KR20220110818A - Fc 다량체의 안정한 조성물 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 특히 Fc 다량체 조성물, 본 발명의 Fc 다량체 조성물을 동결 건조된 형태로 포함하는 Fc 다량체 조성물 뿐만 아니라, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물에 관한 것이다.
Description
본 발명은 특히 Fc 다량체 조성물, 본 발명의 Fc 다량체 조성물을 동결 건조된 형태로 포함하는 Fc 다량체 조성물 뿐만 아니라, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물에 관한 것이다.
면역글로불린은 포유 동물의 면역계에서 중요한 역할을 한다. 면역글로불린은 혈장, 림프 및 기타 신체 분비물에서 발견되는 B 림프구에 의해 생산된다. 면역글로불린의 기본 단위는 이황화 결합에 의해 연결된 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 함유하는 이종 4량체이다. 이들 쇄 각각은 항원 결합 부위를 형성하는 N-말단의 가변 영역과 면역글로불린의 이펙터 기능을 담당하는 불변 영역을 갖는다.
상이한 생화학적 및 생리학적 특성을 갖는 5가지 주요 클래스의 면역글로불린이 있다: IgG (γ 중쇄), IgA (α), IgM (μ), IgD (δ) 및 IgE (ε). 사람 IgG는 혈장에서 가장 풍부한 면역글로불린인 반면, IgA는 외부 분비물, 예를 들어, 타액, 누액, 및 기도 및 장관의 점액에서의 주요 항체 클레스이다. IgM은 단연코 사람 순환계에서 물리적으로 가장 큰 항체이며, 일반적으로 기본 면역글로불린 단위의 5량체로서 존재하며, 감염 과정에서 초기에 출현한다.
Fc 영역 ("결정화 가능한 단편")은 면역글로불린의 꼬리 영역이며, IgG 및 IgA의 경우에서 중쇄의 2개의 C-말단 도메인 및 IgM 및 IgE의 경우에서 중쇄의 3개의 C-말단 도메인을 포함한다.
일반적으로 정맥내 (IVIG) 또는 피하 (SCIG) 투여되는 사람 혈장 유래의 정제된 IgG 제품은 현재 여러 임상 응용 분야에서 사용된다. 원발성 또는 후천성 면역 결핍 및 감염성 질환의 치료를 위한 전통적인 용도에 추가하여, 이들 제품은 또한 또한 자가 면역 질환 및 특정 신경계 장애, 예를 들어, CIDP의 치료에 효과적인 것으로 나타났다.
자가 면역 질환, 염증 및 신경계 장애의 치료에서 IVIG/SCIG 제품의 작용 기전은 주로 Fc 영역에 의해 매개되는 IgG 분자의 이펙터 기능에 기초하는 것으로 보인다. Fc 영역은 Fc 수용체 및 보체 시스템과 상호 작용하여 면역 조절 활성을 갖는 역할을 담당한다.
Fc 수용체는 사람 혈소판, 비만 세포, 식세포, 예를 들어, 대식 세포 및 단핵구, 과립구, 예를 들어, 호중구, 호염구 및 호산구 뿐만 아니라 선천성 면역계의 림프구 (자연 살해 세포 ) 또는 적응 면역계 (예를 들어, B 세포)와 같은 면역계의 세포의 외부 표면 상에 있는 수용체이다. Fab 영역을 통해 항원 (예를 들어, 미생물 병원체)에 부착되는 항체의 상기 Fc 영역의 결합은 일반적으로 면역계의 상기 세포에 대한 상기 병원체의 연결을 초래한다. 결과적으로, 병원체에 대한 공동 작용이 유도된다.
보체 시스템은 병원체의 세포막을 파괴하는 막횡단 채널을 형성하여 병원체의 세포막을 공격하는 면역계의 일부이다. 이는 후속적으로 세포 용해와 병원체의 사멸을 초래한다. 또한, 보체 시스템의 활성화는 이물질 및 손상된 물질을 제거하기 위한 식세포의 자극 및 추가의 식세포를 유인하기 위한 염증을 초래한다.
자가 면역, 염증 및 신경계 장애 치료를 위해 IVIG/SCIG를 대체하기 위한 여러 전략이 조사 중이다. 하나의 접근법은 IgG의 Fc 부분만을 고농도로 사용하거나, 예를 들어, Fc 수용체에 대한 Fc 부분의 결합 활성 (avidity)을 증가시키기 위해 여러 Fc 부분을 하나의 분자로 재조합적으로 조립하는 것이다. 예를 들어, 다량체성 Fc 분자의 다양한 배열 형태는 국제공개공보 WO 2008/151088 A2에 개시되어 있다. 2 내지 10개의 Fc 부분의 상이한 배열 형태를 갖는 유익한 작제물이 개시되어 있다 (Momenta의 국제공개공보 WO 2015/168643 A2 참조). 가장 바람직한 옵션은 가요성 펩타이드 링커로 연결된 2개의 Fc 폴리펩타이드의 2개의 장쇄 및 단일 Fc 폴리펩타이드의 2개의 단쇄로부터 생성된 3가 사람 IgG1 Fc 분자이었다. 놉-인-홀 (knob-in-hole) 및 정전기 돌연변이와 같은 돌연변이가 상기 작제물의 올바른 조립을 지시하기 위해 도입되었다. 또 다른 예는, 예를 들어, 국제공개공보 WO 2014/060712 A1 및 WO 2017/129737 A1에 개시된 바와 같은 IgG Fc 폴리펩타이드에 대한 IgM의 C-말단 18개 아미노산 꼬리 조각의 부가에 의해 조립된 6량체 Fc 분자이다.
치료학적 용도를 위해서는 이러한 Fc 다량체의 안정한 제형이 필요하다. 그러나, 심지어 단일 Fc 단편도 물리적 및 화학적 분해에 매우 취약하며, 특히, 용액 중에서 응집되기 쉽다. Fc 다량체의 경우, 이것은 훨씬 더 문제가 된다. Fc 다량체를 액상 형태로 제형화하려는 첫 번째 시도는 매우 낮은 단백질 농도 (30 mg/ml)에서만 성공적이었다. 치료학적 용도를 위해, 이들 단백질의 보다 농축된 용액이 매우 바람직하다. 주로 상기에서 언급한 바와 같이, Fc 다량체는 용액에서 응집하는 경향이 있고 응집 속도는 단백질 농도가 증가함에 따라 증가하여 가시적인 침전물을 초래하기 때문에, 적절하게 높은 단백질 농도를 갖는 안정한 조성물이 달성되지 않았다. 이러한 침전물은 환자에게 투여될 때 유해할 수 있는 것으로 공지되어 있다.
따라서, 본 발명의 목적은, 예를 들어, 피하 투여에 의한 환자에 대한 Fc 다량체의 편리한 투여를 가능하게 하는 보다 높은 농도의 Fc 다량체를 갖는 안정한 Fc 다량체 조성물을 제공하는 것이다.
발명의 요약
하기를 포함하는 Fc 다량체 조성물이 제공된다:
a) 60 mg/ml 내지 180 mg/ml 농도의 Fc 다량체,
b) 4.8 내지 6.0의 pH 값, 및
c) 200 mM 내지 450 mM 농도의 안정화제.
본 발명은 또한 본 발명의 Fc 다량체 조성물을 동결 건조된 형태로 포함하는 Fc 다량체 조성물에 관한 것이다.
또한, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 Fc 다량체 조성물이 제공된다.
제1 양태에서, 본 발명은 하기를 포함하는 Fc 다량체 조성물에 관한 것이다:
a) 60 mg/ml 내지 180 mg/ml 농도의 Fc 다량체,
b) 4.8 내지 6.0의 pH 값, 및
c) 200 mM 내지 450 mM 농도의 안정화제.
실시예의 결과는 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물이 특히 안정하다는 것을 나타낸다. 특히, 실시예에 따르면, 청구범위에서 제공된 바와 같은 조건의 사용은 보다 높은 단백질 농도를 갖는 Fc 다량체 조성물에서도 단백질 침전 및 탈아미드화를 방지하고 단편화 속도 감소를 초래하는 것으로 밝혀졌다.
본 발명에 따른 "Fc 다량체"라는 용어는 적어도 2개의 Fc 부분으로 구성된 다량체를 기술한다.
본 발명에 따라 본 출원에서 상호 교환적으로 사용되는 "Fc 부분", "Fc 단량체", "Fc 단편" 또는 "Fc 도메인"이라는 용어는 Fc 수용체에 결합할 수 있는 2개의 Fc 폴리펩타이드로부터 조립된 분자를 기술한다.
본 발명에 따른 "Fc 폴리펩타이드"라는 용어는 항체의 중쇄 불변 도메인의 일부로 이루어진 폴리펩타이드 쇄를 기술한다.
특히, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 항체 불변 도메인 (CH2 및/또는 CH3) 또는 이의 기능적 단편 (예를 들어, (i) 또 다른 Fc 폴리펩타이드와 이량체화하여 Fc 부분을 형성하고 (ii) Fc 수용체에 결합할 수 있는 단편)을 포함한다.
또한, 상기 Fc 부분은 힌지 영역과 면역글로불린 중쇄 불변 도메인의 불변 CH2 및 CH3 (및 CH4) 도메인 또는 이의 단편의 임의의 조합을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 "불변 도메인 CH2/CH3/CH4"이라는 용어는 항체의 중쇄의 불변 도메인 부분을 기술한다.
본 발명에 따른 "힌지 영역"이라는 용어는 항체의 중쇄의 불변 도메인의 폴리펩타이드 쇄의 가요성 스트레치를 기술하며, 이의 일반적인 기능은 항체 또는 이의 단편의 Fab와 Fc 부분의 연결이다.
특히, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 전체 또는 부분 힌지 영역 및 항체 불변 도메인 CH2 및/또는 CH3 및/또는 CH4를 포함하거나 이들로 이루어진다. 보다 특히, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 힌지 영역 및 제2 및/또는 제3 항체 불변 도메인 (CH2 및/또는 CH3), 바람직하게는 힌지 영역 및 제2 및 제3 항체 불변 도메인 (CH2 및 CH3)을 포함하거나 이들로 이루어진다.
본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 IgA, IgD, IgG, IgE 또는 IgM 항체로부터 유래될 수 있고, 특히, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 IgG 항체, 바람직하게는 사람 IgG 항체로부터 유래될 수 있고, 보다 특히, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 IgG 항체 서브클래스 IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3 또는 IgG4 중 하나로부터 유래될 수 있다. 가장 바람직하게, 본 발명의 Fc 폴리펩타이드는 사람 IgG1로부터 유래될 수 있다.
일반적으로, 본 발명에 따른 Fc 폴리펩타이드는 항원 인식 영역으로 작용할 수 있는 면역글로불린의 어떠한 부분도 상보성 어떠한 결정 영역 (complementarity determining region: CDR)도 포함하지 않는다.
상기 Fc 폴리펩타이드는 야생형 형태일 수 있거나, 야생형 Fc 폴리펩타이드 서열과 비교하여 하나 이상의 변화를 포함할 수 있다.
이러한 변화는 아미노산 치환, 부가 또는 결실과 같은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 아미노산의 임의의 공지된 변화일 수 있다. 추가로, 변화는 보존적이거나, 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이, Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 도메인과 Fc 수용체 사이, 또는 Fc 폴리펩타이드 또는 Fc 도메인과 보체계 사이의 상호 작용을 변경하는 임의의 변화일 수 있다.
변화는 Fc 폴리펩타이드의 임의의 위치, 특히, 힌지 영역, CH2 또는 CH3 도메인에서 도입될 수 있다.
적합한 변경은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 특히, 이러한 변화는 놉-인투-홀 아미노산 변화, 이황화 결합을 초래하는 아미노산 변화, 역으로 하전된 아미노산 상호 작용을 초래하는 아미노산 변화 뿐만 아니라 Fc 부분에서 Fc 폴리펩타이드의 개선된 상호 작용을 초래하는 펩타이드 링커의 혼입일 수 있다.
조작된 공동 (cavity) 및 가공된 돌기 (protuberance) (또는 "놉-인투-홀" 전략)의 사용은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있고, 예를 들어, Carter 및 동료 (문헌 [Ridgway et al., Protein Eng. 9:617-612, 1996]; [Atwell et al., J Mol Biol. 270:26-35, 1997]; [Merchant et al., Nat Biotechnol. 16:677-681, 1998])에 의해 기재되어 있고, 또한 미국 특허 US 5,731,168에 개시되어 있다.
본 발명에서, 조작된 공동 및 조작된 돌기는 본 출원에서 기재된 Fc 부분의 제조에 사용될 수 있다.
"조작된 공동"이라는 용어는, 예를 들어, CH3 불변 도메인에서의 원래 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 원래 아미노산 잔기 보다 더 작은 측쇄 부피를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 치환하여, 예를 들어, CH3 불변 도메인에서 3차원 공동을 생성하는 것을 지칭한다.
본 출원에서 사용되는 "조작된 돌기"라는 용어는, 예를 들어, CH3 불변 도메인에서의 원래 아미노산 잔기 중 적어도 하나를 원래 아미노산 잔기 보다 더 큰 측쇄 부피를 갖는 상이한 아미노산 잔기로 치환하여, 예를 들어, CH3 불변 도메인에서 3차원 돌기를 생성하는 것을 지칭한다.
조작된 공동은 타이로신 또는 트립토판과 같은 보다 큰 측쇄를 포함하는 아미노산을 알라닌, 발린 또는 트레오닌과 같은 보다 작은 측쇄를 포함하는 아미노산으로 대체하여 구성될 수 있다. 유사하게, 조작된 돌기는 알라닌, 발린 또는 트레오닌과 같은 보다 작은 측쇄를 포함하는 아미노산을 타이로신 또는 트립토판과 같은 보다 큰 측쇄를 포함하는 아미노산으로 대체하여 구성될 수 있다. 아미노산의 대체 방법은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
본 발명에 따른 Fc 부분에서, 2개의 Fc 폴리펩타이드는 상호 작용할 수 있는데, 여기서, 제1 Fc 폴리펩타이드는 조작된 공동을 이의 CH3 불변 도메인에 포함할 수 있는 반면, 제2 Fc 폴리펩타이드는 조작된 돌기를 이의 CH3 불변 도메인에 포함할 수 있다.
다른 실시 형태에서, 하나의 CH3 불변 도메인에서의 조작된 공동 또는 조작된 돌기는 또 다른 CH3 불변 도메인에서 원래 아미노산을 보다 잘 수용하도록 생성될 수 있다.
본 발명에서, 인터-CH3 도메인 이황화 결합 조작을 추가로 적용하여 이량체 형성을 증진시키키ㄹ 수 있다. 예를 들어, 하나의 CH3 불변 도메인에서 시스테인이 아닌 아미노산은 또 다른 Fc 폴리펩타이드의 시스테인, 특히, Fc 폴리펩타이드의 CH3 불변 도메인과의 이황화 결합 형성을 가능하게 하도록 아미노산 시스테인으로 대체될 수 있다.
또한, 하나 이상의 펩타이드 링커의 혼입을 사용하여 이량체 형성을 증진시킬 수 있다. 이러한 펩타이드 링커는 일반적으로 글리신 및/또는 세린과 같은 가요성 아미노산을 포함한다. 이에 의해, 제1 Fc 폴리펩타이드는 펩타이드 링커를 통해 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결될 수 있는데, 여기서, 상기 펩타이드 링커의 N-말단은 화학 결합을 통해 제1 Fc 폴리펩타이드의 C-말단에 연결될 수 있으며, 상기 펩타이드 링커의 C-말단은 화학 결합을 통해 제2 Fc 폴리펩타이드의 N-말단에 연결될 수 있다. 적합한 펩타이드 링커는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
또한, 2개의 Fc 폴리펩타이드는 글리신 링커에 의해 연결될 수 있으며, 즉, Fc 폴리펩타이드의 2개 부분은 2개 이상의 글리신 분자의 아미노산 쇄를 통해 연결될 수 있다.
Fc 폴리펩타이드가 하나 이상의 변화를 포함하는 경우, 이는 분자의 임의의 위치에서 있을 수 있다.
본 발명에 따른 Fc 부분은 일반적으로 2개의 Fc 폴리펩타이드로부터 조립된다. 특히, 본 발명에 따른 Fc 부분은 전체 항체인 것으로 이해되지 않을 수 있다.
Fc 부분은 2개의 동일한 Fc 폴리펩타이드로 구성될 수 있다. 또한, Fc 부분은 서로 상이한 2개의 Fc 폴리펩타이드로 구성될 수 있다.
Fc 부분에서, 두 Fc 폴리펩타이드는 상기에서 기재된 바와 같이 돌연변이될 수 있거나, 두 Fc 폴리펩타이드는 야생형일 수 있거나, 하나의 Fc 폴리펩타이드는 상기에서 기재된 바와 같이 돌연변이될 수 있는 반면, 다른 Fc 폴리펩타이드는 야생형일 수 있다.
Fc 부분에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 공유 또는 비공유 결합과 같은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 공지된 종류의 분자간 및 분자내 힘을 통해 상호 작용할 수 있다. 상기 Fc 폴리펩타이드는, 예를 들어, 상기에서 기재된 바와 같은 아미노산 치환에 의해 아미노산 서열에 도입될 수 있는 역으로 하전된 아미노산을 통해 상호 작용할 수 있다. 또한, 상기 Fc 폴리펩타이드는 상이한 Fc 폴리펩타이드의 2개의 시스테인 잔기로부터의 2개의 티올기의 커플링으로부터 유도된 이황화 결합을 통해 상호 작용할 수 있다. 또한, 상기 Fc 폴리펩타이드는 상기에서 기재된 바와 같이 펩타이드 링커를 통해 연결될 수 있다.
특히, 상기 Fc 다량체는 2 내지 10개의 Fc 부분으로 구성되고, 보다 특히, 상기 Fc 다량체는 3 내지 6개의 Fc 부분으로 구성되고, 가장 특히, 상기 Fc 다량체는 3개의 Fc 부분으로 구성된다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 3 내지 6개의 Fc 부분으로 구성된다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 3개의 Fc 부분으로 구성된다.
일부 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 3개의 Fc 부분을 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하는데, 여기서, 제1 폴리펩타이드는 제1 Fc 폴리펩타이드, 제1 링커 및 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제2 폴리펩타이드는 제3 Fc 폴리펩타이드, 제2 링커, 및 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제3 Fc 폴리펩타이드는 제1 Fc 부분을 형성하고, 상기 제5 Fc 폴리펩타이드 및 상기 제2 Fc 폴리펩타이드는 제2 Fc 부분을 형성하고, 상기 제6 Fc 폴리펩타이드 및 제4 Fc 폴리펩타이드는 제3 Fc 부분을 형성한다.
일부 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 항원 인식 영역, 예를 들어, 가변 도메인 (예를 들어, VH, VL, 초가변 영역 (hypervariable region: HVR)) 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지 않는다.
이러한 양태의 일부 실시 형태에서, 제1 및 제3 Fc 폴리펩타이드 각각은 제1 Fc 폴리펩타이드와 제3 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고/하거나; 제2 및 제5 Fc 폴리펩타이드 각각은 제2 Fc 폴리펩타이드와 제5 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고/하거나; 제4 및 제6 Fc 폴리펩타이드 각각은 제4 Fc 폴리펩타이드와 제6 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 상보적 이량체화 선택성 모듈은 Fc 폴리펩타이드의 선택적 이량체화를 촉진한다. 본 출원에서 기재된 임의의 Fc 작제물에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이에 (즉, 상기 Fc 작제물의 상기 Fc 폴리펩타이드와 또 다른 Fc 펩타이드 사이에) 상이한 서열, 예를 들어, 20개 이하의 아미노산 (예를 들어, 15, 10개 이하의 아미노산), 예를 들어, 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 아미노산 만큼 상이한 서열을 가질 수 있다. 예를 들어, 본 출원에서 기재된 작제물의 Fc 폴리펩타이드 서열은 상이할 수 있는데, 이는 임의의 Fc 작제물의 상보적 이량체화 선택성 모듈이 상기 Fc 폴리펩타이드 중 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 조작된 공동 및 상기 Fc 폴리펩타이드 중 다른 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 조작된 돌기를 포함할 수 있고, 여기서, 상기 조작된 공동 및 상기 조작된 돌기가 Fc 폴리펩타이드의 공동 내로의 돌기 쌍을 형성하도록 위치하기 때문이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물은 아미노산 변형을 CH3 도메인에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물은 선택적 이량체화를 위해 아미노산 변형을 상기 Fc 폴리펩타이드 (하나 이상의 Fc 폴리펩타이드)의 CH3 도메인에 포함한다. 예시적인 조작된 공동 및 돌출은 당해 분야에 공지되어 있다. 다른 실시 형태에서, 상기 상보적 이량체화 선택성 모듈은 상기 Fc 폴리펩타이드 중 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 조작된 (치환된) 음으로 하전된 아미노산 및 상기 Fc 폴리펩타이드 중 다른 하나의 CH3 항체 불변 도메인의 조작된 (치환된) 양으로 하전된 아미노산을 포함하는데, 여기서, 상기 음으로 하전된 아미노산 및 상기 양으로 하전된 아미노산은 상보적 Fc 폴리펩타이드 사이에 Fc 도메인의 형성을 촉진하도록 위치한다. 예시적인 상보적 아미노산 변화는 당해 분야에 공지되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드 중 하나 이상은 동일한 서열이다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드 중 하나 이상은 동일한 변형을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드 중 1, 2, 3 또는 4개만이 동일한 변형을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 링커를 통해 연결된 적어도 2개의 Fc 단량체를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 적어도 하나의 링커를 포함한다. 링커는 3~200개의 아미노산 (예를 들어, 3~150, 3~100, 3~60, 3~50, 3~40, 3~30, 3~20, 3~10, 3~8, 3~5, 4~30, 5~30, 6~30, 8~30, 10~20, 10~30, 12~30, 14~30, 20~30, 15~25, 15~30, 18~22, 및 20~30개의 아미노산)을 포함하는 아미노산 스페이서일 수 있다. 적합한 펩타이드 링커는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들어, 글리신 및 세린과 같은 가요성 아미노산 잔기를 함유하는 펩타이드 링커를 포함한다. 특정 실시 형태에서, 링커는 GS, GGS, GGSG, GGGGS, GGG, GGGG의 모티프, 예를 들어, 단일, 다중 또는 반복 모티프를 포함할 수 있다. 특정 실시 형태에서, 링커는 GS, GGS, GGSG, GGGGS, GGG, GGGG 또는 서열 번호 34~61 중 임의의 것을 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 링커를 사용하여 탠덤 시리즈 (tandem series)로 2개의 Fc 폴리펩타이드를 연결한다. 다른 실시 형태에서, 링커를 사용하여 CL 및 CH1 항체 불변 도메인을 연결한다. 다른 실시 형태에서, 링커는 또한 글리신 및 세린 이외의 아미노산을 포함할 수 있다.
본 출원에서 기재된 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 서열 번호 1~31, 또는 10개 이하 (예를 들어, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하)의 단일 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 서열 번호 1~31을 포함하는 폴리펩타이드를 포함할 수 있다. 일부 실시 형태에서, 작제물의 Fc 도메인의 Fc 폴리펩타이드는 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이에 (즉, 상기 Fc 작제물의 상기 Fc 폴리펩타이드와 또 다른 Fc 폴리펩타이드 사이에) 상이한 서열, 예를 들어, 20개 이하의 아미노산 (예를 들어, 15, 10개 이하의 아미노산), 예를 들어, 20, 15, 10, 8, 7, 6, 5, 4, 3 또는 2개 이하의 아미노산 만큼 상이한 서열을 가질 수 있다.
일부 실시 형태에서, Fc 작제물의 하나 이상의 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 작제물의 하나 이상의 Fc 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, Fc 작제물의 모든 Fc 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 포함한다. 일부 실시 형태에서, Fc 작제물의 모든 Fc 폴리펩타이드는 말단 라이신 잔기를 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, Fc 폴리펩타이드의 말단 라이신 잔기는 서열 번호 2, 4, 5, 7, 9, 11, 13, 15, 17, 19 및 21 중 어느 하나의 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어지며, 말단 라이신 잔기를 포함하지 않는 상응하는 Fc 폴리펩타이드를 생성하기 위해 제거될 수 있다. 일부 실시 형태에서, 말단 라이신 잔기를 서열 번호 1, 3, 6, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20 및 22~31의 서열을 포함하거나 이들로 이루어지거나 본질적으로 이루어진 Fc 폴리펩타이드에 부가하여 말단 라이신 잔기를 포함하는 상응하는 Fc 폴리펩타이드를 생성할 수 있다.
한 실시 형태에서, 본 발명의 Fc 다량체는 그 전문이 본 출원에 참조로 포함된 국제공개공보 WO 2015/168643 A2, WO 2017/205436 A1, WO 2017/205434 A1 및 WO 2018/129255 A1에 개시된 바와 같다. 바람직하게, 상기 Fc 다량체는 2 내지 10개의 Fc 도메인, 예를 들어, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 또는 10개의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 다량체는 3개의 Fc 도메인을 포함한다.
하나의 양태에서, 본 개시 내용은 3개의 Fc 도메인을 형성하는 4개의 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 작제물을 특징으로 한다. 제1 폴리펩타이드는 화학식 A-L-B를 갖는데, 여기서, A는 제1 Fc 폴리펩타이드를 포함하고; L은 링커이고; B는 제2 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제2 폴리펩타이드는 화학식 A'-L'-B'를 갖는데, 여기서, A'는 제3 Fc 폴리펩타이드를 포함하고; L'는 링커이고; B'는 제4 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제3 폴리펩타이드는 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 제4 폴리펩타이드는 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 이러한 양태에서, A와 A'가 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, B와 제5 Fc 폴리펩타이드가 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, B'와 제6 Fc 폴리펩타이드가 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성한다.
이러한 양태의 일부 실시 형태에서, A 및 A'는 각각 이들 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 다른 실시 형태에서, B 및 상기 제 5 Fc 폴리펩타이드는 각각 이들 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, B 및 상기 제 6 Fc 폴리펩타이드는 각각 이들 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 이량체화 선택성 모듈을 포함한다.
이러한 양태의 일부 실시 형태에서, A, B, A', B', 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드 중 하나 이상은 Fc 폴리펩타이드로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, A, B, A', B', 제3 폴리펩타이드 및 제4 폴리펩타이드 각각은 Fc 폴리펩타이드로 이루어진다.
이러한 양태의 일부 실시 형태에서, B와 B' 각각은 돌연변이 D399K 및 K409D를 포함하고, A와 A' 각각은 돌연변이 S354C, T366W 및 E357K를 포함하며, 상기 제5 및 제6 Fc 폴리펩타이드 각각은 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V 및 K370D를 포함한다. 상기 넘버링은 본 문서 전체에서 IgG에 대한 Kabat EU 넘버링 시스템을 지칭하며, 이는 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
이러한 양태의 일부 실시 형태에서, A와 A' 각각은 돌연변이 D399K 및 K409D를 포함하고, B와 B' 각각은 돌연변이 S354C, T366W 및 E357K를 포함하며, 상기 제5 및 제6 Fc 폴리펩타이드 각각은 돌연변이 Y349C, T366S, L368A, Y407V 및 K370D를 포함한다.
이러한 양태의 일부 실시 형태에서, L 및 L' 각각은 적어도 4, 8, 12, 14, 16, 18 또는 20개의 글리신을 포함한다. 일부 실시 형태에서, L 및 L' 각각은 4~30, 8~30, 또는 12~30개의 글리신을 포함한다. 이러한 양태의 일부 실시 형태에서, L 및 L' 각각은 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (서열 번호 61)를 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
일부 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물은 이종 모이어티 (moiety), 예를 들어, 펩타이드, 예를 들어, 링커를 통해 B 또는 B'의 N-말단 또는 C-말단에 연결된 알부민 결합 펩타이드를 추가로 포함한다.
다른 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물의 제1 및 제2 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 가지며, 상기 Fc 작제물의 제3 및 제4 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서열 번호 24의 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어지며, 상기 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열 번호 23의 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서열 번호 24의 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어지며, 상기 제3 및 제4 폴리펩타이드는 162번 위치에서 Glu의 Asp로의 치환을 갖는 서열 번호 23의 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물 중의 Fc 다량체는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물 중의 Fc 다량체는 162번 위치에서 Glu의 Asp로의 치환을 갖는 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 조성물 중의 Fc 다량체는 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드 및 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드 (여기서, 상기 폴리펩타이드 중 약 12%는 162번 위치에서 Glu의 Asp로의 치환을 가짐)를 포함한다. 본 개시 내용의 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드 각각은 10개 이하 (예를 들어, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하)의 단일 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 서열 번호 24의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어지며, 상기 제3 및 제4 폴리펩타이드는 10개 이하 (예를 들어, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하)의 단일 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 서열 번호 23의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 일부 경우에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서열 번호 29의 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어지며, 상기 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서열 번호 28의 서열을 포함하거나 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다. 본 개시 내용의 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드 각각은 10개 이하 (예를 들어, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1개 이하)의 단일 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 서열 번호 29의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어지며, 상기 제3 및 제4 폴리펩타이드는 10개 이하 (예를 들어, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 또는 1개 이하)의 단일 아미노산 변형 (예를 들어, 치환, 예를 들어, 보존적 치환)을 갖는 서열 번호 28의 서열을 포함하거나, 이로 이루어지거나 본질적으로 이루어진다.
본 개시 내용의 이러한 양태의 일부 실시 형태에서, 제1 및 제3 Fc 폴리펩타이드 각각은 제1 Fc 폴리펩타이드와 제3 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하며, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 각각은 제2 Fc 폴리펩타이드와 제4 Fc 폴리펩타이드 사이의 이량체화를 촉진하는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제2 Fc 폴리펩타이드 각각의 상보적 이량체화 선택성 모듈은 조작된 돌기를 포함하며, 제3 및 제4 Fc 폴리펩타이드 각각의 상보적 이량체화 선택성 모듈은 조작된 공동을 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 Fc 도메인 단량체 중 하나 이상은 IgG 힌지 영역 또는 이의 일부, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드 각각은 IgG 힌지 영역 또는 이의 일부, IgG CH2 항체 불변 도메인, 및 IgG CH3 항체 불변 도메인을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드 각각은 IgG1 Fc 폴리펩타이드, 바람직하게는 사람 IgG1 Fc 폴리펩타이드이다.
본 개시 내용의 이전 두 양태의 일부 실시 형태에서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 중 하나 이상의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 각각의 N-말단 Asp는 Gln으로 돌연변이된다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드의 하나 이상은 C-말단 라이신이 결여되어 있다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1, 제2, 제3 및 제4 폴리펩타이드 각각은 C-말단 라이신이 결여되어 있다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 가지며, 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖는다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 폴리펩타이드 및 상기 제2 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 폴리펩타이드 및 상기 제4 폴리펩타이드는 동일한 아미노산 서열을 갖지 않는다.
일부 실시 형태에서, 상기 Fc 도메인 중 적어도 하나는 (i) 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성, (ii) 이펙터 기능, (iii) Fc 도메인 황산화 수준, (iv) 반감기, (v) 프로테아제 내성, (vi) Fc 도메인 안정성 및/또는 (vii) 분해에 대한 감수성 중 하나 이상을 변경하는 아미노산 변형을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 도메인은 하나 이상의 Fc 수용체에 대한 결합 친화성을 변경하는 아미노산 변형, 예를 들어, S267E/L328F를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 수용체는 FcγRIIb이다. 일부 경우에서, 본 출원에서 기재된 변형은 FcγRIIb 수용체에 대한 친화성을 증가시킨다. 일부 경우에서, 상기 S267E/L328F 변형은 FcγRIIb에 대한 결합 친화성을 증가시킨다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 도메인은 Fc 도메인 황산화 수준을 변경하는 아미노산 변형, 예를 들어, 241F, 243F, 246K, 260T 또는 301R을 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 도메인은, 예를 들어, 하기 세트로부터 선택된 프로테아제 내성을 변경하는 아미노산 변형을 포함한다: 233P, 234V, 235A 및 236del; 237A, 239D 및 332E; 237D, 239D 및 332E; 237P, 239D 및 332E; 237Q, 239D 및 332E; 237S, 239D 및 332E; 239D, 268F, 324T 및 332E; 239D, 326A 및 333A; 239D 및 332E; 243L, 292P 및 300L; 267E, 268F, 324T 및 332E; 267E 및 332E; 268F, 324T 및 332E; 326A, 332E 및 333A; 또는 326A 및 333A. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 도메인은 분해에 대한 Fc 도메인 감수성을 변경하는 아미노산 변형, 예를 들어, C233X, D234X, K235X, S236X, T236X, H237X, C239X, S241X 및 G249X를 포함하는데, 여기서, X는 임의의 아미노산이다.
일부 실시 형태에서, 본 개시 내용은 a) i) 제1 Fc 폴리펩타이드, ii) 제2 Fc 폴리펩타이드 및 iii) 상기 제1 Fc 폴리펩타이드를 상기 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩타이드; b) i) 제3 Fc 폴리펩타이드, ii) 제4 Fc 폴리펩타이드 및 iii) 상기 제3 Fc 폴리펩타이드를 상기 제4 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제2 폴리펩타이드; c) 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및 d) 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 작제물을 특징으로 하는데, 여기서, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드와 제5 Fc 폴리펩타이드는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제2 Fc 폴리펩타이드와 제4 Fc 폴리펩타이드는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제3 Fc 폴리펩타이드와 제6 Fc 폴리펩타이드는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 아미노산 변형을 I253번 위치에 (예를 들어, 단일 아미노산 변형을 I253번 위치에) 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제2 폴리펩타이드는 서로 동일하며, 상기 제3 및 제4 폴리펩타이드는 서로 동일하다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인은 아미노산 변형을 I253번 위치에 포함한다. 일부 경우에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환을 I253번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 변형을 I253번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환을 I253번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 Fc 도메인은 아미노산 변형을 I253번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환을 I253번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, I253번 위치에서의 각각의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)은 I253A, I253C, I253D, I253E, I253F, I253G, I253H, I253I, I253K, I253L, I253M, I253N, I253P, I253Q, I253R, I253S, I253T, I253V, I253W 및 I253Y로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시 형태에서, I253번 위치에서의 각각의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)은 I253A이다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 a) i) 제1 Fc 폴리펩타이드, ii) 제2 Fc 폴리펩타이드 및 iii) 상기 제1 Fc 폴리펩타이드를 상기 제2 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제1 폴리펩타이드; b) i) 제3 Fc 폴리펩타이드, ii) 제4 Fc 폴리펩타이드 및 iii) 상기 제3 Fc 폴리펩타이드를 상기 제4 Fc 폴리펩타이드에 연결하는 링커를 포함하는 제2 폴리펩타이드; c) 제5 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제3 폴리펩타이드; 및 d) 제6 Fc 폴리펩타이드를 포함하는 제4 폴리펩타이드를 포함하는 Fc 작제물을 특징으로 하는데, 여기서, 상기 제1 Fc 폴리펩타이드와 제5 Fc 폴리펩타이드는 결합하여 제1 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제2 Fc 폴리펩타이드와 제4 Fc 폴리펩타이드는 결합하여 제2 Fc 도메인을 형성하고, 상기 제3 Fc 폴리펩타이드와 제6 Fc 폴리펩타이드는 결합하여 제3 Fc 도메인을 형성하고, 적어도 하나의 Fc 도메인은 아미노산 변형 (예를 들어, 단일 아미노산 변형)을 R292번 위치에 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인은 아미노산 변형을 R292번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환을 R292번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 변형을 R292번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환을 R292번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 Fc 도메인은 아미노산 변형을 R292번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환을 R292번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 R292번 위치에 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)을 R292P에 포함한다 (즉, 각각의 Fc 단량체는 예를 들어, 서열 번호 23과 비교하여 R292P 변형을 갖는다). 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, R292번 위치에서의 각각의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)은 R292D, R292E, R292L, R292P, R292Q, R292R, R292T 또는 R292Y로 이루어진 그룹으로부터 독립적으로 선택된다. 일부 실시 형태에서, R292번 위치에서의 각각의 아미노산 변형 (예를 들어, 치환)은 R292P이다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형 (예를 들어, 치환) I253A를 포함하며, 상기 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형 (예를 들어, 치환) R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 변형 (예를 들어, 치환) I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함하며, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 경우에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하며, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하며, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함하며, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A를 포함하며, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하며, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인은 아미노산 치환 R292P를 포함하며, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 I253A 및 R292P를 포함한다 (예를 들어, 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다). 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함하며, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함하며, 상기 제2 Fc 도메인은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 Fc 도메인, 제2 Fc 도메인 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 I253A 및 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 I253A를 포함하고, 상기 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 제1, 제2 및 제3 Fc 도메인 각각은 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제1 및 제5 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제3 및 제6 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다. 일부 실시 형태에서, 제2 및 제4 Fc 폴리펩타이드 중 하나 또는 둘 모두는 아미노산 치환 R292P를 포함한다.
일부 실시 형태에서, 본 출원에서 기재된 Fc 작제물은 항원 인식 영역, 예를 들어, 가변 도메인 또는 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함하지 않는다. 일부 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물 (또는 Fc 작제물 내의 Fc 도메인)은 상이한 폴리펩타이드에 존재하는 Fc 폴리펩타이드의 결합에 의해 전체적으로 또는 부분적으로 형성된다. 특정 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물은 2개의 폴리펩타이드의 결합을 촉진하는 추가의 도메인 (예를 들어, IgM 테일피스 또는 IgA 테일피스)을 포함하지 않는다. 다른 실시 형태에서, 공유 결합 (예를 들어, 이황화 가교)은 결합하여 Fc 도메인을 형성하는 2개의 Fc 폴리펩타이드 사이에만 존재한다. 다른 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물은 Fc 도메인 사이의 공유 결합 (예를 들어, 이황화 가교)을 포함하지 않는다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 Fc 작제물은 상기 Fc 작제물 내의 모든 또는 실질적으로 모든 Fc 도메인이 세포 표면 상의 Fc 수용체와 동시에 상호 작용할 수 있도록 충분한 구조적 가요성을 제공한다. 하나의 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 이량체화 선택성 모듈을 갖는다는 점에서 야생형과 일차 서열이 상이하거나 서로 상이하다.
또 다른 양태에서, 본 개시 내용은 Fc 폴리펩타이드의 선택적 이량체화를 촉진하기 위한 조성물 및 방법을 특징으로 한다. 본 개시 내용은 Fc 도메인을 포함하는데, 여기서, 상기 Fc 도메인의 2개의 Fc 폴리펩타이드는 CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에서 동일한 돌연변이를 포함한다. 본 개시 내용은 또한 CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면에서 하전된 잔기의 고리 내의 적어도 2개의 위치에 2개의 Fc 폴리펩타이드 서열에서 동일한 돌연변이를 갖는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 도입하는 단계를 포함하는, 이러한 Fc 도메인을 제조하는 방법을 포함한다. CH3 항체 불변 도메인 사이의 계면은 하전된 잔기의 고리로 둘러싸인 소수성 패치로 이루어진다. 하나의 CH3 항체 불변 도메인이 또 다른 도메인과 함께 올 때, 이러한 하전된 잔기는 반대 전하의 잔기와 쌍을 이룬다. 2개 이상의 상보적인 잔기 쌍의 두 구성원의 전하를 역전시킴으로써, 돌연변이된 Fc 폴리펩타이드는 동일한 돌연변이된 서열의 Fc 폴리펩타이드에 대해 상보성을 유지하지만, 이러한 돌연변이가 없는 Fc 폴리펩타이드에 대해 보다 낮은 상보성을 갖는다. 이러한 실시 형태에서, 동일한 이량체화 선택성 모듈은 동종 이량체화를 촉진한다. 이러한 Fc 도메인은 이중 돌연변이체 K409D/D399K, K392D/D399K, E357K/K370E, D356K/K439D, K409E/D399K, K392E/D399K, E357K/K370D 또는 D356K/K439E를 포함하는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 또 다른 실시 형태에서, Fc 도메인은 이중 돌연변이체의 임의의 쌍을 조합하는 4중 돌연변이체, 예를 들어, K409D/D399K/E357K/K370E를 포함하는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다.
또 다른 실시 형태에서, 동일한 이량체화 선택성 모듈에 추가하여, 상기 Fc 도메인의 Fc 폴리펩타이드는 특이적 결합을 촉진하는 동일하지 않은 돌연변이 (예를 들어, 조작된 공동 및 돌기)를 갖는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함한다. 결과적으로, 상기 2개의 Fc 폴리펩타이드는 2개의 이량체화 선택성 모듈을 포함하고 서로에 대해 상보성을 유지하지만, 다른 Fc 폴리펩타이드에 대해 감소된 상보성을 갖는다. 이러한 실시 형태는 공동 함유 Fc 폴리펩타이드와 돌기 함유 Fc 폴리펩타이드 사이의 이종 이량체화를 촉진한다. 하나의 예에서, 두 Fc 폴리펩타이드의 하전된 쌍 잔기에서 동일하지 않은 돌연변이를 갖는 상보적 이량체화 선택성 모듈은 하나의 Fc 폴리펩타이드 상의 돌기 및 다른 Fc 폴리펩타이드 상의 공동과 조합된다. 또 다른 실시 형태에서, 상기 Fc 도메인의 Fc 폴리펩타이드는 특이적 결합을 촉진하는 동일하지 않은 돌연변이 (예를 들어, 조작된 공동 및 돌기)를 갖는 상보적 이량체화 선택성 모듈을 포함하고, 동일한 이량체화 선택성 모듈을 포함하지 않는다.
본 출원에서 기재된 임의의 Fc 작제물에서, 상기 Fc 폴리펩타이드의 순서는 상호 교환 가능한 것으로 이해된다. 예를 들어, 화학식 A-L-B를 갖는 폴리펩타이드에서, A의 카복시 말단은 L의 아미노 말단에 연결될 수 있고, 이는 차례로 이의 카복시 말단에서 B의 아미노 말단에 연결된다. 대안으로, B의 카복시 말단은 L의 아미노 말단에 연결될 수 있고, 이는 차례로 이의 카복시 말단에서 C의 아미노 말단에 연결된다. 이러한 배열 형태의 둘 모두는 화학식 A-L-B에 포함된다.
이러한 작제물의 특성은 실질적으로 균질한 조성물의 효율적인 생성을 가능하게 한다. 조성물의 균질성 정도는 상기 조성물의 약동학 및 생체내 성능에 영향을 미친다. 조성물의 이러한 균질성은 상기 조성물의 안전성, 효능, 균일성 및 신뢰성을 보장하기 위해 바람직하다. 본 개시 내용의 Fc 작제물은 실질적으로 균질한 (예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 균질한) 집단 또는 조성물에 있을 수 있다.
본 출원에서 추가로 상세히 기재된 바와 같이, 본 개시 내용은 모두 동일한 수의 Fc 도메인을 갖는 Fc 작제물을 포함하는 실질적으로 균질한 조성물 뿐만 아니라 이러한 실질적으로 균질한 조성물을 제조하는 방법을 특징으로 한다.
본 개시 내용의 Fc 작제물은 2~10개의 Fc 도메인 (예를 들어, 2~8개의 Fc 도메인, 2~6개의 Fc 도메인, 2~4개의 Fc 도메인, 2~3개의 Fc 도메인, 3~5개의 Fc 도메인 또는 5~10개의 Fc 도메인), 예를 들어, 2, 3, 4 , 5, 6, 7, 8, 9 또는 10개의 Fc 도메인, 예를 들어, 본 출원에 기재된 것들을 갖는 Fc 작제물의 실질적으로 균질한 집단 (예를 들어, 적어도 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 균질함)을 포함하는 약제학적 조성물에 있을 수 있다. 결과적으로, Fc 작제물의 실질적인 응집 또는 원치 않는 다량체화를 갖지 않는 약제학적 조성물이 생성될 수 있다.
또한, 상기 Fc 다량체는 6개의 Fc 부분으로 구성될 수 있는데, 여기서, 이들 Fc 부분은 IgG Fc 부분이고, IgM의 C-말단 18개 아미노산 테일피스의 부가는 IgG의 6량체화를 초래한다. 이러한 육량체의 바람직한 예는 WO 2017/129737 A1에 개시되어 있다. 예를 들어, 상기 Fc 다량체는 6개의 IgG Fc 도메인을 포함한다. 상기 IgG Fc 도메인 각각은 2개의 Fc 폴리펩타이드를 포함하고, 각각의 Fc 폴리펩타이드는 IgG Fc 폴리펩타이드 및 IgM 테일피스를 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 IgG 힌지 영역을 추가로 포함하고, 상기 Fc 폴리펩타이드는 Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다.
예를 들어, 하나의 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 IgG1 힌지 영역, IgG1 Fc 영역 및 IgM 테일피스를 포함하고, Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않는다. 바람직한 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 서열 번호 32이고, 5개 이하의 보존적 아미노산 변화를 갖는다.
바람직한 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 IgG1 힌지 영역, IgG1 Fc 영역 및 IgM 테일피스를 포함하는데, 여기서, 상기 IgG1 Fc 영역은 309번 위치 (EU 넘버링에 따름)에서 류신 대신 시스테인을 갖고, 상기 Fc 폴리펩타이드는 Fab 폴리펩타이드를 포함하지 않고, 상기 Fc 폴리펩타이드는 서열 번호 33이다. 하나의 실시 형태에서, 상기 Fc 폴리펩타이드는 5개 이하의 보존적 아미노산 변화를 갖는 서열 번호 33이다.
일반적으로, Fc 다량체는 동일한 Fc 부분으로 구성될 수 있다. 또한, Fc 다량체는 임의의 조합에서 모두 서로 상이하거나 부분적으로 동일하고 부분적으로 서로 상이한 Fc 부분으로 구성될 수 있다.
Fc 다량체에서, 모든 Fc 부분이 돌연변이될 수 있거나, 어떠한 Fc 부분도 돌연변이되지 않을 수 있거나, 임의의 수의 Fc 부분이 돌연변이될 수 있다. 특히, 본 발명에 따른 Fc 부분은 전체 항체인 것으로 이해되지 않을 수 있다.
상기 Fc 폴리펩타이드, 상기 Fc 부분 또는 상기 Fc 다량체는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 항체 생산, Fc 부분 생산 또는 단백질 생산을 위한 임의의 공정에 의해 생산될 수 있다. Fc 폴리펩타이드, Fc 부분 및 Fc 다량체의 생산 방법은 일반적으로 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 상기 Fc 폴리펩타이드, 상기 Fc 부분 또는 상기 Fc 다량체는 상기 단백질을 인코딩하는 핵산을 포유 동물 세포, 세균 세포 또는 곤충 세포 내로 도입한 후 상기 포유 동물 세포, 세균 세포 또는 곤충 세포의 도움으로 생산될 수 있다. 후속적으로, 상기 Fc 폴리펩타이드, 상기 Fc 부분 또는 상기 Fc 다량체는 상기 포유 동물 세포, 세균 세포 또는 곤충 세포로부터 단리되거나 상청액으로부터 회수될 수 있다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 Fc 다량체를 60 mg/ml 내지 180 mg/ml의 농도로 포함한다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 Fc 다량체를 특히, 70 mg/ml 내지 160 mg/ml의 농도로, 보다 특히 80 mg/ml 내지 120 mg/ml의 농도로, 보다 더 특히, 90 mg/ml 내지 110 mg/ml의 농도로, 가장 특히, 95 mg/ml 내지 105 mg/ml의 농도로 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 Fc 다량체를 특히, 70 mg/ml 내지 160 mg/ml의 농도로, 보다 특히, 70 mg/ml 내지 140 mg/ml의 농도로, 보다 더 특히, 70 mg/ml 내지 120 mg/ml의 농도로, 가장 특히, 70 mg/ml 내지 110 mg/ml의 농도로 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 Fc 다량체를 70 mg/ml 내지 110 mg/ml의 농도로 포함한다.
또한, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 Fc 다량체를, 특히, 90 mg/ml 내지 180 mg/ml의 농도로, 보다 특히, 110 mg/ml 내지 180 mg/ml의 농도로, 보다 더 특히, 115 mg/ml 내지 160 mg/ml의 농도로, 가장 특히, 120 mg/ml 내지 160 mg/ml의 농도로 포함한다.
또 다른 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 Fc 다량체를 110 mg/ml 내지 180 mg/ml, 특히, 120 mg/ml 또는 160 mg/ml의 농도로 포함한다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물의 단백질 농도는 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 적절한 기술에 의해 측정될 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물의 단백질 농도는 흡광 분광학 기술, 비색법 (예를 들어, 브래드포드 테스트, 뷰렛 검정, 비신코닌산 검정 (BCA 검정) 또는 로리 검정), 중량 분석 (예를 들어, 킬달), 정량적 아미노산 분석 (예를 들어, 전체 가수 분해, 말단기 분석 및 에드만 분해법) 또는 굴절법에 의해 측정될 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 Fc 다량체 조성물의 단백질 농도를 측정하기 위해 280 nm에서의 흡광도를 측정하는 UV 분광법을 사용하였다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 4.8 내지 6.0의 pH 값을 추가로 포함한다.
특히, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 4.9 내지 5.8의 pH 값을 포함하고, 보다 특히, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 5.0 내지 5.6의 pH 값을 포함하고, 가장 특히, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 5.0 내지 5.5의 pH 값을 포함한다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 5.0 내지 5.5의 pH 값을 포함한다.
본 발명의 Fc 다량체 조성물의 pH 값은 pH 미터와 같은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 pH 값을 측정하기 위한 임의의 기술에 의해 검출될 수 있다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 200 mM 내지 450 mM의 농도의 안정화제를 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 "안정화제"라는 용어는 본 발명의 조성물의 임의의 성분의 분해를 방지하는 임의의 물질일 수 있다. 특히, 상기 안정화제는 본 발명의 조성물의 Fc 다량체 및/또는 Fc 부분의 분해 및/또는 응집을 방지하는 물질이다.
적합한 안정화제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 적합한 안정화제는 임의의 항산화제 (예를 들어, 자동 산화를 방지하기 위함), 임의의 격리제 (예를 들어, 촉매로서 작용할 수 있는 금속 이온을 불활성화시키기 위함) 또는 임의의 자외선 안정화제 (예를 들어, 자외선 조사로 인한 분해를 방지하기 위함)일 수 있다.
특히, 본 발명에서 사용되는 안정화제는 폴리올 및/또는 아미노산일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 안정화제로서 사용되는 폴리올은 2 내지 20개의 탄소 원자, 특히, 3 내지 18개의 탄소 원자, 보다 특히, 4 내지 15개의 탄소 원자, 가장 특히, 5 내지 12개의 탄소 원자를 기본으로 하는 유기 분자일 수 있다. 또한, 상기 폴리올은 선형 또는 분지형일 수 있다. 또한, 상기 폴리올은 하나, 둘 또는 그 이상의 원을 포함하는 원형 분자일 수 있다. 상기 폴리올은 적어도 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 8개의 하이드록시기를 포함할 수 있다. 상기 폴리올은 추가로 지방족, 지환족 또는 방향족일 수 있다.
본 발명의 조성물에서 안정화제로서 사용되는 적합한 폴리올은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 이당류, 글리세롤, 만니톨, 이노시톨, 자일리톨, 에리트리톨 및/또는 아도니톨일 수 있다. 보다 특히, 상기 안정화제는 수크로오스 또는 트레할로오스 및/또는 소르비톨과 같은 이당류이다.
본 발명의 조성물에서 안정화제로서 사용되는 적합한 아미노산은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 특히, 알라닌, 아르기닌, 아스파라긴, 아스파르트산, 시스테인, 글루타민, 글루타민산, 글리신, 히스티딘, 이소류신, 류신, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 프롤린, 세린, 트레오닌, 트립토판, 타이로신 및/또는 발린과 같은 천연 아미노산이 본 발명의 조성물에서 안정화제로서 사용될 수 있다. 보다 특히, 프롤린 또는 아르기닌이 본 발명의 조성물에서 안정화제로서 사용될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 안정화제로서 폴리올, 특히, 이당류, 바람직하게는 수크로오스 또는 트레할로오스, 또는 소르비톨과 같은 환원 당류를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 하나의 안정화제를 포함할 수 있거나, 2, 3, 4, 5개 또는 그 이상의 안정화제의 혼합물을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 50 mM 내지 500 mM 안정화제, 특히, 100 mM 내지 400 mM 안정화제, 보다 특히, 200 mM 내지 300 mM 안정화제, 가장 특히, 225 mM 내지 275 mM 안정화제를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 적어도 200 mM 수크로오스, 특히, 200 mM 내지 1000 mM 수크로오스, 보다 특히, 200 mM 내지 750 mM 수크로오스, 가장 특히, 220 mM 내지 500 mM 수크로오스를 포함할 수 있다. 수크로오스를 하나 이상의 다른 안정화제와 조합하여 사용하는 경우, 보다 낮은 농도, 예를 들어, 적어도 100 mM 수크로오스, 또는 100 mM 내지 250 mM 수크로오스가 또한 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 100 mM 내지 500 mM 트레할로오스, 특히, 150 mM 내지 400 mM 트레할로오스, 보다 특히, 200 mM 내지 300 mM 트레할로오스를 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 조성물은 50 mM 내지 500 mM 소르비톨, 특히, 100 mM 내지 400 mM 소르비톨, 보다 특히, 200 mM 내지 300 mM 소르비톨, 가장 특히, 225 mM 내지 275 mM 소르비톨을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물에서, Fc 다량체 대 안정화제의 몰 비는 1:100 내지 1:800, 특히, 1:300 내지 1:650, 보다 특히, 1:350 내지 1:500, 가장 특히, 1:400 내지 1:425일 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물에서, Fc 다량체 대 안정화제의 몰 비는 1:300 내지 1:650, 특히, 1:400 내지 1:425이다. 이러한 실시 형태의 Fc 다량체 조성물은 2~8℃에서 12 개월 동안 저장될 때 바람직하게는 10% 미만, 보다 바람직하게는 7% 미만, 보다 더 바람직하게는 5% 미만, 가장 바람직하게는 3.5% 미만의 응집체 (SEC에 의해 결정됨)를 함유한다. 이러한 실시 형태의 Fc 다량체 조성물은 25℃에서 저장될 때 바람직하게는 15% 미만, 보다 바람직하게는 10% 미만, 보다 더 바람직하게는 8% 미만, 가장 바람직하게는 6.5% 미만의 응집체를 함유한다.
또한, 본 발명에 따른 조성물은 완충제를 포함할 수 있거나, 완충제를 포함하지 않을 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 완충제를 포함한다.
본 발명에 따른 "완충제"라는 용어는 약산과 이의 짝염기 또는 그 반대의 혼합물을 포함하는 것을 기술하며, 이는 추가의 산 또는 염기가 이에 첨가될 때 이의 완충 영역에서 이의 pH를 거의 일정한 값으로 유지한다.
본 발명의 Fc 다량체 조성물은 하나 이상의 완충제를 포함할 수 있다. 본 발명에 적합한 완충제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 일반적으로, 약제학적 적용에 적합한, 특히, 사람 환자와 같은 대상체의 신체에 투여하기에 적합한 임의의 완충제가 사용될 수 있다. 본 발명에 필요한 pH 범위에서 적합한 완충제의 예로는 포스페이트 완충제, 글루타메이트 완충제, 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제 및/또는 시트레이트 완충제가 있다. 특히, 상기 완충제는 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제 또는 시트레이트 완충제이다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 완충제를 포함하는데, 여기서, 상기 완충제는 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제 또는 시트레이트 완충제이다. 바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 히스티딘 완충제를 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 항산화제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 "항산화제"라는 용어는 산화를 억제하는 물질을 기술한다. 바람직하게, 상기 항산화제는 상기 Fc 다량체 또는 상기 조성물의 Fc 다량체의 Fc 부분 또는 Fc 폴리펩타이드의 산화를 억제한다. 적합한 항산화제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 예를 들어, 약제학적 적용에 적합한, 특히, 사람 환자와 같은 대상체의 신체에 투여하기에 적합한 임의의 항산화제가 사용될 수 있다. 본 발명의 Fc 다량체 조성물은 하나 이상의 항산화제를 포함할 수 있다.
적합한 항산화제의 예로는 아스코르브산, 비타민 E, 환원 글루타티온 (GSH) 및/또는 메티오닌이 있다. 특히, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 메티오닌을 포함할 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 양의 항산화제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 또한 항산화제의 유형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 상기 Fc 다량체 조성물은 0.01 mM 내지 100 mM 항산화제, 특히, 0.05 mM 내지 50 mM 항산화제, 보다 특히, 0.1 mM 내지 30 mM 항산화제, 가장 특히, 0.5 mM 내지 25 mM 항산화제 또는 심지어 1 mM 내지 20 mM을 포함할 수 있다.
특히, 상기 Fc 다량체 조성물은 0.01 mM 내지 100 mM 메티오닌, 특히, 0.05 mM 내지 20 mM 메티오닌, 보다 특히, 0.1 mM 내지 17 mM 메티오닌, 보다 더 특히, 0.5 mM 내지 15 mM 메티오닌, 가장 특히, 1 mM 내지 12 mM 메티오닌을 포함할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 항산화제, 특히, 메티오닌을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 조성물은 계면 활성제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명에 따른 "계면 활성제"라는 용어는 2개의 액체 사이, 기체와 액체 사이, 또는 액체와 고체 사이의 표면 장력 (또는 계면 장력)을 낮추는 화합물을 기술한다. 이에 의해, 계면 활성제는 물에 용해될 때 전진 접촉각을 낮추고, 표면에서 공기 상을 치환하는 것을 돕고, 이를 액상으로 대체할 수 있다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물에 사용될 수 있는 계면 활성제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 특히, 약제학적 적용에 적합한, 특히, 사람 환자와 같은 대상체의 신체에 투여하기에 적합한 임의의 계면 활성제가 사용될 수 있다.
예를 들어, 상기 계면 활성제는 음이온성, 비이온성, 쌍성 이온성 계면 활성제의 서브클래스 중 하나일 수 있거나, 양이온성 헤드 그룹을 갖는 계면 활성제의 서브클래스에 속할 수 있다.
특히, 비이온성 계면 활성제가 사용될 수 있다. 폴리옥시에틸렌 글리콜 옥틸페놀 에테르 (예를 들어, C8H17-(C6H4)-(O-C2H4)1-25-OH (예를 들어, TritonTM X-100)), 소르비탄 알킬 에스테르 (예를 들어, SPAN® 및/또는 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르, 예를 들어, 폴리소르베이트 (예를 들어, 폴리소르베이트 20 또는 폴리소르베이트 80)) 및/또는 폴록사머 (예를 들어, Antarox®)과 같은 적합한 비이온성 계면 활성제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 특히, 소르비탄 알킬 에스테르, 보다 특히, 폴리옥시에틸렌 글리콜 소르비탄 알킬 에스테르, 보다 더 특히, 폴리소르베이트, 가장 특히, 폴리소르베이트 80이 사용된다.
일반적으로, 음이온성 계면 활성제도 또한 사용될 수 있다. 디옥틸 나트륨 설포석시네이트 (DOSS), 나트륨 라우릴 에테르 설페이트 (예를 들어, Texapon®), 리그노설포네이트 및/또는 나트륨 스테아레이트와 같은 적합한 음이온성 계면 활성제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다.
일반적으로, 본 발명의 조성물은 하나 이상의 계면 활성제를 포함할 수 있다. 상기 조성물이 1개 초과의 계면 활성제를 포함하는 경우, 이들은 동일하거나 상이한 서브클래스의 계면 활성제에 속할 수 있다. 또한, 상기 조성물이 1개 초과의 계면 활성제를 포함하는 경우, 이들은 상기에서 언급된 계면 활성제의 임의의 혼합물일 수 있다.
본 발명에서 사용될 수 있는 적합한 양의 계면 활성제는 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있으며, 또한 계면 활성제의 유형에 따라 달라질 수 있다. 일반적으로, 상기 조성물은 0.0001% w/v 내지 0.5% w/v의 계면 활성제, 특히, 0.001% w/v 내지 0.1% w/v의 계면 활성제, 보다 특히, 0.005% w/v 내지 0.05% w/v의 계면 활성제, 가장 특히, 0.01% w/v 내지 0.03%의 w/v 계면 활성제를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 조성물은 0.0001% w/v 내지 0.5% w/v의 폴리소르베이트 80, 특히, 0.001 % w/v 내지 0.1% w/v의 폴리소르베이트 80, 보다 특히, 0.005% w/v 내지 0.05% w/v의 폴리소르베이트 80, 가장 특히, 0.01% w/v 내지 0.03%의 w/v 폴리소르베이트 80을 포함할 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 계면 활성제, 특히, 폴리소르베이트 80을 추가로 포함한다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 물, 염, 임의의 기원의 젤라틴, 식물성 검, 리그닌설포네이트, 탈크, 당, 전분, 아라비아 검, 식물성 오일, 폴리알킬렌 글리콜, 향미제, 보존제, 유화제, 윤활제, 착색제, 습윤제, 충전제 등을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 통상적인 약제학적 첨가제 및 보조제, 부형제 또는 희석제, 예를 들어, 활성 화합물과 유해하게 반응하지 않는 기타 물질을 추가로 포함할 수 있다. 상기 Fc 다량체 조성물은 프로테아제 억제제와 같은 효소를 추가로 포함할 수 있다.
특히, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 하나 이상의 염을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 염, 특히, 염화 나트륨과 같은 약제학적 적용에 적합한 염은 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지되어 있다. 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 특히 1 mM 내지 250 mM 염, 보다 특히, 10 mM 내지 200 mM 염, 가장 특히, 30 mM 내지 170 mM 염을 추가로 포함할 수 있다.
임의로, 상기 현탁액은 또한 화합물의 용해도를 증가시켜 고농축 용액의 제조를 가능하게 하는 추가의 적합한 제제를 함유할 수 있다.
본 발명의 하나의 실시 형태에서, 본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물은 70 mg/ml Fc 다량체, 특히, CSL730, L-히스티딘 완충제, 염화 나트륨 및 L-프롤린, 폴리소르베이트 80, 및 주사용수를 포함할 수 있다.
상기 Fc 다량체 조성물은 저장을 위해 상기 조성물을 보존하기에 적합한 것으로 당해 분야의 통상의 기술자에게 널리 공지된 임의의 방식으로 멸균 또는 처리될 수 있다.
제2 양태에서, 본 발명은 본 발명의 Fc 다량체 조성물을 동결 건조된 형태로 포함하는 Fc 다량체 조성물에 관한 것이다.
제1 양태에 따른 Fc 다량체 조성물과 관련하여 상기에서 기재된 모든 실시 형태는 또한 제2 양태에 적용될 수 있다.
본 발명에 따른 "동결 건조된"이라는 용어는 생성물을 동결시키고 압력을 낮추고 승화에 의해 얼음을 제거하는 것을 포함하는 임의의 저온 탈수 공정을 의미한다.
상기 Fc 다량체 조성물은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 동결 건조 기술에 의해 동결 건조될 수 있다. 동결 건조는 임의의 수단과 임의의 온도에서 수행될 수 있다. 바람직하게, 동결 건조는 실온 (room temperature: RT)에서 수행된다.
상기 Fc 다량체 조성물은, 예를 들어, 상기 Fc 다량체 조성물의 농축을 포함할 수 있는 동결 건조 전에 전처리될 수 있다.
상기 동결 건조는 1차 건조의 제1 단계를 포함할 수 있다. 1차 건조 단계 동안, 압력이 (몇 밀리바 범위로) 낮아지고, 얼음이 승화될 수 있도록 물질에 충분한 열이 공급될 수 있다. 필요한 열량은 승화 분자의 승화 잠열을 사용하여 계산될 수 있다. 이러한 초기 건조 단계에서, 물질 중에 포함된 물 중 약 95%가 승화될 수 있다. 이러한 단계는 느릴 수 있는데 (산업계에서는 수일 걸릴 수 있음), 이는 너무 많은 열이 추가되면 물질의 구조가 변경될 수 있기 때문이다.
1차 건조 단계에서, 압력은 부분 진공의 적용을 통해 제어될 수 있다. 상기 진공은 일반적으로 승화 속도를 높이는데, 이는 의도적인 건조 공정으로서 유용하다. 또한, 냉각 응축기 챔버 및/또는 응축기 플레이트는 수증기가 재액화 및 응고될 표면을 제공할 수 있다.
상기 동결 건조는, 온도가 1차 건조 단계 보다 더 높게 상승될 수 있고 심지어 0℃를 초과할 수 있는 2차 건조의 제2 단계를 포함할 수 있다. 일반적으로, 압력이 또한 이러한 단계에서 탈착을 촉진하기 위해 (전형적으로는 마이크로바 또는 파스칼 분수의 범위로) 낮아질 수 있다. 그러나, 증가된 압력으로부터 이익을 얻는 제품도 있을 수 있다. 동결 건조 후, 완충제 성분은 건조된 염의 형태로 잔류할 수 있다.
또한, 동결 건조 공정 후, 상기 물질은, 예를 들어, 유리 바이알에 밀봉될 수 있다. 일반적으로, 생성된 분말은 사용 전에 적합한 용매의 첨가에 의해 재구성될 수 있다. 상기 용액은 완충 식염수 수용액과 같은 수용액일 수 있다.
바람직하게, 동결 건조는 (대부분) 액체가 제거될 때까지 수행된다. 동결 건조 공정의 종료시, 생성물 중의 최종 잔류 수분 함량은 일반적으로 매우 낮다. 특히, 생성물 중의 최종 잔류 수분 함량은 약 1%~4%이다.
특히, 본 출원에서 기재된 동결 건조물은 실질적으로 순수하고/거나 멸균될 수 있다.
바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 동결 건조 형태의 Fc 다량체 조성물에서, 상기 Fc 다량체는 3 내지 10개의 Fc 부분으로 구성된다.
보다 바람직한 실시 형태에서, 본 발명의 동결 건조 형태의 Fc 다량체 조성물에서, 상기 Fc 다량체는 3개의 Fc 부분으로 구성된다.
제3 양태에서, 본 발명은 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한 본 발명의 Fc 다량체 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 "자가 면역 질환"이라는 용어는 정상적인 신체 부위에 대한 비정상적인 면역 반응으로 인해 발생하는 병태를 기술하며, 염증성 질환의 서브타입이다.
일반적으로, 본 발명의 Fc 다량체 조성물은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 자가 면역 질환의 치료에 사용될 수 있다. 특히, 본 발명의 Fc 다량체 조성물은 Fc 부분 또는 Fc 다량체의 투여에 의해 치유될 수 있는 것으로 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 자가 면역 질환의 치료에 사용될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 Fc 다량체 조성물은 임의의 신체 부위의 자가 면역 질환의 치료에 사용될 수 있다.
본 발명에 따른 Fc 다량체 조성물로 치료될 수 있는 자가 면역 질환의 예로는 셀리악병, 제1형 당뇨병, 그레이브스병, 염증성 장 질환, 다발성 경화증, 건선, 류마티스 관절염, 특발성 혈소판 감소성 자반증 (idiopathic thrombocytopenic purpura: ITP), 가와사키병, 길랑-바레 증후군 (Guillain-Barre syndrome: GBS), 만성 염증성 탈수초성 다발성 신경병증 (Chronic Inflammatory Demyelinating Polyneuropathy: CIDP), 다초점 운동 신경병증 (Multifocal Motor Neuropathy: MMN), 중증 근무력증, 궤양성 대장염, 면역 복합체 매개성 신장 장애, 경피증, 피부근염, 시신경 척수염, 쇼그렌 증후군, 전신 혈관염 또는 전신 홍반성 루푸스가 포함될 수 있다.
본 발명에 따른 "염증성 질환"이라는 용어는 염증, 즉, 유해한 자극 (예를 들어, 병원체, 손상된 세포 또는 자극제)에 대한 체내 세포 및 조직의 복잡한 생물학적 및 방어 반응을 특징으로 하는 장애 또는 병태를 기술한다. 염증은 일반적으로 면역 세포, 혈관 및 분자 매개체와 관련된다.
염증성 질환에 대한 예로는 천식, 만성 소화성 궤양, 결핵, 치주염, 크론병, 사구체 신염, 이식 거부, 부비동염 또는 활동성 간염이 있다.
또한, 제1 양태에 따른 Fc 다량체 조성물과 관련하여 상기에서 기재된 모든 실시 형태는 또한 제3 양태에 적용된다.
자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에서 본 발명의 Fc 다량체 조성물의 사용은 비경구 투여, 예를 들어, 피하, 정맥내 및/또는 경피 투여와 같은 당해 분야의 통상의 기술자에게 공지된 임의의 형태의 투여를 포함할 수 있다. 특히, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에서 본 발명의 Fc 다량체 조성물의 사용은 이의 피하 투여를 포함한다.
또한, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에서 본 발명의 Fc 다량체 조성물의 사용은 추가의 면역글로불린 또는 이의 일부, 비스테로이드성 항염증 약물 (nonsteroidal anti-inflammatory drug: NSAID) 및/또는 면역 억제제의 병행 사용을 수반할 수 있다. 상기 Fc 다량체 조성물 및 추가의 면역글로불린 또는 이의 일부, 비스테로이드성 항염증 약물 (NSAID) 및/또는 면역 억제제는 1회 투여로 함께 투여되거나, 2회 이상의 투여로 개별적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 본 출원에서 기재된 특정 방법, 프로토콜 및 시약에 한정되지 않는데 이는 이들이 달라질 수 있기 때문이다. 또한, 본 출원에서 사용된 용어는 단지 특정 실시 형태들을 설명하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위를 한정하려는 것으로 의도되지 않는다. 본 출원 및 첨부된 청구 범위에서 사용되는 단수 형태 "한", "하나" 및 "상기"는 문맥이 달리 명백하게 명시하지 않는다면 복수의 지시 대상을 포함한다. 유사하게, "포함하다", "함유하다" 및 "포괄하다"라는 문구는 배타적이 아니라 포괄적으로 해석되어야 한다.
달리 정의되지 않는다면, 본 출원에서 사용된 모든 기술 용어 및 과학 용어 및 임의의 약어는 본 발명의 기술 분야의 통상의 기술자에 의해 통상적으로 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 출원에서 기재된 것들과 유사하거나 동등한 임의의 방법들 및 물질들이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있지만, 바람직한 방법들 및 물질들은 본 출원에서 기재될 것이다.
본 발명은 하기 도면 및 실시예에 의해 추가로 예시되는데, 이는 본 발명을 설명하기 위한 것이지만 이를 한정하려는 것이 아니며, 이로부터 추가의 특징, 실시 형태 및 이점이 취해질 수 있다. 이와 같이, 논의된 특정 변형은 본 발명의 범위에 대한 제한 사항으로서 해석되어서는 안된다. 본 발명의 범위를 벗어나지 않으면서 다양한 균등물, 변경 및 변형이 이루어질 수 있다는 것은 당해 분야의 통상의 기술자에게 자명할 것이며, 따라서, 이러한 균등한 실시 형태는 본 출원에 포함되는 것으로 이해되어야 한다.
도 1: 제형 1~12에 대해 35℃에서 시간 경과에 따른 가용성 (물리적) 응집 (HMW %).
도 2: 측정 pH의 함수로서 25℃ 및 35℃에서 응집 속도에 대한 풀링된 (pooled) 데이터의 플롯.
도 3: 제형 1~12에 대한 35℃에서 시간 경과에 따른 단편화 (LMW 종 %) (NR-캘리퍼).
도 4: 측정 pH의 함수로서 35℃에서 단편화 속도 (± SE)에 대한 풀링된 데이터의 플롯.
도 5: 모든 제형에 대해 35℃에서 시간 경과에 따른 산성 종의 형성 (CEX).
도 6: 측정 pH의 함수로서 25℃ 및 35℃에서 산성 종 형성 속도에 대한 풀링된 데이터의 플롯
도 7: 육안으로 보이지 않는 입자 분석 (a) FF1, F2, F3, F4, F5, F9, F12, F17에서 5℃ 및 25℃에서의 3 개월 후 ≥ 10 마이크론의 입자 (흑색 막대) 및 ≥ 25 마이크론의 입자 (회색 막대)에 대한 입자 수 (입자/mL). (b) F1, F2, F3, F4, F5, F9, F12, F17에서 5℃ 및 25℃에서의 3 개월 후 모든 크기 범위의 입자에 대한 입자 수 (입자/mL)의 개요: 2~5 마이크론 (흑색 막대), 5~10 마이크론 (회색 막대), 10~25 마이크론 (횡단선) 및 10-25마이크론 (사선 줄무늬).
도 8: 양이온 교환 크로마토그래피로 측정된 산성 및 염기성 종 %의 초기 (T0) 결과.
도 9: 제형에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 산화를 정량화하기 위한 RP-HPLC의 대표적인 크로마토그램.
도 10: Fc 다량체 분자 (CSL730)의 모든 제형에 대해 RP-HPLC에 의해 측정된 초기 (T0) % 단쇄 산화 종, 장쇄 산화 종 및 상대적 총 산화 %를 비교하는 플롯
도 11: 최대 2 개월의 저장 안정성 동안 25℃ 및 40℃에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 모든 제형에 대해 RP-HPLC로 측정된 총 산화 %의 과정을 도시하는 플롯
도 12: CSL730과 같은 4개의 폴리펩타이드로부터 형성된 3개의 Fc 도메인을 포함하는 Fc 작제물의 예시. 제1 폴리펩타이드 (502)는 돌기 함유 Fc 폴리펩타이드 (504)와 탠덤 시리즈로 연결된 wt 서열 (506)과 CH3-CH3 계면에서 상이한 하전된 아미노산을 함유하는 하나의 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제2 폴리펩타이드 (508)는 또 다른 돌기 함유 Fc 폴리펩타이드 (510)와 탠덤 시리즈로 연결된 wt 서열 (512)과 CH3-CH3 계면에서 상이한 하전된 아미노산을 함유하는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩타이드 (각각 514 및 516)는 공동 함유 Fc 폴리펩타이드를 함유한다.
도 2: 측정 pH의 함수로서 25℃ 및 35℃에서 응집 속도에 대한 풀링된 (pooled) 데이터의 플롯.
도 3: 제형 1~12에 대한 35℃에서 시간 경과에 따른 단편화 (LMW 종 %) (NR-캘리퍼).
도 4: 측정 pH의 함수로서 35℃에서 단편화 속도 (± SE)에 대한 풀링된 데이터의 플롯.
도 5: 모든 제형에 대해 35℃에서 시간 경과에 따른 산성 종의 형성 (CEX).
도 6: 측정 pH의 함수로서 25℃ 및 35℃에서 산성 종 형성 속도에 대한 풀링된 데이터의 플롯
도 7: 육안으로 보이지 않는 입자 분석 (a) FF1, F2, F3, F4, F5, F9, F12, F17에서 5℃ 및 25℃에서의 3 개월 후 ≥ 10 마이크론의 입자 (흑색 막대) 및 ≥ 25 마이크론의 입자 (회색 막대)에 대한 입자 수 (입자/mL). (b) F1, F2, F3, F4, F5, F9, F12, F17에서 5℃ 및 25℃에서의 3 개월 후 모든 크기 범위의 입자에 대한 입자 수 (입자/mL)의 개요: 2~5 마이크론 (흑색 막대), 5~10 마이크론 (회색 막대), 10~25 마이크론 (횡단선) 및 10-25마이크론 (사선 줄무늬).
도 8: 양이온 교환 크로마토그래피로 측정된 산성 및 염기성 종 %의 초기 (T0) 결과.
도 9: 제형에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 산화를 정량화하기 위한 RP-HPLC의 대표적인 크로마토그램.
도 10: Fc 다량체 분자 (CSL730)의 모든 제형에 대해 RP-HPLC에 의해 측정된 초기 (T0) % 단쇄 산화 종, 장쇄 산화 종 및 상대적 총 산화 %를 비교하는 플롯
도 11: 최대 2 개월의 저장 안정성 동안 25℃ 및 40℃에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 모든 제형에 대해 RP-HPLC로 측정된 총 산화 %의 과정을 도시하는 플롯
도 12: CSL730과 같은 4개의 폴리펩타이드로부터 형성된 3개의 Fc 도메인을 포함하는 Fc 작제물의 예시. 제1 폴리펩타이드 (502)는 돌기 함유 Fc 폴리펩타이드 (504)와 탠덤 시리즈로 연결된 wt 서열 (506)과 CH3-CH3 계면에서 상이한 하전된 아미노산을 함유하는 하나의 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제2 폴리펩타이드 (508)는 또 다른 돌기 함유 Fc 폴리펩타이드 (510)와 탠덤 시리즈로 연결된 wt 서열 (512)과 CH3-CH3 계면에서 상이한 하전된 아미노산을 함유하는 Fc 폴리펩타이드를 포함한다. 제3 및 제4 폴리펩타이드 (각각 514 및 516)는 공동 함유 Fc 폴리펩타이드를 함유한다.
실시예
파트 1 - pH-완충제-염 스크리닝 연구
고농도에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)를 포함하는 제형에 대한 pH, 완충제 유형 및 이온 강도의 영향을 연구하기 위해, 100 mg/mL의 단백질 농도를 갖는 CSL730 제형을 제조하고, 단백질 안정성에 대해 조사하였다.
CSL730은 국제공개공보 WO 2015/168643 A2에서 본질적으로 기재된 바와 같이 생성된, 서열 번호 24의 2개의 장쇄 및 서열 번호 23의 2개의 단쇄로 이루어진 3가 Fc 다량체이다. 이는 도 12에 도시된 바와 같이 3가 Fc 다량체를 생성한다.
물질 및 방법
물질: 실시예에 사용된 물질, 이의 카탈로그 번호 및 공급 업체는 표 1에 열거되어 있다.
[표 1]
실시예에 사용된 물질
제형의 제조: 출발 물질로서 CSL730 (재조합 Fc 다량체 벌크 정제 단백질 (농도: 146 mg/ml))을 사용하여 제형을 제조하였다. 벌크 정제 단백질을 하기에 열거된 12개의 완충액 각각에 대해 투석하였다. 각 완충액의 pH를 제조 후에 측정하였다. 손실을 설명하기 위해 30% 초과 (단백질 mg)를 적용하였다. 상기 제형을 약 5 시간 동안 약 1L의 완충액에 대해 투석하고, 후속적으로 새로운 완충액 (약 1L)으로 교체하고 밤새 투석하였다. 투석은 15 ml의 10K MWCO 카세트에서 2~8℃에서 일어났다. 투석을 위해 하기 완충액을 제조하였다:
1. 20 mM 빙초산, 50 mM 수크로오스, pH 4.5
2. 20 mM 빙초산, 50 mM 수크로오스, pH 5
3. 20 mM 빙초산, 50 mM 수크로오스, pH 5.5
4. 20 mM 히스티딘, 50 mM 수크로오스, pH 5
5. 20 mM 히스티딘, 50 mM 수크로오스, pH 5.5
6. 20 mM 히스티딘, 50 mM 수크로오스, pH 6
7. 20 mM 히스티딘, 50 mM 수크로오스, pH 6.5
8. 20 mM 히스티딘, 50 mM 수크로오스, pH 7
9. 20 mM 히스티딘, 50 mM 수크로오스, 100 mM NaCl, pH 6
10. 20 mM 시트르산 일수화물, 50 mM 수크로오스, pH 5.5
11. 20 mM 시트르산 일수화물, 50 mM 수크로오스, pH 6
12. 50 mM 수크로오스, pH 5.3 (완충제 부재)
투석 후, 각 샘플의 단백질 농도를 측정하였다. 샘플이 너무 희석된 것으로 밝혀졌을 때, 목표 100 ± 10 mg/mL를 목표로 Amicon 튜브 (30 kDa 컷오프)를 사용하여 원심 분리에 의해 상향 농축하였다. 이후에 단백질 농도를 확인하였다.
충전 및 마무리를 층류 후드 아래에서 수행하였다. 각 제형을 0.22 μm 필터를 통해 여과하고, 1 ml의 제형을 갖는 미리 라벨링된 2 ml 유리 바이알에 충전하였다. 그 다음, 바이알을 마개를 닫고 크림핑 (crimping)하였다.
본 연구를 위해 제조된 제형의 요약은 표 2에 제시되어 있다. 모든 제형에 대한 목표 완충액 농도는 20 mM이었다. 아세테이트, 히스티딘 및 시트레이트 완충액을 상이한 각각의 pH에서 사용하여 4.5~7의 pH 범위 내에서 우수한 완충 용량을 달성하였다. 어떠한 계면 활성제도 본 연구의 제형에 첨가하지 않았다. 최소 수준의 안정성을 제공하기 위해 50 mM 수크로오스를 모든 제형에 안정화제로서 첨가하였다. 수크로오스는 이온 강도에 영향을 미치지 않는다는 것에 유의한다. 고농도의 단백질이 자가 완충 작용을 하는 것으로 공지되어 있기 때문에, 하나의 완충액 무함유 제형을 제조하였다. 완충액 무함유 용액의 pH는 단백질 자체에 따라 다르다.
[표 2]
본 연구를 위해 제조된 제형의 요약
충전 후, 충전된 제형을 2~8℃, 25℃ 또는 35℃의 안정성 챔버에 넣었다. 충전/마무리 직후 ("t0"/t=0 분석의 경우) 및 4주 이하 동안의 미리 결정된 후속 시점에서 샘플을 분석하였다. 상이한 제형 사이의 분해의 동력학을 비교하기 위해, 최소 3개의 시점 (t=0, t=2주 및 t=4주)에 걸쳐 다중 선형 회귀를 사용하여 상이한 경로에 의한 분해 속도 상수 (표준 오차 포함)를 측정하였다. 일반화 선형 모델 (general linear model: GLM)을 사용하여 다중 선형 회귀를 수행하여 상기 모델에 대한 분석 데이터를 플롯하고, 적합화하였다 (수학식 1).
[수학식 1]
%P = Po + k.t
제형의 안정성을 분석하는데 사용되는 방법:
안정성 표시 방법을 사용하여 다음과 같은 다양한 시점에서 제형을 분석하였다: 크기 배제 크로마토그래피 (size exclusion chromatography: SEC), 양이온 교환 크로마토그래피 (cation exchange chromatography: CEX) 및 모세관 겔 전기 영동 (capillary gel electrophoresis: CGE) (캘리퍼) (Caliper). 또한, 제형의 pH 및 시각적 외관 (색상, 탁도 및 육안으로 보이는 입자의 경우)을 상이한 시점에서 모니터링하였다.
연구에 사용된 방법, 각 방법의 목적 및 각 분석 시점에 사용된 분석은 표 3에 요약되어 있다.
[표 3]
제형의 안정성 연구에 사용되는 분석 방법
분석 방법에 대한 설명은 하기와 같다:
육안 검사: 육안 검사를 백색과 흑색 배경과 형광등을 갖춘 검사 스테이션에서 수행하였다. 바이알 중의 제형을 거품을 생성하지 않게 부드럽게 휘저은 다음, 색상, 투명도 및 육안으로 보이는 입자의 존재에 대해 검사하였다. 2명의 독립적인 검사자가 검사를 수행하였다.
pH 검사: InLab®Ultra Micro ISM 전극을 갖춘 Mettler Toledo SevenExcellence pH 미터를 사용하여 pH를 측정하였다.
UV 분광법: IMPLEN P360 나노광도계 상에서 희석하지 않은 제형에 대해 A280/UV 측정을 사용하여 단백질 농도를 측정하였다. 측정을 제형 당 3회 수행하고, 측정값의 평균값을 계산하였다.
크기 배제 크로마토그래피 (SEC)-고성능 액체 크로마토그래피 (high performance liquid chromatography: HPLC): SEC-HPLC를 사용하여 제형의 단백질 응집 프로파일을 결정하였다. Acquity BEH200 컬럼 (Waters, 4.6x150 mm)을 갖춘 Dionex 시스템 (Ultimate 3000)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 샘플을 적절한 완충액에 10 g/L로 희석하고, 3.0 μL를 주입하고, 등용매 조건하에 0.3 mL/분의 유속으로 분리를 수행하였다. 이동상은 15분의 실행 시간을 갖는 BES 완충액 (pH 6.5)으로 이루어졌다. 온전한 단백질을 대략 3.5분의 체류 시간으로 280 nm에서 검출하였다. 단량체 종, 고분자량 종 (high molecular weight species: HMWS, 응집체) 및 저분자량 종 (LMWS, 단편)을 상대 면적 %로 보고하였다. 내부 및 외부 참조를 사용하여 실행을 검증하였다.
양이온 교환 크로마토그래피 (CEX): CEX-HPLC를 사용하여 단백질성 산성, 주요 및 염기성 종의 비율을 결정하였다. Propack WCX-10 컬럼 (Thermo Fisher, 4x250 mm)을 갖춘 Dionex 시스템 (Ultimate 3000)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 샘플을 적절한 완충액에 10 g/L로 희석하고, 3.0 μL의 주입 부피를 사용하고, 0.7 ml/분의 구배 방법으로 분리를 수행하였다. 간단히 말하자면, pH 5 및 pH 10의 2개의 수성 완충액 (이미다졸, 피페라진 및 TRIS 기반)을 55분의 기간에 걸쳐 교대로 사용하였다. 종을 280 nm에서 검출하였고, 참조 표준에 대해 식별하였고, 통합 면적에 대한 상대 면적 백분율로 보고하였다.
모세관 겔 전기 영동 (CGE) "캘리퍼" 방법: 단백질 "밴딩 패턴"을 모세관 겔 전기 영동으로 수득하였다. 미세 유체 LabChip GXII 시스템 (Perkin Elmer Australia Pty Ltd)을 사용하여 분석을 수행하였다. 미세 유체 칩 상의 단백질 전기 영동을 1차원 SDS-PAGE의 주요 특징의 통합에 의해 달성하였다: 이것은 분리, 염색, 탈염색 및 검출을 포함한다. 모세관 시퍼 (sipper)를 통해 미세 역가 플레이트로부터 상기 칩에 변성 단백질을 직접 부하하였다. 그 다음, 샘플을 동전기식으로 부하하고, 얽힌 중합체 용액의 저점도 매트릭스를 포함하는 14 mm 길이의 분리 채널에 주입하였다. 전체 샘플 준비 절차를 제조 업체 프로토콜에 따라 수행하였다. 비환원 샘플의 경우, 단백질 용액을 완충액 및 Milliq 물로 1g/L로 희석하였다. 환원 샘플을 1 M DTT로 희석하였다. 비환원 샘플에 대해서는 변성이 40℃에서 20분 동안 일어났으며, 환원 샘플에 대해서는 변성이 80℃에서 15분 동안 일어났다. 결과를 비환원 샘플에 대해 LMWS Intact 및 HMWS에 대한 상대 면적 백분율로 보고하였다. 환원 샘플의 경우, 장쇄 및 단쇄 분획을 고려하였다.
실시예 1 - t=0에서의 육안 검사
충전 직전의 모든 제형의 시각적 외관을 평가하였다. 추가로, 모든 제형의 모든 충전된 바이알을 충전/마감 후 시각적 외관에 의해 평가하였다.
높은 단백질 농도로 인해, 모든 제형은 약간의 유백색을 갖는 황갈색을 띠었다. 유백색은 pH에 따라 증가하는 것으로 관찰되었다. pH 6.5 및 7에서의 제형 중의 CSL730은 pH 7에서 보다 강렬한 침전물과 함께 침전되었다. 보다 높은 pH를 사용하여 Fc 단편을 침전시킬 수 있다는 것은 널리 공지되어 있다. 침전된 단편을 낮은 pH 완충액에 용해시켜 나중에 회수할 수 있다. 이는 재조합 Fc 다량체의 침전된 부분으로 확인되었다 (데이터는 도시되지 않음). 그러나, 저장 안정성에 대한 이러한 높은 pH 노출의 영향은 잘 이해되지 않는다.
바이알 (침전된 제형 포함)에 충전하기 전에 모든 제형을 여과하고, 마개를 닫고 크림핑한 후에 다시 검사하였다. 모든 제형은 황갈색을 띠고, 약간 유백색을 띠고, 육안으로 보이는 입자가 없었다 (pH 6.5 및 pH 7.0 제형 포함). 어떠한 겔화도 임의의 제조된 제형에서 관찰되지 않았다.
전반적으로, 결과는 pH ≥ 6.5에서의 제형이 단백질 침전을 초래하였다는 것을 나타냈다. pH 4.5까지 낮은 pH 값을 갖는 제형은 보다 낮은 pH가 단백질 침전을 초래하지 않았기 때문에 보다 적합하였다.
실시예 2 - t=0에서의 pH 및 단백질 농도 측정
모든 제형 1-12 (표 2 참조)에 대한 pH 및 단백질 농도 측정을 t=0에서 수행하였다. 목표 값과의 차이도 또한 평가하였다. 그 결과는 표 4에 요약되어 있다.
pH 측정은, pH 값이 목표 pH로부터 각각 0.4 및 0.3 단위 이내인, 표적 pH 4.5를 갖는 아세테이트 제형 및 표적 pH 5.0을 갖는 히스티딘 제형을 제외하고, 측정 pH 값이 목표 pH 값과 비교하여 대부분의 제형에 대해 ± 0.2 pH 단위 내에 있다는 것을 나타냈다. 전반적으로, 측정 pH 값에 기초하여, 본 연구에 대한 pH 스크리닝은 4.88 내지 6.92의 pH 범위를 포함한다.
측정 단백질 농도와 관련하여, 대부분의 제형은 100 +/- 10 mg/mL의 목표 농도 내에 있었다. 목표 pH 4.5 및 5.0을 갖는 아세테이트 제형은 예외이었다. 이러한 샘플은 실수로 과도하게 희석되었으며, 따라서, 연구 편차로 간주된다. 다른 한편으로, pH 6.5 및 7.0에서의 히스티딘 제형은 침전 발생의 결과로 낮은 농도를 가졌다.
상기 결과는 제형의 pH 값이 대부분의 경우에서 예상된 바와 같았다는 것을 나타낸다. 아세테이트 제형을 제외하고, pH ≥ 6.5에서 단백질 농도의 현저한 하락은 이러한 조건하에 단백질의 상당한 침전과 관련이 있다.
[표 4]
모든 제형에 대한 측정 pH (및 목표 값과의 차이) 및 단백질 농도 값.
실시예 3 - 크기 배제 크로마토그래피에 의한 t=0에서의 고분자량 (HMW) 프로파일
모든 제형 1~12 (표 2 참조)를 상기에서 기재된 바와 같이 t=0에서 고분자량 (가용성 응집체) 종의 정량화를 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
모든 제형에 대한 가용성 응집체 프로파일은 모든 제형에서 상대적으로 낮은 HMW % (전체 < 1.5%)를 나타냈으며, 대략적인 경향은 pH 증가가 보다 높은 HMW 분자 %와 관련되어 있다 (침전 지점까지)는 것을 나타낸다. 흥미롭게도, pH ≥ 6.5에서 침전 후 제형의 여과된 용액의 초기 HMW %도 또한 1.5% 미만으로 떨어졌다. 이는 pH ≥ 6.5가 높은 단백질 농도에서 Fc 다량체 분자를 제형화하는데 적합하지 않지만 낮은 단백질 농도에서 재조합 Fc 다량체 분자를 제형화하는데 적합할 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 4 - 모세관 겔 전기 영동에 의한 t=0에서의 저분자량 (LMW) 프로파일
모든 제형 1~12 (표 2 참조)를 상기에서 기재된 바와 같이 t=0에서 저분자량 종 (단편화)의 정량화를 위해 캘리퍼 (NR 캘리퍼)를 사용하는 비환원성 모세관 겔 전기 영동에 의해 분석하였다.
제형 8 (pH 약 7에서 침전)을 제외한 모든 제형은 상대적으로 낮은 LMW % (1.5~2.0%)를 나타냈다. 전반적으로, 상기 데이터는 pH와 LMW % 사이에 비례 관계가 없다는 것을 나타낸다. 그러나, pH 6.9에서 LMW %의 증가는 LMW %의 보다 측정 가능한 증가가 일어나는 임계 pH가 있을 수 있다는 것을 나타낸다.
실시예 5 - 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 의한 t=0에서의 산성 및 염기성 종 프로파일
모든 제형을 상기에서 기재된 바와 같이 t=0에서 산성 및 염기성 종의 정량화를 위해 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 의해 분석하였다.
제형 7 및 8을 제외하고, 모든 제형은 유사한 수준의 산성 종 %의 수준을 나타냈다. 산성 종의 백분율은 제형 7에서 보다 낮았으며 (52%), 제형 8에서 가장 낮았다 (45%).
상기 데이터는 pH와 초기 산성 종 % 사이에 관계가 없다는 것을 나타냈다. pH ≥ 6.5에서 히스티딘 완충액에서 초기 산성 종 %의 감소는 산성 종의 상당한 감소가 관찰되는 임계 pH가 있을 수 있다는 것을 나타낸다.
제형 7 및 8을 제외하고, 모든 제형은 유사한 수준의 염기성 종 %의 수준을 나타냈다. 모든 제형과 비교하여, 염기성 종의 백분율은 제형 7 및 8에서 더 낮았다 (4%).
상기 데이터는 pH와 초기 염기성 종 % 사이에 관계가 없다는 것을 나타냈다. pH ≥ 6.5에서 히스티딘 완충액에서 초기 염기성 종 %의 감소는 염기성 종의 감소가 관찰되는 임계 pH가 있을 수 있다는 것을 나타낸다.
그러나, 제형 7 및 8의 결과는 상기에서 기재된 바와 같이 산성 및 염기성 종 모두에 대한 단백질 침전에 의해 영향을 받을 수 있다.
실시예 1 내지 5의 요약
가공 동안 및 충전/마무리 직후 (T=0) 수행된 분석에 기초하여, pH ≥ 6.5를 갖는 제형은 고농도 (≥ 100 mg/mL)의 Fc 다량체 분자 제형에 적합하지 않을 수 있다는 결론을 내릴 수 있다.
그럼에도 불구하고, 모든 제형은 모든 제형의 pH 값 범위에 걸친 분해 동역학을 커버하는 안정성에 놓였다.
실시예 6 - 시간 경과에 따른 육안 검사
제형 1 내지 12 (표 2 참조)를 2주 및 4주 후에 육안으로 검사하였다. 그 결과는 표 5에 요약되어 있다.
상기에서 기재된 바와 같이, 2명의 검사자 (Insp 1 및 Insp 2)가 각 시점과 온도에서 시각적 외관을 검사하였다. 대부분의 경우에서 검사관 사이에 일반적인 정렬이 있었다.
모든 저장 온도에서 대부분의 제형에 대해 색상 및 투명도와 관련하여 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 모든 제형의 색상은 약간 황갈색을 유지하는 반면, 투명도는 약간 유백색을 유지하였다. 보다 높은 저장 온도에서의 제형은 육안으로 보이는 입자를 나타내기 시작했지만, 가장 중요한 입자 형성은 pH ≥ 6.5에서 일어났다. 흥미롭게도, 염을 함유하는 제형은 pH 6에서 동일한 제형과 비교하여 육안으로 보이는 입자를 나타내지 않았다.
상기 결과는 육안 검사의 각 시점에서의 입자 형성이 보다 낮은 pH를 갖는 샘플과 비교하여 pH ≥ 6.5에서 증가하였다는 것을 나타낸다.
[표 5]
2~8℃, 25℃ 및 35℃에서 2주 또는 4주 동안 저장된 제형에서 2명의 검사자에 의한 시각적 외관 테스트의 결과
실시예 7 - 시간 경과에 따른 pH 및 단백질 농도
최대 4주 동안 2~8, 25 및 35℃에서 제형 1 내지 12 (표 2 참조)의 pH 및 단백질 농도를 모니터링하였다.
전반적으로, 실험 오차 내에서, 결과는 최대 4주의 저장 동안 모든 제형에 대해 2~8, 25 및 35℃에서 pH와 단백질 농도의 최소 변화를 나타냈다.
실시예 8 - 시간 경과에 따른 고분자량 (HMW) 형성과 pH/완충액/염 사이의 관계 (크기 배제 크로마토그래피)
최대 4주 동안 2~8, 25 및 35℃에서 제형 1 내지 12 (표 2 참조)에서 HMW 종 %를 모니터링하였다. 35℃에서 저장된 제형에 대한 시간 경과에 따른 HMW %의 변화에 대한 대표적인 플롯은 도 1에 도시되어 있다. 도 1은 HMW 종 %의 초기 높은 증가 후 시간에 따른 종의 보다 느린 증가를 나타낸다. 동일한 경향이 25℃에서 저장된 제형에 대해 관찰되었다.
2~8℃에서의 4주의 저장 후 응집체 종 (HMW %)의 변화 %는 표 6에 제시되어 있다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하는 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (standard error: SE)와 함께 응집 속도 상수를 25 및 35℃ (3개 시점에서)에서 모든 제형에 대해 결정하였다. 그 결과는 표 6에 요약되어 있다.
표 6의 결과는 응집 속도가 온도 및 pH에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다. 보다 높은 응집 속도는 pH ≥ 6.0에서 일어났다. 상기 경향은 35℃에서 보다 두드러지게 관찰되었다. 6.9의 pH를 갖는 히스티딘 완충액 중의 제형 (제형 8)이 가장 안정한 것으로 나타났다는 것에 유의한다. 그러나, 이는 다른 모든 제형에서의 훨씬 보다 높은 단백질 농도와 비교하여 단백질 침전 후 이러한 제형에서의 매우 낮은 단백질 농도 (18 mg/mL)의 허상이다 (표 4 참조).
완충제 유형은 응집 속도에 약간의 영향을 미쳤다. 등가 pH에서, 상이한 완충액도 유사하게 나타났다. 자가 완충된 제형 (제형 12)은 완충제를 함유하는 등가 pH를 갖는 제형 (제형 5) 보다 약간 덜 안정하였다. 염의 첨가 (보다 높은 이온 강도를 초래함)는 응집 거동의 개선에 큰 영향을 미치지 않는 것으로 나타났다.
응집 경향은 측정 pH의 함수로서 풀링된 데이터 (25 및 35℃에서의 응집 속도)를 도시하는 도 2에 요약되어 있다 (응집 거동을 나타내지 않는 pH 7 제형 없음). 도 2는 측정 pH가 증가함에 따라 응집 속도의 전반적인 비선형 증가를 도시한 것이다.
[표 6]
2~8℃에서의 4주 저장 후 HMW %의 변화 (5번째 열), 25℃ (6번째 열) 및 35℃ (7번째 열)에서의 응집 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 응집 (HMW %)에 대한 SEC 데이터의 요약
실시예 9 - 시간 경과에 따른 단편 형성 (LMW)과 pH/완충액/염 사이의 관계 (비환원 캘리퍼스)
제형 1 내지 12 (표 2 참조)의 단편화를 최대 4주 동안 2~8, 25 및 35℃에서 모니터링하였다. 35℃에서 저장된 제형에 대한 시간 경과에 따른 단편 %의 변화에 대한 대표적인 플롯은 도 3에 도시되어 있다. 도 3은 LMW 종 (단편) %의 초기 높은 증가 후 시간에 따른 종의 보다 느린 증가를 나타낸다. 동일한 경향이 25℃에서 저장된 제형에 대해 관찰되었다.
2~8℃에서의 4주의 저장 후 단편의 변화 %는 표 7에 제시되어 있다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하는 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 단편화 속도 상수를 25 및 35℃ (3개 시점에서)에서 제형에 대해 결정하였다. 일반화 선형 모델 (GLM)을 사용하여 다중 선형 회귀를 수행하여 상기 모델에 대한 분석 데이터를 플롯하고, 적합화하였다 (수학식 1). 그 결과는 표 7에 요약되어 있다.
상기 데이터는 일반적으로 낮은 단편화가 2~8℃에서 일어난다는 것을 나타냈다. 그러나, 단편화 속도는 저장 온도와 pH (pH ≥ 6.0)에 따라 증가하였다. LMW %의 보다 중요한 변화가 약 pH 7에서 제형에 대해 2~8℃에서 관찰되었다. 25℃ 및 35℃에서, 단편화 속도는 또한 약 pH 7 (18 mg/mL의 가장 낮은 단백질 농도에도 불구하고)에 이어서 pH 6.5에서 제형 8에 대해 가장 높았다. 동일한 pH에서, 완충제 유형은 응집 속도에 약간의 영향만 미쳤다. NaCl (보다 높은 이온 강도)의 첨가에 대한 명확한 이점은 발견되지 않았다.
단편화 경향은 측정 pH의 함수로서 풀링된 데이터 (표준 오차를 갖는 35℃에서의 단편화 속도)를 도시하는 도 4에 요약되어 있다. 응집에서 관찰된 바와 같이, 도 4는 측정 pH가 증가함 (≥ pH 6.0)에 따라 단편화 속도가 증가하였다는 것을 전반적으로 도시한 것이다.
[표 7]
2~8℃에서의 4주 저장 후 단편화의 변화 (5번째 열), 25℃ (6번째 열) 및 35℃ (7번째 열)에서의 단편화 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 단편화 (LMW %)에 대한 NR-캘리퍼 데이터의 요약
실시예 10 - 시간 경과에 따른 산성 종 형성과 pH/완충액/염 사이의 관계 (양이온 교환 크로마토그래피)
최대 4주 동안 2~8, 25 및 35℃에서 제형 1 내지 12 (표 2 참조)에서 산성 종의 형성을 모니터링하였다. 35℃에서 저장된 제형에 대한 시간 경과에 따른 산성 종 %의 변화에 대한 대표적인 플롯은 도 5에 도시되어 있다. 도 5는 HMW % (도 1) 및 LMW % (도 3)에 대한 플롯과 비교하는 시간 경과에 따른 산성 종 %의 보다 우수한 선형 증가 (약 pH 7에서의 히스티딘 제형 제외)를 도시한 것이다. 동일한 경향이 또한 25℃에서 저장된 제형에 대해 관찰되었다.
2~8℃에서의 4주의 저장 후 산성 종의 변화 %는 표 8에 제시되어 있다. Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하는 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 산성 종 형성 속도 상수를 25 및 35℃ (3개 시점에서)에서 제형에 대해 결정하였다. 일반화 선형 모델 (GLM)을 사용하여 다중 선형 회귀를 수행하여 상기 모델에 대한 분석 데이터를 플롯하고, 적합화하였다 (수학식 1). 그 결과는 또한 표 8에 요약되어 있다.
상기 데이터는 일반적으로 낮은 단편화가 2~8℃에서 일어났다는 것을 나타냈다. 그러나, 산성 종 형성 속도는 저장 온도와 pH (pH ≥ 6.0)에 따라 증가하였다. 가장 높은 수준의 산성 종이 약 pH 7의 제형에서 2~8℃에서의 4주 후에 형성되었다. 25℃ 및 35℃에서, 산성 종 형성 속도는 또한 약 pH 7 (18 mg/mL의 가장 낮은 단백질 농도에도 불구하고)에 이어서 pH 6.5에서 제형 8에 대해 가장 높았다.
동일한 pH에서, 완충제 유형은 또한 산성 종 형성 속도에 역할을 하는 것으로 밝혀졌으며, 히스티딘 완충제의 제형은 아세테이트 또는 시트레이트 완충제의 동일한 pH의 제형과 비교하여 보다 우수한 저장 안정성을 나타낸다.
NaCl (보다 높은 이온 강도)의 첨가는 염이 없는 동일한 pH의 제형 보다 산성 종 형성 속도와 관련하여 보다 우수한 저장 안정성을 나타냈다.
pH에 따른 산성 종 형성 경향은 측정 pH의 함수로서 풀링된 데이터 (25 및 35℃에서의 산성 종 형성 속도)를 도시하는 도 6에 요약되어 있다. 응집 및 단편화에서 관찰된 바와 같이, 도 6은 측정 pH가 증가함 (pH > 6.0)에 따라 산성 종 형성 속도가 증가하였다는 것을 전반적으로 도시한 것이다.
[표 8]
2~8℃에서의 4주 저장 후 산성 종 %의 변화 (5번째 열) 및 25℃ (6번째 열) 및 35℃ (7번째 열)에서의 산성 종 형성 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 CEX 데이터 (산성 종 %)의 요약
실시예 1 내지 10의 결론
상기 결과는 고농도 (100 mg/mL)의 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 제형이 단백질 침전을 방지하기 위해 특정 조건을 필요로 한다는 것을 나타낸다. pH ≥ 6.5는 침전으로 인해 고농도 (100 mg/mL)의 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 제형에 적합하지 않을 수 있는 것으로 나타났다. 높은 단백질 농도 (100 mg/mL)의 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 제형은 6 보다 낮은 pH에서 응집, 단편화 및 산성 종 형성에 더 안정하였다. 또한, 높은 단백질 농도 (100 mg/mL)의 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 제형은 히스티딘 완충제 뿐만 아니라 높은 염 농도에서 산성 종 형성에 더 안정하였다.
파트 2 - 안정화제 스크리닝 연구
Fc 다량체 분자 (CSL730)를 10~100 mg/ml의 단백질 농도로 포함하는 액상 제형에 대한 안정화제 유형 (당/폴리올 및 아미노산), 안정화제 수준, 계면 활성제 수준, 항산화제 유형 및 항산화제 수준의 효과를 조사하기 위해, 부형제 스크리닝 연구를 수행하였다. 단백질 농도의 함수로서의 저장 안정성을 조사하기 위해 병행 단기 (3 개월) 연구를 수행하였다. 전반적으로, 10~100 mg/mL 범위의 단백질 농도를 갖는 CSL730 제형을 제조하고 단백질 안정성에 대해 조사하였다.
물질 및 방법
물질: 실시예에 사용된 물질은 파트 1에서와 동일하였으며; 본 파트에서 사용된 추가의 물질, 이의 카탈로그 번호 및 공급 업체는 표 9에 열거되어 있다.
[표 9]
실시예에 사용된 물질, 공급 업체로부터의 상응하는 카탈로그 번호 및 공급 업체
제형의 제조: pH 6.0에서 20 mM 히스티딘, 40 mM NaCl 및 200 mM 프롤린 중에 제형화된 120 mg/mL의 CSL730 재조합 Fc 다량체 벌크 정제 단백질로부터 제형을 제조하였다.
히스티딘은 20 mM의 목표 완충제 농도의 모든 제형에서 선택된 완충제이었다. pH를 하나를 제외한 모든 제형에서 5.25 ± 0.1로 고정하였다. 폴리소르베이트 80 (PS80)은 모든 제형에서 선택된 계면 활성제이었다. PS80 농도를 하나를 제외한 모든 제형에서 0.02% w/v로 고정하였다. 200~300 mM의 목표 농도 범위에 걸쳐 상이한 안정화제 (프롤린, 아르기닌, 수크로오스, 트레할로오스 및 소르비톨)를 사용하였다. 4개의 제형은 다양한 수준 (1~20 mM)의 항산화제 (메티오닌 또는 환원 글루타티온 GSH)를 함유하였다. 연구 (따라서 제형 차이)는 주로 한번에 한 가지씩 (one factor at a time: OFAT) 변화시키도록 설계되었다. 본 연구를 위해 제조된 제형의 요약은 표 10에 제공되어 있다.
투석을 위해 하기 완충액을 제조하였다:
1. 20 mM 히스티딘, 250 mM 수크로오스, pH 5.25
2. 20 mM 히스티딘, 250 mM 트레할로오스, pH 5.25
3. 20 mM 히스티딘, 250 mM 소르비톨, pH 5.25
4. 20 mM 히스티딘, 250 mM 아르기닌, pH 5.25
5. 20 mM 히스티딘, 167 mM 아르기닌, 83 mM 수크로오스, pH 5.25
6. 20 mM 히스티딘, 225 mM 수크로오스, pH 5.25
제형 (2~6, 8~16, 18)을 제조하기 위해, 약 30~50 mL 분량의 벌크 정제 단백질을 상기에서 열거된 6개의 완충액 각각에 대해 투석하였다. 각 완충액의 pH를 제조 후에 측정하였다. 손실을 설명하기 위해 30 % 초과 (단백질 mg)를 적용하였다. 상기 제형을 약 5 시간 동안 약 1L의 완충액에 대해 투석하고, 후속적으로 새로운 완충액 (약 1L)으로 교체하고 밤새 투석하였다. 투석은 30 또는 70 ml의 10K MWCO 카세트에서 2~8℃에서 일어났다.
투석 후, 각 투석물의 단백질 농도를 측정하였다. 샘플이 너무 희석된 것으로 밝혀졌을 때, 목표 120 ± 5 mg/mL를 목표로 Amicon 튜브를 사용하여 원심 분리에 의해 농축하였다. 이후에 단백질 농도를 확인하였다.
하기 스톡 용액을 제조하고, 최종 제형의 제조를 돕기 위한 스파이크 용액으로서 사용하였다.
1. 20 mM 히스티딘, 5.75 % w/v (500 mM) 프롤린, 0.02 % w/v PS80, pH 5.25
2. 20 mM 히스티딘, 17.04 % w/v 수크로오스, 0.02 % w/v PS80, pH 5.25
3. 10 % w/v PS80
4. 20 mM 히스티딘, 200 mM 프롤린, 40 mM 염화 나트륨, 0.02 % w/v PS80, pH 5.8 ("CSL730 희석제"로 라벨링)
원료 의약품 (drug substance: DS)은 pH 6.0에서 118 mg/mL 재조합 Fc 다량체 CSL730, 20 mM 히스티딘, 40 mM NaCl, 200 mM 프롤린 및 0.02% w/v PS80으로 구성되었다. 100 ± 5 mg/mL의 단백질 농도를 달성하기 위해 적절한 부피의 스톡 용액 1 또는 스톡 용액 2를 첨가하여 상기 DS를 희석한 다음, 0.1 M HCl을 사용하여 pH를 5.25 ± 0.1로 조정하여 제형 1 및 제형 7을 각각 제조하였다. pH를 5.8 ± 0.1로 유지하면서 스톡 용액 4를 사용하여 상기 DS를 100 ± 5 mg/mL로 직접 희석하여 제형 17을 제조하였다.
상향 농축 단계 및 단백질 농도 확인 (A280 측정) 후, 제형 2~6, 8~16 및 18을 필요에 따라 완충액 1~6으로 적절하게 희석하고, 0.1 M HCl을 사용하여 최종 pH를 5.25 ± 0.1로 조정하였다. pH 조정 단계 후에 단백질 농도를 확인하였다.
충전 및 마무리를 층류 후드 아래에서 수행하였다. 각 제형 및 이의 상응하는 위약을 0.22 μm PES 멸균 필터를 통해 여과하고, 1 ml의 제형을 갖는 미리 라벨링된 0.8 ml 유리 바이알에 충전하였다. 그 다음, 바이알을 마개를 닫고 크림핑하였다. 총 17개의 액상 제형과 13개의 위약을 제조하였다.
충전/마무리 후, 충전된 액상 제형의 바이알을 2~8℃, 25℃ 또는 40℃에서 안정 챔버에 넣었다. "T0"/T=0 분석의 경우, 샘플을 충전/마무리 직후에 분석한 후, 6 개월 이하 동안의 미리 결정된 후속 시점에서 분석하였다. 상이한 제형 사이의 분해의 동력학을 비교하기 위해, JMP 및 Excel 소프트웨어를 사용하는 다중 선형 회귀를 사용하여 상이한 경로에 의한 분해 속도 상수 (표준 오차 포함)를 측정하였다. 일반화 선형 모델 (GLM)을 사용하여 다중 선형 회귀를 계산하여 상기 모델에 대한 분석 데이터를 플롯하고, 적합화하였다 (수학식 1).
[수학식 1]
%P = Po + k.t
[표 10]
부형제 스크리닝 연구를 위해 제조된 제형의 요약
제형의 안정성을 분석하는데 사용되는 방법:
안정성 표시 방법을 사용하여 다음과 같은 다양한 시점에서 제형을 분석하였다: 산화를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX), 모세관 겔 전기 영동 (CGE) (캘리퍼) 및 역상 HPLC (RP-HPLC). 또한, 제형의 pH, 시각적 외관 (색상, 탁도 및 육안으로 보이는 입자의 경우) 및 육안으로 보이지 않는 입자 (subvisible particle: SVP)를 상이한 시점에서 모니터링하였다.
연구에 사용된 방법과 각 방법의 목적은 표 11에 요약되어 있다. 저장 조건 및 분석 시점은 표 12에 요약되어 있다.
[표 11]
제형의 안정성 연구에 사용되는 분석 방법 및 이의 목적
[표 12]
저장 조건 및 분석 시점의 요약
상기 분석 방법에 대한 설명은 하기와 같이 제공된다:
육안 검사, pH 측정, UV 분광법, 크기 배제 크로마토그래피, 양이온 교환 크로마토그래피 및 모세관 겔 전기 영동을 상기 파트 1에서 기재된 바와 같이 수행하였다.
삼투질 농도: Gonotec Osmomat 3000 삼투질 농도계를 사용하여 제형의 삼투질 농도를 빙점 강하에 의해 초기 시점 (T0)에서 측정하였다. 샘플 부피는 300 μL이었다. 측정을 제형 당 3회 수행하고, 측정값의 평균값을 계산하였다.
육안으로 보이지 않는 입자 계수 테스트: FlowCam Biologics 기기 (동적/유동 이미징 입자 분석 - DIPA - 기술)를 사용하여 육안으로 보이지 않는 입자에 대한 제한된 분석을 3 개월의 저장 시간 후에만 2~8℃ 및 25℃에서 관심 대상 제형에 대해 수행하였다. 0.5 mL의 최소 샘플 부피를 사용하였다. 측정을 제형 당 3회 수행하고, 측정값의 평균값을 계산하였다.
역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의한 산화의 분석: RP-HPLC 방법을 사용하여 산화 종의 총량을 총 면적의 백분율로 결정하고, 단쇄 및 장쇄 모두의 산화의 상대량을 결정하였다. 샘플 제조는 적절한 완충액에서 10g/L로의 샘플 희석 후 변성 시약으로서 구아니딘 및 이황화 결합의 환원을 위한 DL-디티오트레이톨(DTT)의 사용을 포함하였다. 이러한 단계는 2개의 동일한 장쇄와 2개의 동일한 단쇄를 생성한다. 단편의 산화를 방지하기 위해, 고농도의 L-메티오닌을 함유하는 용액에 의한 후속 희석 단계 후 2 μg/μl의 샘플 농도에서의 샘플 분석을 수행하였다. AdvanceBio RP-mAb 디페닐 3.5 μm, 2.1 x 50 mm 컬럼을 갖춘 Thermo Ultimate 3000 (또는 동급)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 3 μL의 주입 부피를 사용하고, 0.35 ml/분의 구배 방법으로 분리를 수행하였다. 컬럼 온도를 65℃로 설정하였다. 간단히 말하자면, 2개의 완충액 (물 중의 0.1% 트리플루오로아세트산 및 아세토니트릴 중의 0.08% TFA)을 20분에 걸쳐 교대로 사용하였다. 종을 280 nm에서 검출하였고, 참조 표준에 대해 식별하였고, 통합 면적에 대한 상대 면적 백분율로 보고하였다.
폴리소르베이트 80 (PS80)의 분석: RP-HPLC를 사용하여 상이한 제형에서 초기 시점 (T0)에서 PS80의 양을 정량화하였다. 요약하자면, PS80 표준 및 샘플을 40℃에서 에탄올에 이어서 0.1 M KOH로 처리한 후, 역상 HPLC 방법에 의해 가수 분해로부터 생성된 올레산의 샘플 분석을 수행하였다. Nova-Pak® C18 3.9 x 150mm, 4 μm 역상 컬럼 (Waters)을 갖춘 Dionex (Ultimate 3000) 시스템 (또는 동급)을 사용하여 샘플을 분석하였다. 주입 부피는 15 μL이었으며, 등용매 방법을 사용하여 2.0ml/분으로 분리를 수행하였다. 이동상은 pH 2.8에서 20% 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 완충액을 함유하는 80% 아세토니트릴이었다. 컬럼 온도를 40℃로 설정하였다. 종을 250 nm에서 검출하고, PS80 표준 용액에 의해 생성된 표준 검량선을 사용하여 정량화하였다. 데이터를 PS80의 %(w/v)로 보고한다.
실시예 1 - T0에서 및 시간 경과에 따른 육안 검사
충전된 모든 바이알을 충전/마무리 후 2명의 검사자 (상기에서 기재된 바와 같은 Insp 1 및 Insp 2)와 각 시점 및 온도에서 시각적 외관 (100% 육안 검사)으로 검사하였다. 어떠한 유의한 불일치도 검사자 사이의 시각적 설명에서 발견되지 않았다.
10 mg/ml 제형을 제외하고, 다른 모든 제형은 높은 단백질 농도로 인해 약간의 황갈색 (brownish yellow: BY) (70 mg/mL 제형) 내지 약간의 유백색을 띤 BY (100 mg/mL 제형) 색상을 나타냈다. 0~2개의 육안으로 보이는 입자가 일부 제형 및 위약에서 무작위로 관찰되었다. 단백질에 대한 지식을 가지고 면밀히 조사한 결과, 육안으로 보이는 입자는 본질적으로 외인성인 것으로 나타났다 (아마도 충전/마무리 공정 동안에 도입되었을 것임). 높은 단백질 농도의 제형은 겔화를 겪지 않았다.
제형 1 내지 18 (표 10 참조)을 상이한 온도에서 최대 6개월 동안 육안으로 검사하였다. 대부분의 제형의 색상은 T0 (10 mg/ml 제형에 대해 무색, 70 mg/ml 제형에 대해 약간의 BY, 및 100 mg/ml 제형에 대해 BY)부터 모든 저장 온도에서 변화되지 않은 상태로 유지되었다. 환원 GSH를 갖는 제형은 동일한 단백질 농도의 제형과 비교하여 약간 더 많은 BY 색상을 나타냈다. 투명도는 변화되지 않은 상태로 유지되었다 (10 mg/ml 제형에서는 투명하고, 다른 모든 제형에서는 약간의 유백색). 입자 수는 온도와 시간에 관계 없이 T0 (0~2)에서 변화되지 않은 상태로 유지되었다. 어떠한 제형도 임의의 온도에서 저장 기간 동안 겔화되지 않았다.
시간에 따라, GSH 함유 위약은 약간의 BY 또는 BY 색상으로의 변색을 나타냈다. 상기 색상은 저장 시간, 저장 온도 및 GSH 농도 증가에 따라 강화되었다. 다른 제형에 대한 위약은 온도와 시간에 관계 없이 투명하고 무색으로 유지되었다. 전반적으로, 입자 수는 T0부터 변화되지 않은 상태로 유지되었다.
실시예 2 - T0에서 및 시간 경과에 따른 삼투질 농도, pH, 단백질 농도 및 폴리소르베이트 80 측정
모든 제형 1~18 (표 10 참조)에 대한 삼투질 농도, pH, 단백질 농도 및 폴리소르베이트 80 (PS80) 농도 측정을 초기 시점 (T0)에서 수행하였다. 그 결과는 표 13에 요약되어 있다.
표 13의 결과는 단백질 농도가 고농도 제형에 대해 100 ± 5 mg/mL 이내에 있다는 것을 나타낸다. pH 측정은 측정 pH 값이 목표 pH 값과 비교하여 모든 제형에 대해 ± 0.1 pH 단위 이내에 있다는 것을 나타냈다. 삼투질 농도 측정값은 삼투질 농도 값이 400 mOsm/kg 초과인 아르기닌 함유 제형 (제형 5, 6)을 제외하고 일반적으로 300~390 mOsm/kg 이내에 있었다. 모든 제형의 PS80 농도는 PS80 목표 농도의 최대 ± 0.003% w/v 이내에 있었다.
최대 6 개월 동안 2~8, 25 및 40℃에서 제형 1 내지 18 (표 10 참조)의 pH 및 단백질 농도를 모니터링하였다.
표 14는 상이한 저장 온도 및 시간에서의 pH 측정 결과를 요약한 것이다. 실험 오차 이내에서, 결과는 측정된 시간 프레임 내의 모든 제형에 대해 모든 온도에서 pH의 최소 변화 (최대 ± 0.1 단위 이내)를 나타냈다.
표 15는 상이한 저장 온도 및 시간에서의 단백질 농도 측정 결과를 요약한 것이다. 실험 오차 이내에서, 결과는 시간에 따른 단백질 농도의 작은 변화를 나타냈다. 3개의 제형은 시간에 따른 단백질 농도의 상대적으로 보다 큰 변화를 나타냈지만 (40℃에서의 F3 및 25℃ 및 40℃에서의 F15), 이들 제형 중 어느 것에서도 단백질 침전이 나타나지 않았다. 단백질 농도의 평균 변화는 측정 기간 내에서 2~8℃에서 1.0 mg/mL, 25℃에서 1.7 mg/mL, 40℃에서 1.6 mg/mL이었다. 이는 사용된 고처리량 기술의 상대적 검정 가변성의 결과인 것으로 추정된다.
[표 13]
초기 시점 (T0)에서 모든 제형에 대해 측정된 단백질 농도 (± 표준 편차), pH, 삼투질 농도 (± 표준 편차) 및 폴리소르베이트 80 (PS80) 농도
[표 14]
최대 6 개월 동안 상이한 저장 온도에서 모든 제형에 대해 측정된 pH (제형에 대한 측정이 음영 영역을 갖는 저장 조건에서 수행되지 않음)
[표 15]
최대 6 개월 동안 상이한 저장 온도에서 모든 제형에 대해 측정된 단백질 농도 (mg/mL) (제형에 대한 측정이 음영 영역을 갖는 저장 조건에서 수행되지 않음)
실시예 3 - 6 개월 시점에서 육안으로 보이지 않는 입자의 제한된 분석
육안으로 보이지 않는 낮은 입자 수가 테스트된 모든 입자 크기 범위에서 5 및 25℃에서 3 개월 동안 저장 후 테스트된 대부분의 제형에 대해 측정되었다 (도 7 참조).
육안으로 보이지 않는 높은 입자 수가 F1 (5℃ 및 25℃ 모두)에 대해 관찰되었다. 이는 제형을 생성하기 위한 공정과 관련될 수 있었다. 높은 수준의 입자는 투석이 아닌 스파이킹에 의한 pH 조정과 관련될 수 있었다.
실시예 4 - T0에서 및 시간 경과에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의한 응집 거동 (고분자량 종)의 연구
모든 제형 1~18 (표 10 참조)을 상기에서 기재된 바와 같이 T0에서 고분자량 (가용성 응집체) 종의 정량화를 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
모든 제형에 대한 초기 (T0) HMW %는 표 17에 제시되어 있다. 앞서 기재된 바와 같은 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 응집 속도 상수를 2~8, 25 및 40℃에서 모든 제형에 대해 결정하였다. 그 결과는 또한 표 16에 요약되어 있다.
모든 제형에 대한 초기 (T0) 가용성 응집체 프로파일은 HMW %의 변이를 나타냈다. 이는 상이한 제형을 제조할 때 공정의 차이에 기인한다. 예를 들어, 일부 투석물은 투석 후 상향 농축을 겪어야 하였지만, 다른 투석액은 그렇지 않았다. 전반적으로, 비교적 낮은 HMW %가 T0에서 모든 제형에서 측정되었다 (전체 <1.5%). 흥미롭게도, 응집체 (HMW %) 수준의 체계적인 증가 (systematic increase)는 단백질 농도 증가를 갖는 제형 (F2, F10, F11)에서 관찰되었다. 이러한 제형은 동일한 스톡 투석물 용액의 동일한 완충액을 사용하여 단순 희석에 의해 제조되었다는 것에 유의한다.
모든 제형의 응집이 응집 안정성 측면에서 제형의 성능을 구별하기에 충분한 수준 (최고 성능에서 최악 성능까지)에 도달하였기 때문에, 모든 제형의 분석을 40℃에서 3 개월의 저장 후 중단하였다. F10, F11, F14 및 F15의 분석도 또한 2~8℃ 및 25℃에서 3 개월 후에 중단하였다. F10 및 F11에 대해 2~8℃ 및 25℃에서 3 개월까지 수집된 응집 데이터는 물리적 안정성 (응집에 의함)에 대한 단백질 농도의 영향을 결정하기에 충분하였다. 다른 한편으로, F14와 F15는 이러한 방법과 이들의 제거를 정당화하기에 충분한 다른 방법 (논의 예정)에 의해 불충분한 안정성을 나타냈다. 일반적으로, 주요 종 (단량체) %는 응집 (HMW %)과 단편 (LMW %)의 동시 증가와 함께 시간에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 단편화는 이러한 방법에 의해 보고되지 않지만 나중에 논의되는 바와 같이 LMW (CGE)에 대한 보다 신뢰할 수 있는 방법에 의해 보고된다.
예상된 바와 같이, 표 16의 결과는 응집 속도가 저장 온도에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다. 온도가 10℃ 증가할 때마다, 응집 속도는 평균 1.75배 증가하고 보다 큰 변화가 40℃에서 관찰되었는데, 이는 보다 낮은 온도 저장 조건과 비교하여 이러한 보다 높은 저장 온도에서 분자의 상이한 응집 기전의 가능성이 있다는 것을 나타낸다.
안정화제 유형의 효과를 평가하기 위해, F1~F7의 저장 안정성을 비교하였다. 제형에 사용된 안정화제는 당/폴리올, 아미노산, 또는 아미노산과 당의 혼합물이었다. 전체 안정화제 수준을 이러한 제형에 대해 250 mM으로 고정하였다. 표 16의 결과는 수크로오스 및 트레할로오스 기반 제형 (각각 F2 및 F3) 중의 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 모든 온도에서 다른 모든 제형과 비교하여 2~8℃ 및 25℃에서 약간 더 낮은 응집 속도와 40℃에서 상당히 더 낮은 응집 속도에 의해 입증된 바와 같이 보다 우수한 저장 안정성을 가졌다는 것을 나타낸다. 소르비톨 기반 제형은 40℃에서 아미노산 기반 제형 (아미노산과 함께 수크로오스의 존재 여부에 관계 없이) 보다 우수한 안정성을 나타냈지만, 최대 6 개월 동안 보다 낮은 온도에서 유사한 안정성을 나타냈다. 유사하게, 프롤린 기반 제형은 40℃에서 아르기닌 기반 제형 (수크로오스의 존재 여부에 관계 없이) 보다 우수한 안정성을 나타냈지만, 최대 6 개월 동안 보다 낮은 온도에서 유사한 안정성을 나타냈다.
고정된 안정화제 수준에서 단백질 농도의 영향을 평가하기 위해, 당 유형 안정화제로서의 수크로오스에 대해 F2, F10 및 F11의 저장 안정성을 비교하였다. 단백질 농도 범위는 10~100 mg/mL이었다. 예상된 바와 같이, 표 16의 결과는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 F11에서 매우 낮은 농도 (10 mg/mL), 이어서 70 mg/mL (F10), 이어서 100 mg/mL (F2)에서 우수한 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다. 모든 온도에서 3개의 모든 제형에 대한 단백질 농도의 함수로서의 응집 속도 상수의 플롯은 단백질 농도에 따른 응집 속도의 비선형 증가를 나타낸다 (결과는 도시되지 않음). 고정된 안정화제 수준에서, 단백질 농도가 감소함에 따라, 안정화제 대 단백질의 몰비가 증가한다는 것에 유의한다 (표 10) - 저장 안정성의 상당한 개선에 기여할 수 있는 요인.
고정된 (높은) 단백질 농도 (100 mg/mL)에서 안정화제 수준의 영향을 평가하기 위해, 당 유형 안정화제로서의 수크로오스에 대해 F2, F8 및 F9의 저장 안정성을 비교하였다. 안정화제 수준은 200~300 mM의 범위이었다. 표 16의 결과는 225 mM (F8)의 수크로오스가 모든 저장 온도에서 250 mM (F2) 및 300 mM (F9) 제형과 비교하여 가장 안정하지 않은 수크로오스 제형이었다는 것을 나타낸다. F9는 모든 온도에서 F2 보다 점진적으로 더 좋은 저장 안정성을 나타냈다. 유사하게, 200 mM의 프롤린 (F17)에서의 Fc 다량체 분자 (CSL730)는 모든 저장 온도에서 250 mM의 프롤린에서 보다 상당히 덜 안정하였다. 흥미롭게도, Fc 다량체 분자 (CSL730)는 40℃ 저장 온도에서 프롤린 제형과 비교하여 모든 수크로오스 제형에서 더 안정하였다.
고정된 안정화제 수준에서 항산화제 (유형 및 수준)의 효과를 평가하기 위해, F2, F12, F13, F14 및 F15의 저장 안정성을 비교하였다. 메티오닌 (10 및 20 mM) 및 환원 글루타티온 GSH (1 및 10 mM)를 항산화제로서 사용하였다. 표 16의 결과는 항산화제로서 메티오닌을 갖는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 40℃에서 메티오닌 수준의 증가에 따라 저장 안정성 (물리적)의 점증적 (작은) 개선을 나타냈다는 것을 보여준다. 그러나, 메티오닌을 함유하거나 함유하지 않는 제형의 물리적 안정성 사이에는 어떠한 유의한 차이도 없었다. 환원 GSH를 함유하는 제형은 항산화제를 함유하지 않는 제형 (F2) 및 항산화제로서 메티오닌을 함유하는 제형 (F12, F13)과 비교하여 40℃에서 상당히 더 큰 불안정성을 나타냈다. 보다 작은 저장 안정성 차이가 25℃에서 F2, F12 및 F13과 비교하여 GSH 함유 제형 사이에 관찰되었지만, 결과는 동일하였다 (환원 GSH 제형에서 안정성이 더 낮음). 그럼에도 불구하고, 다른 방법에 의한 안정성 데이터가 F14 및 F15의 제거를 정당화하는 상당한 불안정성을 나타내기 때문에, 환원 GSH 제형 (F14, F15)을 3 개월의 저장 후에 제거하였다.
고정된 안정화제 수준에서 계면 활성제 (PS80)의 효과를 평가하기 위해, F2 및 F18의 저장 안정성을 비교하였다. PS80 수준을 0.02% w/v 및 0.04% w/v에서 평가하였다. 최대 6 개월 동안 2~8℃ 및 25℃에서의 두 제형의 저장 안정성 (응집) 사이에는 어떠한 유의한 차이도 관찰되지 않았다. 그러나, Fc 다량체 분자 (CSL730)는 40℃에서 보다 낮은 PS80 농도 (F2)에서 더 안정하였다.
[표 16]
초기 (T0) HMW %, 및 최대 6 개월 동안 2~8℃, 최대 6 개월 동안 25℃ 및 3 개월 동안 40℃에서의 응집 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 응집 (HMW %)에 대한 SEC 데이터 요약 (제형에 대한 측정이 음영 영역을 갖는 저장 조건에서 수행되지 않음)
실시예 4 - T0에서 및 시간 경과에 따른 비환원 모세관 겔 전기 영동 (NR-cGE)에 의한 단편화 거동 (저분자량 종)의 연구
모든 제형 (표 10 참조)을 상기에서 기재된 바와 같이 T0에서 저분자량 (LMW) 종 (즉, 단편화)의 정량화를 위해 캘리퍼 (NR 캘리퍼)를 사용하는 비환원성 cGE에 의해 분석하였다. 위약 샘플도 또한 실행하였으며, 단백질 피크를 갖는 위약 성분 (즉, 제형 불활성 성분)의 어떠한 간섭도 cGE 크로마토그램에서 관찰되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음).
모든 제형에 대한 초기 (T0) LMW 총 종 %를 측정하였다. F15는 단편의 가장 높은 T0 수준을 가졌으며, 관찰은 또한 SEC를 사용하여 확인하였다 (데이터는 도시되지 않음). F15를 제외한 모든 제형에서 측정된 초기 (총) LMW 종 %는 2.1~2.5%의 범위로 상대적으로 낮았다.
F10 및 F11을 제외하고, 선택된 제형에 대해 상이한 온도에서 시간 경과에 따른 NR-cGE "캘리퍼" 방법을 사용하여 제형의 단편화 거동을 모니터링하였는데, 이는 상대적으로 보다 높은 처리량 방법이기 때문이다. 앞서 기재된 바와 같은 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 단편화 속도 상수를 상이한 저장 온도에서 결정하였다. 그 결과는 또한 표 17에 요약되어 있다.
모든 제형의 단편화가 단편화 안정성 측면에서 제형의 성능을 구별하기에 충분한 수준 (최고 성능에서 최악 성능까지)에 도달하였기 때문에, 모든 제형의 분석을 40℃에서 3 개월의 저장 후 중단하였다. F14와 F15의 분석도 또한 2~8℃ 및 25℃에서 3 개월 후에 중단하였는데, 이는 이들이 이러한 방법과 이들의 제거를 정당화하기에 충분한 다른 방법 (응집, 산화)에 의해 불충분한 안정성을 나타냈기 때문이다. 일반적으로, SEC 분석에서 관찰된 바와 같이, 주요 종 %는 응집 (HMW %)과 단편 (LMW %)의 동시 증가와 함께 시간에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다. 그러나, 응집은 이러한 방법에 의해 보고되지 않았는데, 이는 응집이 가용성 응집체에 대한 보다 신뢰할 수 있는 방법인 SEC에 의해 보고되었기 때문이다.
3 개월 후 및 6 개월 후 LMW %의 매우 작은 변화에 의해 입증된 바와 같이, 단편화의 작은 변동 (검정 오차 이내)이 시간에 따라 2~8℃에서 연구된 모든 제형에서 일어났다.
예상된 바와 같이, 표 17의 결과는 단편화 속도가 저장 온도에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다.
안정화제 유형의 효과를 평가하기 위해, F1~F7의 저장 안정성을 비교하였다. 표 17의 결과는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 25℃ 및 40℃ 둘 다에서 아르기닌의 존재하에 (수크로오스의 존재 또는 부재에 관계 없음: F5 및 F6) 보다 상당한 단편화 가능성을 나타냈다는 것을 보여준다. 단편화는 25℃에서 다른 모든 제형과 비슷하였다. 40℃에서, 더 적은 단편화가 40℃에서 보다 낮은 단편화 속도에 의해 입증될 때 프롤린 및 트레할로오스 제형 (각각 F1 및 F3)과 비교하여 수크로오스 및 소르비톨 (각각 F2 및 F4) 제형에서 관찰되었다.
고정된 단백질 농도 (100 mg/mL)에서 안정화제 수준의 영향을 평가하기 위해, 당 유형 안정화제로서의 수크로오스에 대해 F2, F8 및 F9의 저장 안정성을 비교하였다. 안정화제 수준은 200~300 mM의 범위이었다. 표 17의 결과는 수크로오스 수준의 함수로서 25℃에서 단편화 안정성에 큰 차이가 없다는 것을 나타낸다. 놀랍게도, 250 mM (F2) 수크로오스를 함유하는 제형은 40℃에서 225 mM 및 300 mM 수크로오스의 상응하는 제형 보다 더 우수한 단편화 안정성을 나타냈다. 안정화제로서 프롤린을 사용하는 경우, 200 mM (F17) 프롤린 중의 Fc 다량체 분자 (CSL730)는 25℃ 및 40℃에서 250 mM 프롤린을 함유하는 제형과 비교하여 단편화와 관련하여 약간 더 우수한 안정성을 나타냈다.
고정된 안정화제 수준에서 항산화제 (유형 및 수준)의 효과를 평가하기 위해, F2, F12, F13, F14 및 F15의 저장 안정성을 비교하였다. 표 17의 결과는 40℃에서 항산화제로서 메티오닌의 존재 대 부재하에 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 단편화 저장 안정성에서 작은 차이가 있었다는 것을 나타낸다. 단편화와 관련된 안정성은 설명할 수 없는 이유로 25℃에서 메티오닌의 부재하에 약간 더 우수하였다. 단편화와 관련된 보다 상당한 불안정성은 환원 GSH를 함유하는 제형에 대해 25℃ 및 40℃ 모두에서 3 개월의 저장 후에만 관찰되었다. 따라서, 이러한 방법과 다른 방법에 의한 안정성 데이터가 F14 및 F15의 제거를 정당화하는 상당한 불안정성을 나타내기 때문에, 환원 GSH 제형 (F14, F15)을 3 개월의 저장 후에 제거하였다.
고정된 안정화제 수준에서 계면 활성제 (PS80)의 효과를 평가하기 위해, F2 (0.02 % w/v PS80) 및 F18 (0.04 % w/v PS80)의 저장 안정성을 비교하였다. 최대 6 개월 동안 25℃에서의 두 제형의 저장 안정성 (단편화) 사이에는 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 그러나, Fc 다량체 분자 (CSL730)는 40℃에서 보다 낮은 PS80 농도 (F2)에서 더 안정하였다.
[표 17]
초기 (T0) LMW %, 3 및 6 개월 후 2~8℃에서의 단편화 변화, 및 6 개월의 저장 기간 동안 25℃에서 및 3 개월의 저장 기간 동안 40℃에서의 단편화 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 단편화 (LMW %)에 대한 "캘리퍼" 방법의 NR-cGE 데이터의 요약 (제형에 대한 측정이 음영 영역을 갖는 저장 조건에서 수행되지 않음)
실시예 5 - T0에서 및 시간 경과에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 의한 산성 및 염기성 종의 연구
모든 제형 (표 10 참조)을 상기에서 기재된 바와 같이 T0에서 산성 종 및 염기성 종 %의 정량화를 위해 CEX에 의해 분석하였다. 위약 샘플도 또한 CEX에 의해 실행하였으며, 단백질 피크를 갖는 위약 성분의 어떠한 간섭도 CEX 크로마토그램에서 관찰되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음).
도 8은 모든 제형에 대한 산성 및 염기성 종 %에 대한 초기 (T0) 결과를 비교한다. 대부분의 제형에 대한 T0에서의 산성 종 %는 비슷하였다. F15 (높은 환원 GSH 수준) 및 F17 (보다 낮은 프롤린 수준) 중의 산성 종 %의 출발 수준은 다른 제형과 비교하여 약 2.5~3.5% 더 낮았다 (표 9 참조). 유사하게, 대부분의 제형에 대한 T0에서의 염기성 종 %는 비슷하였다 (약 4~5%). 그러나, F15는 다른 제형과 비교하여 가장 높은 출발 수준의 염기성 종 % (6.1%)를 나타냈다.
상이한 온도에서 시간 경과에 따른 CEX 방법을 사용하여 모든 제형에 대한 산성 종 %를 모니터링하였다. 앞서 기재된 바와 같은 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 산성 종 형성 속도 상수를 상이한 저장 온도에서 결정하였다. 그 결과는 또한 표 18에 요약되어 있다.
모든 제형의 산성 종의 수준이 산성 종의 안정성 측면에서 제형의 성능을 구별하기에 충분히 상이하고 높기 (최고 성능에서 최악 성능까지) 때문에, 모든 제형의 분석을 40℃에서 2 개월의 저장 후 중단하였다. F10, F11, F14 및 F15의 분석도 또한 2~8℃ 및 25℃에서 3 개월 후에 중단하였다. F14와 F15는 이러한 방법과 이들의 제거를 정당화하기에 충분한 다른 방법에 의해 불충분한 안정성을 나타냈다. 일반적으로, 주요 종 %는 염기성 종 %의 동시 증가와 산성 종 %의 보다 큰 증가와 함께 시간에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다.
F15는 2~8℃에서 3 개월 동안만의 저장 후 산성 종 %의 상당한 증가를 나타냈고, 이어서 F17이 뒤따랐다. 산성 종 %의 작은 변동 (검정 오차 이내)이 동일한 온도에서 다른 제형에 대해 관찰되었다. 2~8℃에서 3 개월 시점 후 계속된 제형의 경우, 산성 종 %의 작은 변동이 동일한 제형에서 관찰되었다. 이들 제형 중에서, F17은 2~8℃에서 6 개월의 저장 후 여전히 보다 높은 수준의 산성 종 %를 나타냈다 (표 18).
예상된 바와 같이, 표 18의 결과는 산성 종 형성 속도가 저장 온도에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다.
안정화제 유형의 효과를 평가하기 위해, F1~F7의 저장 안정성을 비교하였다. 표 18의 결과는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 25℃ 및 40℃ 모두에서 아르기닌 (F5 및 F6)의 존재하에 산성 종 형성 속도와 관련하여 놀랍게도 보다 우수한 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다 (단편화 및 응집 안정성 경향과 다름).
고정된 안정화제 수준에서 단백질 농도의 영향을 평가하기 위해, 당 유형 안정화제로서의 수크로오스에 대해 F2, F10 및 F11의 저장 안정성을 비교하였다. 표 18의 결과는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 25℃ 및 40℃ 둘 다에서 상이한 단백질 농도의 3개의 제형 사이의 산성 종 형성과 관련하여 안정성에서 작은 차이를 나타냈다는 것을 보여준다.
고정된 단백질 농도 (100 mg/mL)에서 안정화제 수준의 영향을 평가하기 위해, 당 유형 안정화제로서의 수크로오스에 대해 F2, F8 및 F9의 저장 안정성을 비교하였다. 안정화제 수준은 200~300 mM의 범위이었다. 표 18의 결과는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 25℃ 및 40 ℃ 둘 다에서 상이한 수크로오스 수준의 3개의 제형 사이의 산성 종 형성과 관련하여 안정성에서 작은 차이를 나타냈다는 것을 보여준다. F17에 대해 보다 높은 수준의 산성 종 %로 출발함에도 불구하고, 200 mM (F17) 프롤린 중의 Fc 다량체 분자 (CSL730)는 25℃ 및 40℃ 모두에서 250 mM 프롤린 중의 산성 종 형성과 관련하여 안정성이 비슷하였다. 전반적으로, 수크로오스 및 프롤린 제형에서 산성 종 형성과 관련된 Fc 다량체 분자 (CSL730) 안정성은 25℃ 및 40℃ 모두에서 비슷하였다.
고정된 안정화제 수준에서 항산화제 (유형 및 수준)의 효과를 평가하기 위해, F2, F12, F13, F14 및 F15의 저장 안정성을 비교하였다. 표 18의 결과는 25℃ 및 40℃ 모두에서 항산화제로서 메티오닌의 존재 대 부재하에 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 산성 종 형성에 관한 저장 안정성에서 작은 차이가 있었다는 것을 나타낸다. 응집 및 단편화 안정성의 관찰과 유사하게, 산성 종 형성에 관한 보다 많은 불안정성이 환원 GSH를 함유하는 제형에서 관찰되었다. 환원 GSH 함량의 증가에 따른 산성 종 형성 속도 상수의 체계적인 증가는 25℃에서 최대 3 개월 및 40℃에서 최대 2개월이다. 따라서, 이러한 방법과 다른 방법에 의한 안정성 데이터가 F14 및 F15의 제거를 정당화하는 상당한 불안정성을 나타내기 때문에, 환원 GSH 제형 (F14, F15)을 3 개월의 저장 안정성 후에 제거하였다.
고정된 안정화제 수준에서 계면 활성제 (PS80)의 효과를 평가하기 위해, F2 (0.02% w/v PS80) 및 F18 (0.04% w/v PS80)의 저장 안정성을 비교하였다. 25℃ 및 40℃에서의 두 제형의 저장 안정성 (산성 종 형성) 사이에는 작은 차이가 관찰되었다.
[표 18]
초기 (T0), 3 및 6 개월 후 2~8℃에서의 산성 종 %의 변화, 및 6 개월의 저장 기간 동안 25℃에서 및 2 개월의 저장 기간 동안 40℃에서의 산성 종 형성 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 산성 종 %에 대한 CEX 데이터의 요약 (제형에 대한 측정이 음영 영역을 갖는 저장 조건에서 수행되지 않음)
실시예 6 - T0에서 및 시간 경과에 따른 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (RP-HPLC)에 의한 산화 거동의 연구
모든 제형 (표 10 참조)을 상기에서 기재된 바와 같이 T0에서 장쇄 (long chain: LC) 및 단쇄 (short chain: SC)의 총 산화 % 및 산화 %의 정량화를 위해 RP-HPLC에 의해 분석하였다. 도 9는 샘플 제형에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 산화 프로파일에 대한 대표적인 크로마토그램을 도시한 것이다. 도 9는 SC 산화 종, 이어서 SC, 이어서 LC 산화 종, 이어서 LC의 용출을 도시한 것이다. 크로마토그램 프로파일은 또한 SC 및 LC 단편 뿐만 아니라 SC 및 LC N-3차 피루베이트도 포함한다. 위약 샘플도 또한 RP-HPLC 방법에 의해 실행하였으며, 단백질 피크를 갖는 위약 성분의 어떠한 간섭도 크로마토그램에서 관찰되지 않았다 (데이터는 도시되지 않음). 이는 환원 GSH를 갖는 제형을 실행하는데 특히 중요하였다.
도 10은 모든 제형에 대한 SC 산화 종 %, LC 산화 종 % 및 총 산화에 대한 상대 면적 (%)에 대한 초기(T0) 결과를 비교한다. 대부분의 제형에 대한 T0에서의 산성 종 %는 비슷하였다. 대부분의 제형에 대한 SC 산화 종 %, LC 산화 종 %, 및 총 산화에 대한 상대 면적 (%)의 출발 수준은 비슷하였다. 다른 한편으로, 보다 높은 수준의 산화가 환원 GSH를 갖는 제형 (F14 및 F15)의 모든 측정 값에서 관찰되었다 (또한 표 19 참조). 산화 종 % (SC 및 LC) 및 총 산화 %는 환원 GSH 수준이 증가함에 따라 T0에서 증가하였다.
모든 제형에 대한 SC 산화 종 %, LC 산화 종 % 및 총 산화에 대한 상대 면적 (%)을 상이한 온도에서 시간 경과에 따른 RP-HPLC 방법을 사용하여 모니터링하였다. 앞서 기재된 바와 같은 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 총 산화 속도 상수를 상이한 저장 온도에서 결정하였다. 그 결과는 또한 표 19에 요약되어 있다.
몇 개의 선택된 제형을 2~8℃ 및 25℃에서 최대 6 개월 동안 분석하였다. 일부 제형의 산화 분석을 (40℃에서의 성능을 기준으로) 25℃에서 단 2 개월 후에 중단하였다. 산화가 최악의 제형의 식별 및 제거를 가능하게 할 수 있을 만큼 충분히 높은 수준에 도달하였기 때문에, 모든 제형의 분석을 40℃에서 2 개월의 저장 후 중단하였다. 일반적으로, 비산화 SC 종 % 및 비산화 LC 종 %는 산화 SC 종 % 및 산화 LC 종 %의 동시 증가와 함께 시간에 따라 감소하는 것으로 관찰되었다. 전반적으로, 도 11에서 입증된 바와 같이, 상이한 제형 중의 총 산화 %는 시간과 온도에 따라 다양한 비율로 증가하였다.
표 19는, 2~8℃에서 6 개월의 저장 후 산화에 대해 테스트된 제형의 경우, 이들이 총 산화 %의 작은 증가를 나타냈다는 것을 보여준다. 그러나, 주요 안정화제로서 아르기닌을 함유하는 제형 (F5)은 6 개월의 저장 후 가장 많은 산화를 나타냈다 - F14 및 F15는 2~8℃에서 포함되지 않았다.
예상된 바와 같이, 표 19의 결과는 산화 속도가 저장 온도에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다. 특히, 25℃에서 및 40℃에서의 산화 속도의 증가는 10 mM 환원 GSH (F15)의 존재하에 매우 경미하였다. 이는, 연구된 시스템 (F15)에서의 높은 수준의 GSH에서, 산화가 덜 온도 의존적으로 되고 GSH 농도에 의해 보다 많이 유발되어 산화 동력학의 변경을 초래한다는 것을 나타낼 수 있을 가능성이 있다.
안정화제 유형의 효과를 평가하기 위해, F1~F7의 저장 안정성을 비교하였다. 표 19의 결과는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 아미노산과 비교하여 25℃에서 폴리올/당의 존재하에 산화에 대해 보다 우수한 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다. 그러나, 40℃에서의 결과는 25℃에서의 결과와 일치하지 않았다. 따라서, 어떤 경향도 상기 결과로부터 결론을 내릴 수 없다. 측정된 산화 수준에서의 검정 가변성을 고려할 때, 제형 사이의 차이는 작은 것으로 간주된다.
고정된 안정화제 수준에서 단백질 농도의 영향을 평가하기 위해, 당 유형 안정화제로서의 수크로오스에 대해 F2, F10 및 F11의 저장 안정성을 비교하였다. 표 19의 결과는 단백질 농도가 25℃ 및 40℃ 둘 다에서 증가함에 따라, Fc 다량체 분자 (CSL730)가 산화에 대해 보다 우수한 안정성을 나타냈다는 것을 보여준다. 이는 100 mg/mL 및 70 mg/mL 단백질 (각각 F2 및 F10)의 제형에 대해 10 mg/mL 단백질(F11)의 제형의 안정성을 비교할 때 40℃에서 특히 사실인 것으로 나타났다. F2 및 F10은 40℃에서 F11 보다 2.4~2.8배 더 안정하였다.
고정된 단백질 농도 (100 mg/mL)에서 안정화제 수준의 영향을 평가하기 위해, 당 유형 안정화제로서의 수크로오스에 대해 F2, F8 및 F9의 저장 안정성을 비교하였다. 안정화제 수준은 200~300 mM의 범위이었다. 표 19의 결과는 Fc 다량체 분자 (CSL730)가 25℃ 및 40 ℃ 둘 다에서 상이한 수크로오스 수준의 3개의 제형 사이의 산화와 관련하여 안정성에서 약간의 차이를 나타냈다는 것을 보여준다. 동일한 결과가 25℃와 40℃ 모두에서 200 mM 및 250 mM 수준으로 안정화제로서의 프롤린의 존재하에도 나타났다.
고정된 안정화제 수준에서 항산화제 (유형 및 수준)의 효과를 평가하기 위해, F2, F12, F13, F14 및 F15의 저장 안정성을 비교하였다. 표 19의 결과는 메티오닌의 부재와 비교하여 25℃ (F12 및 F13)에서 메티오닌 수준의 증가에 따른 산화에 대한 안정성의 작지만 체계적인 개선을 나타낸다. 산화에 대한 안정성의 체계적이지만 보다 유의한 개선이 메티오닌 수준의 증가에 따라 40℃에서 관찰되었다. 환원 GSH를 함유하는 제형은 메티오닌을 함유하는 제형 (또는 심지어 항산화제를 함유하지 않는 다른 제형)과 대조적으로 산화에 대한 가장 불량한 안정성을 나타냈다 (또한 도 11 참조). 환원 GSH 함량의 증가에 따른 산화 속도 상수의 비선형 증가가 25℃ 및 40℃에서 최대 2 개월의 저장 동안 관찰되었다. 두 온도 모두에서, 1 mM GSH는 25℃와 40℃ 모두에서 메티오닌을 함유하는 대응 제형 보다 4.7~9.3배 더 많은 산화를 초래하였다. 따라서, (이전에 논의된 다른 방법과 마찬가지로) 환원 GSH 제형 (F14, F15)을 단 2 개월의 산화 저장 안정성에만 기초하여 제거하였다.
고정된 안정화제 수준에서 계면 활성제 (PS80)의 효과를 평가하기 위해, F2 (0.02 % w/v PS80) 및 F18 (0.04 % w/v PS80)의 저장 안정성을 비교하였다. 40℃에서의 두 제형의 저장 안정성 (산화성) 사이에는 어떠한 측정 가능한 차이도 관찰되지 않았다.
[표 19]
초기 (T0), 6 개월 후 2~8℃에서의 총 산화 %의 변화, 및 최대 6 개월의 저장 기간 동안 25℃에서 및 2 개월의 저장 기간 동안 40℃에서의 산화 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 총 산화에 대한 상대 면적 (%)의 RP-HPLC 데이터의 요약 (제형에 대한 측정이 음영 영역을 갖는 저장 조건에서 수행되지 않음)
파트 2의 결론
● 높은 농도 (≥ 100 mg/mL)의 CSL730의 안정한 액체 DP의 제형화가 실현 가능하다.
● 응집, 산성 종 형성, 단편화 및 산화에 대해 안정하다.
● 특히 높은 단백질 농도로 Fc 다량체 분자의 안정화에 기여하는 요인
● 보다 낮은 pH (5~5.8)
● 안정화제로서의 이당류/폴리올 및 보다 적은 양의 아미노산의 사용
● 단백질 안정성을 위한 최적의 몰비는 1:420의 단백질 대 수크로오스 비이다. 또한 보다 낮은 단백질 대 수크로오스 비로 안정성을 달성하였다. 제형 견고성은 상기 비율 이상으로 증가한다.
● 산화 방지제는 저장 동안 다른 첨가제로 인해 일어날 수 있는 황변 및/또는 부산화 반응을 방지하거나 특정 제조 조건 (예를 들어, 빛 노출, 분리기의 충전 기계의 멸균으로 인한 기화 과산화 수소 잔류물에 대한 노출) 또는 임상 투여 동안 비정상적인 취급 조건으로부터 보호하기 위해 필요할 수 있다.
● 보다 높은 PS80 수준은 저장 안정성을 위해 필요하지 않을 수 있지만, 제조 및 임상 취급/투여 동안 안정성을 보장하기 위해 필요할 수 있다.
파트 3. 120~160 mg/ml의 단백질 농도에서의 안정화제 스크리닝 연구
높은 단백질 농도에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)를 포함하는 액상 제형에 대한 20 mM 히스티딘, 0.02% w/v 폴리소르베이트 80 및 10 mM 메티오닌의 존재하에 안정화제 유형 (파트 2에 기반한 관심 대상 안정화제는 수크로오스, 트레할로오스 및 프롤린이었음)의 효과를 조사하기 위해, 부형제 스크리닝 연구에 대한 후속 연구를 수행하였다. 단백질 농도는 다양하였지만, 단백질 대 안정화제의 몰비를 약 1:420으로 고정하였다. 모든 제형의 pH를 5.25 ± 0.1로 고정하였다. 전반적으로, 120~160 mg/mL 범위의 단백질 농도를 갖는 CSL730 제형을 제조하고 단백질 안정성에 대해 조사하였다. 본 연구를 위해 제조된 제형은 표 20에 요약되어 있다.
[표 20]
보다 높은 단백질 농도로 후속 연구를 위해 제조된 제형의 요약
제형의 안정성을 분석하는데 사용되는 방법:
안정성 표시 방법을 사용하여 다음과 같은 다양한 시점에서 제형을 분석하였다: 산화를 위한 크기 배제 크로마토그래피 (SEC), 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX), 모세관 겔 전기 영동 (CGE) (캘리퍼) 및 역상 HPLC (RP-HPLC). 또한, 제형의 pH, 시각적 외관 (색상, 탁도 및 육안으로 보이는 입자의 경우) 및 육안으로 보이지 않는 입자 (subvisible particle: SVP)를 상이한 시점에서 모니터링하였다.
연구에 사용된 방법과 각 방법의 목적은 표 21에 요약되어 있다. 현재까지의 저장 조건 및 분석 시점은 표 22에 요약되어 있다.
[표 21]
제형의 안정성 연구에 사용되는 분석 방법 및 이의 목적
[표 22]
저장 조건 및 분석 시점의 요약
분석 방법을 상기 파트 1 및 파트 2에서 기재된 바와 같이 수행하였다.
실시예 1 - T0에서 및 시간 경과에 따른 시각적 외관
충전된 모든 바이알을 충전/마무리 후 2명의 검사자 (상기에서 기재된 바와 같은 Insp 1 및 Insp 2)와 각 시점 및 온도에서 시각적 외관 (100% 육안 검사)으로 검사하였다. 대부분의 경우에서 검사관 사이에 일반적인 정렬이 있었다.
모든 제형은 높은 단백질 농도로 인해 약간의 유백색을 띤 황갈색 (BY) 색상을 나타냈다. 0~1개의 육안으로 보이는 입자가 일부 제형 및 위약에서 무작위로 관찰되었다. 단백질에 대한 지식을 가지고 면밀히 조사한 결과, 육안으로 보이는 입자는 본질적으로 외인성인 것으로 나타났다 (아마도 충전/마무리 공정 동안에 도입되었을 것임). 높은 점도에도 불구하고, 제형 중 어느 것도 겔화되는 것으로 발견되지 않았다.
제형 1 내지 6 (표 20 참조)을 상이한 온도에서 최대 12개월 동안 육안으로 검사하였다. 모든 제형의 색상은 T0 (BY)부터 모든 저장 온도에서 변화되지 않은 상태로 유지되었다. 투명도는 변화되지 않은 상태로 유지되었다 (약간 유백색). 입자 수는 온도와 시간에 관계 없이 T0 (0~1)에서 변화되지 않은 상태로 유지되었다. 어떠한 제형도 임의의 온도에서 저장 기간 동안 겔화되지 않았다.
실시예 2 - T0에서 및 시간 경과에 따른 삼투질 농도, pH, 단백질 농도 및 폴리소르베이트 80 측정
모든 제형 1~6 (표 20 참조)에 대한 삼투질 농도, pH, 단백질 농도 및 폴리소르베이트 80 (PS80) 농도 측정을 초기 시점 (T0)에서 수행하였다. 그 결과는 표 23에 요약되어 있다.
표 23의 결과는 F1, F3 및 F5에 대한 단백질 농도가 120 ± 5 mg/mL 이내에 있으며 F2, F4 및 F6에 대한 단백질 농도가 160 ± 5 mg/mL 이내에 있었다는 것을 나타낸다. pH 측정은 측정 pH 값이 목표 pH 값과 비교하여 대부분의 제형에 대해 ± 0.1 pH 단위 이내에 있었다는 것을 나타냈다. pH의 약간 더 높은 편차가 F6에서 관찰되었다 (0.17 단위 이내). 120 mg/ml 제형에 대한 삼투질 농도는 일반적으로 382~414 mOsm/kg 이내인 반면, 160 mg/ml 제형에 대한 삼투질 농도는 일반적으로 더 높았다 (529~551 mOsm/kg). 모든 제형의 PS80 농도는 PS80 목표 농도의 최대 ± 0.003 % w/v 이내에 있었다.
최대 12 개월 동안 2~8, 25 및 35℃에서 제형 1 내지 6 (표 20 참조)의 pH 및 단백질 농도를 모니터링하였다. 실험 오차 이내에서, 결과는 측정된 시간 프레임 내의 모든 제형에 대해 모든 온도에서 pH의 최소 변화 (최대 ± 0.1 단위 이내)를 나타냈다. 또한, 실험 오차 이내에서, 결과는 시간에 따른 단백질 농도의 작은 변화를 나타냈다.
[표 23]
초기 시점 (T0)에서 모든 제형에 대해 측정된 단백질 농도, pH, 삼투질 농도 및 폴리소르베이트 80 (PS80) 농도
실시예 3 - T0에서 및 시간 경과에 따른 크기 배제 크로마토그래피에 의한 응집 거동 (고분자량 종)의 연구
모든 제형 1~6 (표 20 참조)을 상기에서 기재된 바와 같이 T0에서 고분자량 (가용성 응집체) 종의 정량화를 위해 크기 배제 크로마토그래피에 의해 분석하였다.
모든 제형에 대한 초기 (T0) HMW %는 표 24에 제시되어 있다. 앞서 기재된 바와 같은 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 응집 속도 상수를 2~8, 25 및 35℃에서 모든 제형에 대해 결정하였다. 그 결과는 또한 표 24에 요약되어 있다.
표 24에 나타낸 바와 같이, 초기 (T0) 가용성 응집체 수준 (HMW %)은 높은 단백질 농도에도 불구하고 비슷하고 낮았다 (0.8~1% HMW 이내).
모든 제형의 분석을 2~8℃, 25℃에서 최대 12 개월의 저장 및 35℃에서 최대 6 개월의 저장에서 수행하였다. 예상된 바와 같이, 표 24의 결과는 응집 속도가 저장 온도에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다. 안정성 연구의 온도 범위 내에서, 온도가 10℃ 증가할 때마다, 응집 속도는 최대 2배 증가하였다.
보다 높은 단백질 농도 (160 mg/ml)에서의 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 안정성은 보다 낮은 단백질 농도 (120 mg/ml)에서의 동일한 제형과 대조적으로 2~8℃, 25℃ 및 35℃에서 평균 1.3배 덜 안정하였다.
약 1:420의 고정된 몰비로 최대 3 개월 동안, 모든 안정화제는 연구된 모든 온도에서 Fc 다량체 분자 (CSL730)를 안정화하는 것과 관련하여 유사하게 작동하는 것으로 나타났다. 이는 또한 최대 12 개월까지 사실로 확인되었다.
[표 24a]
초기 (T0) HMW %, 및 3 개월 동안 2~8℃, 25℃ 및 35℃에서의 응집 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 응집 (HMW %)에 대한 SEC 데이터 요약
[표 24b]
초기 (T0) HMW %, 및 12 개월 동안 2~8℃ 및 25℃ 및 최대 6 개월 동안 35℃에서의 응집 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 응집 (HMW %)에 대한 SEC 데이터 요약
F1 내지 F6은 모두 적어도 12 개월 동안 우수한 안정성을 나타냈다. 4℃에서, 6개의 모든 제형은 12 개월 후 3.5% 미만의 HMW 종을 함유하였으며; 25℃에서, 6개의 모든 제형은 6.5% 미만의 HMW 종을 함유하였다.
실시예 4 - T0에서 및 시간 경과에 따른 비환원 모세관 겔 전기 영동 (NR-cGE)에 의한 단편화 거동 (저분자량 종)의 연구
모든 제형 (표 20 참조)을 상기에서 기재된 바와 같이 T0에서 저분자량 (LMW) 종 (즉, 단편화)의 정량화를 위해 캘리퍼 (NR 캘리퍼)를 사용하는 비환원성 cGE에 의해 분석하였다.
모든 제형에 대한 초기 (T0) LMW 종 %는 표 25에 제시되어 있다. 표 25에 나타낸 바와 같이, 모든 제형에 대한 T0에서의 LMW %는 비슷하였다. T0에서 SEC 방법에 의해 측정된 것과 동일한 결과가 LMW에서 관찰되었다 (모든 제형에서 측정된 LMW %는 2.6~2.7% 범위에 있었음).
초기에는 3 개월 동안 상이한 온도에서 시간 경과에 따라 NR-cGE "캘리퍼" 방법을 사용하여 모든 제형에 대한 LMW 종 %를 모니터링하였지만, 이제는 12 개월 동안 계속하였다. 앞서 기재된 바와 같은 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 단편화 속도 상수를 상이한 저장 온도에서 결정하였다. 그 결과는 표 25에 요약되어 있다.
예상된 바와 같이, 표 25의 결과는 단편화 속도가 저장 온도에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다. 최대 12 개월 동안 LMW %의 작은 변화에 의해 입증된 바와 같이, 단편화의 작은 변동 (검정 오차 이내)이 시간에 따라 2~8℃에서 연구된 모든 제형에서 일어났다. 그러나, 저장 온도의 10℃ 증가 (25℃에서 35℃로) 동안, 단편화 속도는 단백질 농도에 관계 없이 평균 3.6 내지 4배 증가하였다. 유사한 결과가 SEC 방법에 의해 측정된 단편화 속도에서 관찰되었다 (결과는 도시되지 않음). SEC 방법의 경우, 단편화 속도는 저장 온도의 10℃ (25℃에서 35℃로) 증가 동안 평균 3.5배 증가하였다.
동일한 저장 온도에서, 보다 높은 단백질 농도 (160 mg/ml)의 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 안정성 사이에는 보다 낮은 단백질 농도 (120 mg/ml)의 동일한 제형과 대조적으로 어떠한 차이도 관찰되지 않았다. 즉, 단백질 농도의 함수로서의 25℃와 35℃ 모두에서 제형의 안정성 사이에는 어떠한 유의한 차이도 없었다. 동일한 결과가 SEC 방법에 의해 측정된 LMW에서 관찰되었다 (결과는 도시되지 않음).
약 1:420의 고정된 몰비로 최대 12 개월 동안, 모든 안정화제는 2~8℃, 25℃ 및 35℃에서 단편화에 대한 Fc 다량체 분자 (CSL730)를 안정화하는 것과 관련하여 유사하게 작동하는 것으로 나타났다.
[표 25a]
초기 (T0) LMW %, 3 개월 후 2~8℃에서의 단편화 변화, 및 3 개월의 저장 기간 동안 25℃ 및 35℃에서의 단편화 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 단편화 (LMW %)에 대한 "캘리퍼" 방법의 NR-cGE 데이터의 요약
[표 25b]
초기 (T0) LMW %, 및 12 개월 동안 2~8℃ 및 25℃ 및 최대 6 개월 동안 35℃에서의 단편화 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 단편화 (LMW %)에 대한 "캘리퍼" 방법의 NR-cGE 데이터의 요약
실시예 5 - T0에서 및 시간 경과에 따른 양이온 교환 크로마토그래피 (CEX)에 의한 산성 및 염기성 종의 연구
모든 제형 (표 20 참조)을 상기에서 기재된 바와 같이 T0에서 산성 종 및 염기성 종 %의 정량화를 위해 CEX에 의해 분석하였다.
모든 제형에 대한 초기 (T0) 산성 종 %는 표 26에 제시되어 있다. 표 26에 나타낸 바와 같이, 모든 제형에 대한 T0에서의 산성 종 %는 비슷하였다. 유사하게, 모든 제형에 대한 T0에서의 염기성 종 %도 또한 비슷하였다 (3.5~3.7%).
상이한 온도 (최대 12 개월)에서 시간 경과에 따른 CEX 방법을 사용하여 모든 제형에 대한 산성 종 %를 모니터링하였다. 앞서 기재된 바와 같은 다중 선형 회귀에 의해, 상응하는 표준 오차 (SE)와 함께 산성 종 형성 속도 상수를 상이한 저장 온도에서 결정하였다. 그 결과는 표 26에 요약되어 있다.
예상된 바와 같이, 표 26의 결과는 산성 및 염기성 종 형성 속도가 저장 온도에 따라 증가하였다는 것을 나타낸다. 2~8℃에서 최대 12 개월 동안, 연구된 모든 제형 중 임의의 제형에 대해 산성 종 형성에서 어떠한 변화도 관찰되지 않았다. 그러나, 저장 온도의 10℃ 증가 (25℃에서 35℃로) 동안, 산성 종 형성 속도는 평균 3.1~3.4배 증가하였다.
표 26의 결과는 보다 낮은 단백질 농도 (120 mg/ml)의 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 안정성이 보다 높은 단백질 농도 (160 mg/ml)의 동일한 제형 보다 25℃의 저장 온도에서 약간 더 우수하였다는 것을 나타낸다.
표 26의 결과는 또한 약 1:420의 고정된 몰비에서, 25℃에서 수크로오스, 트레할로오스 또는 프롤린의 존재하에 산성 종 형성과 관련하여 Fc 다량체 분자 (CSL730)의 안정성이 유사하였다는 것을 나타낸다. 35℃에서의 결과는 해당 온도에서 분석을 위한 보다 적은 샘플로 인해 덜 결정적이다.
[표 26]
초기 (T0), 3 개월 후 2~8℃에서 산성 종 %의 변화, 3 개월의 저장 시간 동안 25℃ 및 40℃에서 산성 종 형성 속도 상수 k (± SE)를 비교하는 산성 종 %에 대한 CEX 데이터의 요약
어떠한 유의한 차이도 상이한 시점 및 온도에 대해 염기성 종 %에 대한 6개의 제형 중에서 관찰되지 않았다.
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<210> 1
<211> 473
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr
65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Tyr Thr Leu Pro Pro Cys Arg Asp Lys Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Trp Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
245 250 255
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
260 265 270
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
275 280 285
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
290 295 300
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
305 310 315 320
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
325 330 335
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
340 345 350
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
355 360 365
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu
370 375 380
Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
385 390 395 400
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
405 410 415
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Lys Ser Asp Gly Ser Phe Phe
420 425 430
Leu Tyr Ser Asp Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
435 440 445
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
450 455 460
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly
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<210> 2
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<400> 2
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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
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Leu Ser Cys Ala Val Asp Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
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Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
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210 215 220
Pro Gly
225
<210> 17
<211> 474
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 17
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly Lys Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
225 230 235 240
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<400> 26
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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Asp Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Val Ser Lys Leu Thr Val
180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 27
<211> 226
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
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35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
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130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Asp Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
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165 170 175
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180 185 190
Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser
210 215 220
Pro Gly
225
<210> 28
<211> 226
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 28
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
35 40 45
Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val
50 55 60
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65 70 75 80
Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly
85 90 95
Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile
100 105 110
Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val
115 120 125
Cys Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser
130 135 140
Leu Ser Cys Ala Val Asp Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu
145 150 155 160
Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro
165 170 175
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
195 200 205
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210 215 220
Pro Gly
225
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<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly
1 5 10 15
Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met
20 25 30
Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His
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50 55 60
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65 70 75 80
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115 120 125
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130 135 140
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
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Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
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<210> 32
<211> 250
<212> PRT
<213> Homo sapiens
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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala
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<213> Homo sapiens
<400> 33
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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro
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Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val
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Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr
130 135 140
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Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr
165 170 175
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180 185 190
Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe
195 200 205
Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys
210 215 220
Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu
225 230 235 240
Val Met Ser Asp Thr Ala Gly Thr Cys Tyr
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<211> 4
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10
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<211> 12
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Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
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<211> 15
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<213> Artificial Sequence
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
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Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
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<213> Artificial Sequence
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Ser
<210> 59
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<212> PRT
<213> Artificial Sequence
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly
1 5 10 15
Gly Gly Ser Gly
20
<210> 60
<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 60
Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
1 5 10 15
Ser Gly Gly Gly
20
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<211> 20
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Linker
<400> 61
Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly Gly
1 5 10 15
Gly Gly Gly Gly
20
Claims (16)
- 하기를 포함하는 Fc 다량체 조성물:
a) 60 mg/ml 내지 180 mg/ml 농도의 Fc 다량체,
b) 4.8 내지 6.0의 pH 값, 및
c) 200 mM 내지 450 mM 농도의 안정화제. - 제1항에 있어서, Fc 다량체를 70 mg/ml 내지 110 mg/ml 농도로 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제1항에 있어서, Fc 다량체를 110 mg/ml 내지 180 mg/ml, 특히, 120 mg/ml 또는 160 mg/ml 농도로 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 완충제를 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제4항에 있어서, 상기 pH 값이 5.0 내지 5.5인, Fc 다량체 조성물.
- 제4항 또는 제5항에 있어서, 상기 완충제가 아세테이트 완충제, 히스티딘 완충제 또는 시트레이트 완충제인, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 안정화제가 폴리올, 특히, 이당류, 바람직하게는 수크로오스 또는 트레할로오스, 또는 소르비톨인, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Fc 다량체 대 안정화제의 몰 비가 1:300 내지 1:650, 특히, 1:400 내지 1:425인, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 항산화제, 특히, 메티오닌을 추가로 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 계면 활성제, 특히, 폴리소르베이트 80을 추가로 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항의 Fc 다량체 조성물을 동결 건조된 형태로 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 3 내지 10개의 Fc 부분으로 구성되는, Fc 다량체 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 3개의 Fc 부분으로 구성되는, Fc 다량체 조성물.
- 제13항에 있어서, 각 Fc 부분이 힌지 영역, CH2 불변 도메인 및 CH3 불변 도메인을 각각 포함하는 2개의 Fc 폴리펩타이드를 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제14항에 있어서, 상기 Fc 다량체가 서열 번호 23의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드 및 서열 번호 24의 아미노산 서열을 갖는 2개의 폴리펩타이드를 포함하는, Fc 다량체 조성물.
- 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서, 자가 면역 질환 또는 염증성 질환의 치료에 사용하기 위한, Fc 다량체 조성물.
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