ES2562912T3 - Procedimiento de estabilización de un anticuerpo, y preparación de anticuerpo de tipo disolución estabilizada - Google Patents

Procedimiento de estabilización de un anticuerpo, y preparación de anticuerpo de tipo disolución estabilizada Download PDF

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Abstract

Procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolución, que comprende añadir 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de ácido cítrico a la disolución de anticuerpo, en el que la concentración del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.

Description

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DESCRIPCION
Procedimiento de estabilizacion de un anticuerpo, y preparacion de anticuerpo de tipo disolucion estabilizada.
Campo tecnico
La presente invencion se refiere a un procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion, y a una preparacion de anticuerpo de tipo disolucion estabilizada segun se reivindica.
Tecnica anterior
En anos recientes, el tratamiento de una enfermedad usando un anticuerpo se ha adoptado rapidamente a traves del avance de la biotecnologfa. Tambien en Japon, en el campo medico se proporcionan diversas preparaciones de anticuerpo tales como Synagis, Remicade, Rituxan y Herceptin.
Cuando un anticuerpo se almacena en una disolucion durante un tiempo prolongado, se produce la formacion de un producto qufmicamente degradado, la formacion de un agregado insoluble, la formacion de una asociacion soluble, o similar. Por lo tanto, a fin de proporcionar un farmaco de anticuerpo estable y seguro, ha habido una demanda de un procedimiento para suprimir la formacion de tales sustancias.
Cuando un anticuerpo se almacena en un estado de una disolucion durante un tiempo prolongado, se produce una reaccion de degradacion qufmica tal como la escision de un enlace de disulfuro o un enlace peptfdico de un anticuerpo. Como resultado, existe preocupacion por la disminucion en su actividad, un efecto secundario inesperado o similar debido al deterioro en la calidad del mismo.
La protefna se insolubiliza mediante la agregacion de moleculas cuya estructura de orden superior se destruye, con estructura de orden superior destruida debido a la agitacion, esfuerzo termico, o similar. Cuando tal agregado insoluble se administra intravenosamente, es factible que ocurra un efecto secundario grave tal como el choque anafilactico (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n° 502938/98).
Como procedimiento para suprimir la formacion de un agregado insoluble, se conoce un procedimiento de anadir acido cftrico a 100 mmoles/l o mas o heparina a 0,5% a una disolucion de anticuerpo a fin de suprimir la formacion de un agregado insoluble causado por esfuerzo termico en una disolucion acuosa de un factor de crecimiento de queratinocitos humano recombinante (Journal of Pharmaceutical Science, Vol. 83, n° 12, 1657-1661 (1994)). Ademas, el documento EP1254666 describe una preparacion farmaceutica estabilizada de un anticuerpo contra un peptido relacionado con la hormona paratiroidea, en la que el anticuerpo se disuelve en una disolucion tampon que contiene al menos un tampon seleccionado del grupo que consiste en acido acetico, acido cftrico, acido fosforico, y sus sales, y esta en forma de una disolucion de pH 5 a 8. Ademas, como procedimiento para suprimir la formacion de un agregado insoluble causado por esfuerzo termico en una disolucion acuosa de un anticuerpo, se conoce un procedimiento que usa un tampon de glicina o un tampon de histidina (documento WO 02/13860), un procedimiento de adicion de polivinilpirrolidona a 2% o mas (Pharmaceutical Research Vol. 11, n° 5, 624-632, 1994), un procedimiento de anadir un tampon de fosfato, cloruro de sodio y maltosa (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n° 504499/91), y similar.
Aunque algunas protefnas pueden no conducir a la insolubilizacion, se sabe que forman una asociacion soluble que comprende un numero pequeno de moleculas proteicas tal como un dfmero o un trfmero. Por ejemplo, cuando la protefna es un anticuerpo, se considera que se forma facilmente un dfmero soluble (Biochemistry, Vol. 38, 1396013967 (1999)). Ademas, cuando se administra un dfmero de un anticuerpo al cuerpo humano, existe el riesgo de provocar un efecto secundario tal como fiebre, nausea o hipotension (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n° 502938/98).
Como procedimiento para suprimir la formacion de una asociacion soluble, se conoce un procedimiento de anadir un derivado de acido nicotfnico o un a-aminoacido que tiene una cadena lateral lipofila como agente estabilizante a una preparacion lfquida de inmunoglobulina (solicitud de patente japonesa publicada sin examinar n° 502938/98).
Como se describe anteriormente, ha habido una demanda de un procedimiento para proporcionar una preparacion de anticuerpo estable que logre la estabilizacion del anticuerpo en una disolucion al superar factores plurales de inestabilidad tales como la formacion de un producto qufmicamente degradado, la formacion de un agregado insoluble y la formacion de una asociacion soluble. Sin embargo, hasta ahora no se ha conocido tal procedimiento.
Descripcion
Un objetivo de la presente descripcion es proporcionar un procedimiento para suprimir la formacion de una asociacion soluble de un anticuerpo en disolucion; un procedimiento para suprimir la formacion de un producto qufmicamente degradado de un anticuerpo en una disolucion; y un procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion. Ademas, otro objetivo de la presente descripcion es proporcionar una preparacion de anticuerpo de
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tipo disolucion en la que se suprima la formacion de una asociacion soluble; una preparacion de anticuerpo de tipo disolucion en la que se suprima la formacion de un producto qmmicamente degradado; una preparacion de anticuerpo de tipo disolucion en la que se supriman la formacion de una asociacion soluble, la formacion de un producto qmmicamente degradado y la formacion de un agregado insoluble; un agente para suprimir la formacion de una asociacion soluble de un anticuerpo; un agente para suprimir la formacion de un producto qmmicamente degradado de un anticuerpo; y un agente estabilizante para un anticuerpo.
La presente invencion se refiere a los siguientes [1] a [16].
[1] Un procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion, que comprende anadir 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido dtrico a la disolucion de anticuerpo, en el que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
[2] El procedimiento segun [1], en el que el procedimiento para estabilizar un anticuerpo es la supresion de la formacion de un dfmero y un producto qmmicamente degradado del anticuerpo en una disolucion.
[3] Un procedimiento para suprimir la formacion de un dfmero de un anticuerpo en una disolucion, que
comprende anadir 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico a la disolucion de
anticuerpo, en el que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
[4] Un procedimiento para suprimir la formacion de un producto qmmicamente degradado de un anticuerpo en una disolucion, que comprende anadir 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico a la disolucion de anticuerpo, en el que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
[5] El procedimiento segun uno cualquiera de [1] a [4], que comprende ademas un tensioactivo no ionico.
[6] El procedimiento segun uno cualquiera de [1] a [5], en el que el pH de la disolucion esta en el intervalo de 4
a 7.
[7] El procedimiento segun uno cualquiera de [1] a [6], en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
[8] El procedimiento segun uno cualquiera de [1] a [7], en el que el anticuerpo es uno cualquiera de los anticuerpos contra gangliosido GD3 y anticuerpos contra el receptor 4 de quimiocina CC (en lo sucesivo denominado como CCR4).
[9] Una preparacion de anticuerpo en la que se suprime la formacion de un dfmero, de un producto qmmicamente degradado y de un agregado insoluble del anticuerpo, que comprende 10 a 30 mg/ml de glicina, 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico y 0,01 a 150 mg/ml de anticuerpo.
[10] La preparacion segun [9], que comprende ademas un tensioactivo no ionico.
[11] La preparacion segun uno cualquiera de [9] a [10], en la que el pH de la disolucion esta en el intervalo de 4 a 7.
[12] La preparacion segun uno cualquiera de [9] a [11], en la que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
[13] La preparacion segun uno cualquiera de [9] a [12], en la que el anticuerpo es uno cualquiera de anticuerpos contra gangliosido GD3 y anticuerpos contra CCR4.
[14] Una disolucion de anticuerpo, que comprende 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico, y 0,01 a 150 mg/ml de anticuerpo como principio activo.
[15] Utilizacion de una disolucion de anticuerpo en un procedimiento para estabilizar el anticuerpo, comprendiendo la disolucion 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico, y 0,01 a 150 mg/ml de anticuerpo como principio activo.
[16] Utilizacion segun [15], en la que la estabilizacion del anticuerpo es la supresion de la formacion de un dfmero, de un producto qmmicamente degradado y de un agregado insoluble del anticuerpo en una disolucion.
Tambien se describen en la presente memoria:
(1) Un procedimiento para estabilizar un anticuerpo en disolucion, que comprende anadir glicina y acido cftrico al anticuerpo en una disolucion.
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(2) El procedimiento segun el (1) anterior, en el que el procedimiento para estabilizar un anticuerpo es la supresion de la formacion de una asociacion insoluble y de un producto qufmicamente degradado del anticuerpo en una disolucion.
(3) Un procedimiento para suprimir la formacion de una asociacion soluble de un anticuerpo en una disolucion, que comprende anadir glicina al anticuerpo en una disolucion.
(4) Un procedimiento para suprimir la formacion de un producto qufmicamente degradado de un anticuerpo en una disolucion, que comprende anadir acido cftrico al anticuerpo en una disolucion.
(5) El procedimiento segun uno cualquiera de los (1) a (4) anteriores, en el que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
(6) El procedimiento segun uno cualquiera de los (1) a (3) anteriores, en el que la concentracion de la glicina es 10 a 30 mg/ml.
(7) El procedimiento segun uno cualquiera de los (1), (2) y (4) anteriores, en el que la concentracion del acido cftrico es 0,1 a 50 mmoles/l.
(8) El procedimiento segun uno cualquiera de los (1) a (7) anteriores, que comprende ademas un tensioactivo no ionico.
(9) El procedimiento segun uno cualquiera de los (1) a (8) anteriores, en el que el pH de la disolucion esta en el intervalo de 4 a 7.
(10) El procedimiento segun uno cualquiera de los (1) a (9) anteriores, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
(11) El procedimiento segun uno cualquiera de los (1) a (10) anteriores, en el que el anticuerpo es uno cualquiera de anticuerpos contra gangliosido GD3 y anticuerpos contra el receptor 4 de quimiocina CC (denominado en lo sucesivo como CCR4).
(12) Una preparacion de anticuerpo de tipo disolucion en la que se suprime la formacion de una asociacion soluble del anticuerpo, que comprende glicina y el anticuerpo.
(13) Una preparacion de anticuerpo de tipo disolucion en la que se suprime la formacion de un producto qufmicamente degradado del anticuerpo, que comprende acido cftrico y el anticuerpo.
(14) Una preparacion de anticuerpo de tipo disolucion en la que se suprime la formacion de una asociacion soluble, de un producto qufmicamente degradado y de un agregado insoluble del anticuerpo, que comprende glicina, acido cftrico y el anticuerpo.
(15) La preparacion segun uno cualquiera de los (12) a (14) anteriores, en la que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
(16) La preparacion segun uno cualquiera de los (12), (14) y (15) anteriores, en la que la concentracion de la glicina es 10 a 30 mg/ml.
(17) La preparacion segun uno cualquiera de los (13) a (15) anteriores, en la que la concentracion del acido cftrico es 0,1 a 50 mmoles/l.
(18) La preparacion segun uno cualquiera de los (12) a (17) anteriores, que comprende ademas un tensioactivo no ionico.
(19) La preparacion segun uno cualquiera de los (12) a (18) anteriores, en la que el pH de la disolucion esta en el intervalo de 4 a 7.
(20) La preparacion segun uno cualquiera de los (12) a (19) anteriores, en la que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
(21) La preparacion segun uno cualquiera de los (12) a (20) anteriores, en la que el anticuerpo es uno cualquiera de los anticuerpos contra gangliosido GD3 y anticuerpos contra CCR4.
(22) Un agente para suprimir la formacion de una asociacion soluble de un anticuerpo en una disolucion, que comprende glicina como principio activo.
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(23) Un agente para suprimir la formacion de un producto qufmicamente degradado de un anticuerpo en una disolucion, que comprende acido cftrico como componente eficaz.
(24) Un agente estabilizante para un anticuerpo, que comprende glicina y acido cftrico como principio activo.
(25) El agente estabilizante para un anticuerpo segun el (24) anterior, en el que la estabilizacion del anticuerpo es la supresion de la formacion de una asociacion soluble, de un producto qufmicamente degradado y de un agregado insoluble del anticuerpo en una disolucion.
El anticuerpo a usar en la presente invencion tambien incluye un fragmento de anticuerpo. Tal anticuerpo y fragmento de anticuerpo incluyen un anticuerpo policlonal y un anticuerpo monoclonal; sin embargo, se prefiere un anticuerpo monoclonal.
Ademas, el anticuerpo o fragmento de anticuerpo mencionado anteriormente incluye un anticuerpo de animal no humano, un anticuerpo recombinante, un fragmento de anticuerpo del mismo, y similar.
Los ejemplos del anticuerpo recombinante incluyen un anticuerpo humanizado, un anticuerpo humano, y similar, y los ejemplos del anticuerpo humanizado incluyen un anticuerpo quimerico humano, un anticuerpo con CDR injertadas humano, y similares.
El anticuerpo quimerico humano se refiere a un anticuerpo que comprende VH y VL de un anticuerpo de animal no humano, y CH y CL de un anticuerpo humano. Como la CH de un anticuerpo quimerico humano, se puede usar cualquier CH en tanto que pertenezca a inmunoglobulina humana (en lo sucesivo denominada hIg); sin embargo, se prefieren aquellas que pertenecen a la clase de hIgG, y se puede usar una cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase hIgG, tal como hIgGI, hIgG2, hIgG3 y hIgG4. Ademas, como la CL de un anticuerpo quimerico humano, se puede usar cualquier CL en tanto que pertenezca a la hIg, y se pueden usar aquellas que pertenezcan a una clase k o a una clase l.
Ademas, los ejemplos del animal no humano incluyen un raton, una rata, un hamster, un conejo, y similar.
El anticuerpo con CDR injertadas humano se refiere a un anticuerpo en el que las CDRs de VH y VL de un anticuerpo de animal no humano se injertan en una posicion apropiada en VH y VL de un anticuerpo humano.
El anticuerpo con CDR injertadas humano de la presente invencion se puede producir disenando y construyendo los ADNc que codifican regiones V en las que las CDRs de VH y VL de un anticuerpo de animal no humano se ligan a los armazones estructurales (en lo sucesivo denominados FR(s)) de VH y VL de un anticuerpo humano opcional, insertandolos en un vector de expresion para una celula de animal que tiene los ADNc que codifican CH y CL de un anticuerpo humano, respectivamente, para construir de ese modo un vector de expresion de anticuerpo con CDR injertadas humano, e introduciendo entonces el vector de expresion en una celula de animal para expresar el anticuerpo con CDR injertadas humano.
Como la CH de un anticuerpo con CDR injertadas humano, se puede usar cualquier CH en tanto que pertenezca a la hIg; sin embargo, se prefieren aquellas que pertenecen a la clase hIgG, y se puede usar una cualquiera de las subclases que pertenecen a la clase hIgG, tal como hIgGI, hIgG2, hIgG3 y hIgG4. Ademas, como la CL de un anticuerpo con CDR injertadas humano, se puede usar cualquier CL en tanto que pertenezca a la hIg, y se pueden usar aquellas que pertenezcan a una clase k o a una clase l.
El anticuerpo humano es originalmente un anticuerpo que existe de forma natural en el cuerpo humano; sin embargo, tambien incluye anticuerpos obtenidos de una biblioteca de fagos de anticuerpos humanos y de un animal transgenico productor de anticuerpos humanos, que se preparan en base al progreso reciente en tecnicas de ingenierfa genetica, de ingenierfa celular y de ingenierfa del desarrollo. El anticuerpo que existe en el cuerpo humano se puede obtener, por ejemplo, aislando linfocito de sangre periferica humana, inmortalizandolo infectandolo con el virus de EB o similar, seguido de la clonacion, obteniendo de ese modo un linfocito productor del anticuerpo, y cultivando entonces el linfocito y purificando el anticuerpo a partir del sobrenadante del cultivo. La biblioteca de fagos de anticuerpos humanos es una biblioteca en la que un fragmento de anticuerpo tal como Fab o scFv se expresa sobre la superficie de un fago insertando en el gen del fago un gen del anticuerpo preparado a partir de una celula B humana. Un fago que expresa un fragmento de anticuerpo que tiene una actividad de union a antfgeno deseada sobre su superficie se puede recuperar de la biblioteca usando como fndice la actividad de union a un sustrato que tiene sobre el un antfgeno inmovilizado. El fragmento de anticuerpo se puede convertir posteriormente en una molecula de anticuerpo humano que comprende dos cadenas H de longitud completa y dos cadenas L de longitud completa mediante tecnicas de ingenierfa genetica. El animal transgenico productor del anticuerpo humano es un animal no humano en el que se ha introducido en su celula un gen del anticuerpo humano. Especfficamente, un raton transgenico productor de anticuerpo humano se puede producir, por ejemplo, introduciendo un gen del anticuerpo humano en una celula ES de raton, transplantando la celula ES en un embrion de etapa temprana de un raton, y desarrollandolo entonces. Como procedimiento para preparar un anticuerpo humano a partir de tal animal
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transgenico productor del anticuerpo humano, el anticuerpo humano se puede producir y acumular en un sobrenadante de cultivo cultivando un hibridoma productor de anticuerpo humano obtenido mediante un procedimiento para preparar hibridoma, generalmente llevado a cabo en un animal no humano.
Los ejemplos del fragmento de anticuerpo que se deben utilizar en la presente invencion incluyen Fab, Fab', F(ab')2, scFv, diacuerpo, dsFv, un peptido que contiene CDR, y similar.
El Fab es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de alrededor de 50.000 y que tiene actividad de union a antfgeno, en el que aproximadamente una mitad del lado N-terminal de la cadena H y la cadena L de longitud completa, entre los fragmentos obtenidos tratando una molecula de anticuerpo de tipo IgG con una proteasa, papafna (que escinde en el resto de aminoacido en la posicion 224 de la cadena H), estan unidos juntos a traves de un enlace de disulfuro.
El Fab que se debe utilizar en la presente invencion se puede obtener tratando un anticuerpo con una proteasa, papafna. Como alternativa, el Fab se puede producir insertando ADN que codifica Fab del anticuerpo en un vector de expresion para procariota o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o en un eucariota para expresar el Fab.
El F(ab')2 es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de alrededor de 100.000 y que tiene actividad de union a antfgeno, que es significativamente mas grande que el Fab unido via un enlace de disulfuro de la region bisagra, entre fragmentos obtenidos tratando una molecula de anticuerpo de tipo IgG con una proteasa, pepsina (que escinde en el resto de aminoacido en la posicion 234 de la cadena H).
El F(ab')2 que se debe utilizar en la presente invencion se puede obtener tratando un anticuerpo con una proteasa, pepsina. Como alternativa, el F(ab')2 se puede preparar uniendo Fab' descrito mas abajo via un enlace de tioeter o un enlace de disulfuro.
El Fab' es un fragmento de anticuerpo que tiene un peso molecular de alrededor de 50.000 y que tiene actividad de union a antfgeno, en el que se escinde el enlace de disulfuro de la region bisagra del F(ab')2 anterior.
El Fab' que se debe utilizar en la presente invencion se puede obtener tratando F(ab')2 con un agente reductor, ditiotreitol. Como alternativa, el Fab' se puede producir insertando ADN que codifica un fragmento Fab' del anticuerpo en un vector de expresion para procariota o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo el vector en un procariota o un eucariota para expresar el Fab'.
El scFv es un polipeptido VH-P-VL o VL-P-VH en el que una cadena VH y una cadena VL estan enlazadas usando un enlazador peptfdico apropiado (en lo sucesivo denominado como P) y un fragmento de antfgeno que tiene una actividad de union a antfgeno.
El scFv que se debe utilizar en la presente invencion se puede producir obteniendo los ADNc que codifican VH y VL del anticuerpo, construyendo ADN que codifica el scFv, insertando el ADN en un vector de expresion para procariota o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresion en un procariota o en un eucariota para expresar el scFv.
El diacuerpo es un fragmento de anticuerpo en el que scFv esta dimerizado, y tiene una actividad de union a antfgeno divalente. El diacuerpo puede tener una actividad de union a antfgeno divalente al mismo antfgeno o a antfgenos diferentes. El diacuerpo a usar en la presente invencion se puede producir obteniendo los ADNc que codifican VH y VL del anticuerpo, construyendo aDn que codifica scFv de manera que la longitud de la secuencia de aminoacidos de un enlazador no tenga mas de 8 restos, insertando el ADN en un vector de expresion para procariota o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresion en un procariota o un eucariota para expresar el diacuerpo.
El dsFv es un fragmento de anticuerpo en el que polipeptidos preparados sustituyendo un resto de aminoacido en cada una de VH y VL por un resto de cistefna estan enlazados via un enlace de disulfuro entre los restos de cistefna. El resto de aminoacido a sustituir por un resto de cistefna se puede seleccionar en base a una estimacion de la estructura tridimensional del anticuerpo segun el procedimiento mostrado por Reiter et al. (Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). El dsFv a usar en la presente invencion se puede producir obteniendo los ADNc que codifican VH y VL del anticuerpo, construyendo ADN que codifica dsFv, insertando el ADN en un vector de expresion para procariota o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresion en un procariota o un eucariota para expresar el dsFv.
El peptido que contiene CDR comprende al menos una region de CDR de VH o VL. Un peptido que contiene CDRs plurales se puede enlazar directamente o via un enlazador peptfdico apropiado. El peptido que contiene CDR a usar en la presente invencion se puede producir construyendo los ADN que codifican los CDRs de VH y VL del anticuerpo, insertando los ADN en un vector de expresion para procariota o un vector de expresion para eucariota, e introduciendo entonces el vector de expresion en un procariota o un eucariota para expresar el peptido. Ademas, el
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peptido que contiene CDR tambien se puede producir mediante un procedimiento sintetico qufmico tal como un procedimiento de Fmoc (metodo de fluorenilmetoxicarbonilo) o un procedimiento de tBoc (metodo de t- butiloxicarbonilo).
El anticuerpo al que se puede aplicar la presente invencion puede ser cualquier anticuerpo; sin embargo, los ejemplos especfficos incluyen un anticuerpo monoclonal contra gangliosido GD3, un anticuerpo monoclonal contra CCR4, y similar. Los ejemplos del anticuerpo monoclonal contra gangliosido GD3 incluyen un anticuerpo monoclonal de raton KM-641 (patente japonesa n° 3006943), un anticuerpo quimerico humano KM-871 (Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar n° 304989/93), un anticuerpo con CDR injertadas humano KM-8871 (documento WO 01/23432), y similar. Los ejemplos del anticuerpo monoclonal contra CCR4 incluyen un anticuerpo quimerico humano KM2760 (documento WO 01/64754), un anticuerpo con CDR injertadas humano anti-CCR4 KM8760 (documento WO 03/18635), y similar.
En la presente invencion, el producto qufmicamente degradado se refiere a una sustancia que resulta de la escision de un enlace de disulfuro o de un enlace peptfdico de un anticuerpo. Los ejemplos especfficos incluyen aquellos en los que una parte o toda la cadena H o la cadena L del anticuerpo se ha perdido. Ademas, tambien se incluyen el fragmento Fab descrito anteriormente, aquellos en los que la cadena H y la cadena L del fragmento Fab se han escindido adicionalmente, y similares.
En la presente invencion, el agregado insoluble se refiere a una sustancia insolubilizada que resulta de la agregacion de moleculas cuya solubilidad en agua se ha reducido significativamente debido a que la hidrofobia de la superficie de las moleculas ha aumentado debido al cambio de la estructura de orden superior de las moleculas, o similar. En consecuencia, por la formacion del agregado insoluble, se incrementa la turbidez de la preparacion de anticuerpo de tipo disolucion.
En la presente invencion, la asociacion soluble se refiere a una sustancia en la que moleculas de anticuerpo estan asociadas entre si, pero la estructura de orden superior de las moleculas de anticuerpo no ha cambiado o el cambio de la estructura de orden superior es relativamente menor, por lo que la solubilidad en agua del agregado se mantiene hasta un grado que no se deposita en una disolucion acuosa. En consecuencia, el incremento en la turbidez de una preparacion no aumenta por la formacion de tal asociacion soluble. En general, el numero de moleculas de anticuerpo a asociar entre si es relativamente pequeno, y habitualmente es un dfmero, un trfmero o un tetramero.
Un procedimiento para producir la preparacion de anticuerpo de tipo disolucion de la presente invencion no esta particularmente limitado en tanto que sea un procedimiento que se lleva a cabo en la produccion de una preparacion general de anticuerpo de tipo disolucion. Especfficamente, se puede producir preparando previamente una disolucion que contiene un anticuerpo y una disolucion que contiene un aditivo, y mezclando las disoluciones. Tambien se puede producir anadiendo directamente un anticuerpo o un material aditivo a un disolvente y disolviendolo en el.
En el procedimiento de estabilizacion de un anticuerpo en una disolucion, el procedimiento de la supresion de la formacion de una asociacion soluble en una disolucion, y el procedimiento de la supresion de la formacion de un producto qufmicamente degradado en una disolucion de la presente invencion, la concentracion de anticuerpo puede ser cualquier valor en tanto que este en el intervalo de 0,01 a 150 mg/ml; sin embargo, preferiblemente es 0,1 a 50 mg/ml, mas preferiblemente 1 a 20 mg/ml.
En el procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion y el procedimiento para suprimir la formacion de una asociacion soluble en una disolucion de la presente invencion, la cantidad de glicina a anadir puede ser cualquier concentracion en tanto que la concentracion de glicina este en el intervalo de 10 a 30 mg/ml, preferiblemente es 20 a 25 mg/ml, mas preferiblemente 22 a 23 mg/ml. Los ejemplos de la forma de glicina a anadir incluyen glicina, sales farmaceuticamente aceptables de glicina, tales como hidrocloruro de glicina, y similares.
En el procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion, y el procedimiento para suprimir la formacion de un producto qufmicamente degradado en una disolucion de la presente invencion, la cantidad de acido cftrico a anadir puede ser cualquier concentracion en tanto que la concentracion de acido cftrico este en el intervalo de 0,1 a 50 mmoles/l, pero es preferiblemente 0,5 a 20 mmoles/l, mas preferiblemente 1 a 10 mmoles/l. Los ejemplos de la forma de acido cftrico a anadir incluyen acido cftrico, sales farmaceuticamente aceptables de acido cftrico tales como citrato de sodio, y similares.
El procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion de anticuerpo de la presente invencion tiene un efecto sobre la supresion de la formacion de un dfmero, de un producto qufmicamente degradado y de un agregado insoluble del anticuerpo en una disolucion.
La concentracion de anticuerpo en la preparacion de la presente invencion puede ser cualquier concentracion en tanto que este en el intervalo de 0,01 a 150 mg/ml, pero es preferiblemente 0,1 a 50 mg/ml, mas preferiblemente 1 a 20 mg/ml.
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El contenido de glicina en la presente invencion puede ser cualquier contenido en tanto que la concentracion de glicina este en el intervalo de 10 a 30 mg/ml, pero preferiblemente esta en el intervalo de 20 a 25 mg/ml, mas preferiblemente 22 a 23 mg/ml. Los ejemplos de la forma de glicina a anadir incluyen glicina, sales farmaceuticamente aceptables de glicina tales como hidrocloruro de glicina, y similares.
El contenido de acido cftrico en la presente invencion puede ser cualquier contenido en tanto que la concentracion de acido cftrico esta en el intervalo de 0,1 a 50 mmoles/l, pero preferiblemente esta en el intervalo de 0,1 a 50 mmoles/l, mas preferiblemente 1 a 10 mmoles/l. Los ejemplos de la forma de acido cftrico a anadir incluyen acido cftrico, sales farmaceuticamente aceptables de acido cftrico tales como citrato de sodio, y similares.
La preparacion de la presente invencion puede comprender un tensioactivo no ionico ademas del anticuerpo, glicina y acido cftrico mencionados anteriormente, y los ejemplos preferidos incluyen esteres de acidos grasos con sorbitan, esteres de acidos grasos con sorbitan polioxietilenados, polioxipropilenglicoles polioxietilenados, aceites de ricino hidrogenados polioxietilenados, esteres de acidos grasos con polietilenglicol, esteres de acidos grasos con glicerina, esteres de acidos grasos con sacarosa, y similares. Los ejemplos particularmente preferidos incluyen monolaurato de polioxietilensorbitan (polisorbato 20), monooleato de polioxietilensorbitan (polisorbato 80), y similares. La concentracion de tensioactivo no ionico no esta particularmente limitada en tanto que este en una concentracion farmaceuticamente aceptable, pero es preferiblemente 0,01 a 10 mg/ml, mas preferiblemente 0,05 a 1 mg/ml, lo mas preferible 0,1 a 0,3 mg/ml.
Se prefiere que el pH de la preparacion de la presente invencion se controle para que sea un valor apropiado. Como pH apropiado, preferiblemente es pH 4 a 7, mas preferiblemente pH 5 a 6. En cuanto al pH, se puede usar cualquiera de los diversos reguladores del pH farmaceuticamente aceptables, tales como acido clorhfdrico, acido sulfurico, acido fosforico, acido cftrico, acido acetico, acido lactico, acido tartarico, hidroxido de sodio e hidroxido de potasio.
Ademas, en la preparacion de la presente invencion, se pueden anadir aditivos farmaceuticamente aceptables como se ilustra mas abajo.
Los ejemplos de un agente que ajusta la tonicidad incluyen sales inorganicas tales como cloruro de sodio, cloruro de potasio, hidrogenofosfato de sodio y dihidrogenofosfato de sodio; azucares y alcoholes de azucares tales como glucosa, fructosa, lactosa, maltosa, trehalosa, manitol, sorbitol y xilitol; glicerina, dextrano, propilenglicol, polietilenglicol, nicotinamida, y similares.
Los ejemplos de un agente analgesico incluyen inositol, clorobutanol, propilenglicol, alcohol bencflico, lidocafna, sulfato de magnesio, y similares.
Los ejemplos de un conservante incluyen parabenos, tal como p-hidroxibenzoato de metilo y p-hidroxibenzoato de etilo; acido benzoico, etanol, edetato tetrasodico, acido cftrico, acido salicflico, sorbitol, acido sorbico, glicerina, clorobutanol, fenol, propilenglicol, alcohol bencflico, y similar.
Los ejemplos de un agente que controla la viscosidad incluyen alginato de sodio, goma de xantana, glicerina, gelatina, dextrano, dextrina, eteres alquflicos de celulosa tales como hidroxipropilcelulosa e
hidroxipropilmetilcelulosa; polietilenglicol, polialcohol vinflico.
Los ejemplos de un antioxidante incluyen acido eritorbico, dibutilhidroxitolueno, butilhidroxianisol, tioglicolato de sodio, a-tocoferol, acetato de tocoferol, acido L-ascorbico, bisulfito de sodio, sulfito de sodio, pirosulfito de sodio, hidrocloruro de cistefna, edetato sodico, y similares.
Un procedimiento de administracion preferido para la preparacion de la presente invencion es la inyeccion; sin embargo, tambien se pueden emplear formas de administracion percutanea, transmucosal, transnasal, pulmonar, oral u otras. Un procedimiento de administracion particularmente preferido por medio de inyeccion es un procedimiento de inyeccion intravenosa, subcutanea o intramuscular. Ademas, usando un dispositivo de administracion apropiado, se puede administrar directamente a una region de lesion tal como una region tumoral o una region inflamatoria.
Ademas, la preparacion de la presente invencion se puede usar despues de que se diluye con un diluyente en el momento del uso. Los ejemplos del diluyente incluyen infusiones tales como una disolucion salina fisiologica y una disolucion de azucar. La preparacion diluida se puede administrar al cuerpo mientras que la velocidad se controla mediante infusion intravenosa, o usando una bomba de jeringuilla o similar.
La preparacion de anticuerpo de tipo disolucion de la presente invencion se puede usar como una inyeccion para esterilizar la preparacion mediante una tecnica estandar tal como filtracion aseptica seguido de su envasado en un recipiente inyectable tal como una ampolla, un vial o una jeringuilla en un entorno aseptico. Ademas, cuando la preparacion de anticuerpo de tipo disolucion se envasa en un recipiente, se puede llevar a cabo tambien la
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sustitucion del gas en el espacio del recipiente usando un gas inerte tal como nitrogeno o argon.
En adelante, la presente invencion se describira especfficamente haciendo referencia a los Ejemplos; sin embargo, la presente invencion no esta limitada a estos Ejemplos.
Mejor modo de poner en practica la invencion
Ejemplo 1 Preparacion de la preparacion de muestra
Se preparo cada una de las composiciones en disolucion de las formulaciones 1 a 5 mostradas en la Tabla 1, se sometieron a filtracion aseptica, se inyectaron en un vial de vidrio, y entonces se cerraron hermeticamente con un tapon de caucho y una tapa de aluminio, con lo que se preparo una preparacion de muestra. Todas estas operaciones se llevaron a cabo en un entorno aseptico. En cuanto al anticuerpo, se uso un anticuerpo quimerico humano contra gangliosido GD3 KM-871, que se produjo mediante el procedimiento descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar n° 304989/93.
Tabla 1
Concentracion de anticuerpo (mg/ml) Aditivo pH
Formulacion 1
2 Acido fosforico: 10 mmol/l 6
Formulacion 2
2 Acido cftrico: 10 mmol/l 6
Formulacion 3
2 Acido cftrico: 10 mmol/l Manitol: 50 mg/ml 6
Formulacion 4
2 Acido cftrico: 10 mmol/l Glicina: 23 mg/ml 6
Formulacion 5
2 Acido cftrico: 10 mmol/l Glicina: 23 mg/ml Polisorbato 80: 0,1 mg/ml 6
Ejemplo 2 Ensayo de estabilidad
Cada preparacion de muestra preparada en el Ejemplo 1 se almaceno a 40°C durante 1 mes, y entonces se llevo a cabo un ensayo de estabilidad para los siguientes apartados del ensayo.
(1) Observacion visual del contenido
El contenido de cada preparacion de muestra se observo visualmente con luces fluorescentes blancas mientras se agitaba suavemente, y se determino la presencia o ausencia de turbidez.
(2) Medida de la turbidez
El contenido de cada preparacion de muestra se recogio en una microcelda de cuarzo, y se midio la absorbancia a una longitud de onda de 400 nm (O.D.400) con un espectrofotometro de ultravioleta (Hitachi U-3300).
(3) HPLC de filtracion en gel
Se llevo a cabo un analisis mediante HPLC en las siguientes condiciones para determinar el contenido de cada preparacion de muestra.
(Condiciones de HPLC)
Columna: TSKgel G3000 SWXL (Tosoh Co.)
Fase movil: 0,5 moles/l de tampon de fosfato que contiene 0,3 moles/l de cloruro de sodio Longitud de onda de medida: 280 nm Caudal: 1 ml/min.
Cantidad inyectada: 40 ml
Aparato: Sistema LC-10A (Shimadzu Corporation)
La suma de las areas de los picos de los componentes eluidos en el lado de mayor peso molecular del pico de la molecula sin cambiar en el diagrama de HPLC se considero como el area del pico de asociaciones solubles, y el contenido de las asociaciones solubles se calculo mediante la siguiente ecuacion (1).
(Contenido de asociaciones solubles (%)) = (Area del pico de asociaciones solubles)/(Area del pico total)x100 (1) Ademas, la suma de las areas de los picos de los componentes eluidos en el lado de peso molecular inferior del pico
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de la molecula sin cambiar en el diagrama de HPLC se considero como el area del pico de productos qufmicamente degradados, y el contenido de los productos qufmicamente degradados se calculo mediante la siguiente ecuacion (2).
(Contenido de productos qufmicamente degradados (%))=(Area del pico de los productos qufmicamente
degradados)/(Area del pico total)x100 (2)
Los resultados de la (1) observacion visual del contenido y de la (2) medida de la turbidez (O.D.400) se muestran en la Tabla 2. En la Tabla 2, los valores de la turbidez (O.D.400) indican la cantidad de incremento durante el perfodo de almacenamiento (40°C, 1 mes), que se obtuvo restando el valor inicial del valor de medida.
Tabla 2
Almacenamiento a 40°C durante 1 mes
Presencia u ausencia de turbidez (observacion visual) Cantidad de incremento de O.D.400
Formulacion 1
Ausencia 0,002
Formulacion 2
Ausencia 0,000
Formulacion 3
Ausencia 0,002
Formulacion 4
Ausencia 0,002
Formulacion 5
Ausencia 0,002
A partir de los resultados de la observacion visual del contenido en todas las formulaciones (formulaciones 1 a 5), no se observo turbidez. Ademas, en todas las formulaciones, se observo raramente un incremento en la turbidez (O.D.400).
Los resultados de la HPLC de filtracion en gel se muestran en la Tabla 3. El valor mostrado en la Tabla 3 indica la cantidad de incremento durante el perfodo de almacenamiento (40°C, 1 mes), que se obtuvo restando el valor inicial del valor de medida.
Tabla 3
Cantidad de incremento tras el almacenamiento a 40°C durante 1 mes
Asociaciones solubles (%) Productos qufmicamente degradados (%)
Formulacion 1
0,20 1,48
Formulacion 2
0,20 0,59
Formulacion 3
0,22 0,47
Formulacion 4
0,02 0,51
Formulacion 5
0,04 0,42
Al comparar la formulacion 1 (acido fosforico) con las formulaciones 2 y 3 (acido cftrico), la cantidad de incremento de los productos qufmicamente degradados en las formulaciones 2 y 3 fue mas pequena que en la formulacion 1. De los resultados anteriores, se encontro que anadiendo acido cftrico a una disolucion, se puede reducir el incremento en los productos qufmicamente degradados.
Ademas, al comparar la formulacion 2 con la formulacion 4, la cantidad de incremento de asociaciones solubles en la formulacion 4 fue mas pequena que aquella en la formulacion 2, y se encontro que, anadiendo glicina a una disolucion, se puede reducir el incremento en las asociaciones solubles.
Tambien, en la formulacion 5 obtenida anadiendo ademas polisorbato 80 a la formulacion 4, la estabilidad de la disolucion se mantuvo.
Ejemplo 3 Confirmacion del efecto sobre la supresion de agregados insolubles 1 (Preparacion de muestra)
Se preparo cada una de las composiciones en disolucion de las formulaciones 7 a 11 mostradas en la Tabla 4, se filtraron a traves de un filtro con un tamano de poros de 0,2 mm, y entonces se inyectaron en un tubo de ensayo de vidrio. El tubo de ensayo se cerro hermeticamente con un tapon de silicona, con lo que se preparo una preparacion de muestra. En cuanto al anticuerpo, se uso un anticuerpo quimerico humano contra gangliosido gD3 KM-871, descrito en la Solicitud de Patente Japonesa Publicada Sin Examinar n° 304989/93.
Tabla 4
Concentracion de anticuerpo (mg/ml) Aditivo pH
Formulacion 7
2 Acido fosforico: 50 mmol/l 6
Formulacion 8
2 Acido cftrico: 0,1 mmol/l Glicina: 10 mg/ml 6
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Concentracion de anticuerpo (mg/ml) Aditivo pH
Formulacion 9
2 Acido cftrico: 0,1 mmol/l Glicina: 30 mg/ml 6
Formulacion 10
2 Acido cftrico: 50 mmol/l Glicina: 10 mg/ml 6
Formulacion 11
2 Acido cftrico: 50 mmol/l Glicina: 30 mg/ml 6
Ejemplo 4 Confirmacion del efecto sobre la supresion de agregados insolubles 1 (Ensayo de estabilidad)
Cada preparacion de muestra preparada en el Ejemplo 3 se almaceno a 70°C durante 270 segundos, y entonces se llevo a cabo un ensayo de estabilidad para los siguientes apartados de ensayo.
(1) Observacion visual del contenido
El contenido de cada preparacion de muestra se observo visualmente bajo luces fluorescentes blancas mientras se agito suavemente, y se determino la presencia o ausencia de turbidez.
(2) Medida de la turbidez
El contenido de cada preparacion de muestra se recogio en una microcelda de cuarzo, y se midio la absorbancia a una longitud de onda de 400 nm (O.D.400) con un espectrofotometro de ultravioleta (Hitachi U-3300).
En la Tabla 5 se muestran los resultados de la (1) observacion visual del contenido y de la (2) medida de la turbidez (O.D.400).
Tabla 5
Tras almacenar a 70°C durante 270 segundos
Presencia u ausencia de turbidez (observacion visual) O.D.400
Formulacion 7
Turbidez blanca aparente 2,471
Formulacion 8
Ausencia 0,009
Formulacion 9
Ausencia 0,011
Formulacion 10
Ausencia 0,020
Formulacion 11
Ausencia 0,033
En la formulacion 7, se observo turbidez blanca aparente como resultado de la observacion visual, y la turbidez (O. D.400) tambien mostro un valor elevado. Por otro lado, en las formulaciones 8, 9, 10 y 11, no se observo turbidez como resultado de la observacion visual del contenido, y se confirmo que los valores de la turbidez (O.D.400) son significativamente menores que aquellos de la formulacion 7.
Ejemplo 5 Confirmacion del efecto sobre la supresion de agregados insolubles 2 (Preparacion de muestra)
Se preparo cada una de las composiciones en disolucion de las formulaciones 12 a 16 mostradas en la Tabla 6, se filtraron a traves de un filtro con un tamano de poros de 0,2 p.m, y entonces se inyectaron en un tubo de ensayo de vidrio. El tubo de ensayo se cerro hermeticamente con un tapon de silicona, con lo que se preparo una preparacion de muestra. En cuanto al anticuerpo, se uso un anticuerpo con CDR injertadas humano contra CCR4 descrito en el documento WO 03/18635, KM8760.
Tabla 6
Concentracion de anticuerpo (mg/ml) Aditivo pH
Formulacion 12
2 Acido fosforico: 50 mmol/l 6
Formulacion 13
2 Acido cftrico: 0,1 mmol/l Glicina: 10 mg/ml 6
Formulacion 14
2 Acido cftrico: 0,1 mmol/l Glicina: 30 mg/ml 6
Formulacion 15
2 Acido cftrico: 50 mmol/l Glicina: 10 mg/ml 6
Formulacion 16
2 Acido cftrico: 50 mmol/l Glicina: 30 mg/ml 6
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30
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Ejemplo 6 Confirmacion del efecto sobre la supresion de agregados insolubles 2 (Ensayo de estabilidad)
Cada preparacion de muestra preparada en el Ejemplo 5 se almaceno a 70°C durante 210 segundos, y entonces se llevo a cabo un ensayo de estabilidad para los siguientes apartados de ensayo.
(1) Observacion visual del contenido
El contenido de cada preparacion de muestra se observo visualmente bajo luces fluorescentes blancas mientras se agito suavemente, y se determino la presencia o ausencia de turbidez.
(2) Medida de la turbidez
El contenido de cada preparacion de muestra se recogio en una microcelda de cuarzo, y se midio la absorbancia a una longitud de onda de 400 nm (O.D.400) con un espectrofotometro de ultravioleta (Hitachi U-3300).
En la Tabla 7 se muestran los resultados de la (1) observacion visual del contenido y de la (2) medida de la turbidez (O.D.400).
Tabla 7
Tras almacenar a 70°C durante 210 segundos
Presencia u ausencia de turbidez (observacion visual) O.D.400
Formulacion 12
Turbidez blanca aparente 0,698
Formulacion 13
Ausencia 0,079
Formulacion 14
Ausencia 0,006
Formulacion 15
Ausencia 0,056
Formulacion 16
Ausencia 0,024
En la formulacion 12, se observo turbidez blanca aparente como resultado de la observacion visual, y la turbidez (O.D.400) tambien mostro un valor elevado. Por otro lado, en las formulaciones 13, 14, 15 y 16, no se observo turbidez como resultado de la observacion visual del contenido, y se confirmo que los valores de la turbidez (O.D.400) son significativamente menores que aquellos de la formulacion 12.
Ejemplo 7 Confirmacion del efecto sobre la supresion de asociaciones solubles y de productos qufmicamente degradados (Preparacion de muestra)
Se preparo cada una de las composiciones en disolucion de las formulaciones 17 a 21 mostradas en la Tabla 8, se sometieron a filtracion aseptica, se inyectaron en un vial de vidrio, y entonces se cerraron hermeticamente con un tapon de caucho y una tapa de aluminio, con lo que se preparo una preparacion de muestra. Todas estas operaciones se llevaron a cabo en un entorno aseptico. En cuanto al anticuerpo, se uso un anticuerpo con CDR injertadas humano contra CCR4 descrito en el documento WO 03/18635, KM8760.
Tabla 8
Concentracion de anticuerpo (mg/ml) Aditivo pH
Formulacion 17
2 Acido fosforico: 50 mmol/l 6
Formulacion 18
2 Acido cftrico: 0,1 mmol/l Glicina: 10 mg/ml 6
Formulacion 19
2 Acido cftrico: 0,1 mmol/l Glicina: 30 mg/ml 6
Formulacion 20
2 Acido cftrico: 50 mmol/l Glicina: 10 mg/ml 6
Formulacion 21
2 Acido cftrico: 50 mmol/l Glicina: 30 mg/ml 6
Ejemplo 8 Confirmacion del efecto sobre la supresion de asociaciones solubles y de productos qufmicamente degradados (Ensayo de estabilidad)
Cada preparacion de muestra preparada en el Ejemplo 7 se almaceno a 40°C durante 1 mes, y entonces se evaluo la estabilidad analizando el contenido mediante HplC de filtracion en gel en las siguientes condiciones.
(Condiciones de HPLC)
Columna: TSKgel G3000 SWXL (Tosoh Co.)
Fase movil: 0,05 moles/l de tampon de fosfato que contiene 0,3 moles/l de cloruro de sodio
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15
20
25
30
35
40
45
50
Longitud de onda de medida: 280 nm Caudal: 1 ml/min.
Cantidad inyectada: 40 ml
Aparato: Sistema LC-10A (Shimadzu Corporation)
La suma de las areas de los picos de los componentes eluidos en el lado de mayor peso molecular del pico de la molecula sin cambiar en el diagrama de HPLC se considero como el area del pico de asociaciones solubles, y el contenido de las asociaciones solubles se calculo mediante la siguiente ecuacion.
(Contenido de asociaciones solubles (%)) = (Area del pico de asociaciones solubles)/(Area del pico total) x 100 (1)
Ademas, la suma de las areas de los picos de los componentes eluidos en el lado de peso molecular inferior del pico de la molecula sin cambiar en el diagrama de HPLC se considero como el area del pico de productos qufmicamente degradados, y el contenido de los productos qufmicamente degradados se calculo mediante la siguiente ecuacion.
(Contenido de productos qufmicamente degradados (%)) = (Area del pico de los productos qufmicamente
degradados)/(Area del pico total) x 100 (2)
Los resultados de la HPLC de filtracion en gel se muestran en la Tabla 9. Los resultados muestran la cantidad incrementada durante el perfodo de almacenamiento (40°C, 1 mes), que se obtuvo restando el valor inicial del valor de medida.
Tabla 9
Cantidad de incremento tras el almacenamiento a 40°C durante 1 mes
Asociaciones solubles (%) Productos qufmicamente degradados (%)
Formulacion 17
0,11 0,96
Formulacion 18
-0,02 0,44
Formulacion 19
0,02 0,47
Formulacion 20
-0,05 0,35
Formulacion 21
0,05 0,38
Como resultado de comparar la formulacion 17 con las formulaciones 18, 19, 20 y 21, se encontro que las formulaciones 18, 19, 20 y 21 tienen una excelente estabilidad en vista de tanto las asociaciones solubles como los productos qufmicamente degradados.
Ejemplo 9 Confirmacion de la estabilidad de la preparacion (Preparacion de muestra)
Se preparo una composicion en disolucion de una formulacion 22 mostrada en la Tabla 10, se sometio a filtracion aseptica, se inyecto en un vial de vidrio, y entonces se cerro hermeticamente con un tapon de caucho y una tapa de aluminio, con lo que se preparo una preparacion de muestra. Todas estas operaciones se llevaron a cabo en un entorno aseptico. En cuanto al anticuerpo, se uso un anticuerpo con CDR injertadas humano contra CCR4 descrito en el documento WO 03/18635, KM8760.
Tabla 10
Concentracion de anticuerpo (mg/ml) Aditivo pH
Formulacion 22
4 Acido cftrico: 2 mmol/l Glicina: 22,5 mg/ml Polisorbato 80: 0,2 mg/ml 5,5
Ejemplo 10 Confirmacion de la estabilidad de la preparacion (Almacenamiento a 40°C)
La preparacion de muestra preparada en el Ejemplo 9 se almaceno a 40°C durante 1 mes, y entonces se evaluo la estabilidad analizando el contenido mediante HPLC de filtracion en gel en las siguientes condiciones.
(Condiciones de HPLC)
Columna: TSKgel G3000 SWxL (Tosoh Co.)
Fase movil: 0,05 moles/l de tampon de fosfato que contiene 0,3 moles/l de cloruro de sodio Longitud de onda de medida: 280 nm Caudal: 1 ml/min.
Cantidad inyectada: 40 ml
Aparato: Sistema LC-10A (Shimadzu Corporation)
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
55
La suma de las areas de los picos de los componentes eluidos en el lado de mayor peso molecular del pico de la molecula sin cambiar en el diagrama de HPLC se considero como el area del pico de asociaciones solubles, y el contenido de las asociaciones solubles se calculo mediante la siguiente ecuacion (1).
(Contenido de asociaciones solubles (%)) = (Area del pico de asociaciones solubles)/(Area del pico total) x 100 (1)
Ademas, la suma de las areas de los picos de los componentes eluidos en el lado de peso molecular inferior del pico de la molecula sin cambiar en el diagrama de HPLC se considero como el area del pico de productos qufmicamente degradados, y el contenido de los productos qufmicamente degradados se calculo mediante la siguiente ecuacion (2).
(Contenido de productos qufmicamente degradados (%)) = (Area del pico de los productos qufmicamente
degradados)/(Area del pico total) x 100 (2)
Los resultados de la HPLC de filtracion en gel se muestran en la Tabla 11. Los resultados muestran la cantidad incrementada durante el perfodo de almacenamiento (40°C, 1 mes), que se obtuvo restando el valor inicial del valor de medida.
Tabla 11
Cantidad de incremento tras el almacenamiento a 40°C durante 1 mes
Asociaciones solubles (%) Productos qufmicamente degradados (%)
Formulacion 22
-0,02 0,46
Se confirmo que la formulacion 22 que comprende acido cftrico y glicina tiene una excelente estabilidad en vista tanto de las asociaciones solubles como de los productos qufmicamente degradados.
Ejemplo 11 Confirmacion de la estabilidad de la preparacion (Almacenamiento a 70°C)
El contenido de la preparacion preparada en el Ejemplo 9 se filtro a traves de un filtro con un tamano de poros de 0,2 p,m, y entonces se inyecto en un tubo de ensayo de vidrio. La abertura del tubo de ensayo se cerro hermeticamente con un tapon, con lo que se preparo una muestra. La muestra se almaceno a 70°C durante 210 segundos, y entonces se llevo a cabo un ensayo de estabilidad para los siguientes apartados de ensayo.
(1) Observacion visual del contenido
El contenido de cada preparacion de muestra se observo visualmente bajo luces fluorescentes blancas mientras se agito suavemente, y se determino la presencia o ausencia de turbidez.
(2) Medida de la turbidez
El contenido de cada preparacion de muestra se recogio en una microcelda de cuarzo, y se midio la absorbancia a una longitud de onda de 400 nm (O.D.400) con un espectrofotometro de ultravioleta (Hitachi U-3300).
En la Tabla 12 se muestran los resultados de la (1) observacion visual del contenido y de la (2) medida de la turbidez (O.D.400).
Tabla 12
Tras almacenar a 70°C durante 210 segundos
Presencia o ausencia de turbidez (observacion visual) O.D.400
Formulacion 22
Ausencia 0,014
Se confirmo que la formulacion 22, que es una preparacion que comprende acido cftrico y glicina, tiene igualmente una excelente estabilidad en vista de los agregados insolubles.
Aplicabilidad industrial
Segun la presente descripcion, se puede proporcionar un procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion, y una preparacion de anticuerpo de tipo disolucion estabilizada.

Claims (16)

  1. 5
    10
    15
    20
    25
    30
    35
    40
    45
    50
    REIVINDICACIONES
    1. Procedimiento para estabilizar un anticuerpo en una disolucion, que comprende anadir 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico a la disolucion de anticuerpo, en el que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
  2. 2. Procedimiento segun la reivindicacion 1, en el que el procedimiento de estabilizacion de un anticuerpo es la supresion de la formacion de un dfmero y de un producto qufmicamente degradado del anticuerpo en una disolucion.
  3. 3. Procedimiento para suprimir la formacion de un dfmero de un anticuerpo en una disolucion, que comprende anadir 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico a la disolucion de anticuerpo, en el que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
  4. 4. Procedimiento para suprimir la formacion de un producto qufmicamente degradado de un anticuerpo en una disolucion, que comprende anadir 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico a la disolucion de anticuerpo, en el que la concentracion del anticuerpo es 0,01 a 150 mg/ml.
  5. 5. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, que comprende ademas un tensioactivo no ionico.
  6. 6. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el pH de la disolucion se encuentra en el intervalo de 4 a 7.
  7. 7. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano.
  8. 8. Procedimiento segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que el anticuerpo es cualquiera de los anticuerpos contra gangliosido GD3 y anticuerpos contra el receptor 4 de quimiocina CC (al que se hace referencia en adelante como CCR4).
  9. 9. Preparacion de anticuerpo en la que se suprime la formacion de un dfmero, de un producto qufmicamente degradado y de un agregado insoluble del anticuerpo, que comprende 10 a 30 mg/ml de glicina, 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico y 0,01 a 150 mg/ml de anticuerpo.
  10. 10. Preparacion segun la reivindicacion 9, que comprende ademas un tensioactivo no ionico.
  11. 11. Preparacion segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 10, en la que el pH de la disolucion se encuentra en el intervalo de 4 a 7.
  12. 12. Preparacion segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 11, en la que humanizado o un anticuerpo humano.
  13. 13. Preparacion segun cualquiera de las reivindicaciones 9 a 12, en la que el anticuerpos contra gangliosido GD3 y anticuerpos contra CCR4.
  14. 14. Disolucion de anticuerpo, que comprende 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico, y 0,01 a 150 mg/ml de anticuerpo como un principio activo.
  15. 15. Utilizacion de una disolucion de anticuerpo en un procedimiento para estabilizar el anticuerpo, comprendiendo la disolucion 10 a 30 mg/ml de glicina y 0,1 a 50 mmoles/l de acido cftrico, y 0,01 a 150 mg/ml de anticuerpo como un principio activo.
  16. 16. Utilizacion segun la reivindicacion 15, en la que la estabilizacion del anticuerpo es la supresion de la formacion de un dfmero, de un producto qufmicamente degradado y de un agregado insoluble del anticuerpo en una disolucion.
    el anticuerpo es un anticuerpo anticuerpo es cualquiera de los
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