CN109813690A - 一种石墨烯量子点荧光探针及其合成方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种石墨烯量子点荧光探针，其结构如式Ⅰ所示：本发明以偶氮染料为目标化合物，以偶氮染料脱色菌株为实验客体，首次将石墨烯量子点荧光探针技术应用于示踪微生物降解可视化中，利用荧光标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程，阐明微生物细菌细胞对偶氮染料分子的捕获和降解转移特点。该研究的开展将建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物示踪研究模式，更生动直观、高效、特异地对单个细胞进行快速、高灵敏度分析标识，能为功能微生物的高效示踪提供新的工具，也能为功能微生物单细胞研究和未培养微生物的深入挖掘提供技术支撑，对于毒性芳烃污染物防治具有重大的实践意义和应用潜力。

Description

一种石墨烯量子点荧光探针及其合成方法和应用

技术领域：

本发明涉及功能微生物示踪技术领域，具体涉及一种石墨烯量子点荧光探针及其合成方法和应用。

背景技术：

目前随着经济的持续发展和社会的进步，环境污染问题在我们日常生产生活中的已经变得十分严峻。环境污染不仅会对经济和生态造成严重的损伤，而且会严重威胁人们的生命健康安全。环境污染物中人工合成的芳烃类化合物结构复杂、难以自然降解，对人类具有致癌、致畸等生物毒性，并且可以随着大气、水体、土壤、生物体等介质进行长距离迁移扩散，造成广泛的面源污染，严重威胁人类健康和生态安全。因此，芳烃类化合物的污染治理是生态环境保护的重大难题。

目前，对于环境治理最有前景的手段当属生物修复技术，利用生物修复技术净化环境中有毒有害物质，远好于传统的物理、化学修复技术。微生物是生态系统物质循环和能量转化的重要驱动者，具有把污染物降解为无毒无害产物的能力。利用微生物净化有毒有害物质，被认为是目前最有前景的环境污染治理手段。长期以来科学家从不同角度开展有机污染物微生物降解研究。随着微生物生理生态学分析检测技术的发展和应用，大量研究表明污染环境中广泛存在着可以利用自身酶系对毒性芳烃污染物进行降解的功能微生物。这些具有降解功能的微生物在污染环境的净化和修复过程中起着不可替代的作用，是加速芳烃污染物去除的重要力量。

功能微生物的呼吸作用能够将氧化有机物产生的电子转移至电子受体进行还原，在环境污染物降解、清洁能源生产、温室气体排放和生物合成等领域具有重要的应用前景。快速准确检测功能微生物，是深入研究呼吸机理和拓展其环境应用的重要前提。相较于传统的细胞功能代谢活性分析检测手段，如酶活的检测、代谢产物分析，荧光标记技术是一种快速、方便的生物分析手段。由于石墨烯量子点具有优异的稳定性、出色的光学和电化学特性、光漂白抗性及低毒性，受到化学、材料科学、物理及生物学等各领域科研人员的极大关注。制备出能快速、准确示踪功能微生物的石墨烯量子点，将对环境污染物防治有重大的实践意义和应用潜力。由于石墨烯量子点生物学的研究现今多应用于哺乳动物细胞，因此制备出适用于微生物研究使用的石墨烯量子点，对材料科学，微生物学具有重要的意义。

发明内容：

本发明的目的是提供一种石墨烯量子点荧光探针及其合成方法和在示踪具有毒性芳烃降解活性微生物中的应用。

本发明是通过以下技术方案予以实现的：

一种石墨烯量子点荧光探针，其结构如式Ⅰ所示：

本发明荧光探针为基于荧光共振能量转移机理结构的纳米量子点，由式Ⅱ所示的荧光供体石墨烯量子点GQDs和式Ⅲ所示的用于石墨烯量子点GQDs表面修饰的荧光受体偶氮染料甲基红合成：

本发明的石墨烯量子点荧光探针的制备方法，包括以下步骤：

(1)苝在热HNO₃中回流反应10-14h，冷却至室温，混合物用去离子水稀释并用微孔滤膜除去酸，得到棕黄色粗产物，分散于水合肼中超声1-3h，然后转移至水热反应釜中190-210℃反应8-12h，待冷却至室温后用微孔滤膜除去不溶的碳产物，随后透析得到如式Ⅱ所示的石墨烯量子点(graphene quantum dots,GQDs)；

(2)甲基红溶于水与DMSO混合液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC，随后缓慢调节反应液pH至5，室温下搅拌，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺NHS，随后调节pH至9.0，再缓慢滴加步骤(1)得到的石墨烯量子点GQDs，在黑暗条件下，轻柔搅拌40-50h，最后透析得到目标探针GQDs-M。

特别地，所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。

水与DMSO混合液中两者体积比1：2。

甲基红、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐EDC与N-羟基琥珀酰亚胺NHS的摩尔比为1：4：2。

本发明还保护所述石墨烯量子点荧光探针在示踪具有毒性芳烃降解活性微生物中的应用。

本发明设计并合成了一类对偶氮染料的降解作用有专一选择性的石墨烯量子点荧光探针——探针GQDs-M。探针GQDs-M在偶氮染料未被降解时，由于分子内存在着荧光共振能量转移(FRET)，整体是无荧光的；当偶氮染料部分被细菌细胞的酶降解后，偶氮染料结构被破坏，荧光部分将会发射荧光。

本发明以偶氮染料为目标化合物，以偶氮染料脱色菌株为实验客体，首次将石墨烯量子点荧光探针(探针GQDs-M)技术应用于示踪微生物降解可视化中，利用荧光标记示踪偶氮染料在细菌细胞内降解的显色过程，阐明微生物细菌细胞对偶氮染料分子的捕获和降解转移特点。相比于201510128212.2有机分子探针N-Red1，本发明石墨烯量子点荧光探针稳定性更高，不易于被生物体降解降解；毒性低，对菌株的影响小，能更原位的还原微生物降解污染物的过程。更重要的是，有机荧光小分子由细胞内向外扩散严重，导致不具有降解功能的菌株也被荧光染色，产生假阳性，影响了探针的使用。而本发明石墨烯量子点荧光探针定位性好，进入细胞内部后不会游动，完美的解决了这个问题。该研究的开展将建立一套全新的基于化学荧光标记技术的微生物示踪研究模式，更生动直观、高效、特异地对单个细胞进行快速、高灵敏度分析标识，能为功能微生物的高效示踪提供新的工具，也能为功能微生物单细胞研究和未培养微生物的深入挖掘提供技术支撑，对于毒性芳烃污染物防治具有重大的实践意义和应用潜力。

附图说明：

图1是本发明石墨烯量子点探针的光谱分析；其中A为红外光谱；B为拉曼光谱。

图2是本发明石墨烯量子点探针的光学特性；其中A为石墨烯量子点探针GQDs在不同激发波长下的发射光谱；B为石墨烯量子点探针GQDs-M在不同激发波长下的发射光谱；C为石墨烯量子点探针GQDs的紫外吸收光谱及激发和发射光谱；D为为石墨烯量子点探针GQDs-M的紫外吸收光谱及激发和发射光谱。

图3是本发明石墨烯量子点探针的TEM照片；其中，A为石墨烯量子点探针的图片，图中标尺为100nm，B石墨烯量子点探针与脱色希瓦氏菌S12共培养的图片，图中标尺为1μm。

图4是本发明的石墨烯量子点探针GQDs-M与脱色希瓦氏菌S12、大肠杆菌及鞘脂菌C1共培养后使用流式细胞仪进行分析的结果；其中，A为不同培养时间内流式细胞仪分析的柱形图，FL3荧光通道信号为X轴，Y轴是细胞数；B为细菌在不同培养时间的平均荧光强度柱形图。

图5是本发明的石墨烯量子点探针GQDs与脱色希瓦氏菌S12及大肠杆菌共同培养12小时进行激光共聚焦拍摄的照片；其中，A为大肠杆菌与GQDs共培养的共聚焦图，B为脱色希瓦氏菌S12与GQDs共培养的共聚焦图。

图6-10为本发明的石墨烯量子点探针GQDs-M与脱色希瓦氏菌S12及大肠杆菌在厌氧条件下不同时间段内拍摄的激光共聚焦图片；图6为S12与大肠杆菌在与GQDs-M共培养4小时后拍摄的共聚焦图片；图7为S12与大肠杆菌在与GQDs-M共培5.5小时后拍摄的共聚焦图片；图8为S12与大肠杆菌在与GQDs-M共培养6.5小时后拍摄的共聚焦图片；图9为S12与大肠杆菌在与GQDs-M共培养21小时后拍摄的共聚焦图片；图10为S12与大肠杆菌在与GQDs-M共培养48小时后拍摄的共聚焦图片；其中A为大肠杆菌，B为S12。

图11是本发明的石墨烯量子点探针GQDs-M在希瓦氏菌S12共同培养12小时后在胞内特定位点累积的共聚焦图，其中A、B、C为白光图，D、E、F为荧光通道图。

具体实施方式：

以下是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：石墨烯量子点荧光探针GQDs-M的合成

具体合成过程如下。

1)石墨烯量子点GQDs的合成：

0.2g苝在热HNO₃(80℃)中回流12h。待冷却至室温时，混合物用去离子水稀释并用0.22μm微孔滤膜除去酸。得到棕黄色粗产物分散于1.5M水合肼中超声2h。悬浮液转移至水热反应釜中200℃反应10h。待冷却至室温后用0.22μm微孔滤膜除去不溶的碳产物。随后用透析袋(3500Da)透析约一周得到如式Ⅱ所示的石墨烯量子点(graphene quantum dots,GQDs)。

2)石墨烯量子点GQDs-M合成：

0.1mmol甲基红溶于15mL水/DMSO混合液(1：2)中，加入76.8mg EDC(0.4mmol)，随后缓慢加入0.01M HCl调节反应液pH至5，室温下搅拌30min。NHS(23.0mg，0.2mmol)加入到反应液中，随后用0.01M NaOH调节pH至9.0，再缓慢滴加GQDs(50mg)。在黑暗条件下，反应液轻柔搅拌48h。最后透析约一周得到目标探针，简记为GQDs-M。

实施例2：石墨烯量子点探针的光谱：

石墨烯量子点GQDs和石墨烯量子点GQDs-M分散于水溶液中，测试其红外光谱、拉曼光谱、吸收光谱以及荧光光谱。红外光谱测试使用傅里叶变换红外光谱仪(Bruker/Tensor II)，测试范围4000-400cm^-1。拉曼光谱测试使用显微拉曼光谱仪(LabRAM Aramis)，测试范围4000-100cm^-1。紫外光谱测试使用紫外可见分光广度计(SHIMADZU/UV-2600)，测试范围400-800nm。荧光光谱测试使用荧光分光光度计(Perkin Elmer/LS-45)，激发波长范围200-600nm，发射波长范围400-800nm。

图1，图2是本发明石墨烯量子点探针的光谱分析。图1A为石墨烯量子点的红外光谱，图1B为石墨烯量子点的拉曼光谱。在红外光谱中GQDs在3500-3000cm^-1处出现氨基和羟基的特征峰，GQDs-M红外谱图中则有羟基、酰胺键、偶氮键等的特征吸收峰。在拉曼光谱中，GQDs有两个明显的石墨烯量子点特征峰，GQDs-M则相比在较高波数段多一个峰。图2A为不同激发波长的荧光发射光谱，图2B为GQDs-M不同激发波长的发射光谱，图2C为GQDs的激发光谱、吸收光谱和最大发射光谱，图2D为GQDs-M的激发光谱、吸收光谱和最大发射光谱。可以看出，在不同激发波长下GQDs-M的发射光谱的荧光强度都相对于GQDs大幅降低。GQDs-M的吸收光谱较GQDs发生了蓝移并在520nm处多了一个吸收峰，而激发光谱也发生红移，并且发射光谱荧光强度大大降低。

实施例3：石墨烯量子点探针的形貌结构：

先将石墨烯量子点探针悬浮液经0.22μm微孔滤膜过滤，再于截留分子量3500Da的透析膜透析约一周时间。使用透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM)进行颗粒表征。

图3A是本发明石墨烯量子点探针TEM表征。可以看出纳米颗粒分散良好，呈规则球型，平均粒径2±1nm。图3B为石墨烯量子点探针与S12共同培养12h后的TEM图，可以看出石墨烯量子点探针在菌体及其四周环境中均匀分布。

实施例4：细菌的流式细胞仪分析：

脱色希瓦氏菌S12(脱色希瓦氏菌S12，该菌株是现有技术中的菌株，公开于文献：Meiying Xu,Jun Guo,Guoqu Zeng,Xiaoyan Zhong,Guoping Sun，Decolorization ofanthraquinone dye Shewanella decolorationis S12，Appl Microbiol Biotechnol,2006,71:246～251)，鞘脂菌C1，大肠杆菌，将各菌种接种至40mL Luria-Bertani培养基(LB培养基)(胰蛋白胨(Tryptone)10g/L，酵母提取物(Yeast extract)5g/L，氯化钠(NaCl)10g/L，pH＝7.4)的锥形瓶，摇床隔夜培养确保生长完全，再将10μL该预培养菌液转接到5mL新鲜lactate medium(LM)培养基(乳酸钠2.0g/L,酵母提取物2.0g/L,Na₂HPO₄·7H₂O12.8g/L,3g/L KH₂PO₄,NaCl 0.5g/L,和1.0g/L NH₄Cl)的无菌试管中，加入1mL石墨烯量子点GQDs-M悬浮液(1000mg/L)，于厌氧培养箱中培养，每隔一段时间取出离心(7500rmp,10min,25℃)收获菌体用PBS(phosphate buffer saline,137mM NaCl，2.7mM KCl，10mMNa₂HPO₄，2mM KH₂PO4，pH＝7.4)缓冲液洗涤三次后用PBS缓冲液重悬制成菌悬液，使用流式细胞仪(Sysme Cube 6)上样检测。

图4为流式细胞仪检测结果。A为不同培养时间内流式细胞仪分析的柱形图，FL3荧光通道信号为X轴，Y轴是细胞数；B为细菌在不同培养时间的平均荧光强度柱形图。可以看出，随着培养时间增加，其荧光信号较强的细胞数在逐渐增多。平均荧光强度也随时间增加而增加。

实施例5：偶氮降解微生物可视化示踪：

与实施例4的细菌培养条件相同，将石墨烯量子点探针GQDs-M与具有偶氮降解功能的细菌脱色希瓦氏菌S12及不具有偶氮降解功能的细菌大肠杆菌共同培养，每隔一段时间取样离心，用PBS缓冲液洗涤三次，离心重悬成为菌悬液。用滴管吸取10μL菌液滴到载玻片上，在共聚焦显微镜下观察。激发波长选择为488nm。

图5～10为脱色希瓦氏菌S12及大肠杆菌与GQDs-M共同培养4h、5.5h、6.5h、21h和48h后的激光共聚焦照片。随着培养时间增长，同一视距下接收到的S12的荧光信号在逐渐增强，说明随着共同培养时间增长，越来越多的GQDs-M上的偶氮染料被S12还原而发出荧光信号，因大肠杆菌不具有偶氮降解能力，所以大肠杆菌随着培养时间增长则无荧光信号或仅有极弱的荧光信号。图11为S12与GQDs-M共同培养24h后拍摄的共聚焦图片，可以看出菌体中有明显的荧光信号源点，即是菌体中聚集石墨烯量子点探针GQDs-M并降解偶氮染料的特定位点。

根据上述说明书的揭示和教导，本发明所属领域的技术人员还可以对上述实施方式进行适当的变更和修改。因此，本发明并不局限于上面揭示和描述的具体实施方式，对本发明的一些修改和变更也应当落入本发明的权利要求的保护范围内。此外，尽管本说明书中使用了一些特定的术语，但这些术语只是为了方便说明，并不对本发明构成任何限制。

Claims (6)

1.一种石墨烯量子点荧光探针，其特征在于，其结构如式Ⅰ所示：

2.权利要求1所述石墨烯量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，由式Ⅱ所示的荧光供体石墨烯量子点GQDs和式Ⅲ所示的用于石墨烯量子点GQDs表面修饰的荧光受体偶氮染料甲基红合成：

包括以下步骤：

(1)苝在HNO₃中回流反应10-14h，冷却至室温，混合物用去离子水稀释并用微孔滤膜除去酸，得到棕黄色粗产物，分散于水合肼中超声1-3h，然后转移至水热反应釜中190-210℃反应8-12h，待冷却至室温后用微孔滤膜除去不溶的碳产物，随后透析得到如式Ⅱ所示的石墨烯量子点；

(2)甲基红溶于水与DMSO混合液中，加入1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，随后缓慢调节反应液pH至5，室温下搅拌，然后加入N-羟基琥珀酰亚胺，随后调节pH至9.0，再缓慢滴加步骤(1)得到的石墨烯量子点，在黑暗条件下，轻柔搅拌40-50h，最后透析得到目标探针。

3.根据权利要求2所述石墨烯量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，所述微孔滤膜为0.22μm微孔滤膜。

4.根据权利要求2所述石墨烯量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，水与DMSO混合液中两者体积比1：2。

5.根据权利要求2所述石墨烯量子点荧光探针的制备方法，其特征在于，甲基红、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐与N-羟基琥珀酰亚胺的摩尔比为1：4：2。

6.权利要求1所述石墨烯量子点荧光探针在示踪具有毒性芳烃降解活性微生物中的应用。