JPWO2005035573A1 - タンパク質溶液の安定化方法 - Google Patents
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Abstract
Description
μ鎖は、定常領域のドメインを、γ鎖よりも一つ余分に持っている。
μ鎖は、オリゴ糖鎖の数がγ鎖と比較して4箇所多い。
IgMは、IgGには見られないJ鎖と呼ばれるポリペプチド鎖を有する。J鎖は、IgMが抗体産生細胞から分泌される前に、μ鎖の会合を補助すると考えられている。
(1)タンパク質を低温で安定化する方法であって、タンパク質を含有する溶液にクエン酸緩衝液を添加する方法。
(2)タンパク質の安定化が低温沈殿の抑制によるものである、(1)に記載の方法。
(3)タンパク質がIgMである、(1)に記載の方法。
(4)タンパク質を含有する溶液のpHが5〜8である、(1)に記載の方法。
本発明において使用できる「クエン酸緩衝液」は、クエン酸のみをpH緩衝剤として使用したものに限らず、リン酸などのクエン酸以外のpH緩衝剤も含むものでも良い。
溶液に添加されるクエン酸緩衝液の濃度は、通常、1〜500mMであり、好ましくは5〜100mMであり、さらに好ましくは10〜50mMである。本発明における「安定化」とは、溶液中に生じるタンパク質の低温沈殿の増加を抑制することをいう。
低温沈殿増加抑制率=(A−B)/A×100
A:クエン酸緩衝液を添加しないIgM高濃度溶液(コントロール)の低温沈殿の形成率
B:クエン酸緩衝液を添加したIgM高濃度溶液(被験試料)の低温沈殿の形成率
本発明のタンパク質を含有する溶液のpHは、タンパク質が安定なpHとすることが可能であり、具体的にはpH5〜8であることが好ましい。また、本発明のタンパク質を含有する溶液のpHは、タンパク質の保存安定性に適したpHとすることも可能であり、具体的にはpH5〜7であることが好ましく、さらに好ましくは、pH5〜6であることが望ましい。
非経口投与のための具体的な剤型として、注射剤型、経鼻投与剤型、経肺投与剤型、経皮投与型などを示すことができる。注射剤型の例としては、例えば、静脈内注射、筋肉内注射、腹腔内注射、皮下注射などにより全身または局部的に投与することができる。
その他、本発明の溶液製剤等の調製に関しては、WO2002/096457を、参照のこと。
なお本明細書において引用された全ての先行技術文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
[実施例1]
以下の実施例では、IgMとして、参考例で作製した組換え型抗ガングリオシドGM3ヒト抗体(以下、「MABON−01」という)を使用した。高濃度MABON−01溶液を室温で作製した。溶液の組成は次の通りである。
クエン酸緩衝液:20mM sodium citrate,300mM NaCl,pH5.5(クエン酸緩衝液)
酢酸緩衝液:20mM sodium acetate,300mM NaCl,pH5.5(酢酸緩衝液)
また、IgMを含有するクエン酸緩衝液および酢酸緩衝液を、IgMの濃度に応じて、便宜上、表1のように命名した。
約20mg/mLのMABON−01の20mM sodium acetate,300mM NaCl,pH6.0溶液を室温で調製し、透析膜EasySep(TOMY)を用いて20mM sodium citrate,300mM NaCl,pH5.5(クエン酸緩衝液)、または20mM sodium acetate,300mM NaCl,pH6.0(酢酸緩衝液)に対して4℃で透析し、緩衝液置換を行った。室温に戻した後、それぞれのbufferで希釈し10mg/mL溶液を調製した。これらの溶液を、0.5mLのPCRチューブに充填し、7℃、4℃、1℃で26日間保存して低温沈殿の生成を目視により確認した。遠心分離を行い得られた上清中のMABON−01濃度をゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、G4000SWxl(TOSOH)を用い、50mM sodium phosphate,500mM KCl,pH7.4の溶液を移動相として行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の合計値を低温沈殿前後で比較し、MABON−01の低温沈殿の形成率を算出した。
図2に、各試料における低温沈殿の形成率を示した。いずれの緩衝液系においても温度が低い程、沈殿量が増加する傾向が認められたが、どの温度においてもクエン酸緩衝液系では酢酸緩衝液系に比べて沈殿量が少なく、クエン酸緩衝液を用いることによる明らかな低温沈殿抑制効果が認められた。20mMの酢酸緩衝液から20mMのクエン酸緩衝液に変更することにより、高濃度の塩などを加えることなく、より低温での保存が可能であることが確認された。
約20mg/mLのMABON−01の20mM sodium acetate,300mM NaCl,pH6.0溶液を室温で調製し、透析膜EasySep(TOMY)を用いて20mM sodium citrate,300mM NaCl,pH5.0,pH5.5,またはpH6.0(クエン酸緩衝液)、および20mM sodium acetate,300mM NaCl,pH5.0,pH5.5,またはpH6.0(酢酸緩衝液)に対して4℃で透析し、緩衝液置換を行った。室温に戻した後、それぞれのbufferで希釈し10mg/mL溶液を調製した。これらの溶液を、0.5mLのPCRチューブに充填し、4℃で29日間保存して低温沈殿の生成を目視により確認した。遠心分離を行い得られた上清中のMABON−01濃度をゲルろ過クロマトグラフィーにより測定した。ゲルろ過クロマトグラフィーはカラムとして、G4000SWxl(TOSOH)を用い、50mM sodium phosphate,500mM KCl,pH7.4の溶液を移動相として行った。ゲルろ過クロマトグラフィーの会合体ピーク面積と単量体ピーク面積の合計値を低温沈殿前後で比較し、MABON−01の低温沈殿の形成率を算出した。
低温沈殿の形成率を図4に示す。酢酸緩衝液系ではpH5.5で最大となるカーブを示したのに対し、クエン酸緩衝液系では沈殿量が少なく、一定の傾向は観察されなかった。製剤に最適なpH5.5〜6.0の範囲で比較した場合、20mMの酢酸緩衝液から20mMのクエン酸緩衝液系に変更することにより、同一のpHであっても低温沈殿が抑制されることが確認された。
1.1 抗ガングリオシドGM3ヒト抗体H鎖遺伝子の構築
ガングリオシドGM3に結合するヒト抗体のH鎖をコードする遺伝子は、Epstein−Barrウイルスで形質転換されたヒトB細胞(以下、抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現B細胞と表記する)より抽出したTotal RNAを用いて、RT−PCR法によって増幅した。
Total RNAは、RNeasy Plant Mini Kits(QIAGEN社製)を用いて1×107細胞の抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現B細胞より抽出した。Hoonらが報告している抗ガングリオシドGM3ヒト抗体遺伝子の塩基配列(Cancer Research 1993;53:5244−5250)に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(LMH−f3、LMH−r3)を設計した。LMH−f3(配列番号:7)はセンス方向で、LMH−r3(配列番号:8)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5’末端側と3’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLMH−r3を用い、3’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLMH−f3を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応させた。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix、
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH−f3またはLMH−r3
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD−Plus−
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)、
10ngの完全長抗ガングリオシドGM3ヒト抗体H鎖遺伝子を含むpBluescript KS+ベクター、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLMH−fxho、LMH−rsal
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間、
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
抗ガングリオシドGM3ヒト抗体のL鎖をコードする遺伝子は抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT−PCR法によって増幅した。Total RNAは、上記と同様にして抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現B細胞より抽出した。Hoonらが報告している抗ガングリオシドGM3ヒト抗体遺伝子の塩基配列(Cancer Research 1993;53:5244−5250)に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(LML−f1、LML−r1)を設計した。LML−f1(配列番号:9)はセンス方向で、LML−r1(配列番号:10)はアンチセンス方向でそれぞれ合成した。
1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5’末端側と3’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLML−r1を用い、3’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドLML−f1を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応させた。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML−f1またはLML−r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間、
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復、
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
PCR反応溶液(50μL)の組成を次に示す。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD−Plus−
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)
5’末端側遺伝子断片、
3’末端側遺伝子断片、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドLML−feco、LML−rnot
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
本ベクターpCXND3の構築の流れについて、以下に述べる。DHFR−ΔE−rvH−PM1−f(WO92/19759参照)の抗体H鎖遺伝子とベクターを分割するために、制限酵素EcoRI/SmaI部位で消化し、ベクター側のみ回収した後に、EcoRI−NotI−BamHI adaptor(宝酒造社製)をクローニングした。このベクターをpCHOIと命名した。
pCHOIのDHFR遺伝子発現部位をpCXN(Niwaら、Gene 1991;108:193−200)の制限酵素HindIII部位にクローニングしたベクターをpCXND3と命名した。また、L鎖遺伝子断片をpCXND3にクローニングし、完成したプラスミドをpCXND3/L612Lと命名した。本プラスミドに含まれる抗ガングリオシドGM3ヒト抗体L鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を配列番号:3および配列番号:4に示す。
抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現ベクターを作製するために、pUCAG/L612Hを制限酵素HindIII(宝酒造社製)で消化して得られる約4.0kbpの断片をpCXND3/L612Lの制限酵素HindIII切断部位に連結し、クローニングした。完成したプラスミドをpCXND3/L612IgMと命名した。本プラスミドは動物細胞内でネオマイシン耐性遺伝子、DHFR遺伝子、抗ガングリオシドGM3ヒト抗体遺伝子を発現する。
抗ガングリオシドGM3ヒト抗体のJ鎖をコードする遺伝子は抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現B細胞より抽出したTotal RNAを用いて、RT−PCR法によって増幅した。Total RNAは、上記と同様にして抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現B細胞より抽出した。GenBankに登録されているヒト抗体J鎖遺伝子の塩基配列(GenBank番号:M12759)に基づいて、2本のオリゴヌクレオチド(J−f1、J−r1)を設計し、合成した。J−f1(配列番号:15)はセンス方向でヒト抗体J鎖遺伝子Exon3にハイブリダイズし、J−r1(配列番号:16)はアンチセンス方向でヒト抗体J鎖遺伝子Exon4にハイブリダイズする。
1μgのTotal RNAを使用して、SMART RACE cDNA Amplification Kit(CLONTECH社製)を用い5’末端側と3’末端側に分割して遺伝子断片を増幅した。5’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドJ−r1を用い、3’末端側遺伝子の増幅は合成オリゴヌクレオチドJ−f1を用いた。逆転写反応は42℃で1時間30分間反応させた。
5μLの10×Advantage 2 PCR Buffer、
5μLの10×Universal Primer A Mix、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1μLのAdvantage 2 Polymerase Mix
(以上の成分はいずれもCLONTECH社製)
2.5μLの逆転写反応産物、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドJ−f1またはJ−r1
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて30秒間
94℃/5秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、70℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを5回反復
94℃/5秒間、68℃/10秒間、72℃/3分間のサイクルを25回反復
最後に反応産物を72℃で7分間加熱した。
塩基配列決定の後、5’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で消化して得られる約0.5kbpの断片、および3’末端側遺伝子を含むベクターを制限酵素EcoRI(宝酒造社製)で消化して得られる約1.0kbpの断片を混合し合成オリゴヌクレオチドJ−feco、J−rxbaを用いて完全長の遺伝子断片を増幅した。
J−feco(配列番号:17)は前方プライマーで抗ガングリオシドGM3ヒト抗体J鎖遺伝子の5’末端にハイブリダイズし、かつEcoRI制限酵素認識配列ならびにコザック配列を持つように、またJ−rxba(配列番号:18)は後方プライマーで抗ガングリオシドGM3ヒト抗体J鎖遺伝子の3’末端にハイブリダイズし、XbaI制限酵素認識配列を持つようにそれぞれ設計した。
5μLの10×PCR Buffer、
1mM MgSO4、
0.2mM dNTPs(dATP,dGTP,dCTP,dTTP)、
1ユニットのDNAポリメラーゼKOD−Plus−
(以上の成分はいずれも東洋紡社製)
5’末端側遺伝子断片、
3’末端側遺伝子断片、
10pmoleの合成オリゴヌクレオチドJ−feco、J−rxba
また反応温度条件は次のとおりである。
94℃の初期温度にて2分間
94℃/15秒間、60℃/30秒間、68℃/2分間のサイクルを30回反復
最後に反応産物を72℃で5分間加熱した。
増幅した遺伝子断片は、制限酵素EcoRI(宝酒造社製)および制限酵素XbaI(宝酒造社製)で消化した後に、QIAquick PCR Purification Kit(QIAGEN社製)を用いて精製し、pCOSII−Zeoの制限酵素EcoRIおよびXbaI切断部位に連結し、クローニングした。
CHO細胞(DG44株)を用いた安定発現細胞株の作製は次のようにして行った。Gene PulserII(BioRad社製)を用いたエレクトロポレーション法により遺伝子導入した。
J鎖を発現しない細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現ベクターpCXND3/L612IgM(25μg)とPBSに懸濁したCHO細胞(1×107細胞/ml)の0.75mlを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。
Geneticin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のIgM量について参考例1.6に示す濃度定量法で測定した。抗ガングリオシドGM3ヒト抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガングリオシドGM3ヒト抗体安定発現細胞株CA02、CA15、CA19、CA20、およびCA24を得た。
また、J鎖を発現する細胞株の遺伝子導入について以下に述べる。抗ガングリオシドGM3ヒト抗体発現ベクターpCXND3/L612IgM(25μg)およびJ鎖発現ベクターpCOSII−Zeo/J chain(20μg)とPBSに懸濁したCHO細胞(1×107細胞/ml)の0.75mlを混合したものを氷上で10分間冷却し、キュベットに移した後に1.5kV、25μFDの容量にてパルスを与えた。
同様の培地で50倍希釈溶液を作製し、96ウェル培養用プレートに100μl/ウェルで分注した。CO2インキュベーター(5%CO2)で24時間培養後、0.5mg/mL濃度のGeneticin(Invitrogen社製)および0.6mg/mL濃度のZeocin(Invitrogen社製)を添加して2週間培養した。Geneticin、Zeocin耐性を示す形質転換細胞のコロニーが観察されたウェルの培養上清中のIgM量について参考例1.6に示す濃度定量法で測定した。抗ガングリオシドGM3ヒト抗体高発現細胞株を順次拡大培養し、抗ガングリオシドGM3ヒト抗体安定発現細胞株(CJ15、CJ25、CJ38、CJ45、CJ67)を得た。
培養上清中のIgM濃度の測定は以下のように行った。Anti−Human IgM(BIOSORCE社製)を1μg/mlになるようにCoating Buffer(0.1M NaHCO3、0.02%NaN3)で希釈し、96ウェルELISA用プレートに100μl/ウェルで加え、4℃で24時間以上反応させ、コーティングを行った。
さらに、Rinse Bufferで洗浄した後に、200μL/ウェルのDiluent Bufferを加え、室温で1時間以上反応させ、ブロッキングした。Rinse BufferおよびDiluent Bufferの組成はそれぞれ次のとおりである。
PBS(−)、
0.05% Tween20
Diluent Buffer:
50mM Tris、
1mM MgCl2、
0.15M NaCl、
0.05% Tween20、
0.02% NaN3、
1% BSA
各種抗ガングリオシドGM3ヒト抗体安定発現細胞株を75cm2培養フフスコ内で初発細胞密度2x105cells/mLで培養し、培養上清中のIgM濃度を上記の方法で測定した。結果を表2に示す。IgM産生量は培養3日目で約20mg/L、培養7日目で約50mg/Lであり、単一細胞が産生する能力を示す産生能は5〜19pg/cell/dayであった。IgMはイムノグロブリンの中でも多量体を形成するために、組換え体は発現量が低く、大量に調製することが困難であるとされていたが、今回の結果より、CHO細胞において高い産生量の組換え型IgM発現細胞が作製できることが明らかになった。
Claims (4)
- タンパク質を低温で安定化する方法であって、タンパク質を含有する溶液にクエン酸緩衝液を添加する方法。
- タンパク質の安定化が低温沈殿の抑制によるものである、請求項1に記載の方法。
- タンパク質がIgMである、請求項1に記載の方法。
- タンパク質を含有する溶液のpHが5〜8である、請求項1に記載の方法。
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