CN110196181A

CN110196181A - 六胺银染色试剂盒及其染色方法、保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用

Info

Publication number: CN110196181A
Application number: CN201910550047.8A
Authority: CN
Inventors: 梁永波; 刘玲玲; 陈玲; 李莉; 刘文弟; 齐华; 张娟丽; 于婷
Original assignee: HENAN CELLNOVO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: HENAN CELLNOVO BIOTECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2019-06-24
Filing date: 2019-06-24
Publication date: 2019-09-03
Anticipated expiration: 2039-06-24
Also published as: CN110196181B

Abstract

本发明涉及六胺银染色试剂盒及其染色方法、保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用，属于六胺银染色技术领域。本发明中通过实验发现，BSA、PHA、大肠杆菌蛋白、明胶、奶粉能够提高六胺银染色的效率、改善染色效果，其中BSA的染色效果最好；这些保护蛋白剂可以先与混合染色液中的银离子结合，这样避免了多余的银离子在玻璃片上的非特异性结合附着；同时组织上的粘多糖，被高碘酸氧化成醛，那么醛基就会与银离子较强结合，最终形成特异性着色。因此，保护蛋白剂可以用于在六胺银染色领域，用于制备六胺银染色试剂盒。

Description

六胺银染色试剂盒及其染色方法、保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用

技术领域

本发明涉及六胺银染色试剂盒及其染色方法、保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用，属于六胺银染色技术领域。

背景技术

六胺银染色是病理常规技术中常见的特殊染色，在病理诊断中把它作为显示真菌和肾小球基底膜改变的诊断依据。六胺银法对各种真菌染色都敏感，在少量真菌时，也能很容易发现，对鉴别曲霉和毛酶菌有重要的价值，可结合免疫荧光、电镜等技术全面正确诊断和研究肾小球疾病或者在观察肾小球毛细血管或球囊壁基膜在炎性损伤如断裂、增生、折叠等形态变化时可弥补HE染色法难以观察肾毛细血管球基膜改变的方法学缺陷。

六胺银染色原理是组织经高碘酸氧化、使基底膜内的粘多糖暴露醛基，醛基将六胺银还原为黑色金属银，硫代硫酸钠对已显色的银盐起固定作用，并除去未反应的银离子，氯化金可使金属银转变为更稳定的金属金，同时使背景更为清晰。在染色过程中，需要将硼砂溶液、六次甲基四胺溶液和硝酸银溶液按一定比例混合后，然后在大约60-70℃水浴条件下加热，待染色液温度达到60℃时，染色液才能对组织进行染色。

传统六胺银染色相关的试剂有7种，其中包括高碘酸溶液、硼砂溶液、六次甲基四胺溶液、硝酸银溶液、硫代硫酸钠溶液、氯化金溶液、复染溶液(亮绿溶液、伊红溶液或苏木素溶液等)。这其中硼砂溶液、六次甲基四胺溶液和硝酸银溶液这三个组份是银染色的核心组份，构成六胺银染色液。

传统六胺银染色液需要加热30min以上时，组织开始被染色，大约需要30-60min完成染色，而且染色过程需要专业的病理技术人员进行跟踪和观察其染色强度，决定是否可以染色终止。如果时间控制不好，片子就会被染成黑色。同时溶液开始变灰，随着时间的增长，溶液会变得越来越黑，而且变黑程度越来越快。传统六胺银染色过程中从染色30min开始，整张组织切片(染色液所浸没的部位)开始被染色棕黄色，随着时间的增长，颜色越来越黑。随着时间的增长，在玻璃器皿的四周开始出现明显的银镜反应，即玻璃器皿被镀上了一层金属银，而且染色的片子上也同样被镀上一层银，组织切片看上去特别脏，通过后续的擦拭处理根本无法去除掉。染色后，切片上被染色的组织部位在镜下观察，会有非特异性着色，影响镜下观察和诊断。

发明内容

本发明的目的是提供一种六胺银染色试剂盒，其中包含的保护蛋白剂能够提高六胺银染色效率，改善六胺银染色效果。

本发明中还提供了一种六胺银染色方法，该染色方法具有更高的染色效率，更清晰的染色效果。

本发明中还提供了保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用，保护蛋白剂能够用于六氨银染色中，也能够用于制备六胺银染色试剂盒。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种六胺银染色试剂盒，包括保护蛋白剂、六次甲基四胺、硼砂和硝酸银；所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶。

本发明中通过实验发现，牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、明胶、奶粉等保护蛋白剂能够提高六胺银染色效率，改善六胺银染色效果。并且由保护蛋白剂、六次甲基四胺、硼砂和硝酸银配制得到的六氨银染色液不容易变黑，能够保存较长的时间。

保护蛋白剂具有上述效果的原因是：保护蛋白剂可以先与混合染色液中的银离子结合，这样避免了多余的银离子在玻璃片上的非特异性附着；同时组织上的粘多糖，被高碘酸氧化成醛，那么醛基就会与银离子较强结合，最终形成特异性着色。因此，保护蛋白剂可以添加到六胺银染色试剂盒中。

分析保护蛋白剂缩短六胺银染色时间的原理为：在染色过程中，六氨银染色液中如果没有保护蛋白，则有效银离子会在玻璃表面很快形成银镜反应，被固定下来，大部分银离子被消耗，所以组织周围有效银离子大大降低；而如果加入保护蛋白后，蛋白先与银离子结合，保护银离子不附着在玻璃上，无法形成银镜反应，组织周围会有大量有效银离子可以与组织上被氧化的醛基结合，因此大大缩短的染色时间。本发明六胺银染色试剂盒中的保护蛋白剂、六次甲基四胺、硼砂和硝酸银也可以为单独的固体或者水溶液。

优选的，六次甲基四胺和硼砂可以分别与保护蛋白剂制成混合水溶液，能够节省实验人员在染色前繁琐的试剂溶解、稀释、混合工作，节省染色操作的时间。对于硼砂与保护蛋白剂混合水溶液的优选方案，所述混合水溶液中保护蛋白剂和硼砂的质量浓度比为：0.005-0.05：0.1-0.5。对于六次甲基四胺与保护蛋白剂混合水溶液的优选方案，所述混合水溶液中保护蛋白剂和六次甲基四胺的质量浓度比为：0.005-0.05：0.5-2。

进一步优选的方案，所述保护蛋白剂、六次甲基四胺和硼砂三者为混合水溶液，并且六次甲基四胺和硼砂都不会与保护蛋白剂反应，因此其混合水溶液能够保存较长的时间，能够进一步节省染色操作的时间。所述保护蛋白剂、六次甲基四胺和硼砂的质量浓度比为：0.005-0.05：0.5-2：0.1-0.5。

优选的，所述试剂盒中还包括高碘酸和硫代硫酸钠，在六胺银染色领域，高碘酸和硫代硫酸钠是常用的切片组织氧化剂和固银试剂，试剂盒中加入所述高碘酸和硫代硫酸钠中的一种或两种，可以在染色时与其他试剂配合使用，节省染色操作时间。所述高碘酸和硫代硫酸钠可以为固体或水溶液。

进一步优选的，所述试剂盒中还可以包括氯化金和复染试剂中的一种或两种，氯化金可以用于固色前对切片组织进行调色，氯化金可以为固体或水溶液；复染试剂可以进一步对于组织切片进行染色，便于观察，复染试剂为苏木素水溶液。

本发明的六胺银染色方法，包括如下步骤：

1)将待染色的组织切片进行氧化处理；

2)将步骤1)中氧化处理后的组织切片放入六胺银染色液中于60-70℃下浸染10-30min；

所述六胺银染色液中包括保护蛋白剂、六次甲基四胺、硼砂和硝酸银；所述六胺银染色液中保护蛋白剂的质量浓度为0.005-0.05％，六次甲基四胺的质量浓度为0.5-2％，硼砂的质量浓度为0.1-0.5％；硝酸银的质量浓度为0.05-0.15％；所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶；

3)将步骤2)中浸染后的组织切片进行固银处理。

本发明中的六胺银染色方法与传统六氨银染色方法相比，在六胺银染色液中加入了质量浓度为0.005-0.05％的保护蛋白剂，提高六胺银染色效率，改善六胺银染色效果；染色后背景干净，切片组织清晰可见。

步骤1)的氧化处理会使得切片组织上的粘多糖被高碘酸氧化成醛，醛基会与银离子结合，形成特异性着色。在六胺银染色领域，高碘酸溶液是常用的氧化试剂，具体的使用高碘酸溶液对待染色的组织切片进行氧化处理10-20min，所述高碘酸溶液的质量浓度为0.5-1.5％。

步骤3)的固银处理对已显色的银盐起固定作用，并除去未反应的银离子。在六胺银染色领域，硫代硫酸钠是常用的固银试剂，步骤3)中使用硫代硫酸钠溶液对步骤2)中浸染后的组织切片进行固银处理1-5min；所述硫代硫酸钠溶液的质量浓度为1-5％。

在六胺银染色领域，氯化金用于对于切片组织进行调色，氯化金可使金属银转变为更稳定的金属金，同时使背景更为清晰；组织切片经过氯化金调色后，切片颜色由黄变黑，更容易观察。优选的，步骤2)中组织切片在六胺银染色液中浸染后，使用氯化金溶液进行调色处理，然后再进行固银处理；所述氯化金溶液的质量浓度为0.1-1％。

保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用，所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶。

由于保护蛋白剂具有前述的诸多作用，因此其可以用于六胺银染色领域，具体的其可以用于制备六氨银染色试剂盒，也可以用于六氨银染色。

附图说明

图1为本发明六胺银染色方法的实施例1中染色15min效果图；

图2为本发明六胺银染色方法的实施例1中染色15min后显微镜观察图；

图3为本发明六胺银染色方法的实施例1-3染色效果对比图；

图4为本发明六胺银染色方法的实施例2、4-8染色效果对比图；

图5为本发明六胺银染色方法的实施例2、9-11染色效果对比图；

图6为本发明六胺银染色方法的实施例2、9-11染色后显微镜观察结果图；

图7为本发明六胺银染色方法的实施例2、12染色后显微镜观察结果图；

图8为本发明六胺银染色方法的对比例1中染色液颜色变化图；

图9为本发明六胺银染色方法的对比例1-2中染色效果图；

图10为本发明六胺银染色方法的对比例3中染色效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。除特殊说明的之外，各实施例及试验例中所用的设备和试剂均可从商业途径得到。

以下实施例中，1％高碘酸水溶液、0.5％的氯化金水溶液购自国药集团化学试剂有限公司；5％的硝酸银水溶液购自郑州派尼化学试剂厂；3％的硫代硫酸钠水溶液(海波溶液)购自天津市北方化玻采购销售中心。硼砂、六次甲基四胺采购于国药集团化学试剂有限公司。

BSA(牛血清白蛋白)采购于山西瑞亚力生物技术有限公司；PHA(植物凝集素)为从菜豆中提取得到的蛋白(采购于上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号L103580)；大肠杆菌蛋白为CD79a、CD56重组原核表达蛋白，是通过调取人的CD79a的基因序列(NCBI，ID973)和人的CD56的基因序列(NCBI，ID4684)，然后通过大肠杆菌原核表达系统进行表达，经His标签Ni亲和层析制备所得，由赛诺特生物生技术有限公司自制所得；奶粉为牛奶粉(美素佳儿(Friso)幼儿配方牛奶奶粉，采购于超市)。以下实施例和对比例中的溶液，如未特殊说明，均为水溶液。

六胺银染色试剂盒的实施例1-实施例12

实施例1-12中六胺银染色试剂盒采用高碘酸溶液，硼砂、六次甲基四胺和保护蛋白剂混合溶液(A液)，硝酸银溶液(B液)，硫代硫酸钠溶液，复染染液配制而成；其中实施例9、10、11使用的复染染液分别为亮绿、伊红、苯胺蓝；实施例12还加入了氯化金溶液。

各实施例中六胺银染色试剂盒包括的组分如表1所示：

表1 实施例1-12中各组分的浓度(以下浓度均为质量体积百分数)

A液配制时，最方便的配制方法是在每50mL水溶液中，加入硼砂、六次甲基四胺和保护蛋白剂，其质量浓度分别为0.4％、1％和不同浓度保护蛋白剂(0.01％、0.02％和0.05％)。染色时，需要将A液和B液预先混合均匀配制成六胺银染色液，其混合比例为49mLA液+1mL B液，硝酸银的终浓度为0.1％。

试剂盒中各组分，可以配置成不同浓度的母液，在使用时稀释成上述浓度。

六胺银染色试剂盒的实施例13-实施例20

实施例13-20中六胺银染色试剂盒采用高碘酸溶液，六次甲基四胺和保护蛋白剂混合溶液(A液)，硼砂溶液(B液)，硝酸银溶液(C液)，硫代硫酸钠溶液配制而成；其中实施例13-17、19还加入了氯化金溶液，实施例13-18还加入了复染染液。

各实施例中六胺银染色试剂盒包括的组分如表2所示：

表2 实施例13-20中各组分的质量浓度

A液配制时，最方便的配制方法是在每50mL水溶液中，加入六次甲基四胺和保护蛋白剂，其质量浓度分别为2％和不同浓度保护蛋白剂(0.02％、0.04％和0.1％)。染色时，需要将A液、B液和C液预先混合均匀配制成六胺银染色液，其混合比例为24.5mL A液+24.5mLB液+1mL C液，硝酸银的终浓度为0.1％。

六胺银染色试剂盒的实施例21-实施例30

实施例21-30中六胺银染色试剂盒采用高碘酸溶液，硼砂和保护蛋白剂混合溶液(A液)，六次甲基四胺溶液(B液)，硝酸银溶液(C液)，硫代硫酸钠溶液配制而成；其中实施例21-27、29还加入了氯化金溶液，实施例21-28还加入了复染染液。

各实施例中六胺银染色试剂盒包括的组分如表3所示：

表3 实施例21-30中各组分的质量浓度

A液配制时，最方便的配制方法是在每50mL水溶液中，加入硼砂和保护蛋白剂，其质量浓度分别为0.8％和不同浓度保护蛋白剂(0.02％、0.04％和0.1％)。染色时，需要将A液、B液和C液预先混合均匀配制成六胺银染色液，其混合比例为24.5mL A液+24.5mL B液+1mL C液，硝酸银的终浓度为0.1％。

六胺银染色试剂盒的实施例31-实施例40

实施例31-40中六胺银染色试剂盒采用高碘酸溶液，硼砂溶液(A液)，六次甲基四胺溶液(B液)，保护蛋白剂溶液(C液)，硝酸银溶液(D液)，硫代硫酸钠溶液配制而成；其中实施例31-37、39还加入了氯化金溶液，实施例31-38还加入了复染染液。

各实施例中六胺银染色试剂盒包括的组分如表4所示：

表4 实施例31-40中各组分的质量浓度

染色时，需要将A液、B液、C液和D液预先混合均匀配制成六胺银染色液，其混合比例为16.33mL A液+16.33mL B液+16.33mL C液+1mL D液，硝酸银的终浓度为0.1％。

六胺银染色试剂盒的实施例41

本实施例中六胺银染色试剂盒包括：硼砂、六次甲基四胺、保护蛋白剂、硝酸银、所述保护蛋白剂为BSA蛋白；其中的一种或几种以固体的形式存在；在使用时，将固体溶液为适合浓度的液体使用。

六胺银染色试剂盒的实施例42

本实施例中六胺银染色试剂盒包括：高碘酸、硼砂、六次甲基四胺、保护蛋白剂、硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠；所述保护蛋白剂为PHA蛋白；其中的一种或几种以固体的形式存在；在使用时，将固体溶液为适合浓度的液体使用。

六胺银染色试剂盒的实施例43

本实施例中六胺银染色试剂盒包括：高碘酸、硼砂、六次甲基四胺、保护蛋白剂、硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠；所述保护蛋白剂为明胶；其中的一种或几种以固体的形式存在；在使用时，将固体溶液为适合浓度的液体使用。

六胺银染色试剂盒的实施例44

本实施例中六胺银染色试剂盒包括：高碘酸、硼砂、六次甲基四胺、保护蛋白剂、硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠；所述保护蛋白剂为大肠杆菌蛋白；其中的一种或几种以固体以固体的形式存在；在使用时，将固体溶液为适合浓度的液体使用。

六胺银染色试剂盒的实施例45

本实施例中六胺银染色试剂盒包括：高碘酸、硼砂、六次甲基四胺、保护蛋白剂、硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠；所述保护蛋白剂为奶粉；各组分以固体的形式存在；在使用时，将固体溶液为适合浓度的液体使用。

此外，还包括复染溶液，所述复染溶液可以是本领域常用的苏木素染色液、伊红染色液、苯胺蓝染色液或是亮绿染色液。

六胺银染色试剂盒的对比例1

本对比例中六胺银染色试剂盒中包含传统的六胺银试剂：高碘酸、硼砂、六次甲基四胺、硝酸银(B液)、硫代硫酸钠、亮绿染液，各组分以水溶液的形式存在，其中高碘酸、硝酸银、硫代硫酸钠与六胺银染色试剂盒的实施例1的浓度相同，硼砂、六次甲基四胺以水混合液(A液)的形式存在，每100mL水溶液中，加入硼砂、六次甲基四胺的质量浓度分别为0.4％、1％；亮绿染液的浓度为1％。

在染色时：将硼砂和六次甲基四胺的水混合液(A液)与硝酸银溶液(B液)混合得到六胺银染色液。

六胺银染色试剂盒的对比例2

本对比例中六胺银染色试剂盒中包含传统的六胺银试剂：高碘酸、硼砂、六次甲基四胺、硝酸银、氯化金、硫代硫酸钠、伊红染液，各组分以水溶液的形式存在。其中高碘酸、硝酸银(B液)、氯化金、硫代硫酸钠与六胺银染色试剂盒的实施例1的浓度相同，氯化金的质量浓度为0.5％；硼砂、六次甲基四胺以水混合液(A液)的形式存在，每100mL水溶液中，加入硼砂、六次甲基四胺的质量浓度分别为0.4％、1％；伊红染液的浓度为1％。

六胺银染色试剂盒的对比例3

本对比例中六胺银染色试剂盒为贝索试剂盒(货号BS-4094 20T)。

六胺银染色方法的实施例1

本实施例中六胺银染色方法所使用的待染色组织为肾脏组织；使用六胺银染色试剂盒实施例1中的染色试剂盒进行染色，其中包括如下步骤：

(1)高碘酸水溶液对组织进行氧化处理15min；

(2)纯化水冲洗，浸泡5min×2次；

(3)将新鲜配制的六胺银染色液放入64℃水浴锅中，加热；所述六胺银染色液为试剂盒中的A液与B液以49：1的体积比例配制得到；

待六胺银染色液温度恒定后，将组织切片放入染色液中浸染15min；

(4)纯化水冲洗，浸泡5min×2次；

(5)硫代硫酸钠溶液处理3min；

(6)苏木素复染3min；

(7)纯化水冲洗，浸泡5min×2次。

在染色后，进行常规脱水，透明，封片，镜下观察。本实施例中染色时，六胺银染色液染色15min后颜色和染色得到的切片组织如图1所示，其中A为六胺银染色液染色15min后颜色，B为组织切片染色后结果。染色后的切片组织显微镜观察结果如图2所示，其中A、C为肾脏组织切片(显微镜20×)；B、D为肾脏组织切片(显微镜40×)；从图中可以看出本实施例中的染色方法得到的切片组织清晰，能够很好的观察。

六胺银染色方法的实施例2

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例2中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同。

六胺银染色方法的实施例3

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例3中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同。

六胺银染色方法的实施例1-3中所配制的六胺银染色液染色15min后颜色和染色得到的切片组织如图3所示，其中，A为六胺银染色方法的实施例1；B为六胺银染色方法的实施例2；C为六胺银染色方法的实施例3。从图中可以看出，加入BSA会明显提高染色效果和染色强度，其染色过程中染色缸和染色片子不会出现传统染色液脏的现象；特别是BSA的加入的量不同片子上的组织染色强度会有差异。

六胺银染色方法的实施例4

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例4中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同。

六胺银染色方法的实施例5

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例5中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同。

六胺银染色方法的实施例6

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例6中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同。其中大肠杆菌蛋白为CD79a。

六胺银染色方法的实施例7

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例7中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同。其中大肠杆菌蛋白为CD56。

六胺银染色方法的实施例8

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例8中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同。

六胺银染色方法的实施例2、4-8中所配制的六胺银染色液染色15min后颜色和染色得到的切片组织如图4所示，其中，A为六胺银染色方法的实施例2(0.02％BSA)；B为六胺银染色方法的实施例4(0.02％PHA)；C为六胺银染色方法的实施例5(0.02％明胶)；D为六胺银染色方法的实施例6(0.02％大肠杆菌蛋白CD79a)；E为六胺银染色方法的实施例7(0.02％大肠杆菌蛋白CD56)；F为六胺银染色方法的实施例8(0.02％奶粉)。

从以上染色过程和染色效果图片看，通过加入不同的蛋白包括BSA、PHA、大肠杆菌表达蛋白或是明胶、奶粉等，其染色效果会有较大的差异。加入BSA的效果最好，染色液可溶性特别好，染色过程中染色缸和染色片子不会出现传统染色液脏的现象，片子上的组织染色强度最佳。

六胺银染色方法的实施例9

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例9中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同，复染染液为亮绿(1％)。

六胺银染色方法的实施例10

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例10中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同，复染染液为伊红(1％)。

六胺银染色方法的实施例11

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例11中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同，复染染液为苯胺蓝(1％)。

六胺银染色方法的实施例2、9-11中的方法染色15min后颜色和染色得到的切片组织如图5所示，其中，A为六胺银染色方法的实施例2(苏木素)；B为六胺银染色方法的实施例9(亮绿)；C为六胺银染色方法的实施例10(伊红)；D为六胺银染色方法的实施例11(苯胺蓝)。

显微镜下切片组织的观察结果如图6所示，其中，A为六胺银染色方法的实施例2(苏木素)；B为六胺银染色方法的实施例9(亮绿)；C为六胺银染色方法的实施例10(伊红)；D为六胺银染色方法的实施例11(苯胺蓝)。

本发明中使用苏木素进行复染所具有的有益效果是：在复染试剂的选择过程中，伊红和亮绿复染，都属于细胞浆复染，复染的色彩强弱会对六氨银的染色有或多或少的影响，但是如果用苏木素复染则不会，因为苏木素为细胞核着色，不会对六胺银的染色产生影响，因此其六胺银染色后的片子镜下观察更清晰。

六胺银染色方法的实施例12

本实施例中六胺银染色方法，使用六胺银染色试剂盒实施例12中的染色试剂盒进行染色，染色步骤与六胺银染色方法的实施例1相同，步骤(3)浸染后使用氯化金溶液进行调色，具体是：氯化金溶液调色5s；纯化水冲洗，浸泡5min×2次；然后进行后续的处理。

六胺银染色方法的实施例2、12中的方法染色15min后颜色和染色得到的切片组织显微镜观察图片如图7所示，其中，A为六胺银染色方法的实施例2(未经氯化金调色)；B为六胺银染色方法的实施例12(经氯化金调色)。从图中可以看出，经氯化金调色后组织由黄变黑。

在六胺银染色方法的其他实施例中，可以包括如下步骤：

1)使用高碘酸溶液对待染色的组织切片进行氧化处理10-20min；所述高碘酸溶液的质量浓度为0.5-1.5％；

2)将氧化后的组织切片放入六胺银染色液中浸染10-30min；(优选的，染色时间为10-20min；更为优选的，染色时间为15min)

3)使用硫代硫酸钠溶液对步骤2)中浸染后的组织切片进行固银处理1-5min；所述硫代硫酸钠溶液的质量浓度为1-5％。

对于六胺银染色试剂盒11-40的实验效果与六胺银染色试剂盒1-10的效果相当。

六胺银染色方法的对比例1

本对比例中六胺银染色方法为传统六胺银染色法，使用六胺银染色试剂盒对比例1中的染色试剂盒进行染色，染色步骤为：

(1)高碘酸溶液对组织进行氧化处理15min；

(2)纯化水冲洗，浸泡5min×2次；

(3)将预先混匀的新鲜配制的六胺银染色液放入64℃水浴锅中，加热；

(4)纯化水冲洗，浸泡5min×2次；

(5)硫代硫酸钠溶液处理3min；

(6)亮绿复染3min；

(7)纯化水冲洗，浸泡5min×2次。

在染色后，常规脱水，透明，封片，镜下观察。

本对比例中染色时，染色液的颜色如图8所示，其中A为染色15min；B为染色30min；C为染色60min。为从图中可以看出在染色15min后，染色液颜色变黑，至60min染色液标称漆黑一片。

六胺银染色方法的对比例2

(1)高碘酸溶液对组织进行氧化处理15min；

(2)纯化水冲洗，浸泡5min×2次；

(4)纯化水冲洗，浸泡5min×2次；

(5)氯化金溶液调色5s；

(6)纯化水冲洗，浸泡5min×2次；

(7)硫代硫酸钠溶液处理3min；

(8)伊红复染3min；

(9)纯化水冲洗，浸泡5min×2次。

在染色后，常规脱水，透明，封片，镜下观察。

六胺银染色方法的对比例1-2中染色得到的组织切片如图9所示，其中A为六胺银染色(未经氯化金处理)；B为六胺银染色后(经氯化金处理)(在六胺银染色液处理后进行了氯化金调色)。从图中可以看出，传统的染色方法得到的切片组织背景较脏，并且切片组织上色不明显。

六胺银染色方法的对比例3

本对比例中六胺银染色方法中，使用六胺银染色试剂盒为贝索试剂盒；染色方法根据该试剂盒的说明书进行，染色时间为30min。

染色液染色30min后颜色和染色得到的切片组织如图10所示，其中，A为染色液染色30min后颜色；B为染色得到的切片组织。从中可以看出在染色30min后，染色液略有变黑，切片组织颜色较浅。

传统六胺银染色方法的实验效果(即六胺银染色方法的对比例1-2的实验效果)

传统的六氨染色配制均为液体，虽然配方较多，差异不大。但缺点就是染色过程的染色液在加热到一定温度后，组织切片开始着色，其着色强度不易控制；而且染色过程和染色后的组织切片或是染色缸均会被镀上非常严重的金属银，特别是组织切片上的镀银，切片看上去特别脏，更影响组织在显微镜下的观察和辅助诊断。

贝索试剂盒及染色方法的实验效果(即六胺银染色方法的对比例3的实验效果)

贝索六胺银染色试剂盒的组份为：高碘酸溶液、硼砂溶液、六次甲基四胺银粉剂、硫代硫酸钠溶液、伊红染液。这其中贝索是将六次甲基四胺和硝酸银试剂作为固体试剂进行了混合，该粉剂中有纯化水不能溶解的物质。其缺点是该试剂为固体，使用时需要用硼砂溶液去充分的溶解六次甲基四胺银粉剂，在贝索的说明书也提及溶解液中含有少许透明状或黑色颗粒，属于正常现象，这说明该试剂在溶解方面可能不是很好，如果溶解不好，均会影响后续的染色反映。此外用硼砂溶液去溶解六次甲基四胺银粉剂时，可能有未溶解的组份未被从试剂瓶中转移出来，影响染色强度。在染色过程中，虽然其染色液不会出现非常严重的脏、染色缸和组织切片也出出现片子上有非特异性染色，组织切片上的组织部位的染色强度明显弱。

在进行贝索六胺银染色过程中发现，其染色时间大约为30-60min，时间漫长，而且染色强度也弱。贝索六胺银染色试剂盒染色后的组织在显微镜下呈现黄色，色彩不易观察，而且组织只是银染后，由于银本身不稳定很容易被空气氧化成黑色的氧化银，颜色是会随时间而变化。

本发明中技术方案的实验效果

第一，在关键银染色试剂组成上，把硼砂溶液、六次甲基四胺溶液和蛋白溶液混合在一起，简化了试剂配制过程和染色实验的操作流程。同时试剂为完全水溶性，方便了染色操作，不会对染色过程和染色强度产生负面影响。传统六胺银染色液染色过程中，需要将硼砂溶液、六次甲基四胺溶液和硝酸银溶液现用现混合，市面中的贝索试剂盒组成是硼砂溶液、六次甲基四胺和硝酸银是固体，使用时需要用硼砂溶液去溶解六次甲基四胺和硝酸银固体，使用不方便，实验操作复杂。

本发明中的试剂盒中在使用时硼砂溶液、六次甲基四胺溶液和蛋白混合溶液，需要与硝酸银溶液进行复配使用，复配后的染色液混合后，能够冰箱中稳定保存1个月以上，染色液颜色不变黑，而且使用效果仍然很好。

第二，在染色过程中，染色液不会在染色缸上镀上金属银，完全是透明溶液，易于清洗，方便了使用。组织切片上，也没有镀上金属银，只有组织部位被着色，且着色强度非常好，较传统染色方法染色更快，染色强度更深。染色时间短，大约染色10-20min，较传统六胺银染色时间为30-60min，缩短1倍以上。

第三，在染色效果上，染色液只对组织部位进行着色，片子上无非特异性着色，而且染色缸上也无金属银层，非常干净。特别说明一下，本发明的六胺银染色液，将硼砂、六次甲基四胺、蛋白和硝酸银溶液混合后，在冰箱冷藏条件下可以稳定保存至少1个月以上。

通过以上实验设计和操作可以获得非常好的六胺银染色效果，分析其原理为加入的蛋白类物质，可以明显改善传统染色方法中的缺陷，大大提升染色效果，提高染色强度，加速染色程序。通过发明的方案，六胺银染色时间可以控制在10-20min，比传统染色时间综合1倍以上，而且染色效果非常明显，染色强度也较传统方法提高几倍。最终在显微镜下观察，染色特异性好，无背景非特异性着色。分析其中原理，解释为加入的明胶或是蛋白类物质可以先与混合染色液中的银离子结合，这样避免了多余的银离子在玻璃片上的非特异性附着；同时组织上的粘多糖，被高碘酸氧化成醛，那么醛基就会与银离子较强结合，最终形成特异性着色。传统方案中没有明胶或是蛋白类物质，其溶液中过多的银离子会被氧化成氧化银，形成沉淀。

总结：本发明试剂盒在组份上与传统试剂配制组份是基本一样的，但做出的重大改变：第一，混合的硼砂和六次甲基四胺溶液中加入一定量的保护蛋白剂(诸如BSA、PHA、大肠杆菌蛋白、奶粉等)；第二，将硼砂溶液和六次甲基四胺溶液进行了混合。在后续实验条件完全一致的条件下，改进后的六胺银染色液其在染色过程中还有染色后，首先染色液仍然是澄清、透明的，不会变成黑色；组织切片或是染色缸均是非常干净的，不会被镀上金属银，只有组织部位被染特异性着色；还有染色时间较贝索或是传统方法都缩短了一倍时间，只需要染色10-20即可，而且染色强度也较对照提升了很多。

保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用的实施例1

本实施例中保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用中，保护蛋白剂可以用于制备六胺银染色试剂，或者保护蛋白剂可以用于制备六胺银染色试剂盒。所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶。

保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用的实施例2

本实施例中保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用中，保护蛋白剂可以用于六胺银的染色。所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶。

Claims

1.一种六胺银染色试剂盒，其特征在于：包括保护蛋白剂、六次甲基四胺、硼砂和硝酸银；所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶。

2.根据权利要求1所述的六胺银染色试剂盒，其特征在于：所述保护蛋白剂、六次甲基四胺和硼砂为混合水溶液；所述混合水溶液中保护蛋白剂、六次甲基四胺和硼砂的质量浓度比为：0.005-0.05：0.5-2：0.1-0.5。

3.根据权利要求1所述的六胺银染色试剂盒，其特征在于：所述保护蛋白剂和硼砂为混合水溶液；所述混合水溶液中保护蛋白剂和硼砂的质量浓度比为：0.005-0.05：0.1-0.5。

4.根据权利要求1所述的六胺银染色试剂盒，其特征在于：所述保护蛋白剂和六次甲基四胺为混合水溶液；所述混合水溶液中保护蛋白剂和六次甲基四胺的质量浓度比为：0.005-0.05：0.5-2。

5.根据权利要求1所述的六胺银染色试剂盒，其特征在于：所述试剂盒中还包括高碘酸、硫代硫酸钠、氯化金和/或复染试剂。

6.一种六胺银染色方法，其特征在于：包括如下步骤：

1）将待染色的组织切片进行氧化处理；

2）将步骤1）中氧化处理后的组织切片放入六胺银染色液中于60-70℃下浸染10-30min；

所述六胺银染色液中包括保护蛋白剂、六次甲基四胺、硼砂和硝酸银；所述六胺银染色液中保护蛋白剂的质量浓度为0.005-0.05%，六次甲基四胺的质量浓度为0.5-2%，硼砂的质量浓度为0.1-0.5%；硝酸银的质量浓度为0.05-0.15%；所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶；

3）将步骤2）中浸染后的组织切片进行固银处理。

7.根据权利要求6所述的六胺银染色方法，其特征在于：步骤1）中使用高碘酸溶液对待染色的组织切片进行氧化处理10-20min；所述高碘酸溶液的质量浓度为0.5-1.5%。

8.根据权利要求6所述的六胺银染色方法，其特征在于：步骤3）中使用硫代硫酸钠溶液对步骤2）中浸染后的组织切片进行固银处理1-5min；所述硫代硫酸钠溶液的质量浓度为1-5%。

9.根据权利要求6所述的六胺银染色方法，其特征在于：步骤2）中组织切片在六胺银染色液中浸染后，使用氯化金溶液进行调色处理，然后再进行固银处理；所述氯化金溶液的质量浓度为0.1-1%。

10.保护蛋白剂在六胺银染色领域中的应用，其特征在于：所述保护蛋白剂为牛血清白蛋白、植物凝集素、大肠杆菌蛋白、奶粉或明胶。