JP6186017B2 - ペプチドの濃度を決定する方法 - Google Patents
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Description
a)第1のタグを提供することと
b)第1のタグに、ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドをカップリングすること
または
a)第1のタグを提供することと
b)ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドを形成するアミノ酸を、第1のタグにカップリングすることと
を含み、第1のペプチドのアミノ酸配列のC末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合、好ましくは、アミド結合の配列特異的加水分解によって作製したC末端に対応する、内部ペプチド標準を調製する方法によって解決される。
a)複数の種の内部ペプチド標準を個々に調製し、それによって、内部ペプチド標準の各種が第1の態様の実施形態のいずれかに従って調製されることと、
b)内部ペプチド標準の個々に調製された種を所望により混合することと
を含み、
内部ペプチド標準の種が、第1および/または第2のタグおよび/または第1のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる、複数の種の内部ペプチド標準からなる内部ペプチド標準のライブラリーを調製する方法によって解決される。
a)好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
b)第3の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準の、または第4の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルの一定量を加え、それによってスパイクされた(spiked)混合物を作製することと;
c)スパイクされた混合物を配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、内部ペプチド標準(単数または複数)から第1のタグおよび/または第2のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出し、それによって、複数のペプチドが種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドと内部標準から放出された第1のペプチドとを含むことと;
d)スパイクされた混合物中に含有される第1および/または第2のタグの量を決定することならびにそれから工程b)において添加された内部標準(単数または複数)の量を決定することと;
e)各々工程c)において作製された、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)工程d)において決定された内部標準(単数または複数)の比および量から種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法によって解決される。
a)好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
b)第3の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第4の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルを提供し、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第1のタグおよび/または第2のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出することと;
ca1)工程a)の種々のポリペプチドの混合物に、工程b)の実施において得られた反応混合物を添加することと、
ca2)工程ca1)の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと、
または
cb1)工程a)の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと;
cb2)工程cb1)の実施において得られた混合物に、工程b)の実施において得られた反応混合物を添加すること
のいずれかであって、工程ca2)およびcb2)後に、それぞれ、スパイクされた混合物が得られることと;
d)スパイクされた混合物中に含有される第1および/または第2のタグの量を決定することならびにそれから工程b)において添加された内部標準(単数または複数)の量を決定することと;
e)スパイクされた混合物において、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)工程d)において決定された内部標準(単数または複数)の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法によって解決される。
a)第3の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第4の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルを提供し、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第1のタグおよび/または第2のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出することと;
b)配列特異的加水分解のための手段を所望により除去することと;
c)工程b)のa)の実施から得られた混合物中に含有されている第1および/または第2のタグの量を決定することならびにそれから前記混合物中に含有された内部標準の量を決定することと;
d)好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
da1)工程d)の種々のポリペプチドの混合物に、工程a)またはb)の実施において得られた反応混合物の一部を添加することと;
da2)工程da1)の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドが、プロテオタイプのペプチドを含むこと;
または
db1)工程d)の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと;
db2)工程db1)の実施において得られた混合物に、工程a)またはb)の実施において得られた混合物の一部を添加すること
のいずれかによって、工程da2)およびdb2)後にそれぞれ、スパイクされた混合物が得られることと;
e)スパイクされた混合物中の、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)内部標準(単数または複数)の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法によって解決される。
a)工程da1)の前に、工程a)またはb)の実施において得られた反応混合物は分離工程付されて、前記反応混合物の成分から第1および第2のタグが分離されるか、または
b)工程db2)の前に、工程db1)の実施において得られた反応混合物は分離工程に付されて、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが前記反応混合物の成分から分離される。
より詳しくは、本発明者らは、驚くべきことに、標識された内部標準が、このような目的にとって適していることおよびこのような標識された内部標準は、種々のポリペプチドの混合物に添加される前に定量化される必要はないが、種々のポリペプチドの混合物に添加されたときにその量を決定することで十分であるということを見出した。しかしまた、標識されたまたは標識されていない内部標準が定量化され、その後、種々のポリペプチドの混合物中に添加されることも本発明の範囲内にある。
a)第1のタグを提供する工程と
b)ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドを、第1のタグとカップリングする工程と
を含み、それによって、第1のペプチドのアミノ酸配列のC末端は、アミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製したC末端に対応する。好ましくは、結合は、アミド結合であり、より詳しくは、ペプチドのアミド結合である。本発明の方法のこの実施形態では、第1のペプチドは、通常、全長ペプチドの形態の合成の生成物として提供される。ペプチドの合成のための方法は、当業者には公知であり、中でも、Pennington, 1994, Peptide Synthesis Protocols (Methods in Molecular Biology); Benoiton, 2005, Chemistry of Peptide Synthesisに記載されている。
a)第1のタグを提供する工程、および
b)第1のタグに、ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドを形成するアミノ酸をカップリングする工程
を含み、それによって、第1のペプチドのアミノ酸配列のC末端は、アミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の、好ましくは、ペプチドのアミド結合の配列特異的加水分解によって作製したC末端に対応する。この実施形態では、第1のペプチドを形成する個々のアミノ酸は、続いて、第1のタグに付着される。第1のペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸形成部分の基が、第1のタグに付着される、または第1のペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸形成部分の1つまたはいくつかが第1のタグに付着されると第1のタグに付着されることも本発明の範囲内にある。
あるいは、このような偏りは、1種または数種の同位体が枯渇しているようなものである場合がある。最後に、偏りは、同位体のある種または種の群が濃縮されているが、同位体の別の種または種の群が枯渇しているようなものである場合もある。本発明の方法に関連して使用される質量分析では、同位体およびその分布が重要な役割を果たすので、タグの合成のための非同位体識別法の使用は、好ましい。
一実施形態では、第1のペプチドからのタグの切断において使用される手段は、ペプチドのC末端が生成する配列特異的加水分解において使用されるものである。好ましい実施形態では、第1のタグまたはその第1の部分の除去は、配列特異的である。これは、このような実施形態では、配列特異的化学的切断のための手段、配列特異的酵素的切断のための手段または配列特異的物理的切断のための手段である前記手段、すなわち、化学的切断、酵素的切断および物理的切断のための手段の使用から起こることが好ましい。
a)複数の種の内部ペプチド標準を個々に調製し、それによって、内部ペプチド標準の各種が、本発明の内部ペプチド標準を調製する方法に従って調製される工程と;
b)個別に調製された内部ペプチド標準の種を所望により混合する工程と
を含み、内部ペプチド標準の種は、第1および/または第2のタグおよび/または第1のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる。
同じ考慮が、第1のタグ(単数または複数)および第2のタグ(単数または複数)が特定の標識を必要としないが、第1のタグ(単数または複数)および第2のタグ(単数または複数)が、その化学的および/または物理的特徴のために、標識によって別に付与される情報を提供する場合に当てはまる。このように構成する場合の一例および実施形態として、第1および/または第2のタグの配列(単数または複数)が、それぞれの第1のペプチドの配列のコードを表すような方法での、第1および/または第2のタグ(単数または複数)の配列(単数または複数)の作製のための規定されたアミノ酸残基のコンビナトリアルケミストリーにおける使用がある。言い換えれば、特定の第1および/または特定の第2のタグは、特定の第1のペプチドを示し、特定の第1および/または第2のタグの同定および/または定量化は、事実上、第1のペプチドの同定および/または定量化である。
したがって、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定するための本発明の方法において、第2の特定の第1のペプチドを示す第2の特定の第1および/または第2の特定の第2のタグがある場合には、第2の第1のペプチドが、標的ポリペプチド、好ましくは、第2の標的ポリペプチドのプロテオタイプのペプチドであるという条件で、種々のポリペプチドの混合物において前記の第1のペプチドと前記の第2の第1のペプチド間を識別し得る。
a)好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供する工程と;
b)本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを添加し、好ましくは、本発明の内部ペプチド標準の量または本発明の内部ペプチド標準のパネルの量が未知であり、それによって、スパイクされた混合物を作製する工程と;
c)スパイクされた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、内部ペプチド標準(単数または複数)から第1のタグおよび/または第2のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出し、複数のペプチドが、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドと内部標準から放出された第1のペプチドとを含む工程と;
d)スパイクされた混合物中に含有される第1および/または第2のタグの量を決定することならびにそれから工程b)において添加された内部標準(単数または複数)の量を決定する工程と;
e)各々、c)において作製された、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定する工程と;
f)工程d)において決定された内部標準(単数または複数)の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出する工程と
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法である。本発明の内部ペプチド標準の量または本発明の内部ペプチド標準のパネルの量に、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物が添加され、それによってスパイクされた混合物を作製することは、当業者には認められよう。
a)好ましくは、標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
b)本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを提供し、好ましくは、内部ペプチド標準および/または内部ペプチド標準のパネルの提供された量が未知であり、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第1のタグおよび/または第2のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出することと;
ca1)工程a)の種々のポリペプチドの混合物に、工程b)の実施において得られた反応混合物を添加することもしくは工程b)の実施において得られた反応混合物に、工程a)の種々のポリペプチドの混合物を添加することおよび
ca2)工程ca1)の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと;
または
cb1)工程a)の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと;および
cb2)工程cb1)の実施において得られた混合物に、工程b)の実施において得られた反応混合物を添加することもしくは工程b)の実施において得られた反応混合物に、工程cb1)の実施において得られた混合物を添加すること
のいずれかによって、工程ca2)およびcb2)の後に、それぞれ、スパイクされた混合物が得られることと;
d)スパイクされた混合物中に含有される第1および/または第2のタグの量を決定することならびにそれから工程b)において添加された内部標準(単数または複数)の量を決定することと;
e)スパイクされた混合物中の、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)工程d)において決定された内部標準(単数または複数)の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法である。
生体サンプル、より詳しくは、細胞または臓器の溶解物などの複雑な混合物では、配列特異的加水分解は、最終的に、何十万種のペプチドの生成をもたらし得る。それぞれ、工程ca2)、cb1)およびcb2)を実施した際に得られた反応混合物の複雑性を低減することによって、スパイクされた混合物中に含有される第1および/または第2のタグの量を決定する工程ならびにそれから添加された内部標準(単数または複数)の量を決定する工程、より好ましくは、工程e)の主題として、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定する工程が、より容易に実施され得、分析装置の性能は、あまり進歩していないものであってもよい。この実施形態に関連して、スパイクされた混合物はまた、工程ca2)およびcb2)の実施後に得られ、前記分画工程に付されている反応混合物も指す。
a)本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを提供し、本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルの量が未知であり、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第1のタグおよび/または第2のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出することと; b)配列特異的加水分解のための手段を、所望により除去することと;
c)工程b)のa)の実施から得られた混合物中に含有されている第1および/または第2のタグの量を決定することならびにそれから前記混合物中に含有された内部標準の量を決定することと;
d)好ましくは、標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
da1)工程d)の種々のポリペプチドの混合物に、工程a)もしくはb)の実施において得られた反応混合物の一部を添加することもしくは工程a)もしくはb)の実施において得られた反応混合物の一部に、工程d)の種々のポリペプチドの混合物を添加することおよび
da2)工程da1)の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドが、プロテオタイプのペプチドを含むこと;
または
db1)工程d)の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと;および
db2)工程db1)の実施において得られた混合物に、工程a)またはb)の実施において得られた混合物の一部を添加することもしくは工程a)もしくはb)の実施において得られた混合物の一部を添加することに、工程db1)の実施において得られた混合物を添加すること;
のいずれかによって、工程da2)およびdb2)後にそれぞれ、スパイクされた混合物が得られることと;
e)スパイクされた混合物中の、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)内部標準(単数または複数)の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法である。
キャッピング工程のために、第1のタグは、第1のペプチドのみと反応し、アセチル化された不純物とは反応しない。合成の最後に、第1のタグを保持しないアセチル化された不純物とともに、所望の内部ペプチド標準が作製される。切断反応の後に、第1のタグが、第1のペプチドのみから放出され得る。したがって、この場合には、放出される第1のタグの量は、放出される(release)第1のペプチドの量を示す。
P4’位では、アルギニン残基が使用される。修飾されたアミノ酸残基メタ−ニトロ−チロシンの構造が示されている。この残基のヒドロキシル基のプロトン化状態に応じて、芳香族環構造は、強い吸光度を有し、ヒドロキシルのプロトン化状態については350nmで最大であり、ヒドロキシル基の解離した形態については410nmで最大である。
デスチオ−ビオチン残基を、アミノ酸残基から離して配置し、デスチオ−ビオチンの、デスチオ−ビオチン結合支持体上の結合ポケットとの効果的な相互作用を可能にするために、リンカー分子、Ttdsが導入された。リンカーの化学的構造は、デスチオ−ビオチンの化学的構造と一緒に示されている。デスチオ−ビオチンは、タンパク質ストレプトアビジンまたはアビジンとのデスチオ−ビオチンの親和性が、ビオチンの親和性よりもかなり低いために、ビオチンの代わりに使用される。これによって、デスチオ−ビオチン修飾された化合物と効果的に競合する試薬としてビオチンを使用して、結合されたデスチオ−ビオチン含有内部ペプチド標準の支持体からの溶出が可能になる。
いる。P4’位では、グリシン残基が使用される。第2のタグでは、アルギニン残基がP1位を占めている。プロリン残基は、P2位で、プロテアーゼトリプシンによって好ましいものであるとわかっている。Cal=β−7−メトキシ−クマリル−アラニン残基は、切断媒介プロテアーゼとしてトリプシンの場合には、P3位において良好に受け入れられている。そのアラニン誘導体では、置換クマリル残基が、より強い蛍光シグナルを生じた。デスチオ−ビオチンは、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン/デスチオビオチン結合タンパク質を用いて修飾された支持体との選択的結合を可能にする、第2のタグ内の反応性部分として使用される。デスチオ−ビオチン残基を、アミノ酸残基から離して配置し、デスチオ−ビオチンの、デスチオ−ビオチン結合支持体上の結合ポケットとの効果的な相互作用を可能にするために、リンカー分子、Ttdsが導入された。リンカーの化学的構造は、デスチオ−ビオチンの化学的構造と一緒に図14に示されている。
デスチオ−ビオチンは、タンパク質ストレプトアビジンまたはアビジンとのデスチオ−ビオチンの親和性が、ビオチンの親和性よりもかなり低いために、ビオチンの代わりに使用される。これによって、デスチオ−ビオチン修飾された化合物と効果的に競合する試薬としてビオチンを使用して、結合されたデスチオ−ビオチン含有内部ペプチド標準の支持体からの溶出が可能になる。
この実施例の基本的実験主題が図5に示されている。
天然に存在するアミノ酸残基の一文字コードを使用して図7に表される内部ペプチド標準を、HPLCを使用して分析した。410nmでのUV−Visトレースが示されている。図6A)は、プロテアーゼトリプシンの添加前の反応溶液のUVトレースを示す。410nmで吸収するメタ−ニトロ−チロシンを含有する内部ペプチド標準は、PR−18カラムから約1.85分の保持時間で溶出する。図6B)は、プロテアーゼトリプシンの添加および32℃で1時間の反応混合物のインキュベーション後の反応溶液のUVトレースを示す。410nmで吸収するメタ−ニトロ−チロシンを含有する放出された第1のタグは、PR−18カラムから約0.8分の保持時間で溶出する。放出された第1のペプチドは、その波長では目に見えない。約1.85分の保持時間で目に見える残存するシグナルはほとんどないので、切断反応は、100%に近い切断率を有し、極めて有効であると思われる。
アセチル化された第1のタグSer−Ala−mニトロTyr−Argの300〜500nmの範囲のUV−Visスペクトルが、図8に示されている。トリフルオロ酢酸を含有する種々のアセトニトリル/水混合物中のタグの溶液のスペクトルを記録した。トリフルオロ酢酸によって引き起こされる、これらの混合物のpH値は、pH2の範囲にある。
さらに、15mM TRISバッファーpH8.2中に溶解した、アセチル化されたタグSer−Ala−mニトロTyr−ArgのUV−Visスペクトルを記録した。測定された範囲における吸光度の最大は、pH8.2については約420nmであるが、pH2.0については約355nmである。その相違の原因は、メタ−ニトロ−チロシン残基の側鎖のプロトン化状態である。種々のプロトン化状態の種々の構造が示されている。左側に、プロトン化されたメタ−ニトロ−チロシン残基の構造が示されている。これは、pH2.0で主要な部分である。右側に、解離されたメタ−ニトロ−チロシン残基の構造が示されている。これは、pH8.2で主要な部分であり、ニトロ官能基に近接しているフェノール基の酸性特徴の増大によって引き起こされる。
この定量化の結果が図9に示されている。
より複雑なペプチド標準は、図10に示されるようなペプチド合成を使用して製造され得る。段階的合成によるまたは予備合成されたタグの固相支持体への直接的な付着のいずれかによる固相支持体上での第1のタグの作製後に、第1のペプチドとそれに続く第2のタグが、段階的に合成される。あるいは、第1のペプチドが、第1のタグに付着され、次いで、第2のタグが、結合している第1のペプチド−第1のタグ構造に付着される。さらに、段階的合成および予備合成された構造の付着の組合せがあり得る。
図13に示されるように、第1のタグおよび第2のタグの両方を含む内部ペプチド標準が、支持体に固定されている。第2および第1のタグの両方が、蛍光アミノ酸残基を用いて標識されている。精製されていない内部ペプチド標準の固定化後に、支持体が洗浄されて、特異的に結合しなかったか、または共有結合を形成しなかった、ペプチド合成のアセチル化された副生成物を除去する。その後、精製された内部ペプチド標準は、支持体上で直接的に切断され得る(図13の左側)か、支持体からの放出後に切断され得る(支持体なし切断、図13の右側)。支持体あり切断後に、第2のタグは、支持体上のままとなり、第1のペプチドが、第1のタグと一緒に、支持体から放出される。第1のペプチドおよび第1のタグの放出された混合物は、蛍光検出器を備えたHPLCによって分析され得る。このシステムが蛍光参照第1のタグを用いて較正される場合に、放出された第1のタグの蛍光強度(蛍光単位、FUで測定される)が第1のタグの定量化のために、したがって、第1のペプチドの定量化のために使用され得る。
第1のタグ(Ac−Ser−Ala−ニトロTyr−Arg、図7参照のこと)のアセチル化形態を合成し、アミノ酸分析によって絶対定量化した。規定量の定量化された、アセチル化第1のタグを、HPLCカラム上にロードし、350nmまたは410nmのいずれかで検出されたピークの得られた面積−吸収単位、AUを、アセチル化された第1のタグの総量に対してプロットした。2シリーズの実験の線形回帰分析を実施し、それぞれ0.9994および0.9986の相関関係が得られた。結果は、図18に示されている。
C末端定量化タグ−SA−ニトロTyr−G−OH(ペプチドA〜E、表1)を保持する5種の種々のペプチドを、Fmocをベースとする固相ペプチド合成によって合成し、HPLCによって精製した。図19は、外部標準Ac−SA−ニトロTyr−R−OHと比較した、HPLCによる5種のペプチドの定量化のための直線の検量線を示す。定量化は、350nmで実施した。
C末端定量化タグ−SA−ニトロTyr−G−OHを保持する23種のペプチドを、Fmocベースの固相ペプチド合成によって合成し、HPLCによって精製した。各ペプチドを、以下のトリプシン切断プロトコールに付した:
N末端定量化タグAc−ニトロTyr−SGK−を保持する38種のペプチドを、SPOT合成によって合成した(表3)。ペプチド配列は、各場合において、リシンにN末端が付着された19個の種々のアミノ酸を含有する2種の異なるアミノ酸配列をベースとする(システインを除く、20種の天然に生じるアミノ酸)。
Claims (21)
- ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドをカップリングした第1のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第1のペプチドのアミノ酸配列のC末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたC末端に対応し、該第1のタグが標識を含み、化学的切断、酵素的切断および物理的切断を含む群から選択される手段によって除去可能であり、該標識がメタ−ニトロ−チロシンである、内部ペプチド標準。
- 第1のタグの除去が配列特異的である、請求項1に記載の内部ペプチド標準。
- 第1のペプチドが質量標識を含む、請求項1から2のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準。
- 質量標識がC同位体およびN同位体を含む群から選択される、請求項3に記載の内部ペプチド標準。
- 第2のタグを含む、請求項1から4のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準。
- 第2のタグが、アンカー部分を含む、請求項5に記載の内部ペプチド標準。
- アンカー部分が、ビオチン、デスチオビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンを含む群から選択されるか、または表面での、適当な反応性官能基との化学選択的反応を可能にする化学基である、請求項6に記載の内部ペプチド標準。
- アンカー部分と第1のペプチドの間をリンカーが連結する、請求項6または7に記載の内部ペプチド標準。
- 第1のタグが、第1のペプチドのC末端とカップリングされる、請求項1から8のいずれかに記載の内部ペプチド標準。
- 第2のタグが、第1のペプチドのN末端とカップリングされる、請求項1から9のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準。
- 請求項1から10のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準の複数の異なる種を含む組成物であって、該複数の異なる種の内部ペプチド標準が、第1のタグならびに/または第1のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる、組成物。
- 種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の標的ポリペプチドの存在および/または量、および/または精製ポリペプチドの量を決定する方法における、請求項1から10のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準の使用。
- 種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、
a)種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
b)(i)ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドをカップリングした第1のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第1のペプチドのアミノ酸配列のC末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたC末端に対応する、内部ペプチド標準、または(ii)該内部ペプチド標準の複数の異なる種であって、第1のタグおよび/または第1のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる該内部ペプチド標準の異なる種の一定量を加え、それによってスパイクされた混合物を作製することと;
c)スパイクされた混合物を配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、内部ペプチド標準(単数または複数)から第1のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出し、それによって、複数のペプチドが種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドと内部標準から放出された第1のペプチドとを含むことと;
d)スパイクされた混合物中に含有される第1のタグの量を決定することならびにそれから工程b)において添加された内部標準(単数または複数)の量を決定することと;
e)各々工程c)において作製された、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)工程d)において決定された内部標準(単数または複数)の比および量から種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含み、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドいずれかが質量標識を含む、方法。 - 種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、
a)種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
b)(i)ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドをカップリングした第1のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第1のペプチドのアミノ酸配列のC末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたC末端に対応する、内部ペプチド標準、または(ii)該内部ペプチド標準の複数の異なる種であって、第1のタグおよび/または第1のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる該内部ペプチド標準の異なる種を提供し、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種から第1のタグを切断除去し、このようにして、第1のペプチドを放出することと;
ca1)工程a)の種々のポリペプチドの混合物に、工程b)において得られた反応混合物を添加することと;
ca2)工程ca1)において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと、
または
cb1)工程a)の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと;
cb2)工程cb1)において得られた混合物に、工程b)において得られた反応混合物を添加すること
のいずれかによって、工程ca2)およびcb2)後に、それぞれ、スパイクされた混合物が得られることと;
d)スパイクされた混合物中に含有される第1のタグの量を決定することならびにそれから工程ca1)またはcb2)において添加された内部標準(単数または複数)の量を決定することと;
e)スパイクされた混合物中の、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)工程d)において決定された内部標準(単数または複数)の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含み、
種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む、方法。 - 工程a)において、ポリペプチドが標的ポリペプチドを含有する、請求項13または14に記載の方法。
- 種々のポリペプチドの少なくとも1種の混合物中の、第1のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および/または量を決定する方法であって、
a)(i)ある1つのアミノ酸配列を含む第1のペプチドをカップリングした第1のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第1のペプチドのアミノ酸配列のC末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたC末端に対応する、内部ペプチド標準、または(ii)該内部ペプチド標準の複数の異なる種であって、第1のタグおよび/または第1のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる該内部ペプチド標準の異なる種を提供し、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種から第1のタグを切断除去し、このようにして第1のペプチドを放出することと;
b)場合によっては、配列特異的加水分解のための手段を除去することと;
c)工程a)またはb)から得られた混合物中に含有されている第1のタグの量を決定することならびにそれから前記混合物中に含有された内部標準の量を決定することと;
d)種々のポリペプチドの混合物を提供することと;
da1)工程d)の種々のポリペプチドの混合物に、工程a)またはb)において得られた反応混合物の一部を添加することと;
da2)工程da1)において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと;
または
db1)工程d)の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと;
db2)工程db1)において得られた混合物に、工程a)またはb)において得られた混合物の一部を添加すること
のいずれかによって、工程da2)およびdb2)後にそれぞれ、スパイクされた混合物が得られることと;
e)スパイクされた混合物中の、第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと;
f)内部標準(単数または複数)の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含み、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準(単数または複数)の第1のペプチドのいずれかが質量標識を含む、方法。 - 工程d)において、ポリペプチドが標的ポリペプチドを含有する、請求項16に記載の方法。
- 質量標識が、C同位体およびN同位体を含む群から選択される、請求項13から17のいずれか一項に記載の方法。
- 内部ペプチド標準から放出された第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比が、質量分析によって決定される、請求項13から18のいずれか一項に記載の方法。
- 内部ペプチド標準から放出された第1のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比が、多段質量分析によって決定される、請求項19に記載の方法。
- 配列特異的加水分解のための手段が、タンパク質分解性酵素、配列特異的化学反応または配列特異的物理的処理から選択される、請求項13から20のいずれか一項に記載の方法。
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