CN116138250B - 一种穿刺细胞保存液、试剂盒、保存方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种穿刺细胞保存液、试剂盒、保存方法及应用，所述穿刺细胞保存液包括2,3‑二羟基丁二酸、氨丁三醇、γ聚谷氨酸、吐温20、NaCl和缓冲液。本发明的穿刺细胞保存液配方简单，各试剂协同配合发挥固定细胞样本和去除杂质成分的作用，避免加入多余成分，具有显著提高的稳定性和较长的有效期；所述穿刺细胞保存液用于保存穿刺细胞样本，在妇科和/或非妇科的液基细胞学和免疫细胞化学染色中具有广泛的应用前景。

Description

一种穿刺细胞保存液、试剂盒、保存方法及应用

技术领域

本发明属于生物医学技术领域，涉及一种穿刺细胞保存液、试剂盒、保存方法及应用。

背景技术

细针穿刺细胞学（FNAC）是利用细针穿刺病灶部位、吸取微小组织成分（包括细胞、间质和伴随物）进行细胞形态学检查的技术，该技术通过观察微小组织成分中的活细胞进行相关研究。

妥善保存处理穿刺细胞对FNAC检测结果的准确性具有重要影响。现有技术主要利用常规的细胞保存液保存穿刺细胞，该类细胞保存液中通常添加有一定比例的蛋白类物质、甲醛、苯酚和醇类，以达到保鲜和固定样本的作用；同时，为提高细胞保存液的抗凝血性能，配方中还加入EDTA、肝素、乙二胺四乙酸盐等试剂。但是，现有细胞保存液不能快速去除微小组织中的间质和伴随物等成分，造成穿刺细胞聚集影响染色结果；含有的血细胞去除试剂对穿刺细胞具有损伤作用，不利于增加穿刺细胞的机械强度和稳定性、保持和固定穿刺细胞的天然形态结构。另外，现有细胞保存液含有防腐剂、固定剂、抗凝血剂、渗透压维持剂、pH缓冲剂、保湿剂等多种试剂，配方复杂、稳定性差，穿刺细胞不能长时间保存于细胞保存液中。

因此，有必要针对穿刺细胞开发配方简单、保存效果良好的细胞保存液，用于保存穿刺细胞样本。

发明内容

针对现有技术的不足及实际需求，本发明提供了一种穿刺细胞保存液、试剂盒、保存方法及应用，所述穿刺细胞保存液可以快速去除细胞间质等干扰物，有效分散穿刺细胞，增强穿刺细胞膜的机械强度，保持穿刺细胞原有形态结构的长期稳定性，在细针穿刺细胞学中具有重要的应用前景。

为达此目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供了一种穿刺细胞保存液，所述穿刺细胞保存液包括2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇、γ聚谷氨酸、吐温20、NaCl和缓冲液。

本发明中，2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇和γ聚谷氨酸作为穿刺细胞保存液的主要功效试剂，相互配合，在有效去除穿刺细胞间基质的同时避免细胞发生皱缩、膨胀或破裂，不仅提高了穿刺细胞的分散性而且维持了细胞形态的完整性；吐温20和缓冲液作为功效成分的保护溶剂，维持2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇和γ聚谷氨酸在溶液中的稳定性。所述穿刺细胞保存液中的各试剂共同配合，确保穿刺细胞保存液的稳定性和有效性，实现了长期保存穿刺细胞的技术效果。

优选地，所述2,3-二羟基丁二酸在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为5~20 mM，例如可以是5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM、10 mM、11 mM、12 mM、13 mM、14 mM、15 mM、16 mM、17mM、18 mM、19 mM或20 mM，优选为8~15 mM。

优选地，所述氨丁三醇在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为20~40 mM，例如可以是20 mM、21 mM、22 mM、23 mM、24 mM、25 mM、26 mM、27 mM、28 mM、29 mM、30 mM、31 mM、32mM、33 mM、34 mM、35 mM、36 mM、37 mM、38 mM、39 mM或40 mM，优选为25~35 mM。

优选地，所述γ聚谷氨酸的数均分子量为90~120万，例如可以是90万、95万、100万、105万、110万、115万或120万，优选为100万。

优选地，所述γ聚谷氨酸在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为1~10 mM，例如可以是1 mM、2 mM、3 mM、4 mM、5 mM、6 mM、7 mM、8 mM、9 mM或10 mM，优选为3~8 mM。

优选地，所述吐温20在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为1~5 mM，例如可以是1mM、2 mM、3 mM、4 mM或5 mM，优选为2.5~5 mM。

优选地，所述NaCl在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为50~100 mM，例如可以是50mM、55 mM、60 mM、65 mM、70 mM、75 mM、80 mM、85 mM、90 mM、95 mM或100 mM，优选为70~80mM。

优选地，所述缓冲液包括Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液。

优选地，所述穿刺细胞保存液的pH为7.0~7.8，例如可以是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7或7.8，优选为7.2~7.5。

本发明中，2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇、γ聚谷氨酸、吐温20、NaCl和缓冲液在合理的配比下充分混合形成穿刺细胞保存液，配方简单，各试剂性质稳定有效，实现了长时间保存穿刺细胞的技术效果。

优选地，所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸 5~20 mM

氨丁三醇 20~40 mM

γ聚谷氨酸 1~10 mM

吐温20 1~5 mM

NaCl 50~100 mM

余量为缓冲液。

优选地，所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸 8~15 mM

氨丁三醇 25~35 mM

γ聚谷氨酸 3~8 mM

吐温20 2.5~5 mM

NaCl 70~80 mM

余量为缓冲液。

第二方面，本发明提供了一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒包括第一方面所述的穿刺细胞保存液。

优选地，所述穿刺细胞保存试剂盒还包括洗涤液。

优选地，所述洗涤液包括磷酸盐缓冲液。

优选地，所述洗涤液的pH为7.0~7.5，例如可以是7.0、7.1、7.2、7.3、7.4或7.5。

优选地，所述试剂盒还包括染色液，所述染色液包括第一染色液和/或第二染色液。

优选地，所述第一染色液包括DAB染色液，由DAB底物、DAB底物缓冲液和DAB显色剂组成，其中，所述DAB底物的成分包括过氧化物酶葡聚糖聚合物、Tris/HCl、氯化钠、牛血清白蛋白、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、4-氨基安替比林、聚乙二醇（PEG3000）、酪蛋白和吐温-20，所述DAB底物的pH值为7.6；所述DAB底物缓冲液的成分包括咪唑、N,N'-乙基双(2-[2-羟基苯基]甘氨酸)（EDHPA）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40）、过氧化氢和氯化苯二甲烃铵，所述DAB底物缓冲液的pH为7.5；所述DAB显色剂由3,3二氨基联苯胺四氯化碳溶于80%丙二醇制成。

优选地，所述第二染色液包括苏木素染色液，所述苏木素染色液的配制方法包括：

在100份无水乙醇中溶解1份苏木素，并进行加热，得到溶液A；

在100份蒸馏水中溶解60 g明矾并加入100份甘油，再进行加热，得到溶液B；

将溶液A和溶液B混合，并加入10份冰醋酸，得到溶液C；

将溶液C暴露在空气和阳光中，持续3-4个星期，得到所述苏木素显色液。

第三方面，本发明提供了一种穿刺细胞保存方法，所述穿刺细胞保存方法使用第一方面所述的穿刺细胞保存液和/或第二方面所述的穿刺细胞保存试剂盒，包括：

使用洗涤液清洗含有穿刺细胞的样本后，将细胞置于穿刺细胞保存液中保存。

优选地，所述保存的时间为1 h~30天，例如可以是1 h、3 h、6 h、9 h、12 h、18 h、1天、2天、3天、4天、5天、7天、10天、14天、15天、18天、20天、21天、22天、23天、24天、25天、26天、27天、28天、29天或30天。

优选地，所述保存的温度为0~4℃，例如可以是0℃、1℃、2℃、3℃或4℃。

第四方面，本发明提供了第一方面所述的穿刺细胞保存液和/或第二方面所述的穿刺细胞保存试剂盒在保存穿刺细胞样本中的应用。

优选地，所述穿刺细胞包括胰腺穿刺细胞、甲状腺穿刺细胞或乳腺穿刺细胞中的任意一种。

第五方面，本发明提供了第一方面所述的穿刺细胞保存液和/或第二方面所述的穿刺细胞保存试剂盒在妇科和/或非妇科的液基细胞学和免疫细胞化学染色样本中的应用。

优选地，所述液基细胞学和免疫细胞化学染色样本来源于胰腺细针穿吸标本、甲状腺细针穿吸标本、乳腺细针穿吸标本、体表肿物细针穿吸标本、支气管刷检标本、支气管肺泡灌洗液、痰液、尿液、胸腹水、胸腹腔灌洗液或脑脊液中的任意一种或至少两种的组合。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

（1）本发明的穿刺细胞保存液中，2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇、γ聚谷氨酸、吐温20、NaCl和缓冲液协同配合发挥去除穿刺细胞间基质、提高穿刺细胞的分散性、增强穿刺细胞的机械强度、维持细胞形态的完整性的作用；

（2）本发明的穿刺细胞保存液配方简单，稳定性好、有效期长，实现了长时间保存穿刺细胞、且不破坏穿刺细胞天然结构的技术效果；

（3）本发明使用所述穿刺细胞保存液保存穿刺细胞30天，穿刺细胞形态基本完整，细胞涂片染色结果清晰，确保了细胞涂片检测结果的准确性，在妇科和/或非妇科的液基细胞学和免疫细胞化学染色中具有广泛的应用前景。

附图说明

图1为实施例1的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图2为实施例2的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图3为实施例3的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图4为实施例4的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图5为实施例5的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图6为实施例6的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图7为实施例7的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图8为实施例8的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图9为实施例9的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图10为实施例10的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图11为实施例11的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图12为实施例12的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图13为实施例13的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图14为实施例14的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图15为实施例15的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图16为对比例1的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图17为对比例2的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图18为对比例3的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图19为对比例4的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图；

图20为实施例2的穿刺细胞染色结果；

图21为实施例6的穿刺细胞染色结果；

图22为实施例11的穿刺细胞染色结果；

图23为实施例13的穿刺细胞染色结果；

图24为对比例1的穿刺细胞染色结果；

图25为对比例2的穿刺细胞染色结果。

具体实施方式

为进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合实施例和附图对本发明作进一步地说明。可以理解的是，此处所描述的具体实施方式仅仅用于解释本发明，而非对本发明的限定。

实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。

实施例1，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸10 mM、氨丁三醇30 mM、γ聚谷氨酸5 mM、吐温20 3 mM、NaCl75 mM和PBS缓冲液（pH=7.2）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.0）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中4℃保存。

实施例2，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸11.5 mM、氨丁三醇32 mM、γ聚谷氨酸4 mM、吐温20 4.5 mM、NaCl 72 mM和PBS缓冲液（pH=7.2）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.0）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中4℃保存。

实施例3，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸13 mM、氨丁三醇27.5 mM、γ聚谷氨酸6.5 mM、吐温20 4 mM、NaCl 78 mM和PBS缓冲液（pH=7.2）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.2）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中4℃保存。

实施例4，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸8 mM、氨丁三醇35 mM、γ聚谷氨酸3 mM、吐温20 2.5 mM、NaCl70 mM和PBS缓冲液（pH=7.2）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.2）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中3℃保存。

实施例5，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸15 mM、氨丁三醇25 mM、γ聚谷氨酸8 mM、吐温20 5 mM、NaCl80 mM和PBS缓冲液（pH=7.5）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.2）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中2℃保存。

实施例6，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸18 mM、氨丁三醇38 mM、γ聚谷氨酸2 mM、吐温20 2 mM、NaCl65 mM和PBS缓冲液（pH=7.5）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.2）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中4℃保存。

实施例7，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸20 mM、氨丁三醇20 mM、γ聚谷氨酸10 mM、吐温20 1 mM、NaCl100 mM和Tris缓冲液（pH=7.8）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.5）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中1℃保存。

实施例8，

本实施例提供一种穿刺细胞保存试剂盒，所述穿刺细胞保存试剂盒内含穿刺细胞保存液和洗涤液；

所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸5 mM、氨丁三醇40 mM、γ聚谷氨酸1 mM、吐温20 5 mM、NaCl 50mM和Tris缓冲液（pH=7.8）；

所述洗涤液为PBS缓冲液（pH=7.5）。

使用所述穿刺细胞保存试剂盒保存穿刺细胞样本，步骤如下：

使用2倍体积的PBS缓冲液清洗含有穿刺细胞的样本，离心后，将细胞置于穿刺细胞保存液中0℃保存。

实施例9，

与实施例7相比，本实施例的穿刺细胞保存液中2,3-二羟基丁二酸的终浓度为25mM，γ聚谷氨酸的终浓度为5 mM，其他条件与实施例7相同。

实施例10，

与实施例7相比，本实施例的穿刺细胞保存液中氨丁三醇的终浓度为15 mM，2,3-二羟基丁二酸的终浓度为15 mM，其他条件与实施例7相同。

实施例11，

与实施例7相比，本实施例的穿刺细胞保存液中γ聚谷氨酸的终浓度为0.5 mM，2,3-二羟基丁二酸的终浓度为22 mM，其他条件与实施例7相同。

实施例12，

与实施例1相比，本实施例的穿刺细胞保存液中2,3-二羟基丁二酸的终浓度为14mM，其他条件与实施例1相同。

实施例13，

与实施例1相比，本实施例的穿刺细胞保存液中氨丁三醇的终浓度为22.5 mM，其他条件与实施例1相同。

实施例14，

与实施例1相比，本实施例的穿刺细胞保存液中γ聚谷氨酸的终浓度为2 mM，其他条件与实施例1相同。

实施例15，

与实施例1相比，本实施例的穿刺细胞保存液中吐温20的终浓度为1 mM，其他条件与实施例1相同。

对比例1，

与实施例4相比，本实施例的穿刺细胞保存液不含2,3-二羟基丁二酸，γ聚谷氨酸的终浓度为10 mM，其他条件与实施例4相同。

对比例2，

与实施例4相比，本实施例的穿刺细胞保存液不含氨丁三醇，2,3-二羟基丁二酸的终浓度为20 mM，γ聚谷氨酸的终浓度为10 mM，其他条件与实施例4相同。

对比例3，

与实施例4相比，本实施例的穿刺细胞保存液不含γ聚谷氨酸，2,3-二羟基丁二酸的终浓度为10 mM，其他条件与实施例4相同。

对比例4，

与实施例4相比，本实施例的穿刺细胞保存液不含吐温20，其他条件与实施例4相同。

单细胞计数，

在穿刺细胞样本保存在穿刺细胞保存液的第0 min、第15 min、第30 min、第1 h、第2 h、第1天、第7天、第14天、第21天和第30天，取10 μL混合均匀的穿刺细胞样本悬液滴接入细胞计数板，静置片刻后将计数板稳定转移至显微镜下进行计数，统计未聚集的单个细胞数量。

图1~图19分别为实施例1~15、对比例1~4的穿刺细胞样本随时间变化的单个细胞数量统计图。可以看出，实施例1~8的穿刺细胞保存液可以在15~30 min内快速去除穿刺细胞间基质，黏连的穿刺细胞分散为单个细胞，且在30天内保持单个细胞的稳定性；实施例9~11的穿刺细胞保存液可以在1~2 h内去除穿刺细胞间基质，黏连的穿刺细胞分散为单个细胞；实施例12~15的穿刺细胞保存液也可以在15 min~1 h内快速去除穿刺细胞间基质，黏连的穿刺细胞分散为单个细胞。

对比例1~4的穿刺细胞保存液分别缺少2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇、γ聚谷氨酸或吐温20，穿刺细胞保存液中各试剂的协同作用不强，不能有效去除穿刺细胞间质，穿刺细胞有较多聚集、分散性差。

细胞形态检测，

在穿刺细胞样本保存在穿刺细胞保存液的第0 h、第1 h、第12 h、第1天、第4天、第7天、第14天、第21天、第28天和第30天，取10 μL混合均匀的穿刺细胞样本悬液滴加在玻片上，静置10 min后滴加染色液染色，覆盖盖玻片。

其中，染色液包括DAB染色液和苏木素染色液；

所述DAB染色液由DAB底物、DAB底物缓冲液和DAB显色剂组成，其中，所述DAB底物的成分包括过氧化物酶葡聚糖聚合物、Tris/HCl、氯化钠、牛血清白蛋白、5-溴-5-硝基-1,3-二恶烷、4-氨基安替比林、聚乙二醇（PEG3000）、酪蛋白和吐温-20，所述DAB底物的pH值为7.6；所述DAB底物缓冲液的成分包括咪唑、N,N'-乙基双(2-[2-羟基苯基]甘氨酸)（EDHPA）、乙基苯基聚乙二醇（Nonidet P-40）、过氧化氢和氯化苯二甲烃铵，所述DAB底物缓冲液的pH为7.5；所述DAB显色剂由3,3二氨基联苯胺四氯化碳溶于80%丙二醇制成；

所述苏木素染色液的配制方法包括：

在100份无水乙醇中溶解1份苏木素，并进行加热，得到溶液A；

在100份蒸馏水中溶解60 g明矾并加入100份甘油，再进行加热，得到溶液B；

将溶液A和溶液B混合，并加入10份冰醋酸，得到溶液C；

将溶液C暴露在空气和阳光中，持续3-4个星期，得到所述苏木素显色液。

将制作的细胞涂片置于显微镜下，观察细胞形态完整性和细胞清晰度，其中，细胞形态完整性评价为“是”或“否”，“是”表示细胞形态完整、“否”表示细胞形态不完整，细胞清晰度评分为1~5，分数越高代表细胞清晰度越高。

细胞形态完整性结果见表1。使用实施例1~15的穿刺细胞保存液在0~4℃下保存穿刺细胞，30天内穿刺细胞形态基本完整。具体地，使用实施例1~5的穿刺细胞保存液处理的穿刺细胞在30天内保持形状稳定、细胞膜和细胞核结构清晰可见，染色效果好，其中实施例2的穿刺细胞染色结果见图20；使用实施例6~8的穿刺细胞保存液处理的穿刺细胞在30天内未发生皱缩或破裂、细胞膜和细胞核结构清晰可见，其中实施例6的穿刺细胞染色结果见图21；使用实施例9~11的穿刺细胞保存液处理的穿刺细胞在30天内大部分保持天然形态，仅有个别细胞发生皱缩，但细胞膜结构完整，其中实施例11的穿刺细胞染色结果见图22；使用实施例12~15的穿刺细胞保存液处理的穿刺细胞在30天内保持形态完整、细胞膜和细胞核结构清晰可见，其中实施例13的穿刺细胞染色结果见图23。以上结果表明，采用本发明的穿刺细胞保存液在0~4℃下可以保存穿刺细胞30天，细胞具有较完整的细胞形态，制备的细胞涂片结果清晰。

对比例1~4的穿刺细胞保存液分别缺少2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇、γ聚谷氨酸或吐温20，从染色结果（对比例1的穿刺细胞染色结果见图24，对比例2的穿刺细胞染色结果见图25）看到7天内部分细胞破裂，部分细胞黏连集合在一起，染色效果差，影响细胞学检测结果。

表1

细胞涂片的染色清晰度打分情况见表2。使用实施例1~8的穿刺细胞保存液在0~4℃保存穿刺细胞样本30天，从制备的细胞涂片可以看到清晰的细胞膜和细胞核结构，染色清晰度得分为4~5；使用实施例9~11的穿刺细胞保存液在0~4℃保存穿刺细胞样本30天，从制备的细胞涂片看到细胞未破裂，具有细胞膜和细胞核结构，染色清晰度得分为3~5；使用实施例12~15的穿刺细胞保存液在0~4℃保存穿刺细胞样本30天，从制备的细胞涂片看到细胞结构保持完整，染色清晰度得分为4~5。由此说明，采用本发明的穿刺细胞保存液在0~4℃下保存穿刺细胞样本30天，进行细胞染色制备涂片，细胞结构完整清晰。

对比例1~4的穿刺细胞保存液分别缺少2,3-二羟基丁二酸、氨丁三醇、γ聚谷氨酸或吐温20，细胞聚集严重，不能维持穿刺细胞的原始形态，穿刺细胞在7天内发生破裂，不能观察到清晰可见的细胞结构。

表2

申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (16)

1.一种穿刺细胞保存液，其特征在于，所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸 5~20 mM

氨丁三醇 20~40 mM

γ聚谷氨酸 1~10 mM

吐温20 1~5 mM

NaCl 50~100 mM

余量为缓冲液；

所述缓冲液为Tris缓冲液或磷酸盐缓冲液；

所述γ聚谷氨酸的数均分子量为90~120万；

所述穿刺细胞保存液的pH为7.0~7.8。

2.根据权利要求1所述的穿刺细胞保存液，其特征在于，所述2,3-二羟基丁二酸在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为8~15 mM。

3.根据权利要求1所述的穿刺细胞保存液，其特征在于，所述氨丁三醇在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为25~35 mM。

4.根据权利要求1所述的穿刺细胞保存液，其特征在于，所述γ聚谷氨酸在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为3~8 mM。

5.根据权利要求1所述的穿刺细胞保存液，其特征在于，所述吐温20在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为2.5~5 mM。

6.根据权利要求1所述的穿刺细胞保存液，其特征在于，所述NaCl在所述穿刺细胞保存液中的终浓度为70~80 mM。

7.根据权利要求1所述的穿刺细胞保存液，其特征在于，所述穿刺细胞保存液由以下物质按终浓度配制形成：

2,3-二羟基丁二酸 8~15 mM

氨丁三醇 25~35 mM

γ聚谷氨酸 3~8 mM

吐温20 2.5~5 mM

NaCl 70~80 mM

余量为缓冲液。

8.一种穿刺细胞保存试剂盒，其特征在于，所述穿刺细胞保存试剂盒包括权利要求1-7任一项所述的穿刺细胞保存液。

9.根据权利要求8所述的穿刺细胞保存试剂盒，其特征在于，所述穿刺细胞保存试剂盒还包括洗涤液。

10.根据权利要求9所述的穿刺细胞保存试剂盒，其特征在于，所述洗涤液包括磷酸盐缓冲液。

11.根据权利要求9所述的穿刺细胞保存试剂盒，其特征在于，所述洗涤液的pH为7~7.5。

12.一种穿刺细胞保存方法，其特征在于，所述穿刺细胞保存方法使用权利要求1-7任一项所述的穿刺细胞保存液和/或权利要求8-11任一项所述的穿刺细胞保存试剂盒，包括：

使用洗涤液清洗含有穿刺细胞的样本后，将细胞置于穿刺细胞保存液中保存。

13.根据权利要求12所述的穿刺细胞保存方法，其特征在于，所述保存的时间为1 h~30天。

14.根据权利要求12所述的穿刺细胞保存方法，其特征在于，所述保存的温度为0~4℃。

15.权利要求1-7任一项所述的穿刺细胞保存液和/或权利要求8-11任一项所述的穿刺细胞保存试剂盒在保存穿刺细胞中的应用。

16.根据权利要求15所述的应用，其特征在于，所述穿刺细胞包括胰腺穿刺细胞、甲状腺穿刺细胞或乳腺穿刺细胞中的任意一种。

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