JP5704466B2 - 細胞学的または組織学的固定組成および染色方法 - Google Patents

Description

本発明は、染色および分析のため薄板上に組織、細胞または細胞成分を固定するための組成に関するものである。

本発明は、また、この固定剤の調製方法およびその組織学または細胞学での使用に関するものである。本発明の特定の利用は、この固定剤を使用した、特に血液および骨髄のための組織、細胞または細胞成分の染色方法である。

組織、細胞または細胞の部分を同定するために、顕微鏡観察または画像分析システムと組み合わされた細胞染色技術を使用する。

これらの染色方法は、組織診断または細胞診断について医学または獣医学分析と同様に基礎研究においても、多数の生物学分野で不可欠である。

特に血液学においては、久しく以前からＭＧＧ、メイ−グリュンワルド ギムザ（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ Ｇｉｅｍｓａ）の名称で公知の染色が使用される。その染色方法は、下記のように、
−メタノール中に溶解したメチレンブルー−エオシンによって構成されたメイ−グリュンワルド（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ）溶液で薄板上に染色する細胞を固定し、
−薄板を緩衝液と接触させ、
−次に、メタノール中にグリセリンとともに溶解したコバルトブルーＩＩ−エオシンによって構成されたギムザ（Ｇｉｅｍｓａ）溶液と薄板を接触させ、
−最後に薄板をすすいで、乾燥させる
ことからなる。

したがって、この技術を標準とし、信頼性のある比較を設定することができるすべての実行者に公知の染色が得られる。

しかしながら、ＭＧＧ染色は、多数の欠点を呈している。特に、有毒性かつ揮発性の溶剤を使用する。さらに、グリセリンの存在によって、薄板のすすぎがより困難になり、濾過のときフィルタの詰まりが生じることがあるので、それもまた不都合な点を生じさせることがある。

さらに、良好な染色を実現するためには、染料が安定しており、薄板のすすぎの後に染料の堆積が残らないことが重要である。

ところが、ＭＧＧでは、そのような堆積が出現することがある。これらの堆積は、染色自動装置および細胞の識別システムの作動を妨害し、様々な細胞要素の区別と、細胞診断の場合は健康な細胞から病気の細胞の識別を難しくする。

これらの欠点を回避するために、ＭＧＧを他の染色方法に変更することが試された。

しかしながら、ＭＧＧに換えるために開発された方法の大多数では、分析に必須のその再現性を保持することも比較できる結果を得ることもできなかった。

また、ＭＧＧと同様に、それらの方法でも染料それ自体または細胞の固定溶液を実現するためにメタノールを使用している。実際、メタノールは、細胞を良好に固定することができるという特有の物理的特性を備えている。

ところが、メタノールは有毒性かつ揮発性であり、実行者にとって危険である場合があるので、その使用を制限することが望ましい。

メタノールをエタノールに変更した溶液が提案されたが、エタノールだけでは、特に固定に使用するとき、満足できる結果が得られない。

他の溶液は、細胞構造の固定剤として、ピクリン酸、ホルムアルデヒド、グルタルアルデヒド、または、オスミウム酸を使用することからなる。

しかし、得られた結果が優れていても、毒性製品が存在すると、それらを操作することになる人々にとって危険が引き起こされる。

さらに、画像分析システムの発達とともに、染色段階の常に同じ展開を確実にするために、染色自動装置が必要である。しかし、現在の試薬および固定製品では、これらの機械は、回路およびタンクに急速な汚れの蓄積が生じるので、過重な保守に悩まされる。

さらにまた、知られているように、歴史的に、関係する国によって、生物学の同一分野でも、染色試薬は異なることがある。それは、特定の型の細胞要素の様々な色調および多少とも目立つ視覚化によって表される。血液学では、従来から、染色試薬の組み合わせ（「ヨーロッパ文化」の国々で使用されるＭＧＧ染料のように）を介在させる染色と単一の染色試薬（「アングロサクソンおよびアジア文化」の国々で使用されるライト（Ｗｒｉｇｈｔ）およびリーシュマン（Ｌｅｉｓｈｍａｎ）染料のように）を介在させる染色を区別する。また、現在使用される固定溶液は所定の染色方法に特化されており、二つの異なる方法に同一の固定剤を使用することはできない。

したがって、毒性がなく、安定し、経済的で、使用が簡単で、再現性のある結果を得ることができ、かつ染色自動装置に適した組織、細胞または細胞成分の染色用製品への要望は存続している。特に、薄板上の組織、細胞または細胞要素の顕微鏡での研究用の、これらの要望に応え、他の染色方法に適した製品への要望が存続している。

本発明は、従来技術の欠点を解消し、特に血液学の分野に適した、組織学的または細胞学的固定組成を使用することを提案して、この問題を解決しようとする。

このため、本発明は、組織、細胞または細胞成分を、その染色、および顕微鏡でのまたは画像分析システムによる分析のために薄板上の固定するための
少なくとも、
−アルコール、
−ジメチルスルホキシド、
−エチレングリコール、
−水、および、
−塩化ナトリウム
を含む組成の使用を目的とする。

本発明は、また、使用される組織学的また細胞学的組成、または、固定剤を目的とする。

そのような組成は、毒性製品を含まないのが好ましい。それによって、細胞をその染色のため有効に保持して、顕微鏡でおよび画像分析システムによって容易に分析可能な、再現性があり、かつ、安定した結果を得ることができる。

本発明は、また、この組成の調製方法に関する。

好ましくは、その固定組成は、また、少なくとも一つの青色染料および赤色染料を含み、細胞を固定し、染色するために一度に同時に使用することができる。

本発明は、また、固定組成を使用して、特に血液および骨髄に適した、細胞または細胞要素の染色方法を目的とする。

好ましくは、本発明による方法によって、極めて優れた再現性のある結果を得ることができる。そのうえ、経済的で、迅速で、信頼性があり、使用が容易であり、極めて低い含有量の染料しか必要としない。

下記の添付図面を参照して、以下に本発明を詳細に説明する。

図１ａは、ＭＧＧ染色後の血液塗抹標本を示している。 図１ｂは、固定の悪いＭＧＧ染色後の血液塗抹標本を示している。 図１ｃは、ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）染色後の血液塗抹標本を示している。 図１ｄは、リーシュマン（Ｌｅｉｓｈｍａｎ）染色後の血液塗抹標本を示している。 図２ａは、ＭＧＧ染色型染色方法の使用によって、本発明による組成による固定および染色後の血液塗抹標本を示している。 図２ｂは、ライト／リーシュマン（Ｗｒｉｇｈｔ／Ｌｅｉｓｈｍａｎ）染色型染色方法の使用によって、本発明による組成による固定および染色後の血液塗抹標本を示している。 図３ａは、７０°のエタノール＋２％エチレングリコールでの１分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図３ｂは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコールでの１分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図３ｃは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコールでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図４は、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコール＋ジメチルスルホキシドでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図５ａは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコール＋ジメチルスルホキシド＋水５ｍｌでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図５ｂは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコール＋ジメチルスルホキシド＋水１０ｍｌでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図５ｃは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコール＋ジメチルスルホキシド＋水２０ｍｌでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図６ａは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコール＋ジメチルスルホキシド＋水５ｍｌ＋塩化ナトリウム０．１ｇでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図６ｂは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコール＋ジメチルスルホキシド＋水５ｍｌ＋塩化ナトリウム０．３ｇでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している。 図６ｃは、９９．９°のエタノール＋２％エチレングリコール＋ジメチルスルホキシド＋水５ｍｌ＋塩化ナトリウム０．２ｇでの５分間の予備固定段階を備える方法での急速な染色後の血液塗抹標本を示している

本発明は、組織および／または細胞および／または細胞成分を、その染色、および顕微鏡でのまたは画像分析システムによる分析のために薄板上での固定を実施するための、
少なくとも、アルコール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、水および塩化ナトリウムを含む組成の使用を目的とする。

好ましくは、組成は、血液または骨髄の細胞および／または細胞構造を固定するために使用される。

好ましくは、組成は、また、一つまたは複数の染料を含み、組織および／または細胞および／または細胞構造の固定と染色を同時に実施するために使用することができる。

本発明は、また、固定剤とも呼ばれる組織学または細胞学の特定の組成に関するものである。

本発明の意味での固定組成または固定剤とは、細胞および組織が生きた状態のときにあった様相を可能な限り保持するために細胞および組織の自己分解現象を停止させることのできる試薬を意味する。したがって、そのような試薬は、保持されることのできる顕微鏡標本を実現するために形態を尊重し、細胞および組織を不動化することができる。また、細胞および組織の構造的、機能的または遺伝的様相を明らかにするために、染色、組織化学的または免疫学的な反応のような補足的な処理を実施することができる必要がある。

組成は、少なくともアルコール、ジメチルスルホキシド、エチレングリコール、水および塩化ナトリウムを含む。

アルコールは、全ての非毒性アルコールから選択される。好ましいアルコールは、エタノールまたはイソプロパノールである。

また、アルコール混合物を使用することもできる。

特に適した一実施態様によると、アルコールはエタノールである。

水は、脱塩水または脱イオン水であることがある。

組成の有効性をより優れたものにするために、水および塩化ナトリウムは特定の割合で存在しなければならない。また、特に適した一実施態様によると、塩化ナトリウムは組成の総量の０．１〜０．５質量％、水は組成の総量の２〜１２質量％、好ましくは２．６〜８質量％存在する。さらにより好ましくは、塩化ナトリウムは０．２〜０．３％、水は３〜６％である。また、アルコールは組成の総量の４０〜６０質量％、エチレングリコールは組成の総量の０．１〜１質量％存在する。さらに好ましくは、アルコールは５０〜６０％、エチレングリコールは０．１〜０．５％である。

また、ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）が組成総量の３０〜４０質量％存在するとき、特に興味深い結果が得られる。

図３ａ〜６ｃの様々な図面を比較すると、アルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、塩化ナトリウムおよび水の各成分が重要であることが分かる。細胞を固定させ、次に容易に染色および分析できるようにすることができるのは、これらの特定の成分の混合物である。

図３ａ〜６ｃで、細胞は本発明による組成の成分の全部または一部を含む組成によって固定され、続いて、Ｋｉｔ ＲＡＬ ５５５（ＲＡＬ（登録商標））で使用されるような急速染色技術によって染色される。すなわち、固定された薄板を５秒間第一の赤色染料に浸し、次に５秒間青色染料に浸し、最後に薄板をすすいで、乾燥させる。固定組成中にアルコール、エチレングリコール、ジメチルスルホキシド、塩化ナトリウムおよび水が存在するとき得られる結果はより良好なものである。

本発明による組成は、少なくとも以下の段階の実施を含む製造方法によって得られる：
−アルコールおよびエチレングリコールを混合させ、溶液１を得る、
−水に塩化ナトリウムを溶解させ、溶液２を得る、
−攪拌下の溶液１に溶液２を、続いて、ジメチルスルホキシドを添加する、
−濾過。

一実施態様によると、本発明による固定組成は、また、少なくとも一つの青色染料および少なくとも一つの赤色染料を含む。

青色染料は、メチレンブルーおよび／またはコバルトブルーＩおよび／またはチアジン系に属する青色染料の中から選択される。

赤色染料は、エオシンおよび／またはエリトロシンから選択される。

好ましくは、一つまたは複数の青色および赤色染料は、ジメチルスルホキシド中に溶解される。

特に適した一実施態様によると、本発明による組成は、
−ジメチルスルホキシド、
−アルコール、例えば、エタノールまたはイソプロパノール、またはアルコール混合物、
−エチレングリコール、
−水、
−塩化ナトリウム、
−メチレンブルー−エオシン、
−コバルトブルーＩ−エオシン、
−メチレンブルー、
−メチレンコバルトブルーＩ、および、
−チアジン系化合物
を含む。

特に、本発明による組成は、
−ジメチルスルホキシド 約３２（容積）％
−アルコール 約６３（容積）％
−エチレングリコール 約 ０．１（容積）％
−水 約 ４．９（容積）％
−メチレンブルー−エオシン 約２０（重量）％（乾燥材料の重量％）
−コバルトブルーＩ−エオシン 約２０（重量）％（乾燥材料の重量％）
−メチレンブルー 約 ８（重量）％（乾燥材料の重量％）
−メチレンコバルトブルーＩ 約 ８（重量）％（乾燥材料の重量％）
−チアジン系化合物 約 ４（重量）％（乾燥材料の重量％）
−塩化ナトリウム 約４０（重量）％（乾燥材料の重量％）
を含むことがある。

好ましくは、そのような組成によって、組織、細胞または細胞成分の染色および固定を同時に実施することができる。

その組成は、少なくとも以下の段階の実施を含む製造方法によって得られる：
−少なくともジメチルスルホキシド、青色染料および赤色染料を含む溶液４を調製する、
−アルコールおよびエチレングリコールを混合させ、溶液１を得る、
−水に塩化ナトリウムを溶解させ、溶液２を得る、
−攪拌下の溶液１に溶液２を添加して、溶液３を得る、
−攪拌下の溶液３を溶液４に添加する、
−濾過。

溶液４の染料は、ジメチルスルホキシド中に溶解される。

好ましくは、アルコールはエタノールである。

好ましくは、本発明による固定剤は、組織、細胞および細胞構造の良好な固定を可能にしながら、毒性製品を全く含まない。その固定剤は、特に、血液および骨髄の塗抹標本に適している。

別の利点によると、本発明の固定組成は、様々な方法で使用でき、単一の染色試薬を介在させる方法と同様に染色試薬の組み合わせを介在させる方法にも、様々な染色方法に適用できる。

にもかかわらず、本発明は、この固定剤を使用する特定の染色方法を目的とする。特に血液および骨髄用の細胞または細胞構造の染色方法に関する。

これらの方法は、少なくとも染色する標本を本発明の目的である固定組成と接触させることからなる段階を備える。

第一の実施態様によると、染色方法は、少なくとも下記の段階を備える：
−染色する標本、例えば、分析する血液または骨髄の塗抹標本を載せた薄板を本発明による固定組成と、好ましくは５〜１０分間接触させる。
−固定された標本をｐＨ６．５〜７の緩衝溶液に好ましくは３〜８分間接触させ、本発明による固定剤によって準備された染色過程を開始し、制御する。緩衝溶液を通過するとき、この段階では全ての固定剤を除去しないほうが好ましいであろう。
−場合によっては軽く撹拌して、好ましくは５〜２０秒間標本をすすぎ溶液に接触させるが、その役目は、過剰な固定剤を除去して、染色を停止させ、細胞構造の染色を仕上げることである。

この方法は、「ライト（Ｗｒｉｇｈｔ）／リーシュマン（Ｌｅｉｓｈｍａｎ）」型染色に対応する。

第二の実施態様によると、染色方法は、少なくとも下記の段階を備える：
−染色する標本を本発明による固定組成と、好ましくは５〜８分間接触させる。
−固定された標本をｐＨ６．８〜７．２の緩衝溶液に好ましくは２〜３分間接触させ、本発明による固定剤によって準備された染色過程を開始し、制御する。
−場合によっては軽く撹拌して、標本を好ましくは１〜３分間緩衝媒中で攪拌され、ある使用条件で染色を完成させることができる補足の染色試薬と接触させる。
−標本を好ましくは５〜２０秒間すすぎ溶液に接触させる。

この方法は、メイ−グリュンワルドギムザ（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ）型染色に対応する。

本発明による方法の実施に使用される緩衝液は、水、リン酸２ナトリウム、カリウムリン酸塩、抗菌剤および非イオン性界面活性剤によって構成される。

補足の染色試薬は、ジメチルスルホキシドに溶解したメチレンブルー、メチレンコバルトブルーＩおよびチアジン系化合物、および、水に溶解したリン酸２ナトリウムおよびカリウムリン酸塩で構成される。

すすぎ溶液は、それ自体、水に溶解したリン酸２ナトリウム、カリウムリン酸塩、抗菌剤およびイソプロパノールで構成される。

空気による乾燥後、薄板を顕微鏡で、または、画像分析システムによって直接観察する準備ができる。

好ましくは、使用した製品で、特に本発明による固定剤によって、染色の標準化を保証し、色の再現性を得ることができる。その標準化および再現性は、製品、特に固定剤の組成に関係しているが、また、使用できる製品が重要であるということである。実際、そのような製品の使用は、溶液の調製において、特に、質が可変であり、それによって、染色の品質および再現性を劣化させる補足の製品の希釈および使用段階を廃止して、人的要因を導入することを回避する。

この再現性は、画像分析システムが拠にすることができる安定した基準を構成する。疾患の存在の疑わしい兆候の不確定な異常を標定して、様々な型の細胞を識別し、分類する役目を負うこれらのシステムは、得られた結果が再現性でなければ、使用できない。

また、本発明によって使用される固定剤および試薬は、それらの使用によって堆積が限定され、それによって、これらの機械の開発コストがかなり減少したので、染色自動装置内で使用できる。

また別の利点によると、本発明によって、様々な型の細胞の正確な識別が可能な優れた視覚コントラストと、染料の堆積もなく、様々なアーチファクトソースを得ることができる。特に図２ａおよび図２ｂで、得られたコントラストが従来技術の製品で得られたもの（図１ａ、１ｂ、１ｃ、１ｄ）より優れていることが分かる。

本発明は、下記に、血液学に関係した例によって説明されるが、それらの例は本発明を何ら限定するものではない。

−材料
固定組成（製品１）
固定組成は、以下に示すように調製される。

製品１ｌのために、
−ジメチルスルホキシド２８０〜３８０ｍｌに、以下の染料、すなわち、メチレンブルー−エオシン、コバルトブルーＩ−エオシン、メチレンブルー、メチレンコバルトブルーＩ、チアジン系化合物を溶解して、溶液Ａを調製し、
−エタノール５５０〜６８０ｍｌにエチレングリコール約１ｍｌを混合して、溶液Ｂを調製し、
−塩化ナトリウム１〜４ｇを水４０〜６０ｍｌに溶解して、溶液Ｃを調製し、
−溶液Ｂに攪拌下の溶液Ｃを添加して、溶液Ｄを調製し、
−溶液Ｄに溶液Ａを攪拌しながら添加し、
−混合物を濾過する。

緩衝液（製品２）
緩衝液は、以下に示す手順の実施によって調製される。

製品１ｌのために、水約１ｌ中にリン酸２ナトリウム０．１８９〜０．５３０ｇ、カリウムリン酸塩０．３９９〜０．７２６ｇ、抗菌剤約１ｇおよび非イオン性界面活性剤約１ｇを溶解する。続いて、全体を濾過する。

補足の染色試薬（製品３）
補足の染色試薬は、以下に示すように調製される。

製品１ｌのために、
−ジメチルスルホキシド１０〜１５ｍｌに、以下の染料、すなわち、メチレンブルー、メチレンコバルトブルーＩおよびチアジン系化合物を溶解して、第一の溶液を調製し、
−リン酸２ナトリウム５〜８ｇおよびカリウムリン酸塩１．５〜３ｇを水９８５〜９９０ｍｌに溶解して、第二の溶液を調製し、
−第二の溶液に第一の溶液を攪拌しながら添加し、
−混合物を濾過する。

すすぎ溶液（製品４）
すすぎ溶液は、製品１ｌのために、水約９４０ｍｌにリン酸２ナトリウム０．３〜０．５ｇ、カリウムリン酸塩０．３〜０．５ｇ、抗菌剤約０．１ｇおよびアルコール（好ましくはイソプロパノール）４５〜５０ｇを溶解して、得られる。続いて、全体を濾過する。

−染色方法の実施例「メイ−グリュンワルドギムザ（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ）」型染色の結果
「メイ−グリュンワルドギムザ（Ｍａｙ−Ｇｒｕｎｗａｌｄ−Ｇｉｅｍｓａ）」型染色として当業者には公知の結果を得るために、以下の一連の段階を実施することができる：
−分析する血液または骨髄塗抹標本を載せた薄板を製品１と５〜８分接触させ、
−薄板を製品２と２〜３分接触させ、
−薄板を製品３と１〜３分接触させ、および、
−場合によっては軽く攪拌しなから薄板を製品４と５〜２０秒接触させる。

空気で乾燥後、薄板は顕微鏡で直接または画像分析システムで観察できるようになっている。

得られた結果を図２ａに示した。

−染色方法の実施例「ライト／リーシュマン（Ｗｒｉｇｈｔ／Ｌｅｉｓｈｍａｎ）」型染色の結果
「ライト／リーシュマン（Ｗｒｉｇｈｔ／Ｌｅｉｓｈｍａｎ）」型染色として当業者には公知の結果を得るために、以下の一連の段階を実施することができる：
−分析する血液または骨髄塗抹標本を載せた薄板を製品１と５〜１０分接触させ、
−薄板を製品２と３〜８分接触させ、および、
−場合によっては軽く攪拌しながら薄板を製品４と５〜２０秒接触させる。

空気で乾燥後、薄板は顕微鏡で直接または画像分析システムで観察できるようになっている。

得られた結果を図２ｂに示した。

もちろん、本発明は、前記の実施態様に限定されるものではないことは明らかであるが、反対に全ての変更例を含むものである。

Claims (15)

1. 染色および顕微鏡によるまたは画像システムによる分析のため組織、および／または細胞および／または細胞構造の固定組成であって、該組成は、少なくとも以下の成分を、そのパーセンテージは組成総量に対する質量パーセントで表示すると、
   −４０〜６０％のアルコール、
   −ジメチルスルホキシド、
   −０．１〜１％のエチレングリコール、
   −２〜１２％の水、および
   −０．１〜０．５％の塩化ナトリウム
   を含み、かつメタノールは含まず、前記アルコールは、エタノールまたはイソプロパノールであることを特徴とする固定組成。
2. 前記ジメチルスルホキシドは、組成総量の３０〜４０質量％存在することを特徴とする請求項１に記載の組成。
3. また、少なくとも一つの青色染料および少なくとも一つの赤色染料を含むことを特徴とする請求項１〜２のいずれか一つに記載の方法。
4. 前記青色染料は、メチレンブルーおよび／またはコバルトブルーＩおよび／またはチアジン系に属する青色染料から選択され、前記赤色染料はエオシンおよび／またはエリトロシンから選択されることを特徴とする請求項３に記載の組成。
5. 前記組成は、請求項１〜４のいずれか一つに記載の組成であることを特徴とする請求項５に記載の使用。
6. 組織および／または細胞および／または細胞構造の固定および染色を同時に実施するための請求項３または４に記載の組成の使用。
7. 少なくとも以下の段階の実施、
   −アルコールおよびエチレングリコールを混合させ、溶液１を得る、
   −水に塩化ナトリウムを溶解させ、溶液２を得る、
   −攪拌下の溶液１に溶液２を、続いて、ジメチルスルホキシドを添加する、および、
   −濾過
   を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の組成の製造方法。
8. 少なくとも以下の段階の実施、
   −少なくともジメチルスルホキシド、青色染料および赤色染料を含む溶液４を調製する、
   −アルコールおよびエチレングリコールを混合させ、溶液１を得る、
   −水に塩化ナトリウムを溶解させ、溶液２を得る、
   −攪拌下の溶液１に溶液２を添加して、溶液３を得る、
   −攪拌下の溶液３を溶液４に添加する、
   −濾過
   を備えることを特徴とする請求項１〜４のいずれか一つに記載の組成の製造方法。
9. 前記溶液４は、ジメチルスルホキシドに以下の染料、
   −メチレンブルー−エオシン
   −コバルトブルーＩ−エオシン
   −メチレンブルー、
   −メチレンコバルトブルーＩ、
   −チアジン系化合物
   を溶解して、得られることを特徴とする請求項８に記載の製造方法。
10. 前記アルコールは、エタノールまたはイソプロパノールであることを特徴とする請求項７〜９のいずれか一つに記載の製造方法。
11. 少なくとも染色する標本を請求項３または４に記載の固定組成と接触させることからなる段階を備えることを特徴とする、特に血液および骨髄の細胞または細胞構造の染色方法。
12. 少なくとも以下の段階、
    −染色する標本を請求項３または４に記載の固定組成と接触させ、
    −固定された標本をｐＨ６．５〜７．０の緩衝溶液と接触させ、
    −該標本をすすぎ溶液と接触させる
    を備えることを特徴とする、特に血液および骨髄の細胞または細胞構造の染色方法。
13. 少なくとも以下の段階、
    −染色する標本を請求項３または４に記載の固定組成と５〜１０分間接触させ、
    −固定された標本をｐＨ６．５〜７．０の緩衝溶液に３〜８分間接触させ、
    −５〜２０秒間標本をすすぎ溶液に接触させる
    を備えることを特徴とする、特に血液および骨髄の細胞または細胞構造の染色方法。
14. 少なくとも以下の段階、
    −染色する標本を請求項３または４に記載の固定組成と接触させ、
    −固定された標本をｐＨ６．８〜７．２の緩衝溶液に接触させ、
    −標本を補足の反応試薬に接触させ、
    −標本をすすぎ溶液に接触させる
    を備えることを特徴とする、特に血液および骨髄の細胞または細胞構造の染色方法。
15. 少なくとも以下の段階、
    −染色する標本を請求項３または４に記載の固定組成と５〜８分間接触させ、
    −固定された標本をｐＨ６．８〜７．２の緩衝溶液に２〜３分間接触させ、
    −標本を補足の反応試薬に１〜３分間接触させ、
    −５〜２０秒間標本をすすぎ溶液に接触させる
    を備えることを特徴とする、特に血液および骨髄の細胞または細胞構造の染色方法。

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