ES2555219T3 - Composición de fijación citológica o histológica y procedimientos de coloración - Google Patents

Composición de fijación citológica o histológica y procedimientos de coloración Download PDF

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    • G01N1/30Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis

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Abstract

Composición de fijación de tejidos, y/o de células y/o estructuras celulares con vistas a su coloración y a su análisis por microscopio o por un sistema de análisis de imagen, caracterizada por que comprende por lo menos los componentes siguientes, siendo los porcentajes dados en masa con respecto a la composición total: - entre un 40 y un 60% de alcohol, - dimetilsulfóxido, - entre un 0,1 y un 1% de etilenglicol, - entre un 2 y un 12% de agua, y - entre un 0,1 y un 0,5% de cloruro de sodio.

Description

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DESCRIPCION
Composicion de fijacion citologica o histologica y procedimientos de coloracion.
La presente invencion se refiere a una composicion para fijar unos tejidos, unas celulas o unos componentes celulares sobre unas laminas, con vistas a su coloracion y a su analisis.
La invencion se refiere asimismo a un procedimiento de preparacion de este fijador y a su utilizacion en histologfa o citologfa. Una utilizacion particular de la presente invencion es un procedimiento de coloracion de tejidos, celulas o componentes celulares, en particular para la sangre y la medula, que utiliza este fijador.
Para identificar unos tejidos, unas celulas o unas partes de celulas, se utilizan unas tecnicas de coloracion celular asociadas a la observacion microscopica o a sistemas de analisis de imagen.
Estos metodos de coloracion son indispensables en numerosos campos de la biologfa, tanto en la investigacion fundamental como en analisis medico o veterinario para el diagnostico tisular o el citodiagnostico.
En hematologfa particularmente, se utiliza desde hace muchos anos la coloracion conocida bajo el nombre de MGG, May-Grunwald Giemsa. El procedimiento de coloracion consiste:
- en fijar las celulas a colorear sobre un portaobjetos con una solucion de May-Grunwald constituida por azul de metileno-eosina disuelta en metanol,
- en poner en contacto el portaobjetos con una solucion tamponada,
- despues en ponerla en contacto con una solucion de Giemsa constituida por azul Azur II - eosina disuelta en metanol con glicerina,
- y finalmente en aclararla y secarla.
Se obtienen entonces unas coloraciones conocidas por todos los especialistas que hacen de esta tecnica un estandar y permiten establecer unas comparaciones fiables. Sin embargo, la coloracion MGG adolece de numerosos inconvenientes. En particular, utiliza unos disolventes toxicos y volatiles. Ademas, la presencia de glicerina genera tambien unos inconvenientes ya que hace mas diffciles los aclarados de los portaobjetos y puede generar unas obstrucciones de los filtros durante la filtracion.
Ademas, para realizar una buena coloracion, es importante que el colorante sea estable y que no persistan depositos de colorantes despues del aclarado del portaobjetos. Ahora bien, unos depositos de este tipo pueden aparecer con el MGG. Estos depositos perturban el funcionamiento de los dispositivos automaticos de coloracion y de los sistemas de reconocimiento de celulas y obstaculizan la distincion de los diferentes elementos celulares y el reconocimiento de las celulas sanas de las celulas enfermas en el caso de un citodiagnostico.
Con el fin de evitar estos inconvenientes, se ha intentado reemplazar el MGG por otros procedimientos de coloracion.
Sin embargo, una mayorfa de los procedimientos desarrollados para reemplazar el MGG no permiten ni conservar su reproducibilidad esencial para el analisis, ni obtener unos resultados comparables.
Ademas, al igual que el MGG, utilizan metanol, ya sea para realizar los colorantes en si mismos o la solucion de fijacion de las celulas. En efecto, el metanol presenta unas propiedades ffsicas particulares que le permiten fijar bien las celulas.
Ahora bien, el metanol es un producto toxico y volatil, por lo que es deseable limitar su utilizacion, ya que puede ser peligroso para el especialista.
Se han propuesto unas soluciones sustituyendo el metanol por el etanol, pero el etanol solo no da unos resultados satisfactorios, en particular cuando se utiliza para la fijacion.
Otras soluciones consisten en utilizar acido pfcrico, formaldehfdo, glutaraldehfdo o tambien acido osmico como agente de fijacion de las estructuras celulares.
Ahora bien, aunque los resultados obtenidos puedan ser de calidad, la presencia de productos toxicos conlleva unos riesgos para las personas destinadas a manipularlos.
Por otra parte, con el desarrollo de los sistemas de analisis de imagenes, es necesario utilizar unos mecanismos de coloracion con el fin de asegurar un desarrollo siempre identico de las etapas de coloracion. Ahora bien, con los
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reactivos y productos de fijacion actuales, estas maquinas sufren un mantenimiento complejo, ya que provocan un ensuciamiento rapido de los circuitos y depositos.
Finalmente, se sabe que, de manera historica, segun los pafses a los que se dirigen, los reactivos de coloracion pueden ser diferentes para un mismo campo de biologfa. Esto se traduce en unos tonos diferentes y una visualizacion mas o menos marcada de tal o cual tipo de elemento celular. Se distinguen clasicamente en hematologfa unas coloraciones que hacen intervenir una combinacion de reactivos de coloracion (como los colorantes de MGG utilizados en los pafses de "cultura europea"), y unas coloraciones que hacen intervenir un reactivo de coloracion unica (como los colorantes de Wright y de Leishman, utilizados en los pafses "cultura anglosajona o asiatica"). Ahora bien, las soluciones de fijacion utilizadas actualmente son especfficas de un procedimiento de coloracion dado, y no es posible utilizar el mismo fijador para dos procedimientos diferentes.
Por lo tanto, subsiste una necesidad de unos productos destinados a la coloracion de los tejidos, celulas o componentes celulares, no toxicos, estables, economicos, faciles de utilizar, que permitan obtener unos resultados reproducibles y adaptados a los mecanismos de coloracion. En particular, subsiste una necesidad de un producto de fijacion de los tejidos, celulas o elementos celulares sobre unos portaobjetos para su estudio con microscopio, que responda a estas exigencias y que se adapte a diferentes procedimientos de coloracion.
Esto es a lo que responde la presente invencion proponiendo utilizar una composicion de fijacion histologica o citologica que palie los inconvenientes de la tecnica anterior, particularmente adaptada al campo de la hematologfa. La invencion tiene como objeto para ello la utilizacion de una composicion que comprenda por lo menos:
- un alcohol,
- dimetilsulfoxido,
- etilenglicol,
- agua, y
- cloruro de sodio,
para fijar unos tejidos, celulas o componentes celulares en un portaobjetos para su coloracion y su analisis con microscopio o por un sistema de analisis de imagen.
La invencion tiene tambien como objeto la composicion de fijacion histologica o citologica, o fijadora, utilizada.
Ventajosamente, dicha composicion de fijacion no contiene ningun producto toxico. Permite conservar eficazmente las celulas para su coloracion, con el fin de obtener unos resultados reproducibles y estables facilmente analizables con microscopio o por unos sistemas de analisis de imagen.
La invencion se refiere tambien a un procedimiento de preparacion de esta composicion. Preferentemente, la composicion de fijacion comprende tambien por lo menos un colorante azul y un colorante rojo, y puede ser utilizada simultaneamente al mismo tiempo para fijar y colorear las celulas.
Finalmente, la invencion tiene tambien como objeto un procedimiento de coloracion de celulas o de elementos celulares, adaptado en particular para la sangre y la medula, que utiliza la composicion de fijacion.
De manera ventajosa, el procedimiento segun la invencion permite obtener unos resultados reproducibles, de muy buena calidad. Ademas, es economico, rapido, fiable, facil de utilizar y necesita solo un bajo contenido en colorantes.
La invencion se describe ahora en detalle en relacion con las figuras adjuntas, en las que:
- la figura 1a representa un frotis sangufneo despues de una coloracion MGG,
- la figura 1 b representa un frotis sangufneo despues de una coloracion MGG con una mala fijacion,
- la figura 1c representa un frotis sangufneo despues de una coloracion Wright,
- la figura 1d representa un frotis sangufneo despues de una coloracion Leishman,
- la figura 2a representa un frotis sangufneo despues de la fijacion y de la coloracion por la composicion segun
la invencion, mediante la utilizacion de un procedimiento de coloracion de tipo coloracion MGG,
- la figura 2b representa un frotis sangufneo despues de la fijacion y coloracion por la composicion segun la invencion, mediante la utilizacion de un procedimiento de coloracion de tipo coloracion de Wright/Leishman,
- la figura 3a representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 1 minuto con etanol a 70° + un 2% de etilenglicol,
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- la figura 3b representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 1 minuto con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol,
- la figura 3c representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol,
- la figura 4 representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol + dimetilsulfoxido,
- la figura 5a representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + um 2% de etilenglicol + dimetilsulfoxido + 5 ml de agua,
- la figura 5b representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol + dimetilsulfoxido + 10 ml de agua,
- la figura 5c representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol + dimetilsulfoxido + 20 ml de agua,
- la figura 6a representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol + dimetilsulfoxido + 5 ml de agua + 0,1 g de cloruro de sodio,
- la figura 6b representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol + dimetilsulfoxido + 5 ml de agua + 0,3 g de cloruro de sodio, y
- la figura 6c representa un frotis sangufneo despues de una coloracion rapida con un procedimiento que comprende una etapa de fijacion preliminar durante 5 minutos con etanol a 99,9° + un 2% de etilenglicol + dimetilsulfoxido + 5 ml de agua + 0,2 g de cloruro de sodio.
La invencion tiene como objeto la utilizacion para efectuar la fijacion de tejidos y/o de celulas y/o de estructuras celulares sobre un portaobjetos para su coloracion y para su analisis con microscopio o con la ayuda de un sistema de analisis de imagen, de una composicion que comprende por lo menos un alcohol, dimetilsulfoxido, etilengliol, agua y cloruro de sodio.
Preferentemente, la composicion se utiliza para fijar unas celulas y/o estructuras celulares de la sangre o de la medula.
Ventajosamente, la composicion puede contener tambien uno o varios colorantes y ser utilizada para efectuar simultaneamente la fijacion y la coloracion de tejidos y/o de celulas y/o de estructuras celulares.
La invencion se refiere tambien a una composicion particular de fijacion histologica o citologica, tambien denominada fijadora.
Por composicion de fijacion o fijadora en el sentido de la presente invencion, se entiende un reactivo que permite detener los fenomenos de autolisis de las celulas y tejidos con el fin de que conserven un aspecto tan parecido como sea posible al que tienen en estado vivo. Dicho reactivo permite por lo tanto respetar la morfologfa e inmovilizar las celulas y tejidos con el objetivo de realizar unas preparaciones microscopicas que podran ser conservadas. Debe tambien permitir realizar unos tratamientos complementarios, como coloraciones, reacciones histoqufmicas o inmunologicas, con el fin de revelar ciertos aspectos estructurales, funcionales o geneticos de las celulas y tejidos.
La composicion comprende por lo menos un alcohol, dimetilsulfoxido, etilenglicol, agua y cloruro de sodio.
El alcohol se puede seleccionar de entre todos los alcoholes no toxicos. Preferentemente, el alcohol es el etanol o el isopropanol.
Puede tratarse tambien de una mezcla de alcoholes.
Segun un modo de realizacion particularmente adaptado, el alcohol es el etanol. El agua puede ser agua desmineralizada o agua desionizada.
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Con el fin de obtener una mejor eficacia de la composicion, el agua y el cloruro de sodio deben estar presentes en proporciones particulares. Asimismo, segun un modo de realizacion particularmente adaptado, el cloruro de sodio esta presente entre un 0,1 y un 0,5% en masa del total de la composicion, y el agua entre un 2 y un 12%, preferentemente entre un 2,6 y un 8,0%, en masa total de la composicion. Aun mas preferentemente, el cloruro de sodio esta presente entre un 0,2 y un 0,3% y el agua entre un 3 y un 6%. Asimismo, el alcohol esta presente entre un 40 y un 60% en masa del total de la composicion, y el etilenglicol entre un 0,1 y un 1% en masa del total de la composicion. Aun mas preferentemente, el alcohol esta presente entre un 50 y un 60% y el etilenglicol entre un 0,1 y un 0,5%.
Ademas, se obtienen unos resultados particularmente interesantes cuando el DMSO esta presente entre un 30 y un 40% en masa del total de la composicion.
Comparando las diferentes figuras 3a a 6c, se constata que la presencia de cada uno de los componentes alcohol, etilenglicol, dimetilsulfoxido, cloruro de sodio y agua, es importante. Es la mezcla de estos constituyentes particulares, lo cual permite que la composicion se pueda fijar las celulas, que podran despues ser facilmente coloreadas y analizadas.
En las figuras 3a a 6c, las celulas se fijan con unas composiciones que comprenden la totalidad o parte de los constituyentes de la composicion segun la invencion, y despues se colorean mediante una tecnica de coloracion rapida como la utilizada en el kit RAL 555 (RAL®): se sumerge el portaobjetos fijado en un primer colorante rojo durante 5 segundos, despues en un colorante azul durante 5 segundos y finalmente se aclara y se seca el portaobjetos. Los resultados obtenidos son mejores cuando el alcohol, el etilenglicol, el dimetilsulfoxido, el cloruro de sodio y el agua estan presentes en la composicion de fijacion.
La composicion segun la invencion se puede obtener mediante un procedimiento de fabricacion que comprende por lo menos la realizacion de las etapas siguientes:
- mezclar alcohol y etilenglicol con el fin de obtener una solucion 1,
- disolver cloruro de sodio en agua con el fin de obtener una solucion 2,
- anadir la solucion 2 en la solucion 1 bajo agitacion, y despues anadir dimetilsulfoxido, y
- filtrar.
Segun una variante, la composicion de fijacion segun la invencion comprende tambien por lo menos un colorante azul, y por lo menos un colorante rojo.
El colorante azul se puede seleccionar de entre el azul de metileno y/o el azul azur I y/o un colorante azul que pertenece al grupo de las tiazinas.
El colorante rojo se puede seleccionar de entre la eosina y/o la eritrosina. Preferentemente, el o los colorantes azul y rojo estan disueltos en dimetilsulfoxido.
Segun un modo de realizacion particularmente adaptado, la composicion segun la invencion comprende:
- dimetilsulfoxido,
- un alcohol, por ejemplo etanol o isopropanol, o una mezcla de alcoholes,
- etilenglicol,
- agua,
- cloruro de sodio,
- azul de metileno -Eosina,
- azul azur I, Eosina,
- azul de metileno,
- azul azur I de metileno, y
- un compuesto del grupo de las tiazinas.
En particular, la composicion segun la invencion puede comprender:
- aproximadamente un 32% (en volumen) de DMSO,
- aproximadamente un 63% (en volumen) de alcohol,
- aproximadamente un 0,1% (en volumen) de etilenglicol,
- aproximadamente un 4,9% (en volumen) de agua,
- aproximadamente un 20% (en peso de materia seca) de azul de metileno -Eosina,
- aproximadamente un 20% (en peso de materia seca) de azul azur I - Eosina,
- aproximadamente un 8% (en peso de materia seca) de azul de metileno,
- aproximadamente un 8% (en peso de materia seca) de azul azur I de metileno,
- aproximadamente un 4% (en peso de materia seca) de un compuesto del grupo de las tiazinas, y
- aproximadamente un 40% (en peso de materia seca) de cloruro de sodio.
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Ventajosamente, dicha composicion permite efectuar simultaneamente la coloracion y la fijacion de los tejidos, celulas o componentes celulares.
Se puede obtener mediante un procedimiento de fabricacion que comprende por lo menos la realizacion de las etapas siguientes:
- preparar una solucion 4 que comprenda por lo menos dimetilsulfoxido, un colorante azul y un colorante rojo,
- mezclar un alcohol y etilenglicol con el fin de obtener una solucion 1,
- disolver el cloruro de sodio en agua con el fin de obtener una solucion 2,
- anadir la solucion 2 en la solucion 1 bajo agitacion con el fin de obtener una solucion 3,
- anadir la solucion 3 bajo agitacion en la solucion 4, y
- filtrar.
Los colorantes de la solucion 4 se disuelven en DMSO.
Preferentemente, el alcohol es el etanol.
Ventajosamente, el fijador segun la invencion esta desprovisto de productos toxicos permitiendo al mismo tiempo una buena fijacion de los tejidos, celulas y estructuras celulares. Es particularmente adecuado para la fijacion de los frotis sangufneos y medulares.
Segun otra ventaja, la composicion de fijacion se puede utilizar de diferentes maneras y aplicar a diferentes procedimientos de coloracion, tanto los que utilizan una combinacion de reactivos de coloracion como los que hacen intervenir un reactivo de coloracion unico.
La invencion tiene no obstante como objeto unos procedimientos particulares de coloracion que utilizan este fijador. Se trata de procedimientos de coloracion de celulas o de estructuras celulares, en particular para la sangre y la medula.
Estos procedimientos comprenden por lo menos una etapa que consiste en poner en contacto la preparacion a colorear con una composicion de fijacion objeto de la invencion.
Segun una primera variante, el procedimiento de coloracion comprende por lo menos las etapas siguientes:
- poner en contacto una preparacion a colorear, por ejemplo un portaobjetos que lleva unos frotis sangufneos o medulares a analizar, con una composicion de fijacion segun la invencion, preferentemente entre 5 y 10 minutos;
- poner en contacto la preparacion fijada con una solucion tampon a pH comprendido entre 6,5 y 7, preferentemente entre 3 y 8 minutos, con el fin de activar y controlar el proceso de coloracion preparado por el fijador segun la invencion; puede ser ventajoso en esta etapa no eliminar todo el fijador durante el paso en la solucion tampon,
- poner en contacto, eventualmente agitando ligeramente, la preparacion con una solucion de aclarado, preferentemente entre 5 y 20 segundos, cuyas funciones son detener la coloracion eliminando los colorantes en exceso, y afinar la coloracion de las estructuras celulares.
Este procedimiento corresponde a una coloracion de tipo "coloracion de Wright/Leishman".
Segun una segunda variante, el procedimiento de coloracion comprende por lo menos las etapas siguientes:
- poner en contacto una preparacion a colorear con una composicion de fijacion segun la invencion, preferentemente entre 5 y 8 minutos,
- poner en contacto la preparacion fijada con una solucion tampon a pH comprendido entre 6,8 y 7,2, preferentemente entre 2 y 3 minutos, con el fin de activar y controlar el proceso de coloracion preparado por el fijador segun la invencion,
- poner en contacto, eventualmente agitando ligeramente, la preparacion con un reactivo de coloracion complementario, preferentemente entre 1 y 3 minutos, que actua en medio tamponado y permite perfeccionar la coloracion para ciertas condiciones de utilizacion,
- poner en contacto la preparacion con una solucion de aclarado, preferentemente entre 5 y 20 segundos.
Este procedimiento corresponde a una coloracion de tipo "coloracion de May-Grunwald Giemsa".
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El tampon utilizado para la realizacion de los procedimientos segun la invencion puede estar compuesto por agua, por fosfato disodico, por fosfato monopotasico, por un agente anti-microbiano y por un tensioactivo no ionico.
El reactivo de coloracion complementary puede estar compuesto por azul de metileno, por azul azur I de metileno y por un compuesto del grupo de las tiazinas disuelto en DMSO, y por fosfato disodico y por fosfato monopotasico disuelto en agua.
El lfquido de aclarado, por su parte, puede estar compuesto por fosfato disodico, por fosfato monopotasico, por un agente antimicrobiano y por isopropanol disuelto en agua.
Despues del secado al aire, los portaobjetos estan listos para ser observados directamente con microscopio o por un sistema de analisis de imagen.
Ventajosamente, con los productos utilizados, en particular con el fijador segun la invencion, es posible garantizar una estandarizacion de las coloraciones y obtener una reproducibilidad de los colores. Estan relacionadas con la composicion de los productos, en particular del fijador, pero tambien con el hecho de que se trata de productos listos para usar. En efecto, la utilizacion de tales productos evita introducir un factor humano en la preparacion de las soluciones, en particular suprimiendo las etapas de dilucion y de utilizacion de productos complementarios de calidad variable que degradan la calidad y la reproducibilidad de las coloraciones.
Esta reproducibilidad constituye una referencia estable en la que pueden basarse los sistemas de analisis de imagen. Estos sistemas, responsables de identificar y clasificar los diferentes tipos celulares, localizando las anomalfas eventuales, indicios posibles de la presencia de una patologfa, pueden ser utilizados solo si los resultados obtenidos son reproducibles.
Ademas, el fijador y los reactivos utilizados segun la invencion se pueden utilizar en mecanismos de coloracion, ya que su utilizacion limita los depositos, disminuyendo asf considerablemente el coste de explotacion de estas maquinas.
Segun otra ventaja, la invencion permite obtener excelentes contrastes visuales, permitiendo una identificacion precisa de los diferentes tipos celulares, y sin deposito de colorante, fuente de artefactos diversos. Se constata en particular en las figuras 2a y 2b que el contraste obtenido es mejor que el obtenido con los productos de la tecnica anterior (figuras 1a, 1b, 1c y 1d).
La invencion se ilustra ahora mediante un ejemplo no limitativo aplicado a la hematologfa.
Material
Composicion de fijacion (producto 1)
La composicion de fijacion se prepara de la siguiente manera.
Para 1 l de producto:
- se prepara una solucion A disolviendo en 280 a 380 ml de DMSO los siguientes colorantes: azul de metileno -
Eosina, azul azur I - Eosina, azul de metileno, azul azur I de metileno, un compuesto del grupo de las tiazinas,
- se prepara una solucion B mezclando entre 550 y 680 ml de etanol con aproximadamente 1 ml de etilenglicol,
- se prepara una solucion C disolviendo entre 1 y 4 g de cloruro de sodio en 40 a 60 ml de agua,
- se prepara una solucion D anadiendo la solucion C bajo agitacion a la solucion B,
- se anade bajo agitacion la solucion A a la solucion D, y
- se filtra la mezcla.
Tampon (producto 2)
El tampon se prepara mediante la realizacion del protocolo descrito a continuacion.
Para 1 l de producto, se disuelven en aproximadamente 1 l de agua, entre 0,189 y 0,530 g de fosfato disodico, entre 0,399 y 0,726 g d fosfato monopotasico, aproximadamente 1 g de agente antimicrobiano y aproximadamente 1 g de tensioactivo no ionico. Despues, se filtra el conjunto.
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Reactivo de coloracion complementario (producto 3)
El reactivo de coloracion complementario se prepara de la siguiente manera.
Para 1 l de producto:
- se prepara una primera solucion disolviendo entre 10 y 15 ml de DMSO los siguientes colorantes: azul de metileno, azul azur I de metileno y un compuesto del grupo de las tiazinas,
- se prepara una segunda solucion disolviendo entre 985 y 990 ml de agua, entre 5 y 8 g de fosfato disodico y entre 1,5 y 3 g de fosfato monopotasico,
- se anade la primera solucion bajo agitacion a la segunda solucion, y
- se filtra la mezcla.
Liauido de aclarado (producto 4)
El lfquido de aclarado se obtiene, para 1 l de producto, disolviendo en aproximadamente 940 ml de agua, entre 0,3 y 0,5 g de fosfato disodico, entre 0,3 y 0,5 g de fosfato monopotasico, aproximadamente 0,1 g de un agente antimicrobiano, y entre 45 y 50 g de alcohol (preferentemente isopropanol). Despues, se filtra el conjunto.
Ejemplo de procedimiento de coloracion: resultados de tipo "coloracion de May-Grunwald Giemsa"
Para obtener unos resultados reconocidos por los especialistas de la profesion como una coloracion de tipo "coloracion de May-Grunwald Giemsa", es posible realizar la sucesion de las siguientes etapas:
- poner en contacto durante de 5 a 8 minutos un portaobjetos que lleva un frotis sangufneo o medular a analizar con el producto 1,
- poner en contacto durante de 2 a 3 minutos el portaobjetos con el producto 2,
- poner en contacto durante de 1 a 3 minutos el portaobjetos con el producto 3, y
- poner en contacto durante de 5 a 20 segundos, eventualmente agitando ligeramente, el portaobjetos con el producto 4.
Despues del secado al aire, los portaobjetos estan listos para ser observados directamente con microscopio o por un sistema de analisis de imagen.
Los resultados obtenidos se presentan en la figura 2a.
Ejemplo de procedimiento de coloracion: resultados de tipo "coloracion de Wright/Leishman"
Para obtener unos resultados reconocidos por los especialistas de la profesion como una coloracion de tipo "coloracion de Wright/Leishman", es posible llevar a cabo la sucesion de las etapas siguientes:
- poner en contacto durante de 5 a 10 minutos un portaobjetos que tiene un frotis sangufneo o medular a analizar con el producto 1,
- poner en contacto durante de 3 a 8 minutos el portaobjetos con el producto 2, y
- poner en contacto durante de 5 a 20 segundos, eventualmente agitando ligeramente, el portaobjetos con el producto 4.
Despues del secado al aire, los portaobjetos estan listos para ser observados directamente con microscopio o mediante un sistema de analisis de imagen.
Los resultados obtenidos se presentan en la figura 2b.
Por supuesto, la invencion no esta evidentemente limitada al modo de realizacion representado y descrito anteriormente, sino que, por el contrario, cubre todas sus variantes.

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    REIVINDICACIONES
    1. Composicion de fijacion de tejidos, y/o de celulas y/o estructuras celulares con vistas a su coloracion y a su analisis por microscopio o por un sistema de analisis de imagen, caracterizada por que comprende por lo menos los componentes siguientes, siendo los porcentajes dados en masa con respecto a la composicion total:
    - entre un 40 y un 60% de alcohol,
    - dimetilsulfoxido,
    - entre un 0,1 y un 1% de etilenglicol,
    - entre un 2 y un 12% de agua, y
    - entre un 0,1 y un 0,5% de cloruro de sodio.
  2. 2. Composicion segun la reivindicacion 1, caracterizada por que el alcohol es el etanol o el isopropanol.
  3. 3. Composicion segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que el dimetilsulfoxido esta presente entre un 30 y un 40% en masa de la composicion total.
  4. 4. Composicion segun una de las reivindicaciones anteriores, caracterizada por que comprende tambien por lo menos un colorante azul y por lo menos un colorante rojo.
  5. 5. Composicion segun la reivindicacion 4, caracterizada por que el colorante azul se selecciona de entre el azul de metileno y/o el azul azur I y/o un colorante azul que pertenece al grupo de las tiazinas, y por que el colorante rojo se selecciona de entre la eosina y/o eritrosina.
  6. 6. Procedimiento de fabricacion de una composicion segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende por lo menos la realizacion de las etapas siguientes:
    - mezclar alcohol y etilenglicol de manera que se obtenga una solucion 1,
    - disolver cloruro de sodio en agua de manera que se obtenga una solucion 2,
    - anadir la solucion 2 en la solucion 1 bajo agitacion, y despues dimetilsulfoxido, y
    - filtrar.
  7. 7. Procedimiento de fabricacion de una composicion segun una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado por que comprende por lo menos la realizacion de las siguientes etapas:
    - preparar una solucion 4 que comprende por lo menos dimetilsulfoxido, un colorante azul y un colorante rojo,
    - mezclar un alcohol y etilenglicol de manera que se obtenga una solucion 1,
    - disolver cloruro de sodio en agua de manera que se obtenga una solucion 2,
    - anadir la solucion 2 en la solucion 1 bajo agitacion de manera que se obtenga una solucion 3,
    - anadir la solucion 3 bajo agitacion en la solucion 4, y
    - filtrar.
  8. 8. Procedimiento de fabricacion segun la reivindicacion 7, caracterizado por que la solucion 4 se obtiene disolviendo en dimetilsulfoxido los colorantes siguientes:
    - azul de metileno -Eosina,
    - azul azur I, Eosina,
    - azul de metileno,
    - azul azur I de metileno, y
    - un compuesto del grupo de las tiazinas.
  9. 9. Procedimiento de fabricacion segun una de las reivindicaciones 6 a 8, caracterizado por que el alcohol es el etanol o el isopropanol.
  10. 10. Procedimiento de coloracion de celulas o de estructuras celulares, en particular para la sangre y la medula, caracterizado por que comprende por lo menos una etapa que consiste en poner en contacto la preparacion a colorear con una composicion de fijacion segun una de las reivindicaciones 4 o 5.
  11. 11. Procedimiento de coloracion segun la reivindicacion 10, que comprende ademas las etapas siguientes:
    - poner en contacto la preparacion fijada con una solucion tampon a pH comprendido entre 6,5 y 7,0,
    - poner en contacto la preparacion con una solucion de aclarado.
  12. 12. Procedimiento de coloracion segun una de las reivindicaciones 10 u 11, caracterizado por que:
    - la preparacion a colorear se pone en contacto en la composicion de fijacion durante 5 a 10 minutos,
    - la preparacion fijada se pone en contacto en la solucion tampon a pH comprendido entre 6,5 y 7,0 durante 3 a 8 minutos, y
    5 - la preparacion resultante se pone en contacto con una solucion de aclarado durante de 5 a 20 segundos.
  13. 13. Procedimiento de coloracion segun la reivindicacion 10, que comprende ademas las etapas siguientes:
    - poner en contacto la preparacion fijada con una solucion tampon a pH comprendido entre 6,8 y 7,2,
    10 - poner en contacto la preparacion con un reactivo de coloracion complementary,
    - poner en contacto la preparacion con una solucion de aclarado.
  14. 14. Procedimiento de coloracion segun la reivindicacion 13, caracterizado por que comprende las etapas siguientes:
    15 - poner en contacto durante 5 a 8 minutos la preparacion a colorear con una composicion de fijacion segun una
    de las reivindicaciones 4 o 5,
    - poner en contacto durante 2 a 3 minutos la preparacion fijada con una solucion tampon a pH comprendido entre 6,8 y 7,2,
    20
    - poner
    - poner
    en contacto durante 1 a 3 minutos la preparacion con un reactivo de coloracion complementario, en contacto durante 5 a 20 segundos la preparacion con una solucion de aclarado.
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