CN115951065A - 一种高通量筛选蛋白表达的方法及其应用 - Google Patents

一种高通量筛选蛋白表达的方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种高通量筛选蛋白表达的方法及其应用，涉及生物工程技术领域，所述蛋白的N端或C端含有His标签，将待测蛋白的表达上清与HIS Lite混合后，利用FSEC系统进行检测，获得待测蛋白表达检测结果和聚集状态初步判断结果。本发明首次使用荧光标记的HIS Lite作为荧光染料，直接将其与含有His标签的蛋白的细胞上清液混合，使用FSE C系统，可实现高通量筛选蛋白表达的最佳表达质粒和表达条件，获得了纯度好的蛋白，且该蛋白还可以被多功能标记。

Description

一种高通量筛选蛋白表达的方法及其应用
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，具体涉及一种高通量筛选蛋白表达的方法及其应用。
背景技术
目标蛋白在不同的表达系统中表达后，首先需要检测蛋白表达情况，对于细胞内表达的蛋白，需要先对细胞进行裂解后，收取细胞上清进行亲和层析，通过将亲和层析后的样品进行SDS-PAGE检测或者Western blot检测蛋白表达情况。整个过程耗时较长、样品使用量多且通量低。在确定蛋白表达后，还需要进一步通过凝胶过滤层析检测蛋白的聚集状态。从蛋白表达到蛋白纯化鉴定蛋白聚集状态整个过程需要1-2天的时间，效率低且让费成本。为了解决这些问题，目前已经有各种各样的技术可用于蛋白表达的检测和分析，其中荧光介导的检测被认为是高灵敏度的细胞和分子生物学分析方法，其中基于GFP融合的荧光检测分子筛(Fluorescence-detection Size-Exclusion Chromatogra phy，FSEC)方法已广泛应用于对重组蛋白表达水平、聚集状态、热稳定性的快速检测。然而这种方法需要在目标蛋白上面构建GFP融合标签，且纯化后还需通过GFP填料将目标蛋白中的GFP标签去除，这给目标蛋白去除标签后是否稳定带来了不确定性且去除标签中成本也较高。此外，常规手段下，体外获得的重组蛋白不能够直接进行生物标记，例如，需要进行生物素标记的话需要重新设计质粒，耗时长且成本高。
Tris-NTA是一种His标记的蛋白质配体，可以结合His标签的蛋白，目前已经在表面离子共振以及显微镜成像技术中鉴定细胞中His标签是否表达[3.Pfreundschuh,Moritz et al.“Identifying and quantifying two ligand-binding sites while imagi ngnative human membrane receptors by AFM.”Nature communicationsvol.68857.12Nov.2015；4.Liu,Luyao et al.“Rapid and regenerable surface plasmonresonance determinations of biomarker concentration and biomolecular interaction based on tris-nitrilotriacetic acid chips.”Analytica chimica actavol.1170(2021):338625]。但是这些技术仪器昂贵且只能定性判断是否有蛋白表达，不能对蛋白的状态进行分析。
锌指结构蛋白是一类需要结合锌离子才能行使功能的一类蛋白，包括RING、FYVE以及ZZ锌指蛋白等。其中RING-finger是具有指环结构域的蛋白。其主要功能是在蛋白泛素化过程中作为泛素连接酶(E3)，将活化的泛素转移到底物的赖氨酸残基上，在蛋白质修饰过程中起重要重要。人来源的RING-finger 141(RNF141)蛋白是一类被认为在精子发生期间作为生殖细胞特异性转录因子的蛋白[1.Zhang,S et al.“The shorter zinc fingerprotein ZNF230 gene message is transcribed in fertile male testes and may berelated to human spermatogenesis.”The Biochemical journal vol.359,Pt 3(2001):721-7]。SMART数据库根据该蛋白的序列进行预测发现该蛋白的C端具有RING-finger结构，暗示着该蛋白具有RING-finger蛋白功能[2.Miyamoto,Ka zuhide et al.“The zincfinger domain of RING finger protein 141reveals aunique RING fold.”Proteinscience:a publication of the Protein Society vol.26,8(2017):1681-1686.]。目前关于该蛋白全长蛋白的表达和纯化还未有报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种高通量筛选蛋白表达的方法及其应用，以解决现有检测重组蛋白从表达到聚集状态检测时耗时较长且融合标签去除成本较高等技术问题。
本发明通过以下技术方案来实现上述目的：
本发明提供了一种高通量筛选蛋白表达的方法，所述蛋白的N端或C端含有His标签，将待测蛋白的表达上清与HIS Lite混合后，利用FSEC系统进行检测，获得待测蛋白表达检测结果和聚集状态初步判断结果。
进一步改进在于，所述蛋白的N端或C端含有His6-StrepⅡ-TEV-GG融合标签。
进一步改进在于，所述蛋白为RNF141蛋白。
进一步改进在于，所述RNF141蛋白的表达条件为：感受态菌株为BL21(DE3)菌株，诱导条件为0.1mM IPTG，诱导温度为16℃，诱导时间为16个小时。
进一步改进在于，所述RNF141蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述RNF141蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种融合标签，所述融合标签为His6-StrepⅡ-TEV-GG。
本发明还提供了一种上述融合标签在高通量筛选蛋白表达中的应用。
本发明还提供了一种在目的蛋白上实现修饰标记的方法，对连接有上述所述融合标签的目的蛋白进行表达，利用上述高通量筛选蛋白表达的方法进行筛选，获得目的蛋白的表达检测结果和聚集状态初步判断结果，将目的蛋白用TEV酶酶切，获得N端或C端暴露出GG氨基酸的目的蛋白，利用SortaseA酶将修饰标记与GG氨基酸进行连接，获得修饰蛋白。
进一步改进在于，所述修饰标记为生物素标记或荧光标记。
进一步改进在于，所述生物素标记用生物素为Biotin-LPET-G(2-hydroxyaceticacid)-GH，所述荧光标记用荧光素为FAM-Ahx-LPETG(2-hydroxyacetic acid)-GH。
本发明还提供了一种上述方法获得的修饰蛋白在进行生化分析、活性表标记中的应用。
本发明具有如下有益效果：
本发明首次使用荧光标记的HIS Lite作为荧光染料，直接将其与含有His标签的蛋白的细胞上清液混合，使用FSEC系统，可实现高通量筛选蛋白表达的最佳表达质粒和表达条件，获得了纯度好的蛋白，且该蛋白还可以被多功能标记。
附图说明
图1为RNF141蛋白高通量筛选表达条件；
图2为RNF141亲和层析结果；
图3为RNF141蛋白TEV酶切及亲和层析结果；
图4为RNF141蛋白生物素标记；
图5为RNF141蛋白荧光素标记。
具体实施方式
下面结合附图对本申请作进一步详细描述，有必要在此指出的是，以下具体实施方式只用于对本申请进行进一步的说明，不能理解为对本申请保护范围的限制，该领域的技术人员可以根据上述申请内容对本申请作出一些非本质的改进和调整。
1、材料
本发明所用方法如无特别说明均为本领域的技术人员所知晓的常规方法，未注明具体条件者，按照常规条件或者制造商建议的条件进行，所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
2、方法
2.1RNF141蛋白高通量筛选表达条件
RNF141的基因序列均是通过基因合成获得，RNF141的基因序列如SEQ ID NO.2所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。采用pET-28a载体，使用常规的分子生物学手段进行引物设计、PCR及载体片段重组构建得到重组质粒，所有重组质粒均经测序验证与目标序列完全一致。
将测序正确的重组质粒按照常规分子生物学手段分别转化BL21(DE3)和Rosetta2(DE3)大肠杆菌感受态细胞，分别挑取单克隆菌斑至3管5mL LB液体培养基中，37℃培养，待菌液OD600至0.6-0.8时，在其中1管BL21(DE3)菌中加入0.5mM IPTG，37℃诱导4个小时；另1管BL21(DE3)菌中加入0.1mM IPTG，16℃诱导16个小时；Rosetta2(DE3)菌中加入0.1mMIPTG，16℃诱导16个小时。收集各条件下培养的菌体，用裂解buffer将菌体吹匀后，使用超声破碎仪超声10秒，将超声后的样品用16000rpm高速离心10分钟收集上清。分别取40μl各管中上清，每管加入40μl HIS lite(购于美国AAT Bioquest公司)混合后将样品使用进行FSEC系统进行检测，检测结果见图1。根据结果可知，在14分钟内可以知道RNF141蛋白在细胞上清中仅少部分蛋白是折叠不正确的高聚蛋白，其中BL21菌株中蛋白表达量要高于Rosetta2菌株，且BL21菌株中16℃诱导的条件蛋白产量最高。因此，使用HIS Lite，使用FSEC系统筛选出RNF141蛋白的最佳表达条件为：BL21(DE3)菌株，诱导条件为0.1mM IPTG，温度为16℃，时间为16个小时。RNF141蛋白因为N端含有His标签，所以可以与HIS Lite结合，因此与HIS Lite结合后可以在FSEC系统中检测到荧光。
2.2RNF141蛋白大量表达及纯化
(1)大量表达
将重组RNF141菌株接中至50mL LB液体培养基中37℃培养过夜，将过夜培养的细菌按1:100的比例接至1L LB液体培养基中，37℃培养至菌液OD600为0.6-0.8时加入0.1mMIPTG，16℃培养16小时，5000rpm离心收集菌体。
(2)亲和层析
将收集的菌体进行称重，按照1:10比例加入相应体积的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl(pH 8.0)，500mM NaCl，10％glycerol)，使用高压均质机破碎菌体，16000rpm高速离心收集上清。使用亲和层析His FF富集纯化蛋白，纯化前先用裂解buffer平衡His FF柱，将所有细胞上清与His FF结合后，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE检测，蛋白纯化结果如图2所示，His FF能够富集到目标蛋白，且蛋白纯化较好。
(3)TEV酶切及亲和层析
将(2)中亲和层析中300mM洗脱下的蛋白用TEV酶进行酶切，去除RNF141蛋白的N端标签，具体操作：将TEV酶和RNF141蛋白按照蛋白酶量1:20的比例在RNF141中加入相应体积的TEV酶，4℃，过夜酶切。将过夜酶切的样品进行再次His FF亲和层析，用不同梯度的咪唑溶液进行洗脱，收集不同梯度咪唑洗脱下的蛋白进行SDS-PAGE检测，蛋白纯化结果如图3所示。根据实验结果可知，RNF141的标签可以被TEV酶切除，且纯化较高。收集切除后的标签后的蛋白。
2.3RNF141蛋白修饰
RNF141蛋白经TEV酶切除后的蛋白为GG-RNF141，其N端暴露出两个甘氨酸。
SortaseA酶是一种能够识别底物蛋白C端短肽序列LPXTG，水解位置在T和G之间，水解后的T可以与另一个蛋白游离的G连接，因此可以将蛋白与肽、核酸、糖类等进行连接。
(1)RNF141生物素标记
本实施例用的生物素为Biotin-LPET-G(2-hydroxyacetic acid)-GH(购置于北京中科亚光生物科技有限公司)，分子量为663Da。RNF141蛋白在LC-MS上检测的分子量约为25574Da。
具体实验操作如下：
将SortaseA酶、RNF141和生物素三种样品按照摩尔比例1:20:200进行混合，室温下反应1小时后，利用LC-MS检测反应前后反应体系中样品的分子量判断SortaseA酶是否将修饰物标记在了目标蛋白上，结果如图4所示，根据实验结果可知RNF141在反应后在LC-MS的分子量为26241Da，较之前大了667Da，该分子量与生物素分子量接近，说明RNF141被成功标记上生物素。
(2)荧光标记
本实施例用的荧光素为FAM-Ahx-LPETG(2-hydroxyacetic acid)-GH(购置于北京中科亚光生物科技有限公司)，分子量为910Da。RNF141蛋白在LC-MS上检测的分子量约为25574Da。
具体实验操作如下：
将SortaseA酶、RNF141和FAM三种样品按照摩尔比例1:20:200进行混合，室温下反应1小时后，利用LC-MS检测反应前后反应体系中样品的分子量判断SortaseA酶是否将修饰物标记在了目标蛋白上，结果如图5所示，根据实验结果可知RNF141在反应后在LC-MS的分子量为26485Da，较之前大了911Da，该分子量与FAM分子量接近，说明RNF141被成功标记上FAM荧光素。
2.4结论
本发明以RNF141为例，此方法同样适用于其它His标签蛋白，该高通量筛选方法不仅可以筛选蛋白表达条件，还可以筛选不同的蛋白纯化缓冲液、蛋白片段长度等，原理相似。在质粒设计时，其N端或者C端添加His6-StrepⅡ-TEV-GG标签后，即可同时实现高通量筛选和多功能生物标记，其标记后的产物可以直接应用于生化分析、活性表标记等。无论是高通量筛选还是多功能标记都具有操作简单、时间短、成本低等特点。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。

Claims (11)

1.一种高通量筛选蛋白表达的方法，所述蛋白的N端或C端含有His标签，其特征在于，将待测蛋白的表达上清与HIS Lite混合后，利用FSEC系统进行检测，获得待测蛋白表达检测结果和聚集状态初步判断结果。
2.根据权利要求1所述的一种高通量筛选蛋白表达的方法，其特征在于，所述蛋白的N端或C端含有His6-StrepⅡ-TEV-GG融合标签。
3.根据权利要求1所述的一种高通量筛选蛋白表达的方法，其特征在于，所述蛋白为RNF141蛋白。
4.根据权利要求3所述的一种高通量筛选蛋白表达的方法，其特征在于，所述RNF141蛋白的表达条件为：感受态菌株为BL21(DE3)菌株，诱导条件为0.1mM IPTG，诱导温度为16℃，诱导时间为16个小时。
5.根据权利要求3所述的一种高通量筛选蛋白表达的方法，其特征在于，所述RNF141蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述RNF141蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.一种融合标签，其特征在于，所述融合标签为His6-StrepⅡ-TEV-GG。
7.一种如权利要求6所述的融合标签在高通量筛选蛋白表达中的应用。
8.一种在目的蛋白上实现修饰标记的方法，其特征在于，对连接有如权利要求6所述融合标签的目的蛋白进行表达，利用如权利要求1-5任一所述的高通量筛选蛋白表达的方法进行筛选，获得目的蛋白的表达检测结果和聚集状态初步判断结果，将目的蛋白用TEV酶酶切，获得N端或C端暴露出GG氨基酸的目的蛋白，利用SortaseA酶将修饰标记与GG氨基酸进行连接，获得修饰蛋白。
9.根据权利要求8所述的一种在目的蛋白上实现修饰标记的方法，其特征在于，所述修饰标记为生物素标记或荧光标记。
10.根据权利要求9所述的一种在目的蛋白上实现修饰标记的方法，其特征在于，所述生物素标记用生物素为Biotin-LPET-G(2-hydroxyacetic acid)-GH，所述荧光标记用荧光素为FAM-Ahx-LPETG(2-hydroxyacetic acid)-GH。
11.一种如权利要求8-10任一所述的方法获得的修饰蛋白在进行生化分析、活性表标记中的应用。
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Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070287160A1 (en) * 2006-04-21 2007-12-13 Chou Judy H Methods for high throughput screening of cell lines
US20140141991A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-22 Arizona Board of Regents, a body Corporate of the State of Arizona, Acting for and on Behalf of Ariz High throughput detection of fusion proteins
CN111247431A (zh) * 2017-08-18 2020-06-05 新加坡科技研究局 鉴定蛋白质相互作用的方法
WO2021099484A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Archaeal peptide recombinase – a novel peptide ligating enzyme
CN114574471A (zh) * 2022-04-06 2022-06-03 无锡佰翱得生物科学有限公司 一种重组SortaseA酶及其固定化方法和应用

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20070287160A1 (en) * 2006-04-21 2007-12-13 Chou Judy H Methods for high throughput screening of cell lines
US20140141991A1 (en) * 2012-11-09 2014-05-22 Arizona Board of Regents, a body Corporate of the State of Arizona, Acting for and on Behalf of Ariz High throughput detection of fusion proteins
CN111247431A (zh) * 2017-08-18 2020-06-05 新加坡科技研究局 鉴定蛋白质相互作用的方法
WO2021099484A1 (en) * 2019-11-20 2021-05-27 MAX-PLANCK-Gesellschaft zur Förderung der Wissenschaften e.V. Archaeal peptide recombinase – a novel peptide ligating enzyme
CN114574471A (zh) * 2022-04-06 2022-06-03 无锡佰翱得生物科学有限公司 一种重组SortaseA酶及其固定化方法和应用

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
A. E. BACKMARK等: "Fluorescent probe for high-throughput screening of membrane protein expression", PROTEIN SCIENCE, vol. 22, pages 1124 - 1132 *
GENBANK: "RING finger protein 141", XP_003910278.1 *
KWABENA SARPONG等: "Efficient sortase-mediated N-terminal labeling of TEV protease cleaved recombinant proteins", ANALYTICAL BIOCHEMISTRY, vol. 521, pages 55 - 58, XP029912040, DOI: 10.1016/j.ab.2017.01.008 *

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