CN104458386B

CN104458386B - 一种血栓成分的染色方法及其应用

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Publication number: CN104458386B
Application number: CN201410693206.7A
Authority: CN
Inventors: 李君�; 沈粤春; 陆东风; 李新春
Original assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University
Priority date: 2014-11-25
Filing date: 2014-11-25
Publication date: 2017-04-26
Anticipated expiration: 2034-11-25
Also published as: CN104458386A

Abstract

本发明一种血栓成分的染色方法及其应用涉及医学技术领域，特别是一种涉及血栓成分的化学染色方法和血栓成分的识别及血栓性质的鉴定方法。其公开的一种血栓成分的染色方法是：对石蜡组织切片依次经过脱蜡、水化后，利用铁明矾水溶液媒染、苏木精染色、苦味酸‑橙黄G溶液染色、胭脂红‑品红溶液染色、磷钨酸分化颜色，使血栓中不同成分呈现不同颜色。本发明同时公开了其方法的血栓成分的识别及血栓性质的鉴定方法，有效的根据血栓中不同成分呈现不同颜色，依据这些颜色和形态学，从而识别血栓成分、鉴定血栓性质。

Description

一种血栓成分的染色方法及其应用

技术领域

本发明涉及医学技术领域，特别是一种涉及血栓成分的化学染色方法和血栓成分的识别及血栓性质的鉴定方法。

背景技术

在医学标本诊断及动物实验过程中，经常需要对血栓进行鉴定，此血栓鉴定可通过病理检测完成，即通过血栓的染色和识别而鉴定血栓的成分，包括血栓中的红细胞、白细胞、血小板及纤维素或称纤维蛋白组织；鉴定血栓的性质，包括红血栓、白血栓、混合血栓。

现有技术中涉及血栓的染色及识别技术主要有：(1)苏木精-伊红染色法(Hematoxylin-Eosin staining)，简称HE染色法：它是病理技术中最基本最常用的染色方法，广泛应用于各种组织细胞的染色，也用于血栓的染色。HE染色的染液中的苏木精为碱性染料，使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体染成紫蓝色；而染液中的伊红为酸性，使细胞质和细胞外基质中的成分染成红色，故HE染色的优点是仅用苏木精和伊红两种染料、染色步骤较少、染色过程较快，只需1-2小时，能使无色切片的组织和细胞清晰显示；缺点是，对于血栓来说，除白细胞胞核被染成蓝色，其它成分均被染成红色，包括血栓中的红血球、白细胞胞浆、血小板、纤维素成分，这些成分无法确切区分；(2)磷钨酸苏木素染色法(PTAH法)：它是用高锰酸钾和草酸分别对切片进行氧化漂白处理后，用磷钨酸苏木素染料浸染标本24小时，使血栓成分中纤维素网状结构团块物质染成蓝紫色，有利于辨别血栓甚至微小血栓，故PTAH法的优点是可通过识别纤维素以鉴定血栓特别是微小血栓，缺点是染色时间长，不能鉴定血栓中的其它细胞成分包括红细胞、白细胞、血小板；(3)Martius ScarletBlue(MSB)染色法：纤维素MSB染色法分别经过天青石蓝液染、苏木素染液染、马休黄液染、亮结晶紫猩红染液染、磷钨酸、苯胺兰液染处理，将血栓中红细胞染成黄色、白细胞核染成蓝黑色、纤维素染成金黄至鲜红色，此种染色法存在染色步骤繁多、不易操作、染色结果色彩斑斓、对比性差的缺点；(4)血细胞染色：例如过氧化物酶染色使蓝色定位于细胞浆、过碘酸-雪夫染色紫使红色定位于细胞浆中的糖原类物质，但不能识别血栓中的纤维素。因此，现有血栓染色技术有待进一步改进和发展。

发明内容

本发明目的是：提供了一种简易操作、效果明显和效率高的血栓染色方法，通过染色使血栓不同成分呈现不同颜色，通过区别颜色、结合形态学改变，识别血栓成分、鉴定血栓性质、协助血栓的临床诊断及动物实验结果判断。

本发明的目的可通过以下技术方案实现：

一种血栓成分的染色方法，对石蜡组织切片依次经过脱蜡、水化后，利用铁明矾水溶液媒染、苏木精染色、苦味酸-橙黄G溶液染色、胭脂红-品红溶液染色、磷钨酸分化颜色，使血栓中不同成分呈现不同颜色。

本发明的目的还可通过以下技术方案实现：

进一步的，所述的组织切片在脱蜡和水化前先置于50-70℃温箱中加温25-60分钟。

进一步的，所述的脱蜡、水化过程包括依次将切片浸泡于100％酒精2-4分钟两次、95％酒精2-4分钟两次、70％酒精2-4分钟两次、TBS(Tris碱缓冲盐溶液，或称三羟甲基氨基甲烷缓冲盐溶液)溶液2-4分钟一次。

进一步的，所述组织切片染色及分化颜色中，铁明矾水溶液浓度为4-6％、作用时间为4-6分钟；苏木精溶液染色时间为4-6分钟；苦味酸-橙黄G溶液染色时间为30-60分钟；胭脂红-品红溶液染色及磷钨酸分化染色，时间均分别为4-6分钟，各染色步骤间均用水清洗组织切片。

进一步的，所述苦味酸-橙黄G溶液的配制方法是：量取8-12ml饱和苦味酸水溶液，加35-45ml饱和苦味酸异丙醇溶液，再称取0.5-1.5g橘黄G，将三者混和、搅拌均匀。

进一步的，所述胭脂红-品红溶液的配置方法是：称取0.15-0.35g胭脂红、0.25g酸性品红，量取0.3-0.6ml冰醋酸、40-60ml蒸馏水，四者混和、搅拌均匀。

进一步的，所述TBS溶液的配制方法是：在800ml蒸馏水中溶解8g NaCl、0.2g KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚并用HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后于高压下蒸汽灭菌20分钟，室温保存。或购买商业成品的TBS溶液。

一种上述血栓成分的染色方法的应用，通过对血栓成分染色方法后的组织切片进行血栓成分的识别，识别方法为：血栓中圆形深红染色者为红细胞、圆形红色细胞浆含蓝色细胞核者为白细胞、不规则点状深蓝色者为血小板、网状或丝状紫红色者为纤维蛋白组织。

一种上述血栓成分的染色方法的应用，通过对血栓成分染色方法后的组织切片进行血栓的性质识别，该识别方法为：红色血栓主要由纤维网眼内充满的大量正常血液分布的血细胞构成；白色血栓主要由许多聚集呈珊瑚状的血小板构成、含少量红细胞和纤维素；透明血栓主要由纤维素即纤维蛋白构成；混合血栓由红色与白色交替、形成层层相间条纹。

本发明的技术的具体方案是：(1)准备标本，将石蜡组织切成5um切片；(2)配制液体，分别配制苦味酸-橙黄G溶液和胭脂红-品红溶液，苦味酸-橙黄G溶液的配置方法是：10ml饱和苦味酸水溶液、40ml饱和苦味酸异丙醇溶液和0.1g橘黄G，混合均匀；胭脂红-品红溶液的配置方法是：0.25g胭脂红、0.25g酸性品红、0.5ml冰醋酸和49.5ml蒸馏水，混合均匀；(3)组织染色，加温切片组织20-60分钟后染色步骤如下：①切片常规脱蜡至水化或复水，依次100％酒精3分钟2次、95％酒精3分钟2次、70％酒精3分钟2次、TBS溶液3分钟1次，②5％铁明矾水溶液媒染5分钟后水洗；③苏木精染色5分钟后水洗；④苦味酸-橙黄G溶液染色45分钟后水洗；⑤胭脂红-品红溶液染色5分钟后水洗；⑥磷钨酸分化颜色5分钟后水洗；(4)封片，上述最后一步水洗后，切片置于空气中2-5分钟，使组织稍干燥，即滴加GVA(水水溶性封片剂)、覆盖盖玻片；(5)显微镜下观察结果。

主要步骤的目的及操作注意事项：①加温切片的目的是(染色前的第一个步骤)使切片上的组织更牢固的粘附于载玻片上，使组织不易脱片，也有利于组织脱蜡；②脱蜡的目的是(紧随加温之后)切片组织经梯度酒精脱蜡处理后，可将二甲苯彻底消除，使组织易于水化、有利于染色；③5％铁明矾处理的目的是(切片在苏木精染色之前用5％铁明矾处理)避免细胞胞核着色不佳而发白和染色质颗粒糊模不清的现象；④水洗的目的是(每一步实质性染色之后)彻底清洗干净染料，使下一步染料能够干净的发挥染色效果，而不至于染料混合影响染色效果。染色的注意事项是：除注意实质性染料的染色时间外，水洗切片组织后进行下一步染色时应保持切片组织即勿太干燥又勿太潮湿，太干，可致组织收缩、变形，影响组织形态、干扰组织观察；太湿，会使下一步使用的染液稀释、降低染液的浓度和PH值，降低染色效果、影响染色质量。避免组织太干太湿的方法是：用自来水清洗组织切片后，轻轻甩干、空气自然干燥或用吸管小心吸去多余水分，且忌吸管接触组织而吸去组织或破坏组织，

本发明的有益效果

1、本发明通过对石蜡组织切片依次经过脱蜡、水化和利用铁明矾水溶液媒染、苏木精染色、苦味酸-橙黄G溶液染色、胭脂红-品红溶液染色、磷钨酸分化颜色，使红细胞及白细胞浆呈深红色、白细胞核呈蓝色、血小板呈深蓝色、纤维蛋白组织呈紫红色，使血栓中不同成分呈现不同颜色，依据这些颜色和形态学，从而识别血栓成分、鉴定血栓性质。

2、本发明通过对石蜡组织切片依次经过脱蜡、水化和利用铁明矾水溶液媒染、苏木精染色、苦味酸-橙黄G溶液染色、胭脂红-品红溶液染色、磷钨酸分化颜色，使血栓中不同成分呈现不同颜色，与现有技术相比较，染色时间短，一般2-3小时即可，同时通过不同颜色和形态有效区分血栓成分、鉴定血栓性质，有利于更好的为临床及动物实验服务。

3、本发明组织切片在脱蜡和水化前进行温箱加温处理，由此使组织切片上的组织更牢固的粘附于载玻片上，使组织不易脱片，也有利于组织脱蜡。

4、本发明的切片组织经梯度酒精脱蜡处理后，可将二甲苯彻底消除，使组织易于水化、有利于染色。

5、本发明的组织切片通过铁明矾处理，有效的避免细胞胞核着色不佳而发白和染色质颗粒糊模不清的现象。

6、本发明组织切片的各个染色步骤之间，均采用水洗，彻底清洗干净组织切片上的染料，使下一步染料能够干净的发挥染色效果，而不至于染料混合影响染色效果。

具体实施方式

一种血栓成分的染色方法，其具体方法如下：

一、准备标本：1、取材：选择需要检测的病理标本；2、固定：将标本浸泡于10％福尔马林液中24小时以上；3、包埋：将病理标本包埋于石蜡块中；4、切片：将标本用石蜡标本切割机切成常规5um切片；5、贴片：将组织切片平整的贴敷于载玻片上备用。

二、配制液体：1、TBS溶液的配制：在800ml蒸馏水中溶解8g氯化钠NaCl、0.2g氯化钾KCl和3g Tris碱，加入0.015g酚并用氯化氢HCl调至pH值至7.4，用蒸馏水定容至1L，分装后于高压下蒸汽灭菌20分钟，室温保存备用，或购买商业成品TBS溶液；2、苦味酸-橙黄G溶液的配制：分别量取10ml饱和苦味酸水溶液及40ml饱和苦味酸异丙醇溶液，称取0.1g橘黄G，三者混和、搅拌均匀；3、胭脂红-品红溶液的配制：称取0.25g胭脂红、0.25g酸性品红，量取0.5ml冰醋酸、49.5ml蒸馏水，四者混和、搅拌均匀。

三、组织染色：1、将切片组织染色前先置于60℃温箱中加温20分钟；2、脱蜡及水化：依次将切片浸泡于100％酒精各3分钟2次、95％酒精各3分钟2次、70％酒精各3分钟2次、TBS溶液3分钟；3、5％铁明矾水溶液作用5分钟后用水漂洗；4、苏木精溶液染色5分钟后用水漂洗；5、苦味酸-橙黄G溶液染色45分钟后用水漂洗；6、胭脂红-品红溶液染色5分钟后用水漂洗；7、磷钨酸分化颜色5分钟后用水漂洗，

四、封片：1、切片稍干燥：轻轻甩干、空气自然干燥或用吸管小心吸去切片上的多余水；2、滴加1-2滴封片剂；3、覆盖盖玻片：切记避免盖玻片与组织或载玻片之间出现空气泡，以免影响观察组织及影响美观。

一种上述血栓成分的染色方法的应用，将切片置于显微镜下观察染色结果：即通过对上述染色方法后的组织切片进行血栓成分的识别，识别方法为：血栓中圆形深红染色者为红细胞、圆形红色细胞浆含蓝色细胞核者为白细胞、不规则点状深蓝色者为血小板、网状或丝状紫红色者为纤维蛋白组织；通过对上述染色方法后的组织切片进行血栓的性质识别，该识别方法为：红色血栓主要由纤维网眼内充满的大量正常血液分布的血细胞构成；白色血栓主要由许多聚集呈珊瑚状的血小板构成、含少量红细胞和纤维素；透明血栓主要由纤维素即纤维蛋白构成；混合血栓由红色与白色交替、形成层层相间条纹。

通过上述对血栓成分和性质的识别，结合临床血栓的大小与形成部位做出正确诊断、指导临床治疗或判断动物实验结果，例如红色血栓多发生于血流极度缓慢或停止之后；白色血栓多发生于血流速度较快的动脉、心室部位；透明血栓多发生于微循环小血管内，仅在显微镜下见到，故又称微血栓；混合血栓常表现为血栓不断形成的过程，多在二尖瓣狭窄和心房纤维颤动时，左心房内形成的血栓。

Claims

1.一种血栓成分的染色方法，其特征是：对石蜡组织切片依次经过脱蜡、水化后，利用铁明矾水溶液媒染、苏木精染色、苦味酸-橙黄G溶液染色、胭脂红-品红溶液染色、磷钨酸分化颜色，使血栓中不同成分呈现不同颜色，所述胭脂红-品红溶液的配置方法是：称取0.15-0.35g胭脂红、0.25g酸性品红，量取0.3-0.6ml冰醋酸、40-60ml蒸馏水，四者混和、搅拌均匀。

2.根据权利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是：所述的组织切片在脱蜡和水化前先置于50-70℃温箱中加温25-60分钟。

3.根据权利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是：所述的脱蜡、水化过程包括依次将切片浸泡于100％酒精2-4分钟两次、95％酒精2-4分钟两次、70％酒精2-4分钟两次、TBS溶液2-4分钟一次。

4.根据权利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是：所述组织切片染色及分化颜色中，铁明矾水溶液浓度为4-6％、作用时间为4-6分钟；苏木精溶液染色时间为4-6分钟；苦味酸-橙黄G溶液染色时间为30-60分钟；胭脂红-品红溶液染色及磷钨酸分化染色，时间均分别为4-6分钟，各染色步骤间均用水清洗组织切片。

5.根据权利要求1所述血栓成分的染色方法，其特征是：所述苦味酸-橙黄G溶液的配制方法是：量取8-12ml饱和苦味酸水溶液，加35-45ml饱和苦味酸异丙醇溶液，再称取0.5-1.5g橘黄G，将三者混和、搅拌均匀。