CN103690997A - 用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒及其使用方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒，包括溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV。溶栓液的各组分及浓度为：尿激酶100000IU/L、NaCL 9g/L；灌注液I的各组分及浓度为：EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L；灌注液II的各组分及浓度为：十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L；灌注液III的组分及浓度为：DNase I0.01g/L；灌注液IV的组分及浓度为：过氧乙酸0.01%。溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV依次对肝脏进行灌注，可制备去细胞肝脏支架，此方法去肝脏细胞效果稳定，能够保留完整的细胞外基质结构及胶原蛋白等成分。

Description

用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒及其使用方法

技术领域

本发明涉及肝脏组织工程领域，特别是涉及一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒及其使用方法。

背景技术

在现有肝脏替代疗法还存在不足的背景下，研制可供移植的组织工程肝脏十分必要。肝脏组织工程是构建可移植肝脏的一条创新型途径，其核心内容是通过将肝脏种子细胞与生物支架材料相复合，构建出可移植的组织工程肝脏，用于对病损肝脏进行形态、结构及功能的永久性替代。目前，由于缺乏合适的支架材料，通常所构建的组织工程肝脏结构简单，缺乏完善的血管网络而不能达到肝脏替代的目的。

理想的肝脏支架材料的性能和结构要求包括：1、支架材料具有可生物降解性和生物相容性，降解产物不应有毒和引起炎症；2、支架材料具有可加工性及孔隙大小、孔隙率的可调控性，为预血管化和血管生成创造条件；3、支架材料应有足够的表面积用于细胞粘附，也应有足够的空间使细胞集落、扩展及增殖。

目前常用支架材料主要包括两类，一类是天然基质材料，如：胶原、纤维连接蛋白、层连蛋白、透明质酸、海藻酸钠和壳聚糖等，它们均有较好的生物相容性，可为细胞组织化生长提供微环境，但由于缺乏组织与器官构建中所需的血管床样结构，且其形成的支架材料很难有较好的稳定性和机械性能，缺乏可加工性，导致天然基质材料在应用中存在一定的障碍。另一类是合成高分子聚合物，如：聚羟基乙酸（PGA）和聚乳酸（PLA）等，具有生物降解性好，力学性能良好，降解速度可控等优点，但在生物相容性方面仍有一定的缺陷。

目前肝脏组织工程中常用的支架材料是上述支架材料通过复合、修饰和改性等方法改造而来的材料，可为种植于其上的细胞提供更合适的环境因素，生长因子，及诱导新生血管形成的预血管化位点和多孔结构等。然而，由各种天然细胞外基质构成的复杂三维网状支架，相对于肝细胞生长所需的复杂的肝脏结构来说，目前肝脏组织工程中常用的支架材料显得过于简单，不能很好地解决肝细胞生长所需要的营养输送和废物排出等问题。

去细胞支架材料作为一种天然的生物支架，相对于目前肝脏组织工程中常用的支架材料，不仅保留细胞粘附、增殖所依赖的细胞外基质成分，如：胶原蛋白及纤维粘连蛋白等，更重要的是保留细胞高密度生长所需要的管道结构，是最适合肝细胞生长的支架材料。但是，目前关于去细胞肝脏支架的制备方法还不完善，制备效果不够理想。

发明内容

本发明主要解决的技术问题是提供一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒及其使用方法，去肝脏细胞效果稳定，能够保留完整的细胞外基质结构及胶原蛋白和糖蛋白等成分。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒，试剂盒包括溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV。

其中，溶栓液的各组分及浓度为：尿激酶100000IU/L、NaCL9g/L。

灌注液I的各组分及浓度为：EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L。

灌注液II的各组分及浓度为：十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L。

灌注液III的组分及浓度为：DNase I 0.01g/L。

灌注液IV的组分及体积浓度为：过氧乙酸0.01%。

其中，溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV的溶剂均为去离子水。

为解决上述技术问题，本发明采用的一个技术方案是：提供一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

第一次灌注：通过经结扎肝动脉、胆管和去除胆囊处理的肝脏的门静脉灌注500ml含100000IU/L尿激酶的生理盐水溶液，灌注完成后，肝脏于-80℃存放48h以上。

本发明灌注的肝脏为一叶或全肝。灌注前还需去除肝脏上的膈肌组织和多余的脂肪组织等。

第二次灌注：通过肝脏门静脉灌注3000ml含0.2g/L EDTA的生理盐水溶液。

第三次灌注：通过肝脏门静脉灌注15L含5g/L十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液。

第四次灌注：通过肝脏门静脉灌注200ml0.01g/L的DNase I溶液，灌注完成后，于4℃存放2h。

第五次灌注：通过肝脏门静脉灌注200ml体积浓度为0.01%的过氧乙酸溶液，灌注完成后，于4℃保存3h。

其中，0.01%的过氧乙酸溶液也可为含0.01%过氧乙酸的生理盐水溶液。

第六次灌注：通过肝脏门静脉灌注10L含1%青-链霉素的生理盐水溶液，用时8h的灌注用于对肝脏进行冲洗，冲洗完成后，获得去细胞肝脏支架。

其中，第一次灌注、第二次灌注、第三次灌注、第四次灌注、第五次灌注及第六次灌注均利用插入所述肝脏门静脉的硅胶管进行灌注。

其中，灌注的肝脏为猪肝或尸肝等大动物的肝脏。

其中，第一次灌注的速度为10ml/min。

其中，第二次灌注的速度为35-50ml/min。

其中，第三次灌注的速度为15-25ml/min。

其中，第一次灌注、第二次灌注、第三次灌注、第四次灌注、第五次灌注及第六次灌注的灌注液其溶剂均为去离子水。

本发明的有益效果是：区别于现有技术的情况，本发明的试剂盒包括溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV。其中，溶栓液的各组分及浓度为：尿激酶100000IU/L、NaCL 9g/L；灌注液I的各组分及浓度为：EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L；灌注液II的各组分及浓度为：十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L；灌注液III的组分及浓度为：DNaseI 0.01g/L；灌注液IV的组分及体积浓度为：过氧乙酸0.01%。利用本发明的试剂盒可进行去细胞肝脏支架的制备，具体为溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV依次对肝脏进行灌注，灌注完成后获得的去细胞肝脏支架，去肝脏细胞效果稳定，能够保留完整的细胞外基质结构及胶原蛋白和糖蛋白等成分。

附图说明

图1是本发明制备的去细胞肝脏支架的结构图；

图2是本发明制备的去细胞肝脏支架在DR机下门静脉造影的结构图一；

图3是本发明制备的去细胞肝脏支架在DR机下门静脉造影的结构图二；

图4是本发明制备的去细胞肝脏支架石蜡切片的苏木精-伊红染色结构图；

图5是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的Masson染色结构图；

图6是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的PAS染色结构图；

图7是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的银染结构图；

图8是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的电子显微镜扫描图。

具体实施方式

下面结合附图和实施例对本发明进行详细说明。

实施例1

猪肝与人肝体型相当，且易获得，是最适合构建组织工程肝脏的支架材料。下面以猪肝为例，详细介绍用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒及其使用方法。

本实施例的试剂盒包括：溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV。

其中，溶栓液的各组分及浓度为：尿激酶100000IU/L、NaCL 9g/L。

灌注液I的各组分及浓度为：EDTA 0.2g/L、NaCL 9g/L。

灌注液II的各组分及浓度为：十二烷基硫酸钠5g/L、NaCL 9g/L。

灌注液III的组分及浓度为：DNase I 0.01g/L。

灌注液IV的组分及体积浓度为：过氧乙酸0.01%。

在本实施例中，溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV的溶剂均为去离子水。

利用本实施例的试剂盒制备去细胞肝脏支架的方法如下：

A．去细胞前肝脏的处理

离体约8小时以内的新鲜家猪肝脏，取一叶肝组织，重500g，去除肝脏上附着的膈肌和脂肪等组织，结扎肝动脉和胆管等管道结构，仔细分离、去除胆囊。

肝脏初步处理完成后，经肝脏门静脉插入19号硅胶管，连接蠕动泵，以用于试剂盒中溶液的灌注。

B．首先利用500ml含100000IU/L尿激酶的生理盐水溶液进行灌洗，灌洗速度为10ml/min，直至肝静脉流出的液体由红色变为无色，然后将肝脏放入-80℃冰箱，存放时间需超过48h。

在肝脏去细胞的过程中，彻底溶栓是关键。溶栓液注入肝脏后，放入-80℃冰箱，48h以上，一方面给予尿激酶足够的溶栓时间，因为彻底溶栓是提高灌注效率的关键；另一方面，冰冻有益于细胞之间的分离。

C．经插入门静脉的硅胶管灌注3000ml的灌注液I，灌注速度为40ml/min，灌注时间约1.25h。灌注开始时肝静脉流出大量血液，此次灌注可使肝内微小管道血栓经尿激酶溶解后被彻底冲洗干净。

在本实施例中，灌注液I的灌注速度维持在35-50ml/min，此速度可将肝脏中溶解的血栓冲洗出来。

灌注液I中的EDTA能够结合Ca离子，松解细胞之间的桥粒连接，使得细胞洗脱相对容易。

D．经插入门静脉的硅胶管灌注约15L的灌注液II，灌注速度20ml/min，用时12.5h。灌注过程中，肝静脉流出液体逐渐变黄，质韧的肝脏变的柔软，颜色雪白，肝叶边缘变得透明。

在本实施例中，灌注液II的灌注速度保持在15-25ml/min，灌注过程中肝脏表面均匀变化。灌注速度过快或者过慢都将导致细胞碎片阻塞细小的管道而无法彻底洗脱出来。

E．经插入门静脉的硅胶管灌注200ml的灌注液III，并于4℃保存2h。

灌注液III中的DNase I能够将粘附在去细胞肝脏支架上的脱氧核糖核酸链分解成细小的片段，以彻底去除来源于异体组织的细胞成分。

F．经插入门静脉的硅胶管灌注200ml的灌注液IV，并于4℃保存3h。

过氧乙酸溶液是一种强氧化剂，采用一定浓度的过氧乙酸溶液能够有效地杀灭去细胞肝脏支架上可能的微生物，使最终制成的去细胞肝脏支架能够在洁净的环境中保存数周。

G．经插入门静脉的硅胶管缓慢灌注含有1%青-链霉素的0.9%NaCL溶液，进行冲洗，用量10L，灌注用时约8h。

上述方法依次进行，以完成猪肝去细胞支架的制备，可作为肝脏组织工程的支架材料。本实施例制备的去细胞肝脏支架外观呈雪白色，肝脏边缘部分透亮，局部可见管道结构。

在本实施例中，对于组织厚实的猪肝脏，灌注液的流速对去细胞肝脏支架的获取非常重要，因此，上述方法中溶栓液、灌注液I和灌注液II的灌注速度不同。

本实施例的试剂盒及其制备去细胞支架的方法可应用于人的肝脏，以制备肝脏组织工程的支架材料。

下面通过具体的方法验证本实施例制备的去细胞肝脏支架符合肝脏组织工程的需要。

请参阅图1，图1是本发明制备的去细胞肝脏支架的结构图，如图1所示，去细胞肝脏支架边缘透明，如箭头所示，其内的管道清晰。

请参阅图2和图3，图2和图3分别是本发明制备的去细胞肝脏支架在DR机下门静脉造影的结构图，如图所示，去细胞肝脏支架内管道逐级显现，且没有明显的造影剂渗漏情况。其中，使用的造影剂为泛影葡胺。

请参阅图4，图4是本发明制备的去细胞肝脏支架石蜡切片的苏木精-伊红染色结构图。苏木精-伊红染色为石蜡切片常用的染色方法，其原理为，苏木精染液为碱性，主要使细胞核内的染色质与胞质内的核糖体着紫蓝色；伊红为酸性染料，主要使细胞质和细胞外基质中的成分着粉红色。

如图4所示，去细胞支架上未见明显的细胞残余。

请参阅图5，图5是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的Masson染色结构图。Masson染色主要用于胶原纤维和肌纤维的鉴别染色，染色时，胶原纤维被苯胺蓝染成蓝色或被亮绿染成绿色，肌纤维被酸性品红和丽春红染成红色。其中，染色效果与阴离子染料的分子大小和组织的渗漏性有关。

如图5所示，蓝色为胶原纤维，可见去细胞肝脏支架上胶原结构保留较好，且未见明显的细胞成分残余。

请参阅图6，图6是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的PAS染色结构图，PAS染色在组织学上，主要用来检测组织中的糖原和其他多糖物质，具体为过碘酸把糖类相邻两个碳上的羟基氧化成醛基，再用Schiff试剂和醛基反应使呈现紫红色。

如图6所示，去细胞肝脏支架上残余部分糖蛋白成分。

请参阅图7，图7是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的银染结构图，利用硝酸银进行染色，银染可将网状纤维染成黑色，如图7所示，在去细胞肝脏支架上未见明显的网状纤维成分。

请参阅图8，图8是本发明制备的去细胞肝脏支架切片的电子显微镜扫描图，从图中显示，去细胞肝脏支架上未见明显的细胞成分残余，且其胶原结构保存完整。

综上所述，本发明试剂盒中的试剂及各试剂的灌注速度，可制备出能最大限度模拟体内肝细胞生长微环境的三维支架，此支架可保证培养肝细胞的数量，可维持肝细胞形态及功能，达到人工肝要求的肝细胞培养规模。

以上所述仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书及附图内容所作的等效结构或等效流程变换，或直接或间接运用在其他相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。

Claims (9)

1.一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV； 

所述溶栓液的各组分及浓度为： 

尿激酶         100000IU/L 

NaCL           9g/L 

所述灌注液I的各组分及浓度为： 

EDTA           0.2g/L 

NaCL           9g/L 

所述灌注液II的各组分及浓度为： 

十二烷基硫酸钠  5g/L 

NaCL           9g/L 

所述灌注液III的组分及浓度为： 

DNase I        0.01g/L 

所述灌注液IV的组分及体积浓度为： 

过氧乙酸       0.01%。 

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述溶栓液、灌注液I、灌注液II、灌注液III及灌注液IV的溶剂均为去离子水。 

3.一种用于制备去细胞肝脏支架的试剂盒的使用方法，其特征在于，包括以下步骤： 

第一次灌注：通过经结扎肝动脉、胆管和去除胆囊处理的肝脏的门静脉灌注500ml含100000IU/L尿激酶的生理盐水溶液，灌注完成后，所述肝脏于-80℃存放48h以上； 

第二次灌注：通过所述肝脏门静脉灌注3000ml含0.2g/L EDTA的生理盐水溶液； 

第三次灌注：通过所述肝脏门静脉灌注15L含5g/L十二烷基硫酸钠的生理盐水溶液； 

第四次灌注：通过所述肝脏门静脉灌注200ml0.01g/L的DNase I溶液，灌注完成后，于4℃存放2h； 

第五次灌注：通过所述肝脏门静脉灌注200ml体积浓度为0.01%的过氧乙酸溶液，灌注完成后，于4℃保存3h； 

第六次灌注：通过所述肝脏门静脉灌注10L含1%青-链霉素的生理盐水溶液，用时8h的灌注用于对所述肝脏进行冲洗，冲洗完成后，获得去细胞肝脏支架。 

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述第一次灌注、第二次灌注、第三次灌注、第四次灌注、第五次灌注及第六次灌注均利用插入所述肝脏门静脉的硅胶管进行灌注。 

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述肝脏为猪肝或尸肝。 

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述第一次灌注的速度为10ml/min。 

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述第二次灌注的速度为35-50ml/min。 

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第三次灌注的速度为15-25ml/min。 

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述第一次灌注、第二次灌注、第三次灌注、第四次灌注、第五次灌注及第六次灌注的灌注液其溶剂均为去离子水。 

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