JPH03167472A

JPH03167472A - 実験動物の胎児骨格染色法

Info

Publication number: JPH03167472A
Application number: JP30799789A
Authority: JP
Inventors: Satoshi Kawamura; 聡川村
Original assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date: 1989-11-27
Filing date: 1989-11-27
Publication date: 1991-07-19

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】Ｌ粟±二且亙ユ互本発明は実験動物の胎児脂肪を透明化する方法と、これ
を用いた胎児骨格染色法に関する。さらに詳しくは、胎
児脂肪を透明化することにより剥皮および脂肪除去を行
なわない実験動物の胎児骨格染色法に関するものである
。

の　　と本発　が解決しようと　る課題物質の安全性を
検討する上で、急性毒性、慢性毒性、変異原性毒性、生
殖・発生毒性などを調べる必要がある。その中で、生殖
・発生毒性の分野では、胎児の形態的異常の有無を観察
しなければならず、なかでも骨格の検査は必須である。

この骨格検査のため、通常の状態では骨格を観察できな
いので胎児の表皮や筋肉を取り除き、骨格の周囲の組織
を透徹して、さらに骨格を染色した標本を作製する必要
がある。

また、この他に発生生物学において骨格系の発生を調べ
る際にも同様に骨格を染色した標本を作製し観察する。

従来は、実験動物の胎児骨格標本を作製する方法として
次のような方法を用いていた。

まず、実験動物の子宮から摘出した胎児をエタノールに
つけて固定する。そして、その固定した胎児に、剥皮処
理を施し、再度エタノールに固定する。ここまでのいず
れかの段階で胸腹臓器を摘出しておく。その後ＫＯＨ水
溶液により胎児の筋肉などを透徹する。透徹後染色剤を
用いて、骨格を染色し、その後脱色し、観察に供する。

しかし、この方法では、ＫＯＨ水溶液により透徹後、脂
肪組織は白色組織として残り、そのため骨格を詳細に観
察することが困難であった。従って、良質な標本を得る
ために、染色前の剥皮作業時に脂肪組織を除去する必要
があった。しかしながら、胎児骨格染色を行なう工程の
中で最初に行う剥皮作業と良質な骨格標本を作成するた
めの脂肪組織の除去は時間と労力と熟練を要するもので
ある。　そして、その手間を省くため脂肪除去を行わな
かった、白色の脂肪組織が残ったままの標本ではこれが
障害となり、詳細な観察に多大な時間を要し、かつ見落
としが生じ易く、また細部の写真撮影も困難であった。

。題を解決するためのそこで本発明者は、上記課題を解決するために胎児の表
皮および脂肪組織を化学的に除去する方法を鋭意検討し
た。その結果、胎児を剥皮作業を施さないでエタノール
固定後、ＫＯＨ・エタノール溶液に浸し、その後ＫＯＨ
水溶液にて透徹すると他の組織と同様に脂肪組織も透明
になることを見出し、剥皮ならびに脂肪除去の作業を省
略し、かつ脂肪組織が白色組織として残らない新しい骨
格染色注を開発した。

さらに本発明は、このＫＯＨ・エタノール液中に前述の
染色剤を加えることで脂肪の処理と同時に骨格染色を行
なうことができることも見出した。

以下、本発明を詳細に説明する。

実験動物の胎児を母親の子宮から摘出する。その摘出し
た胎児を９９％エタノールに最低１日以上固定する。胸
腹部臓器をエタノール固定前、あるいは次のＫＯＨ・エ
タノール溶液に浸す前に除去する。ただし、表皮、脂肪
組織ならびに眼球は除去しなくてもよい。エタノール固
定後、ｌ−１７５％ＫＯＨ（ｗ／■）・８０〜９０％エ
タノール（ｖ／ｖ）　・０．０００５　〜０．００３％
（ｗ　／　ｗ　）アリザリンレッドＳ（ｗ／ｖ）溶液に
２〜ｌＯ日浸した後、０．５〜２％ＫＯＨ（ｗ／ｖ）水
溶液を用いて透徹する。その際に用いるＫＯＨ・エタノ
ール溶液あるいは、ＫＯＨ水溶液の量は胎児が完全に浸
ればそれでよいが、体重のｌＯ〜１５倍の液量が好まし
い。さらにその後、５０％グリセロール（　Ｖ　／　Ｖ
　）水溶液を用いてアリザリンレッドＳを脱色し、標本
を作製する。作製した骨格が染色された標本は、防腐剤
を添加した１００％グリセロール中で保存することが可
能である。

本発明を適用できる実験動物として、マウス、ウサギ、
ハムスター等のすべての啼乳類動物の胎児が挙げられる
。

また、胎児のみならず、生後まもない幼弱な動物にも本
発明を適用することが可能である。

実験動物の子宮から摘出した胎児をＫＯＨ・エタノール
溶液に浸す前にエタノールにより固定するが、それは最
低１日以上行なうことが必要である。また、場合によっ
ては数ケ月間固定を行なった実験動物の胎児を用いるこ
とも可能である。

本発明に用いるＫＯＨ・エタノール溶液は、脂肪を透明
化するためには、エタノール濃度は８０％（　ｖ　／　
ｖ　）以上必要である。また、ＫＯＨ濃度は１−１．７
５％（　ｗ　／　ｖ　）の濃度が好ましい。

しかし、ＫＯＨｌ度は、高い方が脂肪細胞が完全に透徹
された良質な骨格標本を得ることができるが、その反面
標本が脆くなるという、欠点を有する。

ＫＯＨ・エタノール溶液に胎児を浸した後、脂肪細胞を
透徹するために用いるＫＯＨ水溶液の濃度は０．５〜２
％（Ｗ／Ｖ）が好ましい。透徹化に要する時間は、通常
１〜２日で充分である。しかし、標本の状態やＫＯＨ・
エタノール溶液中に浸した時間との関係があるため個々
の場合の検討が必要であるが、脂肪細胞が透明化すれば
反応を終えることができる。

本発明に用いる染色剤としては、骨格を染色すアリザリ
ンレッドＳの他に、軟骨を染色するアルシアンブルー（
ナカライテスク）やメチレンブルー（ナカライテスク）
、トルイジンブルー（ナカライテスク）が挙げられる。

本発明では、ＫＯＨ・エタノール溶液に染色剤を添加し
て脂肪の処理と同時に染色を行なっているが、ＫＯＨ水
溶液による透徹後に染色を行なうことももちろん可能で
ある。

骨格を染色するためＫＯＨ・エタノール躊岐に添加する
アリザリンレッドＳ等の染色剤の濃度は高い方が、標本
が染色され易いが反面脱色に多大な時間を要するので０
．０００５〜０．００３％（ｗ／ｖ）が好ましい。

アリザリンレッドＳ等、染色剤の脱色は、５０％グリセ
ロール溶液（　Ｖ　／　Ｖ　）を用いて行なう。

その時間は、標本の染色の程度によって異なるが、通常
１日の脱色で充分である。

本発明の操作は、すべて室温条件下で行うことが可能で
ある。

以上の処理は、実験動物の胎児の大きさによりそれぞれ
の溶液の至適濃度、至適処理時間が異なるので個々の場
合の至適の条件の検討が必要である。

以下、本発明をラット胎児を用いた実施例により詳しく
説明するが、本発明の範囲はこの例に限定されるもので
はない。

実施例胎生２０日令ラットを母親の子宮より摘出した。

それらの胎児ラットの胸腹部臓器を摘出後、９９％エタ
ノールに浸して、１日固定した。エタノール固定を行っ
た胎児を、最終濃度１．５％ＫＯＨ（ｗ／ｖ）　　・８
５％エタノール（ｖ／ｖ）　　・０．００ｌ５％アリザ
リンレッドＳ（ｗ／ｖ．）溶液に５日間浸し、脂肪組織
処理と同時に骨格の染色も行なった。この際、ＫＯＨ・
エタノール溶液を、１匹当り５〇一用いた。次いで、ｌ
％ＫＯＨ水溶液に１日間浸し、脂肪組織を透徹した。そ
の後５０％のグリセリン溶液に移し、過染色部分を脱色
し、実験動物の胎児の骨格が染色された標本を作成した
。そして、その標本の骨格の形態的異常の観察を行った
。観察終了後、防腐剤としてチモールを少量含んだ１０
０％グリセリンにてその標本を保存した。

このように本発明により、従来は胎児の骨格を染色した
標本を作製する時に最も労力と時間を要した剥皮ならび
に脂肪除去作業を省くことが可能になった。さらに、脂
肪組織が透明化された、良質な骨格染色標本を得ること
も出来るようになった。

良質な骨格染色標本を得られるようになった結果、物質
の安全性を検討する上で必要である生殖・発生毒性の検
討項目である、実験動物胎児の骨格の形態的異常の有無
を詳細に観察することが可能になった。

手続補正書（自発）ｌ．事件の表示平或ｌ年１１月２７日提出め特許願住所大阪市中央区北浜四丁目５番３３号名称（２　０　９）住友化学工業株式会社代表者森英雄４．

Claims

【特許請求の範囲】

（１）実験動物胎児をエタノールによって固定した後、
ＫＯＨ・エタノール溶液に浸し、次いでＫＯＨ水溶液に
より透徹することを特徴とする実験動物胎児の脂肪組織
透明化方法
（２）特許請求の範囲第１項記載の方法においてＫＯＨ
・エタノール溶液またはＫＯＨ水溶液に染色剤を加える
ことにより、もしくは透徹後に染色剤で胎児骨格を染色
することを特徴とする実験動物の胎児骨格染色法