JP5926693B2 - ペプチドの濃度を決定する方法 - Google Patents

Description

本発明は、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法、内部ペプチド標準を調製する方法、複数の種の内部ペプチド標準からなる内部ペプチド標準のライブラリーを調製する方法、内部ペプチド標準を調製する方法によって得ることができる内部ペプチド標準および内部ペプチド標準を調製する方法によって得ることができる内部標準のパネルに関する。

当技術分野では、細胞溶解物から得たタンパク質および修飾されたタンパク質を定量化するための新規方法を提供することが必要である。さらに、２つの異なる状態にある細胞間のタンパク質発現レベルを正確に比較するための、特に、低含量のタンパク質を比較するための新規方法を提供することが必要である。

タンパク質検出、より詳しくは、タンパク質定量化のための現行標準は、免疫反応性検出（ウェスタン分析）に基づいている。しかし、この技術には、適切に特異的な抗体を入手できることが必要である。さらに、多数の抗体は、フォールディングされていない（変性した）形態でタンパク質を認識するだけであり、交差反応性がひどく制限的であり得、定量化は、一般に、相対的なものである。

ミクロキャピラリー液体クロマトグラフィー（ＬＣ）およびデータベース検索と併せた、自動化された、データ依存性エレクトロスプレーイオン化（ＥＳＩ）タンデム質量分析法（ＭＳ／ＭＳ）のための方法および機器使用の開発は、ゲルで分離されたタンパク質の同定の感度および速度を大幅に増大した。ミクロキャピラリーＬＣ−ＭＳ／ＭＳは、個々のタンパク質を、ゲル電気泳動的分離を行わず、混合物から直接的に大規模同定するために成功裏に使用されている（Link et al., 1999; Opitek et al., 1997）。しかし、これらのアプローチはタンパク質同定を著しく加速するが、分析されたタンパク質の量は、容易には決定され得ず、これらの方法は、２ＤＥ／ＭＳ／ＭＳアプローチもが直面するダイナミックレンジの問題を実質的に軽減しないことがわかっている。したがって、複雑なサンプル中の低含量のタンパク質はまた、事前濃縮を行わずにミクロキャピラリーＬＣ／ＭＳ／ＭＳ方法によって分析することが困難である。

別の方法論が、最近記載された。ＩＣＡＴ試薬技術は、同位体コードアフィニティータグ（ＩＣＡＴ）と呼ばれる化学試薬のクラスを利用する。これらの試薬は、それぞれ、８個の重水素または水素原子を除いて化学的に同一である同位体的に重い形態および軽い形態で存在する。２種の細胞溶解物から得たタンパク質は、システイニル残基で、一方またはもう一方のＩＣＡＴ試薬を用いて独立に標識され得る。溶解物を混合およびタンパク質分解した後、ＩＣＡＴ標識されたペプチドが、各ＩＣＡＴ試薬中に組み込まれたビオチン分子との親和性によって単離される。ＩＣＡＴ標識されたペプチドをＬＣ−ＭＳ／ＭＳによって分析し、それらは重いおよび軽いペプチド対として溶出する。定量化は、サンプル中の各ＩＣＡＴ標識されたペプチド対の量に関する相対発現比を求めることによって実施される。

ＩＣＡＴ標識されたペプチド各々の同定は、第２段階の質量分析（ＭＳ／ＭＳ）および配列データベース検索によって実施される。最終結果は、大規模での相対タンパク質発現比である。この技術の主要な欠点は、１）定量化が、相対的にしかすぎないこと；２）専門的な化学が必要であること、および３）データベース検索が、大きなＩＣＡＴ試薬分子の存在によって妨げられること、および４）翻訳後修飾された（例えば、リン酸化された）タンパク質の相対量が、分析に対して見えないことである。

国際特許出願ＷＯ０３／０１６８６１には、内部ペプチド標準が使用される、細胞溶解物から直接的にタンパク質を絶対定量化する方法が開示されている。この方法は、既知量の内部標準ペプチドの添加を必要とする。

本発明の根底にある問題は、種々のポリペプチドの混合物において、標的ポリペプチドの存在を決定する方法を提供することである。本発明の根底にある問題は、種々のポリペプチドの混合物において、標的ポリペプチドの量を決定する方法を提供することである。

本発明の根底にあるさらなる問題は、種々のポリペプチドの混合物において標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法において使用するのに特に適している内部ペプチド標準を作製する方法を提供することである。

さらに、本発明の根底にある問題は、種々のポリペプチドの混合物において標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法において使用するのに特に適している、内部ペプチド標準および内部標準ペプチドのパネルをそれぞれ提供することである。

本発明の根底にあるこれらおよびその他の問題は、添付の独立クレームの主題によって解決される。好ましい実施形態は、添付の従属クレームおよび以下の説明から理解され得る。

第１の態様の第１の実施形態でもある第１の態様では、本発明の根底にある問題は、
ａ）第１のタグを提供することと
ｂ）第１のタグに、ある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドをカップリングすること
または
ａ）第１のタグを提供することと
ｂ）ある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドを形成するアミノ酸を、第１のタグにカップリングすることと
を含み、第１のペプチドのアミノ酸配列のＣ末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合、好ましくは、アミド結合の配列特異的加水分解によって作製したＣ末端に対応する、内部ペプチド標準を調製する方法によって解決される。

第１の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２の実施形態では、配列特異的加水分解は、タンパク質分解性酵素の反応、配列特異的化学反応または配列特異的物理的処理を含む群から選択される反応によって起こる。

第１の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３の実施形態では、タンパク質分解性酵素は、ヒドロラーゼ、ペプチダーゼ、プロテアーゼ、トリプシン、トロンビン、Ｖ８プロテアーゼ、プロリルエンドペプチダーゼ、スブチリシンおよびキモトリプシンおよびエスラスターゼ（eslastase）を含む群から選択される。

第１の態様の第２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４の実施形態では、配列特異的化学反応が、Ｃ末端ホモセリンラクトンをもたらす臭化シアンのようなハロゲン化シアンを用いる処理およびＣ末端アスパラギン酸残基をもたらすアスパルチル−プロリル結合の選択的酸性加水分解を含む群から選択される。

第１の態様の第１から第４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５の実施形態では、Ｃ末端は、アルギニン、リシン、グルタミン酸およびプロリンを含む群から選択されるアミノ酸である。

第１の態様の第１から第５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６の実施形態では、内部ペプチド標準は、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の標的ポリペプチドの存在および／もしくは量ならびに／または精製されたポリペプチドの量を決定する方法において使用するためのものである。

第１の態様の第１から第６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７の実施形態では、第１のタグは、ペプチド、プロテアーゼ基質および脱離基を含む群から選択される。

第１の態様の第１から第７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８の実施形態では、第１のタグは、２〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは、２〜６個のアミノ酸残基、より好ましくは、２〜４個のアミノ酸残基、最も好ましくは、３個のアミノ酸残基からなるペプチドである。

第１の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第９の実施形態では、第１のタグは、少なくとも１個の生体アミノ酸残基を含む。

第１の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１０の実施形態では、第１のタグは、少なくとも１個の非生体アミノ酸残基を含む。

第１の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１１の実施形態では、第１のタグは、少なくとも１個のＤ−アミノ酸残基を含む。

第１の態様の第８から第１１実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１２の実施形態では、第１のタグのアミノ酸残基の少なくとも１個が、α−アミノ酸残基、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基およびδ−アミノ酸残基を含む群から選択される。

第１の態様の第７から第１２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１３の実施形態では、第１のタグはペプチドであり、第１のタグを形成するペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１個は、ペプチドの合成の非同位体識別法において得られた同位体組成とは異なる同位体組成を含む。

第１の態様の第７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１４の実施形態では、第１のタグは、好ましくは、ペプチド、芳香族アミド、芳香族エステルまたはチオエステル、脂肪族アミド、エステルまたはチオエステルを含む群から選択されるプロテアーゼ基質の一部である。

第１の態様の第７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１５の実施形態では、第１のタグは、好ましくは、ペプチド、芳香族アミン、フェノールまたはチオフェノール、脂肪族アミン、脂肪族アルコールまたは脂肪族チオールを含む群から選択される脱離基である。

第１の態様の第１から第１５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１６の実施形態では、第１のタグは、標識の特異的カップリングを可能にする反応性基を含む。

第１の態様の第１６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１７の実施形態では、第１のタグの第１のペプチドとのカップリング後に、標識が第１のタグにカップリングされる。

第１の態様の第１から第１７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１８の実施形態では、第１のタグは標識を含む。

第１の態様の第１６から第１８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第１９の実施形態では、標識は、質量標識、蛍光標識およびＵＶ標識を含む群から選択される。

第１の態様の第１から第１９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２０の実施形態では、標識は、ケージ化合物中に含有される質量標識である。

第１の態様の第１９から第２０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２１の実施形態では、質量標識は、同位体標識であり、同位体は、好ましくは、Ｃ同位体、Ｎ同位体、Ｃｌ同位体およびＢｒ同位体を含む群から選択される。

第１の態様の第１９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２２の実施形態では、蛍光標識は、β−７−メトキシ−クマリル−アラニン、クマリル誘導体、ナフチルアミン誘導体、ナフタレンのヒドロキシルおよびチオール誘導体、アミノ−、ヒドロキシル−またはチオール−フルオレセイン誘導体、アミノ−、ヒドロキシル−またはチオール−ローダミン誘導体およびアミノ安息香酸誘導体を含む群から選択される。

第１の態様の第１９の実施形態の一実施形態でもある、第１の態様の第２３の実施形態では、ＵＶ標識は、置換アニリン、置換アニリド、置換フェノール、置換チオフェノール、置換ナフチルアミン、置換ナフチルアミド、置換チオアリールエステル、置換アリールエステルのような置換芳香族アミン、アミド、フェノール、チオフェノール、エステル、チオエステルならびに置換第１級および第２級アミン、置換第２級および第３級アミド、置換アルコール、置換チオール、置換チオエステル、置換エステルのような置換脂肪族アミン、アミド、アルコール、チオール、エステル、チオエステルを含む群から選択される。

第１の態様の第１から第２３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２４の実施形態では、第１のタグまたは第１のタグの第１の部分は、第１のペプチドとのカップリング後に除去可能である。

第１の態様の第２４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２５実施形態では、第１のタグまたはその第１の部分は、化学的切断、酵素的切断および物理的切断を含む群から選択される手段によって除去可能である。

第１の態様の第２４から第２５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２６の実施形態では、第１のタグまたはその第１の部分の除去は、配列特異的である。

第１の態様の第１から第２６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２７の実施形態では、第１のタグまたはその第１の部分は、検出方法においてシグナルを提供する。

第１の態様の第１から第２７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２８の実施形態では、シグナルは、標識によって提供される。

第１の態様の第２８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第２９の実施形態では、シグナルは、第１のタグまたはその第１の部分を特異的に示す特異的シグナルである。

第１の態様の第２７から第２９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３０の実施形態では、シグナルは、定量的シグナルである。

第１の態様の第２７から第３０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３１の実施形態では、シグナルは、好ましくは、１：１の化学量論に一致して第１のタグまたはその第１の部分に比例する。

第１の態様の第２７から第３１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３２の実施形態では、検出方法は、蛍光検出、ＵＶ検出および質量検出を含む群から選択される。

第１の態様の第１から第３２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３３の実施形態では、第１のペプチドのアミノ酸配列は、プロテオタイプのポリペプチドまたはプロテオタイプのポリペプチドの断片のアミノ酸配列に対応する。

第１の態様の第１から第３２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３４の実施形態では、第１のペプチドのアミノ酸配列は、複数のプロテオタイプのポリペプチドアミノ酸配列に対応する。

第１の態様の第１から第３４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３５の実施形態では、第１のペプチドの第１のタグとのカップリングは、第１のペプチドのアミノ酸配列を第１のタグへ合成することによって実施される。

第１の態様の第３５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３６の実施形態では、第１のタグに第１のペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸が順次加えられる。

第１の態様の第１から第３６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３７の実施形態では、第１のタグが表面に固定される。

第１の態様の第１から第３６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３８の実施形態では、第１のタグは、表面で合成され、その後、第１のペプチドが第１のタグとカップリングされる。

第１の態様の第１から第３８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第３９の実施形態では、第１のタグは、第１のペプチドのＣ末端とカップリングされる。

第１の態様の第１から第３９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４０の実施形態では、第１のペプチドは、第２のタグを含む。

第１の態様の第１から第４０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４１の実施形態では、第２のタグが、第１のペプチドのＮ末端と、好ましくは、第１のペプチドのＮ末端アミノ酸とカップリングされる。

第１の態様の第４１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４２の実施形態では、第２のタグは、第１のペプチドの全長アミノ酸配列の合成またはカップリングの完了時に第１のペプチドのＮ末端アミノ酸とカップリングされる。

第１の態様の第４１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４３の実施形態では、第２のタグは、第１のペプチドのアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸とカップリングされ、前記の第２のタグは、好ましくは、第１のタグに続いて、第１のペプチドとカップリングされる。

第１の態様の第４０から第４３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４４の実施形態では、第２のタグは、第１のタグとは異なっている。

第１の態様の第４０から第４４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４５の実施形態では、第２のタグは、ペプチド、プロテアーゼ基質および脱離基を含む群から選択される。

第１の態様の第４５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４６の実施形態では、第２のタグは、２〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは２〜６個のアミノ酸残基、より好ましくは２〜４個のアミノ酸残基、最も好ましくは３個のアミノ酸残基からなるペプチドである。

第１の態様の第４６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４７の実施形態では、第２のタグは、少なくとも１個の生体アミノ酸残基を含む。

第１の態様の第４６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４８の実施形態では、第２のタグは、少なくとも１個の非生体アミノ酸残基を含む。

第１の態様の第４６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第４９の実施形態では、第２のタグは、少なくとも１個のＤ−アミノ酸残基を含む。

第１の態様の第４６から第４９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５０の実施形態では、第２のタグのアミノ酸残基の少なくとも１個は、α−アミノ酸残基、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基およびδ−アミノ酸残基を含む群から選択される。

第１の態様の第４５から第５０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５１の実施形態では、第２のタグはペプチドであり、第２のタグを形成するペプチドの少なくとも１個のアミノ酸残基は、ペプチドの合成の非同位体識別法において得られた同位体組成とは異なっている同位体組成を含む。

第１の態様の第４５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５２の実施形態では、第２のタグは、好ましくは、エンドプロテアーゼ基質のＮ末端部分を摸倣するペプチドおよびペプチド誘導体を含む群から選択されるプロテアーゼ基質である。

第１の態様の第４５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５３の実施形態では、第２のタグは、好ましくは、ペプチドおよび置換ペプチドを含む群から選択される脱離基である。

第１の態様の第４０から第５３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５４の実施形態では、第２のタグは、標識の特異的カップリングを可能にする反応性基を含む。

第１の態様の第４０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５５の実施形態では、第１のタグを第１のペプチドとカップリングした後に、標識が第２のタグとカップリングされる。

第１の態様の第４０から第５５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５６の実施形態では、第２のタグは、標識を含む。

第１の態様の第５４から第５６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５７の実施形態では、標識は、質量標識、蛍光標識およびＵＶ標識を含む群から選択される。

第１の態様の第５７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５８の実施形態では、標識は、ケージ化合物中に含有される質量標識である。

第１の態様の第５７から第５８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第５９の実施形態では、質量標識は同位体標識であり、同位体は、好ましくは、Ｃ同位体、Ｎ同位体、Ｃｌ同位体およびＢｒ同位体を含む群から選択される。

第１の態様の第５７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６０の実施形態では、蛍光標識は、β−７−メトキシ−クマリル−アラニン、クマリル誘導体、ナフチルアミン誘導体、ナフタレンのヒドロキシルおよびチオール誘導体、アミノ−、ヒドロキシル−またはチオール−フルオレセイン誘導体、アミノ−、ヒドロキシル−またはチオール−ローダミン誘導体およびアミノ安息香酸誘導体を含む群から選択される。

第１の態様の第５７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６１の実施形態では、ＵＶ標識は、置換アニリン、置換アニリド、置換フェノール、置換チオフェノール、置換ナフチルアミン、置換ナフチルアミド、置換チオアリールエステル、置換アリールエステルのような置換芳香族アミン、アミド、フェノール、チオフェノール、エステル、チオエステルならびに置換第１級および第２級アミン、置換第２級および第３級アミド、置換アルコール、置換チオール、置換チオエステル、置換エステルのような置換脂肪族アミン、アミド、アルコール、チオール、エステル、チオエステルを含む群から選択される。

第１の態様の第４０から第６１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６２の実施形態では、第２のタグまたは第２のタグの第１の部分は、第１のペプチドとのカップリング後に除去可能である。

第１の態様の第６２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６３の実施形態では、第２のタグまたはその第１の部分は、化学的切断、酵素的切断および物理的切断を含む群から選択される手段によって除去可能である。

第１の態様の第６２から第６３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６４の実施形態では、第２のタグまたはその第１の部分の除去は、配列特異的である。

第１の態様の第４０から第６４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６５の実施形態では、第２のタグまたはその第１の部分は、検出方法においてシグナルを提供する。

第１の態様の第６５の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６６の実施形態では、シグナルは、標識によって提供される。

第１の態様の第６６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６７の実施形態では、シグナルは、第２のタグまたはその第１の部分を特異的に示す特異的シグナルである。

第１の態様の第６５から第６７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６８の実施形態では、シグナルは、定量的シグナルである。

第１の態様の第６５から第６８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第６９の実施形態では、シグナルは、第１のタグまたはその第１の部分に比例する。

第１の態様の第６５から第６９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７０の実施形態では、検出方法は、蛍光検出、ＵＶ検出および質量検出を含む群から選択される。

第１の態様の第４０から第７０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７１の実施形態では、第１のタグおよび第２のタグは、異なる標識を含む。

第１の態様の第４０から第７１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７２の実施形態では、第２のタグは、アンカー部分を含む。

第１の態様の第７２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７３の実施形態では、アンカー部分は、第２のタグおよび／または内部ペプチド標準を表面に付着させるのに適している。

第１の態様の第７２から第７３の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７４の実施形態では、アンカー部分は、第２のタグおよび／または内部ペプチド標準の表面への可逆的付着を可能にする。

第１の態様の第７２から第７４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７５の実施形態では、アンカー部分は、ビオチン、デスチオビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンを含む群から選択され、または表面での、適当な、すなわち、対応する反応性官能基との化学選択的反応を可能にする化学基である。

第１の態様の第７２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７６の実施形態では、アンカー部分は、第２のタグおよび／または内部ペプチド標準の表面への不可逆的付着を可能にし、好ましくは、不可逆的付着は共有結合による付着である。

第１の態様の第７２から第７６の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７７の実施形態では、アンカー部分は、アンカー部分と第２のタグの間に配置されるリンカーに付着される。

第１の態様の第７７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７８の実施形態では、リンカーは、Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノ−プロポキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピル）−スクシンアミド酸または分岐鎖もしくは直鎖いずれかのアルカン、好ましくは２〜３０個の炭素原子からなるもの、より好ましくは４〜２０個の炭素原子からなるもの、最も好ましくは４〜１０個の炭素原子からなるもの；あるいはポリエーテル、好ましくは１〜１０、より好ましくは２〜５のエチレンオキシドもしくはポリプロピレンオキシド単位からなるポリマーまたは分岐もしくは非分岐のポリアルコールまたはポリウレタン、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホン、好ましくは１〜１００個の単量体単位からなるもの、より好ましくは１〜５０個の単量体単位からなるもの、最も好ましくは１〜２０個の単量体単位からなるもの、または前記アルカンと前記ポリウレタン、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンとの組合せ、または分岐鎖または直鎖いずれかのジアミノアルカン、好ましくは２〜３０個の炭素原子からなるもの、より好ましくは２〜２０個の炭素原子からなるもの、最も好ましくは２〜１０個の炭素原子からなるもの、ならびにジアミノアルカンとポリエーテルの組合せ、好ましくは２〜３０個の炭素原子からなるもの、より好ましくは２〜２０個の炭素原子からなるもの、最も好ましくはコハク酸もしくはグルタル酸のような２〜１０個の炭素原子からなるもの、アミノ酸および好ましくは１〜２０個の残基またはより好ましくは１〜１０個の残基または最も好ましくは１〜３個の残基からなるペプチドを含む群から選択され、好ましくは、リンカーは、Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノ−プロポキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピル）−スクシンアミド酸のようなジカルボン酸とジアミノポリエーテルの組合せである。

第１の態様の第７２から第７８の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第７９の実施形態では、第２のタグは、ある１つのアミノ酸配列を含むペプチドを含み、リンカーは、アンカー部分とＮ末端の間に、好ましくは、第２のタグのＮ末端アミノ酸残基の間に配置される。

第１の態様の第１から第７９の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８０の実施形態では、内部ペプチド標準は精製される。

第１の態様の第４０から第８０の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８１の実施形態では、内部ペプチド標準は第２のタグ、第１のペプチドおよび第１のタグを含み、内部ペプチド標準はペプチドの混合物中に含有され、内部ペプチド標準は表面に固定され、内部ペプチド標準は、内部ペプチド標準のアンカー部分を介して表面と特異的に相互作用する。

第１の態様の第８０から第８１の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８２の実施形態では、内部ペプチド標準とは異なっているペプチドは、混合物から除去される。

第１の態様の第８１から第８２の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８３の実施形態では、内部ペプチド標準は、表面から除去され、反応器に移される。

第１の態様の第１から第８３の実施形態の一実施形態、好ましくは、第１の態様の第１から第６７の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８４の実施形態では、第１および／または第２のタグは、第１のペプチドから除去される。

第１の態様の第１から第８４の実施形態の一実施形態でもある第１の態様の第８５の実施形態では、第１および／または第２のタグの量が定量化される。

第２の態様の第１の実施形態でもある第２の態様では、本発明の根底にある問題は、
ａ）複数の種の内部ペプチド標準を個々に調製し、それによって、内部ペプチド標準の各種が第１の態様の実施形態のいずれかに従って調製されることと、
ｂ）内部ペプチド標準の個々に調製された種を所望により混合することと
を含み、
内部ペプチド標準の種が、第１および／または第２のタグおよび／または第１のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる、複数の種の内部ペプチド標準からなる内部ペプチド標準のライブラリーを調製する方法によって解決される。

第２の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第２の実施形態では、第１および／または第２のタグは、ある１つのアミノ酸配列を有するペプチドを含み、内部ペプチド標準のライブラリーの各種のアミノ酸配列は、内部ペプチド標準のライブラリーのその他の種のアミノ酸配列とは異なっている。

第２の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第２の態様の第３の実施形態では、内部ペプチド標準のライブラリーの内部ペプチド標準の各種は、プロテオタイプのペプチドを含む。

第３の態様の第１の実施形態でもある第３の態様では、本発明の根底にある問題は、第１の態様の任意の実施形態の方法によって得ることができる内部ペプチド標準によって解決される。

第４の態様の第１の実施形態でもある第４の態様では、本発明の根底にある問題は、第２の態様の任意の実施形態の方法によって得ることができる内部ペプチド標準のパネルによって解決される。

第５の態様第１の実施形態でもある第５の態様では、本発明の根底にある問題は、
ａ）好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
ｂ）第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準の、または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルの一定量を加え、それによってスパイクされた（ｓｐｉｋｅｄ）混合物を作製することと；
ｃ）スパイクされた混合物を配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、内部ペプチド標準（単数または複数）から第１のタグおよび／または第２のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出し、それによって、複数のペプチドが種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドと内部標準から放出された第１のペプチドとを含むことと；
ｄ）スパイクされた混合物中に含有される第１および／または第２のタグの量を決定することならびにそれから工程ｂ）において添加された内部標準（単数または複数）の量を決定することと；
ｅ）各々工程ｃ）において作製された、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
ｆ）工程ｄ）において決定された内部標準（単数または複数）の比および量から種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法によって解決される。

第５の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第２の実施形態では、質量標識は、Ｃ同位体およびＮ同位体を含む群から選択される。

第５の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第３の実施形態では、請求項９１の工程ｃ）において内部ペプチド標準から放出された第１のペプチド対請求項９１の工程ｃ）における種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比は、質量分析によって決定される。

第５の態様の第１から第３の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第４の実施形態では、質量分析は、多段質量分析（mass spectometry）である。

第５の態様の第１から第４の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第５の実施形態では、ペプチドの存在に特徴的である、フラグメンテーションおよびタンデム質量分析計におけるそれに続く分析によって得られたペプチドサインは、プロテオタイプのペプチドについて公知である。

第５の態様の第１から第５の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第６の実施形態では、配列特異的加水分解の手段は、タンパク質分解性酵素、配列特異的化学反応または配列特異的物理的処理から選択される。

第５の態様の第１から第６の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第７の実施形態では、第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルは、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物への添加に先立って精製されない。

第５の態様の第１から第６の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第８の実施形態では、第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルは、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物への添加に先立って精製される。

第５の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第９の実施形態では、精製は、第２のタグによる前記内部ペプチド標準（単数または複数）の合成の副生成物からの内部ペプチド標準（単数または複数）の選択的除去に基づいている。

第５の態様の第１から第９の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第１０の実施形態では、工程ｄ）において量が決定されるタグは蛍光標識を含み、タグの量は、標識の蛍光シグナルを測定することによって決定される。

第５の態様の第１から第９の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第１１の実施形態では、工程ｄ）において量が決定されるタグはＵＶ標識を含み、タグの量は、標識のＵＶシグナルを測定することによって決定される。

第５の態様の第１から第１１の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第１２の実施形態では、工程ｃ）後であって工程ｄ）前に、処理されたスパイク混合物が分離工程に付されて、処理されたスパイク混合物の成分から第１および第２のタグが分離される。

第５の態様の第１から第１１の実施形態の一実施形態でもある第５の態様の第１３の実施形態では、工程ｃ）後であって工程ｅ）前に、処理されたスパイク混合物が分離工程に付されて、第１のペプチドおよび種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが、処理されたスパイク混合物の成分から分離される。

第６の態様の第１の実施形態でもある第６の態様では、本発明の根底にある問題は、
ａ）好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
ｂ）第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルを提供し、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第１のタグおよび／または第２のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出することと；
ｃａ１）工程ａ）の種々のポリペプチドの混合物に、工程ｂ）の実施において得られた反応混合物を添加することと、
ｃａ２）工程ｃａ１）の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと、
または
ｃｂ１）工程ａ）の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと；
ｃｂ２）工程ｃｂ１）の実施において得られた混合物に、工程ｂ）の実施において得られた反応混合物を添加すること
のいずれかであって、工程ｃａ２）およびｃｂ２）後に、それぞれ、スパイクされた混合物が得られることと；
ｄ）スパイクされた混合物中に含有される第１および／または第２のタグの量を決定することならびにそれから工程ｂ）において添加された内部標準（単数または複数）の量を決定することと；
ｅ）スパイクされた混合物において、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
ｆ）工程ｄ）において決定された内部標準（単数または複数）の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法によって解決される。

第６の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第２の実施形態では、質量標識は、Ｃ同位体およびＮ同位体を含む群から選択される。

第６の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第３の実施形態では、内部ペプチド標準から放出された第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比は、質量分析によって決定される。

第６の態様の第１から第３の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第４の実施形態では、質量分析は、多段質量分析である。

第６の態様の第１から第４の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第５の実施形態では、ペプチドの存在に特徴的である、フラグメンテーションおよびタンデム質量分析計におけるそれに続く分析によって得られたペプチドサインは、プロテオタイプのペプチドについて公知である。

第６の態様の第１から第５の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第６の実施形態では、配列特異的加水分解のための手段は、タンパク質分解性酵素、配列特異的化学反応または配列特異的物理的処理から選択される。

第６の態様の第１から第６の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第７の実施形態では、第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルは、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物への添加に先立って精製されない。

第６の態様の第１から第６の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第８の実施形態では、第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルは、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物への添加に先立って精製される。

第６の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第９の実施形態では、精製は、第２のタグによる、前記内部ペプチド標準（単数または複数）の合成の副生成物からの内部ペプチド標準（単数または複数）の選択的除去に基づいている。

第６の態様の第１から第９の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第１０の実施形態では、工程ｄ）において量が決定されるタグは、蛍光標識を含み、タグの量は、標識の蛍光シグナルを測定することによって決定される。

第６の態様の第１から第９の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第１１の実施形態では、工程ｄ）において量が決定されるタグはＵＶ標識を含み、タグの量は、標識のＵＶシグナルを測定することによって決定される。

第６の態様の第１から第１０の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第１２の実施形態では、工程ｄ）の前に、スパイクされた混合物は分離工程に付されて、処理されたスパイクされた混合物の成分から第１および第２のタグが分離される。

第６の態様の第１から第１１の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第１３の実施形態では、工程ｅ）の前に、スパイクされた混合物は分離工程に付されて、第１のペプチドおよび種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが、処理されたスパイク混合物の成分から分離される。

第６の態様の第１から第１３の実施形態の一実施形態でもある第６の態様の第１４の実施形態では、工程ｂ）において使用される配列特異的加水分解のための手段は、工程ｃａ１）またはｃｂ１）を実施する前に工程ｂ）の実施において得られた混合物から除去される。

第７の態様の第１の実施形態でもある第７の態様では、本発明の根底にある問題は、
ａ）第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルを提供し、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第１のタグおよび／または第２のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出することと；
ｂ）配列特異的加水分解のための手段を所望により除去することと；
ｃ）工程ｂ）のａ）の実施から得られた混合物中に含有されている第１および／または第２のタグの量を決定することならびにそれから前記混合物中に含有された内部標準の量を決定することと；
ｄ）好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
ｄａ１）工程ｄ）の種々のポリペプチドの混合物に、工程ａ）またはｂ）の実施において得られた反応混合物の一部を添加することと；
ｄａ２）工程ｄａ１）の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドが、プロテオタイプのペプチドを含むこと；
または
ｄｂ１）工程ｄ）の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと；
ｄｂ２）工程ｄｂ１）の実施において得られた混合物に、工程ａ）またはｂ）の実施において得られた混合物の一部を添加すること
のいずれかによって、工程ｄａ２）およびｄｂ２）後にそれぞれ、スパイクされた混合物が得られることと；
ｅ）スパイクされた混合物中の、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
ｆ）内部標準（単数または複数）の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法によって解決される。

第７の態様の第１の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第２の実施形態では、質量標識は、Ｃ同位体およびＮ同位体を含む群から選択される。

第７の態様の第１および第２の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第３の実施形態では、内部ペプチド標準から放出された第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比は、質量分析によって決定される。

第７の態様の第１から第３の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第４の実施形態では、質量分析は、多段質量分析である。

第７の態様の第１から第４の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第５の実施形態では、ペプチドの存在に特徴的である、フラグメンテーションおよびタンデム質量分析計におけるそれに続く分析によって得られたペプチドサインは、プロテオタイプのペプチドについて公知である。

第７の態様の第１から第５の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第６の実施形態では、配列特異的加水分解のための手段は、タンパク質分解性酵素、配列特異的化学反応または配列特異的物理的処理から選択される。

第７の態様の第１から第６の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第７の実施形態では、第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルは、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物への添加に先立って精製されない。

第７の態様の第１から第６の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第８の実施形態では、第３の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準または第４の態様の任意の実施形態の内部ペプチド標準のパネルは、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物への添加に先立って精製される。

第７の態様の第８の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第９の実施形態では、精製は、第２のタグによる、前記内部ペプチド標準（単数または複数）の合成の副生成物からの内部ペプチド標準（単数または複数）の選択的除去に基づいている。

第７の態様の第１から第９の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第１０の実施形態では、量が工程ｃ）において決定されるタグは、蛍光標識を含み、タグの量は、標識の蛍光シグナルを測定することによって決定される。

第７の態様の第１から第９の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第１１の実施形態では、量が工程ｃ）において決定されるタグはＵＶ標識を含み、タグの量は、標識のＵＶシグナルを測定することによって決定される。

第７の態様の第１から第１１の実施形態の一実施形態でもある第７の態様の第１２の実施形態では、方法において、
ａ）工程ｄａ１）の前に、工程ａ）またはｂ）の実施において得られた反応混合物は分離工程付されて、前記反応混合物の成分から第１および第２のタグが分離されるか、または
ｂ）工程ｄｂ２）の前に、工程ｄｂ１）の実施において得られた反応混合物は分離工程に付されて、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが前記反応混合物の成分から分離される。

本発明者らは、驚くべきことに、特定の形態の内部標準を使用して、種々のポリペプチドの混合物において、ポリペプチドの存在を決定することが可能であることを見出した。より詳しくは、本発明者らは、驚くべきことに、標識された内部標準が、このような目的にとって適していることおよびこのような標識された内部標準は、種々のポリペプチドの混合物に添加される前に定量化される必要はないが、種々のポリペプチドの混合物に添加されたときにその量を決定することで十分であるということを見出した。しかしまた、標識されたまたは標識されていない内部標準が定量化され、その後、種々のポリペプチドの混合物中に添加されることも本発明の範囲内にある。

本発明の種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法は、プロテオタイプのペプチドの概念に基づいている。

本明細書において使用されることが好ましいプロテオタイプのペプチドとは、ポリペプチドの混合物中のポリペプチドにとって独特である、対象とするポリペプチドのペプチド断片である。このために、プロテオタイプのペプチドの同定および定量化はそれぞれ、個々のポリペプチドの混合物中の対象とするポリペプチドの存在および量と直接的に、明確に相関している。プロテオタイプのペプチドのアミノ酸配列は、対象とするポリペプチド中に１回のみ含有されることが好ましいが、対象とするポリペプチド中に数回含有されるアミノ酸配列も、プロテオタイプのペプチドのアミノ酸であるのに適したものであり得る。このような場合には、プロテオタイプのペプチドのアミノ酸配列として作動し、したがって、有用であるためのこの種のアミノ酸配列の適合性にとっての唯一の必要条件は、対象とするポリペプチドのアミノ酸配列中に含有されるこのようなアミノ酸配列のコピー数間に定義された関係または化学量論があることである。

しかし、プロテオタイプのペプチドのアミノ酸配列が、ポリペプチドの混合物中の２種以上のポリペプチド中に含有されるということも本発明の範囲内にある。このような場合には、プロテオタイプのペプチドは、ポリペプチドの混合物中の２種以上のポリペプチドと相関している。このような場合には、プロテオタイプのペプチドの定量化は、プロテオタイプのペプチドのアミノ酸配列を共有する混合物中に含有される２種以上のポリペプチドの全体量の定量化である。

好ましくは、プロテオタイプのペプチドの長さは、４〜４０個のアミノ酸残基、好ましくは、６〜２５個のアミノ酸残基、より好ましくは、８〜１５個のアミノ酸残基、最も好ましくは、８〜１２個のアミノ酸残基である。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する種々の方法の実施は、好ましくは、内部ペプチド標準の使用を必要とする。したがって、本出願の第１の態様は、内部ペプチド標準を調製する方法である。好ましい実施形態では、このように作製された標準または標準のパネルが、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の標的ポリペプチドの存在および／もしくは量ならびに／または精製されたポリペプチドの量を決定する方法において使用される、または使用されるためのものであり、それによって、好ましくは、このような方法は、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の標的ポリペプチドの存在および／もしくは量ならびに／または本発明の精製されたポリペプチドの量を決定する方法である。

本発明の内部ペプチド標準を調製する方法は、以下の工程
ａ）第１のタグを提供する工程と
ｂ）ある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドを、第１のタグとカップリングする工程と
を含み、それによって、第１のペプチドのアミノ酸配列のＣ末端は、アミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製したＣ末端に対応する。好ましくは、結合は、アミド結合であり、より詳しくは、ペプチドのアミド結合である。本発明の方法のこの実施形態では、第１のペプチドは、通常、全長ペプチドの形態の合成の生成物として提供される。ペプチドの合成のための方法は、当業者には公知であり、中でも、Pennington, 1994, Peptide Synthesis Protocols (Methods in Molecular Biology); Benoiton, 2005, Chemistry of Peptide Synthesisに記載されている。

あるいは、本発明の内部ペプチド標準を調製する方法は、以下の工程
ａ）第１のタグを提供する工程、および
ｂ）第１のタグに、ある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドを形成するアミノ酸をカップリングする工程
を含み、それによって、第１のペプチドのアミノ酸配列のＣ末端は、アミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の、好ましくは、ペプチドのアミド結合の配列特異的加水分解によって作製したＣ末端に対応する。この実施形態では、第１のペプチドを形成する個々のアミノ酸は、続いて、第１のタグに付着される。第１のペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸形成部分の基が、第１のタグに付着される、または第１のペプチドのアミノ酸配列のアミノ酸形成部分の１つまたはいくつかが第１のタグに付着されると第１のタグに付着されることも本発明の範囲内にある。

本明細書において、用語、アミノ酸配列のＣ末端は、好ましくは、アミノ酸配列の最後の、すなわち、最もＣ末端のアミノ酸残基を意味する。

配列特異的加水分解は、タンパク質分解性酵素の反応、配列特異的化学反応または配列特異的物理的処理を含む群から選択される反応によって実施される。この種の反応は、当業者には公知であり、例えば、Handbook of Proteolytic Enzymes, Academic Press, 1998; Kaiser and Metzka, 1999参照のこと。

配列特異的加水分解が、タンパク質分解性酵素によって実施される実施形態では、タンパク質分解性酵素は、ヒドロラーゼ、特に、Ｃ末端アルギニンおよびリシン残基をもたらすトリプシン、主にＣ末端アルギニン残基をもたらすトロンビン、Ｃ末端グルタミン酸残基をもたらすＶ８プロテアーゼ、Ｃ末端プロリン残基をもたらすプロリルエンドペプチダーゼ、主に、Ｃ末端フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニンもしくはロイシン残基をもたらすスブチリシンおよびキモトリプシンおよびＣ末端アラニン、グリシンセリンもしくはバリン残基をもたらすエスラスターゼのようなエンドプロテアーゼを含む群から選択される。

配列特異的加水分解が配列特異的化学反応によって実施される実施形態では、配列特異的化学反応は、好ましくは、Ｃ末端ホモセリンラクトンをもたらす臭化シアンのようなシアンハロゲン化物を用いる処理およびＣ末端アスパラギン酸残基をもたらすアスパルチル−プロリル結合の選択的酸性加水分解を含む群から選択される。

配列特異的加水分解が配列特異的物理的処理によって実施される実施形態では、このような配列特異的物理的処理は、好ましくは、例えば、質量分析計中で起こり得る高真空下でのイオン化によるフラグメンテーション反応から選択される（Pfeifer, T., Schierhorn, A., Friedemann, R., Jakob, M., Frank, R., Schutkowski, M., & Fischer G. (1997) Specific Fragmentation of Thioxo Peptides Facilitates the Assignment of the Thioxylated Amino Acid. J. Mass Spec. 32, 1064-1071）。

好ましい実施形態では、配列特異的加水分解のためにどの種類の手段が使用されるかに関わらず、Ｃ末端は、アミノ酸残基であることが好ましい。好ましくは、このようなアミノ酸残基は、アルギニン、リシン、グルタミン酸およびプロリンを含む群から選択される。

第１のペプチドは、アミノ酸配列を含む。一実施形態では、第１のペプチドは、アミノ酸配列からなる。前記の第１のペプチドに、第１のタグが付着される。好ましくは、このような第１のタグは、共有結合によって第１のペプチドに付着される。一実施形態では、第１のペプチドに付着された第２のタグがある。一実施形態では、第１のタグおよび第２のタグは両方とも、第１のペプチドに付着される。第１のタグが第１のペプチドに付着され、第２のタグが第１のペプチドに付着される実施形態では、好ましくは、第１のタグが、第１のペプチドのＣ末端アミノ酸残基に付着され、第２のタグが第１のペプチドのＮ末端アミノ酸残基に付着される。

以下では、第１のタグの種々の実施形態が、より詳細に記載される。異なって示されない場合には、第１のタグについて記載される種々の実施形態は、第２のタグの実施形態でもあり得る。特徴および実施形態の記載が簡単にタグを指す場合には、特徴および実施形態のこのような記載は、第１のタグおよび第２のタグの両方の特徴および実施形態の記載であることを意味する。

一実施形態では、タグは、ペプチド、プロテアーゼ基質および脱離基を含む群から選択される。

タグがペプチドである実施形態では、このようなペプチドは、２〜１０個のアミノ酸残基、好ましくは、２〜６個のアミノ酸残基、より好ましくは、２〜４個のアミノ酸残基、最も好ましくは、３個のアミノ酸残基からなる。このようなアミノ酸およびアミノ酸残基の化学については、それぞれ、個々のアミノ酸は、各々、ペプチドのその他のアミノ酸残基とは独立に、生体アミノ酸または非生体アミノ酸であり得るということは認められるべきである。また、個々のアミノ酸は、各々、ペプチドのその他のアミノ酸残基とは独立に、Ｌ−アミノ酸またはＤ−アミノ酸であり得る。個々のアミノ酸は、各々、ペプチドのその他のアミノ酸残基とは独立に、α−アミノ酸、β−アミノ酸残基、γ−アミノ酸残基またはδ−アミノ酸残基であり得るということも本発明の範囲内にある。一実施形態では、タグのアミノ酸配列は、Ｌ−アミノ酸残基からなる。別の実施形態では、タグのアミノ酸配列は、Ｄ−アミノ酸残基からなる。一実施形態では、タグのアミノ酸配列は、Ｌ−αアミノ酸残基からなる。別の実施形態では、タグのアミノ酸配列は、Ｄ−αアミノ酸残基からなる。

一実施形態では、タグはペプチドであり、タグを形成するペプチドのアミノ酸残基の少なくとも１個が、ペプチドの合成の非同位体識別法において得られた同位体組成とは異なっている同位体組成を含む。本明細書において、好ましく使用されるように、ペプチドの合成の非同位体識別法は、原子の個々の同位体、ひいては、個々の同位体を含有するアミノ酸が、識別されない合成法である。結果として、個々の原子の同位体は偏らない。このような偏りは、１種または数種の同位体が濃縮されているようなものである場合がある。あるいは、このような偏りは、１種または数種の同位体が枯渇しているようなものである場合がある。最後に、偏りは、同位体のある種または種の群が濃縮されているが、同位体の別の種または種の群が枯渇しているようなものである場合もある。本発明の方法に関連して使用される質量分析では、同位体およびその分布が重要な役割を果たすので、タグの合成のための非同位体識別法の使用は、好ましい。

一実施形態では、タグは、好ましくは、ペプチド、芳香族アミド、芳香族エステルまたはチオエステル、脂肪族アミド、エステルまたはチオエステルを含む群から選択されるプロテアーゼ基質またはプロテアーゼ基質の一部である。一実施形態では、プロテアーゼ基質は、好ましくは、１〜２０個のアミノ酸残基、好ましくは、１〜１０個のアミノ酸残基、より好ましくは、１〜５個のアミノ酸残基、最も好ましくは、１〜３個のアミノ酸残基を含む、またはからなるペプチドである。

一実施形態では、タグは、反応性基、好ましくは、化学反応性基を含む。このような反応性基は、標識のタグへのカップリングを可能にする。一実施形態では、カップリングは、タグおよび標識間の化学的結合の形成によって起こる。代替実施形態では、標識は、反応性基、好ましくは、化学反応性基を含む。このような反応性基は、タグの標識へのカップリングを可能にする。一実施形態では、カップリングは、タグおよび標識間の化学的結合の形成によって起こる。

標識のタグへのカップリングについては、タグの第１のペプチドへのカップリング後に、標識がタグにカップリングされることは本発明の範囲内にある。代替実施形態では、タグの第１のペプチドへのカップリングの前に、標識がタグにカップリングされる。

第１のタグおよび第２のタグのいずれかまたは両方の一実施形態では、標識は、アミノ酸の一部である。それと一致して、アミノ酸は、好ましくは、修飾されたアミノ酸である。このようなアミノ酸、好ましくは、修飾されたアミノ酸は、タグの合成において使用される。好ましい実施形態では、タグは、このようなアミノ酸を含むペプチドである。一実施形態では、このような修飾されたアミノ酸は、例えば、Cawley et al., J. Biol. Chem. 278, (2003)に記載されるようなメタ−ニトロ−チロシンである。

タグ、第１のタグおよび第２のタグのいずれかまたは両方に付着される標識は、好ましくは、質量標識、蛍光標識およびＵＶ標識を含む群から選択される。

一実施形態では、質量標識は、ケージ化合物中に含有される。ケージド化合物は、当技術分野で公知であり、例えば、Capello et al., Cancer Biother. Radiopharm. 18, 2003, Storch et al., J. Nucl. Med. 46, 2005に記載されている。

標識が質量標識である実施形態では、質量標識は同位体標識であり、同位体は、好ましくは、Ｃ同位体、Ｎ同位体、Ｃｌ同位体およびＢｒ同位体を含む群から選択される。^１３Ｃとして好ましいＣ同位体。好ましいＮ同位体は、^１５Ｎ同位体である。好ましいＢｒ同位体は、^７９Ｂｒおよび^８１Ｂｒである。好ましいＣｌ同位体は、^３５Ｃｌおよび^３７Ｃｌである。

標識が蛍光標識である実施形態では、蛍光標識は、中でも、Handbook of Proteolytic Enzymes, Academic Press, 1998に、またはThe Handbook - A Guide to Fluorescent Probes and Labeling Technologies, Invitrogen, http://www.invitrogen.com/site/us/en/home/References/Molecular-Probes-The-Handbook.htmlに記載されるような、β−７−メトキシ−クマリル−アラニン、クマリル誘導体、ナフチルアミン誘導体、ナフタレンのヒドロキシルおよびチオール誘導体、アミノ−、ヒドロキシル−またはチオール−フルオレセイン誘導体、アミノ−、ヒドロキシル−またはチオール−ローダミン誘導体およびアミノ安息香酸誘導体を含む群から選択されることが好ましい。

標識がＵＶ標識である実施形態では、ＵＶ標識は、中でも、Handbook of Proteolytic Enzymes, Academic Press, 1998, Peters et al., Curr. Microbiol. 18, 1989; Harper et al., Anal. Biochem. 118, 1981; Janowski et al., Anal. Biochem. 252, 1997; Glucksman et al., Biophys. J. 62, 1992またはSoeda et al., Chem. Pharm. Bull. 33, 1985に記載されるような、置換アニリン、置換アニリド、置換フェノール、置換チオフェノール、置換ナフチルアミン、置換ナフチルアミド、置換チオアリールエステル、置換アリールエステルのような置換芳香族アミン、アミド、フェノール、チオフェノール、エステル、チオエステルならびに置換第１級および第２級アミン、置換第２級および第３級アミド、置換アルコール、置換チオール、置換チオエステル、置換エステルのような置換脂肪族アミン、アミド、アルコール、チオール、エステル、チオエステルを含む群から選択されることが好ましい。

タグまたはタグの第１の部分は、第１のペプチドへのカップリング後に除去可能である、すなわち、タグまたはその第１の部分が、タグまたはタグの第１の部分を含むコンストラクトから再度除去されるということは本発明の範囲内にある。これから生じる利点は、タグ、より詳しくは、除去されたタグと存在している第１のペプチド間の化学量論関係、このように除去または放出されたタグは、第１のペプチド、より詳しくは、タグにカップリングされた第１のペプチドの指標であるということである。これによって、タグの除去の前に、それぞれ、タグを定量化することによって、第１のペプチドおよびタグにカップリングされ第１のペプチドの定量化が可能となる。第１のタグおよび第２のタグの両方とも、それに定量化が基づくタグとして使用され得るが、定量化に使用されるタグは第１のタグであることが好ましい。

第１のペプチドからのタグの除去は、化学的切断、酵素的切断および／または物理的切断によって起こり得る。このような化学的切断、酵素的切断または物理的切断を実施するための手段は、当業者に公知である。好ましい実施形態では、このような手段は、ペプチドのＣ末端が生成する配列特異的加水分解に関連して本明細書に記載されるものである。一実施形態では、第１のペプチドからのタグの切断において使用される手段は、ペプチドのＣ末端が生成する配列特異的加水分解において使用されるものである。好ましい実施形態では、第１のタグまたはその第１の部分の除去は、配列特異的である。これは、このような実施形態では、配列特異的化学的切断のための手段、配列特異的酵素的切断のための手段または配列特異的物理的切断のための手段である前記手段、すなわち、化学的切断、酵素的切断および物理的切断のための手段の使用から起こることが好ましい。

本発明に関連して、タグの機能の１つは、検出され得るシグナルを提供することである。このようなシグナルは、タグによって、タグに付着された標識によって、または両方によって提供され得る。このようなシグナルは、内部ペプチド標準を利用して、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法において使用するためのものである。好ましくは、このような方法は、本発明の種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法である。一実施形態では、シグナルは、タグを示し、さらにより好ましくは、定量的シグナルである。別の実施形態では、シグナルは、タグまたはその一部に比例する。シグナルは、１：１の化学量論に従う、すなわち、１シグナル単位（unity）は、1つのタグまたは標識に対応するということが好ましい。当業者ならば、化学量論が公知であり、方法の実施において再現性がある限り、本発明の方法の実施においてその他の化学量論も使用され得るということを理解するであろう。

化学的切断、酵素的切断および／または物理的切断による第１からのタグの除去について、本明細書に開示されるその多様な実施形態においていわれてきたことは、タグの部分のみが、タグおよび第１のペプチドの両方を含むコンストラクトから除去される実施形態にも当てはまる、または適用可能である。したがって、この実施形態では、タグは、第１のペプチドから部分でのみ除去される。結果として、タグの一部は、第１のペプチドにカップリングされているままであるが、タグの別の部分は、タグおよび第１のペプチドを含むコンストラクトから除去される。この実施形態の通常の実施例は、第１のペプチドおよびタグを含むコンストラクトからタグの一部の切断除去の過程で、ＦＲＥＴシステムの２種の成分の一方が、ＦＲＥＴシステムのもう一方の成分から分離されるいわゆるＦＲＥＴシステムである。このような切断除去によって、本発明の方法に関連して検出および使用され得るシグナルが生成する。ＦＲＥＴシステムは、例えば、Yaron et al. 1979、Bratovanova and Petkov 1987、Meldal et al. 1994、Wang et al. 1990、Lee et al., Blood 103, 204に記載されている。

シグナルに応じて、種々の検出方法が使用され得る。このような検出方法は、蛍光検出、ＵＶ検出および質量検出を含む群から選択され得る。どのシグナルのためにどの検出方法が使用されるか、およびこれがそれぞれ、どのタグおよび標識のためであるかを決定することは、当業者の範囲内にある。

タグは、第１のペプチドおよびタグを含むコンストラクトの固定化のために使用され得る。一実施形態では、タグが、表面に固定され、続いて、第１のペプチドがタグにカップリングされる。一実施形態では、タグが、表面に固定され、第１のペプチドのアミノ酸配列を形成するアミノ酸またはアミノ酸の基が、固定タグまたは第１のペプチドのアミノ酸配列の１個または数個のアミノ酸がすでにカップリングもしくは付着されている固定タグにカップリングまたは付着される。その一実施形態では、タグは、第１のタグである。代替実施形態では、タグは、第２のタグである。

第２のタグがプロテアーゼ基質である一実施形態では、プロテアーゼ基質が、エンドプロテアーゼ基質のＮ末端部分を摸倣するペプチドおよびペプチド誘導体を含む群から選択されることが好ましい。第１のタグが、好ましくは、第１のペプチドのＣ末端に付着されているプロテアーゼ基質である一実施形態では、プロテアーゼ基質が、エンドプロテアーゼ基質のＣ末端部分を摸倣するペプチドおよびペプチド誘導体を含む群から選択されることが好ましい。

一実施形態では、第２のタグは、ペプチドである。好ましくは、このようなペプチドは、ペプチドである第１のタグの１つまたはいくつかの特徴を有する。一実施形態では、第２のタグであるか、または第２のタグの一部であるペプチドが、Ｎ末端、好ましくは、第１のペプチドのアミノ酸配列のＮ末端アミノ酸残基に付着される。

第１のタグおよび第２のタグが第１のペプチドにカップリングされる実施形態では、第１のタグおよび第２のタグは、互いに異なっていることが好ましい。第２のタグのカップリングの前に、第１のタグが第１のペプチドにカップリングされることは、本発明の範囲内である。しかし、第１のタグのカップリングの前に、第２のタグが第１のペプチドにカップリングされることも本発明の範囲内である。これは、第１および第２のタグがそれぞれ、全長分子としてカップリングされない場合、第１のタグおよび第２のタグのビルディングブロックが、続いて、第１のペプチドに付着される実施形態においても等しく当てはまる。

第１のタグおよび第２のタグが、第１のペプチドにカップリングされる実施形態では、一実施形態では、第１のタグおよび第２のタグは異なっている。第１のタグおよび第２のタグが第１のペプチドにカップリングされ、第１のタグおよび第２のタグが異なっている実施形態では、第１のタグの標識は、第２のタグの標識とは異なっている。あるいは、第１のタグの標識および第２のタグの標識は同一である。

第１のタグおよび第２のタグが第１のペプチドにカップリングされる実施形態では、一実施形態では、第１のタグおよび第２のタグは同一であるが、第１のタグの標識および第２のタグの標識は異なっている。

一実施形態では、第２のタグは、アンカー部分を含む。アンカー部分は、リンカーに付着され、それによって、リンカーがアンカー部分と第２のタグの間に配置されることが好ましい。アンカー部分は、第２のタグおよび／または内部ペプチド標準を、好ましくは固体表面である表面に付着させるのに適していることが好ましい。代替実施形態では、表面は、可溶性であるが、溶媒が変更されると収縮および沈殿できるポリマーなどの非固体表面である。このようなポリマーは、当業者には公知である（Reactive and Functional Polymers, Volume 44, Issue 1, 14 April 2000, Pages 41-46, The effect of PEG groups on swelling properties of PEG-grafted-polystyrene resins in various solvents, Byeong-Deog Parka and Yoon-Sik Lee; BioPharm International Supplements, Mar 2, 2010, PEG Precipitation: A Powerful Tool for Monoclonal Antibody Purification, Michael Kuczewski, Emily Schirmer, PhD, Blanca Lain, PhD, Gregory Zarbis-Papastoitsis, PhD; Current Opinion in Chemical Biology, Volume 1, Issue 1, June 1997, Pages 107-113, Synthesis on soluble polymers: new reactions and the construction of small molecules, Dennis J Gravert and Kim D Janda）。

一実施形態では、このようなポリマーは、修飾されたエチレングリコールである。表面との付着は、内部ペプチド標準の精製を目的として使用され得る。一実施形態では、アンカー部分によって、内部ペプチド標準の、表面との可逆的付着が可能になる。しかし、アンカー部分の付着および／または内部ペプチド標準が不可逆的である場合も本発明の範囲内である。付着が不可逆的である実施形態の場合には、付着は、共有結合による付着である。好ましい実施形態では、共有結合による付着は、アンカー部分、第２のタグまたは第１の内部ペプチド標準の化学選択的反応によって確立される。

一実施形態では、アンカー部分は、ビオチン、イミノビオチン、デスチオビオチン、アビジン、ストレプトアビジンを含む群から選択され、アンカー部分が結合する表面は、互いに結合することが当技術分野で公知であるこれらのアンカー部分の相互作用パートナーを含む。あるいは、アンカー部分は、表面上の適当な反応性官能基との化学選択的反応を可能にする化学基である。このような化学基は、マレイミド基；ブロモピルビン酸または４−カルボキシ−α−ブロモ−アセトフェノンのようなα−ハロ−ケトン、４−カルボキシ−α−イソチオシアナト−アセトフェノンのようなα−イソチオシアナト−ケトン、カルボキシベンズアルデヒドのようなアルデヒド、レブリン酸のようなケトン、チオセミカルバジド、コハク酸モノチオアミドのようなチオアミド、ブロモ酢酸のようなα−ブロモ−カルボン酸、４−ヒドラジノ安息香酸のようなヒドラジン、アミノオキシ酢酸のようなＯ−アルキルヒドロキシルアミンおよびグルタル酸モノヒドラジドのようなヒドラジドのような第１のペプチドおよび／または第１のタグ中に見られない化学基に相当する。

より詳しくは、それ自体当業者に公知であるいくつかの反応が、アンカー部分または第２のタグまたは内部標準ペプチドの付着のための化学選択的（chemosselective）反応を達成するために使用され得る。このような反応は、中でも、Lemieux & Bertozzi（Lemieux、G. A. & Bertozzi, C. R.,1998, Chemoselective ligation reactions with proteins, oligosaccharides and cells, TIBTECH, 16, 506-513、図１６および１７参照のこと）に記載されている。必要な方向性の固定を目的として、基本的に、それぞれの相互作用条件下で、実質的に１種のみの特定の化合物が、アミノ酸配列および表面の間で形成されることは保障されなければならない（図１４および１５）。したがって、アミノ酸配列側の反応性基の選択は、実質的に、個々の配列に応じて変わる。あるいは、すべてのアミノ酸配列の末端構造標準が提供され、この末端構造が、表面、特に、活性化された表面との特異的反応に利用されることは本発明の範囲内で提供される（図１４および１５）。通常、化学選択的反応の際に、アミノ酸配列中に含有されるアミノまたはカルボキシル基は、悪影響を受けない。適した反応の例として、ハロカルボン酸およびチオールからのチオエーテルの形成があり、これは、ハロカルボン酸およびチオールからのチオエーテル、チオールおよびマレイミドからのチオエーテル、チオエステルおよび１，２−アミノチオールからのアミド結合、ジチオエステルおよび１，２−アミノチオールからのチオアミド結合、アルデヒドおよび１，２−アミノチオールからのチアゾリジン、アルデヒド／ケトンおよび１，２−アミノアルコールからのオキサゾリジン、アルデヒド／ケトンおよび１，２−ジアミンからのイミダゾール（図１６および１７も参照のこと）、チオアミドおよびα−ハロ−ケトンからのチアゾール、アミノオキシ化合物およびα−イソチオシアナト−ケトンからのアミノチアゾール、アミノオキシ化合物およびアルデヒドからのオキシム、アミノオキシ化合物およびケトンからのオキシム、ヒドラジンおよびアルデヒドからのヒドラゾン、ヒドラジドおよびケトンからのヒドラゾンの形成を含む。さらに、図１６および１７において示されるラジカルＲ１〜Ｒ５または上記の化学選択的反応における残基は、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキルまたはアリールラジカルまたは複素環式化合物であり得、ここで、アルキルは、分岐および非分岐Ｃ_１−２０−アルキル、Ｃ_３−２０−シクロアルキル、好ましくは、分岐および非分岐−Ｃ_１−１２アルキル、Ｃ_３−１２シクロアルキル、特に好ましくは、分岐および非分岐Ｃ_１−６−アルキル、Ｃ_３−６−シクロアルキルラジカルを表す。アルケニルは、分岐および非分岐Ｃ_２−２０−アルケニル、分岐および非分岐Ｃ_１−２０−アルキル−Ｏ−Ｃ_２−２０アルケニル、Ｃ_１−２０（−Ｏ／Ｓ−Ｃ_２−２０）_２−２０アルケニル、アリール−Ｃ_２−２０−アルケニル、分岐および非分岐ヘテロシクリルＣ_２−２０アルケニル、Ｃ_３−２０−シクロアルケニル、好ましくは、分岐および非分岐Ｃ_２−１２−アルケニル、分岐および非分岐Ｃ_１−１２（−Ｏ／Ｓ−Ｃ_２−１２）_２−１２アルケニル、特に好ましくは、分岐および非分岐Ｃ_２−６−アルケニル、分岐および非分岐Ｃ_１−６（−Ｏ／Ｓ−Ｃ_２−８）_２−８アルケニルラジカルを表し；アルキニルは、分岐および非分岐Ｃ_２−２０−アルキニル、分岐および非分岐Ｃ_１−２０（−Ｏ／Ｓ−Ｃ_２−２０）_２−２０アルキニル、好ましくは、分岐および非分岐Ｃ_２−１２−アルキニル、分岐および非分岐Ｃ_１−１２（−Ｏ／Ｓ−Ｃ_２−１２）_２−１２アルキニル、特に好ましくは、分岐および非分岐Ｃ_２−６−アルキニル、分岐および非分岐Ｃ_１−６（−Ｏ／Ｓ−Ｃ_２−８）_２−８アルキニルラジカルを表し；シクロアルキルは、架橋および非架橋Ｃ_３−４０−シクロアルキル、好ましくは、架橋および非架橋Ｃ_３−２６−シクロアルキル、特に好ましくは、架橋および非架橋Ｃ_３−１５−シクロアルキルラジカルを表し；アリールは、置換および非置換単一連結−または多重連結フェニル、ペンタレニル、アズレニル、アントラセニル、インダセニル、アセナフチル、フルオレニル、フェナレニル、フェナントレニルを表し、好ましくは、置換および非置換単一連結または多重連結フェニル、ペンタレニル、アズレニル、アントラセニル、インデニル、インダセニル、アセナフチル、フルオレニルを表し、特に好ましくは、置換および非置換単一連結または多重連結フェニル、ペンタレニル、アントラセニルラジカルならびにその部分水和された誘導体を表す。複素環式化合物は、１〜７個のヘテロ原子を有する不飽和および飽和３〜１５員単環式、二環式および三環式環、好ましくは、１〜５個のヘテロ原子を有する３〜１０員の単環式、二環式および三環式環、特に好ましくは、１〜３個のへテロ原子を有する５員、６員および１０員の単環式、二環式および三環式環であり得る。

さらに、アルキル、アルケニル、アルキニル、シクロアルキル、アリール、ヘテロ原子、複素環式化合物、生体分子または天然物質で、０〜３０（好ましくは、０〜１０、特に好ましくは、０〜５）の以下の置換基：フッ素、塩素、臭素、ヨウ素、ヒドロキシル、アミド、エステル、酸、アミン、アセタール、ケタール、チオール、エーテル、ホスフェート、スルフェート、スルホキシド、ペルオキシド、スルホン酸、チオエーテル、ニトリル、尿素、カルバマートが、単独で、または互いに組み合わせて生じてもよく、以下：フッ素、塩素、臭素、ヒドロキシル、アミド、エステル、酸、アミン、エーテル、ホスフェート、スルフェート、スルホキシド、チオエーテル、ニトリル、尿素、カルバマートが好ましく、塩素、ヒドロキシル、アミド、エステル、酸、エーテル、ニトリルが特に好ましい。

アンカー部分と第２のタグの間に配置されているリンカーは、一実施形態では、リンカーは、少なくとも２つの官能基からなる化学構造である。リンカーは、アンカー部分を、共有結合で第１のペプチドとつなぐことが好ましい。リンカーは、アンカー部分を第１のペプチドから離して配置し、これによって、アンカー部分と固体表面間の適切な相互作用が可能となる。さらに、リンカーによって、第２のタグ／第１の（fist）ペプチド結合の効率的な酵素的切断が可能となる。

一実施形態では、リンカーは、Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノ−プロポキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピル）−スクシンアミド酸または分岐鎖もしくは直鎖いずれかのアルカン、好ましくは、２〜３０個の炭素原子からなるもの、より好ましくは、４〜２０個の炭素原子からなるもの、最も好ましくは、４〜１０個の炭素原子からなるもの；またはエチレンオキシドもしくはプロピレンオキシドのポリマー、好ましくは、１〜１０、より好ましくは、２〜５のエチレンオキシドもしくはポリプロピレンオキシド単位からなるポリマーを意味するポリエーテル、またはポリグリコールおよびＯ，Ｏ’−ビス（２−アミノプロピル）−ポリエチレングリコールのようなその誘導体のような分岐もしくは非分岐のポリアルコールまたはポリウレタン、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホン、好ましくは、１〜１００個の単量体単位からなるもの、より好ましくは、１〜５０個の単量体単位からなるもの、最も好ましくは、１〜２０個の単量体単位からなるものまたは記載されたアルカンと、記載されたポリウレタン、ポリヒドロキシ酸、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリアミド、ポリエステル、ポリスルホンの組合せ、または分岐鎖もしくは直鎖いずれかのジアミノアルカン、好ましくは、２〜３０個の炭素原子からなるもの、より好ましくは、２〜２０個の炭素原子からなるもの、最も好ましくは、１，３−ジアミノプロパン、１，６−ジアミノヘキサンおよび１，８−ジアミノオクタンのような２〜１０個の炭素原子からなるもの、ならびにジアミノアルカンと１，４−ビス−（３−アミノプロポキシ）ブタンのようなポリエーテルもしくはカルボン酸およびジカルボン酸およびヒドロキシ−、メルカプト−およびアミノカルボン酸または分岐もしくは直鎖いずれかのジカルボン酸のような誘導体、好ましくは、２〜３０個の炭素原子からなるもの、より好ましくは、２〜２０個の炭素原子からなるもの、最も好ましくは、コハク酸もしくはグルタル酸のような２〜１０個の炭素原子からなるものとの組合せを含む群から選択される。アミノ酸およびペプチドは、好ましくは、１〜２０個の残基またはより好ましくは、１〜１０個の残基または最も好ましくは、リシンの三量体、３−アミノプロピオン酸の二量体および６−アミノヘキサン酸の単量体のような１〜３個の残基からなる。好ましくは、リンカーは、Ｎ−（３−｛２−［２−（３−アミノ−プロポキシ）−エトキシ］−エトキシ｝−プロピル）−スクシンアミド酸のようなジカルボン酸とジアミノポリエーテルとの組合せである。

一実施形態では、第２のタグは、リンカーが、アンカー部分とＮ末端の間、好ましくは、第２のタグのＮ末端アミノ酸残基の間に配置される、アミノ酸配列を含むペプチドを含む。

本発明の方法の一実施形態では、内部ペプチド標準は第２のタグ、第１のペプチドおよび第１のタグを含み、内部ペプチド標準はペプチドの混合物中に含有され、内部ペプチド標準は表面に固定され、内部ペプチド標準は、内部ペプチド標準のアンカー部分を介して表面と特異的に相互作用する。１つのまたはいくつかのその後の工程では、内部ペプチド標準とは異なっているペプチドが、混合物から除去される。好ましくは、第２のタグおよびアンカー部分、それぞれによる内部ペプチド標準の固定の特異性によって、第２のタグおよびアンカー部分それぞれの、表面との相互作用が可能となる。このために、任意の非結合性化合物または、非特異的結合性化合物が、洗浄などによって除去され得、この結果、通常、表面に固定される、意図される内部ペプチド標準が精製される。

上記から、一実施形態では、内部ペプチド標準は、表面に付着されていることが理解されよう。付着が、ビオチン、デスチオビオチン、アビジンまたはストレプトアビジンの使用などによって可逆性である場合には、これらおよび同様の化合物の添加が、このように固定された内部ペプチド標準と前記化合物の相互作用パートナーの間の競合をもたらし、そこで、固定された内部ペプチド標準が放出される。付着が共有結合である代替実施形態では、第１のタグを含むかどうかにかかわらず、第２のタグと第１のペプチド間の配列特異的切断のための手段の使用が好ましく、そこで、このような第１のペプチドが、表面から放出される。いずれの場合も、この種の手順によって、精製された内部ペプチド標準が提供される。

このように得られた、または任意の形態の精製された内部ペプチド標準は、好ましくは、特に、複数の種の内部ペプチド標準からなる、内部ペプチド標準のライブラリーを調製する方法および種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法をはじめとする本発明の任意の方法においてさらに使用され得る。前記方法において使用するために、このように精製された内部ペプチド標準は、第２および／または第１のタグを依然として含有するかどうかにかかわらず、種々の反応器に移されることが好ましい。前記方法の種々の実施形態に応じて、第２のタグが、内部ペプチド標準の使用に先立って除去されるということは、当業者には認められよう。前記方法の種々の実施形態に応じて、第１のタグが内部ペプチド標準の使用に先立って除去されるということは、当業者には認められよう。最後に、前記方法の種々の実施形態に応じて、第１および第２のタグが内部ペプチド標準の使用に先立って除去されるということは、当業者には認められよう。第１のタグ、第２のタグまたは第１のタグおよび第２のタグの両方が除去されると、第１、第２、または第１および第２のタグの両方の定量化、ひいては、最終的に、内部ペプチド標準の定量化のための方法が進行し得る。第１のタグ、第２のタグならびに第１のタグおよび第２のタグの定量化のための方法は、当業者に公知である。当業者には認められており、明らかであるように、使用される特定の方法は、個々のタグの種類に応じて、タグが少なくとも１種の標識を有する実施形態では、標識の種類に応じて異なる。

本発明はまた、内部ペプチド標準のライブラリーまたはパネルおよびそれらを調製する方法に関する。好ましくは、内部ペプチド標準のライブラリーまたはパネルは、複数の種の内部ペプチド標準を含む。本明細書において、好ましく使用されるように、複数の種の内部ペプチド標準とは、少なくとも２種の内部ペプチド標準を意味する。内部ペプチド標準のライブラリーを調製するための本発明の方法は、以下の工程：
ａ）複数の種の内部ペプチド標準を個々に調製し、それによって、内部ペプチド標準の各種が、本発明の内部ペプチド標準を調製する方法に従って調製される工程と；
ｂ）個別に調製された内部ペプチド標準の種を所望により混合する工程と
を含み、内部ペプチド標準の種は、第１および／または第２のタグおよび／または第１のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる。

一実施形態では、第１および／または第２のタグは、アミノ酸配列を有するペプチドを含み、内部ペプチド標準のライブラリーの各種のアミノ酸配列は、内部ペプチド標準のライブラリーのその他の種のアミノ酸配列とは異なっている。その一実施形態では、種々の種のアミノ酸配列が、第１のペプチドのアミノ酸配列に関して互いに異なる。

種々の種のアミノ酸配列が、第１のペプチドのアミノ酸配列に関して互いに異なる実施形態では、種々の種の第１および第２のタグは、同一であり得る。種々の種の第１および第２のタグが同一である場合およびそれらが標識を有する場合は、種々の種の種々の第１および／または第２のタグについて標識が同一であることは本発明の範囲内である。このような場合には、標識の定量化は、通常、個々の種々の種によって寄与される分子の個々の数間を識別せずに、反応または容器中に含有される内部ペプチド標準分子の総数に関する情報を提供する。種々の種の第１および第２のタグが同一である場合およびそれらが標識を有する場合には、種々の種の第１のタグおよび／または第２のタグの標識が異なっていること、より好ましくは、種々の種の第１のタグの標識が異なっており、したがって個々の種について特徴的であることは本発明の範囲内である。このような場合には、標識の定量化は、通常、個々の種々の種によって寄与される分子の個々の数間を識別して、反応または容器中に含有される種々の個々の内部ペプチド標準の数に関する情報を提供する。同じ考慮が、第１のタグ（単数または複数）および第２のタグ（単数または複数）が特定の標識を必要としないが、第１のタグ（単数または複数）および第２のタグ（単数または複数）が、その化学的および／または物理的特徴のために、標識によって別に付与される情報を提供する場合に当てはまる。このように構成する場合の一例および実施形態として、第１および／または第２のタグの配列（単数または複数）が、それぞれの第１のペプチドの配列のコードを表すような方法での、第１および／または第２のタグ（単数または複数）の配列（単数または複数）の作製のための規定されたアミノ酸残基のコンビナトリアルケミストリーにおける使用がある。言い換えれば、特定の第１および／または特定の第２のタグは、特定の第１のペプチドを示し、特定の第１および／または第２のタグの同定および／または定量化は、事実上、第１のペプチドの同定および／または定量化である。したがって、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法において、第２の特定の第１のペプチドを示す第２の特定の第１および／または第２の特定の第２のタグがある場合には、第２の第１のペプチドが、標的ポリペプチド、好ましくは、第２の標的ポリペプチドのプロテオタイプのペプチドであるという条件で、種々のポリペプチドの混合物において前記の第１のペプチドと前記の第２の第１のペプチド間を識別し得る。

第２の態様では、本発明は、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法に関する。

第１の基本的な実施形態では、本発明の種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法は、以下の工程：
ａ）好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供する工程と；
ｂ）本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを添加し、好ましくは、本発明の内部ペプチド標準の量または本発明の内部ペプチド標準のパネルの量が未知であり、それによって、スパイクされた混合物を作製する工程と；
ｃ）スパイクされた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、内部ペプチド標準（単数または複数）から第１のタグおよび／または第２のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出し、複数のペプチドが、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドと内部標準から放出された第１のペプチドとを含む工程と；
ｄ）スパイクされた混合物中に含有される第１および／または第２のタグの量を決定することならびにそれから工程ｂ）において添加された内部標準（単数または複数）の量を決定する工程と；
ｅ）各々、ｃ）において作製された、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定する工程と；
ｆ）工程ｄ）において決定された内部標準（単数または複数）の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出する工程と
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法である。本発明の内部ペプチド標準の量または本発明の内部ペプチド標準のパネルの量に、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物が添加され、それによってスパイクされた混合物を作製することは、当業者には認められよう。

この第１の基本的な実施形態では、本発明の内部ペプチド標準の量は、種々のポリペプチドの混合物に、このような内部ペプチド標準が添加される場合には未知である。第１のタグおよび／または第２のタグは、プロテオタイプのペプチドが配列特異的加水分解によって種々のポリペプチドの混合物から作製される場合に第１のペプチドから切断除去されるだけであり、そのために、例えば、本明細書に開示されるような配列特異的加水分解が使用され得る。この第１の基本的実施形態では、プロテオタイプのペプチドの放出ならびに第１および第２のタグのいずれかまたは両方、好ましくは、第１のタグの放出をもたらす配列特異的加水分解は、配列特異的加水分解のための同一手段によって達成されることが好ましい。

第１の基本的実施形態では、工程ｃ）において配列特異的加水分解のための手段で処理された後のスパイクされた混合物は、分画工程に付され得る。このような分画工程は、クロマトグラフィー手順によって、好ましくは、液体クロマトグラフィーによって実施され得る。このような分画工程の目的は、工程ｃ）を実施した際に得られた反応混合物の複雑性を低減することである。このような工程ｃ）において、前記混合物中に含有されるポリペプチドの種の数に応じて、種々のポリペプチドの混合物の配列特異的加水分解によって膨大な数のペプチドが生じ得るということは、当業者には認められよう。生体サンプル、より詳しくは、細胞または臓器の溶解物などの複雑な混合物では、配列特異的加水分解は、最終的に、何十万種のペプチドの生成をもたらし得る。工程ｃ）を実施した際に得られた反応混合物の複雑性を低減することによって、スパイクされた混合物中に含有される第１および／または第２のタグの量を決定する工程ならびにそれから工程ｂ）において添加された内部標準（単数または複数）の量を決定する工程、より好ましくは、工程ｅ）の主題として、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定する工程が、より容易に実施され得、分析装置の性能は、あまり進歩していないものであってもよい。

第１の基本的実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ｃ）の後、工程ｅ）の前に、処理されたスパイク混合物、すなわち、工程ｃ）を実施した後に得られた反応混合物が分離工程に付されて、第１のペプチドおよび種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが、処理されたスパイク混合物の成分から分離される。この実施形態は、事実上、直前の実施形態の極めて特定の実施形態である。

第１の基本的な実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ｃ）の後、工程ｅ）の前に、処理されたスパイク混合物が分離工程に付されて、処理されたスパイク混合物の成分から第１および第２のタグが分離される。この分離工程によって、第１および／または第２のタグは、工程ｃ）を実施した後に得られた反応混合物から除去される。第１のタグおよび／または第２のタグのこのような分離は、第１および／または第２のタグの検出および定量化が、工程ｃ）を実施した後に得られた反応混合物中に含有されるその他の化合物によって妨げられないか、または不明瞭にされない限り有利であり得る。これによって、第１および／または第２のタグの検出および定量化のための、より高い正確度および／またはより少ない複雑性の分析方法が可能となる。

第２の基本的な実施形態では、本発明の種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法は、
ａ）好ましくは、標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
ｂ）本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを提供し、好ましくは、内部ペプチド標準および／または内部ペプチド標準のパネルの提供された量が未知であり、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第１のタグおよび／または第２のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出することと；
ｃａ１）工程ａ）の種々のポリペプチドの混合物に、工程ｂ）の実施において得られた反応混合物を添加することもしくは工程ｂ）の実施において得られた反応混合物に、工程ａ）の種々のポリペプチドの混合物を添加することおよび
ｃａ２）工程ｃａ１）の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと；
または
ｃｂ１）工程ａ）の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと；および
ｃｂ２）工程ｃｂ１）の実施において得られた混合物に、工程ｂ）の実施において得られた反応混合物を添加することもしくは工程ｂ）の実施において得られた反応混合物に、工程ｃｂ１）の実施において得られた混合物を添加すること
のいずれかによって、工程ｃａ２）およびｃｂ２）の後に、それぞれ、スパイクされた混合物が得られることと；
ｄ）スパイクされた混合物中に含有される第１および／または第２のタグの量を決定することならびにそれから工程ｂ）において添加された内部標準（単数または複数）の量を決定することと；
ｅ）スパイクされた混合物中の、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
ｆ）工程ｄ）において決定された内部標準（単数または複数）の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法である。

この第２の基本的な実施形態では、２つの基本的な代替案があり得る。第１の代替案では、工程ｃａ１）およびｃａ２）が実施される。第２の代替案では、工程ｃｂ１）およびｃｂ２）が実施される。それにもかかわらず、この第２の実施形態では、内部ペプチド標準（単数または複数）を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理することは、好ましくは、標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物の処理とは別個に達成される。

第２の基本的な実施形態では、工程ｃａ２）の実施後に、または工程ｃｂ１）もしくはｃｂ２）の実施後に得られた反応混合物は、分画工程に付され得る。このような分画工程は、クロマトグラフィー手順によって、好ましくは、液体クロマトグラフィーによって実施され得る。このような分画工程の目的は、工程ｃａ２）を実施した際に得られた反応混合物または工程ｃｂ１）もしくはｃｂ２）を実施した際に得られた反応混合物の複雑性を低減することである。前記工程ｃａ２）、ｃｂ１）およびｃｂ２）では、前記混合物中に含有されるポリペプチドの種の数に応じて、種々のポリペプチドの混合物の配列特異的加水分解によって膨大な数のペプチドが生じ得るということは、当業者には認められよう。生体サンプル、より詳しくは、細胞または臓器の溶解物などの複雑な混合物では、配列特異的加水分解は、最終的に、何十万種のペプチドの生成をもたらし得る。それぞれ、工程ｃａ２）、ｃｂ１）およびｃｂ２）を実施した際に得られた反応混合物の複雑性を低減することによって、スパイクされた混合物中に含有される第１および／または第２のタグの量を決定する工程ならびにそれから添加された内部標準（単数または複数）の量を決定する工程、より好ましくは、工程ｅ）の主題として、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定する工程が、より容易に実施され得、分析装置の性能は、あまり進歩していないものであってもよい。この実施形態に関連して、スパイクされた混合物はまた、工程ｃａ２）およびｃｂ２）の実施後に得られ、前記分画工程に付されている反応混合物も指す。

第２の基本的な実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ｅ）の前に、処理されたスパイク混合物、すなわち、工程ｃａ２）、ｃｂ１）またはｃｂ２）を実施した後に得られた反応混合物は分離工程に付されて、第１のペプチドおよび種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが、処理されたスパイク混合物の成分から分離される。この実施形態は、事実上、直前の実施形態の極めて特定の実施形態である。この実施形態に関連して、スパイク混合物はまた、工程ｃａ２）およびｃｂ２）の実施後に得られ、前記分離工程に付されている反応混合物も指す。

第２の基本的な実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ｄ）の前に、処理されたスパイク混合物は分離工程に付されて、処理されたスパイク混合物の成分から第１および第２のタグが分離される。この分離工程によって、第１および／または第２のタグは、工程ｃ）を実施した後に得られた反応混合物から除去される。第１のタグおよび／または第２のタグのこのような分離は、第１および／または第２のタグ検出および定量化が、工程ｃａ２）、ｃｂ１）およびｃｂ２）を実施した後に得られた反応混合物中に含有されるその他の化合物によって妨げられないか、または不明瞭にされない限り有利であり得る。これによって、第１および／または第２のタグの検出および定量化のための、より高い正確度および／またはより少ない複雑性の分析方法が可能となる。この実施形態に関連して、スパイクされた混合物はまた、工程ｃａ２）およびｃｂ２）の実施後に得られ、前記分離工程に付されている反応混合物も指す。

第２の基本的な実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ｂ）において使用される配列特異的加水分解のための手段は、工程ｃａ１）またはｃｂ１）の実施に先立って工程ｂ）の実施において得られた混合物から除去される。このような手段は、当業者に公知である。配列特異的加水分解のための手段を除去するための手順の限定されない例として、液体クロマトグラフィー、高性能逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーがある。この実施形態において使用されるように、配列特異的加水分解のための手段の除去はまた、このような手段の不活性化も包含する。例えば、手段は、酵素であり、この酵素は、熱処理によって、ｐＨシフトまたは酵素活性に対する阻害剤の添加によって不活化され得る。

第３の基本的実施形態では、本発明の種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法は、
ａ）本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを提供し、本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルの量が未知であり、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルを、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルから第１のタグおよび／または第２のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出することと；
ｂ）配列特異的加水分解のための手段を、所望により除去することと；
ｃ）工程ｂ）のａ）の実施から得られた混合物中に含有されている第１および／または第２のタグの量を決定することならびにそれから前記混合物中に含有された内部標準の量を決定することと；
ｄ）好ましくは、標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
ｄａ１）工程ｄ）の種々のポリペプチドの混合物に、工程ａ）もしくはｂ）の実施において得られた反応混合物の一部を添加することもしくは工程ａ）もしくはｂ）の実施において得られた反応混合物の一部に、工程ｄ）の種々のポリペプチドの混合物を添加することおよび
ｄａ２）工程ｄａ１）の実施において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドが、プロテオタイプのペプチドを含むこと；
または
ｄｂ１）工程ｄ）の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと；および
ｄｂ２）工程ｄｂ１）の実施において得られた混合物に、工程ａ）またはｂ）の実施において得られた混合物の一部を添加することもしくは工程ａ）もしくはｂ）の実施において得られた混合物の一部を添加することに、工程ｄｂ１）の実施において得られた混合物を添加すること；
のいずれかによって、工程ｄａ２）およびｄｂ２）後にそれぞれ、スパイクされた混合物が得られることと；
ｅ）スパイクされた混合物中の、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
ｆ）内部標準（単数または複数）の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
を含む、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む方法である。

この第３の基本的実施形態では、２つの基本的な代替案があり得る。第１の代替案では、工程ｄａ１）およびｄａ２）が実施される。第２の代替案では、工程ｄｂ１）およびｄｂ２）が実施される。それにもかかわらず、この第２の実施形態では、内部ペプチド標準（単数または複数）を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理することは、好ましくは、標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物の処理とは別個に達成され、さらに、工程ｃ）として、工程ｂ）のａ）の実施から得られた混合物中に含有される第１および／または第２のタグの量が決定され、それから、前記混合物中に含有される内部標準の量が決定される。それと一致して、好ましくは標的ポリペプチドを含有するこのような種々のポリペプチドの混合物が、方法のその段階で配列特異的加水分解に付されているかどうかにかかわらず、反応、工程ａ）またはｂ）の実施において得られた反応混合物の一部を添加することで、好ましくは、前記反応混合物の既知アリコートによって、好ましくは標的ポリペプチドを含有する種々のポリペプチドの混合物に、内部ペプチド標準の既知量が添加される。

第３の基本的実施形態では、工程ｄａ２）の実施後に、または工程ｄｂ１）またはｄｂ２）の実施後に得られた反応混合物は、分画工程に付され得る。このような分画工程は、クロマトグラフィー手順によって、好ましくは、液体クロマトグラフィーによって実施され得る。このような分画工程の目的は、工程ｄａ２）を実施した際に得られた反応混合物または工程ｄｂ１）もしくはｄｂ２）を実施した際に得られた反応混合物の複雑性を低減することである。前記工程ｄａ２）、ｄｂ１）およびｂ２）では、前記混合物中に含有されるポリペプチドの種の数に応じて、種々のポリペプチドの混合物の配列特異的加水分解によって膨大な数のペプチドが生じ得るということは、当業者には認められよう。生体サンプル、より詳しくは、細胞または臓器の溶解物などの複雑な混合物では、配列特異的加水分解は、最終的に、何十万種のペプチドの生成をもたらし得る。それぞれ、工程ｄａ２）、ｄｂ１）およびｄｂ２）を実施した際に得られた反応混合物の複雑性を低減することによって、工程ｅ）の主題として、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定する工程が、より容易に実施され得、分析装置の性能は、あまり進歩していないものであってもよい。特に、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比が、質量分析によって決定される場合には、低い解像度を有する質量分析計が使用されてもよく、これによって、本発明の方法が、自由に使える最新式の質量分析計を有さない実験室によっても使用され得ることが可能となる。この実施形態に関連して、スパイクされた混合物はまた、前記分画工程に付されており、工程ｄａ２）およびｄｂ２）の実施後に得られる反応混合物も指す。

第３の基本的実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ｅ）の前に、処理されたスパイク混合物、すなわち、工程ｄａ２）、ｄｂ１）またはｄｂ２）を実施した後に得られた反応混合物は分離工程に付されて、第１のペプチドおよび種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが、処理されたスパイク混合物の成分から分離される。この実施形態は、事実上、直前の実施形態の極めて特定の実施形態である。この実施形態に関連して、スパイク混合物はまた、前記分画工程に付されており、工程ｄａ２）およびｄｂ２）の実施後に得られる反応混合物も指す。

第３の実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ｄａ１）の前に、工程ａ）またはｂ）の実施において得られた反応混合物は分離工程に付されて、前記反応混合物の成分から第１および第２のタグが分離される。第１のタグおよび／または第２のタグのこのような分離は、第１および／または第２のタグ検出および定量化が、工程ｄａ２）、ｄｂ１）およびｄｂ２）を実施した後に得られた反応混合物中に含有されるその他の化合物によって妨げられないか、または不明瞭にされない限り有利であり得る。これによって、第１および／または第２のタグの検出および定量化のための、より高い正確度および／またはより少ない複雑性の分析方法が可能となる。この実施形態に関連して、スパイクされた混合物はまた、工程ｄａ２）、ｄｂ１）およびｃｂ２）の実施後に得られ、前記分離工程に付されている反応混合物も指す。第３の実施形態に従う方法の代替実施形態では、工程ｄｂ２）の前に、工程ｄｂ１）の実施において得られた反応混合物は分離工程に付されて、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドが、前記反応混合物の成分から分離される。この実施形態は、事実上、分画工程を含む上記の実施形態の極めて特定の実施形態である。この実施形態に関連して、スパイクされた混合物はまた、工程ｄａ２）、ｄｂ１）およびｄｂ２）の実施後に得られ、前記分離および／または分画工程に付されている反応混合物も指す。

第３の実施形態に従う方法の一実施形態では、工程ａ）において使用される配列特異的加水分解のための手段は、工程ｃ）またはｄ）を実施する前に、工程ａ）の実施において得られた混合物から除去される。第３の基本的実施形態に従う方法のさらなる実施形態では、配列特異的加水分解のための手段は、工程ｄａ１）において、または工程ｄｂ１）において使用されると、工程ｅ）を実施する前に除去される。このような手段は、当業者に公知である。配列特異的加水分解のための手段を除去するための手順の限定されない例として、液体クロマトグラフィー、高性能逆相液体クロマトグラフィー、サイズ排除クロマトグラフィー、電気泳動、キャピラリー電気泳動、ゲル電気泳動およびアフィニティークロマトグラフィーがある。この実施形態において使用されるように、配列特異的加水分解のための手段の除去はまた、このような手段の不活性化も包含する。例えば、手段は、酵素であり、酵素は、熱処理または酵素活性に対する阻害剤の添加によって不活化され得る。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法の第１、第２および第３の基本的実施形態の各々およびいずれかにおいて、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが、少なくとも１種の質量標識を含むことが好ましい。質量標識の使用によって、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することが可能になる。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法に関連して、内部ペプチド標準から放出された第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比は、質量分析によって決定されることが好ましい。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法の第１、第２および第３の基本的実施形態の各々およびいずれかにおいて、質量標識は、Ｃ同位体およびＮ同位体を含む群から選択されることが好ましい。適したＣ同位体およびＮ同位体は、当業者に公知である。好ましいＣ同位体は、質量分析によって、第１のタグおよび／または第２のタグおよび／または第１のペプチドおよび／またはプロテオタイプ（proteotpyic）のペプチドの識別、好ましくは、第１のペプチドをプロテオタイプのペプチドと識別することを可能にするものである。このような好ましいＣ同位体は、^１３Ｃ同位体を含む群から選択されることが好ましい。好ましいＮ同位体は、質量分析によって、第１のタグおよび／または第２のタグおよび／または第１のペプチドおよび／またはプロテオタイプのペプチドの識別、好ましくは、第１のペプチドをプロテオタイプのペプチドと識別することを可能にするものである。このような好ましいＮ同位体は、^１５Ｎ同位体を含む群から選択されることが好ましい。この実施形態では、内部ペプチド標準は、好ましくは標的ポリペプチドおよびプロテオタイプのペプチドそれぞれを含有する種々のポリペプチドの混合物の同位体と比較して、重いまたは軽い同位体を含有し得る。しかし、好ましくは標的ポリペプチドおよびプロテオタイプのペプチドをそれぞれ含有する種々のポリペプチドの混合物が、内部ペプチド標準中に含有される同位体と比較して、重いまたは軽い同位体を含有し得ることも本発明の範囲内である。このような同位体は、それぞれの同位体（単数または複数）を含有するこのような内部ペプチド標準のビルディングブロックの使用によって、内部ペプチド標準中に組み込まれ得、ならびに／または、このような同位体は、このような同位体（単数または複数）を有するこのような種々のポリペプチドおよびプロテオタイプのペプチドのビルディングブロックを使用することによって、好ましくは標的ポリペプチドおよびプロテオタイプのペプチドをそれぞれ含有する種々のポリペプチドの混合物の種々のポリペプチド中に組み込まれ得る。種々のポリペプチドまたは種々のポリペプチドの混合物が、細胞、組織、臓器または生物体などの生物システムから導かれる場合には、それぞれ標識された種々のポリペプチドおよびプロテオタイプのペプチドは、このような 生物システムに、このような種々のポリペプチドおよびプロテオタイプのペプチドの標識されたビルディングブロックまたは前駆体をそれぞれ供給することによって得られ得る。

異なって標識された第１のペプチドおよびプロテオタイプのペプチドの使用に起因する分子量のこの相違のために、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を、好ましくは、質量分析によって決定することが可能である。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法の第１、第２および第３の基本的実施形態の各々およびいずれかにおいて使用されるように、質量分析（Mass spectromertry）は、当業者に公知であり、例えば、Gsteiger and Aebersold，Nat. Rev. Genet. 10, 2009に記載されている。好ましい実施形態では、質量分析は、多段質量分析である。Pan et al., J. Proteome Res. 8, 2009。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法の第１、第２および第３の基本的実施形態の各々およびいずれかでは、ペプチドの存在に特徴的であるフラグメンテーションによって得られるペプチドサインは、プロテオタイプのペプチドについて、ひいては、第１のペプチドについても公知であることが好ましい。その一実施形態では、フラグメンテーションによって得られるペプチドサインが、好ましくは、タンデム質量分析計における、それに続く分析に付される。フラグメンテーションのための方法は、当業者に公知であり、衝突誘起解離（例えば、Wells JM, McLuckey SA (2005). 「Collision-induced dissociation (CID) of peptides and proteins」Meth. Enzymol. 402: 148-85参照のこと）、電子捕獲解離（例えば、Zubarev RA, Kelleher NL, McLafferty FW (1998).「Electron capture dissociation of multiply charged protein cations. A nonergodic process」J. Am. Chem. Soc. 120 (13): 3265-66参照のこと）、電子移動解離（例えば、Syka JE, Coon JJ, Schroeder MJ, Shabanowitz J, Hunt DF (2004).「Peptide and protein sequence analysis by electron transfer dissociation mass spectrometry」Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101 (26): 9528-33参照のこと）、赤外多光子解離（例えば、Little DP, Speir JP, Senko MW, O'Connor PB, McLafferty FW (1994).「Infrared multiphoton dissociation of large multiply charged ions for biomolecule sequencing」 Anal. Chem. 66 (18): 2809-15参照のこと、黒体赤外放射解離（例えば、Schnier PD, Price WD, Jockusch RA, Williams ER (1996).「Blackbody Infrared Radiative Dissociation of Bradykinin and Its Analogues: Energetics、Dynamics、and Evidence for Salt-Bridge Structures in the Gas Phase」Journal of the American Chemical Society 118 (30): 7178-7189参照のこと）を含む群から選択される。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法の第１、第２および第３の基本的実施形態の各々およびいずれかでは、本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部標準のパネルは、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の前記方法における使用の前に精製される。好ましい実施形態では、精製は、第２のタグに基づいている、または利用する。このような実施形態では、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルの合成の副生成物は、内部ペプチド標準または内部ペプチド標準のパネルが、同様に本明細書に開示される表面に、固定もしくは付着されながら、または固定もしくは付着されて、反応混合物から除去されることが好ましい。代替実施形態では、本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルは、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の前記方法における使用の前に精製されない。このような代替実施形態では、本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルは、内部ペプチド標準を調製するための本発明の方法から得られるように使用され得る。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法の第１、第２および第３の基本的実施形態の各々およびいずれかでは、内部ペプチド標準の量または内部ペプチド標準のパネルの量は、前記内部ペプチド標準（単数または複数）に付着されている第１のタグまたは第２のタグ、好ましくは、第１のタグの量に基づいて決定されることが好ましい。その一実施形態では、タグは、当業者に公知の蛍光標識を含み、その一部の限定されない例が本明細書に開示されている。タグの量は、標識の蛍光シグナルを測定することによって決定される。代替実施形態では、タグは、当業者に公知のＵＶ標識を含み、その一部の限定されない例が本明細書に開示されている。タグの量は、標識のＵＶシグナルを測定することによって決定される。

種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法の第１、第２および第３の基本的実施形態の各々およびいずれかでは、好ましくは、種々のポリペプチドの混合物は、好ましくはサンプルである。一実施形態では、このようなサンプルは、少なくとも１種のポリペプチド、好ましくは、２種以上のポリペプチドを含有する。サンプルは、生体サンプルであっても、非生体サンプルであってもよい。生体サンプルは、生体物質から得られるサンプルであり得る。生体物質は、体液サンプル、細胞またはその一部の溶解物または調製物、組織またはその一部の溶解物または調製物、臓器またはその一部の溶解物または調製物、完全生物体またはその一部の溶解物または調製物、発酵ブロスまたはその一部および細胞培養液またはその一部を含む群から選択され得る。体液サンプルは、体液が、血液、血漿、血清、尿、髄液（liquor）、痰、糞便を含む群から選択される体液のサンプルであり得る。非生体サンプルは、化学反応から得られるサンプルであり得る。化学反応は、ポリペプチドの合成または翻訳後修飾をシミュレートするポリペプチドの化学修飾のプロセスであり得る。

種々のポリペプチドの混合物が、好ましくは、標的ポリペプチドを含有すると本発明の方法において示される限り、好ましくは、これは、混合物は、前記標的ポリペプチドを含有するか、または前記標的ポリペプチドを含有しないかのいずれかであることを意味する。好ましい実施形態では、混合物は、前記標的ポリペプチドを含有する。混合物が前記標的ポリペプチドを含有しない場合には、その量は決定され得ないということは、当業者には明らかである。それにもかかわらず、種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定するための本発明の方法を実施する場合、混合物は、前記標的ポリペプチドを含有しないという知見は、すでに、前記方法によって得られる価値ある情報および価値ある結果を構成し得る。

化合物、容器反応混合物または同様のものに添加される本発明の内部ペプチド標準の量または本発明の内部ペプチド標準のパネルの量が未知であると本発明の方法において示される限り、好ましくは、これは、前記化合物、容器、反応混合物または同様のものに添加される、本発明の内部ペプチド標準の分子数または本発明の内部ペプチド標準のパネルの分子数は未知であることを意味する。それに関連して、本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルの添加は、好ましくは、前記の本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを含有する液体のアリコートを移すことによって生じるということは、当業者には認められよう。本発明の方法の実施において、アリコートの容量は公知であることが好ましい。しかし、アリコートの容量が公知ではないことも本発明の範囲内である。しかし、特に、後者の実施形態では、前記化合物、容器、反応混合物または同様のものに、前記の本発明の内部ペプチド標準または本発明の内部ペプチド標準のパネルを添加することによって得られる反応混合物の容量が、公知であることが好ましい。

好ましく使用されるように、例えば、「１〜５」などの範囲の限界を特定する任意の表現は、１〜５の任意の整数、すなわち、１、２、３、４および５を意味する。言い換えれば、２つの整数によって規定されている任意の範囲は、前記の定義の限界を規定する２つの整数および前記範囲によって含まれる、または前記範囲内に含有される任意の整数を両方とも含む。

本発明のさらなる特徴、実施形態および利点は、以下の図および実施例からとられ得る。

図１は、本発明の内部ペプチド標準の作製を示す模式図である。 図２は、本発明の精製された内部ペプチド標準の定量化を示す模式図である。 図３は、キャッピング工程を用いて合成される、本発明の精製されていない内部ペプチド標準の定量化を示す模式図である。 図４は、ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析される、精製されていない内部ペプチド標準の定量化を示す模式図である。 図５は、内部ペプチド標準の酵素的切断を用いる、第１のタグ中に組み込まれた発色団の適合性を示す実験を示す模式図である。 図６は、実施例２において論じられる、トリプシン消化の前および後の第１のタグで標識された第１のペプチドの実行の特徴を示すクロマトグラムである。 図７は、メタ−ニトロ−チロシンを含有する第１のタグの組成を示す。 図８は、実施例３において論じられる、メタ−ニトロ−チロシンを含有するアセチル化された第１のタグのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを示す。 図９は、ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって分析された精製されていない内部ペプチド標準の定量化の結果を示す。 図１０は、第１および第２のタグの両方を含む内部ペプチド標準の作製および使用を示す模式図である。 図１１は、内部ペプチド標準の支持体なし（off-support）切断を示す模式図である。 図１２は、内部ペプチド標準の支持体あり（on-support）切断を示す模式図である。 図１３は、精製された内部ペプチド標準の切断によって放出された第１のペプチドを定量化するための種々の選択肢を示す模式図である。 図１４は、デスチオ−ビオチンを含有する第２のタグの組成を示す。 図１５は、蛍光標識を含有する第１および第２のタグの組成を示す。 図１６は、支持体上へのペプチド誘導体の固定に使用され得る種々の化学選択的化学反応を示す。 図１７は、支持体上へのペプチド誘導体の固定に使用され得る種々の化学選択的化学反応を示す。 図１８は、図７に示される第１のタグの濃度の関数としての吸収単位を示す図であり、これによって吸収が３５０ｎｍまたは４１０ｎｍのいずれかで決定される。 図１９は、５種の異なる標識されたペプチドおよび標準Ａｃ−ＳＡ−ニトロＴｙｒ−Ｒ−ＯＨの定量化のための直線の検量線を示す。

図１は、本発明の内部ペプチド標準の作製の模式図である。図１Ａ）では、ａ）予備合成された第１のタグが、予備合成された第１のペプチドに１工程で融合され、内部ペプチド標準が得られる。図１Ｂ）に示されるように、第１のタグが段階的に合成される場合には、ＥＰ０６５１７６２に記載されるものなどの最先端のペプチド合成プロトコールに従って、追加のアミノ酸が段階的に加えられる。最後のアミノ酸残基をカップリングした後、第１のペプチドのアミノ酸配列が完了し、固体合成支持体からの保護基の除去および化合物の任意選択の除去の後に、内部ペプチド標準の合成が完了する。

図２は、本発明の精製された内部ペプチド標準の定量化を示す模式図である。理想的には、１００％純粋または少なくとも９８％純粋または９５％純粋な、精製された内部ペプチド標準が、配列特異的切断のための手段を用いて切断され、規定の比の第１のタグおよび第１のペプチドを放出する。好ましくは、比は、１：１である。切断反応がほぼ１００％である場合および出発純度が高い場合には、放出される第１のタグの量は、放出される第１のペプチドの量に比例する。

図３は、キャッピング工程を用いて合成される、本発明の精製されていない内部ペプチド標準の定量化を示す模式図である。この実施形態では、内部ペプチド標準は、改変された手順によって合成される。各カップリング工程の後であって保護基の各除去の前に、追加のキャッピング工程が導入される。例えば、適宜活性化された酢酸が使用される場合には、不完全なカップリング工程に起因する副生成物がアセチル化され、それによって、化学的に反応性ではなくなる。第１のペプチドの合成の最後に、第１のタグが加えられる。キャッピング工程のために、第１のタグは、第１のペプチドのみと反応し、アセチル化された不純物とは反応しない。合成の最後に、第１のタグを保持しないアセチル化された不純物とともに、所望の内部ペプチド標準が作製される。切断反応の後に、第１のタグが、第１のペプチドのみから放出され得る。したがって、この場合には、放出される第１のタグの量は、放出される（release）第１のペプチドの量を示す。

図４は、ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析される、精製されていない内部ペプチド標準の定量化を示す模式図である。内部ペプチド標準が、合成され、ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を備えた質量分析計に接続されたＨＰＬＣによって分析される。ＨＰＬＣ実施の間に、内部ペプチド標準が、依然として第１のタグを保持する不純物から分離される。内部ペプチド標準のシグナルは、ＨＰＬＣに接続された質量分析計によって同定され得る。第１のペプチドと結合している第１のタグの相対量は、ＨＰＬＣ実施のＵＶ−Ｖｉｓトレースから算出され得る。この算出によって、内部標準の相対量が、精製されていない内部ペプチド標準内のパーセントで得られる。適当な切断反応の後に、放出された第１のタグの量が測定され、次いで、出発物質の相対量に対して補正される。この実施例では、ＵＶ−Ｖｉｓトレースによって、質量トレースによって同定された内部ペプチド標準に対応している、ペプチドを含有するすべての第１のタグの２２％が得られた。切断後に、放出された第１のタグの測定された総量は、内部ペプチド標準の２２％の含量を反映して、０．２２の係数によって補正されなければならない。

図７は、メタ−ニトロ−チロシンを含有する第１のタグの組成を示した。第１のタグの組成は、天然に存在するアミノ酸残基の一文字コードを使用して示されている。この化合物は、プロテアーゼトリプシンを使用する切断に対して最適化された第１のタグの代表例である。セリンおよびアラニン残基が、Ｐ１’およびＰ２’位をそれぞれ占めている。発色団含有アミノ酸残基メタ−ニトロ−チロシンは、Ｐ３’位に対して最適化されている。Ｐ４’位では、アルギニン残基が使用される。修飾されたアミノ酸残基メタ−ニトロ−チロシンの構造が示されている。この残基のヒドロキシル基のプロトン化状態に応じて、芳香族環構造は、強い吸光度を有し、ヒドロキシルのプロトン化状態については３５０ｎｍで最大であり、ヒドロキシル基の解離した形態については４１０ｎｍで最大である。

図１０は、第１および第２のタグの両方を含む内部ペプチド標準の作製および使用を示す模式図である。より複雑なペプチド標準は、図１０に示されるようなペプチド合成を使用して製造され得る。段階的合成によるまたは予備合成されたタグの固相支持体への直接的な付着のいずれかによる固相支持体上での第１のタグの作製後に、第１のペプチドとそれに続く第２のタグが、段階的に合成される。あるいは、第１のペプチドが、第１のタグに付着され、次いで、第２のタグが、結合している第１のペプチド−第１のタグ構造に付着される。さらに、段階的合成および予備合成された構造の付着の組合せがあり得る。

図１１は、第１のタグおよび第２のタグの両方を含む内部ペプチド標準の支持体なし切断を示す模式図である。第２のタグを介して支持体に固定された内部ペプチド標準は、洗浄工程の後に支持体から放出され得る。これらの洗浄工程は、特異的に結合しなかったか、または共有結合を形成しなかったペプチド合成の副生成物を除去する。放出された、精製された内部ペプチド標準は、切断され、第２および第１のタグと一緒に、第１のペプチドを生成し得る。第１のタグおよび／または第２のタグは、切断反応によって生じた第１のペプチドの量の定量化に使用され得る。

図１２は、第１のタグおよび第２のタグの両方を含む内部ペプチド標準の支持体あり切断を示す模式図である。第２のタグを介して支持体に固定された内部ペプチド標準は、洗浄工程の後に支持体上で直接的に切断され得る。これらの洗浄工程は、特異的に結合しなかったか、または共有結合を形成しなかったペプチド合成の副生成物を除去する。精製されたが、依然として固定されている内部ペプチド標準は、支持体上で切断され、第１のタグと一緒に、第１のペプチドを生成し得る。第２のタグは、依然として支持体に結合されている（図では示されていない）。第１のタグは、切断反応によって生成した第１のペプチドの量の定量化に使用され得る。

図１４は、デスチオ−ビオチンを含有する第２のタグの組成を示す。第２のタグの組成は、天然に存在するアミノ酸残基の３文字コードを使用して示されている。この示される第２のタグは、プロテアーゼトリプシンを使用する切断のために最適化された第２のタグの一実施形態である。アルギニン残基が、Ｐ１位を占めている。プロリン残基は、Ｐ２位で、プロテアーゼトリプシンによって好ましいものであるとわかっている。アラニン残基は、Ｐ３位において良好に受け入れられている。デスチオ−ビオチンは、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン／デスチオビオチン結合タンパク質を用いて修飾された支持体との選択的結合を可能にする、第２のタグ内の反応性部分として使用される。デスチオ−ビオチン残基を、アミノ酸残基から離して配置し、デスチオ−ビオチンの、デスチオ−ビオチン結合支持体上の結合ポケットとの効果的な相互作用を可能にするために、リンカー分子、Ｔｔｄｓが導入された。リンカーの化学的構造は、デスチオ−ビオチンの化学的構造と一緒に示されている。デスチオ−ビオチンは、タンパク質ストレプトアビジンまたはアビジンとのデスチオ−ビオチンの親和性が、ビオチンの親和性よりもかなり低いために、ビオチンの代わりに使用される。これによって、デスチオ−ビオチン修飾された化合物と効果的に競合する試薬としてビオチンを使用して、結合されたデスチオ−ビオチン含有内部ペプチド標準の支持体からの溶出が可能になる。

図１５は、蛍光標識を含有する第１および第２のタグの組成を示す。第１のタグおよび第２のタグの組成は、天然に存在するアミノ酸残基の３文字コードを使用して示されている。示される第１のタグおよび第２のタグは各々、プロテアーゼトリプシンを使用する切断に対して最適化された第１および第２のタグ表す。第１のタグでは、セリンおよびアラニン残基は、Ｐ１’およびＰ２’位をそれぞれ占めている。フルオロフォア含有アミノ酸残基Ｃａｌ＝β−７−メトキシ−クマリル−アラニンは、Ｐ３’位に対して最適化されている。Ｐ４’位では、グリシン残基が使用される。第２のタグでは、アルギニン残基がＰ１位を占めている。プロリン残基は、Ｐ２位で、プロテアーゼトリプシンによって好ましいものであるとわかっている。Ｃａｌ＝β−７−メトキシ−クマリル−アラニン残基は、切断媒介プロテアーゼとしてトリプシンの場合には、Ｐ３位において良好に受け入れられている。そのアラニン誘導体では、置換クマリル残基が、より強い蛍光シグナルを生じた。デスチオ−ビオチンは、アビジンまたはストレプトアビジンのようなビオチン／デスチオビオチン結合タンパク質を用いて修飾された支持体との選択的結合を可能にする、第２のタグ内の反応性部分として使用される。デスチオ−ビオチン残基を、アミノ酸残基から離して配置し、デスチオ−ビオチンの、デスチオ−ビオチン結合支持体上の結合ポケットとの効果的な相互作用を可能にするために、リンカー分子、Ｔｔｄｓが導入された。リンカーの化学的構造は、デスチオ−ビオチンの化学的構造と一緒に図１４に示されている。デスチオ−ビオチンは、タンパク質ストレプトアビジンまたはアビジンとのデスチオ−ビオチンの親和性が、ビオチンの親和性よりもかなり低いために、ビオチンの代わりに使用される。これによって、デスチオ−ビオチン修飾された化合物と効果的に競合する試薬としてビオチンを使用して、結合されたデスチオ−ビオチン含有内部ペプチド標準の支持体からの溶出が可能になる。

図１６は、支持体上へのペプチド誘導体の固定化のために使用され得る種々の化学選択的化学反応を示す。内部ペプチド標準と適宜修飾された支持体間の共有結合の化学選択的形成に適している４種の種々の化学反応が示されている。反応Ａ）では、アルデヒド（Ｒ_１＝水素）またはケトン（水素ではないＲ_１）が結合している支持体および内部ペプチド標準を含有するアミノオキシ部分が、オキシム結合の形成によって反応する。反応Ｂ）では、メルカプタンが結合している支持体および内部ペプチド標準を含有するマレイミドが、置換スクシンイミドの形成によって反応する。反応Ｃ）では、ヒドラジドが結合している支持体および内部ペプチド標準を含有するアルデヒドが、置換ヒドラゾンの形成によって反応する。反応Ｄ）では、キニンが結合している支持体および内部ペプチド標準を含有するシクロペンタジエンが、置換ディールス・アルダー付加物の形成によって反応する。

図１７は、支持体上へのペプチド誘導体の固定化のために使用され得るさらなる化学選択的化学反応を示す。内部ペプチド標準と適宜修飾された支持体間の共有結合の化学選択的形成に適している４種の種々の化学反応が示されている。反応Ａ）では、アルデヒド（Ｒ＝水素）またはケトン（水素ではないＲ）が結合している支持体および内部ペプチド標準内の置換ヒドロキシル−アミンが、ニトロンの形成によって反応する。反応Ｂ）では、アルデヒド（Ｒ＝水素）が結合している支持体および内部ペプチド標準を含有する芳香族アミノカルボキシルが、置換２，３，４ａ，８ａ−テトラヒドロ−１Ｈ−キナゾリン−４−オンの形成によって反応する。反応Ｃ）では、チオアミドが結合している支持体および内部ペプチド標準を含有するα−ブロモ−ケトンが、置換チアゾールの形成によって反応する。反応Ｄ）では、チオアミドが結合している支持体および内部ペプチド標準を含有する置換フェニレンジアミンが、置換ベンゾイミダゾールの形成によって反応する。

図１９は、５種の異なる標識されたペプチドの定量化のための直線の検量線を示す。すべてのペプチドは、３５０ｎｍでのＵＶ測定による定量化を可能にするＣ末端定量化タグ−ＳＡ−ニトロＴｙｒ−Ｒ−ＯＨを保持する（ペプチドＡ〜Ｅ、表１）。また、外部標準Ａｃ−ＳＡ−ニトロＴｙｒ−Ｒ−ＯＨの検量線が表されている。

内部ペプチド標準の酵素的切断を用いる、第１のタグに組み込まれた発色団の適合性
この実施例の基本的実験主題が図５に示されている。

天然に存在するアミノ酸残基の一文字コードとして示される所与の配列の内部標準ペプチドを、固相支持体上で段階的に合成した。第１のタグは、修飾されたアミノ酸残基（ニトロＴｙｒ＝３’−ニトロ−チロシン）を含有し、これは、３５０〜４１０ｎｍの間の波長で特定のＵＶ−Ｖｉｓ吸収をもたらした。ペプチドが固相支持体から放出され、プロテアーゼトリプシンを用いて３２℃で１時間処理した。切断反応の前および後に、ＨＰＬＣ−ＭＳ分析を実施して、切断反応の有効性を推定した。基本的実験が図５に示されている。

この実施例から、第１のタグへの発色団の組み込みは、内部ペプチド標準の酵素的切断と適合していると結論付けた。

内部ペプチド標準の切断の前および後の４１０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓトレース
天然に存在するアミノ酸残基の一文字コードを使用して図７に表される内部ペプチド標準を、ＨＰＬＣを使用して分析した。４１０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓトレースが示されている。図６Ａ）は、プロテアーゼトリプシンの添加前の反応溶液のＵＶトレースを示す。４１０ｎｍで吸収するメタ−ニトロ−チロシンを含有する内部ペプチド標準は、ＰＲ−１８カラムから約１．８５分の保持時間で溶出する。図６Ｂ）は、プロテアーゼトリプシンの添加および３２℃で１時間の反応混合物のインキュベーション後の反応溶液のＵＶトレースを示す。４１０ｎｍで吸収するメタ−ニトロ−チロシンを含有する放出された第１のタグは、ＰＲ−１８カラムから約０．８分の保持時間で溶出する。放出された第１のペプチドは、その波長では目に見えない。約１．８５分の保持時間で目に見える残存するシグナルはほとんどないので、切断反応は、１００％に近い切断率を有し、極めて有効であると思われる。

この実施例の根底にある実験の結果が、図６に示されている。

この結果は、第１のタグ中のメタ−ニトロ−チロシン残基が、プロテアーゼトリプシンによって媒介される切断反応に適合することを実証する。

メタ−ニトロ−チロシンを含有するアセチル化された第１のタグのＵＶ−Ｖｉｓスペクトル
アセチル化された第１のタグＳｅｒ−Ａｌａ−ｍニトロＴｙｒ−Ａｒｇの３００〜５００ｎｍの範囲のＵＶ−Ｖｉｓスペクトルが、図８に示されている。トリフルオロ酢酸を含有する種々のアセトニトリル／水混合物中のタグの溶液のスペクトルを記録した。トリフルオロ酢酸によって引き起こされる、これらの混合物のｐＨ値は、ｐＨ２の範囲にある。さらに、１５ｍＭ ＴＲＩＳバッファーｐＨ８．２中に溶解した、アセチル化されたタグＳｅｒ−Ａｌａ−ｍニトロＴｙｒ−ＡｒｇのＵＶ−Ｖｉｓスペクトルを記録した。測定された範囲における吸光度の最大は、ｐＨ８．２については約４２０ｎｍであるが、ｐＨ２．０については約３５５ｎｍである。その相違の原因は、メタ−ニトロ−チロシン残基の側鎖のプロトン化状態である。種々のプロトン化状態の種々の構造が示されている。左側に、プロトン化されたメタ−ニトロ−チロシン残基の構造が示されている。これは、ｐＨ２．０で主要な部分である。右側に、解離されたメタ−ニトロ−チロシン残基の構造が示されている。これは、ｐＨ８．２で主要な部分であり、ニトロ官能基に近接しているフェノール基の酸性特徴の増大によって引き起こされる。

種々の溶媒混合物の、ｐＨ２．０の極めて類似したＵＶ−Ｖｉｓスペクトルによって、ＨＰＬＣ勾配を使用するメタ−ニトロ−チロシンを含有する第１のタグの定量化が可能となる。３５５ｎｍでの総吸光度は、溶媒のアセトニトリル含量とはほぼ独立している。

ＨＰＬＣ−ＭＳによって分析される、精製されていない内部ペプチド標準の定量化
この定量化の結果が図９に示されている。

内部ペプチド標準は、ＵＶ−Ｖｉｓ検出器を備えたＨＰＬＣ−ＥＳＩ−ＭＳによって分析される。図９の上部に、２２０ｎｍでのＵＶトレースが示されている。標的内部ペプチド標準の他に、種々の不純物に相当するいくつかのシグナルがあり、２．４２５〜２．５０２分の保持時間領域内のＥＳＩマススペクトルにおいて同定され得る。図９の中央に、この場合には、２のｐＨ値で３５０ｎｍで特異的に吸収する発色団（メタ−ニトロ−チロシン）を備えた第１のタグを示す３５０ｎｍでのＵＶトレースが示されている。２２０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓトレースにおけるシグナルを、３５０ｎｍでのＵＶ−Ｖｉｓトレースにおけるシグナルと比較すると、副生成物のほぼすべてが第１のタグを有することが明確になる。それにもかかわらず、ＨＰＬＣ＿ＭＳシステムは、規定量のメタ−ニトロ−チロシンを含有する第１のタグを用いて較正される場合には、３５０ｎｍでの種々のピークの領域によって、各副生成物の、および標的内部標準ペプチドの正確な定量化が可能となる。

第１および第２のタグの両方を含む内部ペプチド標準の作製および使用
より複雑なペプチド標準は、図１０に示されるようなペプチド合成を使用して製造され得る。段階的合成によるまたは予備合成されたタグの固相支持体への直接的な付着のいずれかによる固相支持体上での第１のタグの作製後に、第１のペプチドとそれに続く第２のタグが、段階的に合成される。あるいは、第１のペプチドが、第１のタグに付着され、次いで、第２のタグが、結合している第１のペプチド−第１のタグ構造に付着される。さらに、段階的合成および予備合成された構造の付着の組合せがあり得る。

適当な方法によって内部ペプチド標準を固相支持体から放出する時点で、内部ペプチド標準は、第２のタグ内の部分を介して別の支持体上に再固定され得る。この固定化反応は、化学的結合の化学選択的形成から、または第２のタグもしくは第２のタグの一部の、結合パートナーもしくは相互作用パートナーとの特異的結合から選択され得る。

精製された内部ペプチド標準の切断によって放出された第１のペプチドを定量化するための方法
図１３に示されるように、第１のタグおよび第２のタグの両方を含む内部ペプチド標準が、支持体に固定されている。第２および第１のタグの両方が、蛍光アミノ酸残基を用いて標識されている。精製されていない内部ペプチド標準の固定化後に、支持体が洗浄されて、特異的に結合しなかったか、または共有結合を形成しなかった、ペプチド合成のアセチル化された副生成物を除去する。その後、精製された内部ペプチド標準は、支持体上で直接的に切断され得る（図１３の左側）か、支持体からの放出後に切断され得る（支持体なし切断、図１３の右側）。支持体あり切断後に、第２のタグは、支持体上のままとなり、第１のペプチドが、第１のタグと一緒に、支持体から放出される。第１のペプチドおよび第１のタグの放出された混合物は、蛍光検出器を備えたＨＰＬＣによって分析され得る。このシステムが蛍光参照第１のタグを用いて較正される場合に、放出された第１のタグの蛍光強度（蛍光単位、ＦＵで測定される）が第１のタグの定量化のために、したがって、第１のペプチドの定量化のために使用され得る。

支持体なし切断後、第１のペプチドが、第１のタグおよび第２のタグと一緒に、支持体から放出される。第１のペプチド、第１のタグおよび第２のタグの放出された混合物は、蛍光検出器を備えたＨＰＬＣによって分析され得る。このシステムが蛍光参照第１のタグおよびまたは蛍光第２のタグを用いて較正される場合に、放出された第１のタグおよび第２のタグの蛍光単位、ＦＵで測定された蛍光強度が、タグの定量化のために、したがって、第１のペプチドの定量化のために使用され得る。

規定量の発色団を含有する第１のタグを使用するＨＰＬＣシステムの較正
第１のタグ（Ａｃ−Ｓｅｒ−Ａｌａ−ニトロＴｙｒ−Ａｒｇ、図７参照のこと）のアセチル化形態を合成し、アミノ酸分析によって絶対定量化した。規定量の定量化された、アセチル化第１のタグを、ＨＰＬＣカラム上にロードし、３５０ｎｍまたは４１０ｎｍのいずれかで検出されたピークの得られた面積−吸収単位、ＡＵを、アセチル化された第１のタグの総量に対してプロットした。２シリーズの実験の線形回帰分析を実施し、それぞれ０．９９９４および０．９９８６の相関関係が得られた。結果は、図１８に示されている。

図１８から（form）明らかである線形相関関係によって、適当な内部ペプチド標準から放出された、メタ−ニトロ−チロシンを含有する第１のタグの量を決定することが可能となる。図１８から同様に明らかであるように、３５０ｎｍでの吸収を決定することは、第１のタグのより正確な決定を可能にする、観察される勾配の点で、４１０ｎｍでの吸収と比較して明らかに有利である。

ニトロ−チロシンをベースとするタグを用いるペプチド定量化：直線性およびペプチド配列からの独立
Ｃ末端定量化タグ−ＳＡ−ニトロＴｙｒ−Ｇ−ＯＨ（ペプチドＡ〜Ｅ、表１）を保持する５種の種々のペプチドを、Ｆｍｏｃをベースとする固相ペプチド合成によって合成し、ＨＰＬＣによって精製した。図１９は、外部標準Ａｃ−ＳＡ−ニトロＴｙｒ−Ｒ−ＯＨと比較した、ＨＰＬＣによる５種のペプチドの定量化のための直線の検量線を示す。定量化は、３５０ｎｍで実施した。

定量化は、すべてのペプチドの試験された濃度範囲（１００〜７００ｎｍｏｌ／ｍｌ）にわたって直線であり、ペプチド配列と無関係であることがわかった。定量化の総合誤差（ＳＤ）は、５．４％であった。

ニトロ−チロシンベースのタグを用いるペプチド定量化：２３の種々のペプチドからのタグ切断の効率
Ｃ末端定量化タグ−ＳＡ−ニトロＴｙｒ−Ｇ−ＯＨを保持する２３種のペプチドを、Ｆｍｏｃベースの固相ペプチド合成によって合成し、ＨＰＬＣによって精製した。各ペプチドを、以下のトリプシン切断プロトコールに付した：

トリプシン活性化：トリプシン（２０μｇ、配列決定等級修飾トリプシン、Ｐｒｏｍｅｇａ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ、ＵＳＡ、カタログ番号Ｖ５１１、比活性１６．９６５ｕ／ｍｇ）を、トリプシン再懸濁バッファー（２００μＬ、Ｐｒｏｍｅｇａ、カタログ番号Ｖ５４２Ａ、成分５０ｍＭ酢酸）に溶解し、３７℃で１５分間インキュベートした。

還元およびアルキル化：ペプチド（約０．０５ｍｇ）を、１Ｍ尿素および１００ｍＭ新鮮な炭酸水素アンモニウム（３００μＬ）に溶解した。ＴＣＥＰ（Ｔｒｉｓ（２−カルボキシエチル）ホスフィンヒドロクロリド、０．２Ｍ、７．５μＬ、最終濃度５ｍＭ）を加え、溶液を３７℃で１時間インキュベートした。ヨードアセトアミド（０．５Ｍ、６．０μＬ、最終濃度１０ｍＭ）を添加した後、溶液を室温、暗所で、さらに３０分間インキュベートした。

消化：サンプルを、活性化されたトリプシン溶液（ウェルあたり１０μＬ、１．０μｇ、得られる酵素／基質比１：５０）を用いて、室温で一晩消化した。消化を停止するために、ＨＣｌ（２Ｍ、８μＬ、最終濃度５０ｍＭ）およびＴＦＡ（３．２μＬ、最終濃度１％、ｐＨ＜２）を加えた。最後に、サンプルをＬＣ−ＭＳによって３５０ｎｍで分析した。

表２は、ＬＣ−ＭＳおよび３５０ｎｍでのＵＶ検出によって決定される切断効率が、わずか７５％であったペプチド２０（ＨＬＶＳＰＥＡＬＤＬＬＤ−Ｋ−ＳＡ−ニトロＴｙｒ−Ｇ）を除いて、すべての場合において＞９９％であったことを示す。これは、１種のペプチドを除いて、定量化タグの切断が基本的に定量的であることを意味する。

ペプチド２０は、Ｃ末端リシンに付着されたアスパラギン酸を有する。ＬｙｓまたはＡｒｇおよび酸性アミノ酸ＡｓｐおよびＧｌｕ間のペプチド結合は、トリプシンによってゆっくりと切断されることが多いことがわかっている（Rehm, H.; Letzel, T. Der Experimentator Proteinbiochemie/Proteomics, 6^th edition, 2010, Spektrum Akademischer Verlag, Heibelberg, p.242）。しかし、これらの結合の不完全な切断は、ＭＳベースのプロテオミクスにおいてタグがついたペプチドを適用することには問題はないが、これは、この情報が、プロテオタイプのペプチドの選択プロセスのために考慮され得るからである。実際には、これは、Ｄ−Ｋ−およびＥ−Ｋ−結合を有するペプチドが、タンパク質の検出および定量化のためのプロテオタイプのペプチドとして簡単に選択されないことを意味する。

還元およびアルキル化プロセスを試験ペプチドに適用したが、これは、ペプチドを、同様のワークフローに付すことを目的としていたからであり、これは、同様のワークフローがタンパク質からのプロテオタイプのペプチドの調製に通常使用されるからである。これは、タグがつけられたペプチドは、トリプシン消化によるその切断の前に、生体サンプル中に添加されてもよく、したがって、タンパク質と同時に切断されるという利点を有する。すべての切断実験が、所望の生成物につながったので、定量化タグは、還元もアルキル化工程も干渉しないということが結論付けられ得る。

ニトロ−チロシンベースのタグを用いるペプチド定量化：３８種の種々のペプチドからのタグ切断の効率
Ｎ末端定量化タグＡｃ−ニトロＴｙｒ−ＳＧＫ−を保持する３８種のペプチドを、ＳＰＯＴ合成によって合成した（表３）。ペプチド配列は、各場合において、リシンにＮ末端が付着された１９個の種々のアミノ酸を含有する２種の異なるアミノ酸配列をベースとする（システインを除く、２０種の天然に生じるアミノ酸）。

すべてのペプチドを、実施例９に記載されるものと同様のトリプシン切断プロトコールに付した。ＬＣ−ＭＳおよび３５０ｎｍでのＵＶ検出によって決定される３８種のペプチドの切断効率が、表３に示されている。ほぼすべての場合において（＞９９％）、定量化タグが効率的に切断されることは明らかである。

４種のペプチドは効率的に切断されなかった。これらは、Ｋ−Ｄ−（ペプチド３および２３）およびＫ−Ｐ−結合（ペプチド１３および３３）を含有するペプチドである。Ｌｙｓ／ＡｒｇおよびＰｒｏならびに酸性アミノ酸ＡｓｐおよびＧｌｕ間のペプチド結合は、トリプシンによってゆっくりと切断されることが多いということがわかっているので、これは驚くべきことではない（Rehm, H.; Letzel, T. Der Experimentator Proteinbiochemie/Proteomics, 6^th edition, 2010, Spektrum Akademischer Verlag, Heibelberg, p.242）。しかし、これらの結合の不完全な切断は、ＭＳベースのプロテオミクスにおいてタグがついたペプチドを適用することには問題ではないが、これは、プロテオタイプのペプチドの選択プロセスのために考慮され得るからである。実際には、これは、Ｄ−Ｋ−、Ｅ−Ｋ−およびＰ−Ｋ−結合を有するペプチドが、タンパク質の検出および定量化のためのプロテオタイプのペプチドとして簡単に選択されないことを意味する。

ＫＫ−またはＫＲ−モチーフを有するペプチドは、この基のＣ末端で切断され、良好な切断効率を有していた（ペプチド９、１５、２９、３５）。

本明細書、特許請求の範囲、配列表および／または図面において開示される本発明の特徴は、別個に、およびその任意の組合せで、その種々の形態の本発明を実現するための材料であり得る。

Claims (18)

1. 質量標識およびある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドをカップリングした第１のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第１のペプチドのアミノ酸配列のＣ末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたＣ末端に対応し、該第１のタグが標識を含み、化学的切断、酵素的切断および物理的切断を含む群から選択される手段によって除去可能であり、該標識がメタ−ニトロ−チロシンを含む、内部ペプチド標準。
2. 第１のタグの除去が配列特異的である、請求項１に記載の内部ペプチド標準。
3. 質量標識がＣ同位体およびＮ同位体を含む群から選択される、請求項１または２に記載の内部ペプチド標準。
4. 第２のタグを含む、請求項１から３のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準。
5. 第２のタグが、アンカー部分を含む、請求項４に記載の内部ペプチド標準。
6. アンカー部分が、ビオチン、デスチオビオチン、アビジンおよびストレプトアビジンを含む群から選択されるか、または表面での、適当な反応性官能基との化学選択的反応を可能にする化学基である、請求項５に記載の内部ペプチド標準。
7. アンカー部分と第１のペプチドの間をリンカーが連結する、請求項５または６に記載の内部ペプチド標準。
8. 第１のタグが、第１のペプチドのＣ末端とカップリングされる、請求項１から７のいずれかに記載の内部ペプチド標準。
9. 第２のタグが、第１のペプチドのＮ末端とカップリングされる、請求項１から８のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準。
10. 請求項１から９のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準の複数の異なる種を含む組成物であって、該複数の異なる種の内部ペプチド標準が、第１のタグおよび／または第１のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる、組成物。
11. 種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の標的ポリペプチドの存在および／または量、および／または精製ポリペプチドの量を決定する方法における、請求項１から９のいずれか一項に記載の内部ペプチド標準の使用。
12. 種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、
    ａ）標的ポリペプチドを含有するか、または含有しない種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
    ｂ）（ｉ）ある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドをカップリングした第１のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第１のペプチドのアミノ酸配列のＣ末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたＣ末端に対応し、該第１のタグが標識を含み、化学的切断、酵素的切断および物理的切断を含む群から選択される手段によって除去可能であり、該標識がメタ−ニトロ−チロシンを含む、内部ペプチド標準、または（ｉｉ）該内部ペプチド標準の複数の異なる種であって、第１のタグおよび／または第１のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる該内部ペプチド標準の異なる種、の一定量を加え、それによってスパイクされた混合物を作製することと；
    ｃ）スパイクされた混合物を配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、内部ペプチド標準（単数または複数）から第１のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出し、それによって、複数のペプチドが種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドと内部標準から放出された第１のペプチドとを含むことと；
    ｄ）スパイクされた混合物中に含有される第１のタグの量を決定することならびにそれから工程ｂ）において加えられた内部標準（単数または複数）の量を決定することと；
    ｅ）各々工程ｃ）において作製された、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
    ｆ）工程ｄ）において決定された内部標準（単数または複数）の比および量から種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
    を含み、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む、方法。
13. 種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、
    ａ）標的ポリペプチドを含有するか、または含有しない種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
    ｂ）（ｉ）ある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドをカップリングした第１のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第１のペプチドのアミノ酸配列のＣ末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたＣ末端に対応し、該第１のタグが標識を含み、化学的切断、酵素的切断および物理的切断を含む群から選択される手段によって除去可能であり、該標識がメタ−ニトロ−チロシンを含む、内部ペプチド標準、または（ｉｉ）該内部ペプチド標準の複数の異なる種であって、第１のタグおよび／または第１のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる該内部ペプチド標準の異なる種、を提供し、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種から第１のタグを切断除去し、このようにして、第１のペプチドを放出することと；
    ｃａ１）工程ａ）の種々のポリペプチドの混合物に、工程ｂ）において得られた反応混合物を添加することと；
    ｃａ２）工程ｃａ１）において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと、
    または
    ｃｂ１）工程ａ）の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと；
    ｃｂ２）工程ｃｂ１）において得られた混合物に、工程ｂ）において得られた反応混合物を添加すること
    のいずれかによって、工程ｃａ２）およびｃｂ２）後に、それぞれ、スパイクされた混合物が得られることと；
    ｄ）スパイクされた混合物中に含有される第１のタグの量を決定することならびにそれから工程ｃａ１）またはｃｂ２）において添加された内部標準（単数または複数）の量を決定することと；
    ｅ）スパイクされた混合物中の、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
    ｆ）工程ｄ）において決定された内部標準（単数または複数）の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
    を含み、
    種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む、方法。
14. 種々のポリペプチドの少なくとも１種の混合物中の、第１のペプチドがプロテオタイプのペプチドである標的ポリペプチドの存在および／または量を決定する方法であって、
    ａ）（ｉ）ある１つのアミノ酸配列を含む第１のペプチドをカップリングした第１のタグを含む内部ペプチド標準であって、該第１のペプチドのアミノ酸配列のＣ末端が、ペプチドのアミド結合、エステル結合またはチオエステル結合の配列特異的加水分解によって作製されたＣ末端に対応し、該第１のタグが標識を含み、化学的切断、酵素的切断および物理的切断を含む群から選択される手段によって除去可能であり、該標識がメタ−ニトロ−チロシンを含む、内部ペプチド標準、または（ｉｉ）該内部ペプチド標準の複数の異なる種であって、第１のタグおよび／または第１のペプチドのアミノ酸配列において互いに異なる該内部ペプチド標準の異なる種、を提供し、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、内部ペプチド標準または該内部ペプチド標準の複数の異なる種から第１のタグを切断除去し、このようにして第１のペプチドを放出することと；
    ｂ）場合によっては、配列特異的加水分解のための手段を除去することと；
    ｃ）工程ａ）またはｂ）から得られた混合物中に含有されている第１のタグの量を決定することならびにそれから前記混合物中に含有された内部標準の量を決定することと；
    ｄ）標的ポリペプチドを含有するか、または含有しない種々のポリペプチドの混合物を提供することと；
    ｅａ１）工程ｄ）の種々のポリペプチドの混合物に、工程ａ）またはｂ）において得られた反応混合物の一部を添加することと；
    ｅａ２）工程ｅａ１）において得られた混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むこと；
    または
    ｅｂ１）工程ｄ）の種々のポリペプチドの混合物を、配列特異的加水分解のための手段を用いて処理して、種々のポリペプチドの混合物から複数のペプチドを作製し、それによって、複数のペプチドがプロテオタイプのペプチドを含むことと；
    ｅｂ２）工程ｅｂ１）において得られた混合物に、工程ａ）またはｂ）において得られた混合物の一部を添加すること
    のいずれかによって、工程ｅａ２）およびｅｂ２）後にそれぞれ、スパイクされた混合物が得られることと；
    ｆ）スパイクされた混合物中の、第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比を決定することと；
    ｇ）内部標準（単数または複数）の比および量から、種々のポリペプチドの混合物中の標的ポリペプチドの量を算出することと
    を含み、種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドまたは内部ペプチド標準（単数または複数）の第１のペプチドのいずれかが質量標識を含む、方法。
15. 質量標識が、Ｃ同位体およびＮ同位体を含む群から選択される、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. 内部ペプチド標準から放出された第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比が、質量分析によって決定される、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. 内部ペプチド標準から放出された第１のペプチド対種々のポリペプチドに由来するプロテオタイプのペプチドの比が、多段質量分析によって決定される、請求項１６に記載の方法。
18. 配列特異的加水分解のための手段が、タンパク質分解性酵素、配列特異的化学反応または配列特異的物理的処理から選択される、請求項１２から１７のいずれか一項に記載の方法。

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