルから単離して得られたものであることを特徴とする、請求項13に記載の方法。
- 前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプル中の細胞を前記細胞単離緩衝液で懸濁させた後、密度勾配遠心分離により前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルの初代腫瘍細胞を得る工程を含む方法において、前記婦人科腫瘍における胸腔液サンプルを前記単離緩衝液で単離することを特徴とする、請求項16に記載の方法。
- 細胞培養容器Mを用いて前記婦人科腫瘍の初代細胞を、前記婦人科腫瘍の初代細胞の培地で懸濁培養して、37℃、5% CO2の条件下で培養し、2~4日毎に培地を一回交換する工程を含む方法において、前記婦人科腫瘍の初代細胞を、前記婦人科腫瘍の初代細胞の培地で懸濁培養し、
前記細胞培養容器Mは、
(I)ポリスチレン材質の細胞培養容器、ポリカーボネート材質の細胞培養容器、ポリメチルメタクリレート材質の細胞培養容器、COC樹脂材質の細胞培養容器、シクロオレフィンポリマー材質の細胞培養容器又は低付着性表面の細胞培養容器;及び
(II)(I)における細胞培養容器をCYTOP修飾した細胞培養容器
のいずれか一つであることを特徴とする、請求項12~17のいずれか一項に記載の方法。 - 前記細胞培養容器は、細胞培養皿、細胞培養ウェルプレート、又は細胞培養用マイクロウェルプレートチップであることを特徴とする、請求項18に記載の方法。
- 前記(II)において、前記(I)における細胞培養容器を、エッチング出力 20W、エッチング時間 3分間というエッチング条件で、純酸素エッチングした後、前記細胞培養容器の表面を請求項10に記載の1% CYTOP溶液で覆い、前記1% CYTOP溶液を乾燥することにより、CYTOP修飾を完了する工程を含む方法において、前記(I)における細胞培養容器をCYTOP修飾することを特徴とする、請求項18又は19に記載の方法。
- 婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織に対して解離前処理を行う工程であって、婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルの表面を、体積百分率で70~75%であるエタノールで洗浄し、前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルを請求項10に記載のサンプル洗浄液及び無菌PBS溶液で順番に洗浄する工程を、さらに含むことを特徴とする、請求項14~20のいずれか一項に記載の方法。
- 前記解離前処理を行う前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織サンプルは、その解離時間が2時間以下であり、前記解離前処理を行う直前に請求項10に記載のサンプル保存液に保存されることを特徴とする、請求項21に記載の方法。
- 前記婦人科腫瘍における固形腫瘍の組織に対して解離処理を前記サンプル解離液で行った後、さらに、解離反応を請求項10に記載の消化停止液で停止させ、細胞懸濁液を収集し、前記細胞懸濁液を濾過して組織残片及び接着細胞を除去し、遠心分離した後、無菌PBSで細胞を再懸濁し、再度遠心分離した後、前記培地で細胞ペレットを再懸濁させる工程を含むことを特徴とする、請求項14~22のいずれか一項に記載の方法。
- 前記婦人科腫瘍の初代細胞を前記培地で培養する過程において、前記婦人科腫瘍の初代細胞が直径80~120μmの塊を形成するとき、前記婦人科腫瘍の初代細胞を継代させる工程をさらに含むことを特徴とする、請求項12~23のいずれか一項に記載の方法。
- 前記継代を行う際に使用する細胞消化液は、請求項10に記載の細胞消化液であることを特徴とする、請求項24に記載の方法。
- 前記継代を行う際に使用する消化停止液は、請求項10に記載の消化停止液であることを特徴とする、請求項24又は25に記載の方法。
- 2~3回継代して増幅させた前記婦人科腫瘍の初代細胞を凍結保存及び/又は蘇生する工程をさらに含むことを特徴とする、請求項24~26のいずれか一項に記載の方法。
- 前記凍結保存を行う際に用いる細胞凍結保存液は、請求項10に記載の細胞凍結保存液であることを特徴とする、請求項27に記載の方法。
- 前記婦人科腫瘍は、乳がん、卵巣がん、子宮内膜がん、子宮頸がん、又はそれらの転移病巣であることを特徴とする、請求項1~9のいずれか一項に記載の培地、請求項10に記載の支援試薬、請求項11に記載の使用、又は請求項12~28のいずれか一項に記載の方法。
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