WO2010095365A1 - 質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチド、人工標準タンパク質、及びタンパク質の定量方法 - Google Patents

質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチド、人工標準タンパク質、及びタンパク質の定量方法 Download PDF

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amino acid
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大槻純男
上家潤一
寺崎哲也
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国立大学法人東北大学
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    • H01J—ELECTRIC DISCHARGE TUBES OR DISCHARGE LAMPS
    • H01J49/00—Particle spectrometers or separator tubes

Definitions

  • the present invention relates to an evaluation peptide for evaluating the efficiency of pretreatment performed in protein quantification using mass spectrometry, an artificial standard protein containing the peptide, and a protein quantification method using the artificial standard protein. It is preferable to incorporate two or more kinds of evaluation peptides in the artificial standard protein, and it is more preferable to incorporate two or more cysteines.
  • a certain amount of the artificial standard protein of the present invention is added to the protein sample before pretreatment, and then the pretreatment is performed and the evaluation peptide is quantified by mass spectrometry. Pretreatment efficiency can be evaluated.
  • the mass spectrometer is an MS / MS in which two mass spectrometers with electrospray ionization (ESI), mass spectrometer with liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS), and mass spectrometer are combined.
  • MS / MS mass spectrometers with various functions, such as spectrum (MS / MSspectrum) or tandem mass spectrum (tandem mass spectrum) mass spectrometers, have been developed. It is used for detection, measurement, and quantification (Patent Documents 1 to 3).
  • proteins are macromolecules and have a three-dimensional structure, they are comprehensively separated by liquid chromatography and are not suitable for analysis by a mass spectrometer. Therefore, in general, proteins are denatured, modified, precipitated, and then converted into peptides using protein digestion enzymes such as trypsin, separated by liquid chromatography, and analyzed by mass spectrometry. ing.
  • protein digestion enzymes such as trypsin
  • mass spectrometry mass spectrometry
  • Patent Documents 4 and 5 The inventors have already invented a method for comprehensively quantifying the absolute expression levels of membrane proteins and metabolic enzymes using a mass spectrometer.
  • the efficiency of pretreatments such as denaturation, modification, precipitation, digestion, etc., hardly affected the sensitivity, although it affected the sensitivity.
  • the quantification method of the inventors in order to use the quantitative value of the target digested peptide as the quantitative value of the target protein, it is an essential condition that the pretreatment is sufficiently performed, and the efficiency of the pretreatment Good or bad influences the accuracy and reliability of quantitative values. Therefore, evaluating the pretreatment efficiency for each sample and confirming that the pretreatment is sufficiently performed are essential for protein quantification using mass spectrometry.
  • Non-patent Document 1 In order to evaluate the pretreatment efficiency, a method has been used in which a purified specific protein already existing in nature is used as a standard protein, and one digested peptide fragment thereof is used as an evaluation peptide.
  • a purified specific protein already existing in nature is used as a standard protein, and one digested peptide fragment thereof is used as an evaluation peptide.
  • this method when a protein having a part of the same amino acid sequence as the evaluation peptide is present in the measurement sample, there is a problem that the quantitative value is affected and overestimation is performed. Furthermore, when evaluating with one evaluation peptide, the evaluation peptide may be completely cut out even if digestion is not sufficiently performed as a whole. There was a problem.
  • JP 2004-28993 A Japanese Patent Laid-Open No. 2004-77276 JP-T-2004-533610 International Publication No. WO07 / 055116 Japanese Patent Application No. 2008-251212
  • An object of the present invention is to provide a highly reliable and versatile evaluation peptide for evaluating pretreatment efficiency in protein quantification using a mass spectrometer, an artificial standard protein including the evaluation peptide, and the artificial standard protein It is to provide a protein quantification method using
  • the present inventors are diligently studying to solve the above-mentioned problems, and by using a peptide having no sufficient amino acid sequence as a known protein and having sufficient sensitivity by a mass spectrometer as an evaluation peptide, The knowledge that it can adapt universally to all kinds of protein samples was obtained. Furthermore, the number of amino acid residues and amino acid types of peptides suitable for detection by a mass spectrometer were found, specific peptides were examined, and four types of amino acid sequences of evaluation peptides satisfying the above conditions were designed.
  • the present invention selects [1] a peptide comprising an amino acid sequence that does not coincide with a naturally occurring protein and a variant thereof, can be detected by mass spectrometry, and includes an amino acid recognized by a protein digestive enzyme.
  • a method of using the peptide as a peptide for evaluation for protein quantification using a mass spectrometer, and [2] an amino acid sequence that does not match a naturally occurring protein or a variant thereof does not match a known protein The method according to [1] above, wherein the method is an amino acid sequence.
  • the present invention also provides [3] a peptide having 3 to 20 amino acid residues, which has an amino acid that is recognized by a protein digestive enzyme at the C-terminus and is recognized by the protein digestive enzyme other than the C-terminus.
  • An evaluation peptide for protein quantification using a mass spectrometer which has no amino acid and consists of an amino acid sequence that does not match a naturally occurring protein and its variant, and [4] an amino acid that can be labeled with a stable isotope
  • the evaluation peptide according to [3] above, or [5] the number of amino acid residues is 8, 10 or 12, and includes proline or glycine and does not include histidine.
  • [7] (1) VGAPGVPALK (SEQ ID NO: 1), (2) QIGDPTVPSGVK (SEQ ID NO: 2), (3) DAPGSGLK (SEQ ID NO: 3), (4) NVAPAGPTLK (SEQ ID NO: 4)
  • the peptide for evaluation for protein quantification using a mass spectrometer characterized by comprising either of the amino acid sequences shown in (4).
  • the present invention relates to [8] a method of using the evaluation peptide according to any one of [3] to [7] for protein quantification using a mass spectrometer.
  • the present invention also includes [9] two or more amino acid sequences of the peptide for evaluation according to any one of [3] to [7] above, and two positions for one type of sequence. It relates to an artificial standard protein for protein quantification using an analyzer, or [10] the artificial standard protein according to [9] above, which has two or more cysteines in one molecule.
  • the present invention provides [11] a method for using the artificial standard protein according to [9] or [10] as an artificial standard protein for protein quantification using a mass spectrometer, and [12] the above [9] ] It relates to a protein quantification method using the artificial standard protein of [10] as an artificial standard protein for protein quantification using a mass spectrometer.
  • the present invention provides [13] (a) a step of adding an artificial standard protein having a known mass to a sample containing a protein to be quantified, adding a protein digesting enzyme, and digesting the protein to be quantified and the artificial standard protein. (B) In the sample obtained by the step (a), a peptide having the same sequence as the peptide that is a digest of the protein to be quantified and the artificial standard protein and labeled with a stable isotope is added, and liquid chromatography is performed.
  • a protein quantification method [14] (A) the artificial standard protein according to [9] or [10], (B) a protein digestion enzyme, (C) the artificial standard protein Protein quantification using a mass spectrometer characterized by comprising peptides (A) to (C) having the same sequence as a peptide digested by the protein digestive enzyme and labeled with stable isotopes It relates to a standard material kit for use.
  • the peptide for evaluation of the present invention has high versatility, and it is possible to evaluate the efficiency of pretreatment of an arbitrary measurement sample using the peptide, thereby ensuring the reliability of the protein quantitative value.
  • An artificial standard protein in which two or more types of evaluation peptides are incorporated into an artificial standard protein each has a 100% recovery rate of all the evaluation peptides when completely fragmented by protein digestion enzymes. The critical digestion integrity can be assessed.
  • the evaluation peptide of the present invention is a peptide that does not have the same amino acid sequence as a known protein and has sufficient sensitivity by a mass spectrometer, and can be applied to any protein sample. Versatile.
  • the flow of pretreatment evaluation in protein quantification of the present invention is typically shown.
  • the method of pre-processing evaluation in protein quantification of the present invention is typically shown. It is the amino acid sequence of the created artificial standard protein, and its schematic diagram. The underlined portion indicates an inserted evaluation peptide, and * indicates a stable isotope-labeled amino acid. It is the chromatogram in the calibration curve of 10 fmol of the peptide for evaluation (VGAPGVPALK; SEQ ID NO: 1). It is the chromatogram in the calibration curve of 10 fmol of the peptide for evaluation (QIGDPTVPSGVK; SEQ ID NO: 2).
  • a peptide comprising an amino acid sequence that does not match a naturally occurring protein and its variant and that can be detected by mass spectrometry and includes an amino acid that is recognized by a protein digestion enzyme is selected.
  • a peptide for evaluation for protein quantification using a mass spectrometer and the amino acid sequence that does not match the naturally occurring protein and its mutants is unknown or known.
  • An amino acid sequence that does not match a protein can be mentioned, but an amino acid sequence that does not match a known protein is more preferable.
  • an amino acid sequence that does not match a known protein an amino acid sequence that has been confirmed not to have the same amino acid sequence, preferably by homology search against a database such as Swiss-Prot can be exemplified.
  • the naturally occurring proteins include homologous proteins (homologues) and proteins having mutation sites derived from SNPs.
  • naturally occurring protein variants include one or more in the amino acid sequence of the natural protein.
  • the amino acid sequence that can be detected by a mass spectrometer is specifically an amino acid sequence that constitutes a peptide that can be detected by, for example, LC-MS / MS, and more specifically, LC-MS / MS.
  • An amino acid sequence constituting a peptide in which 10 fmol can be detected is preferable.
  • 10 fmol can be detected by LC-MS / MS, for example, 10 fmol can be detected using LC / MS / MS system “API5000 (trade name)”, “4000Q TRAP (registered trademark)” manufactured by Applied Biosystems. It means that.
  • the phrase “containing an amino acid that is recognized by a protein digestive enzyme” means that it contains an amino acid that is recognized by a protein digestive enzyme and becomes a cleavage site, and as the protein digestive enzyme, an endopeptidase is preferable, for example, trypsin.
  • the portion recognized by the protein digestive enzyme is preferably the C terminus of the amino acid sequence, and there is an amino acid recognized by the protein digestive enzyme other than the C terminus. Preferably not.
  • the evaluation peptide preferably has lysine (K) or arginine (R) at the C-terminus.
  • the evaluation peptide has an amino acid that can be labeled with a stable isotope.
  • amino acids that can be labeled with a stable isotope include leucine (L) and valine (V).
  • L leucine
  • V valine
  • the number of amino acids that can be labeled with a stable isotope may be one or more. Further, the number of amino acids that can be labeled with a stable isotope may be one type or a plurality of types, but one type is preferred from the viewpoint of cost and the like during implementation.
  • the number of amino acid residues in the evaluation peptide is not particularly limited, but is preferably 4 to 30, more preferably 5 to 15, and still more preferably 8 to 12.
  • the number of amino acid residues of the peptide for evaluation is 8, 10 or 12, which preferably contains proline (P) and / or glycine (G) and does not contain histidine (H).
  • P proline
  • G glycine
  • H histidine
  • Peptides with 8, 10 or 12 amino acid residues and containing proline and / or glycine and no histidine give a strong signal in mass spectrometry, so their presence is detected with a smaller addition. It is suitable as a peptide for evaluation.
  • the peptide for evaluation of the present invention can be designed by combining the above conditions with known criteria.
  • a known criterion for example, a criterion for selecting a peptide suitable for protein analysis using a mass spectrometer (for example, a criterion described in WO 2007/0555116) can be combined.
  • the content and sequence conditions of a hydrophobic amino acid consisting of tryptophan, tyrosine, valine, leucine, isoleucine and phenylalanine are as follows: the content of hydrophobic amino acid is 80% or less, preferably 50% or less, and the hydrophobic amino acid is 10 amino acids or more.
  • a non-contiguous peptide As a specific amino acid sequence condition, a peptide not containing the sequence of asparagine-XY (wherein X represents an amino acid other than proline and Y represents serine, threonine or cysteine);
  • the proteolytic cleavage site is a peptide that is not arginine-arginine, arginine-lysine, lysine-arginine, lysine-lysine; A peptide containing no methionine or cysteine; A peptide that does not contain tryptophan or glutamic acid;
  • One or more of the criteria such as can be used. It is also possible to set a score for each of these criteria and design a peptide with a high total score.
  • evaluation peptide examples include peptides composed of the amino acid sequences shown in SEQ ID NOs: 1 to 4.
  • An artificial standard protein can be designed using the evaluation peptide, and the present invention also includes two or more amino acid sequences of the evaluation peptide, and two or more amino acid sequences per one amino acid sequence. It relates to a featured artificial standard protein. In the present specification, the number of peptides for evaluation incorporated into an artificial standard protein is referred to as “number of incorporations”.
  • a plurality of types of evaluation peptides may be randomly incorporated together with a plurality of types of non-evaluation peptide portions (X) (for example, AB).
  • X for example, AB
  • -XB-C-B-X-A-B-C-A-X which may be arranged in sequence (eg, X-A-X--B--X--A--B--X-- ABBXAB), preferably designed by repeating four or more kinds of peptides for evaluation in order (ABCDD) and repeating (ABCDD) XABBXCD; incorporation number 2).
  • the non-evaluation peptide part (X) When the non-evaluation peptide part (X) is used, it is necessary for the C-terminus to be an amino acid recognized by a protein digestion enzyme in order to separate the evaluation peptide by the protein digestion enzyme.
  • the artificial standard protein since the artificial standard protein has two or more kinds of evaluation peptides in one molecule and two or more evaluation peptides for one kind of sequence, it can be evaluated that the protein has been completely digested by a protein digestive enzyme. High sensitivity per protein. Therefore, it can be suitably used as an artificial standard protein for protein quantification using a mass spectrometer.
  • the artificial standard protein more preferably has two or more cysteines (S).
  • Cysteine (S) may be incorporated in the amino acid sequence of the evaluation peptide or may be incorporated in a site other than the evaluation peptide, but preferably a site other than the evaluation peptide (for non-evaluation) Peptide moiety X site).
  • the artificial standard protein may have a sequence other than the site of the peptide for evaluation, for example, a transport signal sequence, a tag sequence for purification, etc., and preferably contains a tag sequence for purification. .
  • the artificial standard protein can be produced, for example, by the following method. That is, a cDNA sequence is designed from the amino acid sequence of the artificial standard protein, and cDNA is synthesized by nucleic acid oligo synthesis, PCR, or the like. Furthermore, the cDNA is incorporated into an expression vector and a protein is synthesized by Escherichia coli or the like.
  • the obtained synthetic protein can be purified by known conditions and methods such as a purification method using a tag sequence. An accurate amount (concentration) of the purified artificial standard protein can be calculated by amino acid analysis.
  • a stable isotope labeled peptide having the same sequence as the evaluation peptide is synthesized in advance for quantification of the absolute amount of the evaluation peptide. Keep it.
  • the stable isotope labeled peptide added as an internal standard is labeled with at least one stable isotope of 15N, 13C, 18O, and 2H.
  • the unlabeled evaluation peptide and the internal standard stable isotope-labeled evaluation peptide are separated by a mass difference, so that the mass that can be separated by LC-MS / MS A difference is necessary.
  • a peptide containing leucine (L) labeled at 6 positions with 13C is used.
  • a stable isotope-labeled peptide requires that at least one amino acid is labeled with a stable isotope, and the peptide can be prepared by any method known to those skilled in the art.
  • stable isotope-labeled peptides can be chemically synthesized.
  • the stable isotope-labeled peptide thus obtained and the peptide to be quantified are chemically the same except that the mass of the labeled amino acid is different, exhibiting the same behavior in LC-MS / MS measurement, and the analyte And the degree of loss of the standard is equal.
  • a known amount preferably 100-10,000 fmol of an artificial standard protein
  • a protein digestion enzyme is further added, and pretreatment is performed.
  • the pretreatment refers to a treatment in which a protein digestive enzyme is added and the artificial standard protein and the protein to be quantified are digested to form a peptide.
  • the proteolytic enzyme the aforementioned trypsin or the like can be used.
  • the pretreatment temperature and time standard reaction conditions for protein digestion enzymes can be used. For example, pretreatment can be performed at a temperature of 35 ° C. to 45 ° C. for 1 minute to 20 hours.
  • a known amount of the peptide for evaluating stable isotope labeling is added to the sample obtained by the pretreatment step.
  • the amount of the stable isotope labeling evaluation peptide to be added may be a known amount, but is preferably an amount [mol] corresponding to (artificial standard protein [mol] ⁇ number of incorporations).
  • a stable isotope-labeled peptide having the same sequence as the digest of the protein to be quantified by the protein digestion enzyme is added.
  • An evaluation value of pretreatment efficiency is calculated from the amount (A [mol]) of the added artificial standard protein and the quantitative value (B [mol]) of each evaluation peptide (step (c)).
  • the evaluation value between each evaluation peptide is a constant value of 0.80 or more, preferably 0.90 or more, it is evaluated that the pretreatment is sufficiently performed, and a reliable quantitative value is obtained for the protein to be quantified. Therefore, it can be determined (see FIGS. 1 and 2).
  • the evaluation value is constant, for example, there is little or no variation between the evaluation values of a plurality of types of evaluation peptides contained in the artificial standard protein. Specifically, the variation from the average value is within 0.10. There are some cases.
  • the evaluation value of 0.80 or more includes, for example, the case where the average value of the evaluation values of a plurality of types of evaluation peptides contained in the artificial standard protein is 0.80 or more.
  • the quantitative value of the protein to be quantified can be calculated using the evaluation value of the pretreatment efficiency obtained by the pre-process. Moreover, when the evaluation value is lower than 0.80, there is a problem in the preprocessing, and it is possible to consider remeasurement or change of the measurement method without adopting the measurement value.
  • the present invention also relates to a protein quantification kit, and the kit of the present invention includes the following (A) to (C).
  • A) Artificial standard protein (B) Protein digestive enzyme (C) Artificial standard protein which is the same sequence as the peptide digested by the protein digestive enzyme of the artificial standard protein and is included in a peptide kit labeled with a stable isotope Peptides that have the same sequence as the peptides that are digests of the standard protein, protein digestive enzyme, and artificial standard protein by the protein digestive enzyme and are labeled with stable isotopes are the same as those described in detail above.
  • the kit of the present invention may contain a buffer solution, a pH adjuster, a reaction vessel and the like according to necessity and purpose.
  • VGAPGVPALK SEQ ID NO: 1
  • QIGDPTVPSGVK SEQ ID NO: 2
  • DAPGSGLK SEQ ID NO: 3
  • NVAPAGPTLK SEQ ID NO: 4
  • the artificial standard protein was prepared by the following method. 1.
  • IPTG induction Escherichia coli (BL21-CodonPlus (DE3) -RIPL) transformed with pET-vector inserted with artificial standard protein cDNA in LB medium supplemented with kanamycin and chloramphenicol at 30 mg / L and 50 mg / L, respectively. After overnight shaking culture, dilute in LB medium and continue to culture until OD600 shows a value around 0.4, add IPTG at a final concentration of 100 mM, and further incubate for 3 hours to express protein. Guidance was performed. The induced Escherichia coli was sonicated in the presence of 8 MUrea to prepare a soluble fraction and an insoluble fraction, then fractionated by SDS-PAGE, and detected by CBB R-250. 2.
  • the Escherichia coli soluble fraction was added to a spin column packed with a cobalt resin, the column was washed with a 10 mM imidazole solution, and then the artificial standard protein was eluted with a 50 mM, 150 mM, and 500 mM imidazole solution.
  • FIGS. 4-1 to 4-4 The results are shown in Figs. 4-1 to 4-4.
  • the four types of evaluation peptides ⁇ VGAPGVPALK (SEQ ID NO: 1), QIGDPTVPSGVK (SEQ ID NO: 2), DAPGSGLK (SEQ ID NO: 3), NVAPAGPTLK (SEQ ID NO: 4) ⁇ are remarkable. A strong peak was confirmed, indicating that even 10 fmol could be detected.
  • the evaluation value of the peptide for evaluation is 50 to 71%, the evaluation values vary, and all show low values, so that the pretreatment of the protein in this experiment was not performed appropriately. It was judged.
  • the TPI of the comparative example has an evaluation value of 84%, and it can be seen that the validity of the preprocessing cannot be determined correctly only with the TPI.
  • the TPI recovery rate is higher than that of FIG. 5 having a low evaluation value (FIG. 6: 99%, FIG. 5: 84%), and there is a correlation between the evaluation value and the recovery rate.
  • FIG. 6 99%, FIG. 5: 84%)

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Abstract

本発明の課題は、質量分析計を用いたタンパク質の定量における前処理効率を評価するための、信頼性及び汎用性が高い評価用ペプチド、当該評価用ペプチドを含む人工標準タンパク質、当該人工標準タンパク質を用いたタンパク質の定量方法を提供することにある。本発明は、天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致せず、質量分析によって検出が可能であるアミノ酸配列からなり、かつタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を有するペプチドを選択し、当該ペプチドを、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチドとして使用する方法を提供する。

Description

質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチド、人工標準タンパク質、及びタンパク質の定量方法
　本発明は、質量分析を用いたタンパク質の定量において実施される前処理の効率を評価するための評価用ペプチド、当該ペプチドを含む人工標準タンパク質、当該人工標準タンパク質を用いるタンパク質の定量方法に関する。人工標準タンパク質には、２種類以上の評価用ペプチドをそれぞれ２つ以上組み込むことが好ましく、さらに、システインを２つ以上組み込むことがより好ましい。
　本発明のタンパク質の定量方法においては、本発明の人工標準タンパク質を前処理前のタンパク質試料に一定量添加し、その後、前処理を行い質量分析にて評価用ペプチドを定量し、その定量値から前処理効率を評価することができる。
　近年、質量分析法（mass spectrometry）の進展が目覚しく、種々の生物学材料の検出や測定にこの方法が検討され、利用されてきた。質量分析計には、エレクトロスプレー・イオン化法（ＥＳＩ：electrosprayionization)による質量分析計、液体クロマトグラフィーマススペクトロメトリー（ＬＣ－ＭＳ）をもつ質量分析計、質量分析計を２台結合した、ＭＳ／ＭＳスペクトル（ＭＳ／ＭＳspectrum）又はタンデムマススペクトル（tandem mass spectrum: tandem ＭＳ）質量分析計等、種々の機能をもつ質量分析計が開発されており、これらの機能を組み合わせたものが、生物学材料の検出や測定、定量に利用されている（特許文献１～３）。
　質量分析計を用いてタンパク質を網羅的に解析する技術はプロテオミクスと呼ばれている。タンパク質は巨大分子であり立体構造を有しているために網羅的に液体クロマトグラフィーで分離し、質量分析計で解析するには適していない。そのため一般的に、タンパク質を変性、修飾、沈殿し、その後、トリプシンなどのタンパク質消化酵素を用いてタンパク質をペプチドに小分子化し、液体クロマトグラフィーで分離し、質量分析計で解析することが行われている。消化ペプチド断片を同定することによってタンパク質試料中に存在するタンパク質を同定し、さらに、消化ペプチド断片を定量することによってタンパク質試料中の標的タンパク質の発現量を定量することができる。
　発明者らは既に質量分析装置を用いて、膜タンパク質及び代謝酵素の絶対発現量を網羅的に一斉定量する方法を発明している（特許文献４，５）。従来の、同定を目的としたプロテオミクスでは、変性、修飾、沈殿、消化等の前処理の効率は、感度に作用するもののほとんど問題とはならなかった。しかし、発明者らの定量方法においては、標的とする消化ペプチドの定量値を標的タンパク質の定量値とするために、前処理が十分に行われていることが必須の条件となり、前処理の効率の良し悪しが定量値の正確性と信頼性に大きく影響する。従って、各試料毎に前処理効率を評価し、前処理が十分行われていることを確認することは、質量分析を用いたタンパク質の定量に必須である。
　従来、質量分析計を用いたタンパク質の定量において、定量するタンパク質と同一配列を有する安定同位体標識タンパク質を作製し、該安定同位体標識タンパク質を内部標準として用いる知見はあったが、前処理効率を評価する知見はなかった（非特許文献１）。前処理効率の評価には、自然界に既に存在する精製された特定のタンパク質を標準タンパク質として、その一つの消化ペプチド断片を評価用ペプチドとして用いる方法が行われていた。しかし当該方法では、評価用ペプチドと同一のアミノ酸配列を一部に持つタンパク質が測定試料に存在する場合、定量値に影響を与え、過大評価してしまう問題があった。さらに、一つの評価用ペプチドで評価する場合は、全体としては消化が十分に行われていなくても、評価用ペプチドが完全に切り出されてしまう可能性があり、前処理効率を過大評価してしまう問題があった。
　一方、それぞれのタンパク質の定量に用いる標的消化ペプチドを組み込んだ人工タンパク質を作成し、安定同位体標識されたアミノ酸を含む培地で大腸菌を培養することによって安定同位体標識された人工タンパク質を調製する方法がある。この安定同位体標識された人工タンパク質を被定量タンパク質試料に添加し、前処理を行い、質量分析計によって（非標識標的消化ペプチド／安定同位体標識標的消化ペプチド）のピークエリア比を計測し、そのピークエリア比から前処理効率を補正したそれぞれのタンパク質の発現の相対比率を計算する手法が報告されている（非特許文献２）。しかしこの手法は、定量する標的タンパク質が制限され、標的タンパク質を変更するたびに人工タンパク質を設計、精製し直さなければならず、汎用性に大きな課題があった。
特開２００４－２８９９３号公報 特開２００４－７７２７６号公報 特表２００４－５３３６１０号公報 国際公開公報ＷＯ０７／０５５１１６号 特願２００８－２５１２１２号
Dupius K et al., Proteomics 2008, 8, 4633-4636 Kito K et al., J Proteome Res 6: 792-800, 2007
　本発明の課題は、質量分析計を用いたタンパク質の定量における前処理効率を評価するための、信頼性及び汎用性が高い評価用ペプチド、当該評価用ペプチドを含む人工標準タンパク質、当該人工標準タンパク質を用いたタンパク質の定量方法を提供することにある。
　本発明者らは上記課題を解決すべく鋭意検討する中で、既知のタンパク質と同一のアミノ酸配列が存在せず、かつ質量分析計によって十分な感度をもつペプチドを評価用ペプチドとすることで、すべての種のタンパク質試料に汎用的に適応できるとの知見を得た。さらに、質量分析計による検出に好適なペプチドのアミノ酸残基数やアミノ酸種を見い出し、具体的なペプチドを検討し、上記の条件を満たす評価用ペプチドの４種類のアミノ酸配列を設計した。
　また、２種類以上の評価ペプチドをそれぞれ２つ以上人工標準タンパク質に組み込むことで、タンパク質が完全にタンパク質消化酵素によって消化されたことを評価でき、加えて、タンパク質あたりの感度を増加させるとの知見を得た。さらに、人工標準タンパク質にシステインを２つ以上入れることによって、消化効率に大きく影響するＳ－Ｓ結合を解離させる修飾を評価可能であるとの知見を得た。本発明はこれら知見に基づき完成されるに至ったものである。
　すなわち本発明は、［１］天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致せず、質量分析によって検出が可能であるアミノ酸配列からなり、かつタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を含むペプチドを選択し、当該ペプチドを、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチドとして使用する方法や、［２］天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致しないアミノ酸配列が、既知のタンパク質と一致しないアミノ酸配列であることを特徴とする、前記［１］に記載の方法に関する。
　また本発明は、［３］アミノ酸残基数が３～２０のペプチドであって、Ｃ末端にタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を有し、Ｃ末端以外には当該タンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を有さず、天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致しないアミノ酸配列からなる、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチドや、［４］安定同位体標識可能なアミノ酸を有することを特徴とする、前記［３］に記載の評価用ペプチドや、［５］アミノ酸残基数が８、１０又は１２であって、プロリン又はグリシンを含み、かつ、ヒスチジンを含まないことを特徴とする、前記［３］又は［４］に記載の評価用ペプチドや、［６］１又は２のプロリンを含むことを特徴とする、前記［５］に記載の評価用ペプチドや、［７］（１）ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ（配列番号１）、（２）ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号２）、（３）ＤＡＰＧＳＧＬＫ（配列番号３）、（４）ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号４）の（１）～（４）に示すアミノ酸配列のいずれかによって構成されることを特徴とする、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチドに関する。
　さらに本発明は、［８］前記［３］～［７］のいずれかに記載の評価用ペプチドを、質量分析装置を用いたタンパク質定量のために使用する方法に関する。
　また本発明は、［９］前記［３］～［７］のいずれかに記載の評価用ペプチドのアミノ酸配列を２種類以上、かつ、１種類の配列について２箇所含むことを特徴とする、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための人工標準タンパク質や、［１０］１分子中にシステインを２以上有することを特徴とする、前記［９］に記載の人工標準タンパク質に関する。
　さらに本発明は、［１１］前記［９］又は［１０］に記載の人工標準タンパク質を、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための人工標準タンパク質として使用する方法や、［１２］前記［９］又は［１０］に記載の人工標準タンパク質を、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための人工標準タンパク質として使用する、タンパク質の定量方法に関する。
　さらに本発明は、［１３］（ａ）定量対象タンパク質を含む試料中に、質量既知の人工標準タンパク質を添加し、さらにタンパク質消化酵素を添加して、定量対象タンパク質及び人工標準タンパク質を消化する工程；（ｂ）（ａ）工程により得られた試料中に、定量対象タンパク質及び人工標準タンパク質の消化物であるペプチドと同一配列であって、安定同位体標識されたペプチドを添加し、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）測定を行う工程；（ｃ）（ａ）工程において添加した人工標準タンパク質の質量と、（ｂ）工程の測定により得られた、人工標準タンパク質の消化物であるペプチドの質量との比率を算出することで、タンパク質消化酵素による処理効率を評価する工程；の（ａ）～（ｃ）の工程を順次備えたことを特徴とする、タンパク質の定量方法や、［１４］（Ａ）前記［９］又は［１０］に記載の人工標準タンパク質、（Ｂ）タンパク質消化酵素、（Ｃ）前記人工標準タンパク質の前記タンパク質消化酵素による消化物であるペプチドと同一の配列であって、安定同位体標識されたペプチド、の（Ａ）～（Ｃ）を含むことを特徴とする、質量分析装置を用いたタンパク質定量用標準物質キットに関する。
　本発明の評価用ペプチドは汎用性が高く、当該ペプチドを用いて任意の測定試料の前処理の効率を評価することが可能であり、タンパク質定量値の信頼性を確保できる。２種類以上の評価ペプチドをそれぞれ２つ以上人工標準タンパク質に組み込んだ人工標準タンパク質は、タンパク質消化酵素により完全に断片化された場合にすべての評価ペプチドの回収率が１００％となるため、定量にきわめて重要な、消化の完全性を評価できる。また本発明の評価用ペプチドは、既知のタンパク質と同一のアミノ酸配列が存在せず、かつ質量分析計によって十分な感度をもつペプチドを評価用ペプチドであり、どのようなタンパク質試料にも適応できる高い汎用性を有する。
本発明のタンパク質定量における前処理評価の流れを模式的に示したものである。 本発明のタンパク質定量における前処理評価の方法を模式的に示したものである。 作成した人工標準タンパク質のアミノ酸配列とその模式図である。下線部分は挿入された評価用ペプチド、＊は安定同位体標識されたアミノ酸を示している。 評価用ペプチド（ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ；配列番号１）の、検量線１０ｆｍｏｌにおけるクロマトグラムである。 評価用ペプチド（ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ；配列番号２）の、検量線１０ｆｍｏｌにおけるクロマトグラムである。 評価用ペプチド（ＤＡＰＧＳＧＬＫ；配列番号３）の、検量線１０ｆｍｏｌにおけるクロマトグラムである。 評価用ペプチド（ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ；配列番号４）の、検量線１０ｆｍｏｌにおけるクロマトグラムである。 実験操作に習熟しない者が前処理を行った場合の、前処理効率の評価結果である。４種の評価用ペプチドの評価値にはばらつきがあり、いずれも低い値を示している。 実験操作に熟練した者が前処理を行った場合の、前処理効率の評価結果である。４種の評価用ペプチドの評価値はばらつきが少なく、いずれも高い値を示している。 ペプチド８３種類を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのＭＲＭ　ｍｏｄｅによって解析し、ピーク面積値の平均値をペプチド長に対してプロットしたものである。プロリン（Ｐ）が多いほど平均ピーク面積値が大きくなる、また、ヒスチジン（Ｈ）が存在すると平均ピーク面積値が低くなることを示している。 図７と同様に測定、プロットしたものである。グリシンが多いほど平均ピーク面積値が大きくなることを示している。
（評価用ペプチド）
　本発明としては、天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致せず、質量分析によって検出が可能であるアミノ酸配列からなり、かつタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を含むペプチドを選択し、当該ペプチドを、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチドとして使用する方法であれば特に制限されず、上記天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致しないアミノ酸配列としては、未知又は既知のタンパク質と一致しないアミノ酸配列を挙げることができるが、既知のタンパク質と一致しないアミノ酸配列であることがより好ましい。また、既知のタンパク質と一致しないアミノ酸配列として、好適にSwiss-Prot等のデータベースに対して相同性検索によって、同一のアミノ酸配列が存在しないことが確認されたアミノ酸配列を例示することができる。
　上記天然に存在するタンパク質には、相同タンパク質（ホモログ）やＳＮＰｓ由来の変異箇所を有するタンパク質が含まれ、天然に存在するタンパク質の変異体としては、例えば、天然型タンパク質のアミノ酸配列において１又は複数のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができ、より具体的には１若しくは数個のアミノ酸が欠失、置換若しくは付加されたアミノ酸配列からなるタンパク質を挙げることができる。
　質量分析計で検出が可能であるアミノ酸配列としては、具体的には例えばＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって検出が可能であるペプチドを構成するアミノ酸配列であり、さらに具体的には、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって１０ｆｍｏｌが検出可能であるペプチドを構成するアミノ酸配列が好ましい。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳによって１０ｆｍｏｌが検出可能とは、例えば、アプライドバイオシステムズ社製ＬＣ／ＭＳ／ＭＳシステム「ＡＰＩ５０００（商品名）」、「４０００Ｑ　ＴＲＡＰ（登録商標）」等を用いて１０ｆｍｏｌが検出可能であることをいう。
　タンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を含むとは、タンパク質消化酵素によって認識され、切断部位となるアミノ酸を含むことを意味し、タンパク質消化酵素としてはエンドペプチダーゼが好ましく、例えば、トリプシンが挙げられる。本願発明の評価用ペプチドのアミノ酸配列の中で、タンパク質消化酵素によって認識される箇所は、アミノ酸配列のＣ末端であることが好ましく、Ｃ末端以外には当該タンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を有しないことが好ましい。例えばタンパク質消化酵素としてトリプシンを用いる場合、評価用ペプチドは、Ｃ末端にリジン（Ｋ）又はアルギニン（Ｒ）を有することが好ましい。
　また、評価用ペプチドは安定同位体標識可能なアミノ酸を有し、安定同位体標識可能なアミノ酸としては例えば、ロイシン（Ｌ）、バリン（Ｖ）等が挙げられる。１つの評価用ペプチド中に、安定同位体標識可能なアミノ酸は１箇所であってもよいし複数箇所であってもよい。また、安定同位体標識可能なアミノ酸は１種類であっても複数種類であってもよいが、実施時のコスト等の観点からは１種類であることが好ましい。
　評価用ペプチドのアミノ酸残基数は特に制限されるものではないが、４～３０であることが好ましく、５～１５であることがより好ましく、８～１２であることがさらに好ましい。とりわけ、評価用ペプチドのアミノ酸残基数が８、１０又は１２であって、プロリン（Ｐ）及び／又はグリシン（Ｇ）を含み、かつ、ヒスチジン（Ｈ）を含まないものが好ましく、なかでも、１又は２のプロリンを含むことが好ましい。
　アミノ酸残基数が８、１０又は１２であって、プロリン及び／又はグリシンを含み、かつ、ヒスチジンを含まないペプチドは、質量分析において強いシグナルを与えるため、より少量の添加でその存在を検出することができ、評価用ペプチドとして好適である。
　本発明の評価用ペプチドは、上記の条件と公知のクライテリアとを組み合わせて、その配列を設計することができる。公知のクライテリアとしては例えば、質量分析計を用いたタンパク質の分析に好適なペプチドを選択するためのクライテリア（例えば、ＷＯ２００７／０５５１１６号公報に記載のクライテリア）を組み合わせることができる。
　具体的には例えば、
トリプシン分解酵素により得られるペプチドであること；
トリプトファン、チロシン、バリン、ロイシン、イソロイシン、フェニルアラニンからなる疎水性アミノ酸の含量及び配列条件として、疎水性アミノ酸の含量が８０％以下、好ましくは５０％以下であり、かつ前記疎水性アミノ酸が１０アミノ酸以上連続しないペプチドであること；
特定アミノ酸配列条件として、アスパラギン－Ｘ－Ｙ（配列中、Ｘはプロリン以外のアミノ酸を表し、Ｙはセリン、スレオニン又はシステインを表す。）の配列を含まないペプチドであること；
タンパク質分解酵素切断部が、アルギニン－アルギニン、アルギニン－リジン、リジン－アルギニン、リジン－リジンではないペプチドであること；
メチオニン、システインを含まないペプチドであること；
トリプトファン、グルタミン酸を含まないペプチドであること；
等のクライテリアの１又は２以上を用いることができる。また、これらのクライテリアの各々にスコアを設定し、スコア合計の高いペプチドを設計することもできる。
　評価用ペプチドとして具体的には、配列番号１～４に示されるアミノ酸配列によって構成されるペプチドが挙げられる。
（人工標準タンパク質）
　前記の評価用ペプチドを用いて人工標準タンパク質を設計することができ、本発明はまた、前記の評価用ペプチドのアミノ酸配列を２種類以上、かつ、１種類のアミノ酸配列について２箇所以上含むことを特徴とする人工標準タンパク質に関する。なお、本明細書においては、人工標準タンパク質に組み込んだ各評価用ペプチドの数を「組み込み数」という。
　人工標準タンパク質において、複数種類の評価用ペプチド（例えば、Ａ，Ｂ，Ｃ，Ｄ）は複数種類の非評価用ペプチド部分（Ｘ）と共にランダムに組み込まれていてもよいし（例えば、Ａ－Ｂ－Ｘ－Ｂ－Ｃ－Ｂ－Ｘ－Ａ－Ｂ－Ｃ－Ａ－Ｘ）、順番に配列されていてもよいが（例えば、Ｘ－Ａ－Ｘ－Ｂ－Ｘ－Ａ－Ｂ－Ｘ－Ａ－Ｂ－Ｘ－Ａ－Ｂ）、好ましくは、４種類以上の評価用ペプチドを順番に並べ（Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ)、さらに繰り返すことによって設計する（Ａ－Ｂ－Ｃ－Ｄ－Ｘ－Ａ－Ｂ－Ｘ－Ｃ－Ｄ；組み込み数２)。なお、非評価用ペプチド部分（Ｘ）を用いる場合、そのＣ末端はタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸とすることが、タンパク質消化酵素によって評価用ペプチドを分離する上で必要である。
　また、人工標準タンパク質は１分子中に２種類以上、かつ、１種類の配列について２箇所以上の評価ペプチドを有するため、タンパク質が完全にタンパク質消化酵素によって消化されたことを評価でき、加えて、タンパク質あたりの感度が高い。このため、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための人工標準タンパク質として好適に使用できる。
　また、人工標準タンパク質はシステイン（Ｓ）を２つ以上有していることがより好ましい。システイン（Ｓ）は、評価用ペプチドのアミノ酸配列中に組み込まれていても良いし、評価用ペプチド以外の部位に組み込まれていてもよいが、好ましくは評価用ペプチド以外の部位（上記非評価用ペプチド部分Ｘの部位）である。
　また、人工標準タンパク質は、評価用ペプチドの部位以外の配列、例えば、輸送シグナル配列や精製のためのタグ配列等を有していてもよく、精製のためのタグ配列を含んでいることが好ましい。
　人工標準タンパク質は例えば、次の方法で製造できる。すなわち、上記人工標準タンパク質のアミノ酸配列からｃＤＮＡ配列を設計し、核酸オリゴ合成及びＰＣＲ等によって、ｃＤＮＡを合成する。さらに、ｃＤＮＡを発現ベクターに組み込み大腸菌等によってタンパク質を合成する。得られた合成タンパク質は、タグ配列を利用した精製法等の公知の条件・方法によって精製することができる。精製した人工標準タンパク質は、アミノ酸分析によって正確な量（濃度）を算出することができる。
（人工標準タンパク質を用いたタンパク質の前処理評価及び定量）
　本発明の人工標準タンパク質を用いた前処理評価及び被定量タンパク質の定量には、予め、評価用ペプチドの絶対量の定量のため、評価用ペプチドと同一の配列である安定同位体標識ペプチドを合成しておく。内部標準として加えられる安定同位体標識ペプチドは、１５Ｎ，１３Ｃ，１８Ｏ，２Ｈのうち少なくとも一つの安定同位元素により標識される。ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定の際、非標識の評価用ペプチドと内部標準である安定同位体標識された評価用ペプチドとは、質量差によって分離されるため、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分離可能な質量差が必要である。好ましくは１３Ｃで６箇所標識されたロイシン（Ｌ）を含むペプチドを用いる。安定同位体標識ペプチドは、少なくとも一つのアミノ酸が安定同位元素で標識されていることが必要であり、当該ペプチドは、当業者に公知の任意の方法で調製することができる。例えば、安定同位元素により標識されたアミノ酸を用いてＦ－ｍｏｃ法（Amblard M, Fehrentz JA, Martinez J, Subra G. Methods Mol Biol.298:3-24(2005)）等の適当な手段で目的の安定同位体標識ペプチドを化学合成することができる。このようにして得られた安定同位体標識ペプチドと定量対象ペプチドとは、標識アミノ酸の質量が異なる点以外では化学的に同一であり、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ測定において同一の挙動を示し、分析物と標準物の損失の程度は等しくなる。
　本発明に係るタンパク質定量においては、前処理前の定量対象タンパク質を含むタンパク質試料に、既知量、好ましくは１００－１０，０００ｆｍｏｌの人工標準タンパク質を加え、さらにタンパク質消化酵素を添加し、前処理を行う（工程（ａ））。前処理とは、タンパク質消化酵素を添加し、人工標準タンパク質及び定量対象タンパク質を消化して、ペプチドとする処理をいう。タンパク質分解酵素としては、前述のトリプシン等を用いることができる。前処理の温度及び時間は、タンパク質消化酵素の標準的な反応条件を用いることができ、例えば、温度３５℃～４５℃において、１分～２０時間前処理を行うことができる。
　前処理後、前処理工程により得られた試料に、既知量の安定同位体標識評価用ペプチドを加える。加える安定同位体標識評価用ペプチドの量は、既知量であればよいが、（人工標準タンパク質［ｍｏｌ］×組み込み数）に相当する量［ｍｏｌ］であることが好ましい。
　また同時に、定量対象タンパク質の定量のために、定量対象タンパク質のタンパク質消化酵素による消化物と同一配列の、安定同位体標識ペプチドも添加する。
　この試料を液体クロマトグラフ－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）によって測定し、定量対象タンパク質の定量と同時に、各評価ペプチドの絶対量を公知の内部標準法（例えば、国際公開公報ＷＯ０７／０５５１１６号に記載の方法）によって計測する（工程（ｂ））。
　添加した人工標準タンパク質の量（Ａ［ｍｏｌ］）と各評価ペプチドの定量値（Ｂ［ｍｏｌ］）から、前処理効率の評価値を計算する（工程（ｃ））。
評価値は、次式；
評価値＝Ｂ／（Ａ×組み込み数）
によって得られる。
　各評価ペプチド間の評価値が一定値であって０．８０以上、好ましくは０．９０以上の時に前処理が十分行われていると評価し、定量対象タンパク質について信頼性のある定量値が得られていると判断することができる（図１及び図２参照）。
　評価値が一定値とは、例えば、人工標準タンパク質に含まれる複数種の評価ペプチドの評価値の間にばらつきが少なく、もしくは無く、具体的には、平均値からのばらつきが０．１０以内である場合が挙げられる。
　評価値が０．８０以上とは、例えば、人工標準タンパク質に含まれる複数種の評価用ペプチドの評価値の平均値が０．８０以上である場合が挙げられる。
　さらに、前工程により得られた前処理効率の評価値を用いて、定量対象タンパク質の定量値を算出することもできる。また、評価値が０．８０より低い場合には、前処理に問題があり、測定値を採用せず、再測定又は測定方法の変更等を検討することができる。
　本発明はまたタンパク質定量用キットに関し、本発明のキットには、以下の（Ａ）～（Ｃ）が含まれる。
（Ａ）人工標準タンパク質
（Ｂ）タンパク質消化酵素
（Ｃ）前記人工標準タンパク質の前記タンパク質消化酵素による消化物であるペプチドと同一の配列であって、安定同位体標識されたペプチド
　キットに含まれる人工標準タンパク質、タンパク質消化酵素、及び、人工標準タンパク質の前記タンパク質消化酵素による消化物であるペプチドと同一の配列であって、安定同位体標識されたペプチドは、前記に詳述したものと同様であり、本発明のキットには上記（Ａ）～（Ｃ）以外にも必要と目的に応じて、緩衝液、ｐＨ調整剤、反応容器等が含まれていてもよい。
　以下、実施例により本発明をより具体的に説明するが、本発明の技術的範囲はこれらの例示に限定されるものではない。
（評価用ペプチドを含む人工標準タンパク質の調製及び、評価用ペプチドの感度の確認）　
評価用ペプチドとして、ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ（配列番号１）、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号２）、ＤＡＰＧＳＧＬＫ（配列番号３）、ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号４）を選択し、これら４種類のペプチドをそれぞれ２箇所ずつ含む人工標準タンパク質（配列番号５）を調製した（図３参照）。人工標準タンパク質の調製は次の方法によった。
１．ＩＰＴＧ誘導
　人工標準タンパク質ｃＤＮＡを挿入したｐＥＴ－ｖｅｃｔｏｒをトランスフォーメーションした大腸菌 (ＢＬ２１－CodonPlus (DE3)－ＲＩＰＬ)を、カナマイシン及びクロラムフェニコールをそれぞれ３０ｍｇ／Ｌ、５０ｍｇ／Ｌで添加したＬＢ培地において一晩振盪培養した後、ＬＢ培地に希釈し、ＯＤ６００が０．４付近の値を示すまで培養を行い、最終濃度１００ｍＭでＩＰＴＧを添加し、さらに３時間のインキュベートを行うことで、タンパク質の発現誘導を行った。誘導を行った大腸菌は、８ＭＵｒｅａの存在下で超音波破砕を行い、可溶性画分と不溶性画分を調製した後、ＳＤＳ－ＰＡＧＥによって分画し、ＣＢＢ　Ｒ－２５０による検出を行った。
２．人工標準タンパク質の精製
　コバルトレジンを充填したスピンカラムに、大腸菌可溶性画分を添加し、１０ｍＭ Ｉｍｉｄａｚｏｌｅ溶液でカラムを洗浄後、５０ｍＭ，１５０ｍＭ, ５００ｍＭのＩｍｉｄａｚｏｌｅ溶液で人工標準タンパク質の溶出を行った。
（評価用ペプチドの感度の確認）
　人工標準タンパク質に挿入した４種類の評価用ペプチドの全てについて、１０ｆｍｏｌでピークが検出されることを確認した。確認は以下の方法によった。
　４種類の評価用ペプチド｛ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ（配列番号１）、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号２）、ＤＡＰＧＳＧＬＫ（配列番号３）、ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号４）｝を混合し、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳのＭＲＭモードにより、以下の条件で定量を行った。
カラム: Ａｇｉｌｅｎｔ ３００ＳＢ－Ｃ１８ ０．５ｍｍ ＩＤ×１５０ｍｍ，５μｍ　ｐａｒｔｉｃｌｅｓ
ＨＰＬＣ: Ａｇｉｌｅｎｔ１１００　ｓｙｓｔｅｍ
質量分析機: ＡＰＩ５０００
グラジエント条件: １－４５％ アセトニトリル／０．１％ ギ酸, ５０μＬ／ｍｉｎ，５０ｍｉｎ
　結果を図４－１～図４－４に示す。図４－１～図４－４のとおり、４種類の評価用ペプチド｛ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ（配列番号１）、ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号２）、ＤＡＰＧＳＧＬＫ（配列番号３）、ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号４）｝について、顕著なピークが確認され、１０ｆｍｏｌでも検出可能なことが示された。
（評価用ペプチドを用いた前処理効率の評価１）
　実施例１の人工標準タンパク質を用いて、タンパク質定量における前処理効率の評価をおこなった。評価用試料の調製及び評価は次の方法でおこなった。なお、評価用試料の操作は、実験操作に習熟しない者がおこなった。
１．ペプチド試料の調製
　マウスから単離した腎臓形質膜サンプル５０μｇに人工標準タンパク質を１００００ｆｍｏｌ、比較例として大腸菌由来Triose Phosphate Isomerase（ＴＰＩ）２２００ｆｍｏｌを添加した。その後、７Ｍ塩酸グアニジン溶液（０．１Ｍ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１０ｍＭ　ＥＤＴＡ　ｐＨ８．５に溶解）で変性させ、システイン残基のＳＨ基を保護するために、ＤＴＴによる還元処理とヨードアセトアミドによるカルバミドメチル化処理を行なった。続いて、メタノールクロロホルム沈殿法により、脱塩濃縮し、１．２Ｍ　Ｕｒｅａ／１０ｍＭ　Ｔｒｉｓ－ＨＣｌに再懸濁した。その後、タンパク質重量の１／１００量のトリプシンを加え、３７度で１６時間酵素消化してペプチド試料を得た。
２．ペプチド試料の定量分析
　上記ペプチド試料に、５００ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを加えてＬＣ－ＭＳ／ＭＳで測定した。測定後、定量対象ペプチドピークと１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドとのＭＳスペクトル面積比を算出し、検量線を用いて定量値を算出した。
３．検量線の作成
　選定した定量対象ペプチドを用いて、検量線を作成した。具体的には、１０ｆｍｏｌ、５０ｆｍｏｌ、１００ｆｍｏｌ、５００ｆｍｏｌ、１０００ｆｍｏｌの非標識ペプチドにそれぞれ５００ｆｍｏｌの１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチドを添加した後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳにより測定し、ＭＳスペクトル面積比（非標識ペプチド／１３Ｃ６，１５Ｎ標識ペプチド）を算出し、検量線を作成した。
　結果を図５に示す。図５より、評価用ペプチドの評価値は５０～７１％であり、評価値にばらつきがあり、また、いずれも低い値を示しているため、本実験のタンパク質の前処理が適当に行われなかったと判断された。一方、比較例のＴＰＩは評価値が８４％であり、ＴＰＩのみでは前処理の妥当性が正しく判断できないことがわかる。
（評価用ペプチドを用いた前処理効率の評価２）
　実施例２と同様の方法で前処理効率の評価をおこなった。但し、評価用試料の操作は、実験操作に熟練した者がおこなった。また、人工標準タンパク質の添加量を２５０ｆｍｏｌ、大腸菌由来Triose Phosphate Isomerase（ＴＰＩ）の添加量を７００ｆｍｏｌとした。
　結果を図６に示す。図６より、評価用ペプチドの評価値は９０～９７％であり、評価値にばらつきが少なく、いずれも高い評価値を示している。また、前処理のコントロールとしてのＴＰＩは回収率が９９％であり、評価用ペプチドが高い評価値を示した本実験のタンパク質の前処理は適当に行われたと判断された。評価値が高い値を示した図６では、評価値の低い図５よりＴＰＩ回収率が高く（図６：９９％、図５：８４％）、評価値と回収率に相関関係が認められることから、評価用ペプチドを用いた前処理評価の有効性が示された。
［参考例１］より好ましい評価ペプチドの選定
　ペプチド８３種類（各５００ｆｍｏｌ）を、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ（ＡＢＩ　４０００ＱＴＲＡＰ）のＭＲＭ　ｍｏｄｅによって解析し、ピーク面積値の平均値をペプチド長に対してプロットした。その結果、図７に示すとおりプロリン（Ｐ）の残基が多いほど平均ピーク面積値が大きくなる。また、ヒスチジン（Ｈ）が存在すると平均ピーク面積値が低くなる。また、図８に示すとおり、グリシンの残基が多いほど平均ピーク面積値が大きくなる。
　上記の結果からアミノ酸残基数が８、１０又は１２であって、プロリン又はグリシンを有し、かつ、ヒスチジンを有しない評価用ペプチドは、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳで好適に検出できることがわかった。

Claims (14)

  1. 天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致せず、質量分析によって検出が可能であるアミノ酸配列からなり、かつタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を含むペプチドを選択し、当該ペプチドを、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチドとして使用する方法。
  2. 天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致しないアミノ酸配列が、既知のタンパク質と一致しないアミノ酸配列であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
  3. アミノ酸残基数が３～２０のペプチドであって、Ｃ末端にタンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を有し、Ｃ末端以外には当該タンパク質消化酵素によって認識されるアミノ酸を有さず、天然に存在するタンパク質及びその変異体と一致しないアミノ酸配列からなる、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチド。
  4. 安定同位体標識可能なアミノ酸を有することを特徴とする、請求項３に記載の評価用ペプチド。
  5. アミノ酸残基数が８、１０又は１２であって、プロリン又はグリシンを含み、かつ、ヒスチジンを含まないことを特徴とする、請求項３又は４に記載の評価用ペプチド。
  6. １又は２のプロリンを含むことを特徴とする、請求項５に記載の評価用ペプチド。
  7. 下記（１）～（４）に示すアミノ酸配列のいずれかによって構成されることを特徴とする、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための評価用ペプチド。
    （１）ＶＧＡＰＧＶＰＡＬＫ（配列番号１）
    （２）ＱＩＧＤＰＴＶＰＳＧＶＫ（配列番号２）
    （３）ＤＡＰＧＳＧＬＫ（配列番号３）
    （４）ＮＶＡＰＡＧＰＴＬＫ（配列番号４）
  8. 請求項３～７のいずれかに記載の評価用ペプチドを、質量分析装置を用いたタンパク質定量のために使用する方法。
  9. 請求項３～７のいずれかに記載の評価用ペプチドのアミノ酸配列を２種類以上、かつ、１種類の配列について２箇所以上含むことを特徴とする、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための人工標準タンパク質。
  10. １分子中にシステインを２以上有することを特徴とする、請求項９に記載の人工標準タンパク質。
  11. 請求項９又は１０に記載の人工標準タンパク質を、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための人工標準タンパク質として使用する方法。
  12. 請求項９又は１０に記載の人工標準タンパク質を、質量分析装置を用いたタンパク質定量のための人工標準タンパク質として使用する、タンパク質の定量方法。
  13. 以下の（ａ）～（ｃ）の工程を順次備えたことを特徴とする、タンパク質の定量方法。
    （ａ）定量対象タンパク質を含む試料中に、質量既知の人工標準タンパク質を添加し、さらにタンパク質消化酵素を添加して、定量対象タンパク質及び人工標準タンパク質を消化する工程；
    （ｂ）（ａ）工程により得られた試料中に、定量対象タンパク質及び人工標準タンパク質の消化物であるペプチドと同一配列であって、安定同位体標識されたペプチドを添加し、液体クロマトグラフ－タンデム質量分析（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）測定を行う工程；
    （ｃ）（ａ）工程において添加した人工標準タンパク質の質量と、（ｂ）工程の測定により得られた、人工標準タンパク質の消化物であるペプチドの質量との比率を算出することで、タンパク質消化酵素による処理効率を評価する工程；
  14. 以下の（Ａ）～（Ｃ）を含むことを特徴とする、質量分析装置を用いたタンパク質定量用標準物質キット。
    （Ａ）請求項９又は１０に記載の人工標準タンパク質；
    （Ｂ）タンパク質消化酵素；
    （Ｃ）前記人工標準タンパク質の前記タンパク質消化酵素による消化物であるペプチドと同一の配列であって、安定同位体標識されたペプチド；
     
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2735871A1 (en) * 2011-07-22 2014-05-28 Tohoku University Method for fabricating stable-isotope-labeled target peptide fragment in mass spectrometry
WO2022181273A1 (ja) * 2021-02-25 2022-09-01 株式会社 島津製作所 ペプチド測定における品質管理用標準溶液、及びペプチド測定の品質管理

Families Citing this family (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE112011102286B4 (de) * 2010-07-07 2018-11-15 Thermo Fisher Scientific Gmbh Massenspektrometrische Quantifizierung von Analyten unter Verwendung eines Universalreporters
WO2012111249A1 (ja) * 2011-02-14 2012-08-23 学校法人麻布獣医学園 質量分析法における質量変化を検出する方法及び安定同位体標識タンパク質の絶対量の定量方法
CA2828147A1 (en) * 2011-03-08 2012-09-13 Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd. Analysis method
US8916680B2 (en) 2011-11-23 2014-12-23 Quest Diagnostics Investments, Inc. Kisspeptin-54 detection by tandem mass spectrometry
JP5999699B2 (ja) * 2012-11-16 2016-09-28 国立研究開発法人理化学研究所 タンパク質定量方法
JP5845236B2 (ja) * 2012-11-29 2016-01-20 株式会社ニッピ コラーゲンの分析方法、および安定同位体標識コラーゲンの製造方法
WO2018160586A1 (en) * 2017-02-28 2018-09-07 Pierce Biotechnology Inc. Detection and quantification of ras-raf-mapk pathway proteins
CN113588833B (zh) * 2021-08-04 2023-04-28 谱天（天津）生物科技有限公司 一种用于监测蛋白质组样品制备中蛋白酶解效率及误切率的参考品及其应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004028993A (ja) 2002-03-14 2004-01-29 Warner Lambert Co Llc 水素／重水素交換を用いる代謝物のキャラクタリゼーション・システムおよび方法
JP2004077276A (ja) 2002-08-19 2004-03-11 Shimadzu Corp Ｌｃ−ｍｓ分析方法及びその移動相
JP2004533610A (ja) 2001-05-08 2004-11-04 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド タンパク質サンプルを分析するためのプロセス
WO2007055116A1 (ja) 2005-11-08 2007-05-18 Tohoku University 質量分析計を使った膜タンパク質の定量方法
JP2008251212A (ja) 2007-03-29 2008-10-16 Sanyo Electric Co Ltd 非水電解質二次電池

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU8356201A (en) * 2000-08-11 2002-02-25 Agilix Corp Ultra-sensitive detection systems
EP1911461B1 (en) * 2000-10-19 2011-12-07 Epimmune Inc. HLA class I and II binding peptides and their uses
US20050064422A1 (en) 2001-11-29 2005-03-24 Barnidge David R Polypeptide quantitation
WO2005050188A1 (ja) 2003-11-21 2005-06-02 Eisai Co., Ltd. 同位体標識化内部標準物質を用いる定量方法、該定量方法を実行する解析システムおよび該解析のためのプログラム
WO2005116660A2 (en) 2004-05-25 2005-12-08 The Government Of The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Methods for making and using mass tag standards for quantitative proteomics
US20060211077A1 (en) * 2005-03-17 2006-09-21 Abel Kenneth J Methods and compositions to diagnose disease using concatenated oligopeptide standard
JP4913587B2 (ja) 2006-12-28 2012-04-11 雪印メグミルク株式会社 ペプチドおよびタンパク質定量法
GB0708529D0 (en) 2007-05-02 2007-06-13 King S College London Peptide standards

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004533610A (ja) 2001-05-08 2004-11-04 パーセプティブ バイオシステムズ，インコーポレーテッド タンパク質サンプルを分析するためのプロセス
JP2004028993A (ja) 2002-03-14 2004-01-29 Warner Lambert Co Llc 水素／重水素交換を用いる代謝物のキャラクタリゼーション・システムおよび方法
JP2004077276A (ja) 2002-08-19 2004-03-11 Shimadzu Corp Ｌｃ−ｍｓ分析方法及びその移動相
WO2007055116A1 (ja) 2005-11-08 2007-05-18 Tohoku University 質量分析計を使った膜タンパク質の定量方法
JP2008251212A (ja) 2007-03-29 2008-10-16 Sanyo Electric Co Ltd 非水電解質二次電池

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AMBLARD M, FEHRENTZ J.A., MARTINEZ J., SUBRA G., METHODS MOL. BIOL., vol. 298, 2005, pages 3 - 24
DUPIUS K. ET AL., PROTEOMICS, vol. 8, 2008, pages 4633 - 4636
KEIJI KITO ET AL.: "A Synthetic Protein Approach toward Accurate Mass Spectrometric Quantification of Component Stoichiometry of Multiprotein Complexes", JOURNAL OF PROTEOME RESEARCH, vol. 6, 2007, pages 792 - 800, XP055164073, DOI: doi:10.1021/pr060447s *
KITO ET AL.: "Peptide Renketsugata Hyojun Busshitsu to Shitsuryo Bunseki (PCS-MS-ho) o Mochiita Tanpakushitsu no Zettai Teiryo Bunseki", JOURNAL OF JAPANESE BIOCHEMICAL SOCIETY, 2008, pages 4T25-2 *
KITO K. ET AL., J. PROTEOME RES., vol. 6, 2007, pages 792 - 800
ROBERT J BEYNON ET AL.: "Multiplexed absolute quantification in proteomics using artificial QCAT proteins of concatenated signature peptides", NATURE METHODS, vol. 2, 2005, pages 587 - 589, XP008051422 *
SAKAI ET AL.: "LC-MS/MS o Mochiita Zettai Teiryoho no Hyokayo Recombinant Reference Tanpakushitsu no Hatsugen to Seisei", 128TH ANNUAL MEETING OF THE PHARMACEUTICAL SOCIETY OF JAPAN YOKOHAMA 2008 YOSHISHU 4, 5 March 2008 (2008-03-05), pages 141, XP008173061 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP2735871A1 (en) * 2011-07-22 2014-05-28 Tohoku University Method for fabricating stable-isotope-labeled target peptide fragment in mass spectrometry
EP2735871A4 (en) * 2011-07-22 2015-03-11 Univ Tohoku METHOD OF MANUFACTURING A TARGETED PEPTIDE FRAGMENT MARKED WITH MASS SPECTROMETRY STABLE ISOTOPES
US9163276B2 (en) 2011-07-22 2015-10-20 Tohoku University Method for fabricating stable-isotope-labeled target peptide fragment in mass spectrometry
WO2022181273A1 (ja) * 2021-02-25 2022-09-01 株式会社 島津製作所 ペプチド測定における品質管理用標準溶液、及びペプチド測定の品質管理

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