CN106497898B

CN106497898B - 表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法

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Publication number: CN106497898B
Application number: CN201611167593.6A
Authority: CN
Inventors: 陈小强; 钱晓国
Original assignee: Fengning Ping'an High Tech Industrial Co ltd
Current assignee: Fengning Ping'an High Tech Industrial Co ltd
Priority date: 2016-12-16
Filing date: 2016-12-16
Publication date: 2021-04-16
Anticipated expiration: 2036-12-16
Also published as: CN106497898A

Abstract

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法。本发明提供了编码菊粉内切酶的DNA分子、质粒载体、表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法，本发明表达获得的重组菊粉内切酶的活性高达1500U/mL～1800U/mL，表达量可达9g/L；存放10天后仍有80％的酶活力得以保存。

Description

表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法。

背景技术

菊芋的地下块茎富含菊粉。菊粉是一类果糖通过β-2，1键连接，末端带有一个葡萄糖分子的多聚果糖。菊粉经菊粉内切酶水解，可得到低聚果糖。低聚果糖(FOS)进入人体后不能被唾液和消化酶分解，直接通过胃和小肠到达大肠，被大肠内的有益菌主要是双歧杆菌所利用，使双歧杆菌得到大量繁殖，同时产生有机酸如醋酸、丙酸、丁酸和乳酸等。抑制肠内沙门氏菌等腐败菌的生长，从而起到防止便秘、降低血脂和胆固醇、促进矿物质的吸收和肠内有毒废物的排除、提高免疫力等一系列作用。而且其本身由于极难被人体吸收，故属于低热量难消化、低龋齿性的可溶性膳食纤维。

低聚果糖的产业化生产不到20年历史，但以其低热值及优越的生理功能成为近十年来国际食品市场上广泛流行的功能性食品基料，应用范围多达500余种食品。目前国内低聚果糖的生产企业(包括上市企业-山东保龄宝)全部采用蔗糖作为原料来生产。由于工艺特性的限制，其初级低聚果糖产品的纯度只能达到50％左右，含有一半左右的葡萄糖、蔗糖和少量果糖，限制了控糖人群的应用。若需得到较高纯度的低聚果糖，则需应用膜分离法或工业色谱柱技术来分离，极大的提高了企业固定投入和生产成本。

国际上比利时的RafinerieTirlemontoise S.A.和Consucra公司已有以菊粉为原料生产的低聚果糖，商品名为Raftilose和Fibruline。我国从九十年代初开始产菊粉酶微生物菌种的筛选。但至今没有实现大规模的以菊粉为原料制造高纯度低聚果糖的工业化生产。其主要原因即是缺少一种成熟的能低成本大量制备菊粉内切酶的技术。国内有关单位也有关于提高菊粉内切酶表达量的相关报道，但所产生的酶活性一般都小于100u/ml，难以有效地应用于工业生产。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法，该菌株及方法制得的菊粉内切酶的酶活性可达1500U/mL～1800U/mL。

本发明提供了编码菊粉内切酶的DNA分子，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

本发明提供的编码菊粉内切酶的DNA分子来自黑曲霉基因Inu2(AJ006951)，根据宿主细胞进行改造，更适合酵母菌的表达(野生型与SEQ ID NO:1比较如图5)，从而获得活性更高的菊粉内切酶，SEQ ID NO:l所示核苷酸序列长为1485bp，所表达的菊粉内切酶的氨基酸序列与黑曲霉的菊粉内切酶一致。

本发明还提供了一种表达载体，包括骨架和SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子。

本发明提供的表达载体的骨架为pPIC9K。

本发明提供的表达载体中SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子的插入位点为EcoRI与Not I酶切位点之间。

本发明构建的载体能够将SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子插入毕赤酵母GS115的his4区，从而使SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的DNA分子能够顺利的表达。所述表达载体在转化入酵母菌前，转化入大肠杆菌DH5α进行扩增和保存。

本发明还提供了一种工程菌，其为转化本发明所述的表达载体的酵母菌。

在本发明实施例中，酵母菌为毕赤酵母GS115。

所述酵母菌为毕赤酵母GS115时，所述转化采用LiCl法。

所述转化前，表达载体经线性化，所述线性化的酶SalI。

所述转化后，采用MD/-His固体培养基筛选阳性转化子；每升MD/-His固体培养基中包括葡萄糖20g，YNB 13.4g，生物素0.4mg；琼脂20g；筛选培养的温度为28℃。倒置培养。

经培养，MD固体培养基上生长的转化子经DNA测序，PCR检测，验证成功插入SEQ IDNO:1所示核苷酸序列的DNA分子。

本发明还提供了重组菊粉内切酶的制备方法，其为发酵本发明提供的工程菌。

本发明中，发酵前还包括种子活化的步骤。所述活化采用BMGY培养基或BMDY培养基。

发酵的培养基为BMDY培养基或BMMY培养基；发酵的诱导剂为甲醇。

每升BMGY培养基中含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，甘油10g，生物素0.4mg。

每升BMMY培养基中含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，甲醇10g，生物素0.4mg。

每升BMDY培养基中含酵母提取物15g，蛋白胨30g，YNB 13.4g，葡萄糖40g，生物素0.4mg，硫酸铵2g。

本发明实施例中，发酵包括培养和诱导的步骤；

培养的温度为28℃，搅拌速度为150rpm～300rpm；

诱导的温度为28℃，搅拌速度为200rpm～450rpm。

所述发酵过程pH值为6.0。

当采用BMDY培养基作为发酵培养基时，所述发酵24h后开始诱导。即培养的时间为24h。24h后添加诱导剂甲醇。

随着甲醇的添加，发酵72h～120h，菊粉内切酶的活力达到最高。即诱导48h～96h后，菊粉内切酶的活力达到最高。优选的，诱导72h后菊粉内切酶的活力最高。

甲醇的添加采用流加的方式，每24h加入甲醇至甲醇的体积占发酵培养基的1％。

当采用BMMY培养基作为发酵培养基时，因BMMY培养基中即含有甲醇，从培养开始便开始诱导，28℃，共发酵7天。

发酵后，菊粉内切酶存在于发酵液的上清液中，通过纯化步骤可以将其纯化。

所述纯化的方法将发酵上清液透析后经DEAE-Sepharose阴离子柱进行离子交换，用含0.3M/L的NaCl Buffer对目的蛋白进行洗脱，再经Sephadex G-75柱层析收集活性单峰，对洗脱液透析后进行冷冻干燥。

本发明提供制备方法制备的菊粉内切酶。

本发明还提供了一种低聚果糖的制备方法，其为以本发明提供的制备方法制备的菊粉内切酶水解菊粉。

一些实施例中，制备低聚果糖采用本发明提供的工程菌的培养液。

制备低聚果糖采用培养液中纯化获得的菊粉内切酶

本发明提供了编码菊粉内切酶的DNA分子、质粒载体、表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法，本发明表达获得的重组菊粉内切酶的活性高达1500U/mL～1800U/mL，表达量可达9g/L；存放10天后仍有80％的酶活力得以保存。

附图说明

图1示果糖含量标准曲线；

图2示小试摇瓶发酵Inu2活力曲线；

图3示中试发酵罐条件下Inu2酶活力和菌体湿重占比；

图4示Inu2酶活力衰减情况；其中，图4-a示Inu2酶活力衰减情况；图4-b示Inu2酶残余活力百分率；

图5示野生型Imu2密码子与SEQ ID NO:1比较。

具体实施方式

本发明提供了表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

本发明采用的试材皆为普通市售品，皆可于市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本发明：

实施例1菊粉内切酶Inu2表达质粒的构建

由上海捷瑞生物工程有限公司合成(捷瑞基因编号X3556G)SEQ ID NO:1所示核苷酸序列，两端两头含有EcoRI和NotI酶切位点。其中，EcoRI位于5’端，Not I位于3’端。另在3’端连接8个bp的保护碱基，序列为CCCCAAAA。全基因合成后的片段构建在pGH质粒中，大小为1507bp，载体为Amp抗性。然后转化DH5α感受态细胞；得到的转化子以PCR检测是否能扩增出1.5kb的条带；然后提取质粒DNA，酶切验证质粒是否含有1.5kb片段插入；最后，选取克隆的质粒DNA进行序列测定，结果显示所选取的克隆中内切酶基因的DNA序列完全正确。至此，得到了含有SEQ ID NO:1所示核苷酸序列的质粒pGH/Inu2。

实施例2菊粉内切酶Inu2毕赤酵母表达菌株的构建和筛选

抽提全基因合成的质粒后，用限制性内切酶EcoRI和NotI做双酶切，回收1499bp的Inu2片段，并连入pPIC9K质粒，构建成pPIC9K/Inu2质粒。测序正确后，用Sal I限制性内切酶单切载体做线性化，并用LiCl法转化毕赤酵母感受态细胞GS115。后涂布于MD/-His平板(每升含葡萄糖20g，YNB 13.4g，生物素0.4mg，琼脂20g)，28℃培养至长出转化子。从MD/-His平板上挑取生长较好的毕赤酵母转化子的菌体少许，在含有3mg/ml G418的YPD划线培养3天。生长良好的克隆即为多拷贝整合了目的基因的菌种，也即候选的菌种。

实施例3菊粉内切酶Inu2在酵母中的小试诱导表达

挑取10个候选的单克隆接种于50mL BMGY(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB13.4g，甘油10g，生物素0.4mg)，28℃，200rpm培养过夜，获得种子液。

分别取2mL种子液接入50mL BMMY(每升含酵母提取物10g，蛋白胨20g，YNB 13.4g，甲醇10g，生物素0.4mg)，28℃，200rpm发酵7天。

果糖末端的还原性OH可以把DNS还原成棕红色的3-氨基-5硝基水杨酸。果糖含量与反应后体系520nm吸光光度值成正比，因此可通过检测吸光值来测定溶液果糖的含量。以果糖为底物，利用表1结果来制作标准曲线(如图1)。

表1标准曲线实验数据

	0	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
												水	0.6	0.57	0.54	0.51	0.48	0.45	0.42	0.39	0.36	0.33	0.30
DNS	0.45	0.45	0.45	0.45	0.45	0.45	0.45	0.45	0.45	0.45	0.45
												果糖	0	0.03	0.06	0.09	0.12	0.15	0.18	0.21	0.24	0.27	0.30
OD<sub>520</sub>	0	0.1	0.6	1.2	1.65	2.2	2.72	3.26	3.7	4.26	4.76

发酵后，使用稀释100倍后的上清做酶解反应，检测采用果糖作为底物，以果糖为底物，得到各单克隆发酵菌液反应产物的OD₅₂₀。，根据此OD₅₂₀值可以从果糖标准曲线上得到发酵上清液用于酶解反应，可以增加的还原单糖(假设全是果糖)的量约为A＝0.12mg。酶活力的计算公式为U＝A*1000*总稀释倍数/[180(分子量)*10分钟(时间)]＝3667*A(u/ml)。

各克隆测得OD₅₂₀值如表2：

表2各克隆发酵上清液进行酶解反应后OD₅₂₀

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											OD<sub>520</sub>	1.50	1.58	1.42	1.40	1.45	1.38	1.29	1.44	1.32	1.27
酶活力(U/ml)	385	421	371	364	375	360	342	373	345	338

根据表2，各克隆的酶活性无显著性差异。

实施例4菊粉内切酶Inu2在酵母中的小试诱导表达

挑取10个候选的单克隆接种于100mL BMDY(每升含酵母提取物15g，蛋白胨30g，葡萄糖40g，生物素0.4mg)，28℃，200rpm培养过夜，获得种子液。

分别取2mL种子液接入100mL BMDY，28℃，200rpm培养过夜。24小时以后开始加入1％甲醇诱导，以后每天补加1％甲醇，发酵7天。

以实施例3提供的方法和标准曲线测定各单克隆的发酵所得上清液的OD₅₂₀并计算酶活力，

表3各克隆发酵上清液进行酶解反应后OD₅₂₀

编号	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
											OD<sub>520</sub>	1.18	1.20	1.14	1.15	1.16	1.12	1.12	1.11	1.12	1.13
酶活力(U/ml)	314	320	302	304	308	297	297	294	297	299

其中，克隆2发酵酶活力曲线如图3。结果表明，在发酵96h的时候，酶活力达到最高，各克隆的酶活力无显著性差异。

实施例5菊粉内切酶Inu2在酵母中的中试生产工艺研究

选取一个单克隆接入BMDY培养液中，28℃，200rpm摇菌过夜后作为种子液，然后按照1:100的体积比转接入6L的BMDY中，28℃，600rpm发酵24h，而后每24h加入1％甲醇，并在不同的时间点取样测定上清液中酶活力(图3)。结果显示，中试条件下，在发酵66h的时候，该内切酶活力达到最高值1655U/ml；菌体湿重占比为15％，表达量可达9g/L。

实施例6菊粉内切酶Inu2发酵上清液酶活力衰减的研究

将实施例5发酵后的新鲜上清液放入4℃冰箱，每隔24h重新对酶活力进行测定(如图4)。结果显示，当上清液保存10天之后，仍有80％的酶活力得以保存。

以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

SEQUENCE LISTING

<110> 丰宁平安高科实业有限公司

<120> 表达重组菊粉内切酶的基因工程菌株及重组菊粉内切酶的制备方法

<130> MP1621757

<160> 1

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1485

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgcaatcta atgattaccg tccatcatac cacttcacac cggaccaata ctggatgaat 60

gagccaaatg gcttgattaa gatcggatcc acctggcact tgttctttca acacaatccg 120

acggctaatg tatggggtaa tatatgttgg gggcacgcta cgagcaccga cctgatgcac 180

tgggcacaca agcccactgc cattgcggac gagaacggag tcgaagcgtt taccggtaca 240

gcttattatg acccaaacaa cacctctggt cttggggact cggcaaaccc accctatttg 300

gcttggttca caggttatac cacttcaagc caaacacaag accaacgcct ggctttcagt 360

gtggataacg gggcgacgtg gaccaaattt caaggcaatc ccatcatatc aactagccaa 420

gaagcaccac atgacataac gggtggtctc gagagtaggg acccaaaggt attcttccat 480

cgccaatcgg ggaattggat catggttctc gcccatggcg ggcaagacaa gttgtctttc 540

tggacgtctg cagacaccat aaactggaca tggcaaagtg acctgaagtc cacctcgatc 600

aacggtctat cgtccgatat tacagggtgg gaagtccccg acatgtttga actcccggtt 660

gaaggcactg aggagaccac gtgggtggtg atgatgacgc cggctgaagg atccccagct 720

ggtggtaatg gggtcttagc tatcaccggt tcttttgacg ggaagagttt tacggcagac 780

cccgtcgacg cttcgaccat gtggctggac aacgggagag atttcgacgg cgctctgagc 840

tgggtgaacg tgccagcgtc cgacggacgg cggattatcg ctgctgtcat gaatagctac 900

ggttccaacc cgccaacaac cacctggaag gggatgctct cctttccccg gacgttgtcg 960

ctcaagaaag ttggtacgca acaacacttt gttcaacaac cgatcacaga gttggacaca 1020

atcagtacca gtctgcaaat actagcaaac caaaccatta cccctggcca aacattgttg 1080

tcatcgattc ggggaactgc tctcgacgtt cgagttgctt tttaccctga tgctggttcg 1140

gttctgtccc tcgccgtccg aaagggtgct tcggagcaaa cagtcattaa gtacacccaa 1200

tcagacgcca cattgtcggt tgatcgaaca gagagtggag acatctcgta tgacccggct 1260

gcaggtggtg tccataccgc caagttggaa gaggacggca ccggactggt ttccatccgg 1320

gtgttggtgg acacgtgttc tgtagaggtt tttggtggac aaggagaagc cgtcatttcc 1380

gacctcatct tcccgagtga cagttctgac ggtttggctt tggaggtaac tggcggaaat 1440

gcagtgctgc aatcggtgga cgtgcggagt gtttcacttg aatga 1485

Claims

1.一种编码菊粉内切酶的DNA分子，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.一种表达载体，其特征在于，包括骨架和权利要求1所述的DNA分子。

3.根据权利要求2所述的表达载体，其特征在于，所述骨架为pPIC9K。

4.一种工程菌，其特征在于，其为转化权利要求2或3所述表达载体的酵母菌。

5.根据权利要求4所述的工程菌，其特征在于，所述酵母菌为毕赤酵母GS115。

6.重组菊粉内切酶的制备方法，其特征在于，发酵权利要求4或5所述的工程菌。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵的培养基为BMDY培养基；发酵的诱导剂为甲醇。

8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述发酵包括培养和诱导的步骤；

所述培养的温度为28℃，搅拌速度为150rpm～300rpm；

所述诱导的温度为28℃，搅拌速度为200rpm～450rpm。