JPH07502497A - 安定化抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 安定化抗体 この発明は、分解、特に保存時および使用に先立つ処理の際の分解に対する免疫 グロブリンの安定化に関する。

抗体もしくは免疫グロブリンは、二官能性タンパク分子である。異なる抗体の間 で高度に変化し得る一方の部位は、第二の定常部位が細胞のＦＣ受容体への結合 の要因であり、また補体を活性化するのに対し、抗原、例えば生体が遭遇し得る 多くの異なる感染因子に結合する要因である。このように、抗体は、外来微生物 およびウィルスの破壊における哺乳動物の免疫応答の生体成分を代表する。

抗原を用いて動物を免疫することて、異なる特異性および親和性を有する異なる 抗原の産生が生じる。したがって、免疫動物から得られる抗血清は異種抗血清で あり、多くの異なるリンパ球クローンによって産生される抗体プールを含む。

このようにして１）られる抗体はポリクローナル抗体と呼ばれ、このポリクロー ナル性は、診断アッセイおよび治療用途での抗体の使用における主な欠点であっ た。

１９７５年、Ｋｏｈ１４ｒおよびＭｉｌｓｌ＊ｉｎ　（Ｎａｌｕｕ、１９７５． 　２５６　。

４９５−４９７　＞が、抗原で免疫したマウスからの肺臓細胞とネズミミエロー マ株の細胞との融合の成功を報告したとき、大きなステップが前方に踏み出され た。１１イブリドーマと呼ばれる得られた雑種細胞は、肺臓細胞由来の抗体産生 能力を有し、ミエローマ細胞に由来して連続増殖性である。各／％イブリドーマ は、元の抗原の特定の決定基に対する単一の抗体を合成し、分泌する。培養物中 の全ての細胞が同一である、すなわちそれらが独特の抗体種の合成に必要な遺伝 情報を有していることを確実にするために、細胞融合の結果得られたハイブリド ーマのクローニングおよびサブクローニングを行なう。

このように、クローン化ハイブリドーマは、同種抗体もしくはモノクローナル抗 体を産生ずる。

ハイブリドーマ科学の利点は深遠である。各肺臓がら生起する多くの雑種を目的 の抗原に対する抗体の産生能力についてスクリーニングし、わずか数種を選別す るため、純粋ではない抗体を用いて免疫し、さらには特異抗体を得ることさえら 力呵能である。この細胞株の不死性は、よく特徴付けられた同種抗体を、特に病 理学的疾患の診断および免疫療法を含む種々の用途に無■に供給して使用するこ とを可能にする。

不幸にして、臨床環境におけるそのような抗体の有用性は、ヒト抗マウス抗体の 発現（抗グロブリン反応）によって極度の妨げられることがあり、これが治療を 妨害したり、あるいはアレルギーや免疫；夏合体過敏症を引き起こしたりするこ とがある。

抗体分子は、踏量のジスルフィド結合によって互いに保持される２本の軽鎖と２ 本の重鎮とからなる。各々の軽鎖はジスルフィド結合によって重鎮に連結し、２ 本の重鎮はジスルフィド結合によって互いに連結している。各重鎮はその一端に 可変ドメインとそれに続く幾つかの定常ドメインを有し、各軽鎖はその一端に可 変ドメインを、他端に定常ドメインを何する。軽鎖可変ドメインは、重鎮の可変 ドメインと並列している。軽鎖定常ドメインは、重鎮の第１定常ドメインと並列 している。重鎮の残りの定常ドメインは、互いに並列している。軽鎖および重鎮 の定常ドメインは、抗原に対する抗体の結合には直接関与しない。

軽鎖および重鎮の対の各々の可変ドメインは、抗原結合部位を形成する。これら は、各ドメインがフレームワーク領域を含む同様の一般構造を有する。このフレ ームワーク領域は、その配列が比較的保全され、３つの相補性決定領域（ＣＤＲ ）によって連結される４つの領域からなる。４つのフレームワーク領域はβ−ン ート・コンホメーションを大幅に取り入れ、ＣＤＲはβ−シート構造を結合し、 時にはその一部を包含するループを形成する。ＣＤＲは、フレームワーク領域に よって非常に接近した状聾に保持され、他のドメインからのＣＤＲと共に抗原結 合部位の形成に寄与する。

ネズミモノクローナル抗体の使用において、ヒト抗マウス抗体反応の誘発は、ネ ズミ起源の定常ドメインおよび４つのフレームワーク領域によるものである。し たがって、この問題は、２種類の基本型の変性抗体の開発によって処理されてい る。第１の型はキメラ抗体と呼ばれ、ネズミ定常ドメインのみかヒト起源の同等 ドメインによって置換されたものである（Ｍｏｕｉｓｏｎ　ｅｌ　ａｌ、　Ｐ、 Ｎ、＾Ｓ、、　１９８４．８１．６８５１−６８５５；Ｂｏｕｌｉａｎｎｅ　ｅ ｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、１９８５．３］４　、２６８−２７０；およびＮ５ ｕｂｅ＋ｇｅ＋　ｅｌ　ａｔ、　Ｎａｔｕｒｅ、　１９８５．其４　、２６８− ２７０　）　、第２の型は、ネズミ定常ドメインおよびネズミフレームヮーク領 域か全てヒト起源の同等ドメインおよび領域によって置換されたものである。こ の第２の型の変性抗体は、ヒト化もしくＮａｔｕｒｓ、１９ｇ８．　３２２　、 　３２３−３２７　）。

完全な臨床研究に十分な量の抗体を産生させるためには、効率のよい組換え発現 系を利用することが望ましい。ミエローマ細胞は、抗体産生および分泌に特殊化 した天然ポストを代表するものであるので、これらがら誘導された細胞系が組換 え抗体の発現に用いられている。時には、免疫グロブリン調節要素周辺に基づく ｍ合ベクターの設計が必要となり、大きく変化しｉ）る最終発現レベルが報告さ れている（Ｗｉｎｔｅ「ｅｔ　ａｌ、　Ｎａｔｕｒｅ、１９８８．３３２　、３ ２３−３２７；　Ｗｉｅｄｌｃｅｌ　ｘｉ　。

匣、＋９８９．７　、７９９−８０４　）。

抗体について提案されている他の型の発現系には不死化ヒトＢ細胞が含まれる（ Ｒｉｃｅｅｆ　ａｌ、　Ｐｒｏｃ、Ｎａ１１．Ａｃａｄ、Ｓｅｉ、ＵＳＡ、（＋ ９８２）　叩、　７８６２−７８６５　）が、一般に収率が低く、安定な細胞系 を確立する。二とか困難である。Ｅ、ｃｏｌｉがＦ　フラグメ□　Ｖ Ｓｃｉｒｎｃｅ、（１９８８）　２４２　、４２３−４２６　）の発現に用いら れているが、現時点ではこの系において完全な免疫グロブリンは産生されていな い。しかしながら、抗体は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞のよう な組換えタンパク質の産生て公知の哺乳動物発現系においてうまく産生されてい る。

治療もしくは診断のいずれかの用途に用いられる精製抗体の産生においては、抗 体が、保存時並びに抗体の安定に悪影響を及はし１５る種々の化学物質に対して 十分に安定であることが重要である。この発明は、痕跡量の銅（ｃｕ＋＋）が保 存時の免疫グロブリン分子に対する膜安定化作用を有し、この作用が免疫グロブ リン分子を適切な銅イオンキレート剤と一緒に処方することにより除去し得ると いう驚くべき発見に基ついている。

驚くへきことに、免疫グロブリンが原子吸光分光分析のような通常の技術で検出 し１５る量の銅を含有しない場合であっても、銅イオンキレ−１・剤の存在が免 疫グロブリン分子に対する安定化作用を示すことがあることも見出されている。

特定の理論で区切りをつけることを望むものではないが、原子吸光分光分析のよ うな技術の検出限界を下回る量の銅イオンの存在か、適切なキレート剤を添加す ることにより除去することができる免疫グロブリンに対する膜安定化作用を依然 として有している可能性がある。

この発明は、少なくとも１種の免疫グロブリンを、安定化量の銅イオンのキレー ト剤と一緒に含有する安定化免疫グロブリン組成物を提供する。

この発明はまた、免疫グロブリンの保存時の分解、例えば銅イオンの作用の結果 としての分解に対する安定化への銅イオンのキレート剤の使用を提供する。

痕跡量の銅イオンが免疫グロブリンに対する膜安定化作用を有するという事実は 、安定性の見地から、免疫グロブリンが最少可能量の銅イオンを含有することを 確証するという利点があり得ることをも意味する。さらなる側面によると、この 発明は、実質的に銅イオンを含有しない精製免疫グロブリンを提供する。特に、 この発明は、原子吸光分光分析のような通常の技術を使用しても銅を検出するこ とができない免疫グロブリンを提供する。

この発明はまた、免疫グロブリンの安定性を増強する方法であって、免疫グロブ リンに、それらから銅イオンを除去することが可能な精製手順を施すことを包含 する方法を提供する。特に、この手順は、原子吸光分光分析のような通常の手続 きの使用によっては免疫グロブリン中に銅を検出することができないようなもの であるべきである。銅は、タンパク精製の分野において公知の通常の手順、例え ば、シアン化カリウム含有リン酸緩衝液に対する透析とこれに続くゲル濾過で銅 をシアン化銅として除去する手順（例えば、Ｂａｋｅｒ　ａｎｄＥｕｌｌｑｕｉ ｓｔ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅｍ、、　２５３．８４４−８４５　（１９７８）を 参照）によって、免疫グロブリンから除去することができる。

この発明は、全てのクラスの免疫グロブリン、すなわちＩ　ｇＭ、Ｉ　ｇＧＳ　 Ｉ　ｇＥおよびＩｇＤの安定化に適用することが可能であり、Ｆａｂおよび二重 特異性抗体の安定化に拡張することも可能である。この発明は、サブクラスＩｇ Ｇ１゜ＩｇＧ　Ｓ　ＩｇＧ　、ＩｇＧ　およびＩ　ｇ　Ｇ　ｉ、を含むクラス２ Ａ　２Ｂ　３ ＩｇＧの免疫グロブリンの安定化に適用することが好ましい。

この発明は、クラスＩｇＧ１の免疫グロブリンの安定化に適用することがより好 ましい。

この発明は、特には組換え抗体の安定化、最も詳しくはキメラ抗体もしくはヒト 化（ＣＤＲ−グラフト化）抗体の安定化にその用途を見出す。これらの詳細な例 には、ＣＤ２、ＣＤ３　、ＣＤ４　、ＣＤ５　、ＣＤ？　、ＣＤ８　、ＣＤ１１ ａ　、ｂ　。

ＣＤ＋８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤ５４に対するキメラもしくはヒ ト化抗体および、特に、ＣＤＷ５２抗原に対するヒト化抗体、例えばＣＡＭＰＡ ＴＩＩ−１８（ＣＡＭＰＡＴＨはウェルカム企業グループの商標）が含まれる。

さらなる例には、種々の腫瘍細胞マーカー抗原に対するキメラもしくはヒト化抗 体が含まれる。

一般に、免疫グロブリンは、♀朋段階、例えば精製中もしくは精製直後に、金属 イオンキレート剤と処方される。免疫グロブリンの産生手順は、一般に、クロマ トグラフィおよび／またはケル濾過カラムによる精製を包含する。キレート剤は 、精製手順の都合のよい段階、例えば、精製手順の終了時に免疫グロブリン中に キレート剤が残留するように、最終カラムの段階で添加することかできる。その 代わりに、キレート剤は、精製に続く適切な段階で添加することができる。凍結 乾燥免疫グロブリンの場合には、キレート剤は、一般に、凍結乾燥の前に添加す る。

免疫グロブリンに添加するキレート剤のレベルは、存在するいかなる銅もキレ− Ｉ・剤に結合し、それにより免疫グロブリンの脱安走化においてそれらが無効に なることを保証するようなものである。用いられるキレート剤は、目的とする免 疫グロブリンの最終用途に対する悪影響を持たないように選択されるべきではあ るものの、この発明は目的とする免疫グロブリンの最終用途に関係なく適用する ことができる。例えば、治療用途を目的とする抗体の場合には、キレート剤はそ れが存在するであろうレベルで毒性作用を示すべきではない。

特に好ましい金属イオンキレート剤は、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で あり、これは、典型的には、０．０５ｍＭないし５ｍＭ、好ましくはＯ，ＩｍＭ ないし３ｍＭのレベルで免疫グロブリンに添加することができる。ヒトへの投与 を目的とする免疫グロブリンの場合に、ＥＤＴＡ　Ｏ，１ｍＭのレベルは、しば しば免疫グロブリンの安定化に十分なものであるが、２ｍＭまで、もしくはそれ 以上のレベルは生理学的になんら問題を示さない。代わりの金属イオンキレート 剤は、好ましくはアルカリ金属クエン酸塩の形で用いられるクエン酸イオン、例 えばクエン酸す）・リウムである。

治療用途を目的とする免疫グロブリンは、一般に、医薬製剤の形態で患者に投与 される。そのような製剤には、免疫グロブリンに加えて、生理学的に許容し１序 る担体または希釈剤が、おそらくは１種以上の他の薬剤、例えば他の免疫グロブ リンもしくは抗生物質のような薬剤と混合して、好ましく含まれる。適切な担体 には、生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水グルコースお よび緩衝生理食塩水が含まれるが、これに限定されるものではない。これに代え て、免疫グロブリンを凍結乾燥し、必要に応じて使用するために上述の緩衝水溶 液を添加することによりもどすこともできる。投与経路は、静脈内、筋肉内、皮 下および腹腔内注射もしくは送達を含む所定の非経口投与である。キレート剤＋ １、保存および配布または最終用途のいずれかを目的とする（馬力１なるタイプ の免疫グロブリン製剤にも組み入れることができる。医薬製剤は一般に、凍結乾 燥製品の場合にはもどされて、単位投与量当り有効治療投与量の免疫グロブリン を含有する。

ヒト化抗体ＣＡＭＰＡＴＩＩ−１１１の場合には、液体製剤またはもどされた凍 結乾燥製剤は、好ましくは抗体０．５ないし２１）ｍ　ｇ　／ｍｌ、好ましくは ’；１ｍ　ｇ　／　ｍ　１もしくは１０ｍｇ／ｍｌを含有この発明を以下の例に よって説明する。

例　１ 組換え抗体の安定性に及ぼす種々の添加物の効果を３７℃で研究した。抗体は、 ＣＤｗ５２抗原に対するヒト化抗体であるＣＡＭＰＡＴＢ　ＩＢ　（Ｒｉｅｃｈ ｍａｎｎ　ｓｔ　ａｌ　、　ｔｌａｌｕｒ＊、　３２２　、３２３−３２７（１ ９８８））であり、これは抗体分子の重鎮および軽鎖をコード゛するＤＮＡて形 質転換された組換えＣＨＯ細胞系におＣする発現により産生されたものである。

この抗体を細胞培養１ｉ地力為ら抽出して精製した後、リン酸緩衝生理食塩水溶 １夜（１ｍｇ／ｍ１）として４℃で保存した。

上記ＣＡＭＰＡＴＩＩ　ＩＨの溶液０．５ｍｌを特定の添加物と共１こ収容する バイアルを、無菌条件下において、＋３７℃で４週間インキュベートした。この 期間の最後に試料をサイズυＹ除ＨＰＬＣで分析し、試料の安定性を、全溶出タ ン＜り質１こ基づく［ビークＣｌ　（約５０にの分子量を有する抗体の主要分解 生成物によって形成されるピーク）の形成の程度により評価した。

表１ 銅はＣｕＣΩ　・　２Ｈ２０として、１．１０−フェナントロリンは２％（ｖ／ ｖ　）エタノールを含有する水溶液として添加した。

これらの結果は、銅が、対照と比較して、抗ｆ本の分解のｆ呈度を増強すること を示している。ＥＤＴＡの添７ＪＩＩ　＋よ、（也の金属イオンキレート剤であ る　１．１０−フェナントロリンが分解を相当程度減少させるのに対して、実質 的に分解を排除する・例　２ この例もまた、例１において言及されるタイプのＣＨＯＩ１１胞で産生されるＣ Ａ！、ＩＰＡＴ）Ｉ　ＩＩ（（ＩＪン酸緩衝生理食塩水中１１．３ｍｇ／ｍｌ） を用い、このノ〈ンチは１ｍｌ当りＱ、０４ａｇのＣｕ２＋を含有するものと測 定された。この例並びに以下の例において、抗体試料の銅含墓はフィリップスＰ Ｕ９４００Ｘ原子吸光分光光度計を用いる原子吸光分光分析により測定した。

この方法の検出限界は約０．０３ＭｇＣｕ／ｍｌなので、「検出可能な銅を含有 しない」と称する試料は１ｍｌ当り０．０３Ｍｇ未満のＣｕを金白゛する。この ＣＡＭＰＡＴＩＩ　ＩＨの試料をリン酸緩衝生理食塩水中に１ｍｇ／ｍｌとなる ように希釈し、ｐＨ６，０、ｐＨ６，４およびｐＨ６，８の０．２Ｍリン酸ナト リウム緩衝液に対して徹底的に透析した。ＣＡＭＰＡＴＨＩＩは、事前に、ｐ　 Ｈ約６で熱による分解に対して最も安定であることが測定されていた。各ｐＨに おいて、試料３００μｌに以下の物質：（１）水中１０ｍ　ＭのＣｕ　ＣＤ　＃ ２Ｈ２０３０μｍ　：（１１）水中１０ｍ　ＭのＥＤＴＡ　３０ｕ　１　；（ｉ 　ｉ　ｉ）緩衝液３０μｌ； を添加し、試料を６２℃で２４時間インキュベートした。アリコート５０μｌを 例１と同様に分析した。すなわち、分解をサイズ排除クロマトグラフィーにより 評価し、全溶出タンパク質に基づく　「ビークＣ」の形成の程度として測定した 。

％ビークＣの結果を下記表２に示す。

表２ す銅の作用が高まることを示している。銅を添加しない場合においても、ｐＨの 増加に従って％ピークＣの増加が見られる。ＥＤＴＡの存在下ては、ＣＡＭＰＡ ＴＩｉ　ｌＨの分解は抑制される。

例　３ この例は、例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞で産生されるＣＡ＆ＩＰ ＡＴｔｌ　Ｉｌｌの２種類の異なるバッチ（リン酸緩衝生理食塩水中１０ｍｇ／ ｍｌ）を用いた：バッチ１は原子吸光分光分析の測定による検出可能なＣｕ２＋ を含有せず、バッチ２は１ｍｌ当り０，０４ＭｇのＣｕ２＋を含有する。両バッ チの試料をリン酸緩衝生理食塩水中に１ｍｇ／ｍｌに希釈して、５０ｍＭ炭酸水 素アンモニウムに対して４℃で２４時間徹底的に透析し、さらにバッチ２に１ｍ Ｍ　ＥＤＴＡを添加して銅の作用を除去した。両バッチのアリコート２００ｕｌ を４、ＩＱ。

２０．３０．４０．５０および６２℃で２４時間インキュベートし、分解を例１ に記載されるようにサイズ排除クロマトグラフィーにより評価し、全溶出タンパ ク質に基づく「ビークＣ」の形成の程度として測定した。

％ビークＣの結果を下記表３に示す 表３ バッチ１においては検出可能なＣｕ２＋は見出されなかったが・３０および４０ °Ｃでのインキュベーションについては幾らかの分解が明らかであり、５０およ び６２℃では広照な分解があった。検出可能なＣｕ２＋を含有するバッチ２の場 合には、ＥＤＴＡの存在下で、昇温時てあっても最小限度の分解が見られた。こ れらの結果は、検出可能以下のレベル（＋ｕｂｄｓｔｔｃＨｂｌｓｌｅｖｅｌｓ 　）のＣｕ２＋がＣＡＭＰＡＴＩＩ　ｉｌｌの分解を促進する可能性を示唆して いる。

例４ 例１の結果を、ＣＨＯ細胞において産生された同じＣＡＭＰＡＴｎ　ｔｌｌ抗体 を用いて、６２℃で２４時間にわたる３１時インキュベーションにより確認した 。用いたバッチは、原子吸光分光分析により　１ｍｌ当り０．０３ＭｇのＣｕ２ ＋を含有することが測定された。リン酸緩衝生理食塩水中に３．７ｍｇ／ｍｌの ＣＡＭＰＡＴＯ１８を含有するこのバッチを、３×２リツトルの５０ｍＭ炭酸水 素アンモ丘ウムにつして＋４℃で２４時間透析した。アリコート１００μｌを下 記添加物と共に６２℃でインキュベートした：（ｉ）０．ＯＩＭ　ＥＤＴＡ　５ μｌ　（水中）＋０、１Ｍ　Ｃｕ　ＣｆＪ・２Ｈ２０１０μｍ　（水中）；（ｉ ｉ）０．０１Ｍ　ＥＤＴＡ　５μｌ（水中）；（ｉｉｉ）　なし。

添加するＥＤＴＡの量は、抗体中のいかなる残留遷移金属イオンをもキレートす るに十分ではあるが、試料（ｉ）においで添加される銅をキレートするには十分 ではないものであるべきである。

試料５０μｍを、分析のため、０．１．　２．３．４．５および２４時間で抜き 取った。これらの試料を、サイズ排除１１　Ｐ　ＬＣにより、抗体が分解してい る程度の指標として得られるビークＣの形成の程度を用いて、例１と同様に分析 した。その結果を下記表４に示す。

表４ この例もまた、例１において言及されるタイプのＣＨＯｍ胞で産生されるＣＡＭ ＰＡＴＩ（ＩＨ（リン酸緩衝生理食塩水中１０．Ｏｍｇ／ｍｌ）および原子吸光 分光分析による測定で検出可能な銅を含存しないバッチを用いた。このＣＡＭＰ ＡＴＨ１Ｈの試料を５０ｒｎＭ炭酸水素アンモニウムに対して＋４’Ｃで透析し 、アリコート１００μｌを増加する濃度のＣｕＣΩ　・　２Ｈ２０（水中）１０ μｌと共に６２°Ｃて２４時間インキュベートした。これらの試料を、サイズ排 除ＨＰＬＣにより、抗体が分解している程度の指標として得られるビークＣの形 成の程度を用いて、例１と同様に分析した。結果を下記表５に示す。

表５ 分解の程度は、Ｃｕ　２＋／　ＣＡＭＰＡＴＨＩＩのモル比の増加に伴って増加 することが見出された。　０．３を越える比率（データは示さず）では、全タン パク質の回収率をより低いものとする凝集か見られた。

例に の例もまた、例１において言及されるタイプのＣＨＯ細胞で産生されるＣＡＭＰ ＡＴＨ１ｌｌ（リン酸緩衝生理食塩水中１．（１ｍｇ／ｍ　１）を用い、バッチ は原子吸光分光分析による測定て１ｍｌ当りＱ、１９ｕｇのＣｕ２＋を含有する ことが見出されていた。このため、この試料は高い銅含量を有しく銅／　ＣＡ＆ ＩＰＡＴＢＩＨモル比４４９ｐモルＣｕ”／ｎモルＣＡ１１ｌＰＡＴＨ１Ｂ　） 　、早期の安定性研究はこのバッチが３７°Ｃでの保存時に実質的な分解を受け ていることを示した。

この試料の、２ｍＭ　ＥＤＴＡの存在および非存在下における、３７°Ｃでの４ 週間までのインキュベーションの効果を下記表６に示す。これらの試料を、サイ ズ排除ＨＰＬＣにより、抗体が分解している程度の指標として得られるビークＣ の形成の程度を用いて、例１と同様に分析した。

表　６ ２ｍＭ　ＥＤＴＡはＣＡＭＰＡＴ）Ｉ　ＩＨの分解を実質的に減少させるが、そ れを完全に阻止することはない。

同じＣ、（＆Ｉ　Ｐ　、１．　Ｔ　ＨＩ　Ｈの試料を５０ｍＭ炭酸水素アンモニ ウムに対して÷４°Ｃて透析し、アリコート　１００μｍを濃度を変化させたＥ ＤＴＡと共に６２℃で２４時間インキュベートした。これらの試料を、サイズ排 除ＨＰＬＣにより、抗体が分解している程度の指標として得られる「ビークＣ」 の形成の程度を用いて、例１と同様に再度分析した。２つの別々の実験の結果を 下記表７および８に示す。

表８ これらの結果は、０．０１ｍＭ　ＥＤＴＡ程度の少量でＣＡＭＰＡＴＨ＋１３の 分解を有効に阻害することを示す。

例７ 種々の抗体の分解に及はすＣｕ２＋およびＥＤＴＡの効果を下記表９に示す。全 ての試料は、あらゆる添加物の非存在下において４°Ｃおよび６２°Ｃで２４時 間、並びにＣｕ　２＋（ｌｍＭＣｕ　Ｃｊｌ）　・２ＨＯ＋　０．５ｍＭ　ＥＤ ＴＡ）もしくはＥＤＴＡ　（１ｍＭ　ＥＤＴＡ）のいずれかの存在下において６ ２℃で２４時間インキュベートした。

表９ Ｉ　ｇＧ＋−マウスモノクローナルＩｇＧ１抗体、リン酸緩衝生理食塩水中１ｍ ｇ／ｍｌ； ＣＩＨ−例１に記載されるタイプのＣＡｋｌＰＡＴＨＩｌｌ　、リン酸緩衝生理 食塩水中１ｍｇ／ｍｌ； ＣＤ４　−ＣＡＭＰＡＴＨＩＨと同じフレームワーク領域を有し、ＣＨＯ細胞で 産生されるヒト化抗ＣＤ４モノクローナル抗体、リン酸緩衝生理食塩水中 １ｍｇ／ｍｌ； １ｇＧ２−ジグ７　（Ｓｉｇｍｚ　）から市販されるマウスＩｇＧ２モノクロー ナル抗体１−４１３９　、リン酸緩衝液から凍結乾燥されて供給され、水で１ｍ ｇ／ｍｌに再溶解した。

全ての試料は、４℃ではほとんどもしくは全く分解を示さない。これに対して、 ６２℃では幾らか分解し、これは銅の存在によって変動する度合いで増加する。

６２℃での分解は、ＥＤＴＡによって抑制される。

例８ ＣＡＭＰＡＴＩＩ−１１１の安定性に対するリン酸緩衝生理食塩水中の２ｍＭ　 ＥＤＴＡ　（ｐＨ７，２）および５０ｍＭクエン酸塩（ｐＨ６，０）の効果の間 の比較を、種々のレベルの銅で行なった。例１において言及されるタイプのＣＨ Ｏ細胞で産生されるＣＡＭＰＡＴＨＩｌｌ　（このバッチは原子吸光分光分析に よる測定で険出しＩ”Ｊる銅を合釘しない）を、リン酸緩衝生理食塩水で体積１ ０に対してｌに希釈した。アリコート　１ｍｌを下記緩衝液１リツトルにλ＝ｔ 　して透析した。

（ｉ）　リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，２；（１１）リン酸緩衝生理食塩水中 ２ｍＭ　ＥＤＴＡ、ｐＨ７，２；（ｉｉｉ）　５０ｍＭクエン酸ナトリウム、ｐ Ｈ６，０゜透析は、４℃で、３回交換しながら１６時間にわたって行なった。次 いて、緩衝液ブランクを用い、かつ吸光３１数Ａ２８゜（０１％）を１．３２と して３４０ないし２００ｎｍを走査することにより、３つの試料についてタンパ ク濃度をＭ１定した。

（ｉ）　］、　３２ｍ　ｇ／ｍ　１ （ｉｉ）　１．２０ｍ　ｇ／ｍ　１ （ｉｉｉ）　１．２７ｍ　ｇ／ｍ　１ のタンパク濃度が測定された。

その後、上記緩衝液中の抗体のアリコート２００μｌを、増加する濃度のＣｕＣ ｆ　・　２Ｈ２０（２０ｍＭまで）と共に、６２℃で２４時間インキュベートし た（６２℃はＣＡＭＰＡＴＢ−１ｎの銅誘発開裂の最適温度である）。次いで、 試料（アリコート５０μｍ）を例１に記載される方法でサイズ排除ＨＰＬＣによ って分析し、カラムから溶出されるＡ　−吸光ピークのクロマドグラムを切断し 、秤量することによって種々の両分を統合した。この場合、結果は％［ピークＢ Ｊ　（全ＣＡＭＰＡＴＩＩ−１１１＞と記録した。

結果を下記表１０に示す。

表１Ｏ ｐＨ７，２のリン酸緩衝生理食塩水単体番二お（するＣＡＭＰＡＴＩＩ−１１１ の開裂は、たとえ銅を添加しなくとも、６２°Ｃで２４０寺間のインキュベーシ ョンの際には比較的早い。リン酸緩衝生王！食塩ｙｋプラス２ｍＭ　ＥＤＴＡに お（１でｉｔ、　１ｍＭより多食の調力（添加された場合に開裂が誘発される。

５０ｍＭクエン酸塩、ｐＨ５，Ｑにおいては、ＩＯｍ　Ｍを越える銅が添加され た場合に開裂が起こる。

例９ 例８と同様の実験でｐｌＩの変化の効果ら調べた。リン酸緩衝生理食塩水中の、 例１において言及されるタイプのＣ１１０細胞において産生されるＣＡＭＰＡＴ Ｈ−ＩＨ（このバッチは原子吸光分光分析によるｌ１１１定で検出しｆｔ５る銅 を含［ていない）を、リン酸緩衝生理食塩水、ｐＨ７，２中にｌ；２０に希釈し た。その後、例８に記載されるようにタンパク濃度を測定し、リン酸緩衝生理食 塩水、ｐＨ７，２またはリン酸緩衝生理食塩水、ｐｌＩ６．０でタンパク濃度２ ｍｇ／ｍｌに試料を希釈してｐｌＩをチェックした。ＣＡＭＰＡＴＩＩ−ＩＨ試 料（ｐＨ７，２もしくはｐＨ６０のいずれかのリン酸緩衝生理食塩水中２ｍｇ／ ｍｌ）の各々のアリコート２００μｌに４μｌの０．１Ｍ−クエン酸三ナトリウ ム、ｐＨ７，０もしくは４μｌの０、ＩＭ−ＥＤＴＡ。

ｐＨ７，０のいずれかを添加し、クエン酸もしくはＥＤＴＡについて約２ｍＭの 最終濃度をｉυた。

ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＩＩ　（２ｍ　ｇ／　ｍ　Ｉ　）試料２００ｕ　１当り　３ ｍＭまでの銅を、０．１〜Ｉ　ＣｕＣＤ　・２１１２０のアリコートＯないし６ μｌとして添加した。水４μＩを銅を除いて試料に添加した。試料を６２℃で２ ４時間インキュベートし、遠心してあらゆる沈殿物質を除去して、アリコー！・ ５０／ノーを例８に記載される方法でサイズυ［除Ｉｔ　Ｐ　Ｌ　Ｃにより分ｔ Ｊｉ［た。％［ビークＢＪ　（全ＣＡ！＋＋ＰＡＴＨ−１ｌｌ　）として記録さ れる結果を下記表１１に示す。

表１１ 上記表は、２ｍ１ｖＩ−ＥＤＴＡおよび２ｍＭ−クエン酸塩によるＣ　ｕ　”（ １’）結合のおおよその化学旦論およびｐＨの寄与効果を示している。リン酸緩 衝生理食塩水、ｐＨ７，２中の２ｒｒｌＬ　ＥＤＴＡが、ＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨ の銅誘発開裂の抑制に最も国際調査報告 、−一−−−−ＰＣＴ／ＧＢ９２１０１９７０

Claims (21)

【特許請求の範囲】
1. １．少なくとも１種の免疫グロブリンを、安定化量の銅イオンキレート剤と共に 含有する安定化免疫グロブリン組成物。
2. ２．免疫グロブリンがクラスＩｇＧの免疫グロブリンである請求の範囲第１項記 載の組成物。
3. ３．免疫グロブリンが組換えＣＤＲ−グラフト化抗体である請求の範囲第１項ま たは第２項に記載の組成物。
4. ４．抗体が、ＣＤ２、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ５、ＣＤ７、ＣＤ８、ＣＤ１１８、 ｂ、ＣＤ１８、ＣＤ１９、ＣＤ２５、ＣＤ３３、ＣＤｗ５２またはＣＤ５４抗原 に対する抗体である請求の範囲第３項記載の組成物。
5. ５．抗体がＣＤｗ５２抗原に対する抗体である請求の範囲第３項記載の組成物。
6. ６．抗体がＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨである請求の範囲第５項記載の組成物。
7. ７．銅イオンキレート剤がエチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第１項ない し第６項のいずれか１項に記載の組成物。
8. ８．銅イオンキレート剤がクエン酸イオンである請求の範囲第１項ないし第６項 のいずれか１項に記載の組成物。
9. ９．非経口投与に適した液体製剤の形態にある請求の範囲第１項ないし第８項の いずれか１項に記載の組成物。
10. １０．非経口投与に適した液体製剤に戻すことに適合する凍結乾燥形態にある請 求の範囲第１項ないし第８項のいずれか１項に記載の組成物。
11. １１．保存時の分解に対する免疫グロブリンの安定化への銅イオンキレート剤の 使用。
12. １２．銅イオンキレート剤がエチレンジアミン四酢酸である請求の範囲第１１項 記載の使用。
13. １３．銅イオンキレート剤がクエン酸塩である請求の範囲第１１項記載の使用。
14. １４．抗体がＣＤｗ５２抗原に対する組換えＣＤＲ−グラフト化抗体である請求 の範囲第１１項ないし第１３項のいずれか１項に記載の使用。
15. １５．抗体がＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨである請求の範囲第１４項記載の使用。
16. １６．免疫グロブリンに、それらから銅イオンを除去することが可能な精製手順 を施すことを包含する免疫グロブリンの安定性の増強方法。
17. １７．精製手順が、リン酸緩衝液を含有するシアン化カリウムに対する透析と、 それに続く、銅をシアン化銅として除去するためのゲル濾過である請求の範囲第 １６項記載の方法。
18. １８．実質的に銅イオンを含有しない精製免疫グロブリン。
19. １９．原子吸光分光分析によって銅を検出することができない精製免疫グロブリ ン。
20. ２０．ＣＤＷ５２抗原に対する組換えＣＤＲ−グラフト化抗体である請求の範囲 第１８項または第１９項に記載の免疫グロブリン。
21. ２１．抗体がＣＡＭＰＡＴＨ−ＩＨである請求の範囲第２０項記載の免疫グロブ リン。