CN101440369A - 一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法和应用，属于生物工程技术领域。首先，构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌，接着构建高效表达cZOT的基因工程菌，制备获得TrxA－cZOT融合蛋白，纯化得cZOT。本发明与已有技术相比较提高了cZOT的表达量，降低了生产成本；只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的TrxA－cZOT融合蛋白，纯化步骤简单，得率高。
Description
技术领域
本发明涉及一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法和应用，属于生物工程技术领域。
背景技术
随着生物技术的日益发展，越来越多的具有生理活性的多肽或蛋白质分子被发现，多肽和蛋白类药物在现代疾病预防和治疗中作用日益突出。至今，美国已经开发生物多肽药物300多个。但是，由于多肽分子难以透过生物膜，加之体内外稳定性差、体内生物利用度低，一般只能注射给药。口服剂型易被患者接受，是多肽药物非注射剂型的主要发展方向。相对于注射给药，口服是一种方便并且病人依从性比较高的给药方式，对于需要长期给药的病人尤其方便。蛋白多肽类药物目前已有个别品种实现了口服给药，如口服干扰素、胸腺肽、脑蛋白水解物等。但是，由于药物本身的结构以及人体的吸收问题，蛋白多肽类药物口服生物利用度很低。通常情况下，蛋白多肽类药物分子量大，难以通过消化系统的生物膜屏障；胃酸、消化道酶等对蛋白多肽类药物有破坏、降解或聚合作用，严重影响其稳定性。因此，提高口服生物利用度是蛋白多肽类药物口服给药的关键。近年来，蛋白多肽类药物的口服给药技术研究不断取得新进展，为进一步发挥其功效提供了新的技术支撑。
霍乱弧菌封闭带毒素Zonula Occludens Toxin，简称ZOT，是美国科学家Fasano等1991年采用Ussing Chambers分析法测定CT阴性和CT阳性霍乱弧菌培养物上清液时发现的、由399个氨基酸组成的一种毒素。它通过影响细胞间紧密连接(tight junction，或称封闭带)，增加小肠粘膜的通透性。ZOT能可逆地调节紧密连接的结构，因而它能影响生物大分子物质的吸收。但是封闭带毒素为大分子，易形成包涵体，难以通过基因工程技术获得可溶性蛋白，为研究其生物学功能增加了难度。缺失的霍乱弧菌封闭带毒素(deletion Zonula OccludensToxin，cZOT)，是Marinarosaria等通过缺失ZOT基因不同区域，分析发现的封闭带毒素活性中心，是封闭带毒素的265～399位氨基酸片断，具有封闭带毒素的完整生物学功能，能够改变上皮细胞的通透性，促进蛋白、激素等大分子药物由黏膜吸收，增强可溶性蛋白的生物学活性，而且这一作用可逆、安全，不损伤组织，从而可能成为一种新颖、安全的多肽口服佐剂。由于其独特的生物学性质，使用cZOT有可能开辟一种新颖的生物大分子药物口服给药新途径，给制药工业及疫苗工业展示了光明的前景.
但是，cZOT有135个氨基酸，分子量大，目前技术条件下无法通过化学合成的方法获得；即使能够化学合成，其合成成本高，纯化困难。因此，需要一种高效廉价的基因工程制备cZOT的方法。同时，由于该基因稀有密码子含量较高(占30％)，而常规的大肠杆菌BL21(DE3)不提供稀有密码子的翻译，所以cZOT在BL21(DE3)中表达含量较低。因此，我们利用Rosetta gami(DE3)对稀有密码子的偏爱性，选择大肠杆菌Rosetta gami(DE3)进行诱导表达，以提高cZOT的表达量。
发明内容
本发明的目的是提供一种cZOT的高效表达方法，以期利用该方法大规模低成本地发酵生产cZOT。
本发明要解决的一个技术问题是提出一种高效表达cZOT的基因工程菌。该基因工程菌是携带重组质粒的大肠杆菌Rosetta gami(DE3)，所述重组质粒是含cZOT基因的质粒pET-32a(+)。具体分以下几个步骤：
1.构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌
将cZOT基因按照：SD序列-纯化标签His·Tag-硫氧还蛋白(Trx)-蛋白酶(肠激酶EK)酶切位点-cZOT基因-终止密码子(TAA)的碱基序列设计上游引物和下游引物，PCR得到该片断；用两种限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切该片断，得到cZOT基因；用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述两种基因片段，得到重组质粒pET-32a(+)-cZOT；
2.构建高效表达cZOT的基因工程菌
将重组质粒pET-32a(+)-cZOT转化到大肠杆菌Rosetta gami(DE3)感受态细胞中，在含有氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)中任意1-4种抗生素的LB固体培养基上培养16-20h，挑取阳性转化子，经测序验证，获得高效表达cZOT的基因工程菌；
3.制备获得TrxA-cZOT融合蛋白
将筛选出的高产菌株在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.6mM～1.0mM的IPTG诱导表达4～8小时，生产和积累可溶性表达的TrxA-cZOT融合蛋白；离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破碎仪破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集TrxA-cZOT融合蛋白组分；
4.制备获得cZOT
用肠激酶(EK)酶解TrxA-cZOT融合蛋白，23℃～25℃下裂解16～18h，冰浴5min，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到cZOT。
本发明与已有技术相比较具有以下显著优点：(1)通过基因工程技术的方法生产cZOT，提高了cZOT的表达量，降低了生产成本；(2)只要进行一次亲和层析，便可从发酵液中得到较纯的TrxA-cZOT融合蛋白，纯化步骤简单；(3)只要进行一次酶解便能得到cZOT，得率高。
附图说明
图1是重组质粒pET-32a(+)-cZOT的构建示意图。
图2是cZOT的分离纯化和酶切结果图，其中1为标准蛋白质分子质量；2为携带TrxA-cZOT的融合蛋白；3为TrxA-cZOT融合蛋白经EK酶解；4为纯化后的cZOT。
图3是cZOT促进胰高血糖素样肽-1(GLP-1)降血糖实验。
图4是cZOT促进胰岛素(insulin)降血糖实验。
图5是cZOT促进血小板生成素(TPO)生成血小板实验。
具体实施方式
下面结合附图，通过实施例，进一步说明本发明。说明书和实施例中凡未注明具体条件的实验方法，按常规条件进行。
实施例1 构建大肠杆菌(E.coli)表达载体pET-32a(+)-Trx-cZOT
第一步，cZOT DNA序列的扩增
上游引物cgggtaccga cgacgacgac aaggagcctc agtc
下游引物ggaattctca aaatatacta tttagtcctt ttttatc
通过热变性法从霍乱弧菌口服疫苗中提取基因组DNA，以该基因组DNA为模板，加入Pyrobest DNA聚合酶和上下游引物，进行PCR扩增，反应产物用DNA GelExtraction Kit回收，获得cZOT DNA片段；
第二步，含有cZOT基因的工程菌构建
用Kpn I和EcoR I双酶切cZOT，纯化回收大片段；用同样的两种酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段；连接上述回收的两个片段，得到重组质粒pET-32a(+)-cZOT，将重组质粒pET-32a(+)-cZOT转化到大肠杆菌Rosetta gami(DE3)，制得含cZOT DNA序列的基因工程菌，测序证实该基因工程菌含完整的重组cZOT DNA基因片段；
下面是重组质粒pET-32a(+)-cZOT的测序结果：
Query 67
TCAAAATATACTATTTAGTCCTTTTTTATCATTTTCTGTTTTTATCGGTAAACCCCGTTT 126
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 76
TCAAAATATACTATTTAGTCCTTTTTTATCATTTTCTGTTTTTATCGGTAAACCCCGTTT 135
Query 127
CACTTCTACCCACAGCGCTTGCGCTGCAAAGGTATCGAACACCACAAAGTGATTGAAATC 186
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 136
CACTTCTACCCACAGCGCTTGCGCTGCAAAGGTATCGAACACCACAAAGTGATTGAAATC 195
Query 187
CGGTAACGGTAGCACCTTGTAGCGGTAGCTCGATGCAAACAGCTCTGTTGGGACGCTGCC 246
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 196
CGGTAACGGTAGCACCTTGTAGCGGTAGCTCGATGCAAACAGCTCTGTTGGGACGCTGCC 255
Query 247
ACTCTCGGTTTCAAAAAACACTGTAAGCGTATCCTTGTAAATGTGATGACCTGTCGCCCA 306
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 256
ACTCTCGGTTTCAAAAAACACTGTAAGCGTATCCTTGTAAATGTGATGACCTGTCGCCCA 315
Query 307
TAGACCACGATAAGGAATGTCCAAATTGTCTACGAGGCGATAACGCTCATCACCAACAGT 366
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Sbjct 316
TAGACCACGATAAGGAATGTCCAAATTGTCTACGAGGCGATAACGCTCATCACCAACAGT 375
Query 367
GACAAAACCATCTTGGACACAAAGCCGACCAATACAAAAACCAAAAGACGCAGGAGCAAC 426
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Sbjct 376
GACAAAACCATCTTGGACACAAAGCCGACCAATACAAAAACCAAAAGACGCAGGAGCAAC 435
Query 427 CGCCTTGCTCCCGACAGCATTCCCAACAGTAGCCTTTGACTGAGGCTC 474
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Sbjct 436 CGCCTTGCTCCCGACAGCATTCCCAACAGTAGCCTTTGACTGAGGCTC 483
实施例2 cZOT的基因工程制备方法，即用所述的基因工程菌生产cZOT。下述的亲和层析介质为NTA-0树脂，购自Novagen公司，下述的肠激酶(EK)，购自上海新生源生物医药有限公司。
第一步液体培养
将实施例1中构建好的基因工程菌接种于20ml含氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)中任意1-4种抗生素的LB液体培养基中，37℃，210rpm，培养至OD600nm＝1.0~1.2。按照5％体积将上述菌液接种于400ml LB培养基中，培养至OD600nm＝0.6~1.0。加终浓度为0.6mM~1.0mM的IPTG诱导表达4h~8h。将摇瓶冰浴5min，7000rpm，4℃，离心5min收集菌体。加20mlIDA-0Buffer重悬菌体，同时加入终浓度为1mM的PMSF。超声波破碎菌体，离心收集上清，SDS-PAGE证实cZOT在大肠杆菌中为可溶性表达。
第二步纯化TrxA-cZOT
上清用亲和层析柱SNBC 3S NTA Resin分离纯化得融合蛋白TrxA-cZOT。用5倍NTA体积的IDA-0 Buffer平衡NTA Resin。将样品加到NTA Resin中，分别用2倍NTA体积的IDA-0，IDA-20，IDA-40，IDA-60，IDA-80，IDA-100，IDA-200，IDA-500，5倍NTA体积的IDA-1000 Buffer洗脱，分别收集穿透部分和各洗脱部分的洗脱液，用SDS-PAGE分析蛋白质洗脱情况。经SDS-PAGE分析含有融合蛋白的TrxA-cZOT组分的洗脱液，用截流分子量为5KD的超滤管脱盐浓缩，得到的TrxA-cZOT融合蛋白具有较高的纯度。
第三步制备cZOT
融合蛋白TrxA-cZOT用EK蛋白酶酶切。按照每微升EK可以切开150μg融合蛋白的剂量，23℃~25℃酶切16h～18h，，得到了TrxA和cZOT两条条带。酶切产物用亲和层析柱SNBC 3S NTA Resin分离。收集穿透峰和IDA-0的洗脱峰。经SDS-PAGE分析含有cZOT的洗脱液，用5KD的超滤管脱盐浓缩，，得到的cZOT具有较高的纯度。
实施例3 cZOT在胰高血糖素样肽-1(GLP-1)口服给药中的应用
实验材料与方法：
雌性健康昆明小鼠(清洁级，上海复旦大学医学院动物中心提供)；
50％葡萄糖溶液，0.9％NaCl溶液，GLP-1，TrxA-cZOT，cZOT；
血糖测试仪(上海新立医疗器械有限公司)；
雌性健康昆明小鼠禁食过夜，分为4组(n＝8)。1，生理盐水对照组；2，GLP-1口服对照组；3，TrxA-cZOT+GLP-1给药组；4，cZOT+GLP-1给药组。
TrxA-cZOT+GLP-1给药组灌胃给予200μl50％葡萄糖溶液、800nmol/kgTrxA-cZOT和500nmol/kgGLP-1，记此时为零时刻。分别于30、60、90、120分钟进行小鼠尾静脉取血10μl，用血糖测试仪测定血糖浓度。cZOT+GLP-1给药组灌胃给予相同剂量的葡萄糖、cZOT和GLP-1；生理盐水对照组只灌胃葡萄糖和生理盐水；GLP-1对照组只灌胃葡萄糖和GLP-1，按照相同时间间隔测定血糖。
与对照组相比，在给药后30～120分钟，给药组都能够降低小鼠血糖，说明按本发明方法制备出的TrxA-cZOT、cZOT具有促进GLP-1口服吸收的生物学活性。
实施例4 cZOT在胰岛素(Insulin)降血糖实验中的应用
采用雌性健康昆明鼠，注射200mg/kg四氧嘧啶建立糖尿病模型，7天后禁食12h，血糖>11.1mmol/l者，确认为成模鼠。按照实施例3将模型鼠分为4组：1，生理盐水对照组；2，胰岛素口服对照组；3，TrxA-cZOT+胰岛素(Ins)给药组；4，cZOT+胰岛素(Ins)给药组。
TrxA-cZOT+Ins给药组灌胃给予600nmol/kg TrxA-cZOT和600nmol/kgIns，分别于30、60、90、120分钟进行小鼠尾静脉取血10μl，用血糖测试仪测定血糖浓度。cZOT+Ins给药组灌胃给予相同剂量的cZOT和Ins；生理盐水对照组只灌胃生理盐水；Ins对照组只灌胃Ins，按照相同时间间隔测定血糖。
与对照组相比，在给药后90分钟内，给药组都能够降低小鼠血糖，说明按本发明方法制备出的TrxA-cZOT、cZOT具有促进Ins口服吸收的生物学活性。
实施例5 cZOT在血小板生成素(TPO)促进血小板生成实验中的应用
采用雄性健康昆明鼠，尾静脉取血5μl，置于195μl血小板计数液中稀释，37℃孵育30min，相差显微镜下计数血小板个数，以此为基础值分为2组：1，TPO口服对照组；2，cZOT+TPO给药组。给药组第1~5天每天灌胃700nmol/kgcZOT和5mg/kgTPO一次；TPO对照组灌胃5mg/kg TPO，其他同给药组。分别于第3、4、5、7、9天进行血小板计数。
连续给药3天起，与对照组相比，给药组能够促进小鼠血小板的生成，说明按本发明方法制备出的cZOT具有促进TPO口服吸收的生物学活性。
序列表副本
SEQUENCE LISTING
<110>华东师范大学
<120>一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方式及应用
<130>Zonula occludens toxin structure-function analysis.Identification of the fragment biologically active on tightjunctions and of the zonulin receptor binding domain.
<140>2008100351981
<141>2008-03-26
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>408
<212>DNA
<213>Vibrio cholerae
<400>1
Claims (5)
1.一种缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法，其特征在于包括以下几个步骤：
第一步：构建含cZOT基因的大肠杆菌(E.coli)基因工程菌
采用下列上游引物和下游引物克隆cZOT基因：
上游引物 cgggtaccga cgacgacgac aaggagcctc agtc
下游引物 ggaattctca aaatatacta tttagtcctt ttttatc
PCR得到该片断；用限制性内切酶Kpn I和EcoR I双酶切该片断，得到cZOT基因；用同样两种限制性内切酶双酶切质粒pET-32a(+)，纯化回收大片段，连接上述两种基因片段，得到重组质粒pET-32a(+)-cZOT；
第二步：构建高效表达cZOT的基因工程菌
将重组质粒pET-32a(+)-cZOT转化到大肠杆菌Rosetta gami(DE3)感受态细胞中，在含有抗生素的LB固体培养基上培养16-20h，挑取阳性转化子，获得高效表达cZOT的基因工程菌；
第三步：制备获得TrxA-cZOT融合蛋白
将筛选出的高产菌株在LB液体培养基中培养至OD600nm＝0.6～0.8时，加入终浓度为0.6mM～1.0mM的IPTG诱导表达4～8小时，生产和积累可溶性表达的TrxA-cZOT融合蛋白；离心收集菌体，用缓冲液重悬菌体，超声破碎仪破菌后，离心收集上清，进行亲和层析，收集TrxA-cZOT融合蛋白组分；
第四步：制备获得cZOT
用肠激酶(EK)酶解TrxA-cZOT融合蛋白，23℃～25℃下裂解16～18h，冰浴5min，终止反应，再次进行亲和层析，收集穿透峰，冷冻干燥，得到cZOT。
2.如权利要求1所述的缺失的霍乱弧菌封闭带毒素的表达方法，其特征在于抗生素的LB固体培养基为氨苄青霉素(100μg/ml)、卡那霉素(15μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)、氯霉素(34μg/ml)中任意1种或者一种以上。
3、根据权利要求1制备的cZOT蛋白在制备胰高血糖素样肽-1(GLP-1)口服给药中的应用。
4、根据权利要求1制备的cZOT蛋白在制备cZOT蛋白在胰岛素(insulin，Ins)口服给药中的应用。
5、根据权利要求1制备的cZOT蛋白在制备cZOT蛋白在血小板生成素(TPO)口服给药中的应用。
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2008
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| WD01 | Invention patent application deemed withdrawn after publication |
Open date: 20090527 |