CN102127587A - 一种测定吞噬细胞对结核杆菌杀伤活性的方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于抗感染免疫的技术领域，具体说是一种测定吞噬细胞杀伤结核杆菌的方法。其步骤包括：(1)结核杆菌体外培养后用荧光染料标记；(2)人或动物血液标本，或分离或培养的吞噬细胞，与荧光染料标记结核杆菌于37℃共孵育1至90分钟或更长时间后，洗涤除去未被吞噬结核杆菌；(3)将吞噬结核杆菌的吞噬细胞置于37℃1至90分钟或更长时间后，裂解吞噬细胞，释放出结核杆菌；(4)用流式细胞仪检测荧光降低的结核杆菌比例，计算吞噬细胞对结核杆菌的杀伤活性。本发明方法是应用荧光染料标记的结核杆菌被杀伤后荧光强度明显降低的原理，能在短时间内检测吞噬细胞对结核杆菌杀伤活性。其优点是操作简便和快捷，客观性和重复性好。

Description

一种测定吞噬细胞对结核杆菌杀伤活性的方法

技术领域

本发明属于抗结核分枝杆菌感染的细胞免疫学技术领域，具体内容是检测吞噬细胞对结核分枝杆菌杀伤活性的方法。

背景技术

由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis，Mtb)感染引起的结核病，目前仍是发病率和病死率最高的传染病之一。然而迄今为止，关于结核病的发病机制，特别是机体对Mtb感染的免疫机制并未完全阐明。近年来已有许多学者探讨天然免疫在抗Mtb感染中的作用。近年来的研究发现，中性粒细胞(PMN)这一具有天然免疫作用的细胞可能与抗Mtb感染的免疫保护作用密切相关，但有关PMN与抗Mtb感染的免疫保护作用并未得到一致意见，以及PMN对Mtb的确切作用机制尚未明确。因此，探讨PMN在抗Mtb感染的天然免疫中的作用，阐明其能否通过激活杀菌机制杀伤Mtb，是解决PMN是否参与抗结核感染保护性免疫的关键问题，对于全面了解机体抗结核感染的免疫保护机制，具有重要的理论意义和临床实用价值。

传统检测吞噬细胞杀伤Mtb功能的方法，是将吞噬Mtb的吞噬细胞裂解后，接种在培养Mtb的培养基(如苏通培养基)培养2至3周或更长时间后检查和计数Mtb菌落数，与对照对比计算出杀伤率。传统方法操作繁琐，周期较长，影响因素较多。经查阅国内外专利文献和各种出版物，迄今为止，未见有快速、准确地检测吞噬细胞对Mtb杀伤活性方法的发明和报道。因此，发明一种简单、快速、准确的检测吞噬细胞杀伤Mtb的方法，用于探讨PMN在结核杆菌感染中发挥的非特异性免疫杀伤功能，以阐述PMN在抗结核感染免疫中的确切的保护性作用机制是非常重要的，对于阐明人类抗结核的免疫机制以达到控制结核病的发生和发展，也都具有十分重要的学术探讨意义和临床实际价值。

发明内容

1.本发明目的在于提供一种简单、快速、准确地检测吞噬细胞对Mtb的杀伤功能的方法。本发明的方法是利用荧光染料标记Mtb被吞噬细胞杀伤后荧光强度明显降低的原理，设计了应用流式细胞仪检测吞噬细胞杀伤Mtb活性的方法，具体包括以下主要步骤：

(1)Mtb体外培养扩增后用活细胞荧光染料标记，并用流式细胞仪检测荧光标记率。

(2)荧光染料标记Mtb与吞噬细胞置于37℃共同孵育，数分钟至几十分钟，或几个小时(因不同吞噬细胞类型而有所不同)后，离心洗涤除去未被吞噬的结核杆菌。

(3)将吞噬了荧光染料标记Mtb的吞噬细胞置于37℃孵育1至90分钟或更长时间后，裂解吞噬细胞，释放被出Mtb。同时设立置于0℃孵育相同时间的对照组。

(4)用流式细胞仪检测荧光阴性和阳性Mtb比率，或Mtb荧光的强度，计算吞噬细胞对Mtb的杀伤率。

2.本发明所涉及Mtb，主要是(但不仅限于)人型结核杆菌。体外培养扩增的方法可以采用通常培养Mtb的培养基，可以是固体培养基如罗氏培养基，或液体培养基如苏通氏培养基，通常需要培养1至2周或更长时间。收获处于对数生长期的Mtb，用于荧光染料标记以及后续的吞噬杀伤实验。

3.本发明的方法所涉及的用于标记Mtb的荧光染料，是活细胞荧光染料，例如(但不仅限于)：

(1)荧光素二醋酸酯(Fluorescein Diacetate，FDA)，是一种非荧光的酯酶底物，经活细胞吸收后，被细胞内普遍存在的酯酶水解成带电荷的荧光素，呈较强的绿色荧光，并能保留在细胞内；被细胞杀伤后(包括凋亡及坏死)，荧光强度明显降低或消失。FDA标记的终浓度范围为0.01μg/ml至5μg/ml(或0.02μmol/L至10μmol/L)，合适的标记终浓度为0.1μg/ml至0.5μg/ml(或0.2μmol/L至1.0μmol/L)。

(2)2，7双(2羧乙酸)5(和6)羧基荧光素乙酰甲酯[2′，7′-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein，acetoxymethyl ester(BCECF-AM)]，也是类似于FDA的活细胞非荧光的酶底物，进入细胞内后即被胞内的酶水解为有荧光的产物(BCECF)，在细胞内比FDA更能稳定的保留。被细胞杀伤后，荧光强度也明显降低。BCECF的标记终浓度为0.02μg/ml至10μg/ml(或0.05μmol/L至20μmol/L)，合适的标记终浓度为0.2μg/ml至1.0μg/ml(或0.5μmol/L至2.0μmol/L)。

上述荧光染料标记Mtb时，荧光染料与Mtb共同孵育的温度可在4℃至37℃，时间为5至60分钟，合适温度是37℃，时间是20至30分钟。

4.在本发明的方法中，检测荧光染料对Mtb标记的效率的方法采用流式细胞仪检测，具体的检测方法在流式细胞仪的检测图中先以前散射光和侧散射光(均设定为Log)作二维点图，圈定Mtb区域，然后再在有第1荧光通道(FL1)的二维点图(如FLI对SSC，或FLI对FL2)中，以Mtb区域设门，检测FLI荧光阳性的Mtb比例，达到90％或以上者作为荧光标记Mtb的合适样品，用于后续的吞噬细胞吞噬和杀伤Mtb的样本。具体的操作方法参考实施例1，Mtb荧光标记率的检测结果可以参见附图1。

5.在本发明的方法中，吞噬细胞的标本来源包括(但不仅限于)人和各种动物血液标本，或从血液标本和淋巴器官组织及其他器官组织分离获得的含有吞噬细胞的样品，或者是体外培养的具有吞噬活性的细胞系，如THP-1细胞等。

6.在本发明的方法中，检测吞噬细胞对Mtb的杀伤活性实验步骤包括：

(1)首先是吞噬细胞吞噬Mtb，可将吞噬细胞标本与荧光染料标记的Mtb在37℃共同孵育数分钟至数十分钟，或更长时间。孵育时间因不同吞噬细胞的类型而有所不同，就中性粒细胞吞噬Mtb而言，合适的吞噬(即共同孵育)时间是5至20分钟。

(2)其次是离心洗涤吞噬Mtb的吞噬细胞，以除去游离的即未被吞噬的荧光染料标记的Mtb。离心的速率和时间以能沉淀细胞而不沉淀Mtb为原则，通常是离心500至2000r/min，5至20分钟。合适的离心速率是1000至1800r/min，时间是5至10分钟。细胞样本离心后，弃上清(含有未被吞噬的游离的Mtb)后，再加缓冲液(如PBS)重复离心洗涤1次，再弃上清，即可除去未被吞噬的荧光染料标记的Mtb。如果吞噬细胞样本是全血标本，则在离心洗涤前，先用溶血剂(如0.83％氯化铵溶液)，加入全血标本，溶血除去红细胞。

(3)最后是将除去游离Mtb的吞噬细胞样本置于37℃孵育0分钟(可作为对照组)至90分钟或更长时间，其孵育时间根据不同吞噬细胞类型而异，就中性粒细胞而言，合适的孵育时间是10至60分钟。另外也可将吞噬了荧光染料标记Mtb的吞噬细胞置于0℃孵育，孵育时间与在37℃孵育相同，也可作为对照组。通常随着吞噬Mtb的吞噬细胞在37℃孵育时间的延长，杀伤活性(即杀伤率)逐渐增加。

7.在本发明的方法中，对吞噬Mtb的吞噬细胞裂解后，释放出被吞噬细胞吞噬和沙上的的结核分枝杆菌，其裂解吞噬细胞的方法的原则是采用(但不仅限于)低渗和溶解细胞膜等方法，例如(但不仅限于)：

(1)用2至10倍体积的蒸馏水处理1至10分钟，合适的体积是4至5倍，合适的时间是2至3分钟。

(2)先加2至10倍体积的1％去氧胆酸钠，作用3至5分钟后，再加2至4倍体积的蒸馏水作用2至5分钟，即可裂解吞噬细胞释放出Mtb，用于流式细胞仪的检测。

8.在本发明中，对吞噬细胞裂解后释放出来的Mtb是否被杀伤的检测方法，是用流式细胞仪检测荧光标记Mtb的荧光强度的减少作为Mtb被杀伤的指标。在设定荧光阴性和荧光界限的基础上，将荧光阴性的Mtb作为被杀伤的Mtb。检测和计算荧光阴性和阳性的Mtb的数量和比率，计算吞噬细胞的对Mtb的杀伤活性。并以37℃孵育0分钟，或者0℃孵育相同时间的实验样本作为对照组。另外也可以检测杀伤组(即在37℃孵育不同时间)和对照组(在37℃孵育0分钟，或者0℃孵育不同时间)的Mtb的平均荧光强度(MFI)的不同，计算吞噬细胞对Mtb的杀伤活性。

9.在本发明中，用流式细胞仪检测吞噬细胞对Mtb的杀伤活性(或杀伤率)的计算有以下2种方法和公式：

(1)检测荧光阴性和荧光阳性Mtb的比例，按以下公式计算：

(2)测定杀伤组(在37℃孵育)和对照组(在0℃孵育)Mtb的平均荧光强度(MFI)，按以下公式计算：

10.本发明检测吞噬细胞对结核分枝杆菌杀伤功能的方法的优点在于：

(1)所需实验样本少，操作便捷，客观性和重复性好；

(2)能在很短时间内检测到吞噬细胞对结核分枝杆菌杀伤活性；

(3)本发明方法适用检测人群和各种动物的不同类型吞噬细胞对结核分枝杆菌的杀伤活性。

11.本发明提出一种利用荧光染色和流式细胞术检测吞噬细胞对结核分枝杆菌杀伤功能的技术方法，为免疫研究领域的实验研究人员探讨吞噬细胞对结核杆菌的杀伤活性及其调节功能和机制的研究提供了新的技术手段，在研究机体天然免疫细胞对抗结核感染免疫保护机制中具有重要的应用价值。

附图说明。

图1.流式细胞仪对FDA标记结核分枝杆菌的标记率检测图。

结核分枝杆菌与荧光染料FDA(荧光素二醋酸酯)在37℃共同孵育25分钟后，加PBS，离心洗涤2次后，在流式细胞仪上检测，左图为未标记的结核杆菌；右图为标记FDA的结核杆菌。

图2.人外周血中性粒细胞与FDA标记结核杆菌孵育不同时间对结核杆菌的杀伤活性。

A图为人外周血中性粒细胞不同时间杀伤FDA标记结核分枝杆菌杀伤率流式分析图。B图为多次实验(n＝9)的人外周血中性粒细胞对结核杆菌的杀伤活性的统计结果示意图。

图3，人外周血分离的中性粒细胞对BCECF(2，7双(2羧乙酸)5(和6)羧基荧光素乙酰甲酯)标记的结核杆菌的杀伤活性。

从人外周血中分离获取纯化的中性粒细胞，与BCECF-AM(2，7双(2羧乙酸)5(和6)羧基荧光素乙酰甲酯)标记的结核杆菌共同孵育后，离心洗涤除去未被吞噬的结核杆菌，然后在37℃共同孵育不同时间，同时设立置于0℃孵育不同时间的对照组，用去氧胆酸钠和蒸馏水裂解中性粒细胞后，在流式细胞仪上检测。A图为典型的流式细胞仪分析图，B图为多次实验(n＝5)的流式检测结果统计示意图。

具体实施方式

以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以下实施例是以检测以中性粒细胞对结核杆菌的杀伤活性，但并非限制本发明的方法仅限于对中性粒细胞的杀伤结核杆菌的活性的检测。

实施例1

本实施例1包括以下步骤：

1.结核分枝杆菌的培养：将H37Ra菌株接种于罗琴氏固体培养基，37℃培养1个月，收集菌体于1ml EP管，加入生理盐水研磨，取细菌悬液，加入生理盐水洗涤3次，离心10000r/min，2min，抗酸染色阳性且镜下观察细菌分散。分光光度计检测菌液浓度，用生理盐水配成浓度为5×10⁸/ml的M.tb悬液，4℃备用。

2.荧光染料标记结核杆菌和流式细胞术检测Mtb荧光标记率：：取5×10⁸/ml未标记M.tb菌液30μl，加入DMSO配制的FDA溶液(1μg/ml)4μl，然后置37℃30min后，离心10000r/min，2min，弃上清，PBS洗涤2次，用流式细胞仪检测M.tb的FDA标记率时，先设定FSC为E01和Log，设定SSC为Log，然后在FSC/SSC二维点阵图上检测Mtb，选取M.tb区域为R1，然后在SSC(Log)和FL1(FITC)二维点阵图上以M.tb区域(R1)设门，检测FDA标记率，此即M.tb存活率。

3.实施结果：根据上述实施方法，Mtb与FDA溶液(终浓度0.11μg/ml)在37℃30min作用后，用流式细胞仪检测到FDA对结核杆菌的标记率为96％，也表示结核杆菌的存活率为96％。结果见附图1。

实施例2

1.人外周血PMN对FDA标记M.tb的杀伤实验：取健康成人新鲜抗凝全血加入流式管，30μl/管，置冰上10min，然后加入5×10⁸/ml FDA标记的M.tb菌液30μl/管，混匀，置37℃水浴，20min后迅速取出，加冰冷的PBS洗涤两次，弃上清，加入氯化铵溶血剂3ml，放置15min，离心，弃上清，冰冷的PBS洗涤一次，弃上清，加入自体血清，10μl/管，然后置37℃水浴，0～60min后，立即加入冰冷三蒸水，200μl/管，孵育2min，用流式细胞仪检测。同时设定全血加入未标记细菌组(空白对照)和0℃各个时间点对照组。

2.流式细胞术对人外周血PMN杀伤FDA标记M.tb的检测方法：用流式细胞仪检测PMN杀伤M.tb活性时，先设定FSC为E01和Log，设定SSC为Log，

然后在FSC/SSC二维点阵图上检测M.tb，选取M.tb区域为R1，然后在SSC(Log)和FL1(FDA)二维点阵图上以M.tb区域(R1)设门，检测M.tb的FDA阳性率和阴和FL1(FDA)二维点阵图上以Mtb区域(R1)设门，检测Mtb的FDA阳性率和阴性率，PMN对Mtb杀伤率计算公式如下：杀伤率＝FDA阴性率/(FDA阳性率+FDA阴性率)×100％。

3.结果：PMN与FDA标记的Mtb先37℃孵育20min，然后置37℃水浴10～60min后，结果显示，PMN对Mtb的杀伤率0℃时10～60min无显著差异，在23.23％至31.46％；37℃时10min杀伤率30.06％，随时间延长，60min杀伤率达到56.43％，表明PMN对Mtb的杀伤活性随时间增加逐渐增强。附图2的A图为流式分析图，B图为多次(n＝9)实验的结果统计图。

实施例3

1.从人外周血分离中心粒细胞的方法：健康成人外周血经右旋糖酐沉淀后再经密度梯度离心法分离外周血中性粒细胞。

2.分离的中心粒细胞对BCECF标记Mtb的杀伤实验：取健康成人新鲜抗凝全血加入流式管，30μl/管，置冰上10min，然后加入5×10⁸/ml BCECF标记的Mtb菌液30μl/管，混匀，置37℃水浴，7min后迅速取出，加冰冷的PBS洗涤两次，弃上清，加入氯化铵溶血剂3ml，放置15min，离心，弃上清，冰冷的PBS洗涤一次，弃上清，加入自体血清，10μl/管，然后置37℃水浴，0～60min后，立即加5倍体积的1％去氧胆酸钠，作用3分钟后，再加3倍体积的蒸馏水作用5分钟，裂解PMN释放出Mtb，用流式细胞仪检测。同时设定全血加入未标记细菌组(空白对照)和0℃各个时间点对照组。

2.流式细胞术对人外周血分离PMN杀伤BCECF标记Mtb的检测方法：用流式细胞仪检测PMN杀伤Mtb活性时，先设定FSC为E01和Log，设定SSC为Log，然后在FSC/SSC二维点阵图上检测Mtb，选取Mtb区域为R1，然后在SSC(Log)和FL1(BCECF)二维点阵图上以Mtb区域(R1)设门，检测Mtb的BCECF阳性率和阴性率，PMN对Mtb杀伤率计算公式如下：杀伤率＝BCECF阴性率/(BCECF阳性率+BCECF阴性率)×100％。

3.结果：PMN与BCECF标记的Mtb先37℃孵育7min，然后置37℃水浴10～60min后，结果显示，PMN对Mtb的杀伤率在0℃0～60min为15.37％～17.33％；而在37℃30min时杀伤率为37.20％，60min时杀伤率达57.44％，表明PMN对Mtb的杀伤活性随时间增加逐渐增强。附图3为流式分析图。

Claims (10)

1.一种检测吞噬细胞杀伤结核分枝杆菌的方法，包括以下步骤：

(1)结核分枝杆菌体外培养扩增后用荧光染料标记，并用流式细胞仪检测荧光标记率。

(2)荧光染料标记的结核分枝杆菌与吞噬细胞置于37℃共同孵育1至90分钟或更长时间后，离心洗涤除去未被吞噬的结核分枝杆菌。

(3)将吞噬结核分枝杆菌的吞噬细胞置于37℃孵育0至90分钟或更长时间后，裂解吞噬细胞，释放被出的结核分枝杆菌。

(4)用流式细胞仪检测荧光阴性和阳性结核分枝杆菌比率，或结核分枝杆菌荧光的强度，计算吞噬细胞对结核分枝杆菌的杀伤率。

2.根据权利要求1中步骤(1)所述的“结核分枝杆菌体外培养扩增”，其特征是结核分枝杆菌接种在固体培养基，如(不仅限于)罗氏培养基，或液体培养基，如(不仅限于)苏通培养基，于37℃培养1至2周以上。

3.根据权利要求1中步骤(1)和(2)所述“荧光染料标记”，其特征是应用活细胞荧光染料以合适的浓度标记结核杆菌。活细胞荧光染料如(但不仅限于)：(1)荧光素二醋酸酯(Fluorescein Diacetate，FDA)，标记终浓度为0.01μg/ml至5μg/ml，合适终浓度为0.1μg/ml至0.5μg/ml。(2)2，7双(2羧乙酸)5(和6)羧基荧光素乙酰甲酯[2′，7′-bis-(2-carboxyethyl)-5-(and-6)-carboxyfluorescein，acetoxymethyl ester(BCECF-AM)]，标记终浓度为0.02μg/ml至10μg/ml，合适终浓度为0.2μg/ml至1.0μg/ml。标记方法的特征是上述荧光染料与结核分枝杆菌在4℃至37℃共同孵育5至60分钟，孵育的合适温度是37℃，时间是20至30分钟。

4.根据权利要求1中步骤(1)所述的“用流式细胞仪检测荧光标记率”，其检测方法的特征是用流式细胞仪检测荧光阳性结核杆菌，具体方法是先在前散射光和侧散射光二维点图中，圈定结核杆菌区域，然后再在有第1荧光通道(FL1)的二维点图中，以结核杆菌区域设门，检测荧光阳性的结核杆菌比例，达到90％或以上者作为荧光标记结核杆菌。

5.根据权利要求1及其步骤(2)至(4)所述的“吞噬细胞”，是指含有吞噬细胞的标本，包括但不仅限于：外周血标本，从外周血或淋巴器官或其他器官组织分离或纯化获得的吞噬细胞(如中性粒细胞或单核细胞)标本，或培养的具有吞噬活性的细胞系(如THP-1细胞等)。

6.根据权利要求1中的步骤(2)所述的“荧光染料标记的结核分枝杆菌与吞噬细胞置于37℃共同孵育1至90分钟或更长时间”，其特征是共同孵育时间因不同的吞噬细胞类型而有所不同，就中性粒细胞而言，其合适孵育时间是5至20分钟。

7.根据权利要求1中步骤(2)所述的“离心洗涤除去未被吞噬的结核分枝杆菌”，其特征是将吞噬结核杆菌的吞噬细胞用离心机离心，离心速率500至2000r/min，时间5至15分钟，合适的转速和时间分别为1000至1800r/min，和5至10分钟。弃上清后，再加缓冲液(如PBS)重复离心洗涤1次，以弃去未被吞噬的荧光标记的结核分枝杆菌。如为血液标本，在离心之前加氯化铵溶血剂溶血，以去除红细胞。

8.根据权利要求1中步骤(3)所述的“吞噬结核分枝杆菌的吞噬细胞置于37℃孵育0至90分钟或更长时间”。其特征是其时间根据不同吞噬细胞类型而异，就中性粒细胞而言，合适的孵育时间是10至60分钟。

9.根据权利要求1中步骤(3)所述的“裂解吞噬细胞，释放被出的结核分枝杆菌”，其裂解吞噬细胞的方法的特征是应用(但不仅限于)低渗和溶解细胞膜等原理裂解细胞，采用的方法例如(但不仅限于)：(1)用2至10倍体积的蒸馏水处理1至10分钟，合适的体积是4至5倍，合适的时间是2至3分钟。(2)先加2至10倍体积的1％去氧胆酸钠，作用3至5分钟后，再加2至4倍体积的蒸馏水作用2至5分钟，即可裂解吞噬细胞释放出结核分枝杆菌，用于流式细胞仪的检测。

10.根据权利要求1中步骤(4)所述的“用流式细胞仪检测”和“计算吞噬细胞对结核分枝杆菌的杀伤率”的方法，其特征是可按照以下2种方法计算吞噬细胞对结核杆菌(Mtb)的杀伤率；

(1)检测荧光阴性和荧光阳性Mtb的比例，按以下公式计算：

(2)测定杀伤组(37℃孵育不同时间)和对照组(孵育0分钟)Mtb的平均荧光强度(MIF)，按以下公式计算：

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