WO2005033143A1 - 抗体の安定化方法及び安定化された溶液状抗体製剤 - Google Patents

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WO2005033143A1
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solution
formation
preparation
glycine
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Yuji Ueno
Takashi Kayashita
Atsushi Ishihara
Masashi Nakakura
Kyoko Yamauchi
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Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd.
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Definitions

  • the present invention relates to a method for stabilizing an antibody in a solution and a stabilized solution antibody preparation.
  • Proteins are insolubilized by aggregation of molecules that have collapsed higher-order structures due to shaking or heat stress. When these insoluble aggregates are administered intravenously, serious side effects such as anaphylactic shock are likely to occur (Japanese Patent Publication No. Hei 10-0 5 0 2 9 3 8).
  • a recombinant human keratinocyte growth factor can be used to suppress the formation of insoluble f-bioaggregates due to thermal stress in aqueous solutions. It is known to add more than mm o 1 / L citrate or 0.5% heparin to the antibody solution [Journal of Pharmaceutical Science, vol. 83, No. 12, 1657-1661 (1994)] .
  • glycine or histidine buffer is used (WO 0 2/1 3860), and 2% or more of polyvinylpyrrolidone is added.
  • adding phosphate buffer, sodium chloride and maltose Japanese Patent Publication No. 3-5 0 4 4 9 9)
  • Some proteins are not insolubilized, but are known to form soluble aggregates consisting of a small number of protein molecules such as dimers and trimers.
  • a soluble dimer is likely to be formed [Biochemistry, vol.38, 13960-13967 (1999)].
  • side effects such as fever, nausea, and hypotension may occur (Japanese Patent Publication No. Hei 10-0500 2 9 8).
  • a method for suppressing the formation of soluble aggregates a method in which a liquid immunoglobulin preparation contains a nicotinic acid derivative or an ⁇ -amino acid having a lipophilic side chain as a stabilizer is known (Japanese Patent Laid-Open No. 1). 0—5 0 2 9 3 8).
  • stabilization of antibodies in solution overcomes several destabilizing factors such as formation of chemical degradation products, formation of insoluble aggregates, and formation of soluble aggregates, providing stable antibody formulations. How to Wanted but not known so far.
  • An object of the present invention is to provide a method for inhibiting the production of soluble aggregates of antibodies in a solution, a method for inhibiting the production of chemical degradation products, and a method for stabilizing antibodies.
  • the present invention also provides a solution antibody formulation in which the production of soluble aggregates is suppressed, a solution antibody formulation in which the production of chemical degradation products is inhibited, the production of soluble aggregates, the production of chemical degradation products and the insolubility. It is an object of the present invention to provide a solution antibody preparation in which the formation of aggregates is suppressed, an inhibitor for the formation of antibody possible aggregates, an inhibitor for the formation of chemical degradation products of antibodies and an antibody stabilizer.
  • the present invention relates to the following (1) to (25).
  • a method for stabilizing an antibody in a solution which comprises adding glycine and citrate to the antibody.
  • a method for suppressing the formation of soluble aggregates of antibodies in a solution which comprises adding glycine to the antibodies.
  • a method for suppressing the formation of a chemical degradation product of an antibody in a solution which comprises adding citrate to the antibody.
  • a solution-like antibody preparation that contains glycine, kenic acid, and an antibody, and suppresses the formation of soluble aggregates, chemical degradation products, and insoluble aggregates.
  • Antibodies used in the present invention include antibody fragments. These antibodies and antibody fragments may be either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies, but monoclonal antibodies are preferred.
  • the above-mentioned antibody or antibody fragment includes antibodies from non-human animals, recombinant antibodies, antibody fragments thereof, and the like.
  • Examples of recombinant antibodies include humanized antibodies and human antibodies.
  • Examples of humanized antibodies include human chimeric antibodies and human CDR-grafted antibodies.
  • the human chimeric antibody refers to an antibody comprising VH and VL of an animal antibody other than a human and CH and CL of a human antibody.
  • the CH of the human chimeric antibody may be any as long as it belongs to human immunoglobulin (hereinafter referred to as lg), but is preferably of the MgG class, and moreover hlgGl, gG2, hIgG3, Any of the subclasses such as hIgG Can be used.
  • the CL of the human chimeric antibody may be any CL as long as it belongs to hlg, and those of the class or the e class can be used.
  • non-human animals examples include mice, rats, hamsters, and rabbits.
  • the human CDR-grafted antibody refers to an antibody obtained by grafting CDRs of VH and VL of an antibody from a non-human animal into appropriate positions of VH and VL of a human antibody.
  • the human CDR-grafted antibody of the present invention comprises a V region obtained by linking a VH and VL CDR of an antibody from a non-human animal with a VH and VL framework of any human antibody (hereinafter referred to as ⁇ ). Design and construct CDNA to be inserted, and insert it into an animal cell expression vector that has cDNA encoding human antibody CH and CL to construct a human CDR-grafted antibody expression vector and introduce it into animal cells Can be expressed and produced.
  • the CH of human CDR-grafted antibody may be any so long as it belongs to the hlg but it is preferable that the hlgG class, further belongs to MgG class] iIgGl, hIgG2 N hIgG3, hI G4 and subclass was always Either can be used.
  • the CL of the human-type CDR-grafted antibody may be any CL belonging to hlg, and can be of class or class.
  • Human antibodies originally refer to antibodies that exist naturally in the human body, but human antibody phage libraries and human antibodies created by recent advances in genetic engineering, cell engineering, and developmental technology Also included are antibodies obtained from production transgenic animals.
  • the antibodies present in the human body can be obtained by, for example, isolating human peripheral blood lymphocytes, infecting and immortalizing EB virus, etc., and cloning to obtain lymphocytes that produce the antibody. It can be obtained by purifying the antibody from the culture supernatant.
  • the human antibody phage library is a library in which antibody fragments such as Fab and scFv are expressed on the phage surface by inserting antibody genes prepared from human B cells into the phage genes.
  • phages expressing an antibody fragment having a desired antigen-binding activity on the surface can be recovered using the binding activity to the substrate on which the antigen is immobilized as an index.
  • the antibody fragment can be further converted into a human antibody molecule comprising two complete heavy chains and two complete light chains by genetic engineering techniques.
  • a human antibody-producing transgenic animal is an animal in which a human antibody gene is incorporated into cells.
  • a human antibody-producing transgenic mouse can be produced by introducing a human antibody gene into mouse ES cells, and then transplanting the ES cells into an early mouse embryo, followed by development.
  • Human antibody-producing transgeneic Human antibodies are produced from animals by obtaining and culturing human antibody-producing hyperpridoma using conventional methods for producing non-human animals. Human antibodies can be generated and accumulated.
  • Examples of the antibody fragment used in the present invention include Fat), Fab ′, F (ab ′) 2 , scFv, diabody ⁇ dsFv, and a peptide containing CDR.
  • Fab is a fragment obtained by treating an IgG antibody molecule with the proteolytic enzyme papain (cleaved at the 224th amino acid residue of the H chain), about half of the N chain side of the H chain and the entire L chain. It is an antibody fragment having an antigen binding activity with a molecular weight of about 50,000 bound by disulfide bond.
  • the Fab used in the present invention can be obtained by treating an antibody with the proteolytic enzyme papain.
  • a DNA encoding the Fab of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into a prokaryotic or eukaryotic organism to express it, thereby producing a Fab. it can.
  • F (al) ') 2 is a fragment obtained by treating an IgG antibody molecule with the protease pepsin (cleaved at the 234th amino acid residue of the H chain).
  • Fab is a disulfide bond in the hinge region. This is an antibody fragment having an antigen-binding activity with a molecular weight of about 100,000, which is slightly larger than that bound via the.
  • F (al) ′) 2 used in the present invention can be obtained by treating an antibody with the protease pepsin.
  • FalD ′ is an antibody fragment having an antigen-binding activity having a molecular weight of about 50,000, which is obtained by cleaving the disulfide bond in the hinge region of F (ab ′) 2 .
  • Fab ′ used in the present invention can be obtained by treating F (ab ′) 2 with a reducing agent dithiothreitol.
  • the DNA encoding the Fab ′ fragment of the antibody is inserted into a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector, and the vector is introduced into prokaryotic or eukaryotic cells to be expressed and produced. be able to.
  • scFv is a VH-P-VL or VL-P-VH polypeptide in which one VH and one VL are linked using an appropriate peptide linker (hereinafter referred to as P) and binds antigen. It is an antibody fragment having activity.
  • the scFv used in the present invention is obtained by obtaining cDNA encoding the antibody VH and VL, constructing DNA encoding scFv, and using the DNA as a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector. And can be expressed and produced by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a diabody is an antibody fragment obtained by dimerizing scFv and is an antibody fragment having a bivalent antigen-binding activity.
  • the bivalent antigen binding activity can be the same, or one can be a different antigen binding activity.
  • the diabody used in the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs the DNA encoding scFv so that the length of the amino acid sequence of the linker is 8 residues or less, and constructs the DNA.
  • the expression vector can be inserted into a prokaryotic expression vector or a eukaryotic expression vector, and the expression vector can be introduced into prokaryotic or eukaryotic cells to be expressed and produced.
  • dsFv refers to a polypeptide in which one amino acid residue in each of VH and VL is substituted with a cysteine residue and bonded via a disulfide bond between the cysteine residues.
  • the amino acid residue to be substituted for the cysteine residue is determined by the method described by Reiter et al. (Protein Engineering, 1, 697-704, 1994) can be selected based on the prediction of the three-dimensional structure of the antibody.
  • the dsFv used in the present invention obtains cDNA encoding the antibody VH and VL, constructs an MA that encodes the dsFv, and constructs the DNA into a prokaryotic expression vector or an eukaryotic expression vector. And can be expressed by introducing the expression vector into a prokaryotic organism or a eukaryotic organism.
  • the peptide containing CDR is composed of at least the ⁇ region or more of CDR of VH or VL. Peptides containing multiple CDRs can be linked directly or via a suitable peptide linker.
  • the peptide containing CDR used in the present invention constructs DNA that encodes the CDRs of antibody VH and VL, and uses the DM as a prokaryotic expression vector or eukaryotic expression vector. It can be introduced and expressed by introducing the expression vector into a prokaryotic or eukaryotic organism.
  • a peptide containing CDR can also be produced by a chemical synthesis method such as Fmoc method (fluorenylmethyloxycarbonyl method) or tBoc method (t-butyloxycarbonyl method).
  • any antibody to which the present invention can be applied may be used.
  • Specific examples include a monoclonal antibody against Gandarioside GD3 and a monoclonal antibody against CCR4.
  • monoclonal antibodies against ganglioside GD3 mouse monoclonal antibody KM-6 4 1 (patent 3 0 06 9 4 3), human type chimeric antibody KM-8 7 1 (Japanese Patent Laid-Open No. 5-3 0 4 9 8 9), And human CDR-grafted antibody KM-8871 (WO01 / 23432).
  • Examples of monoclonal antibodies against CCR4 include KM2760 (W001 / 64754), a human chimeric antibody, and M8761 (WO03 / 18635), an anti-CCR4 human CDR-grafted antibody.
  • the chemical degradation product refers to a product in which a disulfide bond or peptide bond of an antibody is cleaved.
  • Specific examples include those in which a part or all of the H chain or L chain of the monoclonal antibody is dropped.
  • insoluble aggregates are those in which molecules whose hydrophobicity on the surface of a molecule has increased due to higher order structural changes and the water solubility has decreased remarkably are aggregated and insolubilized. Therefore, the turbidity of the solution antibody preparation is increased by the formation of insoluble aggregates.
  • the soluble aggregate is that antibody molecules are associated with each other, but there is no change in the higher-order structure of the antibody molecule, or the change in the higher-order structure is relatively slight.
  • the water-solubility of the aggregate is maintained to the extent that it does not. Therefore, the production of these soluble aggregates does not cause an increase in turbidity of the preparation.
  • the number of molecules of antibodies that normally associate is relatively small, usually 2 to 4 mer.
  • the method for producing the solution antibody preparation of the present invention is not particularly limited as long as it is a method used in the production of general solution preparations. Specifically, antibody and additive solutions are prepared in advance and mixed. Can be manufactured. Alternatively, the antibody or additive material can be directly added to a solvent and dissolved.
  • the antibody concentration is 0.01 to 150 mg. Any amount can be used as long as it is in the range of / mL, but preferably 0.1 to 50 mg / mL, more preferably 1 to 2 Omg.
  • the amount of glycine to be added is within the range of 10 to 30 mg / mL as the glycine concentration. Any of them may be used, but preferably 20 to 25 m / mL, more preferably 22 to 23 mg / mL.
  • Examples of the form of glycine to be added include pharmaceutically acceptable glycine salts such as glycine and glycine hydrochloride.
  • the amount of citrate added is 0.1 to 5 Ommo 1 / L as the citrate concentration. As long as it is in the range, any may be used, but preferably 0. to. ! !] ! //! ⁇ More preferably 1 ⁇
  • citrate to be added examples include pharmaceutically acceptable salts of citrate such as citrate and sodium citrate.
  • the method for stabilizing an antibody in an antibody solution of the present invention is effective in suppressing the formation of soluble aggregates of antibodies in the solution, the formation of chemical degradation products, and the formation of insoluble aggregates.
  • the concentration of the antibody in the preparation of the present invention may be any as long as it is in the range of 0.01 to 150 mg / mL, preferably 0.1 to 50 mg / mL, more preferably 1 to 20 mg / mL. It is done.
  • the content of glycine in the present invention may be any as long as the glycine concentration is in the range of 10 to 30 mg / mL, preferably 2 to 25 mgZmL, more preferably 22 to 23 mg / mL.
  • Examples of the form of glycine to be added include pharmaceutically acceptable glycine salts such as glycine and glycine hydrochloride.
  • the content of citrate in the present invention may be any as long as the citrate concentration is in the range of 0.1 to 50 mmol / L, preferably 0.5 to 20 mmol / L, more preferably 1 to 1 Ommo 1 /. L is given.
  • Examples of the form of citrate to be added include pharmaceutically acceptable salts of citrate such as citrate and sodium citrate.
  • the preparation of the present invention may contain a nonionic surfactant in addition to the above-mentioned antibody, glycine, and citrate, and preferably include sorbitan fatty acid esters, polyoxyethylene sorbine fatty acid esters, polyoxyethylene.
  • sorbitan fatty acid esters examples include oxshethylene polyoxypropylene glycols, polyoxyethylene hydrogenated castor oils, polyethylene glycol fatty acid ethers, glycerin fatty acid esters, and sucrose fatty acid esters.
  • Particularly preferred are polyoxyethylene sorbitan monolaurate (polysorbate 20), polyoxyethylene sorbitan monooleate (polysorbate 80), and the like.
  • the concentration of the nonionic surfactant is not particularly limited as long as it is in a pharmaceutically acceptable range, but is preferably 0.01 to 1 Omg / mL, more preferably 0.05 to lmg / mL, and most preferably Like Or 0.1 to 0. S mg ZmL.
  • a suitable pH value is preferably pH 4 to 7, more preferably pH 5 to 6.
  • various pharmaceutically acceptable pH regulators such as hydrochloric acid, sulfuric acid, phosphoric acid, citric acid, acetic acid, lactic acid, tartaric acid, sodium hydroxide, and potassium hydroxide can be used.
  • a pharmaceutical acceptable additive as exemplified below may be added to the preparation of the present invention. ..
  • Isotonic agents include inorganic salts such as sodium chloride, potassium chloride, sodium hydrogen phosphate, sodium dihydrogen phosphate, sugars and sugars such as glucose, fructose, lactose, maltose, trehalose, mannitol, sorbitol, xylitol
  • examples include alcohols, glycerin, dextran, propylene glycol, polyethylene glycol, and nicotinamide.
  • soothing agents include inositol, chlorobutanol, propylene glycol, benzyl alcohol, lidocaine and magnesium sulfate.
  • Preservatives include parabens such as methyl paraoxybenzoate and ethyl parabenzoate, benzoic acid, ethanol, tetrasodium edetate, citrate, salicylic acid, sorbitol, sorbic acid, glycerin, chlorobutanol , Phenol, propylene glycol, benzyl alcohol and the like.
  • thickening agents examples include sodium alginate, xanthan gum, glycerin, gelatin, dextran, dextrin, cellulose alkyl ethers such as hydroxypropylcellulose, hydroxypropylmethylcellulose, polyethylene glycol, polyvinyl alcohol and the like.
  • Antioxidants include erythorbic acid, dibutylhydroxytoluene, butyl hydroxyanisole, sodium thioglycolate, one tocopherol, tocopherol acetate,
  • Examples include L-ascorbic acid, sodium hydrogen sulfite, sodium sulfite, sodium pyrosulfite, cystine hydrochloride, and sodium edetate.
  • the preferred administration method of the preparation of the present invention is injection, but administration forms such as transdermal, transmucosal, nasal, pulmonary lung, and phlegm can be used.
  • a particularly preferred administration method by injection is intravenous, subcutaneous tissue or intramuscular injection.
  • it may be administered directly to a lesion site such as tumor or inflammation using an appropriate administration device.
  • the preparation of the present invention can be used after diluting the preparation with a diluent at the time of use.
  • a diluent include infusion solutions such as physiological saline and sugar solution.
  • the diluted preparation can be administered into the living body while controlling the speed by drip, syringe pump or the like.
  • the solution-like antibody preparation of the present invention is sterilized by a general technique such as aseptic filtration, and then sealed in an injection container such as an ampoule, vial, or syringe under sterile conditions, as an injection. Can be used.
  • an injection container such as an ampoule, vial, or syringe under sterile conditions, as an injection.
  • nitrogen it is also possible to fficiently replace the gas in the container space using an inert gas such as argon or argon.
  • an inert gas such as argon or argon.
  • compositions of formulations 1 to 5 shown in Table 1 were prepared, aseptically filtered, poured into a glass vial, sealed with a rubber stopper and an aluminum cap, and used as a sample-formulation. All of these operations were performed in a sterile environment.
  • As the antibody a human chimeric antibody KM-871 against ganglioside GD3 produced by the method described in JP-A No. 5-30 989 was used.
  • Example 1 Each sample preparation prepared in Example 1 was stored at 40 ° C. for 1 month, and then the stability test was performed on the following test items.
  • each sample preparation was visually observed with gentle stirring under a white fluorescent lamp to determine the presence or absence of turbidity.
  • the contents of the sample preparation were analyzed by HP LC under the following conditions.
  • Soluble aggregate content (%) X 100 (1)
  • Total peak area Also, on the HP LC chart, the total peak area of the components eluted to the low molecular weight side from the unchanged peak is defined as the chemical degradation product peak area.
  • the chemical degradation product content was calculated by the following equation (2). Chemical degradation product peak area
  • Table 1 shows the results of (1) visual observation of the contents and (2) turbidity (0.D.4-00) measurement.
  • the turbidity (OD400) value is calculated by subtracting the initial value from the measured value and showing the increase during the storage period (40 ° C, 1 month). 4 0, 1 month storage
  • Example 3 Each sample formulation prepared in Example 3 was stored at 70 ° (: 270 seconds) and then subjected to a stability test on the following test items.
  • each sample preparation was visually observed with gentle stirring under a white fluorescent lamp to determine the presence or absence of turbidity.
  • the contents of the sample preparation were collected in a quartz microcell and the absorbance (O.D.400) at a wavelength of 400 nm was measured with an ultraviolet spectrophotometer (Hitachi U-3300 model).
  • Table 1 shows the results of (1) visual observation of the contents and (2) turbidity (OD40) measurement.
  • Table 5 shows the results of (1) visual observation of the contents and (2) turbidity (OD40) measurement.
  • the solution compositions of formulations 12 to 16 shown in Table 6 were prepared as such, filtered through a filter with a pore size of 0.1, and poured into a glass test tube. The mouth of the test tube was sealed with a silicon stopper to prepare a sample preparation.
  • the antibody used was a human CDR-grafted antibody KM8761 against CCR4 disclosed in WO03 / 18635. Table 6
  • Example 5 After each sample formulation prepared in Example 5 was stored at 70 ° C for 2 10 seconds, the following test items were tested. And a stability test was conducted.
  • each sample preparation was visually observed with gentle stirring under a white fluorescent lamp to determine the presence or absence of turbidity.
  • the contents of the sample preparation were collected in a quartz microcell, and the absorbance (O.D.400) at a wavelength of 400 nm was measured with an ultraviolet spectrophotometer (Hitachi U-3300 type).
  • Table 7 shows the results of (1) visual observation of the contents and (2) turbidity (O.D.400) measurement.
  • Formula 12 showed clear white turbidity and a high turbidity (OD400).
  • Formulation 13 Formulation 14, Formulation 15 and Formulation 16
  • turbidity was not observed, and the turbidity (OD400) value was confirmed to be significantly lower than in Formulation 12.
  • Example 8 Each sample preparation prepared in Example 8 was stored at 4 ° C for 1 month, and then the contents were analyzed by gel filtration HPLC under the following conditions to evaluate the stability.
  • the soluble aggregate content was calculated by the following formula, with the total peak area of the components eluted on the high molecular weight side from the unchanged peak as the soluble aggregate peak area.
  • the chemical degradation product content was calculated by the following formula, using the sum of the peak areas of the components eluted to the low molecular weight side from the unchanged product peak as the chemical degradation product peak area.
  • a solution composition having the formulation 22 shown in Table 10 was prepared, subjected to aseptic filtration, poured into a glass vial, sealed with a rubber stopper and an aluminum cap, and used as a sample preparation. All these operations were performed in a sterile environment.
  • the antibody used was human CDR-grafted antibody KM 8 76 1 against CCR4 disclosed in WO03 / 18635.
  • Example 1 0 Formulation stability confirmation (stored at 40 ° C)
  • Example 9 After the sample preparation prepared in Example 9 was stored at 40 ° C for 1 month, the content solution was subjected to the following conditions. Gel filtration Analysis was performed by HPLC to evaluate the stability.
  • the soluble aggregate content was calculated by the following equation (1), with the total peak area of the components eluted from the unchanged peak to the higher molecular weight side as the soluble aggregate peak area.
  • Soluble aggregate content (%) XI 00 (1)
  • Total peak area Also, on the HP LC chart, the total peak area of components eluted from the unchanged molecular weight peak to the low molecular weight side is defined as the chemical degradation product peak area.
  • the chemical degradation product content was calculated by the following equation (2). Chemical degradation product peak area
  • the content liquid of the preparation prepared in Example 9 was filtered through a filter with a pore size of 0.2 m and injected into a glass test tube. The mouth of the test tube was sealed with a stopper to prepare a sample. After storage at 70 ° C for 210 seconds, the following test items were subjected to stability tests.
  • the contents of the sample preparation were collected in a quartz microcell, and the absorbance (O.D.400) at a wavelength of 400 nm was measured with an ultraviolet spectrophotometer (Hitachi U-3300 type).
  • Table 12 shows the results of (1) visual observation of the contents and (2) turbidity (O.D.400) measurement.
  • Formulation 22 which is a preparation containing citrate and glycine, was confirmed to have excellent stability in terms of insoluble aggregates.
  • a method for stabilizing an antibody in a solution and a stabilized solution-like antibody preparation can be provided.

Abstract

本発明は、溶液中での抗体の可溶性会合体の生成抑制方法、化学的分解物の生成抑制方法、さらに抗体の安定化方法を提供する。また、本発明は、可溶性会合体の生成が抑制された溶液状抗体製剤、化学的分解物の生成が抑制された溶液状抗体製剤、さらに可溶性会合体の生成、化学的分解物の生成および不溶性凝集体の生成が抑制された溶液状抗体製剤ならびに抗体の可溶性会合体の生成抑制剤、抗体の化学的分解物の生成抑制剤および抗体安定化剤を提供する。

Description

明 細 書
抗体の安定化方法及び安定ィ匕された溶液状抗体製剤 技術分野
本発明は、 溶液中での抗体の安定化方法および安定化された溶液状抗体製剤に関する。 背景技術
ノ イォテクノロジ一の進歩により、 抗体を用いた疾患の治療が近年急速に普及している。 我が国においても例えばシナジス、 レミケー 、 リヅキサン、 ハーセプチンなど、 種々の 抗体製剤が医療現場において提供されている。
抗体を溶液中で長期間保存する際、 化学的分解物の生成、 不溶性凝集体の生成、 可溶性 会合体の生成などが起こる。 そこで、 安定でかつ安全な抗体医薬を提供するために、 これ らの生成物'を抑制するための方法が求められている。
抗体を溶液状態で長期間保存した場合に、 抗体のジスルフィ ド結合やペプチド結合の開 裂などの化学的な分解反応が起こる。 その結果、 品質の劣ィ匕により、 その活性低下、 予期 せぬ副作用などが懸念される。
タンパク質は、 振とうや熱ストレスなどにより、 高次構造が崩壊した分子が凝集し、 不 溶化される。 これら不溶性凝集体が静脈内投与された場合、 アナフィラキシーショックな どの重篤な副作用が起こりやすくなる （特表平 1 0— 5 0 2 9 3 8号公報)。
不溶性凝集体の生成を抑制する方法としては、 組換えヒ卜サイトケラチノサイト成長因 子 (recombinant human keratinocyte growth factor) 水溶液の熱ストレスにょる不溶 f生 凝集体の生成を抑制するために、 1 0 O mm o 1 /L以上のクェン酸または 0 . 5 %のへ パリンを抗体溶液に添加することが知られている [Journal of Pharmaceutical Science , vol .83, No .12, 1657-1661 (1994)]。 また、 抗体水溶液の熱ストレスによる不溶性凝集体 生成を抑制する方法としては、 グリシンまたはヒスチジン緩衝液を用いること （WO 0 2 / 1 3 8 6 0公報）、 2 %以上のポリビニルピロリ ドンを添加すること [Pharmaceutical Research, vol .11 , NO .5 , 624-632, 1994]、 リン酸緩衝液および塩化ナトリウムおよびマ ルトースを添^]すること （特表平 3— 5 0 4 4 9 9号公報） などが知られている。
またタンパク質によっては、 不溶化には至らないが、 2量体、 3量体など少数の蛋白質 分子からなる可溶性会合体を形成することが知られている。例えば、蛋白質が抗体の場合、 可溶性の 2量体が形成されやすいとされている [Biochemistry, vol .38 , 13960-13967 (1999 ) ]。 また抗体の 2量体がヒト体内に投与されると、 熱、 吐き気、 低血圧などの副作用 が引き起こされる危険性がある （特表平 1 0— 5 0 2 9 3 8号公報)。
可溶性の会合体生成を抑制する方法としては、 ニコチン酸誘導体または親油性側鎖を有 する α—アミノ酸などを安定化剤として液体免疫グロブリン製剤に含有させる方法が知ら れている （特表平 1 0— 5 0 2 9 3 8号公報)。
以上のように、 溶液中での抗体の安定化は化学的分解物の生成、 不溶性凝集体生成、 可 溶性会合体生成といつた複数の不安定化要因を克服し、 安定な抗体製剤を提供する方法が 望まれているが、 これまでに知られていない。
発明の開示
本発明は、 溶液中での抗体の可溶性会合体の生成抑制方法、 化学的分解物の生成抑制方 法、 さらに抗体の安定化方法を提供することを目的とする。 また、 本発明は、 可溶性会合 体の生成が抑制された溶液状抗体製剤、 化学的分解物の生成が抑制された溶液状抗体製剤、 さらに可溶性会合体の生成、 化学的分解物の生成および不溶性凝集体の生成が抑制された 溶液状抗体製剤ならびに抗体の可 性会合体の生成抑制剤、 抗体の化学的分解物の生成抑 制剤および抗体安定化剤の提供を目的とする。
本発明は以下の （ 1 ) 〜（ 25 )に関する。
(1)抗体にグリシン及びクェン酸を添加することを特徴とする、 溶液中で抗体を安 定化する方法。
(2)抗体を安定化する方法が、 溶液中での抗体の可溶性会合体の生成抑制および化 学的分解物の生成抑制である上記 （1)記載の方法。
(3) 抗体にグリシンを添加することを特徴とする、 溶液中で抗体の可溶性会合体の 生成を抑制する方法。
(4)抗体にクェン酸を添加することを特徴とする、 溶液中で抗体の化学的分解物の 生成を抑制する方法。
(5)抗体濃度が 0. 01~15 OmgZmLである、 上記 （1) 〜 （4) のいずれ か 1項に記載の方法。
(6) グリシンの濃度が 10〜3 OmgZmLである、 上記 （1) 〜 （3) のいずれ か 1項に記載の方法。
(7) クェン酸の濃度が 0. 1~5 Ommo 1/Lである、 上記 （1)、 (2) および (4) のいずれか 1項に記載の方法。
(8) さらに非イオン性界面活性剤を含有する上記 （1) 〜 （7) のいずれか 1項に 記載の方法。
(9) 溶液の pHが 4~ 7の範囲内である上記 （1) 〜 (8) いずれか 1項に記載の 方法。
(10)抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である上記 （1) 〜 （9) のいずれか 1項 に記載の方法。
(11)抗体がガングリオシド GD 3に対する抗体および C Cケモカイン受容体 4 (以 下、 CCR4という） に対する抗体のいずれかの抗体である上記 （1) ~ (10) のいず れか 1項に記載の方法。
( 12 ) グリシンおよび抗体を含有することを特徴とする、 抗体の可溶性会合体の生 成が抑制された溶液状抗体製剤。
(13) クェン酸および抗体を含有することを特徴とする、 抗体の化学的分解物の生 成が抑制された溶液状抗体製剤。 (14) グリシン、 クェン酸および抗体を含有することを特徴とする、 抗体の可溶性 会合体の生成、 化学的分解物の生成および不溶性凝集体の生成が抑制された溶液状抗体製 剤。
(15) 抗体濃度が 0. 01〜： 15 Omg/mLである、 上記 （12) 〜 （14) の いずれか 1項に記載の製剤。 -
(16) グリシンの濃度が 10〜3 OmgZmLである、 上記 （ 12 )、 （ 14) およ び （15) のいずれか 1項に— 載の製剤。
(17) クェン酸の濃度が 0. 1〜5 Ommo 1/Lである、 上記 （13) ~ (15) のいずれか 1項に記載の製剤。
( 18 ) さらに非イオン性界面活性剤を含有する上記 （ 12 ) 〜 （ 17 ) のいずれか 1項に記載の製剤。 .
' (19) 溶液の pHが 4~ 7の範囲内である上記 （12) 〜 （18) のいずれか 1項 に記載の製剤。
(20)抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である上記 （12) ~ (19) のいずれか 1項に記載の製剤。
' (21)抗体がガングリオシド GD 3に対する抗体および CCR 4に対する抗体のい ずれかの抗体である上記 （12) 〜 （20) のいずれか 1項に記載の製剤。
(22) グリシンを有効成分として含有することを特徴とする、 溶液中での抗体の可 溶性会合体の生成抑制剤。
(23) クェン酸を有効成分として含有することを特徴とする、 溶液中での抗体の化 学的分解物の生成抑制剤。 '
(24) グリシン及びクェン酸を有効成分として含有することを特徴とする、 抗体の 安定化剤。
(25) 抗体の安定化が、 溶液中での抗体の可溶性会合体の生成抑制、 化学的分解物 の生成抑制および不溶性凝集体の生成抑制である、 上記 （24) 記載の抗体の安定化剤。 本発明で使用される抗体には抗体断片も含まれる。 これら抗体および抗体断片は、 ポリ クローナル抗体またはモノクローナル抗体のいずれであってもよいが、 モノクローナル抗 体が好ましい。
また、 上記の抗体または抗体断片には、 ヒト以外の動物の抗体、 遺伝子組換え抗体、 そ れらの抗体断片なども含まれる。
遺伝子組換え抗体としては、 ヒト化抗体、 ヒト抗体などがあげられ、 また、 ヒト化抗体 としては、 ヒト型キメラ抗体、 ヒト型 CDR移植抗体などがあげられる。
ヒト型キメラ抗体とは、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLとヒト抗体の CHおよび CL とからなる抗体をいう。 ヒト型キメラ抗体の CH としては、 ヒトイムノグロブリン (以下、 lg と表記する） に属すればいかなるものでもよいが、 MgGクラスのものが好適であり、 さらに MgGクラスに属する hlgGl, gG2、 hIgG3, hIgG といったサブクラスのいずれも 用いることができる。 また、 ヒト型キメラ抗体の CLとしては、 hlgに属すればいずれのも のでもよく、 クラスあるいはえクラスのものを用いることができる。
また、 ヒト以外の動物としては、 マウス、 ラヅ ト、 ハムスター、 ラビヅ トなどがあげら れる。
ヒト型 CDR移植抗体とは、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRをヒト抗体の VH および VLの適切な位置に移植した抗体をいう。
本発明のヒト型 CDR移植抗体は、 ヒト以外の動物の抗体の VHおよび VLの CDRを任意の ヒト抗体の VHおよび VLのフレームワーク （以下、 ΕΈと表記する） と連結した V領域をコ ―ドする CDNAを設計、 構築し、 ヒト抗体の CHおよび CLをコ一ドする cDNAを有する動物 細胞用発現べクタ にそれそれ挿入してヒト型 CDR移植抗体発現ベクターを構築し、 動物 細胞へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
ヒト型 CDR移植抗体の CHとしては、 hlgに属すればいかなるものでもよいが、 hlgGクラ スのものが好適であり、 さらに MgGクラスに属する ] iIgGl、 hIgG2N hIgG3、 hI G4 といつ たサブクラスのいずれも用いることができる。 また、 ヒト型 CDR移植抗体の CL としては、 hlgに属すればいずれのものでもよく、. クラスあるいはえクラスのものを用いることがで ぎる。
ヒト抗体とは、 元来、 ヒト体内に天然に存在する抗体をいうが、 最近の遺伝子工学的、 細胞工学的、 発生工学的な技術の進歩により作製されたヒト抗体ファージライブラリーお よびヒト抗体産生トランスジヱニック動物から得られる抗体なども含まれる。 ヒト体内に 存在する抗体は、 例えば、 ヒト末梢血リンパ球を単離し、 EB ウィルスなどを感染させ不死 化し、 クローニングすることにより、 該抗体を産生するリンパ球を取得し、 これを培養し て、 培養上清中より該抗体を精製することにより得ることができる。 ヒト抗体ファージラ ィブラリ一は、 ヒト B細胞から調製した抗体遺伝子をファージ遺伝子に揷入することによ Fab, scFv などの抗体断片をファージ表面に発現させたライブラリーである。 該ライプ ラリ一より、 抗原を固定化した基質に対する結合活性を指標として所望の抗原結合活性を 有する抗体断片を表面に発現しているファージを回収することができる。 該抗体断片は、 さらに、 遺伝子工学的手法により 2本の完全な H鎖および 2本の完全な L鎖からなるヒト 抗体分子へも変換することができる。 ヒト抗体産生トランスジエニック動物は、 ヒト抗体 遺伝子が細胞内に組込まれた動物をいう。 具体的には、 例えば、 マウス ES細胞ヘヒト抗体 遺伝子を導入し、 該 ES細胞をマウスの初期胚へ移植後、 発生させることによりヒト抗体産 生トランスジエニックマウスを作製することができる。 ヒト抗体産生トランスジエニック 動物からのヒト抗体の作製方法は、 通常のヒト以外の動物で行われているハイプリドーマ 作製方法によりヒト抗体産生ハイプリドーマを取得し、 培養することで培養上清中にヒト 抗体を生成蓄積させることができる。
本発明で使用される抗体断片としては、 Fat)、 Fab'、 F(ab ' )2、 scFv、 diabody^ dsFvおよ び CDRを含むぺプチドなどがあげられる。 Fabは、 IgG型抗体分子を蛋白質分解酵素パパインで処理して得られる断片のうち （H鎖 の 224番目のアミノ酸残基で切断される）、 H鎖の N末端側約半分と L鎖全体がジスルフィ ■ ド結合で結合した分子量約 5万の抗原結合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用される Fab は、 抗体を蛋白質分解酵素パパインで処理して得ることができ る。 または、 該抗体の Fabをコードする DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物 用発現ベクターに挿入し、 該ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより 発現させ、 Fabを製造することができる。
F(al)' )2は、 IgG型抗体分子を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得られる断片のうち （H 鎖の 234番目のアミノ酸残基で切断される）、 Fabがヒンジ領域のジスルフィド結合を介し て結合されたものよりやや大きい、分子量約 10万の抗原結合活性を有する抗体断片である。 本発明で使用される F(al) ' )2は、抗体を蛋白質分解酵素ペプシンで処理して得ることがで きる。 または、 下記の Fab 'をチォエーテル結合あるいはジスルフィド結合させ、 作製する ことができる。
FalD 'は、上記 F (ab ' )2のヒンジ領域のジスルフィ ド結合を切断した分子量約 5万の抗原結 合活性を有する抗体断片である。
本発明で使用される Fab 'は、 F(ab ' )2を還元剤ジチオスレィトール処理して得ることがで きる。 または、 該抗体の Fab '断片をコードする DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真 核生物用発瑪ベクターに挿入し、 該ベクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入すること により発現させ、 製造することができる。
scFvは、 1本の VHと 1本の VLとを適当なぺプチドリンカー （以下、 Pと表記する） を用 いて連結した、 VH- P-VLないしは VL-P-VHポリペプチドで、 抗原結合活性を有する抗体断片 である。
本発明で使用される scFvは、 抗体の VHおよび VLをコ ドする cDNAを取得し、 scFvを コードする DNAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現ベクターあるいは真核生物用発現べク 夕一に揷入し、 該発現ベクターを原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現さ せ、 製造することができる。
diabodyは、 scFv が二量体化した抗体断片で、 二価の抗原結合活性を有する抗体断片で ある。 二価の抗原結合活性は、 同一とすることもできるし、 一方を異なる抗原結合活性と することもできる。本発明で使用される diabodyは、抗体の VHおよび VLをコードする cDNA を取得し、 scFvをコードする DNAをリンカーのアミノ酸配列の長さが 8残基以下となるよ うに構築し、該 DNAを原核生物用発現べク夕一あるいは真核生物用発現べク夕一に挿入し、 該発現べク夕一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 製造するこ とができる。
dsFvは、 VHおよび VL中のそれぞれ 1アミノ酸残基をシスティン残基に置換したポリぺ プチドを該システィン残基間のジスルフィ ド結合を介して結合させたものをいう。' システ イン残基に置換するアミノ酸残基は Reiterらにより示された方法 （Protein Engineering, 1, 697-704 , 1994) に従って、 抗体の立体構造予測に基づいて選択することができる。 本 発明で使用される dsFvは、 抗体の VHおよび VLをコードす.る cDNAを取得し、 dsFvをコー ドする MAを構築し、 該 DNAを原核生物用発現 クタ一あるいは真核生物用発現ベクター に挿入し、 該発現べクタ一を原核生物あるいは真核生物へ導入することにより発現させ、 製造することができる。
CDRを含むペプチドは、 VHまたは VLの CDRの少なくとも Γ領域以上を含んで構成される。 複数の CDR を含むペプチドは、 直接または適 なペプチドリンカ一を介して結合させるこ とができる。 本発明で使用される CDRを含むぺプチドは、 抗体の VHおよび VLの CDRをコ ―ドする DNAを構築し、 該 DMを原核生物用発現べクタ一あるいは真核生物用発現べクタ ―に揷入し、 該発現べク夕一を原核生物ある 、は真核生物へ導入することにより発現させ、 製造することができる。 また、 CDR を含むペプチドは、 Fmoc法 （フルォレニルメチルォキ シカルボニル法)、 tBoc法 （t-ブチルォキシカルポニル法） などの化学合成法によって製造 することもできる。
本発明を適用できる抗体はいかなるものでもよいが、 具体例としては、 ガンダリオシド G D 3に対するモノクローナル抗体、 CCR4に対するモノクロ一ナル抗体などがあげられる。 ガングリオシド G D 3に対するモノクローナル抗体として 、 マウスモノクローナル抗体 K M— 6 4 1 (特許 3 0 0 6 9 4 3号)、 ヒト型キメラ抗体 KM— 8 7 1 (特開平 5— 3 0 4 9 8 9 )、 ヒト型 CDR移植抗体 KM- 8871 (WO01/23432) などがあげられる。 CCR4に対する モノクローナル抗体としては、 ヒト型キメラ抗体である KM2760 (W001/64754), 抗 CCR4ヒ ト型 CDR移植抗体である M8761 (WO03/18635) などがあげられる。
本発明において、 化学的分解物とは、 抗体のジスルフィ ド結合またはペプチド結合が開 裂したものをいう。 具体的には、 モノクローナル抗体の H鎖または L鎖の一部または全て が脱落したものがあげられる。 また前述の Fab断片、 Fab断片の H鎖と L饑がさらに開裂し たものなども包含される。
本発明において、 不溶性凝集体とは、 高次構造変化などにより分子表面の疎水性が増大 し、 著しく水溶性が低下した分子が集合し、 不溶化したものをいう。 したがって、 不溶性 凝集体が生成されることにより溶液状抗体製剤の濁度が増大する。
本発明において、 可溶性会合体とは、 抗体分子同士が会合しているが、 抗体分子の高次 構造の変化がないか、 または高次構造の変化が比較的軽微であるため、 水溶液中で析出し ない程度に該会合体の水溶性が維持されているものをいう。 したがってこれら可溶性会合 体の生 により製剤の濁度の増大は生じない。 通常会合する抗体の分子数は比較的少なく、 通常 2〜4量体である。
本発明の溶液状抗体製剤の製造法は、 一般の溶液状製剤の製造で行なわれている方法で あれば特に限定されない力 具体的には抗体および添加剤の溶液を予め調製し、 それらを 混合することにより製造することができる。 また抗体または添加剤原料を直接溶媒中に添 加し、 溶解させることにより製造することもできる。 本発明の溶液中での抗体の安定化方法、 溶液中での可溶性会合体の生成抑制方法および 溶液中での化学的分解物の生成抑制方法において、 抗体濃度としては、 0. 01〜150 mg/mLの範囲であればいずれでもよいが、 好ましくは 0. l〜50mg/mL、 より 好ましくは 1~2 Omgノ mLがあげられる。
本発明の溶液中での抗体の安定化方法および溶液中での可溶性会合体の生成抑制方法に おいて、 添加するグリシンの量は、 グリシン濃度として 10〜30 mg/mLの範囲であ ればいずれでもよいが、 好ましくは 20~25m /mL、 より好ましくは 22〜 23 m g/mLがあげられる。 添加するグリシンの形態としては、 グリシン、 グリシン塩酸塩な どの薬学的に許容されるグリシンの塩類などがあげられる。
本発明の溶液中での抗体の安定化方法および溶液中での化学的分解物の生成抑制方法に おいて、 添加するクェン酸の量は、 クェン酸濃度として 0. 1~5 Ommo 1/Lの範囲 であればいずれでもよいが、 好ましくは 0. 〜 。！!!]!!。 //!^ より好ましくは 1〜
1 Ommo 1/Lがあげられる。 添加するクェン酸の形態としては、 クェン酸、 クェン酸 ナトリゥムなどの薬学的に許容されるクェン酸の塩類などがあげられる。
本発明の抗体溶液中での抗体の安定化方法は、 溶液中での抗体の可溶性会合体の生成抑 制、 化学的分解物の生成抑制および不溶性凝集体の生成抑制に効果を奏する。
本発明の製剤における抗体の濃度としては、 0. 01〜150 mg/mLの範囲であれ ばいずれでもよいが、 好ましくは 0. l〜50mg/mL、 より好ましくは 1〜 20 m g /mLがあげられる。
本発明におけるグリシンの含有量は、 グリシン濃度として 10〜30mg/mLの範囲 であればいずれでもよいが、 好ましくは 2ひ〜 25mgZmL、 より好ましくは 22〜2 3mg/mLがあげられる。 添加するグリシンの形態としては、 グリシン、 グリシン塩酸 塩などの薬学的に許容されるグリシンの塩類などがあげられる。
本発明におけるクェン酸の含有量は、 クェン酸濃度として 0. l~50mmol/Lの 範囲であればいずれでもよいが、 好ましくは 0. 5〜20mmol/L、 より好ましくは 1~1 Ommo 1/Lがあげられる。 添加するクェン酸の形態としては、 クェン酸、 クェ ン酸ナトリゥムなどの薬学的に許容されるクェン酸の塩類などがあげられる。
本発明の製剤は、 上述の抗体、 グリシン、 クェン酸のほかに、 非イオン性界面活性剤を 含有されてもよく、 好適なものとして、 ソルビタン脂肪酸エステル類、 ポリオキシェチレ ンソルビ夕ン脂肪酸エステル類、 ポリォキシェチレンポリォキシプロピレングリコール類、 ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油類、 ポリエチレングリコール脂肪酸エーテル類、 グリセ リン脂肪酸エステル類、 ショ糖脂肪酸エステル類などがあげられる。 特に好ましいものと してポリォキシエチレンソルビタンモノラウレート (ポリソルべ一ト 20)、 ポリオキシェ チレンソルビタンモノォレエート (ポリソルベート 80) などがあげられる。 非イオン性 界面活性剤の濃度としては、 薬学的に許容される範囲であれば特に制限されないが、 好ま しくは 0. 01~1 Omg/mL、 より好ましくは 0. 05~lmg/mL、 最も好まし くは 0 . 1〜0 . S m gZmLがあげられる。
本発明の製剤は p Hを適切な値に制御するのが望ましい。 適切な pH値としては、 好まし くは pH4〜7であり、 より好ましくは pH 5〜 6があげられる。 p Hには、 例えば塩酸、 硫 酸、 リン酸、 ェン酸、 酢酸、 乳酸、 酒石酸、 水酸化ナトリウム、 水酸化カリウムなどの 医薬品として許容される種々の P H調節剤が使用することができる。
また本発明の製剤に、 以下に例示するような医薬品として許容される添加剤を添加して もよい—？ ..
等張化剤としては、 塩化ナトリウム、 塩化カリウム、 リン酸水素ナトリウム、 リン酸二 水素ナトリウムなどの無機塩類、 グルコース、 フルクトース、 ラクト一ス、 マルトース、 トレハロース、 マンニトール、 ソルビトール、 キシリトールなどの糖及び糖アルコール類、 グリセリン、 デキストラン、 プロピレングリコール、 ポリエチレングリコール、 ニコチン 酸アミドなどがあげられる。
無痛化剤としてイノシトール、 クロロブ夕ノール、 プロピレングリコ一ル、 ベンジルァ ルコール、 リドカイン、 硫酸マグネシウムなどがあげられる。
保存剤としては、 パラォキシ安息香酸メチル、 パラォキシ安息香酸ェチルなどのパラべ ン類、 安息香酸、 エタノール、 ェデト酸四ナトリウム、 クェン酸、 サリチル酸、 ソルビト —ル、 ソルビン酸、 グリセリン、 ク Πロブタノ一ル、 フエノール、 プロピレングリコール、 ベンジルアルコールなどがあげられる。
粘稠剤としては、 アルギン酸ナトリウム、 キサンタンガム、 グリセリン、 ゼラチン、 デ キストラン、 デキストリン、 ヒドロキシプロピルセルロース、 ヒドロキシプロピルメチル セルロースなどのセルロースアルキルエーテル類、 ポリエチレングリ ール、 ポリビニル アルコールなどがあげられる。
酸化防止剤としては、 エリソルビン酸、 ジブチルヒドロキシトルエン、 プチルヒドロキ シァニソール、 チォグリコール酸ナトリウム、 一トコフエ口一ル、酢酸トコフエロール、
L—ァスコルビン酸、亜硫酸水素ナトリゥム、亜硫酸ナトリゥム、 ピロ亜硫酸ナトリゥム、 塩酸システィン、 ェデト酸ナトリウムなどがあげられる。
本発明の製剤の好ましい投与方法は注射であるが、 経皮、 経粘膜、 経鼻、 絰肺、 絰口な どの投与形態を用いることもできる。 特に好ましい注射での投与方法としては、 静脈内、 皮下組織内または筋肉内へ注射する方法である。 また適切な投与装置を用いて、 例えば腫 瘍、 炎症などの病変部位へ直接投与してもよい。
また本発明の製剤は、 使用時に製剤を希釈液で希釈した後に使用することができる。 希 釈液としては、生理食塩水、糖液などの輸液などがあげられる。希釈された製剤は、 点滴、 シリンジポンプなどにより速度を制御しながら生体内へ投与することができる。
本発明の溶液状抗体製剤は、 例えば無菌ろ過などの一般的な手法により滅菌した後、 無 菌的璟境下でアンプル、 バイアル、 シリンジなどの注射剤容器中に封入することにより注 射剤として使用することができる。 また溶液状抗体組成物を容器中に封入する際に、 窒素 やアルゴンなどの不活性ガスを用いて容器空間部のガス置換を ffiすことも可能である。 以下に実施例を示し、 本発明を具体的に説明する。 しかしながら、'本発明はこれら実施 例によって限定されるものではない。
発明を実施するための最良の形態
実施例 1 試料製剤の調製
第 1表に示す処方 1〜 5の溶液組成物をそれぞれ調製し、 無菌'ろ過後、 ガラス製バイァ ルに注入し、 ゴム栓、 アルミキャップで密封し、 試料—製剤とした。 これらの操作は全て無 菌的環境下で行った。 抗体は、 特開平 5 - 3 0 4 9 8 9記載の方法で製造したガングリオ シド GD 3に対するヒト型キメラ抗体 KM— 8 7 1を用いた。 第 1
Figure imgf000010_0001
実施例 2 安定性試験
実施例 1で調製された各試料製剤を 4 0 °C、 1ヶ月間保存した後、 以下の試験項目につ いて安定性試験を行った。
( 1 ) 内容液の目視観察
各試料製剤の内容液を、 白色蛍光灯下、 ゆるやかに攪拌しながら目視で観察し、 濁りの 有無を判定した。
( 2 ) 濁度測定
試料製剤の内容液を石英ミクロセルに採取し、 紫外分光光度計 （日立. U— 3 3 0 0型） で、 波長 4 0 0 n mにおける吸光度 （ O.D . 4 0 0 ) を測定した。 (3) ゲルろ過 HP LC
試料製剤の内容液について、 以下の条件で HP L Cによる分析を行なった。
(H PLC条件）
カラム： TSKgel G3000 SWXL (東ソ一） .
移動相： 0. 3 mo 1/L 塩化ナトリウムを含む、 0. 5'mo l/L リン酸塩緩衝液 測定波長： 280 nm
流速： 1 mL/ m丄 n
注入量： 4 O L
装置： L C— 1 OAシステム （島津製作所）
HPLCチャート上で、 未変化体ピークより高分子量側に溶出された成分のピーク面積 の総和を可溶性会合体ピーク面積として、 以下の式 （1) により可溶性会合体含量を算出 した。
可溶性会合体ピーク面積
可溶性会合体含量 （％) = X 100 (1) 総ピーク面積 また HP L Cチャート上で、 未変化体ピークより低分子量側に溶出された成分のピーク 面積の総和を化学的分解物ピーク面積として、 以下の式 （2) により化学的分解物含量を 算出した。 化学的分解物ピーク面積
化学的分解物含量 （％) = X 100 (2) 総ピーク面積
(1) 内容液の目視観察および（2)濁度 （0.D.4- 00)測定の結果を第 2表に示した。 第 2表において濁度 （O.D.400) の値は測定値から初期値を差し引き、 保存期間 （4 0°C、 1ヶ月） 中の増加量を示したものである。 4 0 、 1ヶ月保存
濁りの有無 （目視観察） O.D. 4 0 0の 加量 処方 1 ハ、、 0 . 0 0 2
処方 2 一'
"、 0 . 0 0 0
処方 3 0 . 0 0 2
処方 4 0 . 0 0 2
処方 5 ハ、、 0 . 0 0 2 全ての処方 （処方 1〜 5 ) において、 内容液の目視観察の結果、 濁りは観察されなかつ た。 また全ての処方において濁度 （0.D. 4 0 0 ) の増大は殆ど認められなかった。
ゲルろ過 H P L Cの結果を第 3表に示した。 第 3表の値は測定値から初期値を差し引き、 保存期間 （4 0 ° 1ヶ月間） 中の増加量を示したものである。 第 3表
Figure imgf000012_0001
処方 1 (リン酸） と処方 2および 3 (クェン酸） との比較において、 化学的分解物の増 加量は処方 1よりも処方 2および 3の方が少なかった。 以上のことから、 溶液中へのクェ ン酸の添加により、 化学的分解物の増加を低減できることが明らかとなつた。
また処方 2およびと処方 4との比較において、 可溶性会合体の増加量は処方 2よりも処 方 4の方が少なく、 溶液中のグリシンの添加により可溶性会合体の増加を低減できること が明らかとなった。 さらに処方 4にポリソルベート 8 0を添加した処方 5においても、 溶液の安定性が維持 された。
実施例 3 不溶性凝集体抑制効果の確認 1 (試料調製） ,
第 4表に示す処方？〜 1 1の溶液組成物をそれそれ調製し、 孔径 0 . 2 mのフィル夕 一でろ過し、 ガラス製試験管に注入した。 試験管の口をシリコン製の栓で密封し試料製剤 とした。 抗体は特開平 5— 3 0 4 9 8 9に開示されているガングリオシド G D 3に対する ヒト型キメラ抗体 KM— 8 7 1を用いた。 第 4表
Figure imgf000013_0001
実施例 4 不溶性凝集体抑制効果の確認 1 (安定性試験）
実施例 3で調製した各試料製剤を 7 0 ° (：、 2 7 0秒間保存した後、 以下の試験項目につ いて安定性試験を行った。
( 1 ) 内容液の目視観察 '
各試料製剤の内容液を、 白色蛍光灯下、 ゆるやかに攪拌しながら目視で観察し、 濁り の有無を判定した。
( 2 ) 濁度測定
試料製剤の内容液を石英ミクロセルに採取し、 紫外分光光度計 （日立 U— 3 3 0 0型） で、 波長 4 0 0 nmにおける吸光度 （ O.D.4 0 0 ) を測定した。
( 1 )内容液の目視観察および（ 2 )濁度（O.D.4 0 0 )測定の結果を第 5表に示した。 第 5表
Figure imgf000014_0001
処方 7では目視観察の結果、 明らかな白濁が認められ、 濁度 （O.D.4 0 0 ) も高い値を 示した。 一方、 処方 8、 処方 9、 処方 1 0および処方 1 1では内容液の目視観察の結果、 濁りは観察されず、 また濁度 （O.D. 4 0 0 ) の値も処方 7に比べ顕著に低いことが確認さ れた。 実施例 5 不溶性凝集体抑制効果の確認 2 (試料調製）
第 6表に示す処方 1 2〜 1 6の溶液組成物をそれそれ調製し、 孔径 0 . のフィル 夕一でろ過し、 ガラス製試験管に注入した。 試験管の口をシリコン製の栓で密封し試料製 剤とした。抗体は WO03/18635に開示されている CCR4に対するヒト型 CDR移植抗体KM 8 7 6 1を用いた。 第 6表
Figure imgf000014_0002
実施例 6 不溶性凝集体抑制効果の確認 2 (安定性試験）
実施例 5で調製された各試料製剤を 7 0 °C、 2 1 0秒間保存した後、 以下の試験項目につ いて安定性試験を行った。
(1) 内容液の目視観察
各試料製剤の内容液を、 白色蛍光灯下、 ゆるやかに攪拌しながら目視で観察し、 濁り の有無を判定した。
(2)濁度測定
試料製剤の内容液を石英ミクロセルに採取し、 紫外分光光度計 （日立 U— 3300型） で、 波長 400 nmにおける吸光度 （ O.D.400) を測定した。
(1) 内容液の目視観察および （2)濁度 （O.D.400) 測定の結果を第 7表に示した。 第 7表
Figure imgf000015_0001
処方 12では目視観察の結果、 明らかな白濁が認められ、 濁度 (O.D.400) も高い値 を示した。 一方、 処方 13、 処方 14、 処方 15および処方 16では内容液の目視観察の 結果、 濁りは観察されず、 また濁度 （O.D.400) の値も処方 12に比べ顕著に低いこと が確認された。
実施例 7 可溶性会合体および化学的分解物抑制効果の確認 （試料調製）
第 8表に示す処方 17~21の溶液組成物をそれそれ調製し、 無菌ろ過を実施後、 ガラ ス製バイアルに注入し、 ゴム栓、 アルミキヤヅプで密封し、 試料製剤とした。 これらの操 作は全て無菌的環境下で行った。抗体は WO03/18635に開示されている CCR4に対するヒト 型0011移植抗体1： 8761を用いた。 第 8表
Figure imgf000016_0001
実施例 8 可溶性会合体および化学的分解物抑制効果の確認 （安定性試験）
実施例 8で調製された各試料製剤を 4◦ °C；、 1ヶ月間保存した後、 内容液を以下の条件 でゲルろ過 H P L Cにより分析し安定性を評価した。
(H PLC条件）
カラム： TSKgel G3000 SWXL (東ソ一）
移動相： 0. 3mo 1/L 塩ィ匕ナトリウムを含む、 0. 05mo 1/L リン酸塩緩衝 液
測定波長： 280 nm
流速： 1 mL/ m 1 n
注入量： 40 L
装置： L C— 10 Aシステム （島津製作所）
HPL Cチャート上で、 未変化体ピークより高分子量側に溶出された成分のピーク面 積の総和を可溶性会合体ピーク面積として、 以下の式により可溶性会合体含量を算出し た。
可溶性会合体ピーク面積
可溶性会合体含量 （％) = X 100 (1) 総ピーク面積
また HPLCチヤ一ト上で、未変化体ピークより低分子量側に溶出された成分のピーク面 積の総和を化学的分解物ピーク面積として、 以下の式により化学的分解物含量を算出した。 化学的分解物ピーク面積
化学的分解物含量（％) = X 1 0 0 ( 2 ) 総ピーク面積
ゲルろ過 H P L Cの結果を第 9表に示した。 結果は測定値から初期値を差し引き、 保存 期間 （4 0 °C、 1ヶ月） 中の増加量を示している。 第 9表
Figure imgf000017_0001
可溶性会合体およびィ匕学的分解物のいずれにおいても、処方 1 7と処方 1 8、処方 1 9、 処方 2 0および処方 2 1とを比較した結果、 優れた安定性を有することが明らかとなった。 実施例 9 製剤の安定性確認 （試料調製）
第 1 0表に示す処方 2 2の溶液組成物を調製し、 無菌ろ過を実施後、 ガラス製バイアル に注入し、 ゴム栓、 アルミキャップで密封し、 試料製剤とした。 これらの操作は全て無菌 的環境下で行った。 抗体は WO03/18635に開示されている CCR4に対するヒト型 CDR移 植抗体 KM 8 7 6 1を用いた。
第 1 0表
Figure imgf000017_0002
実施例 1 0 製剤の安定性確認 ( 4 0 °C保存）
実施例 9で調製された試料製剤を 4 0 ° 1ヶ月間保存した後、 内容液を以下の条件で ゲルろ過 H P L Cにより分析し安定性を評価した。
(H PLC条件）
カラム： TSKgel G3000 SWxL (東ソ一）
移動相： 0. 3mo 1/L 塩化ナトリゥムを含む、 0. 05 m o 1 /L リン酸塩緩衝液 測定波長： 280nm
流速： 1 mL/ m 1 n
注入量： 40 ^ L
装置： LC— 1 OAシステム （島津製作所）
HP LCチャート上で、 未変化体ピークより高分子量側に溶出された成分のピーク面 積の総和を可溶性会合体ピーク面積として、 以下の式 （1) により可溶性会合体含量を 算出した。
可溶性会合体ピーク面積
可溶性会合体含量（％) = X I 00 (1) 総ピーク面積 また HP L Cチャート上で、 未変化体ピークより低分子量側に溶出された成分のピーク 面積の総和を化学的分解物ピーク面積として、 以下の式 （2) により化学的分解物含量を 算出した。 化学的分解物ピーク面積
化学的分解物含量（％) = X 1 00 (2) 総ピーク面積
ゲルろ過 HP LCの結果を表 11に示した。 結果は測定値から初期値を差し引き、 保存 期間 （40°C、 1ヶ月） 中の増加量を示している。 第 11表
Figure imgf000018_0001
クェン酸およびグリシンを含む処方 22は、 可溶性会合体および化学的分解物のいずれ の点において優れた安定性を有することが確認された。 実施例 11 製剤の安定性確認 ( 70°C保存）
実施例 9で調製した製剤の内容液を孔径 0. 2 mのフィル夕一でろ過し、 ガラス製試 験管に注入した。試験管の口を栓で密封し試料とした。 70°C、 210秒間で保存した後、 以下の試験項目について安定性試験を行った。
(1) 内容液の目視観察
一 各試料製剤の内容液を、 白色蛍光灯下、 ゆるやかに寧拌しながら目視で観察し、 濁り の有無を判定した。
(2)濁度測定
試料製剤の内容液を石英ミクロセルに採取し、 紫外分光光度計 （日立 U— 3300型） で、 波長 400 nmにおける吸光度 （ O.D.400) を測定した。
(1) 内容液の目視観察および （2)濁度 （O.D.400) 測定の結果を第 12表に示し た。
第 12表
Figure imgf000019_0001
クェン酸およびグリシンを含む製剤である処方 22は、 不溶性凝集体の点においても優 れた安定性を有することが確認された。
産業上の利用可能性
本発明により、 溶液中での抗体の安定化方法および安定化された溶液状抗体製剤を提供 することができる。

Claims

請求の範囲
1.抗体にグリシン及びクェン酸を添加することを特徴とする、 溶液中で抗体を安定 化する方法。 .
2. 抗体を安定化する方法が、 溶液中での抗体の可溶性会合体の生成抑制および化学 的分解物の生成抑制である請求の範囲 1記載の方法。
3. 抗体にグリシンを添加することを特徴とする、 溶液中で抗体の可溶性会合体の生 成を抑制する方法。
4.抗体にクェン酸を添加することを特徴とする、 溶液中で抗体の化学的分解物の生 成を抑制する方法。
5. 抗体濃度が 0. 01〜： L 5 OmgZmLである、 請求の範囲 1 4のいずれか 1 項に記載の方法。
6. グリシンの濃度が 10~3 Omg/mLである、 請求の範囲 1 ~ 3のいずれか 1 項に記載の方法。
7. クェン酸の濃度が 0. 1~5 Ommo 1ZLである、 請求の範囲 1、 2および 4 のいずれか 1項に記載の方法。
8. さらに非イオン性界面活性剤を含有する請求の範囲 1〜 7のいずれか 1項に記載 の方法。
9. 溶液の pHが 4〜 7の範囲内である請求の範囲 1〜8いずれか 1項に記載の方法。
10. 抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である請求の範囲 1〜9のいずれか 1項に記 載の方法。
11. 抗体がガングリオシド GD 3に対する抗体および C Cケモカイン受容体 4 (以 下、 CCR4 という） に対する抗体のいずれかの抗体である請求の範囲 1〜10のいずれか 1 項に記載の方法。
12. グリシンおよ1び抗体を含有することを特徴とする、 抗体の可溶性会合体の生成 が抑制された溶液状抗体製剤。
13. クェン酸および抗体を含有することを特徴とする、 抗体の化学的分解物の生成 が抑制された溶液状抗体製剤。
14. グリシン、 クェン酸および抗体を含有することを特徴とする、 抗体の可溶性会 合体の生成、 化学的分解物の生成および不溶性凝集体の生成が抑制された溶液状抗体製剤。
15. 抗体濃度が 0. 01〜； 15 Omg/mLである、 請求の範囲 12〜14のいず れか 1項に記載の製剤。 '
16. グリシンの濃度が 10~3 Omg/mLである、 請求の範囲 12、 14および 15のいずれか 1項に記載の製剤。
17. クェン酸の濃度が 0. 1~5 Ommo 1/Lである、 請求の範囲 13~1 5の いずれか 1項に記載の製剤。
18. さらに非イオン性界面活性剤を含有する請求の範囲 12〜17のいずれか 1項 に記載の製剤。
19. 溶液の pHが 4~ 7の範囲内である請求の範囲 12〜18のいずれ力 1項に記 載の製剤。
20. 抗体がヒト化抗体またはヒト抗体である請求の範囲 12〜19のいすれか 1項 に記載の製剤。
21. 抗体がガンダリオシド GD 3に対する抗体および CCR 4に対する 体のいず れかの抗体である請求の範囲 12〜 20のいずれか 1項 記載の製剤。
22. グリシンを有効成分として含有することを特徴とする、 溶液中での 体の可溶 性会合体の生成抑制剤。
23. クェン酸を有効成分として含有することを特徴とする、 溶液中での抗体の化学 的分解物の生成抑制剤。
24. グリシン及びクェン酸を有効成分として含有することを特徴とする、 抗体の安 定化剤。
' 25. 抗体の安定化が、 溶液中での抗体の可溶性会合体の生成抑制、 化学的分解物の 生成抑制および不溶性凝集体の生成抑制である、 請求の範囲 24記載の抗体の安定化剤。
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