JP2013507921A

JP2013507921A - 宿主細胞抗原に対する抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くタンパク質の、ピチア・パストリスにおける製造方法

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Publication number: JP2013507921A
Application number: JP2012534262A
Authority: JP
Inventors: ボブロビツシユ，ピヨートル; ゴマテイナヤガム，スジヤータ; ハミルトン，ステフアン; リー，ホイジユエン; セスラマン，ナタラジヤン; スタツドハイム，テランス・エイ; ビルト，ステフアン
Original assignee: Merck and Co Inc
Current assignee: Merck and Co Inc
Priority date: 2009-10-16
Filing date: 2010-10-11
Publication date: 2013-03-07
Also published as: CN104031961A; BR112012008862A2; AU2010307098A1; CN102648286A; US20140200180A1; EP2488657A1; MX2012004381A; WO2011046855A1; RU2012120102A; US20120232007A1; EP2488657B1; KR20120084734A; ES2589655T3; CA2776392A1; US9139632B2; EP2488657A4

Abstract

宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くタンパク質および糖タンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を記載する。特に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ―マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１、３および４活性から選択される少なくとも１つの活性を示さない組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株を使用して、組換えタンパク質および糖タンパク質を製造する製造方法を記載する。検出可能なα−マンノシダーゼ耐性β−マンノース残基を欠き、したがって、宿主細胞抗原に対する抗体に対する交差結合活性を欠くタンパク質および糖タンパク質を、これらの組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株は産生し得る。更に、宿主細胞抗原に対する抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く二シアル酸化ヒトエリスロポエチンの、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を記載する。

Description

（１）発明の分野
本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くタンパク質および糖タンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法に関する。特に、本発明は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ―マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１、３および４活性からなる群から選択される少なくとも１つの活性を示さない組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株の使用に関する。これらの組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株は、検出可能なα−マンノシダーゼ抵抗性β−マンノース残基を欠くタンパク質および糖タンパク質を産生し得る。本発明は更に、宿主細胞抗原に対する抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く二シアル酸化（ｂｉ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）ヒトエリスロポエチンの、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法に関する。

（２）関連技術の説明
組換えヒトタンパク質の製造は、それが可能となったことにより、ヒトに対する医療に大きな進歩をもたらしており、依然として、薬物発見の、活発な領域である。多数の治療用タンパク質は、適切な構造−機能活性およびその後のヒト血清中での安定性を確保するためには、該タンパク質の特定のアスパラギン残基へのグリカンの翻訳後付加（Ｎ−グリコシル化）を要する。ヒトにおける治療用途の場合、糖タンパク質はヒト様Ｎ−グリコシル化を要する。ヒト様糖タンパク質プロセシングを模擬し得る哺乳類細胞系（例えば、ＣＨＯ細胞、ヒト網膜細胞）は、低いタンパク質力価、長い発酵時間、不均一な産物および継続的なウイルス混入を含む幾つかの欠点を有する。したがって、短い発酵時間で高いタンパク質力価を与えるだけでなくヒト様糖タンパク質をも産生し得る発現系を使用することが望ましい。

メチロトローフ酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）のような真菌宿主は治療用タンパク質の発現に関する顕著な利点を有する。例えば、それらは大量の内在性タンパク質を分泌せず、異種タンパク質を産生するための強力な誘導プロモーターが利用可能であり、それらは、動物血清の使用を伴わない規定化学培地内で増殖可能であり、それらは高い力価の組換えタンパク質を産生し得る（Ｃｒｅｇｇら，ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．２４：４５−６６（２０００））。しかし、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現されるグリコシル化タンパク質は、一般に、付加的マンノース糖を含有していて、「高マンノース」グリカンおよびマンノシルホスファート基（これらは糖タンパク質に負電荷を付与する）を与える。高マンノースグリカンまたは荷電マンナンを有する糖タンパク質は、ヒトにおける望ましくない免疫応答を誘発するリスクを有する（Ｔａｋｅｕｃｈｉ，ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｌｙｃｏｓｃｉ．Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．９：Ｓ２９−Ｓ３５（１９９７）；ＲｏｓｅｎｆｅｌｄおよびＢａｌｌｏｕ，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２４９：２３１９−２３２１（１９７４））。したがって、糖タンパク質上のグリコシル化のパターンが、ヒトにおいて産生される糖タンパク質上で生じるものと同じ又は類似しており、検出可能なβ−マンノシル化を有さない治療用糖タンパク質を真菌宿主細胞において製造することが望ましい。

未感染個体における防御抗体の存在により証明されているとおり、β結合マンノースは、β結合マンノースを含む治療用タンパク質または糖タンパク質が投与された個体において免疫原性となる又は有害な影響を及ぼす可能性がある。また、治療用タンパク質上の露出マンノース基はマクロファージ細胞上のマンノース受容体により迅速にクリアランス（排除）されて、低い薬物効力をもたす。したがって、真菌宿主、例えばピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現される治療用異種タンパク質のＮまたはＯ結合グリカン上のβ結合マンノース残基の存在は、それらの免疫原性の可能性およびクリアランス因子へのそれらの結合能を考慮すると、望ましくない。

ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において製造された糖タンパク質はβ結合マンノース残基を含有することが報告されている。２００３年に、Ｔｒｉｍｂｌｅら（Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．１４：２６５−２７４，ＥｐｕｂＤｅｃ２３）は、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において発現された組換えヒト胆汁酸塩刺激リパーゼ（ｈＢＳＳＬ）におけるβ−１，２−結合マンノース残基の存在を報告した。幾つかのβ−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子がピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）において特定されている（米国特許第７，４６５，５７７号およびＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）を参照されたい）。

前記を考慮すると、組換え治療用タンパク質または糖タンパク質が投与された個体において有害反応を誘発し得るエピトープを欠く組換え治療用タンパク質または糖タンパク質の、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を得ることが必要とされている。組換え治療用タンパク質または糖タンパク質が、個体に投与された場合に有害反応を誘発するリスクをもたらすかどうかを決定するための方法は、組換え治療用タンパク質または糖タンパク質を、全宿主細胞抗原に対して製造された抗体と接触させるというものである。これは、慢性投与を意図されたタンパク質または糖タンパク質の場合に特に関心が持たれる。該抗体に対する交差結合の欠如は、該組換え治療用タンパク質または糖タンパク質が、該抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠き、個体に投与された場合に有害反応を誘発しそうにないことを示している。したがって、該抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠き、個体に投与された場合に有害反応を誘発しそうにない組換え治療用タンパク質または糖タンパク質の製造方法が必要とされている。

米国特許第７，４６５，５７７号

Ｃｒｅｇｇら、ＦＥＭＳＭｉｃｒｏｂｉｏｌ．Ｒｅｖ．、２４、４５−６６（２０００）Ｔａｋｅｕｃｈｉ、ＴｒｅｎｄｓｉｎＧｌｙｃｏｓｃｉ．Ｇｌｙｃｏｔｅｃｈｎｏｌ．、９、Ｓ２９−Ｓ３５（１９９７）ＲｏｓｅｎｆｅｌｄおよびＢａｌｌｏｕ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２４９、２３１９−２３２１（１９７４）Ｔｒｉｍｂｌｅら、Ｇｌｙｃｏｂｉｏｌ．、１４、２６５−２７４，ＥｐｕｂＤｅｃ２３（２００３）Ｍｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．、２８３、９７２４−９７３６（２００８）

本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くタンパク質および糖タンパク質の、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供する。特に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、β−マンノシルトランスフェラーゼ１、β−マンノシルトランスフェラーゼ３およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ４から選択されるＮ−グリカンまたはＯ−グリカンに対する少なくとも１つの活性を示さない組換えメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株の、組換えタンパク質および糖タンパク質を製造するための使用方法を、本発明は提供する。１つの態様においては、該宿主細胞は、不活性β−マンノシルトランスフェラーゼを産生するように、β−マンノシルトランスフェラーゼ２をコードするＢＭＴ２遺伝子と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１，３および４（それをコードする遺伝子はそれぞれＢＭ１、ＢＭ３、ＢＭ４）から選択されるβ−マンノシルトランスフェラーゼをコードする少なくとも１つの遺伝子とが欠失し又は破壊され又は突然変異していて、組換えタンパク質および糖タンパク質を産生する、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株である。他の態様においては、β−マンノシルトランスフェラーゼ１、β−マンノシルトランスフェラーゼ３およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ４の１以上の活性は、化合物、β−マンノシルトランスフェラーゼをコードする１以上のｍＲＮＡに対するアンチセンスＤＮＡ、β−マンノシルトランスフェラーゼをコードする１以上のｍＲＮＡに対するｓｉＲＮＡ（これらに限定されるものではない）を含むβ−マンノシルトランスフェラーゼインヒビターを使用して阻害される。

これらの組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株は、検出可能なα−マンノシダーゼ抵抗性β−マンノース残基を欠くタンパク質および糖タンパク質を産生し得る。本発明は更に、宿主細胞抗原に対する抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く二シアル酸化（ｂｉ−ｓｉａｌｙｌａｔｅｄ）ヒトエリスロポエチンの、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供する。該方法および宿主細胞が産生を可能にする組換え治療用タンパク質および糖タンパク質は、該組換え治療用タンパク質および糖タンパク質が投与された個体において有害反応を誘発するリスクを有することがあるが、該リスクは、本明細書に開示されているとおりには修飾されていない株において産生された場合と比較して低い。該方法および宿主細胞は、クリアランス因子への低い結合能を有する組換えタンパク質または糖タンパク質の製造にも有用である。

１つの態様においては、本発明は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択されるＮ−グリカンまたはＯ−グリカンに対する少なくとも１つの活性を示さず、該組換え糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない。

もう１つの態様においては、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性をコードする遺伝子の欠失または破壊と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子の欠失または破壊とを有し、該組換え糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を有する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ４活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を有する。

もう１つの態様においては、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）遺伝子と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３（ＢＭＴ３）から選択される少なくとも１つの遺伝子とが欠失または破壊されており、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供する。更に詳細な実施形態においては、β−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）、β−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３（ＢＭＴ３）遺伝子が欠失されている。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ４（ＢＭＴ４）遺伝子の欠失または破壊を含む。

もう１つの態様においては、本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質の、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供し、該方法は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択されるＮ−グリカンまたはＯ−グリカンに対する少なくとも１つの活性を示さず、該組換え糖タンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え宿主細胞を準備し、該組換え糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換え糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質を得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない。

もう１つの態様においては、本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質の、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供し、該方法は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性をコードする遺伝子の欠失または破壊と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される活性をコードする少なくとも１つの遺伝子の欠失または破壊とを有する、該組換え糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え宿主細胞を準備し、該組換え糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換え糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質を得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を有する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ４活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を有する。

もう１つの態様においては、本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供し、該方法は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）遺伝子と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３（ＢＭＴ３）から選択される少なくとも１つの遺伝子とが欠失または破壊されている、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を準備し、該組換え糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換え糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質を得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、β−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）、β−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３（ＢＭＴ３）遺伝子が欠失されている。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ４（ＢＭＴ４）遺伝子の欠失または破壊を含む。

一般に、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性は、例えばサンドイッチＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットのようなアッセイにおいて決定される。該方法は治療用タンパク質または糖タンパク質の製造に特に有用である。治療用タンパク質または糖タンパク質の具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニスト。

該宿主細胞または方法の特定の実施形態においては、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子の核酸配列のコドンはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関して最適化されている。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。

該宿主細胞または方法のもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、糖タンパク質上のＮ−グリカンに対するα１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を示さず、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、フコシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、フコシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、ＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩおよびＧｎＴＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを含む。

該宿主細胞または方法の更にもう１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（ここで、下付き数字はＮ−グリカン構造上の特定の糖残基の数を示す）から選択されるＮ−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている。Ｎ−グリカン構造の具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_３ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_３ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_４ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧＩｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡ_３Ｇａｌ_３ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ３ＧｌｃＮＡｃ_２、およびＮＡＮＡ_４Ｇａｌ_４ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２。

さらに、前記宿主細胞のいずれかを使用して前記方法により得られる１以上の組換え糖タンパク質を含む組成物を提供する。

もう１つの態様においては、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される少なくとも１つの活性とを示さず、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む組換えメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供する。特定の実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない。

もう１つの態様においては、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を有し、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む組換えメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供する。特定の実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ４活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を含む。

もう１つの態様においては、本発明は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）遺伝子と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３（ＢＭＴ３）から選択される少なくとも１つの遺伝子との欠失または破壊を有し、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供する。特定の実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ４（ＢＭＴ４）遺伝子をコードする遺伝子の欠失または破壊を含む。

さらにもう１つの態様においては、本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供し、該方法は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択されるＮ−グリカンまたはＯ−グリカンに対する少なくとも１つの活性を示さず、シアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されており、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む組換え宿主細胞を準備し、第１および第２融合タンパク質を発現させプロセシングするのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該成熟ヒトエリスロポエチンを該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンを得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない。

さらにもう１つの態様においては、本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供し、該方法は、シアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されており、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む組換え宿主細胞（ここで、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性をコードする遺伝子と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される活性をコードする少なくとも１つの遺伝子とが欠失または破壊されている）を準備し、第１および第２融合タンパク質を発現させプロセシングするのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該成熟ヒトエリスロポエチンを該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンを得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子の欠失または破壊を含む。

さらにもう１つの態様においては、本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供し、該方法は、シアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されており、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞［ここで、β−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ）遺伝子と、β−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３（ＢＭＴ３）遺伝子から選択される少なくとも１つの遺伝子とが欠失または破壊されている］を準備し、第１および第２融合タンパク質を発現させプロセシングするのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該成熟ヒトエリスロポエチンを該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンを得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ２（ＢＭＴ２）遺伝子、β−マンノシルトランスフェラーゼ１（ＢＭＴ１）遺伝子およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３（ＢＭＴ３）遺伝子の欠失または破壊を含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は更に、β−マンノシルトランスフェラーゼ３遺伝子（ＢＭＴ４）の欠失または破壊を含む。

該宿主細胞または方法の特定の実施形態においては、該エリスロポエチンのＮ末端に融合したシグナルペプチドはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドまたはニワトリリゾチームシグナルペプチドである。

該宿主細胞または方法の更に詳細な実施形態においては、少なくとも１つの核酸分子は、該エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしており、少なくとも１つの核酸分子は、該エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドニワトリリゾチームシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしている。

該宿主細胞または方法の更に詳細な実施形態においては、該エリスロポエチンをコードする核酸分子の核酸配列のコドンはピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関して最適化されている。

該方法の更に詳細な実施形態においては、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収は、カチオン交換クロマトグラフィー工程を含む。

該方法の更に詳細な実施形態においては、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収は、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を含む。

該方法の更に詳細な実施形態においては、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収は、アニオン交換クロマトグラフィー工程を含む。

該方法の更に詳細な実施形態においては、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収は、カチオン交換クロマトグラフィー工程およびそれに続くヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を含み、この後、アニオン交換クロマトグラフィー工程が行われ得る。

本発明は更に、前記宿主細胞を使用して前記方法から得られる、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンと、医薬上許容される塩とを含む組成物を提供する。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンの約５０〜６０％は両方のアンテナ（Ａａｎｔｅｎｎａ）上にシアル酸残基を含み、更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリカンの７０％超（すなわち、７０％を超える）は両方のアンテナ上にシアル酸残基を含み、更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリカンの８０％超は両方のアンテナ上にシアル酸残基を含む。更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンの３０％未満は中性Ｎ−グリカン（すなわち、該Ｎ−グリカンの非還元性末端の少なくとも１つの末端においてシアル酸化されていない）。更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンの２０％未満は中性Ｎ−グリカンである。特定の態様においては、該Ｎ−グリカンの約９９％は１以上のシアル酸残基を含有し、該Ｎ−グリカンの１％未満は中性Ｎ−グリカンである。更に詳細な態様においては、ｒｈＥＰＯの１モル当たり４．５モルのシアル酸が存在する組成物を提供する。更に詳細な態様においては、ｒｈＥＰＯの１モル当たり少なくとも５．０モルのシアル酸が存在する組成物を提供する。

該組成物の更に詳細な実施形態においては、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンは親水性ポリマーにコンジュゲート化（ｃｏｎｊｕｇａｔｅ）されており、該親水性ポリマーは、特定の態様においては、ポリエチレングリコールポリマーである。特定の実施形態においては、該ポリエチレングリコールポリマーは、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンのＮ末端にコンジュゲート化されている。

定義
本明細書中で用いる「Ｎ−グリカン」および「グリコフォーム（ｇｌｙｃｏｆｏｒｍ）」なる語は互換的に用いられ、Ｎ−結合オリゴ糖を意味し、例えば、ポリペプチドのアスパラギン残基にアスパラギン−Ｎ−アセチルグルコサミン結合により結合しているオリゴ糖を意味する。Ｎ−結合糖タンパク質は、該タンパク質中のアスパラギン残基のアミド窒素に結合したＮ−アセチルグルコサミン残基を含有する。糖タンパク質上で見出される主な糖としては、グルコース、ガラクトース、マンノース、フコース、Ｎ−アセチルガラクトサミン（ＧａｌＮＡｃ）、Ｎ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）およびシアル酸（例えば、Ｎ−アセチル−ノイラミン酸（ＮＡＮＡ））が挙げられる。Ｎ−結合糖タンパク質の場合、糖基のプロセシングは翻訳と共に小胞体の内腔（ＥＲルーメン）で生じ、翻訳後にゴルジ装置内で継続する。

Ｎ−グリカンはＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２の共通の五糖コアを有する（「Ｍａｎ」はマンノースを意味し、「Ｇｌｃ」はグルコースを意味し、「ＮＡｃ」はＮ−アセチルを意味し、ＧｌｃＮＡｃはＮ−アセチルグルコサミンを意味する）。Ｎ−グリカンは、「トリマンノースコア」、「五糖コア」または「小マンノース（ｐａｕｃｉｍａｎｎｏｓｅ）コア」とも称されるＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２（「Ｍａｎ３」）コア構造に付加される末梢糖（例えば、ＧｌｃＮＡｃ、ガラクトース、フコースおよびシアル酸）を含む分枝（アンテナ）の数に関して異なる。Ｎ−グリカンは、それらの分枝構成成分に従い分類される（例えば、高マンノース、複合またはハイブリッド）。「高マンノース」型Ｎ−グリカンは５以上のマンノース残基を有する。「複合」型Ｎ−グリカンは、典型的には、「トリマンノース」コアの１，６マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃ、および１，３マンノース・アームに結合した少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを有する。複合Ｎ−グリカンはまた、シアル酸または誘導体（例えば、「ＮＡＮＡ」または「ＮｅｕＡｃ」；ここで、「Ｎｅｕ」はノイラミン酸を意味し、「Ａｃ」はアセチルを意味する）で修飾されていてもよいガラクトース（「Ｇａｌ」）またはＮ−アセチルガラクトサミン（「ＧａｌＮＡｃ」）残基を有し得る。複合Ｎ−グリカンはまた、コア・フコース（「Ｆｕｃ」）および「二分岐（ｂｉｓｅｃｔｉｎｇ）」ＧｌｃＮＡｃを含む鎖内置換を有し得る。複合Ｎ−グリカンはまた、「トリマンノース・コア」上に複数のアンテナを有することが可能であり、これは、しばしば、「多アンテナグリカン」と称される。「ハイブリッド」Ｎ−グリカンは、該トリマンノース・コアの１，３マンノース・アームの末端に少なくとも１つのＧｌｃＮＡｃを、そして該トリマンノース・コアの１，６マンノース・アーム上に０個以上のマンノースを有する。これらの種々のＮ−グリカンは「グリコフォーム」とも称される。

本明細書中で用いる略語は、当技術分野において一般に用いられているものである。例えば、前記の糖の略語を参照されたい。他の一般的な略語には、「ＰＮＧアーゼ」または「グリカナーゼ」または「グルコシダーゼ」が含まれ、これらは全て、ペプチドであるＮ−グリコシダーゼＦ（ＥＣ３．２．２．１８）を意味する。

本明細書中で用いる「組換え宿主細胞」（「発現宿主細胞」、「発現宿主系」、「発現系」または単に「宿主細胞」）なる語は、組換えベクターが導入された細胞を意味すると意図される。そのような用語は、その特定の対象細胞だけでなく、そのような細胞の後代をも意味すると意図されると理解されるべきである。突然変異または環境の影響により、後の世代において、ある修飾が生じ得るため、そのような後代は実際には親細胞と同一でない可能性があるが、本明細書中で用いる「宿主細胞」なる語の範囲内に尚も含まれる。組換え宿主細胞は、培養内で増殖した単離された細胞または細胞系であることが可能であり、あるいは、生きた組織または生物に存在する細胞であり得る。好ましい宿主細胞は酵母および真菌である。

酵素活性を「示さない」宿主細胞は、該酵素活性が阻害または破壊されている宿主細胞を意味する。例えば、該酵素活性は、該酵素活性をコードする遺伝子を欠失または破壊すること（該遺伝子の発現を制御する上流または下流調節配列を欠失または破壊することを含む）により阻害または破壊されることが可能であり、該酵素活性は、該酵素活性をコードする遺伝子を突然変異させて該酵素活性コード化遺伝子を非機能性にすることにより阻害または破壊されることが可能であり、該酵素活性は、該酵素活性の化学的、ペプチドまたはタンパク質インヒビターの使用により阻害または破壊されることが可能であり、該酵素活性は、核酸に基づく発現インヒビター、例えばアンチセンスＤＮＡおよびｓｉＲＮＡの使用により阻害または破壊されることが可能であり、該酵素活性は、該酵素活性をコードする遺伝子の発現を制御もしくは調節する調節因子の発現もしくは活性のインヒビターまたは転写インヒビターの使用により阻害または破壊されることが可能である。

糖タンパク質の調製物中に存在するグリカンの「モル％（モル百分率）」に言及する場合、この用語は、該タンパク質調製物をＰＮＧアーゼで処理し、ついで、グリコフォーム組成物により影響されない方法（例えば、ＰＮＧアーゼにより遊離したグリカンプールを２−アミノベンズアミドのような蛍光タグで標識し、ついで高速液体クロマトグラフィーまたはキャピラリー電気泳動により分離し、ついで蛍光強度によりグリカンを定量すること）により定量した場合に遊離したＮ結合オリゴ糖のプール内に存在する特定のグリカンのモル％を意味する。例えば、５０モル％のＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２は、遊離したグリカンの５０％がＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２であり、残りの５０％が他のＮ結合オリゴ糖から構成されることを意味する。いくつかの実施形態においては、糖タンパク質の調製物中の特定のグリカンのモル％は２０％〜１００％、好ましくは２５％超（すなわち、２５％を超える）、３０％超、３５％超、４０％超または４５％超、より好ましくは５０％超、５５％超、６０％超、６５％超または７０％超、最も好ましくは７５％超、８０％超、８５％超、９０％超または９５％超である。

本明細書中で用いる「主として（主に）」（ｐｒｅｄｏｍｉｎａｎｔｌｙ）なる語、またはその派生語、例えば「主要（主な）」または「優勢である」は、糖タンパク質をＰＮＧアーゼで処理し、遊離グリカンを質量分析、例えばＭＡＬＤＩ−ＴＯＦＭＳにより分析した後、全Ｎ−グリカンに対する最高モル百分率（％）を有するグリカン種に関して用いられると理解される。言い換えると、「主として（主に）」なる語は、ある個々の実体（例えば、特定のグリコフォーム）が他のいずれの個々の実体よりも大きなモル％で存在する場合に定義される。例えば、ある組成物が、４０モル％の種Ａ、３５モル％の種Ｂおよび２５モル％の種Ｃからなる場合、該組成物は種Ａを「主として（主に）」含む。

「治療的有効量」なる語は、患者に利益をもたらすヘマトクリットの上昇をもたらす本発明の組換えエリスロポエチンの量を意味する。該量は個体によって異なり、患者の全般的身体状態および貧血の根本原因を含む多数の要因に左右される。例えば、慢性腎不全に罹患している患者に対する本発明のエリスロポエチンの治療的有効量は、治療適応に基づいて、２０〜３００単位／ｋｇまたは０．５μｇ／ｋｇ〜５００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。「単位」なる語は、エリスロポエチン組成物の活性を評価するための、当技術分野において一般に公知の単位を意味する。純粋なエリスロポエチンの１ミリグラムは１５０，０００単位とほぼ同等である。投与計画は、毎週約３回から、４週間または６週間ごとに約１回であり得る。実際の計画は、患者に投与するエリスロポエチンのタイプ（ＥＰＯまたはＰＥＧ化ＥＰＯ）および個々の患者の応答を含む多数の要因に左右される。より高い用量範囲は、典型的には、貧血用途には用いられないが、他の治療用途には有用であり得る。患者に対するエリスロポエチンの適切な用量を達成し確立するための手段は当技術分野でよく知られており、一般に実施されている。

患者ごとの投与量および投与計画における変動は、量または計画に関して「約」なる語を用いて示される。治療に使用するエリスロポエチンの量は、許容され得る率のヘマトクリット上昇をもたらし、ヘマトクリットを有益なレベル（例えば、通常は少なくとも約３０％、典型的には３０％〜３６％の範囲）に維持する。本組成物の治療的有効量は、公に利用可能な材料および方法を用いて当業者により容易に確認され得る。また、治療中のエリスロポエチンの上昇を維持するために、患者に鉄が投与され得る。投与すべき量は、当業者により一般に用いられる方法により容易に決定され得る。

図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図１Ａ〜Ｊは、野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０（図１Ａ）から始まるピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９（図１Ｅ）および株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２（図１Ｉ）の系統を示す。図２はプラスミドｐＧＬＹ６の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ６は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ遺伝子または転写単位（ＳｃＳＵＣ２）を含む核酸分子を含有し、該核酸分子は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−３’）を含む核酸分子に隣接している。図３はプラスミドｐＧＬＹ４０の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４０は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、５’領域からのｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＯＣＨ１−３’）を含む核酸分子に隣接している。図４はプラスミドｐＧＬＹ４３ａの地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４３ａは、ＢＭＴ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）輸送体遺伝子または転写単位（ＫｌＧｌｃＮＡｃＴｒａｎｓｐ．）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣接している。該隣接遺伝子は、一方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ２−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ２−３’）を含む核酸分子に隣接している。図５はプラスミドｐＧＬＹ４８の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４８は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体（ＭｍＧｌｃＮＡｃＴｒａｎｓｐ．）オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のマウスホモログをコードする核酸分子を含む発現カセットを含有しており、該マウスホモログコード化核酸分子は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーター（ＰｐＧＡＰＤＨＰｒｏｍ）を含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列（ＳｃＣＹＣＴＴ）を含む核酸分子に機能的に連結されており、さらに前記マウスホモログコード化核酸分子は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子に隣接しており、ここで、これらの発現カセットは全体として、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４Ｌ１−３’）を含む核酸分子に隣接している。図６はプラスミドｐＧＬＹ４５の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ４５は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＰＮＯ１−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＮＮ４−３’）を含む核酸分子に隣接している。図７はプラスミドｐＧＬＹ２４７の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ２４７は、ＭＥＴ１６遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、ＭＥＴ１６遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＥＴ１６−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＥＴ１６遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＭＥＴ１６−３’）を含む核酸分子に隣接している。図８はプラスミドｐＧＬＹ２４８の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ２４８は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＥＴ１６遺伝子または転写単位（ＰｐＭＥＴ１６）を含む核酸分子を含有し、これは、一方の側では、ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−５’）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＵＲＡ５−３’）を含む核酸分子に隣接している。図９はプラスミドｐＧＬＹ５８２の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ５８２は、ＨＩＳ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）、（２）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２−ｓリーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ｈＧａｌＴ）触媒ドメイン、（３）ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）、（４）キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＨＩＳ１遺伝子の５’領域（ＰｐＨＩＳ１−５’）およびＨＩＤ１遺伝子の３’領域（ＰｐＨＩＳ１−３’）に隣接している。ＰＭＡ１はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターであり、ＳｃＣＹＣＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ１２ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２終結配列である。図１０はプラスミドｐＧＬＹ１６７ｂの地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂは、ＡＲＧ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（ＣＯ−ＫＤ５３）にＮ末端において融合したキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（コドン最適化されたもの）、（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位、および（３）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（ＣＯ−ＴＣ５４）にＮ末端において融合したラットＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（コドン最適化されたもの）をコードする３つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＡＲＧ１遺伝子の５’領域（ＰｐＡＲＧ１−５’）およびＡＲＧ１遺伝子の３’領域（ＰｐＡＲＧ１−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＰｐＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターであり、ＳｃＣＹＣＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ１２ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２終結配列である。図１１はプラスミドｐＧＬＹ１４３０の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ１４３０は、ＡＤＥ１遺伝子座の発現を損なうことなくＡＤＥ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（ＣＯ−ＮＡ１０）にＮ末端において融合したヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（コドン最適化されている）、（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ（ＭｍＴｒ）、（３）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（ＦＢ８）にＮ末端において融合したマウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメイン（ＦＢ）、および（４）ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。全体はＡＤＥ１遺伝子およびＯＲＦの５’領域（ＡＤＥ１５’およびＯＲＦ）、ならびにＡＤＥ１遺伝子の３’領域（ＰｐＡＤＥ１−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＳＥＣ４はピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ４プロモーターであり、ＯＣＨ１ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１終結配列であり、ＳｃＣＹＣＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＯＣＨ１Ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターであり、ＰｐＡＬＧ３ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列であり、ＰｐＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターである。図１２はプラスミドｐＧＦＩ１６５の地図である。プラスミドｐＧＦＩ１６５は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を損なうことなくＰＲＯ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）、および（２）ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位をコードする発現カセットを含有する。全体はＰＲＯ１遺伝子およびＯＲＦの５’領域（５’ＰＲＯ１ｏｒｆ）ならびにＰＥＯ１遺伝子の３’領域（３’ＰＲＯ）に隣接している。ＳｃＣＹＣＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＡＬＧ３ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列であり、ＰｐＧＡＰＤＨはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターである。図１３はプラスミドｐＧＬＹ２０８８の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ２０８８は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチド（ａｌｐｈａＭＦ−ｐｒｅ）にＮ末端において融合しているコドン最適化成熟ヒトエリスロポエチン（ｃｏ−ｈＥＰＯ）、ならびに（２）ゼオシン耐性タンパク質（ＺｅｏｃｉｎＲ）をコードする発現カセットを含有する。該カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター（ＰｐＡＯＸ１Ｐｒｏｍ）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子または転写単位（ＰｐＴＲＰ２）に隣接している。ＳｃＣＹＣＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＳｃＴＥＦＰｒｏｍはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＥＦ１プロモーターである。図１４はｐＧＬＹ２４５６の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ２４５６は、ＴＲＰ２遺伝子座の発現を損なうことなくＴＲＰ２遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）コドン最適化マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体（ＣＯｍＣＭＰ−ＳｉａＴｒａｎｓｐ）、（２）ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（コドン最適化されたもの）（ＣＯｈＧＮＥ）、（３）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位、（４）コドン最適化ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ＣＯｈＣＭＰ−ＮＡＮＡＳ）、（５）コドン最適化ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（ＣＯｈＳＩＡＰＳ）、および（６）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２リーダーペプチドにＮ末端において融合したコドン最適化マウスａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（ｃｏｍＳＴ６−３３）をコードする６つの発現カセットを含有する。全体はＴＲＰ２遺伝子およびＯＲＦの５’領域（ＰｐＴＲＰ２５’）ならびにＴＲＰ２遺伝子の３’領域（ＰｐＴＲＰ２−３’）に隣接している。ＰｐＰＭＡ１ｐｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターであり、ＰｐＰＭＡ１ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１終結配列であり、ＣＹＣＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列であり、ＰｐＴＥＦＰｒｏｍはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターであり、ＰｐＴＥＦＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１終結配列であり、ＰｐＡＬＧ３ＴＴはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列であり、ｐＧＡＰはピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターである。図１５はプラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４５’）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ４３’）に隣接している。図１６はプラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）の地図である。プラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）は、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（ＰＴＥＦ）およびアシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（ＴＴＥＦ）に機能的に連結されたノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性ＯＲＦ（ＮＡＴ）をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該発現カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１５’）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰＢＳ１３’）に隣接している。図１７はｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）の地図である。プラスミドｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）は、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（ｐＴＥＦ）およびアシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（ＴＲＦｔｔ）に機能的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子ＯＲＦ（Ｈｒｇ）をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有し、該発現カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３５’）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＢＳ３３’）に隣接している。図１８はｐＧＬＹ２０５７の地図である。プラスミドｐＧＬＹ２０５７は、ＡＤＥ２遺伝子座を標的化する組込みプラスミドであり、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）をコードする発現カセットを含有する。該発現カセットは、一方の側では、ＡＤＥ２遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＡＤＥ２−５’）を含む核酸分子に、他方の側では、ＡＤＥ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（ＰｐＡＤＥ２−３’）を含む核酸分子に隣接している。図１９はｐＧＬＹ２６８０の地図である。プラスミドｐＧＬＹ２６８０は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１遺伝子座を標的化し得る組込みベクターであり、（１）ニワトリリゾチームシグナルペプチド（ＣｈｉｃｋｅｎＬｙｓｏｚｙｍｅｓｓ）にＮ末端において融合したコドン最適化ヒト成熟エリスロポエチン（ｃｏ−ｈＥＰＯ）、および（２）プロモーターを伴わないピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ２遺伝子（ＰｐＡＤＥ２）をコードする発現カセットを含有する。該カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーター（ＰｐＡＯＸ１Ｐｒｏｍ）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＲＰ２遺伝子または転写単位（ＰｐＴＲＰ２）に隣接している。ＳｃＣＹＣＴＴはサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列である。図２０はプラスミドｐＧＬＹ２７１３の地図を示す。プラスミドｐＧＬＹ２７１３は、ｌａｃＺ反復（ｌａｃＺ反復）に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（ＰｐＵＲＡ５）を含む発現カセットに隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＮＯ１ＯＲＦ（ＰｐＰＮＯ１ＯＲＦ）を含有する組込みベクターであり、該ＯＲＦおよび該発現カセットの全体は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＥＰ４５’）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（ＰｐＰＥＰ４３’）に隣接している。図２１は、発酵法の流れを例示する概要図である。図２２は、株ＹＧＬＹ３１５９において産生されたｒｈＥＰＯが抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を有することを示す。左パネルは。ｒｈＥＰＯの位置を示す、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、右パネルは、１：３，０００希釈のウサギ抗ＨＣＡ抗体（ＳＬｒＰｒｏＡ精製ウサギ：９１６１）でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。結合抗ＨＣＡ抗体は、ＰＢＳ中で１：５，０００希釈の、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）に結合されたヤギ抗ウサギ抗体を使用して検出された。結合した二次抗体の検出は基質３’３ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を利用した。図２３は、抗ＨＣＡ抗体に対する、株ＹＧＬＹ３１５９において産生されたｒｈＥＰＯの交差結合活性が、ＰＮＡＧアーゼＦを使用して該ｒｈＥＰＯが脱グリコシル化されている場合には検出されないことを示す。左パネルは、ｒｈＥＰＯのグリコシル化および脱グリコシル化形態の位置を示す、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、右パネルは、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す図２４は、野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）および糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＳ２．０株（この場合、ＢＭＴ２遺伝子が破壊または欠失されている）において産生された組換え抗体（ｒｈＩｇＧ）が抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を示したことを示す。左パネルは、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、右パネルは、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。ＧＳ２．０は、主としてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株である。示されているＧＳ２．０株は、約５％のＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを有するｒｈＩｇＧを産生した。ＷＴは野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）である。図２５は、株ＹＧＬＹ３１５９において産生されたｒｈＥＰＯと、複合グリコシル化パターンを含有するがピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されたのでない他のグリコシル化タンパク質との、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を比較する。上パネルは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されたｒｈＥＰＯのグリコシル化および脱グリコシル化形態の位置ならびに組換えヒトフェツイン、アシアロフェツイン（末端シアル酸残基が除去されたヒトフェツイン）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）および組換えＬＥＵＫＩＮＥ［サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において産生されたもの］の位置を示す、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、下パネルは、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。Ｓ３０Ｓプールは、カチオン交換クロマトグラフィーにより精製されたｒｈＥＰＯである。図２６は、株ＹＧＬＹ３１５９において産生されヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製されたｒｈＥＰＯが抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を尚も有することを示す。左パネルは、該ｒｈＥＰＯ（還元型または非還元型）の位置を示す、クロマトグラフィー溶出プール１、２および３の、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示し、右パネルは、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。該パネルの下に、プール１、２および３におけるＮ−グリカンのＨＰＬＣ分析の結果が示されている。図２７Ａは、ヒドロキシアパタイトプール１からの、株ＹＧＬ３１５９において産生されたｒｈＥＰＯのＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦアニオンクロマトグラフィー精製のクロマトグラムを示す。図２７ＢはサンドイッチＥＬＩＳＡを示し、該ＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦアニオンクロマトグラフィーからのｒｈＥＰＯを含有するＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦプールは抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さないが、フロースルーは抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を含有することを、この図は示している。捕捉抗体は抗ｈＥＰＯ抗体であり、交差結合活性はウサギ抗ＨＣＡ抗体［これはＰＢＳ中の出発希釈度１：８００を有し、ついで、１：８１９，２００希釈度の第１１ウェルで終わる行にわたってＰＢＳ中で１：１系列希釈された（ウェル１２：陰性対照）］で検出された。結合した抗ＨＣＡ抗体は、ＰＢＳ中の１：１０，０００希釈度のアルカリホスファターゼ（ＡＰ）に結合されたヤギ抗ウサギ抗体を使用して検出された。結合した二次抗体の検出は基質４−メチルウンンベリフェリルホスファート（４−ＭＵＰＳ）を利用した。図２８は、株ＹＧＬＹ６６６１（Δｂｍｔ２、Δｂｍｔ４およびΔｂｍｔ１）およびＹＧＬＹ７０１３（Δｂｍｔ２およびΔｂｍｔ４）において産生されＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーにより捕捉されたｒｈＥＰＯ（Ｂｌｕｅプール）が抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を尚も有することを示す。左パネルは、ＰＮＧアーゼＦ処理を伴う（＋）および伴わない（−）該Ｂｌｕｅプールの、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。中央パネルは、１：１，０００希釈度のＨＲＰに結合された抗ｈＥＰＯ抗体および基質としてのＤＡＢを使用してプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。右パネルは、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。図２９は、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて、株ＹＧＬＹ６６６１（Δｂｍｔ２、Δｂｍｔ４およびΔｂｍｔ１）およびＹＧＬＹ７０１３（Δｂｍｔ２およびΔｂｍｔ４）において産生されＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーにより捕捉されたｒｈＥＰＯ（Ｂｌｕｅプール）が抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を尚も有することを示す。該ＥＬＩＳＡは図２７Ｂの場合と同様に行われた。図３０は、株ＹＧＬＹ６６６１（Δｂｍｔ２、Δｂｍｔ４およびΔｂｍｔ１）およびＹＧＬＹ７０１３（Δｂｍｔ２およびΔｂｍｔ４）において産生され、ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーにより捕捉され、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製されたｒｈＥＰＯ（ＨＡプール１）の、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を検出するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡを示す。株ＹＧＬＹ６６６１からのＨＡプール１におけるｒｈＥＰＯは抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を示さなかった。該ＥＬＩＳＡは図２７Ｂの場合と同様に行われた。図３１は、株ＹＧＬＹ６６６１（Δｂｍｔ２、Δｂｍｔ４およびΔｂｍｔ１）において産生されＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーにより捕捉されたｒｈＥＰＯ（Ｂｌｕｅプール）が抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を尚も有することを示す。左パネルは、ＰＮＧアーゼＦ処理を伴う（＋）および伴わない（−）該Ｂｌｕｅプールの、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。中央パネルは、１：１，０００希釈度のＨＲＰに結合された抗ｈＥＰＯ抗体および基質としてのＤＡＢを使用してプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。右パネルは、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。図３２Ａは、ＰＮＧアーゼＦ処理を伴う（＋）および伴わない（−）株ＹＧＬＹ７３６１〜７３６６（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）から調製されたＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ捕捉プール（Ｂｌｕｅプール）の、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。該株は、５００ｍＬＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽において増殖させた。図３２Ｂは、ＰＮＧアーゼＦ処理を伴う（＋）および伴わない（−）株ＹＧＬＹ７３９３〜７３９８（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）から調製されたＢｌｕｅＳｅｐｈａｒｏｓｅ６ＦＦ捕捉プール（Ｂｌｕｅプール）の、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示す。該株は、５００ｍＬＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽において増殖させた。図３３は、株ＹＧＬＹ７３６１〜７３６６（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）およびＹＧＬＹ７３９３〜７３９８（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）において産生されＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーにより捕捉されたｒｈＥＰＯ（Ｂｌｕｅプール）の、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を検出するために使用したサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。株ＹＧＬＹ７３６３およびＹＧＬＹ７３６５からのＢｌｕｅプールにおけるｒｈＥＰＯだけが抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を示した。該ＥＬＩＳＡは図２７Ｂの場合と同様に行われた。図３４は、株ＹＧＬＹ７３６１〜７３６６およびＹＧＬＹ７３９３〜７３９８（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）から調製されたＢｌｕｅプールにおけるｒｈＥＰＯ上のＮ−グリカンのＨＰＬＣ分析からの結果を図表形態で示す。「Ｂｉ」は、二分岐Ｎ−グリカンの両方のアームがシアル酸化されているＮ−グリカンを意味する。「Ｍｏｎｏ」は、二分岐Ｎ−グリカンの一方のアームだけがシアル酸化されているＮ−グリカンを意味する。「Ｎｅｕｔｒａｌ」は、シアル酸化されていないＮ−グリカンを意味する。図３５Ａは、株ＹＧＬＹ７３６２、ＹＧＬＹ７３６６、ＹＧＬＹ７３９６およびＹＧＬＹ７３９８（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）ならびにＹＧＬＹ３１５９（Δｂｍｔ２）から調製されたＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィー（Ｂｌｕｅプール）およびヒドロキシアパタイト精製プール（ＨＡプール１ｓ）の、クーマシーブー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図３５Ｂは、株ＹＧＬＹ７３６２、ＹＧＬＹ７３６６、ＹＧＬＹ７３９６およびＹＧＬＹ７３９８（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）ならびにＹＧＬＹ３１５９（Δｂｍｔ２）から調製され、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされたＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィー（Ｂｌｕｅプール）およびヒドロキシアパタイト精製プール（ＨＡプール１ｓ）の４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットを示す図３６は、株ＹＧＬＹ７３９８（Δｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）において産生され、ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーにより捕捉（Ｂｌｕｅプール）され、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーにより精製（ＨＡプール１ｓ）されたｒｈＥＰＯが抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さなかったことを示す。左パネルは、株ＹＧＬＹ３１５９から調製されたｒｈＥＰＯと比較された場合の、株ＹＧＬＹ７３９８から調製されたＢｌｕｅプールおよびＨＡプール１の、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。中央パネルは、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。中央パネルは、抗ＨＣＡ抗体が別の抗体調製物（１：２，０００のＧｉＦポリクローナルウサギ：：６３１６）からのものであること以外は図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされた類似ゲルのウエスタンブロットを示す。図３７は、株ＹＧＬＹ７１１３〜７１２２（Δｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）において産生されＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーにより捕捉（Ｂｌｕｅプール）されたｒｈＥＰＯの抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を検出するために使用されたサンドイッチＥＬＩＳＡの結果を示す。株ＹＧＬＹ７１１８は抗ＨＣＡ抗体に対する非常に低い検出可能な交差結合活性を示した。その他の株はいずれも、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を示さなかった。該ＥＬＩＳＡは図２７Ｂの場合と同様に行われた。図３８は、株ＹＧＬＹ７１１３〜７１２２（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）から調製されたＢｌｕｅプールにおけるｒｈＥＰＯ上のＮ−グリカンのＨＰＬＣ分析からの結果を図表形態で示す。「Ｂｉ」は、二分岐Ｎ−グリカンの両方のアームがシアル酸化されているＮ−グリカンを意味する。「Ｍｏｎｏ」は、二分岐Ｎ−グリカンの一方のアームだけがシアル酸化されているＮ−グリカンを意味する。「Ｎｅｕｔｒａｌ」は、シアル酸化されていないＮ−グリカンを意味する。図３９Ａは、株ＹＧＬＹ７１１５、ＹＧＬＹ７１１７、ＹＧＬＹ７３９４、ＹＧＬＹ７３９５およびＹＧＬＹ７１２０（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）ならびにＹＧＬＹ３１５９（Δｂｍｔ２）から調製されたＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィー（Ｂｌｕｅプール）およびヒドロキシアパタイト精製プール（ＨＡプール１ｓ）の、クーマシーブー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。図３９Ｂは、株ＹＧＬＹ７１１５、ＹＧＬＹ７１１７、ＹＧＬＹ７３９４、ＹＧＬＹ７３９５およびＹＧＬＹ７１２０（全てΔｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）ならびにＹＧＬＹ３１５９（Δｂｍｔ２）から調製され、図２２の場合と同様に抗ＨＣＡ抗体でプローブされたＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィー（Ｂｌｕｅプール）およびヒドロキシアパタイト精製プール（ＨＡプール１ｓ）の４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットを示す図４０Ａは、ＹＧＬＹ３１５９（Δｂｍｔ２）において産生されヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（すなわち、ＨＡプール１の分析）により精製されたｒｈＥＰＯからのＮ−グリカンのＨＰＬＣトレースを示す。図４０Ｂは、ＹＧＬＹ７１１７（Δｂｍｔ２、Δｂｍｔ４、Δｂｍｔ１およびΔｂｍｔ３）において産生されヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィー（すなわち、ＨＡプール１の分析）により精製されたｒｈＥＰＯからのＮ−グリカンのＨＰＬＣトレースを示す。

発明の詳細な説明
本発明は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くタンパク質および糖タンパク質の、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供する。宿主細胞抗原には、免疫原性である可能性があり治療用タンパク質の治療効力または安全性を変化させ得る、組換えタンパク質組成物に持ち込まれ得る残留宿主細胞タンパク質および細胞壁混入物も含まれ得る。宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する交差反応性を有する組成物は、該組成物が何らかの混入宿主細胞物質、通常、ホスホマンノース残基またはβ−マンノース残基を有するＮ−グリカンなどを含有することを意味する。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の野生型株は、これらのＮ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生する。全宿主細胞タンパク質に対して産生された抗体調製物は、これらの構造に対する抗体を含むと予想されるであろう。しかし、Ｎ−グリカンを含有しないタンパク質も、該宿主細胞に対して産生された抗体と交差反応する混入物質（タンパク質など）を含み得るであろう。

該方法および宿主細胞が産生を可能にする組換え治療用タンパク質および糖タンパク質は、該組換え治療用タンパク質および糖タンパク質が投与された個体において有害反応を誘発するリスクを有することがあるが、該リスクは、本明細書に開示されているとおりには修飾されていない株において産生された場合と比較して低い。有害反応には、該個体における望ましくない免疫応答、または該個体の健康に一般に悪影響を及ぼす該個体における部位に対する望ましくない若しくは不適当な結合、集合または相互作用を誘発することが含まれる。該治療用タンパク質または糖タンパク質が投与されている個体における有害反応の誘発のリスクは、慢性的に個体に投与されると意図されるタンパク質または糖タンパク質の場合（例えば、長期にわたって行われると意図される療法）に特に懸念される。本発明における方法により製造された組換え治療用タンパク質または糖タンパク質は、宿主細胞抗原に対する抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さず、したがって、該組換えタンパク質または糖タンパク質が投与された個体において有害反応を誘発するリスクの軽減を示す。該方法および宿主細胞は、クリアランス因子への結合の、より低い可能性を有する組換えタンパク質または糖タンパク質の製造にも有用である。

本発明者らは、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）の幾つかの株において産生される特定の糖タンパク質が、それにおけるマンノース残基の１以上がβ１，２−結合である、Ｎ−またはＯ−グリカンを有し得ることを見出した。治療用途に意図され１以上のβ１，２−結合マンノース残基を有する糖タンパク質は、該糖タンパク質が投与されている個体において望ましくない免疫応答を誘発し得るリスクをもたらす。これらのβ結合マンノース残基は、全宿主細胞抗原に対して産生された抗体を使用して検出され得る。どの治療用糖タンパク質が、１以上のβ１，２−結合マンノース残基を含むＮ−またはＯ−グリカンを有するのか、およびβ１，２−結合マンノース残基を含むＮ−またはＯ−グリカンを有する治療用糖タンパク質が、該糖タンパク質が投与されている個体において望ましくない免疫原性応答を引き起こすのかどうかを予想することは不可能であるため、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な交差結合を欠くように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において治療用糖タンパク質を製造することが望ましい。そのような株は、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）β−マンノシルトランスフェラーゼ（ＢＭＴ）遺伝子ファミリーの公知の４つのβ−マンノシルトランスフェラーゼ（Ｂｍｔｐ）のうちの少なくとも３つの活性を欠失または破壊することにより製造され得る。本明細書に示されているとおり、これらのＢＭＴ遺伝子の少なくとも３つの欠失または破壊を含むピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株は、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合を欠くタンパク質または糖タンパク質を産生し得るピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株を与える。これらの株は治療用タンパク質および糖タンパク質の製造に有用である。Ｎ−および／またはＯ−グリカン上のβ−マンノース構造の存在は免疫応答を惹起することが示されている。

ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）およびカンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）におけるβ−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子の特定は米国特許第７，４６５，５７７号およびＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）において報告されており、これは、β−マンノシル化が、ＡＭＲ２またはＢＭＴ２と称されるβ−マンノシルトランスフェラーゼにより行われたこと、およびピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における該遺伝子の破壊または欠失が、β−マンノシル化が低減した糖タンパク質を産生し得る組換え宿主を与えたことを開示している。該特許はまた、遺伝子ＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４の３つのホモログを開示している。しかし、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する幾つかの糖タンパク質調製物の交差結合活性の源を調べたところ、本発明者らは、該交差結合活性が、ＢＭＴ２遺伝子が破壊または欠失されている組換えピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞の幾つかの株に残っている残存β−マンノシル化の結果であることを見出した。したがって、これらの組換え宿主細胞において産生された異種糖タンパク質は、β−マンノース残基を尚も含有していたＮ−グリカンを有する。これらのβ−マンノース残基は、宿主細胞抗原（ＨＣＡ）に対して産生された抗体でプローブされた、これらの組換え宿主細胞の培養から得られた異種糖タンパク質のＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットにおいて検出可能であった。抗ＨＣＡ抗体は、野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株またはＮＯＲＦ株［すなわち、該異種タンパク質をコードするオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）が除去されていること以外は、異種糖タンパク質を産生する組換え宿主細胞と同じ方法で構築された組換え宿主細胞］に対して産生されたポリクローナル抗体である。ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生される治療用糖タンパク質の場合、これらの残存β−マンノース残基は、疾患または障害に対する治療において該治療用タンパク質の投与を受ける個体によっては、免疫応答を誘発するリスクをもたらす。本発明は、検出可能なβ−マンノシル化を含有せず、したがって、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に交差結合しない糖タンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供する。

ＢＭＴ１、ＢＭＴ２およびＢＭＴ３は高度な配列相同性を示すが、ＢＭＴ４はより低い度合の相同性を有し、キャッピング（ｃａｐｐｉｎｇ）アルファ−マンノシルトランスフェラーゼであると考えられている。しかし、ＢＭＴファミリーの４つのメンバーの全ては、β−結合マンノース構造を有するＮ−および／またはＯ−グリカンの合成に関与するようである。ＢＭＴ２遺伝子が欠失しているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株において産生された試験タンパク質からのＮ−グリカンのＭＡＬＤＩ−ＴＯＦはβ−マンノシル化を検出できない可能性があるが、抗体に基づく本発明における高感度アッセイはΔｂｍｔ２株におけるβ−マンノシル化を検出することが可能であった。したがって、本明細書に教示されている抗ＨＣＡ抗体に基づく検出方法は、全ての検出可能なβ−マンノース構造を除去するためには、ＢＭＴ１およびＢＭＴ３遺伝子ならびに場合によってはＢＭＴ４遺伝子の欠失または破壊も必要であることを示した。それらの３つのβ−マンノシルトランスフェラーゼをコードする遺伝子の欠失または破壊は、（１）該遺伝子（プロモーター配列、オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）および／または転写終結配列を含む）の完全または部分的ノックアウト；（２）該ＯＲＦにおけるフレームシフトの導入；（３）該プロモーターの不活性化または調節；（４）ｓｉＲＮＡまたはアンチセンスＲＮＡによるメッセージのノックダウン；あるいは（５）化学的インヒビターの使用により達成され得る。その結果は、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く糖タンパク質を産生し得る宿主細胞の産生である。

抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く糖タンパク質の製造方法を例示するために、ＢＭＴ２発現または活性を欠くように及びシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを有する組換え成熟ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）を産生し得るように遺伝的に操作されているピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株を、ＢＭＴ１および／またはＢＭＴ３および／またはＢＭＴ４遺伝子の発現を欠くように更に遺伝的に操作した。ＢＭＴ２遺伝子の発現だけが破壊されている株は、抗ＨＣＡ抗体に対する或る程度の検出可能な交差結合活性を有する組換え成熟ヒトＥＰＯを産生した。検出可能な交差結合活性は、ＥＰＯ分子上のβ−結合マンノース残基の存在によるものであることが判明した（図２２〜２７Ｂ、実施例６を参照されたい）。ＢＭＴ１およびＢＭＴ４をコードする遺伝子が該株において破壊または欠失された場合、産生されたＥＰＯは抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を尚も有していた（図２８〜３１を参照されたい）。しかし、ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子が破壊または欠失された場合には、該株のほとんどは、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠き従って検出可能なβ−マンノース残基を欠くグリコシル化組換えヒトＥＰＯを産生した（例えば、図３３および３５Ｂを参照されたい）。

したがって、本発明は更に、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質の製造方法を提供し、該方法は、β−マンノシルトランスフェラーゼの種々の組合せを更に示さなくするために、該組換えタンパク質を産生させるために使用されると意図される宿主細胞を構築することを含む。例えば、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さない宿主細胞を構築する。β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示すことを欠く宿主細胞は、組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該株のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価される。ＮＯＲＦ株は、該組換え糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを欠くこと以外は宿主株と同じ株である。該宿主細胞により産生された組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠く場合には、該宿主細胞は、宿主細胞抗原にする抗体に対する交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するのに有用である。

しかし、検出可能な交差結合活性が検出される場合には、該宿主細胞は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１、β−マンノシルトランスフェラーゼ３またはβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さないように更に操作される。例えば、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を欠く宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性を欠くように更に操作される。該宿主細胞は、組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該株のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価される。該宿主細胞により産生された組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠く場合には、該宿主細胞は、宿主細胞抗原にする抗体に対する交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するのに有用である。

しかし、検出可能な交差結合活性が検出される場合には、該宿主細胞は、β−マンノシルトランスフェラーゼ３またはβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さないように更に操作される。例えば、β−マンノシルトランスフェラーゼ２活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性を欠く宿主細胞は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を欠くように更に操作される。該宿主細胞は、該タンパク質または組換え糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該株のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価される。該宿主細胞により産生された組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠く場合には、該宿主細胞は、宿主細胞抗原にする抗体に対する交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するのに有用である。

しかし、検出可能な交差結合活性が検出される場合には、該株は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さないように更に操作される。該宿主細胞は、該組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該株のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価されて、該組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠くことが確認される。

更なる一例として、ＢＭＴ遺伝子の種々の組合せが欠失または破壊されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を構築する。例えば、ＢＭＴ２遺伝子の破壊または欠失を有するピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を構築する。Δｂｍｔ２宿主細胞は、該組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該株のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価される。ＮＯＲＦ株は、該組換え糖タンパク質をコードするオープンリーディングフレームを欠くこと以外は宿主株と同じ株である。該Δｂｍｔ２宿主細胞により産生された組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠く場合には、該ＢＭＴ２欠失または破壊は、宿主細胞抗原にする抗体に対する交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を該宿主細胞が産生するのを可能にするのに十分なものである。

しかし、検出可能な交差結合活性が検出される場合には、該宿主細胞は、ＢＭＴ１、ＢＭＴ３またはＢＭＴ４遺伝子の欠失を有するように更に操作される。例えば、ＢＭＴ２遺伝子の破壊または欠失を有する宿主細胞は、ＢＭＴ１遺伝子の欠失または破壊を有するように更に操作される。該Δｂｍｔ２Δｂｍｔ１宿主細胞は、該組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該株のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価される。該Δｂｍｔ２Δｂｍｔ１宿主細胞により産生された組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠く場合には、該ＢＭＴ１およびＢＭＴ２欠失または破壊は、宿主細胞抗原にする抗体に対する交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を該宿主細胞が産生するのを可能にするのに十分なものである。

しかし、検出可能な交差結合活性が検出される場合には、該宿主細胞は、ＢＭＴ３またはＢＭＴ４遺伝子の欠失を有するように更に操作される。例えば、ＢＭＴ１およびＢＭＴ２遺伝子の破壊または欠失を有する宿主細胞は、ＢＭＴ３遺伝子の欠失または破壊を有するように更に操作される。該Δｂｍｔ２Δｂｍｔ１Δｂｍｔ３宿主細胞は、該組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該宿主細胞のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価される。該Δｂｍｔ２Δｂｍｔ１Δｂｍｔ３宿主細胞により産生された組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠く場合には、該ＢＭＴ１、ＢＭＴ２およびＢＭＴ３欠失または破壊は、宿主細胞抗原にする抗体に対する交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を該宿主細胞が産生するのを可能にするのに十分なものである。

しかし、検出可能な交差結合活性が検出される場合には、該宿主細胞は、ＢＭＴ４遺伝子の欠失を有するように更に操作される。該Δｂｍｔ２Δｂｍｔ１Δｂｍｔ３Δｂｍｔ４宿主細胞は、該組換えタンパク質または糖タンパク質を製造するために使用され、ついでこれは、該株のＮＯＲＦ形態に対して産生された抗体を使用するウエスタンブロットまたはＥＬＩＳＡにより評価されて、該組換えタンパク質または糖タンパク質が、宿主細胞抗原に対して産生された抗体への検出可能な結合を欠くことが確認される。

本発明は更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される少なくとも１つの活性を示さず、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えメチロトローフ酵母宿主細胞、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を提供する。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない。更に詳細な態様においては、本発明は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ３活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さず、該組換え糖タンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換え宿主細胞を提供する。

本発明は更に、抗宿主細胞抗原抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質の一般的製造方法を提供し、該方法は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される少なくとも１つの活性を示さず、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を準備し、該組換えタンパク質または糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換えタンパク質または糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を欠く。

更に詳細な態様においては、本発明は、抗宿主細胞抗原抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質の一般的製造方法を提供し、該方法は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ３活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さず、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞を準備し、該組換えタンパク質または糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換えタンパク質または糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を得ることを含む。

本発明は更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性をコードする遺伝子が欠失または破壊されており、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性またはβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする少なくとも１つの遺伝子が欠失または破壊されている組換えメチロトローフ酵母宿主細胞［例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞］であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該宿主細胞を提供する。更に詳細な実施形態においては、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子が欠失または破壊されている。更に詳細な態様においては、本発明は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ３活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性をコードする遺伝子が欠失または破壊されている組換え宿主細胞であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該組換え宿主細胞を提供する。

本発明は更に、抗宿主細胞抗原抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質の一般的製造方法を提供し、該方法は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性をコードする遺伝子が欠失または破壊されており、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性またはβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される活性をコードする少なくとも１つの遺伝子が欠失または破壊されている組換えメチロトローフ酵母［例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）］宿主細胞であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該宿主細胞を準備し、該組換えタンパク質または糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換えタンパク質または糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性をコードする遺伝子が欠失または破壊されている。

更に詳細な態様においては、本発明は、抗宿主細胞抗原抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質の一般的製造方法を提供し、該方法は、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ３活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性をコードする遺伝子が欠失または破壊されている組換えメチロトローフ酵母［例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）］宿主細胞であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該宿主細胞を準備し、該組換えタンパク質または糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換えタンパク質または糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を得ることを含む。

本発明は更に、ＢＭＴ２遺伝子と、ＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ３遺伝子の少なくとも１つとが欠失または破壊されている組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該宿主細胞を提供する。更に詳細な実施形態においては、ＢＭＴ２遺伝子、ＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ３遺伝子が欠失または破壊されている。更に詳細な態様においては、本発明は、ＢＭＴ１遺伝子、ＢＭＴ２遺伝子、ＢＭＴ３遺伝子およびＢＭＴ４遺伝子が欠失または破壊されている組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該宿主細胞を提供する。

本発明は更に、抗宿主細胞抗原抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質の一般的製造方法を提供し、該方法は、ＢＭＴ２遺伝子と、ＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ３遺伝子の少なくとも１つとが欠失または破壊されている組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該宿主細胞を準備し、該組換えタンパク質または糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換えタンパク質または糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を得ることを含む。更に詳細な実施形態においては、ＢＭＴ２遺伝子、ＢＭＴ１遺伝子およびＢＭＴ３遺伝子が欠失または破壊されている。

更に詳細な態様においては、本発明は、抗宿主細胞抗原抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質の一般的製造方法を提供し、該方法は、ＢＭＴ１遺伝子、ＢＭＴ２遺伝子、ＢＭＴ３遺伝子およびＢＭＴ４遺伝子が欠失または破壊されている組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞であって、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子を含む該宿主細胞を準備し、該組換えタンパク質または糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該組換えタンパク質または糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換えタンパク質または糖タンパク質を得ることを含む。

一般に、該組換えタンパク質または糖タンパク質は治療用糖タンパク質である。想定される治療用糖タンパク質の具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニスト。

本発明の特定の態様においては、該組換えタンパク質または糖タンパク質をコードする核酸分子は、宿主細胞内における組換えタンパク質または糖タンパク質の発現を増強するようにコドンが最適化されている。例えば、実施例に示されているとおり、末端がシアル酸化された両方の分岐を主なグリコフォームが含む二分岐Ｎ−グリカンを含むエリスロポエチン変異体を産生するように遺伝的に操作されているメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株におけるエリスロポエチンの発現を増強するために、エリスロポエチンのヒト成熟形態をコードする核酸分子をコドン最適化した。

本発明は更に、本発明における方法を使用して及び本明細書に記載の宿主細胞において製造された、宿主細胞抗原に対する抗体への検出可能な交差結合を欠く１以上のタンパク質または糖タンパク質を含む組成物を提供する。該組成物は更に、医薬上許容される担体および塩を含み得る。

適切な宿主細胞には、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３および／またはＢＭＴ４遺伝子のホモログを含む任意の宿主細胞が含まれる。現在、そのような宿主細胞の具体例には、カンジダ・アルビカンス（Ｃａｎｄｉｄａａｌｂｉｃａｎｓ）およびメチロトローフ酵母ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる。したがって、本発明の特定の態様においては、該宿主細胞はメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）、およびその突然変異体、および遺伝的に操作された変異体である。本発明における使用に想定されるメチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）は、グリコシル化パターンがヒト様である又はヒト化されている糖タンパク質をそれらが発現するように、遺伝的に修飾され得る。このようにして、特定の所望のグリコフォームが該組成物において優勢である糖タンパク質組成物が製造され得る。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または該宿主細胞を遺伝的に操作し、および／または外在性酵素を供与して、哺乳類グリコシル化経路の全部または一部を模擬することにより（ＵＳ２００４／００１８５９０に記載されているとおり）、それは達成され得る。所望により、該グリコシル化の追加的遺伝的操作を行って、該糖タンパク質が、コアフコシル化を伴って又は伴わないで産生され得るようにすることが可能である。下等真核宿主細胞の使用は更に有利である。なぜなら、これらの細胞は糖タンパク質の高度に均一な組成物を産生することが可能であり、該糖タンパク質の主要グリコフォームが該組成物中の糖タンパク質の３０モル％超（すなわち、３０モル％を超えて）で存在することが可能となるからである。特定の態様においては、該主要グリコフォームは、該組成物中に存在する糖タンパク質の４０モル％超、５０モル％超、６０モル％超、７０モル％超、最も好ましくは８０モル％超で存在し得る。選択された内在性グリコシル化酵素を除去し、および／または外在性酵素を供与することにより（Ｇｅｍｇｒｏｓｓら，米国特許第７，０２９，８７２号および米国特許第７，４４９，３０８号に記載されているとおり）、それは達成され得る。例えば、宿主細胞は、糖タンパク質上のＮ−グリカン上にマンノース残基を付加する１，６−マンノシルトランスフェラーゼ活性を欠くように選択され又は操作され得る。

１つの実施形態においては、該宿主細胞は更に、α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、α１，２−マンノシダーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る組換え糖タンパク質の通過は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核宿主細胞を開示している。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩまたはＧｎＴＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。例えば、米国特許第７，０２９，８７２号、米国特許第７，４４９，３０８号および米国公開特許出願第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、マンノシダーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００４／０２３００４２号は、マンノシダーゼＩＩ酵素を発現し、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に有する糖タンパク質を産生し得る下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、Ｎ−アセチルグルコサミニルトランスフェラーゼＩＩ（ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩまたはＧｎＴＩＩ）触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号ならびに米国公開特許出願第２００４／００１８５９０号および第２００５／０１７０４５２号は、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をヘキサミニダーゼでインビトロで処理して、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２もしくはＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生する。米国特許第７，０２９，８７２号および米国公開特許出願第２００６／００４０３５３号は、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む糖タンパク質を産生し得る下等真核宿主細胞を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をガラクトシダーゼでインビトロで処理して、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質、例えば、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質組成物を産生させることが可能である。

更に詳細な実施形態においては、直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生する。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌の場合、該宿主細胞が、Ｎ−グリカンへの転移のためのＣＭＰ−シアル酸を供与するための手段を更に含むことが有用である。米国公開特許出願第２００５／０２６０７２９号は、ＣＭＰ−シアル酸合成経路を有するように下等真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示しており、米国公開特許出願第２００６／０２８６６３７号は、シアル酸化糖タンパク質を産生するように真核生物を遺伝的に操作するための方法を開示している。前記細胞において産生された糖タンパク質をノイラミニダーゼでインビトロで処理して、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームもしくはＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームまたはそれらの混合物を主に含む組換え糖タンパク質を産生させることが可能である。

前記宿主細胞はいずれも、米国公開特許出願第２００４／０７４４５８号および第２００７／００３７２４８号に開示されているような二分岐（ｂｉｓｅｃｔｅｄ）（ＧｎＴＩＩＩ）および／または多分岐（ＧｎＴＩＶ、Ｖ、ＶＩおよびＩＸ）Ｎ−グリカン構造を有する糖タンパク質を産生させるためのＧｎＴＩＩＩ、ＧｎＴＩＶ、ＧｎＴＶ、ＧｎＴＶＩおよびＧｎＴＩＸからなる群から選択される１以上のＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼを更に含み得る。

更に詳細な実施形態においては、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生する宿主細胞は更に、ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、ガラクトシルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを主に含む組換え糖タンパク質を産生する。

更に詳細な実施形態においては、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを主に有する糖タンパク質を産生した直前の宿主細胞は更に、シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメインを含み、該触媒ドメインは、該触媒ドメインに通常は結合していない細胞標的化シグナルペプチドに融合しており、該シグナルペプチドは、シアリルトランスフェラーゼ活性を該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化するように選択される。該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置を通る該組換え糖タンパク質の通過は、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２グリコフォームを含む組換え糖タンパク質を産生する。

更に詳細な態様においては、前記宿主はいずれも、フコシルトランスフェラーゼ、およびフコースを産生しフコースをＥＲまたはゴルジ内に輸送する経路を含むように更に修飾される。Ｎ−グリカンの１以上がフコシル化されている糖タンパク質を産生し得るようにピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）を修飾するための方法の具体例はＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００８／００２７８７に開示されている。本発明の特定の態様においては、該ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞は、ＧＤＰ−マンノース−４，６−デヒドラターゼ、ＧＤＰ−ケト−デオキシ−マンノース−エピメラーゼ／ＧＤＰ−ケト−デオキシ−ガラクトース−レダクターゼ、ＧＤＰ−フコース輸送体およびフコシルトランスフェラーゼを含むフコシル化経路を含むように更に修飾される。特定の態様においては、フコシルトランスフェラーゼは、α１，２−フコシルトランスフェラーゼ、α１，３−フコシルトランスフェラーゼ、α１，４−フコシルトランスフェラーゼおよびα１，６−フコシルトランスフェラーゼからなる群から選択される。

種々の前記宿主細胞は更に、１以上の糖輸送体、例えばＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体［例えば、クライベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓｌａｃｔｉｓ）およびムス・ムスクルス（Ｍｕｓｍｕｓｃｕｌｕｓ）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体］、ＵＤＰ−ガラクトース輸送体［例えば、キイロショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体］およびＣＭＰ−シアル酸輸送体（例えば、ヒトシアル酸輸送体）を含む。下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は前記輸送体を欠くため、下等真核宿主細胞、例えば酵母および糸状菌は、前記輸送体を含むように遺伝的に操作されることが好ましい。

宿主細胞には更に、ホスホマンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＰＮＯ１およびＭＮＮ４Ｂの一方または両方を欠失または破壊することにより、ホスホマンノース残基を有する糖タンパク質を排除するように遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）が含まれる（例えば、米国特許第７，１９８，９２１号および第７，２５９，００７号を参照されたい）。更に詳細な態様においては、それは、ＭＮＮ４Ａ遺伝子を欠失または破壊することをも含み得る。破壊は、特定の酵素をコードするオープンリーディングフレームを破壊する（妨げる）こと、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊する（妨げる）こと、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、β−マンノシルトランスフェラーゼおよび／またはホスホマンノシルトランスフェラーゼの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞には更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかが含まれ得る。

宿主細胞には更に、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ［Ｄｏｌ−Ｐ−Ｍａｎ：タンパク質（Ｓｅｒ／Ｔｈｒ）マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子）（ＰＭＴ）（米国特許第５，７１４，３７７号を参照されたい）］の１以上を欠失または破壊することにより糖タンパク質のＯ−グリコシル化を制御するように遺伝的に修飾された、あるいは公開国際出願番号ＷＯ２００７０６１６３１に開示されているとおりにＰｍｔｐインヒビターおよび／またはアルファ−マンノシダーゼの存在下で増殖された、あるいはそれらの両方に付された下等真核細胞［例えば、酵母、例えば、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）］が含まれる。破壊は、Ｐｍｔｐをコードするオープンリーディングフレームを破壊する（妨げる）こと、または該オープンリーディングフレームの発現を破壊する（妨げる）こと、または干渉性ＲＮＡ、アンチセンスＲＮＡなどを使用して、Ｐｍｔｐの１以上をコードするＲＮＡの翻訳を阻害することを含む。該宿主細胞には更に、特定のＮ−グリカン構造を産生するように修飾された前記宿主細胞のいずれかが含まれ得る。

Ｐｍｔｐインヒビターには、ベンジリデンチアゾリジンジオンが含まれるが、これに限定されるものではない。使用され得るベンジリデンチアゾリジンジオンとしては、５−［［３，４−ビス（フェニルメトキシ）フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸、および５−［［３−（１−フェニル−２−ヒドロキシ）エトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン］−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸が挙げられる。

特定の実施形態においては、少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失される。例えば、特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失され、あるいは該宿主細胞は１以上のＰＭＴインヒビターの存在下で培養される。更に詳細な実施形態においては、該宿主細胞は１以上のＰＭＴ遺伝子の欠失または破壊を含み、該宿主細胞は１以上のＰｍｔｐインヒビターの存在下で培養される。これらの実施形態の特定の態様においては、該宿主細胞は分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼをも発現する。

ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターは、Ｏ−グリコシル化の占有を低減することにより、すなわち、グリコシル化される糖タンパク質上のＯ−グリコシル化部位の総数を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。該細胞により分泌されるアルファ−１，２−マンノシダーゼの更なる添加は、該糖タンパク質上に存在するＯ−グリカンのマンノース鎖長を減少させることにより、Ｏ−グリコシル化を制御する。したがって、ＰＭＴ欠失もしくは破壊および／またはＰｍｔｐインヒビターを分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼの発現と組合せることは、占有および鎖長を減少させることによりＯ−グリコシル化を制御する。個々の状況においては、個々の異種糖タンパク質（例えば、抗体）は種々の度合の効率で発現されゴルジ装置から輸送される可能性があり、したがって、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびアルファ−１，２−マンノシダーゼの特定の組合せを要し得るため、ＰＭＴ欠失または破壊、Ｐｍｔｐインヒビターおよびアルファ−１，２−マンノシダーゼの個々の組合せは実験的に決定される。もう１つの態様においては、１以上の内在性マンノシルトランスフェラーゼ酵素をコードする遺伝子が欠失される。この欠失は分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与と組合されることが可能であり、あるいは分泌性アルファ−１，２−マンノシダーゼおよび／またはＰＭＴインヒビターの供与の代わりに行われ得る。

したがって、Ｏ−グリコシル化の制御は、より良好な通算収率または適切に構築された糖タンパク質の収率で、本明細書に開示されている宿主細胞において特定の糖タンパク質を製造するのに有用であり得る。Ｏ−グリコシル化の低減または排除は糖タンパク質（例えば、全抗体）の構築および輸送に有益な効果をもたらすらしい。なぜなら、それらは分泌経路を横断し、細胞表面へ輸送されるからである。したがって、Ｏ−グリコシル化が制御された細胞においては、適切に構築された糖タンパク質、例えば抗体フラグメントの収率が、Ｏ−グリコシル化が制御されていない宿主細胞において得られる収率と比較して増加する。

糖タンパク質の収率は、場合によっては、哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子を過剰発現させることにより、あるいは１以上の内在性シャペロンタンパク質をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換することにより改善され得る。また、宿主細胞における哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質の発現も該細胞におけるＯ−グリコシル化を制御するらしい。したがって、シャペロンタンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能が低減または排除されており、該シャペロンタンパク質の哺乳類またはヒトホモログの少なくとも１つをコードするベクターが細胞内で発現される、本発明における宿主細胞が更に含まれる。また、該内在性宿主細胞シャペロンおよび該哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質が発現される宿主細胞も含まれる。更に詳細な態様においては、下等真核宿主細胞は酵母または糸状菌宿主細胞である。組換えタンパク質の収率の改善およびＯ−グリコシル化の低減または制御のためにヒトシャペロンタンパク質が導入される、宿主細胞のシャペロンの使用の具体例は、ＰＣＴ国際出願番号ＰＣＴ／ＵＳ２００９／０３３５０７に開示されている。前記と同様に、該内在性シャペロンタンパク質の１以上をコードする遺伝子を、１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質をコードする核酸分子で置換すること、あるいは前記のとおりに１以上の哺乳類またはヒトシャペロンタンパク質を過剰発現させることに加えて、タンパク質Ｏ−マンノシルトランスフェラーゼ（ＰＭＴ）タンパク質をコードする少なくとも１つの内在性遺伝子の機能または発現が低減、破壊または欠失されている、下等真核宿主細胞が更に含まれる。特定の実施形態においては、ＰＭＴ１、ＰＭＴ２、ＰＭＴ３およびＰＭＴ４遺伝子からなる群から選択される少なくとも１つの内在性ＰＭＴ遺伝子の機能が低減、破壊または欠失されている。

したがって、本明細書に開示されている方法は、糖タンパク質を産生するように遺伝的に修飾されたいずれかの宿主細胞を使用することが可能であり、この場合、該主要Ｎ−グリカンは、複合Ｎ−グリカン、ハイブリッドＮ−グリカンおよび高マンノースＮ−グリカンからなる群から選択され、ここで、複合Ｎ−グリカンは、Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡＣ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択され、ハイブリッドＮ−グリカンは、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択され、高マンノースＮ−グリカンは、Ｍａｎ_６ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_７ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｍａｎ_８ＧｌｃＮＡｃ_２およびＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２からなる群から選択される。Ｎ−グリカン構造の具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない：Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_３ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_３ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_４ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡ_２Ｇａｌ_２ＧｌｃＮＡｃ_２Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡ_３Ｇａｌ_３ＧｌｃＮＡｃ_３Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_４Ｇａｌ_４ＧｌｃＮＡｃ_４Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２。

該組換え宿主細胞を構築するために使用され得る酵母選択マーカーには、薬物耐性マーカー、および必須細胞栄養素（例えば、アミノ酸）を酵母宿主細胞が合成するのを可能にする遺伝的機能体が含まれる。酵母において一般に使用される薬物耐性マーカーには、クロラムフェニコール、カナマイシン、メトトレキセート、Ｇ４１８（ゲネティシン（ｇｅｎｅｔｉｃｉｎ））、ゼオシンなどが含まれる。酵母宿主細胞が必須細胞栄養素を合成するのを可能にする遺伝的機能体は、対応ゲノム機能における栄養要求性突然変異を有する利用可能な酵母株と共に使用される。一般的な酵母選択マーカーは、ロイシン（ＬＥＵ２）、トリプトファン（ＴＲＰ１およびＴＲＰ２）、プロリン（ＰＲＯ１）、ウラシル（ＵＲＡ３、ＵＲＡ５、ＵＲＡ６）、ヒスチジン（ＨＩＳ３）、リシン（ＬＹＳ２）、アデニン（ＡＤＥ１またはＡＤＥ２）などを合成するための遺伝的機能を付与する。他の酵母選択マーカーには、亜ヒ酸塩の存在下で増殖される酵母細胞に亜ヒ酸塩耐性を付与するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）由来のＡＲＲ３遺伝子が含まれる（Ｂｏｂｒｏｗｉｃｚら，Ｙｅａｓｔ，１３：８１９−８２８（１９９７）；Ｗｙｓｏｃｋｉら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：３００６１−３００６６（１９９７））。幾つかの適当な組込み部位は、米国特許第７，４７９，３８９号に列挙されているものを含み、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座に対するホモログを含む。酵母内にベクターを組込むための方法はよく知られている（例えば、米国特許第７，４７９，３８９号、米国特許第７，５１４，２５３号、米国公開出願第２００９０１２４００号およびＷＯ２００９／０８５１３５を参照されたい）。挿入部位の具体例には、ピチア（Ｐｈｉｃｈｉａ）ＡＤＥ遺伝子、ピチアＴＲＰ（ＴＲＰ１〜ＴＲＰ２を含む）遺伝子、ピチアＭＣＡ遺伝子、ピチアＣＹＭ遺伝子、ピチアＰＥＰ遺伝子、ピチアＰＲＢ遺伝子およびピチアＬＥＵ遺伝子が含まれるが、これらに限定されるものではない。ピチア（Ｐｉｃｈｉａ）ＡＤＥ１およびＡＲＧ４遺伝子はＬｉｎＣｅｒｅｇｈｉｎｏら，Ｇｅｎｅ２６３：１５９−１６９（２００１）および米国特許第４，８１８，７００号に記載されており、ＨＩＳおよびＴＲＰ１遺伝子はＣｏｓａｎｏら，Ｙｅａｓｔ１４：８６１−８６７（１９９８）に記載されており、ＨＩＳ４はＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号Ｘ５６１８０に記載されている。

本発明は更に、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法を提供する。該方法は、シアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されており、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンＥＰＯを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲまたはゴルジ装置を標的化し、該融合タンパク質がＥＲまたはゴルジ装置内に存在する場合には除去される）を含む組換えピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主細胞（ここで、少なくともＢＭＴ１、ＢＭＴ２およびＢＭＴ３遺伝子が欠失または破壊されている）を準備し、第１および第２融合タンパク質を発現させプロセシングするのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、該成熟ヒトエリスロポエチンを該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンを得ることを含む。

特定の態様においては、成熟ヒトエリスロポエチンをコードする核酸分子は、メチロトローフ酵母、例えばピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における最適発現のためにコドンが最適化されている。実施例に示されているとおり、成熟ヒトエリスロポエチンは融合タンパク質としてコードされており、ここで、ＥＰＯは、エリスロポエチンの成熟形態のＮ末端において、グリコシル化を含むプロセシングのための分泌経路に融合タンパク質を標的化するシグナルペプチドのＣ末端に融合されている。シグナルペプチドの具体例には、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドまたはニワトリリゾチームシグナルペプチドが含まれるが、これらに限定されるものではない。本明細書に開示されているものの代わりに、他のシグナル配列、例えばアスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｎｉｇｅｒ）α−アミラーゼシグナルペプチドおよびヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）シグナルペプチドが使用可能である。１つの実施形態においては、第１核酸分子は、該成熟エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしており、第２核酸分子は、該成熟エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドニワトリリゾチームシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしている。該シグナルペプチドは、１以上のプロテアーゼ切断部位を含有し得るリンカーペプチドにより、該成熟ヒトエリスロポエチンに融合され得る。

更に詳細な態様においては、該宿主細胞は、該成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードする発現カセットの２〜１２個のコピーを含む。幾つかの態様においては、該宿主細胞は、該成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードする発現カセットの約８〜１１個のコピーを含む。他の態様においては、該宿主細胞は、該第１核酸の約３〜４個のコピー、および該第２核酸の５〜７個のコピーを含む。

該宿主細胞は、シアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作されており、ここで、少なくともＢＭＴ１、ＢＭＴ２およびＢＭＴ３遺伝子が欠失または破壊されている。そのような宿主細胞は更に、少なくとも、ＯＣＨ１、ＰＮＯ１、ＭＮＮ４およびＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の欠失または破壊を含む。該宿主細胞は更に、少なくとも以下のキメラグリコシル化酵素をコードする１以上の核酸分子を含む：細胞標的化ペプチドに融合したα１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（該細胞標的化ペプチドは該触媒ドメインを該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化する）、細胞標的化ペプチドに融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（該細胞標的化ペプチドは該触媒ドメインを該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化する）、細胞標的化ペプチドに融合したマンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（該細胞標的化ペプチドは該触媒ドメインを該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化する）、細胞標的化ペプチドに融合したＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（該細胞標的化ペプチドは該触媒ドメインを該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化する）、細胞標的化ペプチドに融合したβ１，４−ガラクトシルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（該細胞標的化ペプチドは該触媒ドメインを該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化する）、および細胞標的化ペプチドに融合したα１，２−シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（該細胞標的化ペプチドは該触媒ドメインを該宿主細胞のＥＲまたはゴルジ装置に標的化する）。これらのグリコシル化酵素は、それらが標的化される、ＥＲまたはゴルジ装置内の位置で活性となるように選択される。グリコシル化酵素を選択し、最適な活性のために該酵素をＥＲまたはゴルジ装置の特定の領域に標的化するための方法は、米国特許第７，０２９．８７２号および第７，４４９，３０８号ならびに公開米国出願第２００６／００４０３５３号および第２００６／０２８６６３７号に記載されている。該宿主細胞は、公開米国出願第２００６／０２８６６３７号に記載されているとおり、ＣＭＰ−シアル酸を産生させるための経路の酵素を含むように、ならびにＧｌｃＮＡｃおよびガラクトース輸送体およびＵＤＰ−ガラクトース−４−エピメラーゼを含むように更に修飾される。最後に、該宿主は、細胞標的化ペプチドに融合した真菌α１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（該細胞標的化ペプチドは該触媒ドメインを分泌のために分泌経路に標的化する）をコードする核酸を更に含み、これは、Ｏ−グリカン占有および鎖長の低減をもたらす。

宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性の検出はサンドイッチＥＬＩＳＡまたはウエスタンブロットにおいて決定され得る。

更に詳細な態様においては、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含み、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない成熟ヒトエリスロポエチンの回収は、カチオン交換クロマトグラフィー工程および／またはヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程および／またはアニオン交換クロマトグラフィー工程を含む。１つの実施形態においては、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含み、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない成熟ヒトエリスロポエチンの回収は、カチオン交換クロマトグラフィー工程およびそれに続くヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を含む。所望により、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含み、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない成熟ヒトエリスロポエチンの回収は、アニオンクロマトグラフィー工程を含む。

更に、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含み、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、本明細書に開示されているとおりに得られる成熟ヒトエリスロポエチンおよび医薬上許容される塩を含む組成物を提供する。特定の実施形態においては、該Ｎ−グリカンの約５０〜６０％は両分岐上にシアル酸残基を含み、更に詳細な実施形態においては、該Ｎ−グリカンの７０％超は両分岐上にシアル酸残基を含む。更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンの３０％未満は中性Ｎ−グリカン（すなわち、該Ｎ−グリカンの非還元末端における少なくとも１つの末端においてシアル酸化されていない）である。更に詳細な態様においては、該Ｎ−グリカンの２０％未満は中性Ｎ−グリカンである。

特定の態様においては、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含み、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない成熟ヒトエリスロポエチンは、親水性ポリマーにコンジュゲート化され、特定の実施形態においては、該親水性ポリマーはポリエチレングリコールである。ポリエチレングリコールポリマーにコンジュゲート化された、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの具体例は共有米国公開出願第２００８／０１３９４７０号に記載されている。

該ポリエチレングリコールポリマー（ＰＥＧ）基は任意の簡便な分子量のものであることが可能であり、直鎖状または分枝状であり得る。ＰＥＧの平均分子量は、好ましくは約２キロダルトン（「ｋＤａ」）〜約１００ｋＤａ、より好ましくは約５ｋＤａ〜約６０ｋＤａ、より好ましくは約２０ｋＤａ〜約５０ｋＤａ、最も好ましくは約３０ｋＤａ〜約４０ｋＤａの範囲である。これらのＰＥＧは、ＮＯＦＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ（Ｔｏｋｙｏ，Ｊａｐａｎ）、ＤｏｗＰｈａｒｍａ（ＣｈｉｒｏＴｅｃｈＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＵＫ）、Ｎｅｋｔａｒ（ＳａｎＣａｒｌｏｓ，ＣＡ）およびＳｕｎＢｉｏ（ＡｎｙａｎｇＣｉｔｙ，ＳｏｕｔｈＫｏｒｅａ）を含むいずれかの商業的販売業者から供給され得る。適切なＰＥＧ部分には、例えば、４０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド；６０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒド；３１ｋＤａアルファ−メチル−ｗ−（３−オキソプロポキシ）、ポリオキシエチレン；３０ｋＤａＰＥＧ：３０ｋＤａメトキシポリ（エチレングリコール）プロピオンアルデヒドおよび４５ｋＤａ２，３−ビス（メチルポリオキシエチレン−オキシ）−１−［（３−オキソプロピル）ポリオキシエチレン−オキシ］−プロパンが含まれる。ＰＥＧ基は一般に、関心のあるタンパク質またはポリペプチド上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノまたはエステル基）への、ＰＥＧ部分上の反応性基（例えば、アルデヒド、アミノ、チオールまたはエステル基）を介したアシル化または還元的アミノ化により、該エリスロポエチンに結合される。例えば、ＰＥＧ部分は、エリスロポエチンのＮ末端アミノ酸残基に、直接的に、またはリンカーを介して連結され得る。

合成ペプチドのＰＥＧ化のための有用な方法は、溶液中でのコンジュゲート連結の形成を介して、ペプチドとＰＥＧ部分（それぞれは、お互いに対して反応性である特別な官能性を含有する）とを合体させることからなる。該ペプチドは、通常の固相合成により容易に製造され得る（例えば、実施例４を参照されたい）。該ペプチドは、特定の部位の適切な官能基で「前活性化」される。該前駆体を精製し、十分に特徴づけした後、ＰＥＧ部分と反応させる。該ペプチドとＰＥＧとの連結は通常、水相中で行われ、逆相分析用ＨＰＬＣにより容易にモニターされ得る。該ＰＥＧ化ペプチドは分取ＨＰＬＣにより容易に精製され、分析用ＨＰＬＣ、アミノ酸分析およびレーザー脱着質量分析により特徴づけられ得る。

以下の実施例は本発明の更なる理解を促すことを意図したものである。

遺伝的に操作されたピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＹＧＬＹ３１５９は、シアル酸化Ｎ−グリカンを有する組換えヒトエリスロポエチン（ｒｈＥＰＯ）を産生する株である。該株の構築は米国公開出願第２００８０１３９４７０号に記載されており、図１に図示されている。簡潔に説明すると、該株は、以下のとおりに構築した。

株ＹＧＬＹ３１５９は、既に記載されている方法（例えば、米国特許第７，４４９，３０８号、米国特許第７，４７９，３８９号、米国公開出願第２００９０１２４０００号、公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００９０８５１３５、ＮｅｔｔおよびＧｅｒｎｇｒｏｓｓ，Ｙｅａｓｔ２０：１２７９（２００３）、Ｃｈｏｉら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ１００：５０２２（２００３）、Ｈａｍｉｌｔｏｎら，Ｓｃｉｅｎｃｅ３０１：１２４４（２００３）を参照されたい）を用いて野生型ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０から構築した。全てのプラスミドは、標準的な分子生物学的方法を用いて、ｐＵＣ１９プラスミドにおいて作製した。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関して最適化されたヌクレオチド配列に関しては、天然ヌクレオチド配列をＧＥＮＥＯＰＴＩＭＩＺＥＲソフトウェア（ＧｅｎｅＡｒｔ，Ｒｅｇｅｎｓｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）により解析し、その結果を用いて、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）発現に関してコドンが最適化されたヌクレオチド配列を得た。酵母株をエレクトロポレーション（エレクトロポレーターＢｉｏＲａｄの製造業者により推奨されている標準的な技術を用いるもの）により形質転換した。

プラスミドｐＧＬＹ６（図２）は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）インベルターゼ遺伝子または転写単位（ＳｃＳＵＣ２；配列番号１）を含む核酸分子を含有し、該核酸分子は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５９）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６０）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ６を線状化し、該線状化プラスミドを野生型株ＮＲＲＬ−Ｙ１１４３０内に形質転換して、ＳｃＳＵＣ２遺伝子がＵＲＡ５遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ１−３を選択した。これはウラシルに対して栄養要求性である。

プラスミドｐＧＬＹ４０（図３）は、ＯＣＨ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位（配列番号６１）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子（配列番号６２）に隣接しており、そしてこれは、一方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６４）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＯＣＨ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６５）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４０をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子がＯＣＨ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２−３を選択した。これはＵＲＡ５に対して栄養要求性である。株ＹＧＬＹ２−３を５−フルオロオロト酸（５−ＦＯＡ）の存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけがＯＣＨ１遺伝子座内に残存した幾つかの株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株ＹＧＬＹ４−３を選択した。

プラスミドｐＧＬＹ４３ａ（図４）は、ＢＭＴ２遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ケイ・ラクティス（Ｋ．ｌａｃｔｉｓ）ＵＤＰ−Ｎ−アセチルグルコサミン（ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ）輸送体遺伝子または転写単位（ＫｌＭＮＮ２−２、配列番号３）を含む核酸分子を含有しており、該核酸分子は、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子に隣接している。該隣接遺伝子は、一方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６６）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＢＭＴ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６７）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４３ａをＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ４−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＫｌＭＮＮ２−２遺伝子およびＵＲＡ遺伝子がＢＭＴ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＢＭＴ２遺伝子はＭｉｌｌｅら，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８３：９７２４−９７３６（２００８）および米国特許第７，４６５，５５７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ６−３を選択した。これはウラシルに対して原栄養性である。株ＹＧＬＹ６−３を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した株を得た。これは、該株をウラシルに対して栄養要求性にする。株ＹＧＬＹ８−３を選択した。

プラスミドｐＧＬＹ４８（図５）は、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体オープンリーディングフレーム（ＯＲＦ）のマウスホモログをコードする核酸分子（配列番号１７）を含む発現カセットを含有しており、該マウスホモログコード化核酸分子は、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子（配列番号５３）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列を含む核酸分子（配列番号５６）に機能的に連結されており、さらに前記マウスホモログコード化核酸分子は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む核酸分子に隣接しており、ここで、これらの発現カセットは全体として、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７６）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７７）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４８をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ８−３内に形質転換して、マウスＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体およびＵＲＡ５遺伝子をコードする発現カセットがＭＮＮ４Ｌ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＭＮＮ４Ｌ１遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ１０−３を選択し、ついで５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１２−３を選択した。

プラスミドｐＧＬＹ４５（図６）は、ＰＮＯ１／ＭＮＮ４遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、ＰＮＯ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７４）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＮＮ４遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７５）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ４５をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１２−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５遺伝子がＭＮＮ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。ＰＮＯ１遺伝子は米国特許第７，１９８，９２１号に開示されており、ＭＮＮ４遺伝子（ＭＮＮ４Ｂとも称される）は米国特許第７，２５９，００７号に開示されている。得られた株から株ＹＧＬＹ１４−３を選択し、ついで５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１６−３を選択した。

プラスミドｐＧＬＹ２４７（図７）は、ＭＥＴ１６遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含有し、これは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接しており、そしてこの核酸分子は、一方の側では、ＭＥＴ１６遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８４）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＭＥＴ１６遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８５）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２４７ＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１６−３内に形質転換して、ｌａｃＺ反復に隣接したＵＲＡ５がＭＥＴ１６遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ２０−３を選択した。

プラスミドｐＧＬＹ２４８（図８）は、ＵＲＡ５遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＭＥＴ１６遺伝子または転写単位（配列番号８６）を含む核酸分子を含有し、これは、一方の側では、ＵＲＡ５遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号５９）を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＵＲＡ５遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号６０）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２４８を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ２０−３内に形質転換して、ＵＲＡ５遺伝子座内に挿入されたＳｃＳＵＣ２遺伝子がＭＥＴ１６遺伝子で二重交差相同組換えにより置換された幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ２２−３を選択し、ついで５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＭＥＴ１６遺伝子座内に挿入されたＵＲＡ５遺伝子が喪失しｌａｃＺ反復だけが残存した幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ２４−３を選択した。

プラスミドｐＧＬＹ５８２（図９）は、ＨＩＳ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＵＤＰ−グルコースエピメラーゼ（ＳｃＧＡＬ１０）、（２）サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２−ｓリーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したヒトガラクトシルトランスフェラーゼＩ（ｈＧａｌＴ）触媒ドメイン、（３）ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位、（４）キイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）ＵＤＰ−ガラクトース輸送体（ＤｍＵＧＴ）をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＳｃＧＡＬ１０をコードする発現カセットは、ＳｃＧＡＬ１０ＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号２１）を含み、該ＯＲＦは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号４５）に機能的に連結されており、３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子（配列番号４６）に機能的に連結されている。キメラガラクトシルトランスフェラーゼＩをコードする発現カセットは、ＫＲＥ２−ｓリーダー３３をコードする核酸分子（配列番号１３）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＧａｌＴ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号２３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。ＤｍＵＧＴをコードする発現カセットは、ＤｍＵＧＴＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号１９）を含み、該ＯＲＦは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号４７）に機能的に連結されており、３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ１２転写終結配列を含む核酸分子（配列番号４８）に機能的に連結されている。それらの４つの縦列カセットは、一方の側では、ＨＩＳ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８７）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＨＩＳ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８８）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ５８２を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ２４−３内に形質転換して、それらの４つの縦列発現カセットがＨＩＳ１遺伝子内に相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ５８を選択した。これはヒスチジンに対して栄養要求性であり、ウリジンに対して原栄養性である。

プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂ（図１０）は、ＡＲＧ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（５３）にＮ末端において融合したキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメイン（ＫＤ）（コドン最適化されたもの）、（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位、および（３）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＭＮＮ２リーダーペプチド（５４）にＮ末端において融合したラットＮ−アセチルグルコサミン（ＧｌｃＮＡｃ）トランスフェラーゼＩＩ触媒ドメイン（ＴＣ）をコードする３つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＫＤ５３をコードする発現カセットは、ＭＮＮ２リーダー５３をコードする核酸分子（配列番号５）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたキイロショウジョウバエ（Ｄ．ｍｅｌａｎｏｇａｓｔｅｒ）マンノシダーゼＩＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号３３）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＨＩＳ１発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＩＳ１遺伝子または転写単位（配列番号８９）を含む核酸分子を含む。ＴＣ５４をコードする発現カセットは、ＭＮＮ２リーダー５４をコードする核酸分子（配列番号７）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたラットＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号３１）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。それらの３つの縦列カセットは、一方の側では、ＡＲＧ１遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号７９）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＡＲＧ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８０）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ１６７ｂをＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ５８内に形質転換して、それらの３つの縦列発現カセットがＡＲＧ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７３を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、ウリジンおよびヒスチジンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１２７２を選択した。

プラスミドｐＧＬＹ１４３０（図１１）は、ＡＤＥ１遺伝子座の発現を損なうことなくＡＤＥ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（１０）にＮ末端において融合したヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメイン（ＮＡ）、（２）ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体のマウスホモログ（ＭｍＴｒ）、（３）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＳＥＣ１２リーダーペプチド（８）にＮ末端において融合したマウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメイン（ＦＢ）、および（４）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位をコードする４つの発現カセットを縦列配置で含有する。ＫＩＮＫＯ（Ｋｎｏｃｋ−ＩｎｗｉｔｈｌｉｔｔｌｅｏｒＮｏＫｎｏｃｋ−Ｏｕｔ）組込みベクターは、標的化遺伝子座内への異種ＤＮＡの挿入を、該標的化遺伝子座における遺伝子の発現を損なうことなく可能にし、米国公開出願第２００９０１２４０００号に記載されている。ＮＡ１０をコードする発現カセットは、ＳＥＣ１２リーダー１０をコードする核酸分子（配列番号１１）に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたヒトＧｌｃＮＡｃトランスフェラーゼＩ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号２５）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ＭｍＴｒをコードする発現カセットは、ＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ輸送体ＯＲＦのマウスホモログをコードする核酸分子を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＳＥＣ４プロモーターを含む核酸分子（配列番号４９）に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＯＣＨ１終結配列を含む核酸分子（配列番号５０）に機能的に連結されている。ＦＢ８をコードする発現カセットは、ＳＥＣ１２−ｍリーダー８をコードする核酸分子（配列番号１５）に５’末端において融合している、マウスマンノシダーゼＩＡ触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号２７）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＤＰＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの４つの縦列カセットは、一方の側では、ＡＤＥ１遺伝子の５’領域および完全ＯＲＦからのヌクレオチド配列（配列番号８２）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列（配列番号５４）を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＡＤＥ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号８３）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ１４３０をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１２７２内に形質転換して、それらの４つの縦列発現カセットがＡＤＥ１ＯＲＦの直後のＡＤＥ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ１３０５を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、今やウリジン、ヒスチジンおよびアデニンに対して原栄養性である。ついで該株を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウリジンに対して今や栄養要求性である幾つかの株を得た。株ＹＧＬＹ１４６１を選択した。これは、主としてガラクトースを末端とするＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得る。

プラスミドｐＧＦＩ１６５（図１２）は、ＰＲＯ１遺伝子座の発現を損なうことなくＰＲＯ１遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドにＮ末端において融合したティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）α−１，２−マンノシダーゼ触媒ドメイン（ａＭＡＴＴｒＭａｎ）、および（２）ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位をコードする発現カセットを含有する。ａＭＡＴＴｒＭａｎをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子（配列番号９）に５’末端において融合している、ティー・レーセイ（Ｔ．ｒｅｅｓｅｉ）触媒ドメインをコードする核酸分子（配列番号２９）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。該ＵＲＡ５発現カセットは、ｌａｃＺ反復を含む核酸分子に隣接したピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子または転写単位を含む核酸分子を含む。それらの２つの縦列カセットは、一方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の５’領域および完全ＯＲＦからのヌクレオチド配列（配列番号９０）ならびにそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に、そして他方の側では、ＰＲＯ１遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号９１）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＦＩ１６５をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ１４６１内に形質転換して、それらの２つの発現カセットがＰＲＯ１ＯＲＦの直後のＰＲＯ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ１７０３を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、ウリジン、ヒスチジン、アデニンおよびプロリンに対して原栄養性である。この株は、Ｏ−グリコシル化が減少した糖タンパク質を産生し得る（公開米国出願第２００９０１７０１５９号）。

プラスミドｐＧＬＹ２０８８（図１３）は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１遺伝子座を標的化する組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および該細胞からの分泌に導くためのサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチド（アルファＭＦ−プレ）にＮ末端において融合している成熟ヒトエリスロポエチン（ＥＰＯ）、ならびに（２）ゼオシン耐性タンパク質（ＳｈｂｌｅまたはＺｅｏｃｉｎ^Ｒ）をコードする発現カセットを含有する。ＥＰＯをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドをコードする核酸分子に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化された成熟ヒトＥＰＯをコードする核酸分子（配列番号９２）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＯＸ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号５５）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。Ｚｅｏｃｉｎ^Ｒ発現カセットは、ＳｈｂｌｅＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号５８）を含み、これは、５’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＴＥＦ１プロモーター（配列番号５７）に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列に機能的に連結されている。それらの２つの縦列カセットは、一方の側では、ＴＲＰ２遺伝子を含むヌクレオチド配列（配列番号７８）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２０８８をＰｍｅＩ部位で線状化し、株ＹＧＬＹ１７０３内に形質転換して、それらの２つの発現カセットがＡＯＸ１遺伝子座内にロールイン（ｒｏｌｌｉｎ）単一交差相同組換え（これは、ＡＯＸ１遺伝子座を損なうことなくＡＯＸ１遺伝子座内に挿入されたＥＰＯ発現カセットの複数のコピーを与える）により挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ２８４９を選択した。これはアルギニンに対して栄養要求性であり、ウリジン、ヒスチジン、アデニンおよびプロリンに対して今や原栄養性である。該株から単離されたＤＮＡの配列決定データの強度の測定による判定で、該株は該ＥＰＯ発現カセットの約３〜４コピーを含有する。ＥＲおよびゴルジにおける該キメラＥＰＯのプロセシング中、該リーダーペプチドは除去される。したがって、産生されるｒｈＥＰＯはＥＰＯの成熟形態である。

プラスミドｐＧＬＹ２４５６（図１４）は、ＴＲＰ２遺伝子座の発現を損なうことなくＴＲＰ２遺伝子座を標的化するＫＩＮＫＯ組込みベクターであり、（１）マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体（ｍＣＭＰ−ＳｉａＴｒａｎｓｐ）、（２）ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼ（ｈＧＮＥ）、（３）ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位、（４）ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼ（ｈＣＭＰ−ＮＡＮＡ）、（５）ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼ（ｈＳＩＡＰＳ）、および（６）キメラ酵素をＥＲまたはゴルジに標的化するサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２リーダーペプチド（３３）にＮ末端において融合したマウスａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼ触媒ドメイン（ｍＳＴ６）をコードする６つの発現カセット、およびピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子または転写単位を含有する。マウスＣＭＰ−シアル酸輸送体をコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｍＣＭＰＳｉａＴｒａｎｓｐＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３５）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトＵＤＰ−ＧｌｃＮＡｃ２−エピメラーゼ／Ｎ−アセチルマンノサミンキナーゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＧＮＥＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３７）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＡＰＤＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＲＧ１遺伝子をコードする発現カセットは（配列番号８１）を含む。ヒトＣＭＰ−シアル酸シンターゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＣＭＰ−ＮＡＮＡＳＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号３９）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＧＰＤＡＨプロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。ヒトＮ−アセチルノイラミナート−９−ホスファートシンターゼをコードする発現カセットは、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｈＳＩＡＰＳＯＲＦをコードする核酸分子（配列番号４１）を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１プロモーターを含む核酸分子に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＭＡ１転写終結配列を含む核酸分子に機能的に連結されている。キメラマウスａ−２，６−シアリルトランスフェラーゼをコードする発現カセットは、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＫＲＥ２シグナルペプチドをコードする核酸分子に５’末端において融合している、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関してコドン最適化されたｍＳＴ６触媒ドメインをコードする核酸分子を含み、これは、５’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ１プロモーターを含む核酸分子（配列番号５１）に、そして３’末端においては、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＴＥＦ転写終結配列を含む核酸分子（配列番号５２）に機能的に連結されている。それらの６つの縦列カセットは、一方の側では、終止コドンで終わるＴｒｐ２ｐをコードするＯＲＦの５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号９８）およびそれに続くピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＬＧ３終結配列を含む核酸分子に隣接しており、他方の側では、ＴＲＰ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号９９）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２４５６をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ２８４９内に形質転換して、それらの６つの発現カセットがＴＲＰ２ＯＲＦの直後のＴＲＰ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ３１５９を選択した。これは今やウリジン、ヒスチジン、アデニン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）に対して耐性であり、該ＥＰＯ発現カセットの約３〜約４コピーを含有する。該株はｒｈＥＰＯを産生したが、実施例５の方法を用いた場合、該ｒｈＥＰＯは、ＨＣＡに対して産生された抗体への交差結合反応性を有する（実施例６を参照されたい）。

本明細書中の実施例においては、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）ゲノムの特定の遺伝子座内に種々の発現カセットを組込んだが、本発明の実施は、組込みに用いた遺伝子座には無関係であると理解される。本明細書に開示されている遺伝子座以外の遺伝子座が該発現カセットの組込みに用いられ得る。適切な組込み部位には、米国公開出願第２００７００７２２６２号に列挙されているものが含まれ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）および他の酵母または真菌に関して公知の遺伝子座のホモログが含まれる。

実施例１における株ＹＧＬＹ３１５９を、以下のとおりにＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子を破壊するために更に遺伝的に操作した。

株ＹＧＬＹ３１５９を５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、株ＹＧＬＹ３２２５を得た。これは今やウリジンに対して栄養要求性である。

プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）（図１５）は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号７２）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号７３）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１１を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ３１５９内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ４４３９を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）に対して耐性であり、該ｒｈＥＰＯ発現カセットの約３〜４コピーを含有する。該株はＢＭＴ２およびＢＭＴ４遺伝子の破壊または欠失を有する。

プラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）（図１６）は、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（配列番号１０２）およびアシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（配列番号１０５）に機能的に連結されたノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴ^Ｒ）ＯＲＦ（配列番号１０２）［元々はｐＡＧ２５（ＥＲＯＳＣＡＲＦ，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＧｍｂＨ，Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ１３ａ，Ｄ−１３５２ＢａｄＨｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ１５：１５４１（１９９９）を参照されたい］をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該発現カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号６８）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号６９）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４３０を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ４４３９内に形質転換して、該ＮＡＴ^Ｒ発現カセットがＢＭＴ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ６６６１を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）およびノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対して耐性であり、該ＥＰＯ発現カセットの約３〜４コピーを含有する。該株はＢＭＴ１、ＢＭＴ２およびＢＭＴ４遺伝子の破壊または欠失を有する。株ＹＧＬＹ７０１３をも選択した。しかし、この株は、ＢＭＴ１遺伝子の部分的破壊を有していたに過ぎなかった。この株はＢＭＴ１、ＢＭＴ２およびＢＭＴ４遺伝子の破壊または欠失を有することが示された。

プラスミドｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）（図１７）は、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーター（配列番号１０５）およびアシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列（配列番号１０６）に機能的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｈｙｇ^Ｒ）ＯＲＦ（配列番号１０３）をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有し、該発現カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号７０）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号７１）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４３０を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ６６６１内に形質転換して、該Ｈｙｇ^Ｒ発現カセットがＢＭＴ３遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７３６１〜ＹＧＬＹ７３６６および株ＹＧＬＹ７３９３〜ＹＧＬＹ７３９８を選択した。これらはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）、ノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）およびヒグロマイシンに対して耐性であり、該ＥＰＯ発現カセットの約３〜４コピーを含有する。該株はＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子の破壊または欠失を有し、宿主細胞抗原（ＨＣＡ）に対して産生された抗体への交差結合反応性を欠くｒｈＥＰＯを産生する。

実施例１における株ＹＧＬＹ３１５９を、ＢＭＴ１、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子が破壊または欠失された株を産生するように、ならびにニワトリリゾチームリーダーペプチドに融合した成熟ヒトＥＰＯをコードする発現カセットの幾つかのコピーを含むように更に遺伝的に操作した。簡潔に、ＹＧＬＹ３１５９からのこれらの株の構築を図１に示し、以下に簡潔に説明する。

プラスミドｐＧＬＹ２０５７（図１８）は、ＡＤＥ２遺伝子座を標的化する組込みプラスミドであり、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子をコードする発現カセットを含有する。該発現カセットは、一方の側では、ＡＤＥ２遺伝子の５’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１００）を含む核酸分子に、他方の側では、ＡＤＥ２遺伝子の３’領域からのヌクレオチド配列（配列番号１０１）を含む核酸分子に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２０５７をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ３２２５内に形質転換して、該ＵＲＡ５カセットがＡＤＥ２遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ３２２９を選択した。これはアデニンに対して栄養要求性であり、ウリジン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）に対して耐性であり、該ＥＰＯ発現カセットの約３〜４コピーを含有する。

プラスミドｐＧＬＹ２６８０（図１９）は、ＴＲＰ２またはＡＯＸ１遺伝子座を標的化し得る組込みベクターであり、（１）キメラタンパク質を分泌経路および細胞からの分泌に導くニワトリリゾチームシグナルペプチドにＮ末端において融合したキメラＥＰＯ、および（２）プロモーターを伴わないピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ２遺伝子をコードする発現カセットを含有する。該ＡＤＥ２遺伝子は潜在性プロモーターから十分には転写されない。したがって、アデニンで補足されていない培地における該ベクターで形質転換されたａｄｅ２Δ酵母株の選択は、該組換え体がアデニンに対して原栄養性となるためには、該ベクターの複数のコピーがゲノム内に組み込まれることを要する。該ベクターは該ＥＰＯ発現カセットを更に含むため、該組換え酵母は、ゲノム内に組み込まれた該ＥＰＯカセットの複数のコピーをも含むであろう。このベクターおよび方法は公開ＰＣＴ出願ＷＯ２００９０８５１３５に記載されている。ニワトリリゾチームシグナルペプチドをコードするＤＮＡ配列は配列番号９４に示されており、成熟ヒトＥＰＯをコードするコドン最適化ＯＲＦは配列番号９２に示されており、対応プロモーターを伴わないが対応終結配列を含む（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＡＤＥ２遺伝子は配列番号９６に示されている。該キメラＥＰＯはＡＯＸ１プロモーターおよびサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）ＣＹＣ終結配列に機能的に連結される。それらの２つの縦列カセットは、一方の側では、ＴＲＰ２遺伝子を含むヌクレオチド配列を含む核酸分子に隣接している。

プラスミドｐＧＬＹ２６８０をＰｍｅＩ部位で線状化し、株ＹＧＬＹ３２２９内に形質転換して、それらの２つの発現カセットがＡＯＸ１遺伝子座内にロールイン（ｒｏｌｌｉｎ）単一交差相同組換え（これは、ＡＯＸ１遺伝子座を損なうことなくＡＯＸ１遺伝子座内に挿入されたＥＰＯ発現カセットの複数のコピーを与える）により挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ４２０９を選択した。該遺伝子座内に挿入された該株から単離されたＤＮＡの配列決定データの強度の測定による判定で、該株は該ＥＰＯ発現カセットの約３〜４コピーを含有する。該株はアデニン、ウリジン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株は合計約８〜１１コピーのＥＰＯ発現カセットを含有する。ＥＲおよびゴルジにおける該キメラＥＰＯのプロセシング中、該リーダーペプチドは除去される。したがって、産生されるｒｈＥＰＯはＥＰＯの成熟形態である。

株ＹＧＬＹ４２０９を５‘−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ウラシルに対して栄養要求性である幾つかの株を得た。得られた形質転換体から、株ＹＧＬＹ４２４４を選択した。

ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子（配列番号１０４）を標的化するプラスミドｐＧＬＹ２７１３（図２０）は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットに隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＮＯ１ＯＲＦを含有する組込みベクターであり、該ＯＲＦおよび該発現カセットの全体は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＰＥＰ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ２７１３をＳｆｉＩで線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ４２４４内に形質転換して、該ＰＮＯ１ＯＲＦおよびＵＲＡ５発現カセットがＰＥＰ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ５０５３を選択し、５−ＦＯＡの存在下で対抗選択して、ＵＲＡ５がゲノムから喪失している幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ５５９７を選択した。これはアデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）に対して耐性であり、該ｒｈＥＰＯ発現カセットの約８〜１１コピーを含有する。

プラスミドｐＧＬＹ３４１１（ｐＳＨ１０９２）（図１５）は、ｌａｃＺ反復に隣接しているピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＵＲＡ５遺伝子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該ｌａｃＺ反復は、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号７２）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ４遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号７３）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４１１を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ５５９７内に形質転換して、該ＵＲＡ５発現カセットがＢＭＴ４遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ５６１８を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）およびノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対して耐性であり、該ｒｈＥＰＯ発現カセットの約８〜１１コピーを含有する。該株はＢＭＴ２およびＢＭＴ４遺伝子の破壊または欠失を有する。

プラスミドｐＧＬＹ３４３０（ｐＳＨ１１１５）（図１６）は、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に機能的に連結されたノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）耐性（ＮＡＴ^Ｒ）ＯＲＦ（配列番号１０２）［元々はｐＡＧ２５（ＥＲＯＳＣＡＲＦ，ＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＤｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔＧｍｂＨ，Ｄａｉｍｌｅｒｓｔｒａｓｓｅ１３ａ，Ｄ−１３５２ＢａｄＨｏｍｂｕｒｇ，Ｇｅｒｍａｎｙ）由来；Ｇｏｌｄｓｔｅｉｎら，Ｙｅａｓｔ１５：１５４１（１９９９）を参照されたい］をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有する組込みベクターであり、該発現カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号６８）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ１遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号６９）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４３０を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ５６１８内に形質転換して、該ＮＡＴ^Ｒ発現カセットがＢＭＴ１遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７１１０を選択した。これはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）およびノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）に対して耐性であり、該ｒｈＥＰＯ発現カセットの約８〜１１コピーを含有する。該株はＢＭＴ１、ＢＭＴ２およびＢＭＴ４遺伝子の破壊を有する。

プラスミドｐＧＬＹ４４７２（ｐＳＨ１１８６）（図１７）は、アシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１プロモーターおよびアシビア・ゴシピィ（Ａｓｈｂｙａｇｏｓｓｙｐｉｉ）ＴＥＦ１終結配列に機能的に連結された大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ヒグロマイシンＢホスホトランスフェラーゼ遺伝子（Ｈｙｇ^Ｒ）ＯＲＦ（配列番号１０３）をコードする核酸分子を含む発現カセットを含有し、該発現カセットは、一方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の５’ヌクレオチド配列（配列番号７０）に、他方の側では、ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＢＭＴ３遺伝子の３’ヌクレオチド配列（配列番号７１）に隣接している。プラスミドｐＧＬＹ３４３０を線状化し、該線状化プラスミドを株ＹＧＬＹ７１１０内に形質転換して、該Ｈｙｇ^Ｒ発現カセットがＢＭＴ３遺伝子座内に二重交差相同組換えにより挿入された幾つかの株を得た。得られた株から株ＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２を選択した。これらはウラシル、アデニン、ヒスチジン、プロリン、アルギニンおよびトリプトファンに対して原栄養性である。該株はＺｅｏｃｉｎ（ゼオシン）、ノウルセオスリシン（Ｎｏｕｒｓｅｏｔｈｒｉｃｉｎ）およびヒグロマイシンに対して耐性であり、該ＥＰＯ発現カセットの約８〜１１コピーを含有する。該株はＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３およびＢＭＴ４遺伝子の破壊または欠失を有し、ＨＣＡに対して産生された抗体への検出可能な交差結合反応性を欠くｒｈＥＰＯを産生する。

実施例１〜３における株の幾つかを、以下に示されているとおり及び図２１に図示されているとおりに、ｒｈＥＰＯを製造するために使用した。簡潔に説明すると、製造は、培地を含有する振とうフラスコに実施用細胞バンクからの細胞を接種することから開始し、一連の接種、インキュベーション、および次第に増加するサイズの容器内への成長培養の転移を行い、製造用バイオリアクターへの接種に十分な生物量が入手可能となるまでこれを行う。グリセロールがバッチ段階中の主要炭素源であり、ついで、グリセロールおよび塩の供給により培養成長を維持する。該グリセロールが消失したら、メタノール供給に切り替えることにより、ｒｈＥＰＯタンパク質を発現させるために細胞を誘導する。誘導時にインヒビターを、Ｏ−グリコシル化を最小にするために（例えば、ＰＭＴｉ３，５−［［３−（１−フェニルエトキシ）−４−（２−フェニルエトキシ）］フェニル］メチレン）−４−オキソ−２−チオキソ−３−チアゾリジン酢酸，（公開ＰＣＴ出願番号ＷＯ２００７０６１６３１を参照されたい））、およびタンパク質分解を最小にするために加える。タンパク質分解を最小にするために該段階の終了時にタンパク質分解のインヒビターを加える。該培養を約４℃に冷却し、回収した。

一般には以下の方法を用いて、５００ｍＬＳｉｘＦｏｒｓおよび３Ｌ発酵槽において該株の実験室規模の培養を行った。ＢｉｏｒｅａｃｔｏｒＳｃｒｅｅｎｉｎｇｓ（ＳＩＸＦＯＲＳ）を０．５Ｌの容器（Ｓｉｘｆｏｒｓマルチ・ファーメンテーション・システム（ｍｕｌｔｉ−ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎｓｙｓｔｅｍ），ＡＴＲＢｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｕｒｅｌ，ＭＤ）内で以下の条件下で行う：ｐＨ６．５、２４℃、０．３ＳＬＰＭ、および３５０ｍＬ（３３０ｍＬのＢＭＧＹ培地および２０ｍＬの接種物）の初期実施体積での５５０ｒｐｍの初期攪拌速度。接種の１時間後、攪拌速度を５５０ｒｐｍから１２００ｒｐｍへ１０時間かけて直線的に増加させるために、ＩＲＩＳマルチ・ファーメンター（ｍｕｌｔｉ−ｆｅｒｍｅｎｔｅｒ）ソフトウェア（ＡＴＲＢｉｏｔｅｃｈ，Ｌａｕｒｅｌ．ＭＤ）を使用する。シード（種）培養（１Ｌのバッフル付きフラスコ内の２００ｍＬのＢＭＧＹ）に寒天プレートから直接接種する。９５〜１００の光学密度（ＯＤ_６００）に達するまで、該シードフラスコを２４℃で７２時間インキュベートする。遠心分離により２０ｍＬに濃縮した２００ｍＬの定常期フラスコ培養を該発酵槽に接種する。初期仕込みグリセロール（１８〜２４時間）の発酵が完了したら、該バッチ段階は終了し、ついで第２バッチ段階を行う。これは、１７ｍＬのグリセロール供給溶液（５０％［ｗ／ｗ］グリセロール，５ｍｇ／Ｌビオチン，１２．５ｍＬ／ＬＰＭＴｉ塩（６５ｇ／ＬＦｅＳＯ_４・Ｈ_２Ｏ，２０ｇ／ＬＺｎＣｌ_２，９ｇ／ＬＨ_２ＳＯ_４，６ｇ／ＬＣｕＳＯ_４・５Ｈ_２Ｏ，５ｇ／ＬＨ_２ＳＯ_４，３ｇ／ＬＭｎＳＯ_４・７Ｈ_２Ｏ，５００ｍｇ／ＬＣｏＣｌ_２６Ｈ_２Ｏ，２００ｍｇ／ＬＮａＭｏＯ_４・２Ｈ_２Ｏ，２００ｍｇ／Ｌビオチン，８０ｍｇ／ＬＮａＩ，２０ｍｇ／ＬＨ_３ＢＯ_４）の添加により開始する。溶存酸素の急上昇により示される、第２バッチ段階の完了の後、メタノール供給溶液（１００％ＭｅＯＨ，５ｍｇ／Ｌビオチン，１２．５ｍＬ／ＬＰＭＴｉ）を０．６ｇ／時間で３２〜４０時間にわたって供給することにより、誘導段階を開始する。該培養を遠心分離により回収する。

３Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）および１５Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）ガラスバイオリアクターならびに４０Ｌ（Ａｐｐｌｉｋｏｎ，ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）ステンレス鋼スチーム・イン・プレイス（ｓｔｅａｍｉｎｐｌａｃｅ）バイオリアクターにおいて、バイオリアクター培養（３Ｌ）を行う。凍結ストックバイアルを１％の体積比で直接的にＢＭＧＹ培地に接種することにより、シード培養を調製する。移した直後に細胞が指数関数的に増殖することが保証されるように、２０±５の光学密度（ＯＤ_６００）を得るためにシードフラスコを２４℃で４８時間インキュベートする。該培地は、１リットル当たり、４０ｇグリセロール、１８．２ｇソルビトール、２．３ｇＫ_２ＨＰＯ_４，１１．９ｇＫＨ_２ＰＯ_４，１０ｇ酵母エキス（ＢＤ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ），２０ｇペプトン（ＢＤ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ），４×１０^−３ｇビオチンおよび１３．４ｇ酵母窒素ベース（ＢＤ，ＦｒａｎｋｌｉｎＬａｋｅｓ，ＮＪ）を含有していた。該バイオリアクターに初期培地に対して１０％の体積比のシードを接種する。以下の条件下、フェッドバッチ形態で培養を行う：２４±０．５℃に設定された温度、ＮＨ_４ＯＨで６．５±０．１に制御されたｐＨ、Ｏ_２の添加の際の段階的（ｃａｓｃａｄｉｎｇ）攪拌速度による１．７±０．１ｍｇ／Ｌに維持された溶存酸素。気流速度は０．７ｖｖｍに維持する。初期仕込みグリセロール（４０ｇ／Ｌ）が消失した後、２５０ｇ／Ｌの湿潤細胞重量に達するまで、１２．５ｍＬ／ＬのＰＴＭ１塩を含有する５０％グリセロール溶液を、最大増殖速度の５０％で、８時間にわたって指数関数的に供給する。０．０１時間^−１の比増殖速度を維持するためにメタノールを指数関数的に供給して、３０分間の飢餓段階を行った後、誘導を開始する。１５０ｍＭ／Ｌ／時間の酸素取り込み速度に達したら、酸素限界を避けるために、該メタノール供給速度を一定に維持する。遠心分離により該培養を回収する。

遠心分離および精密濾過による清澄化の後、限外濾過により濾液を１０倍濃縮し、ブルーダイ（ｂｌｕｅｄｙｅ）アフィニティーおよびヒドロキシアパタイトを使用する一連の２つのクロマトグラフィー工程によりｒｈＥＰＯタンパク質を精製する。

一次清澄化を遠心分離により行う。全細胞ブロスを１０００ｍＬ遠心ボトル内に移し、４℃、１３，０００×ｇで１５分間遠心分離する。限外濾過工程は、より大きな発酵槽（１０Ｌ〜４０Ｌ以上）で行うことが可能である。この工程は、１０Ｋの細孔径を有するサルトリアス（Ｓａｒｔｏｒｉｏｕｓ）平面シートを使用して、５倍濃縮まで行うことが可能である。

捕捉工程は、ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦａｓｔＦｌｏｗ（ブルー・セファロース６ファースト・フロー）（Ｐｓｅｕｄｏ−Ａｆｆｉｎｉｔｙ）クロマトグラフィーを使用して行う。ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ｆａｓｔＦｌｏｗ（ＦＦ）カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）で平衡化する。該培養上清を１００ｍＭＮａＣｌに調節し、全量（ｄｅａｄ−ｅｎｄ）フィルター（Ｗｈａｔｍａｎ，ＰｏｌｙｃａｐＴＣ）に通過させた後、該カラムにローディングする。滞留時間を３カラム体積（ＣＶ）の洗浄液で約１０分間に維持した後、ローディングを行う。該溶出は、５０ｍＭＭＯＰＳ（ｐＨ７．０）中の１ＭＮａＣｌの４ＣＶでの段階溶出である。ＥＰＯは１ＭＮａＣｌで溶出する。

ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーを使用して中間工程を行う。該捕捉工程後、マクロプレップ（Ｍａｃｒｏ−ｐｒｅｐ）セラミックヒドロキシアパタイトＩ型４０μｍ（Ｂｉｏ−Ｒａｄ）を使用する。このカラムを平衡化溶液（１ＭＮａＣｌおよび１０ｍＭＣａＣｌ_２を含有する５０ｍＭＭＯＰＳ，ｐＨ７．０）で平衡化する。ブルー（ｂｌｕｅ）カラムからのプール化ｒｈＥＰＯに約１０ｍＭＣａＣｌ_２を加えた後、ローディングを行う。３ＣＶの平衡化溶液およびそれに続くＭＰＯＳ（ｐＨ７．０）中の１２，５ｍＭＮａホスファートでの１０ＣＶの段階溶出でカラムの洗浄を行って、該ｒｈＥＰＯを含有するＨＡプール１を得る。

該ｒｈＥＰＯを更に精製するために、カチオン交換クロマトグラフィー工程を用いることが可能である。ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程（例えば、ＨＡプール１）後のプール化サンプルを５０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．０）に対して４℃で一晩透析し、Ｓｏｕｒｃｅ３０ＳカラムまたはＰｏｒｏｓカチオン交換カラム（ＧＥＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）を同じバッファーで平衡化する。該透析サンプルを該カラムに適用し、０〜７５０ｍＭＮａＣｌの１０ＣＶの直線勾配を適用する。ｒｈＥＰＯは３５０〜５００ｍＭＮａＣｌで溶出して該ｒｈＥＰＯを得る。

該精製ｒｈＥＰＯ分子のＮ末端は４０ｋＤａの直鎖状ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）に還元的アミノ化によりコンジュゲート化され得る（ＰＥＧ化）。該活性化ＰＥＧを５０ｍＭ酢酸ナトリウムバッファー（ｐＨ５．２）中の該ｒｈＥＰＯサンプル（濃度約１ｍｇ／ｍＬ）に１：１０のタンパク質：ＰＥＧ比で加える。該反応は、反応混合物に１０ｍＭシアノボロヒドリドナトリウムを一晩の攪拌下で加えることにより、還元条件下、室温で行う。１０ｍＭＴｒｉｓ（ｐＨ６．０）を加えることにより、該反応を停止させる。

産生されたモノ−ＰＥＧ化ｒｈＥＰＯを、カチオン交換クロマトグラフィー工程を用いて精製した後、最終製剤化バッファー（２０ｍＭリン酸ナトリウム，１２０ｍＭ塩化ナトリウム，０．００５％ポリソルベート（Ｐｏｌｙｓｏｒｂａｔｅ）２０（ｗ／ｖ），ｐＨ７．０）中へのダイアフィルトレーションに付す。

最終産物を、充填に適した濃度に希釈し、薬物貯蔵容器内に滅菌濾過する。該ＰＥＧ化ｒｈＥＰＯは充填まで２〜８℃で貯蔵可能であり、充填時に、それをガラスバイアル内に無菌的に充填し、ついでゴム栓およびアルミニウムキャップで密封する。

市販のタンパク質製剤が公知であり、使用可能である。具体例には以下のものが含まれるが、それらに限定されるものではない。ＡＲＡＮＥＳＰ（登録商標）：ポリソルベート溶液：各１ｍＬは０．０５ｍｇのポリソルベート８０を含有し、注射用水（ＵＳＰ）（１ｍＬに調整）中、２．１２ｍｇの第一リン酸ナトリウム一水和物、０．６６ｍｇの第二リン酸ナトリウム無水物および８．１８ｍｇの塩化ナトリウムと共にｐＨ６．２±０．２で製剤化されている。アルブミン溶液：各１ｍＬは２．５ｍｇのアルブミン（ヒト）を含有し、注射用水（ＵＳＰ）（１ｍＬに調整）中、２．２３ｍｇの第一リン酸ナトリウム一水和物、０．５３ｍｇの第二リン酸ナトリウム無水物および８．１８ｍｇの塩化ナトリウムと共にｐＨ６．０±０．３で製剤化されている。ＥＰＯＧＥＮ（登録商標）は、等張塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム緩衝溶液または塩化ナトリウム／リン酸ナトリウム緩衝溶液中の無菌無色液として静脈内（ＩＶ）または皮下（ＳＣ）投与用に製剤化されている。１回量（単一用量）保存剤非含有バイアル：溶液の各１ｍＬは、注射用水（ＵＳＰ）（ｐＨ６．９±０．３）中、２０００、３０００、４０００または１０，０００単位のエポエチン（Ｅｐｏｅｔｉｎ）アルファ、２．５ｍｇのアルブミン（ヒト）、５．８ｍｇのクエン酸ナトリウム、５．８ｍｇの塩化ナトリウムおよび０．０６ｍｇのクエン酸を含有する。この製剤は保存剤を含有しない。保存処理バイアルは１％ベンジルアルコールを含有する。

宿主細胞抗原（ＨＣＡ）の存在または非存在を分析するために用いられる方法には、ウエスタンブロット分析およびサンドイッチ酵素結合イムノソルベントアッセイ（ＥＬＩＳＡ）が含まれる。

ＮＯＲＦ株培養からの上清を使用して、ウサギにおいて宿主細胞抗原（ＨＣＡ）抗体を調製した。該ＮＯＲＦ株は、ヒト成熟ＥＰＯをコードするＯＲＦをそれが欠くこと以外はＹＧＬＹ３１５９と遺伝的に同一である。完全フロイントアジュバントにおいて調製されたＮＯＲＦ株発酵上清をウサギに注射し、ついで、不完全フロイントアジュバントにおいて調製された発酵上清を、該ウサギに３回、追加免疫注射した。４５日後、該ウサギから採血し、標準的な方法を用いてＨＣＡに対するポリクローナル抗体を調製した（例えば、ＳＬｒプロテインＡ精製されたウサギポリクローナルＩｇＧ９１６１Ｆ０７２２０８−Ｓ、およびＧｉＦ２ポリクローナルウサギ：：６３１６全ウサギ血清）。該ＧＩＦ２抗体はプロテインＡ精製されなかった。

ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＣＡを検出するためのウエスタンブロットは以下のとおりに行った。精製されたＰＥＧ化または非ＰＥＧ化ｒｈＥＰＯ含有サンプルをサンプルローディングバッファー中で還元し、ついでそのうちの１μＬを４〜２０％ポリアクリルアミドＳＤＳＴｒｉｓ−ＨＣｌ（４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ）ゲル（ＢｉｏＲａｄ）のウェルに適用し、約６０分間、１５０Ｖのエレクトロポレーションに付した。分離されたタンパク質をニトロセルロース膜に１００Ｖで約６０分間にわたってエレクトロトランスファーした。トランスファー後、該膜を１％ブロッキング溶液（ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ）で１時間ブロッキングした。ブロッキング後、１：３０００希釈されたウサギ抗ＨＣＡポリクローナル抗体（一次抗体）で該膜をプローブした。ついで該膜を洗浄し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）にコンジュゲート化された二次抗体であるヤギ抗ウサギＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）（Ｐｉｅｒｃｅ＃３１４６０，Ｌｏｔ＃Ｈ５１０１５１５６）（１：５０００希釈物）を使用して、該ウサギ抗ＨＣＡ抗体の検出を行った。該膜を洗浄した後、３，３’ジアミノベンジジン（ＤＡＢ）を使用して結合二次抗体の検出を行った。ＥＰＯタンパク質を検出する場合には、一次抗体は、１：１０００希釈で使用されるＥＰＯ（Ｂ−４）ＨＲＰコンジュゲート化抗体（ＳＣ５２９０Ｌｏｔ＃Ａ０５０７，ＳａｎｔａＣｒｕｚＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）であった。二次抗体は使用しなかった。通常、ＰＮＧアーゼＦ処理で脱グリコシル化されたｒｈＥＰＯサンプルと並べて、該ＥＰＯサンプルを電気泳動する。脱グリコシル化は、１μＬのＰＮＧアーゼＦ酵素（５００単位／μＬ）が加えられた５０μＬのサンプルを使用して行った。３７℃で２時間のインキュベーションの後、該サンプルをサンプルローディングバッファー中で還元し、１μＬのアリコートを取り出し、前記と同様にしてＳＤＳゲルに適用した。

ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）ＨＣＡを検出するためのサンドイッチＥＬＩＳＡは以下のとおりに行った。９６ウェルＥＬＩＳＡプレートのウェルを１μｇ／ウェルのマウス抗ｈＥＰＯモノクローナル抗体でコーティングした。ついで該ウェルをリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で３０分間ブロッキングした。約２００ｎｇ／ｍＬに濃縮された約１００μＬの精製非ＰＥＧ化ｒｈＥＰＯ含有サンプルを該ウェルに加えた。一次検出は、ＰＢＳ中の１：８００の出発希釈度のウサギ抗ＨＣＡポリクローナル抗体（ついで、これは、１：８１９，２００希釈度の第１１ウェルで終わる行にわたってＰＢＳ中で１：１系列希釈された）を用いるものであった。第１２ウェルは陰性対照として用いた。ＥＬＩＳＡのための標準物は、ＹＧＬＹ３１５９から精製されたｒｈＥＰＯであった。６０分後、該ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。該ウサギ抗ＨＣＡ抗体の検出は、アルカリホスファターゼ（ＡＰ）にコンジュゲート化されたヤギ抗ウサギ抗体（ＰＢＳ中の１：１０，０００希釈物）を使用した。６０分後、該ウェルをＰＢＳで３回洗浄した。結合二次抗体の検出は４−メチルウンンベリフェリルホスファート（４−ＭＵＰＳ）を使用した。該ＥＬＩＳＡプレートは、３４０ｎｍの励起波長および４６５ｎｍの放射波長でＴｅｃａｎＧｅｎｉｏｓＭｕｌｔｉｄｅｔｅｃｔｉｏｎＭｉｃｒｏｐｌａｔｅＲｅａｄｅｒを使用して読み取った。

この実施例は、ＹＧＬＹ３１５９が、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性（ＣＢＡ）を有するｒｈＥＰＯを産生すること、およびβ−１，２−マンノシルトランスフェラーゼ遺伝子ＢＭＴ２が欠失または破壊された株において該ｒｈＥＰＯが産生された場合であっても、該交差結合活性が該ｒｈＥＰＯ上のＮ−グリカンの少なくとも一部におけるβ−１，２−マンノース残基（α−１，２−マンノシダーゼ耐性）の存在によるものであったことを示す。

糖操作ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）産生株ＹＧＬＹ３１５９の発酵上清から、３工程のクロマトグラフィー分離により、ｒｈＥＰＯを回収した。それはＳＤＳ−ＰＡＧＥ、ＲＰ−ＨＰＬＣおよびＳＥＣ−ＨＰＬＣによる測定で約９５％のタンパク質純度を示した。モノＰＥＧ化ｒｈＥＰＯは、カチオン交換クロマトグラフィー工程により、その超および非ＰＥＧ化コンジュゲートから、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルによる測定で約９６％の純度で分離された。しかし、ＹＧＬＹ３１５９株のＨＣＡに対する抗体は、ウエスタンブロット上でｒｈＥＰＯと同時移動した該株から産生されたｒｈＥＰＯ調製物における糖タンパク質を検出した。図２２は、抗ＨＣＡ抗体が、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上でｒｈＥＰＯと同時移動するタンパク質を特定したことを示している。ｒｈＥＰＯからのシアル酸の除去は交差結合活性を阻止しなかったが、ＰＮＧアーゼＦを使用するｒｈＥＰＯからの全Ｎ−グリカンの除去は、抗ＨＣＡ抗体でプローブされるウエスタンブロットにおいて検出可能でないｒｈＥＰＯの脱グリコシル化形態を産生した。これを図２３に示す。この図は、ｒＨＥＰＯの脱グリコシル化形態だけが該抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を欠いていたことを示している。

該交差結合活性がｒｈＥＰＯ特異的であったのか、あるいは他の組換えピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株からの精製糖タンパク質調製物において特定可能であったのかどうかを判定するために、他の株において産生された糖タンパク質を単離し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルにより分離し、該ゲルをニトロセルロース膜にトランスファーした。組換えピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生された組換えヒト全抗体（ｒｈＩｇＧ）の場合、野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）において産生されたタンパク質調製物（ＮおよびＯグリコシル化領域の両方から高マンノシル化されている）において、および主としてＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカンを産生するがα−１，２−マンノシダーゼ耐性である検出可能なＭａｎ_９ＧｌｃＮＡｃ_２Ｎ−グリカン（図２４、矢印）をも含有していた組換えＧＳ２．０株において、交差結合活性が検出された。しかし、野生型ピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）からのｒｈＩｇＧ調製物は、ｒｈＩｇＧの場合より大きな見掛け分子量の交差結合活性を含有していた。このことは、該調製物が混入宿主細胞糖タンパク質を含有していたことを示唆している。該交差結合活性はＰＮＧアーゼＦ消化により除去された（図２４における丸印）。

ＹＧＬＹ３１５９において産生されたグリコシル化ｒｈＥＰＯは抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を有していたが、ヒトフェツイン、ヒトアシアロフェツイン、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）およびＬＥＵＫＩＮＥ［サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）において産生された組換えヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ｒｈｕＧＭ−ＣＳＦ）］は抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を有していなかったことを、図２５は示している。フェツインは、肝臓において産生され血流中に分泌される高グリコシル化血液糖タンパク質である。それは、血流中の多種多様な積荷（ｃａｒｇｏ）物質の輸送および利用をもたらす結合タンパク質の大きなグループに属する。これらの担体タンパク質の最もよく知られている代表例は血清アルブミンであり、これは、成体動物の血漿中に最も豊富に存在するタンパク質である。フェツインは、胎児血液に、より豊富に存在し、したがって、「フェツイン（ｆｅｔｕｉｎ）」（ラテン語のｆｅｔｕｓに由来する）と称される。ウシ胎児血清はアルブミンよりフェツインを豊富に含有するが、成体血清はフェツインよりアルブミンを豊富に含有する。アシアロフェツインは、Ｎ−およびＯ−グリカンからの末端シアル酸が穏和な加水分解またはノイラミニダーゼ処理により除去されたフェツインである。現在のところ、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）におけるβ−結合マンノースの報告は存在しない。ＨＳＡはグリコシル化タンパク質ではない。

実験室規模のデータは、ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）Ｉ型４０μｍ樹脂を使用するＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉プールからのｒｈＥＰＯの中間クロマトグラフィー工程精製が、高マンノース型Ｎ−グリカンを有していたｒｈＥＰＯ（ＨＡプール２および３）から、ほぼ検出不可能な交差結合活性を有するｒｈＥＰＯ（ＨＡプール１）を分離し得ることを示した。ＨＡプール１は約９０．４０％の二シアル酸化Ｎ−グリカン（所望のＮ−グリカン形態）および３．５％未満の中性Ｎ−グリカンを含有していた。これとは対照的に、０〜１００ｍＭリン酸ナトリウムからの直線勾配溶出は、より後の溶出画分（ＨＡプール２および３）が高マンノース型Ｎ−グリカンを含有し、ウエスタンブロットにおいて抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を増加させることを示した。これは、ＨＰＬＣＮ−グリカン分析、および４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロット（図２６に示されている）において見られ得る。

ＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦまたはＳｏｕｒｃｅ３０Ｑアニオン樹脂を使用するアニオンカラムクロマトグラフィーも試験した。ＨＡプール１〜３を合わせ、５０ｍＭ酢酸Ｎａ（ｐＨ５．０）に対して４℃で一晩透析した。該透析サンプルを該カラムに適用し、０〜７５０ｍＭＮａＣｌの１０ＣＶの直線勾配を適用した。この場合、ｒｈＥＰＯは３５０〜５００ｍＭＮａＣｌで溶出して、該ｒｈＥＰＯを得た。図２７ＡはｒｈＥＰＯのＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦ精製の一例を示す。データは、より高い対応交差結合活性を示す高マンノース型グリカン（Ｍａｎ_{６，７，８，９＞９}，ほとんどはα１，２−マンノシダーゼ耐性）が、結合および非結合物質をサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて分析した場合に、アニオン交換樹脂に結合しないことを示した（図２７Ｂ）。表１は、結合画分（ＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦプール１）およびフロースルー画分（ＱＳＥＰＨＡＲＯＳＥＦＦフロースルー）におけるｒｈＥＰＯのＮ−グリカン含量のＨＰＬＣ分析の結果を示す。表２は、表１に示す中性Ｎ−グリカンのＮ−グリカン含量を示す。

したがって、抗ＨＣＡ抗体に対する検出不可能な交差結合活性ならびに良好なタンパク質およびグリカン特性を有するｒｈＥＰＯがアニオン交換樹脂に結合し、該樹脂から溶出され得ることを、該図および表は示している。これらのデータはまた、β−１，２−結合オリゴマンノシド（ＢＭＴ１、ＢＭＴ２、ＢＭＴ３、ＢＭＴ４）の生合成に関与する真菌遺伝子のファミリーが該ｒｈＥＰＯ調製物における低レベルの交差結合性不純物の原因となることを示唆した。

したがって、全体として見ると、これらの結果は、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性がｒｈＥＰＯに特異的ではなく、該糖タンパク質上のα−１，２−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンによるものであることを示唆した。ＹＧＬＹ３１５９は、５個の内在性グリコシル化遺伝子をノックアウトし１５個の異種遺伝子を導入することにより作製されていた。ＹＧＬＹ３１５９はｂｍｔ２Δノックアウト株である。ＮＭＲ分光学的研究は、ｂｍｔ２Δノックアウト株が、種々の量の残存β−１，２−マンノースＮ−グリカンを有する糖タンパク質を産生し得ることを示唆している。ＹＧＬＹ３１５９はｂｍｔ２Δであるため、ＢＭＴ１およびＢＭＴ３がコアＮ−グリカン上の低レベルの残存β−１，２−マンノース転移をもたらすと仮定された。

ｒｈＥＰＯを精製するためのクロマトグラフィー工程の組合せは、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を含有しないｒｈＥＰＯ調製物を産生し得るが、該株における抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を低減または排除するためにピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）宿主株を遺伝的に修飾することが特に望ましいであろう。これは、精製中の変動性による、交差結合活性を有するｒｈＥＰＯ調製物の考えられ得る混入のリスクを最小にする。また、各精製工程はｒｈＥＰＯの喪失を引き起こし得るため、遺伝的に修飾されたピチア・パストリス（Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ）株が精製工程の数を減少させることにより、省かれた工程中に喪失するｒｈＥＰＯの量を減少させることが可能である。したがって、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を示さない株を特定するために、４つのＢＭＴ遺伝子の発現を連続的に欠失または破壊した。

β−結合マンノース型Ｎ−グリカンの存在を検出不能レベルまで低減するために、ＢＭＴ１およびＢＭＴ４遺伝子を破壊し、該ｒｈＥＰＯをα−１，２−マンオシダーゼ耐性Ｎ−グリカンの存在に関して分析した。

株ＹＧＬＹ６６６１およびＹＧＬＹ７０１３を、実施例２に記載されているとおりに構築し、抗ＨＣＡ抗体を使用してα−１，２−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンの存在に関して分析した。株ＹＧＬＹ７０１３はｂｍｔ２Δおよびｂｍｔ４Δであり、株ＹＧＬＹ６６６１はｂｍｔ２Δ、ｂｍｔ４Δおよびｂｍｔ１Δであった。該株から産生されたｒｈＥＰＯをＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーに付し、ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉プールのアリコートをＰＮＧアーゼＦｖｅｌｎｏｎで処理した。該処理および未処理アリコートをＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で電気泳動し、ゲルをニトロセルロース膜にトランスファーし、該膜を抗ＥＰＯ抗体または抗ＨＣＡ抗体でプローブした。図２８は、ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉プールのアリコートの４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットにおいて、いずれかの株において産生されたｒｈＥＰＯが、抗ＨＣＡ抗体と交差反応したα−１，２−マンノシダーゼ耐性Ｎ−グリカンを尚も有していたことを示している。表３および４は発酵およびＳｉｘＦｏｒｓ培養の両方からのＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉プール中のｒｈＥＰＯにおけるＮ−グリカン種の分布を示す。該表に示されているとおり、どちらの株も相当な量の中性Ｎ−グリカンを産生し、そのうちの一部はインビトロα１，２−マンノシダーゼ消化に耐性であった。

ＹＧＬＹ３１５９との比較において両方の株から得られたＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉プールにおけるｒｈＥＰＯのサンドイッチＥＬＩＳＡは、どちらの株も抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を有することを示した（図２９）。ヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーによる該ｒｈＥＰＯの更なる精製およびサンドイッチＥＬＩＳＡによる該サンプルの分析は、ＹＧＬＹ６６１（ｂｍｔ２Δ、ｂｍｔ４Δおよびｂｍｔ１Δ）から産生されたｒｈＥＰＯを含有するＨＡプール１が抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠いているらしいこと、およびＹＧＬＹ７０１３（ｂｍｔ２Δおよびｂｍｔ４Δ）において産生されたｒｈＥＰＯが抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を尚も有することを示した（図３０）。該結果は、ＢＭＴ２およびＢＭＴ１遺伝子の欠失が、全ての検出可能な交差結合活性を除去するのに十分ではないことを示唆した。該結果はまた、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィーが、ＨＡプール１において、検出可能な交差結合活性を除去し得ることを示している。図３１は４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのウエスタンブロットであり、これは、株ＹＧＬＹ６６１から調製されたもう１つのＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉プールにおけるｒｈＥＰＯが抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を有し続けていたこと、および該交差結合活性が、該ｒｈＥＰＯの脱グリコシル化により、検出不能に尚もされ得ることを示している。該結果は、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さないｒｈＥＰＯを得るためには、ＢＭＴ３遺伝子の発現が破壊または欠失により阻止される必要があることを示した。

検出可能なβ−結合マンノース型グリカンの排除をより効果的に達成するために、マンノシルトランスフェラーゼ経路に関与する４つ全てのＢＭＴ遺伝子を破壊した。株ＹＧＬＹ７３６１〜７３６６およびＹＧＬＹ７３９３〜７３９８（実施例２）を、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くｒｈＥＰＯを産生する能力に関して評価した。

β−マンノシルトランスフェラーゼ経路に関与する４つ全てのＢＭＴ遺伝子が破壊された種々の株ＹＧＬＹ７３６１〜７３６６およびＹＧＬＹ７３９３〜７３９８株を５００ｍＬＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽内で増殖させ、ついでＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦプール（Ｂｌｕｅ（ブルー）プール）全体にわたってｒｈＥＰＯに関して加工した。該Ｂｌｕｅプールからのアリコートを４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。図３２は、ＰＮＧアーゼＦ処理を伴う及び伴わないそれらの種々の株からのＢｌｕｅプールの、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを示す。該ゲルは、該被験株の全てがグリコシル化ｒｈＥＰＯを産生したことを示している。該株の幾つかをサンドイッチＥＬＩＳＡにより抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性に関して評価した。図３３は、該株のほとんどが抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠いていたことを示している。しかし、ＹＧＬＹ７３６３およびＹＧＬＹ７３６５は抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を有していた。ＰＣＲによるＹＧＬＹ７３６５の再確認は、この株がＢＭＴ３遺伝子の完全なノックアウト体ではなことを示した。これは、ＥＬＩＳＡにおいて存在する抗ＨＣＡ抗体で観察された比較的高い結合を説明するものである（図３３）。株ＹＧＬＹ７３６１〜７３６６のＨＰＬＣＮ−グリカン分析を表５に示し、株ＹＧＬＹ７３９３〜７３９８を表６に示す。該表におけるデータは図３４にグラフで示されている。

株ＹＧＬＹ７３６２、７３６６、７３９６および７３９８を３Ｌ発酵槽内で培養し、ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーおよびそれに続くヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーにより加工した。該Ｂｌｕｅプールおよび該ＨＡプールの両方からのアリコートを還元し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＹＧＬＹ３１５９の対応プールを陽性対照として含めた。図３５Ａは、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、これは、該Ｂｌｕｅプール（ゲルの左半分）およびＨＡプール（ゲルの右半分）の両方がｒｈＥＰＯを産生したことを示している。図３５Ｂは、抗ＨＣＡ抗体でプローブされた、同じサンプルのウエスタンブロットを示す。該被験株はいずれも、該Ｂｌｕｅプールまたは該ＨＡプール１のいずれにおいても、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を有していなかった。

図３６は、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性に関して、ＹＧＬＹ７３９８の５００ｍＬＳｉｘＦｏｒｓ培養から単離されたｒｈＥＰＯについて、該ＢｌｕｅプールおよびＨＡプール１を分析している。一番右のパネルは、もう１つの抗ＨＣＡ調製物であるＧｉＦ２ポリクローナルウサギ：：６３１６でプローブされたウエスタンブロットを示す。この抗体は、ここに示されているＥＬＩＳＡおよびウエスタンブロットを得るために使用されていたＦ０７２２０８−Ｓ抗体を使用して得られたものと同じ結果を示した。該６３１６抗体は、該交差結合活性が抗体特異的でないことを示している。

これらの結果は、４つ全てのＢＭＴ遺伝子の欠失または破壊が、予備的ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉工程またはＩ型４０μＭヒドロキシアパタイトを使用する中間ヒドロキシアパタイト工程の後のｒｈＥＰＯのいずれにおいても、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を示さない株を与え得ることを示している。これらの株は、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を含有するｒｈＥＰＯ調製物が調製されるリスクを最小にする。これは、ｒｈＥＰＯが投与された個体において有害な免疫応答を誘導するリスクがより低いｒＥＰＯの産生を可能にする。

４つ全てのＢＭＴ遺伝子が破壊または欠失された実施例２で得られた株において産生されＰＥＧ化されたｒｈＥＰＯの薬物動態の比較を、株ＹＧＬＹ３１５９から産生されたＰＥＧ化ｒｈＥＰＯに対して行った。該比較は、該ＰＥＧ化ＥＰＯが、減少したインビトロ半減期およびより低いインビボ効力を有することを示した（表７および８を参照されたい）。抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない実施例２で得られた株において産生されたｒｈＥＰＯは、ＥＰＯＧＥＮの場合に概ね類似した薬物動態を示し、ＡＲＡＮＥＳＰの薬物動態より高くはなかった。その低下した薬物動態は二シアル酸化二分岐Ｎ−グリカンの量に影響されることが判明した。該ｒｈＥＰＯ上の、より高いレベルの二シアル酸化二分岐Ｎ−グリカンは、より高い薬物動態と相関した。これらの結果は、ＣＨＯ細胞において産生された組換えヒトエリスロポエチンにおける、より長い半減期が、より高いシアル酸含量に相関していることを示す公開データ（Ｅｇｒｉｅら，Ｅｘｐ．Ｈｅｍａｔｏｌ．３１：２９０−２９９（２００３））と一致している。

検出可能なβ−結合マンノース型グリカンの排除を有効に達成するために、およびより高い薬物動態を有するｒｈＥＰＯを産生する株を得るために、実施例３に記載されている株ＹＧＬＹ７１１３〜７１２２を作製し、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠くｒｈＥＰＯを産生する能力に関して評価した。ニワトリリゾチームリーダー配列に融合した融合タンパク質としてのヒト成熟ＥＰＯをも発現するように、これらの株を修飾した。したがって、これらの株は、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドに融合したヒト成熟ＥＰＯ、およびニワトリリゾチームリーダー配列に融合した融合タンパク質としてのヒト成熟ＥＰＯの両方を発現する。

β−マンノシルトランスフェラーゼ経路に関与する４つ全てのＢＭＴ遺伝子が破壊された種々のＹＧＬＹ７１１３〜ＹＧＬＹ７１２２株を５００ｍＬＳｉｘＦｏｒｓ発酵槽内で増殖させ、ついでＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦプール（Ｂｌｕｅプール）全体にわたってｒｈＥＰＯに関して加工した。幾つかの株の該Ｂｌｕｅプールのアリコートを、抗ＨＣＡ抗体を使用するサンドイッチＥＬＩＳＡにより分析した。図３７は、ＹＧＬＹ７１１８が抗ＨＣＡ抗体に対する非常に低い交差結合活性を有していたことを示しているが、その他の株の全ては、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を示さなかった。株ＹＧＬＹ７１１３〜７１１７のＨＰＬＣＮ−グリカンの分析を表９に示し、株ＹＧＬＹ７１１８〜７１２２を表１０に示す。該表は図３８にグラフで示されている。

株ＹＧＬＹ７１１５、７１１７および７１２０を３Ｌ発酵槽内で培養し、ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦクロマトグラフィーおよびそれに続くヒドロキシアパタイト（ＨＡ）クロマトグラフィーにより加工した。該Ｂｌｕｅプールおよび該ＨＡプールの両方からのアリコートを還元し、４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。ＹＧＬＹ３１５９の対応プールを陽性対照として含めた。ＹＧＬＹ７３９５の対応プールを陰性対照として含めた。図３９Ａは、クーマシーブルー染色された４〜２０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥを示し、これは、該Ｂｌｕｅプール（ゲルの左半分）およびＨＡプール（ゲルの右半分）の両方がｒｈＥＰＯを産生したことを示している。図３９Ｂは、抗ＨＣＡ抗体でプローブされた、同じサンプルのウエスタンブロットを示す。該被験株はいずれも、該Ｂｌｕｅプールまたは該ＨＡプール１のいずれにおいても、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を有していなかった。

これらの結果はまた、４つ全てのＢＭＴ遺伝子の欠失または破壊が、予備的ＢｌｕｅＳＥＰＨＡＲＯＳＥ６ＦＦ捕捉工程またはＩ型４０μＭヒドロキシアパタイトを使用する中間ヒドロキシアパタイト工程の後のｒｈＥＰＯのいずれにおいても、抗ＨＣＡ抗体に対する検出可能な交差結合活性を示さない株を与え得ることを示している。これらの株は、抗ＨＣＡ抗体に対する交差結合活性を含有するｒｈＥＰＯ調製物が調製されるリスクを最小にする。これは、ｒｈＥＰＯが投与された個体において有害な免疫応答を誘導するリスクがより低いｒＥＰＯの産生を可能にする。

ＹＧＬＹ７１１７により産生されたｒｈＥＰＯを含有するｂｌｕｅ（ブルー）プールを更に、ヒドロキシアパタイトカラムクロマトグラフィーに付し、ＨＡプール中のｒｈＥＰＯをシアル酸化含量に関して分析した。図４０Ａおよび図４０Ｂは、それぞれ、ＹＧＬＹ３１５９において産生されたｒｈＥＰＯからのＮ−グリカンのＨＰＬＣトレース、およびそれと比較される、ＹＧＬＹ７１１７において産生されたｒｈＥＰＯからのＮ−グリカンのＨＰＬＣトレースを示す。これらの図はまた、該ヒドロキシアパタイトカラムが追加的混入物を除去したことを示しており、したがって、この分析においては、ＹＧＬＹ７１１７において産生されたｒｈＥＰＯのシアル酸化含量は約９９％であり（中性Ｎ−グリカンは約１％であった）、そのうち、約８９％はＡ２、すなわち、二シアル酸化体であり、約１０％はＡ１、すなわち、モノシアル酸化体であった。

実施例３の方法に従うＰＥＧ化後のＹＧＬＹ７１１７において産生されたｒｈＥＰＯのシアル酸化分析はＰＥＧ化前のシアル酸化の量に類似していた。しかし、シアル酸化の量は、例えば、増殖条件、例えば培地組成、供給速度などにどのような修飾が施されたかによって、限られた程度で変動し得る（表１１を参照されたい）。したがって、本発明における方法は、少なくとも約７５％のＡ２シアル酸化または約７５〜８９％のＡ２シアル酸化を有するｒｈＥＰＯ組成物を与える。したがって、総シアル酸含量はｒｈＥＰＯの１モル当たり少なくともシアル酸４．５モルであり、より詳しくは、ｒｈＥＰＯの１モル当たりシアル酸約４．６〜５．７モルである。

４つ全てのＢＭＴ遺伝子が破壊または欠失された実施例３で得られたＹＧＬＹ７１１７において産生されＰＥＧ化されたｒｈＥＰＯの薬物動態の比較を、株ＹＧＬＹ３１５９から産生されたＰＥＧ化ｒｈＥＰＯに対して行った。該比較は、株ＹＧＬＹ７１１７において産生されたＰＥＧ化ｒｈＥＰＯが、ＹＧＬＹ３１５９およびＡＲＡＮＥＳＰの場合に類似したインビボ半減期およびインビボ効力を有することを示した（表１２および１３を参照されたい）。

配列表
実施例１〜１１に開示されている株の幾つかを製造するために使用した配列を表１４に示す。

本発明は例示実施形態に関して本明細書に記載されているが、本発明はそれらに限定されないと理解されるべきである。当技術分野における通常の技量を有し本明細書中の教示を利用する当業者はその範囲内の追加的な修飾および実施形態を認識するであろう。したがって、本発明は、本明細書に添付されている特許請求の範囲のみによって限定される。

Claims

宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く組換え糖タンパク質の、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法であって、
（ａ）Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される少なくとも１つの活性を示さず、該組換え糖タンパク質をコードする核酸分子を含む組換えピチア・パストリス宿主細胞を提供し、
（ｂ）該組換え糖タンパク質を発現させるのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、
（ｃ）該組換え糖タンパク質を該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を欠く該組換え糖タンパク質を得ることを含む、製造方法。
宿主細胞が、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない、請求項１記載の製造方法。
宿主細胞が更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない、請求項１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて測定される、請求項１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がウエスタンブロットにおいて測定される、請求項１記載の製造方法。
該組換え糖タンパク質が治療用糖タンパク質である、請求項１記載の製造方法。
該治療用糖タンパク質が、エリスロポエチン（ＥＰＯ）；サイトカイン、例えばインターフェロンα、インターフェロンβ、インターフェロンγおよびインターフェロンω；ならびに顆粒球−コロニー刺激因子（ＧＣＳＦ）；ＧＭ−ＣＳＦ；凝固因子、例えば因子ＶＩＩＩ、因子ＩＸおよびヒトプロテインＣ；アンチトロンビンＩＩＩ；トロンビン；可溶性ＩｇＥ受容体α鎖；免疫グロブリン、例えばＩｇＧ、ＩｇＧフラグメント、ＩｇＧ融合体およびＩｇＭ；免疫接着物質および他のＦｃ融合タンパク質、例えば可溶性ＴＮＦ受容体−Ｆｃ融合タンパク質；ＲＡＧＥ−Ｆｃ融合タンパク質；インターロイキン；ウロキナーゼ；キマーゼ；および尿素トリプシンインヒビター；ＩＧＦ結合性タンパク質；上皮増殖因子；成長ホルモン放出因子；アネキシンＶ融合タンパク質；アンジオスタチン；血管内皮増殖因子−２；骨髄前駆体抑制因子−１；オステオプロテジェリン；α−１−アンチトリプシン；α−フェトプロテイン；ＤＮアーゼＩＩ；ヒトプラスミノーゲンのクリングル３；グルコセレブロシダーゼ；ＴＮＦ結合タンパク質１；濾胞刺激ホルモン；細胞傷害性Ｔリンパ球関連抗原４−Ｉｇ；膜貫通アクチベーターおよびカルシウムモジュレーターおよびシクロフィリンリガンド；グルカゴン様タンパク質１；ならびにＩＬ−２受容体アゴニストからなる群から選択される、請求項５記載の製造方法。
該宿主細胞が、ヒト様Ｎ−グリカンを有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１記載の製造方法。
該宿主細胞が、Ｍａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＮＡＮＡＧａｌＧｌｃＮＡｃＭａｎ_５ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃＭａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２、Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２およびＮＡＮＡ_{（１−４）}Ｇａｌ_{（１−４）}ＧｌｃＮＡｃ_{（１−４）}Ｍａｎ_３ＧｌｃＮＡｃ_２から選択されるＮ−グリカンを主として有する糖タンパク質を産生するように遺伝的に操作されている、請求項１記載の製造方法。
請求項１記載の製造方法により得られる１以上の組換え糖タンパク質を含む組成物。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、ピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における製造方法であって、
（ａ）シアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを産生するように遺伝的に操作された組換えピチア・パストリス宿主細胞であって、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性を示さず、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性から選択される少なくとも１つの活性を示さず、２以上の核酸分子（それぞれは、シグナルペプチドに融合した成熟ヒトエリスロポエチンを含む融合タンパク質をコードしており、該シグナルペプチドはＥＲを標的化し、該融合タンパク質がＥＲ中に存在する場合には除去される）を含む、該組換えピチア・パストリス宿主細胞を提供し、
（ｂ）第１および第２融合タンパク質を発現させプロセシングするのに有効な条件下、培地内で該宿主細胞を増殖させ、
（ｃ）該成熟ヒトエリスロポエチンを該培地から回収して、宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む該成熟ヒトエリスロポエチンを得ることを含む、製造方法。
宿主細胞が、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ２活性、β−マンノシルトランスフェラーゼ１活性およびβ−マンノシルトランスフェラーゼ３活性を示さない、請求項１１記載の製造方法。
宿主細胞が更に、Ｎ−グリカンまたはＯ−グリカンに対するβ−マンノシルトランスフェラーゼ４活性を示さない、請求項１２記載の製造方法。
シグナルペプチドが、サッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドまたはニワトリリゾチームシグナルペプチドである、請求項１１記載の製造方法。
少なくとも１つの核酸分子が、該エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしており、少なくとも１つの核酸分子が、該エリスロポエチンがサッカロミセス・セレビシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）αＭＡＴｐｒｅシグナルペプチドニワトリリゾチームシグナルペプチドに融合している融合タンパク質をコードしている、請求項１１記載の製造方法。
エリスロポエチンをコードする核酸分子の核酸配列のコドンがピチア・パストリス（Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ）における発現に関して最適化されている、請求項１１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がサンドイッチＥＬＩＳＡにおいて測定される、請求項１１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性がウエスタンブロットにおいて測定される、請求項１１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収が、カチオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項１１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収が、ヒドロキシアパタイトクロマトグラフィー工程を含む、請求項１１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンの、培地からの回収が、アニオン交換クロマトグラフィー工程を含む、請求項１１記載の製造方法。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む請求項１８記載の製造方法から得られる成熟ヒトエリスロポエチン、および医薬上許容される塩を含む組成物。
宿主細胞抗原に対して産生された抗体に対する検出可能な交差結合活性を有さない、主としてシアル酸を末端とする二分岐Ｎ−グリカンを含む成熟ヒトエリスロポエチンが、親水性ポリマーにコンジュゲート化されている、請求項２２記載の組成物。
親水性ポリマーがポリエチレングリコールポリマーである、請求項２３記載の組成物。