KR100911091B1

KR100911091B1 - 항체의 안정화 방법 및 안정화된 용액상 항체 제제

Info

Publication number: KR100911091B1
Application number: KR1020067006311A
Authority: KR
Inventors: 유지 우에노; 다까시 가야시따; 아쯔시 이시하라; 마사시 나까꾸라; 교꼬 야마우찌
Original assignee: 교와 핫꼬 기린 가부시키가이샤
Priority date: 2003-10-01
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2009-08-06
Also published as: PL1698640T3; JPWO2005033143A1; AU2004277466C1; CY1117215T1; SI1698640T2; US8496930B2; CN1856507A; US10172790B2; DK1698640T3; CA2540848C; JP4219932B2; US20130280248A1; CN100522998C; SI1698640T1; HK1090933A1; EP1698640B1; US9011850B2; WO2005033143A1; PT1698640E; KR20060089227A

Abstract

본 발명은 용액 중에서의 항체의 가용성 회합체의 생성 억제 방법, 화학적 분해물의 생성 억제 방법, 또한 항체의 안정화 방법을 제공한다. 또, 본 발명은 가용성 회합체의 생성이 억제된 용액상 항체 제제, 화학적 분해물의 생성이 억제된 용액상 항체 제제, 또한 가용성 회합체의 생성, 화학적 분해물의 생성 및 불용성 응집체의 생성이 억제된 용액상 항체 제제, 및 항체의 가용성 회합체의 생성 억제제, 항체의 화학적 분해물의 생성 억제제 및 항체 안정화제를 제공한다.

항체의 안정화 방법, 용액상 항체 제제, 가용성 회합체, 화학적 분해물, 불용성 응집체, 글리신, 시트르산, 비이온성 계면 활성제

Description

항체의 안정화 방법 및 안정화된 용액상 항체 제제{METHOD OF STABILIZING ANTIBODY AND STABILIZED SOLUTION-TYPE ANTIBODY PREPARATION}

본 발명은 용액 중에서의 항체의 안정화 방법 및 안정화된 용액상 항체 제제에 관한 것이다.

바이오 테크놀러지의 진보에 의해 항체를 이용한 질환의 치료가 최근 급속히 보급되고 있다. 일본에서도 예를 들면 시나지스(Synagis), 레미케이드(Remicade), 리툭산(Rituxan), 허셉틴(Herceptin) 등, 여러 가지 항체 제제가 의료 현장에서 제공되고 있다.

항체를 용액 중에서 장기간 보존할 때, 화학적 분해물의 생성, 불용성 응집체의 생성, 가용성 회합체의 생성 등이 일어난다. 그래서 안정화되면서도 안전한 항체 의약을 제공하기 위해 이들 생성물을 억제하기 위한 방법이 요구되고 있다.

항체를 용액 상태로 장기간 보존했을 경우에, 항체의 디술피드 결합이나 펩티드 결합의 개열 등의 화학적인 분해 반응이 일어난다. 그 결과, 품질의 열화에 의한 활성 저하, 예기치 못한 부작용 등이 염려된다.

단백질은 진탕이나 열 스트레스 등에 의해 고차 구조가 붕괴된 분자가 응집되어 불용화된다. 이들 불용성 응집체가 정맥 내 투여되었을 경우, 아나필락시성 쇼크 등의 위중한 부작용이 일어나기 쉬워진다(일본 특표 평10-502938호 공보).

불용성 응집체의 생성을 억제하는 방법으로서는 재조합 인간 사이토케라티노사이트 성장 인자(recombinant human keratinocyte growth factor) 수용액의 열 스트레스에 의한 불용성 응집체의 생성을 억제하기 위해 100m㏖/L이상의 시트르산 또는 0.5％의 헤파린을 항체 용액에 첨가하는 것이 알려져 있다[Journal of Pharmaceutical Science, vol.83, No.12.1657-1661(1994)]. 또, 항체 수용액의 열 스트레스에 의한 불용성 응집체 생성을 억제하는 방법으로서는 글리신 또는 히스티딘 완충액을 이용하는 것(WO02/13860 공보), 2％이상의 폴리비닐피롤리돈을 첨가하는 것[Pharmaceutical Research, vol.11, No.5, 624-632, 1994], 인산 완충액 및 염화 나트륨 및 말토오스를 첨가하는 것(일본 특표 평3-504499호 공보) 등이 알려져 있다.

또 단백질에 따라서는 불용화에는 이르지 않지만, 2량체, 3량체 등 소수의 단백질 분자를 포함하는 가용성 회합체를 형성하는 것이 알려져 있다. 예를 들면 단백질이 항체인 경우, 가용성의 2량체가 형성되기 쉽다고 여겨지고 있다[Biochemistry, vol.38, 13960-13967(1999)]. 또 항체의 2량체가 인간 체내에 투여되면 열, 구역질, 저혈압 등의 부작용이 야기될 위험성이 있다(일본 특표 평10-502938호 공보).

가용성의 회합체 생성을 억제하는 방법으로서는 니코틴산 유도체 또는 친유성 측쇄를 가지는 α-아미노산 등을 안정화제로서 액체 면역 글로블린 제제에 함유 시키는 방법이 알려져 있다(일본 특표 평10-502938호 공보).

이상과 같이 용액 중에서의 항체의 안정화는 화학적 분해물의 생성, 불용성 응집체 생성, 가용성 회합체 생성이라고 하는 복수의 불안정화 요인을 극복하고, 안정된 항체 제제를 제공할 방법이 요망되고 있지만, 이제까지 알려지지 않았다.

본 발명은 용액 중에서의 항체의 가용성 회합체의 생성 억제 방법, 화학적 분해물의 생성 억제 방법, 또한 항체의 안정화 방법을 제공하는 것을 목적으로 한다. 또, 본 발명은 가용성 회합체의 생성이 억제된 용액상 항체 제제, 화학적 분해물의 생성이 억제된 용액상 항체 제제, 또한 가용성 회합체의 생성, 화학적 분해물의 생성 및 불용성 응집체의 생성이 억제된 용액상 항체 제제, 및 항체의 가용성 회합체의 생성 억제제, 항체의 화학적 분해물의 생성 억제제 및 항체 안정화제의 제공을 목적으로 한다.

본 발명은 이하의 (1) 내지 (25)에 관한 것이다.

(1) 항체에 글리신 및 시트르산을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 용액 중에서 항체를 안정화하는 방법.

(2) 상기 (1)에 있어서, 항체를 안정화하는 방법이 용액 중에서 항체의 가용성 회합체의 생성을 억제하고 화학적 분해물의 생성을 억제하는 것인 방법.

(3) 항체에 글리신을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 용액 중에서 항체의 가용성 회합체의 생성을 억제하는 방법.

(4) 항체에 시트르산을 첨가하는 것을 특징으로 하는, 용액 중에서 항체의 화학적 분해물의 생성을 억제하는 방법.

(5) 상기 (1) 내지 (4) 중 어느 하나에 있어서, 항체 농도가 0.01 내지 150mg/mL인 방법.

(6) 상기 (1) 내지 (3) 중 어느 하나에 있어서, 글리신의 농도가 10 내지 30mg/mL인 방법.

(7) 상기 (1), (2) 또는 (4) 중 어느 하나에 있어서, 시트르산의 농도가 0.1 내지 50m㏖/L인 방법.

(8) 상기 (1) 내지 (7) 중 어느 하나에 있어서, 비이온성 계면활성제를 더 함유하는 것인 방법.

(9) 상기 (1) 내지 (8) 중 어느 하나에 있어서, 용액의 pH가 4 내지 7의 범위 내인 방법.

(10) 상기 (1) 내지 (9) 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인 방법.

(11) 상기 (1) 내지 (10) 중 어느 하나에 있어서, 항체가 강그리오시드 GD3에 대한 항체 및 CC 케모카인 수용체 4(이하, CCR4라고 한다)에 대한 항체 중 어느 한 항체인 방법.

(12) 글리신 및 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 항체의 가용성 회합체의 생성이 억제된 용액상 항체 제제.

(13) 시트르산 및 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 항체의 화학적 분해물의 생성이 억제된 용액상 항체 제제.

(14) 글리신, 시트르산 및 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 항체의 가용성 회합체의 생성, 화학적 분해물의 생성 및 불용성 응집체의 생성이 억제된 용액상 항체 제제.

(15) 상기 (12) 내지 (14) 중 어느 하나에 있어서, 항체 농도가 0.01 내지 150mg/mL인 제제.

(16) 상기 (12), (14) 또는 (15) 중 어느 하나에 있어서, 글리신의 농도가 10 내지 30mg/mL인 제제.

(17) 상기 (13) 내지 (15) 중 어느 하나에 있어서, 시트르산의 농도가 0.1 내지 50m㏖/L인 제제.

(18) 상기 (12) 내지 (17) 중 어느 하나에 있어서, 비이온성 계면활성제를 더 함유하는 것인 제제.

(19) 상기 (12) 내지 (18) 중 어느 하나에 있어서, 용액의 pH가 4 내지 7의 범위 내인 제제.

(20) 상기 (12) 내지 (19) 중 어느 하나에 있어서, 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인 제제.

(21) 상기 (12) 내지 (20) 중 어느 하나에 있어서, 항체가 강그리오시드 GD3에 대한 항체 및 CCR4에 대한 항체 중 어느 한 항체인 제제.

(22) 글리신을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 용액 중에서의 항체의 가용성 회합체의 생성 억제제.

(23) 시트르산을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 용액 중에서의 항체의 화학적 분해물의 생성 억제제.

(24) 글리신 및 시트르산을 유효 성분으로서 함유하는 것을 특징으로 하는, 항체의 안정화제.

(25) 상기 (24)에 있어서, 항체의 안정화가 용액 중에서의 항체의 가용성 회합체의 생성 억제, 화학적 분해물의 생성 억제 및 불용성 응집체의 생성 억제인 안정화제.

본 발명에서 사용되는 항체에는 항체 단편도 포함된다. 이들 항체 및 항체 단편은 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 하나일 수 있는데, 모노클로날 항체가 바람직하다.

또, 상기의 항체 또는 항체 단편에는 인간 이외의 동물의 항체, 유전자 재조합 항체, 그들의 항체 단편 등도 포함된다.

유전자 재조합 항체로서는 인간화 항체, 인간 항체 등을 들 수 있고, 또, 인간화 항체로서는 인간형 키메라 항체, 인간형 CDR 이식 항체 등을 들 수 있다.

인간형 키메라 항체란, 인간 이외의 동물 항체의 VH 및 VL과 인간 항체의 CH 및 CL를 포함하는 항체를 말한다. 인간형 키메라 항체의 CH로서는 인간 이뮤노글로불린(이하, hIg라고 표기한다)에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, hIgG클래스의 것이 아주 적합하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4라고 하는 서브 클래스 중 어느 것이나 이용할 수 있다. 또, 인간형 키메라 항체의 CL로서는 hIg에 속하면 어느 것이라도 좋고, κ클래스 혹은 λ클래스의 것을 이용할 수 있다.

또, 인간 이외의 동물로서는 마우스, 래트, 햄스터, 래빗 등을 들 수 있다.

인간형 CDR 이식 항체란, 인간 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말한다.

본 발명의 인간형 CDR 이식 항체는 인간 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임 워크(이하, FR라고 표기한다)와 연결한 V영역을 코딩하는 cDNA를 설계, 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL를 코딩하는 cDNA를 가지는 동물세포용 발현 벡터에 각각 삽입해서 인간형 CDR 이식 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물세포에 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

인간형 CDR 이식 항체의 CH로서는 hIg에 속하면 어떠한 것이라도 좋지만, hIgG클래스의 것이 아주 적합하고, 또한 hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4라고 하는 서브 클래스 중 어느 것이나 이용할 수 있다. 또, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로서는 hIg에 속하면 어느 것이라도 좋고, κ클래스 혹은 λ클래스의 것을 이용할 수 있다.

인간 항체란, 원래 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자 공학적, 세포 공학적, 발생 공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 포함된다. 인간 체내에 존재하는 항체는 예를 들면 인간 말초혈 림프구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하여 클로닝함으로써 해당 항체를 생산하는 림프구를 취득하고, 이것을 배양하여 배양 상청액 중으로부터 해당 항체를 정제함으로써 얻을 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리는 인간 B세포로 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입함으로써 Fab, scFv등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 해당 라이브러리로부터 항원이 고정화되어 있는 기질에 대한 결합 활성을 지표로 해서 원하는 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편을 표면에 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 해당 항체 단편은 또한 유전자 공학적 수법에 의해 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄를 포함하는 인간 항체 분자로도 변환시킬 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물은 인간 항체 유전자가 세포 내에 조립된 동물을 말한다. 구체적으로는 예를 들면 마우스 ES세포로 인간 항체 유전자를 도입하고, 해당 ES세포를 마우스의 초기 배에 이식 후 발생시킴으로써 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 제작할 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체의 제작 방법에서는, 통상의 인간 이외의 동물에서 행해지고 있는 잡종 세포 제작 방법에 의해 인간 항체 생산 잡종 세포를 취득하여 배양함으로써 배양 상청 중에 인간 항체를 생성 축적시킬 수 있다.

본 발명에서 사용되는 항체 단편으로서는 Fab, Fab', F(ab')₂, scFv, 디아바디(diabody), dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.

Fab는 IgG형 항체 분자를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리해서 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째의 아미노산 잔기에서 절단된다), H쇄의 N말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디술피드 결합으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 Fab는 항체를 단백질 분해 효소 파파인으로 처리해서 얻을 수 있다. 또는 해당 항체의 Fab를 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 혹은 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 벡터를 원핵생물 혹은 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 Fab를 제조할 수 있다.

F(ab')₂는 IgG형 항체 분자를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리해서 얻어지는 단편 중(H쇄의 234번째의 아미노산 잔기에서 절단된다), Fab가 힌지 영역의 디술피드 결합을 개입시켜 결합된 것보다 약간 큰, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 F(ab')₂는 항체를 단백질 분해 효소 펩신으로 처리해서 얻을 수 있다. 또는 하기의 Fab'를 티오에테르 결합 혹은 디술피드 결합시켜 제작할 수 있다.

Fab'는 상기 F(ab')₂의 힌지 영역의 디술피드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 Fab'는 F(ab')₂를 환원제 디티오스레이톨 처리해서 얻을 수 있다. 또는 해당 항체의 Fab'단편을 코딩하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 혹은 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 벡터를 원핵생물 혹은 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

scFv는 1개의 VH와 1개의 VL를 적당한 펩티드 링커(이하, P라고 표기한다)를 이용해서 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드이고, 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다.

본 발명에서 사용되는 scFv는 항체의 VH 및 VL를 코딩하는 cDNA를 취득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 혹은 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 혹은 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

디아바디는 scFv가 2량체화한 항체 단편이고, 2가의 항원 결합 활성을 가지는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은 동일하게 할 수도 있고, 한쪽을 다른 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. 본 발명에서 사용되는 디아바디는 항체의 VH 및 VL를 코딩하는 cDNA를 취득하고, scFv를 코딩하는 DNA를 링커의 아미노산 배열의 길이가 8잔기 이하가 되도록 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 혹은 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 혹은 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

dsFv는 VH 및 VL중의 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 해당 시스테인 잔기 사이의 디술피드 결합을 개입시켜 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 레이터(Reiter) 등에 의해 개시된 방법[Protein Engineering, 7, 697-704, 1994]에 따라, 항체의 입체 구조 예측에 근거해서 선택할 수 있다. 본 발명에서 사용되는 dsFv는 항체의 VH 및 VL를 코딩하는 cDNA를 취득하고, dsFv를 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 혹은 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 혹은 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다.

CDR을 포함하는 펩티드는 VH 또는 VL의 CDR의 적어도 1 영역 이상을 포함해서 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 개입시켜 결합시킬 수 있다. 본 발명에서 사용되는 CDR을 포함하는 펩티드는 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코딩하는 DNA를 구축하고, 해당 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 혹은 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 해당 발현 벡터를 원핵생물 혹은 진핵생물로 도입함으로써 발현시켜 제조할 수 있다. 또, CDR을 포함하는 펩티드는 Fmoc법(플루오레닐메틸옥시카르보닐법), tBoc법(t-부틸옥시카르보닐법) 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.

본 발명을 적용할 수 있는 항체는 어떠한 것이라도 좋지만, 구체예로서는 강그리오시드 GD3에 대한 모노클로날 항체, CCR4에 대한 모노클로날 항체 등을 들 수 있다. 강그리오시드 GD3에 대한 모노클로날 항체로서는 마우스 모노클로날 항체 KM-641(특허 3006943호), 인간형 키메라 항체 KM-871(일본 특허공개 평5-304989), 인간형 CDR 이식 항체 KM-8871(WO01/23432) 등을 들 수 있다. CCR4에 대한 모노클로날 항체로서는 인간형 키메라 항체인 KM2760(WO01/64754), 항 CCR4 인간형 CDR 이식 항체인 KM8760(WO03/18635) 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서 화학적 분해물이란, 항체의 디술피드 결합 또는 펩티드 결합이 개열된 것을 말한다. 구체적으로는 모노클로날 항체의 H쇄 또는 L쇄의 일부 또는 전부가 결실된 것을 들 수 있다. 또한 전술의 Fab 단편, Fab 단편의 H쇄와 L쇄가 또 개열된 것 등도 포함된다.

본 발명에 있어서 불용성 응집체란, 고차 구조 변화 등에 의해 분자 표면의 소수성이 증대되고, 현저하게 수용성이 저하한 분자가 집합하여 불용화된 것을 말한다. 따라서, 불용성 응집체가 생성됨으로써 용액상 항체 제제의 탁도가 증대한다.

본 발명에 있어서 가용성 회합체란, 항체 분자끼리 회합되어 있지만, 항체 분자의 고차 구조의 변화가 없거나, 또는 고차 구조의 변화가 비교적 경미하기 때문에 수용액 중에서 석출되지 않을 정도로 해당 회합체의 수용성이 유지되고 있는 것을 말한다. 따라서 이들 가용성 회합체의 생성에 의해 제제의 탁도 증대는 발생하지 않는다. 통상 회합하는 항체의 분자수는 비교적 적고, 통상 2 내지 4량체이다.

본 발명의 용액상 항체 제제의 제조법은 일반적인 용액상 제제의 제조에 이용되고 있는 방법이면 특별히 한정되지 않지만, 구체적으로는 항체 및 첨가제의 용액을 미리 조제하고, 그것들을 혼합함으로써 제조할 수 있다. 또 항체 또는 첨가제 원료를 직접 용매 중에 첨가하여 용해시킴으로써 제조할 수도 있다.

본 발명의 용액 중에서의 항체의 안정화 방법, 용액 중에서의 가용성 회합체의 생성 억제 방법 및 용액 중에서의 화학적 분해물의 생성 억제 방법에 있어서 항체 농도로서는, 0.01 내지 150mg/mL의 범위이면 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 0.1 내지 50mg/mL, 보다 바람직하게는 1 내지 20mg/mL를 들 수 있다.

본 발명의 용액 중에서의 항체의 안정화 방법 및 용액 중에서의 가용성 회합체의 생성 억제 방법에 있어서 첨가하는 글리신의 양은 글리신 농도로서 10 내지 30mg/mL의 범위이면 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 20 내지 25mg/mL, 보다 바람직하게는 22 내지 23mg/mL를 들 수 있다. 첨가하는 글리신의 형태로서는 글리신, 글리신 염산염 등의 약학적으로 허용되는 글리신의 염류 등을 들 수 있다.

본 발명의 용액 중에서의 항체의 안정화 방법 및 용액 중에서의 화학적 분해물의 생성 억제 방법에 있어서 첨가하는 시트르산의 양은 시트르산 농도로서 0.1 내지 50m㏖/L의 범위이면 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 0.5 내지 20m㏖/L, 보다 바람직하게는 1 내지 10m㏖/L를 들 수 있다. 첨가하는 시트르산의 형태로서는 시트르산, 시트르산 나트륨 등의 약학적으로 허용되는 시트르산의 염류 등을 들 수 있다.

본 발명의 항체 용액 중에서의 항체의 안정화 방법은, 용액 중에서의 항체의 가용성 회합체의 생성 억제, 화학적 분해물의 생성 억제 및 불용성 응집체의 생성 억제에 효과를 나타낸다.

본 발명의 제제에 있어서의 항체의 농도로서는, 0.01 내지 150mg/mL의 범위이면 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 0.1 내지 50mg/mL, 보다 바람직하게는 1 내지 20mg/mL를 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 글리신의 함유량은 글리신 농도로서 10 내지 30mg/mL의 범위이면 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 20 내지 25mg/mL, 보다 바람직하게는 22 내지 23mg/mL를 들 수 있다. 첨가하는 글리신의 형태로서는 글리신, 글리신 염산염 등의 약학적으로 허용되는 글리신의 염류 등을 들 수 있다.

본 발명에 있어서의 시트르산의 함유량은 시트르산 농도로서 0.1 내지 50m㏖/L의 범위이면 어느 것이라도 좋지만, 바람직하게는 0.5 내지 20m㏖/L, 보다 바람직하게는 1 내지 10m㏖/L를 들 수 있다. 첨가하는 시트르산의 형태로서는 시트르산, 시트르산 나트륨 등의 약학적으로 허용되는 시트르산의 염류 등을 들 수 있다.

본 발명의 제제는 전술의 항체, 글리신, 시트르산 외에, 비이온성 계면활성제가 함유되어 있을 수 있고, 바람직한 것으로서 소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌소르비탄 지방산 에스테르류, 폴리옥시에틸렌폴리옥시프로필렌글리콜류, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자기름류, 폴리에틸렌글리콜 지방산 에테르류, 글리세린 지방산 에스테르류, 자당 지방산 에스테르류 등을 들 수 있다. 특히 바람직한 것으로서 폴리옥시에틸렌소르비탄모노라우레이트(폴리소르베이트 20), 폴리옥시에틸렌소르비탄모노올레에이트(폴리소르베이트 80) 등을 들 수 있다. 비이온성 계면활성제의 농도로서는, 약학적으로 허용되는 범위이면 특별히 제한되지 않지만, 바람직하게는 0.01 내지 10mg/mL, 보다 바람직하게는 0.05 내지 1mg/mL, 가장 바람직하게는 0.1 내지 0.3mg/mL를 들 수 있다.

본 발명의 제제는 pH를 적절한 값으로 제어하는 것이 바람직하다. 적절한 pH치로서는 바람직하게는 pH4 내지 7이고, 보다 바람직하게는 pH5 내지 6을 들 수 있다. pH에는 예를 들면 염산, 황산, 인산, 시트르산, 아세트산, 락트산, 타르타르산, 수산화 나트륨, 수산화 칼륨 등의 의약품으로서 허용되는 여러 가지 pH조절제를 사용할 수 있다.

또 본 발명의 제제에 이하에 예시하는 것 같은 의약품으로서 허용되는 첨가제를 첨가할 수 있다.

등장화제로서는 염화 나트륨, 염화 칼륨, 인산 수소 나트륨, 인산 이수소나트륨 등의 무기 염류, 글루코오스, 프룩토오스, 락토오스, 말토오스, 트레할로오스, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨 등의 당 및 당 알코올류, 글리세린, 덱스트란, 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜, 니코틴산 아미드 등을 들 수 있다.

무통화제로서 이노시톨, 클로로부탄올, 프로필렌글리콜, 벤질알코올, 리도카인, 황산 마그네슘 등을 들 수 있다.

보존제로서는 파라옥시벤조산메틸, 파라옥시벤조산에틸 등의 파라벤류, 벤조산, 에탄올, 에데트산4나트륨, 시트르산, 살리실산, 소르비톨, 소르빈산, 글리세린, 클로로부탄올, 페놀, 프로필렌글리콜, 벤질알코올 등을 들 수 있다.

점조제로서는 알긴산 나트륨, 크산탄검, 글리세린, 젤라틴, 덱스트란, 덱스트린, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스 등의 셀룰로오스 알킬에테르류, 폴리에틸렌글리콜, 폴리비닐알코올 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 에리토르브산, 디부틸히드록시톨루엔, 부틸히드록시아니솔, 티오글리콜산 나트륨, α-토코페롤, 아세트산 토코페롤, L-아스코르브산, 아황산 수소 나트륨, 아황산 나트륨, 피로 아황산 나트륨, 염산 시스테인, 에데트산 나트륨 등을 들 수 있다.

본 발명의 제제의 바람직한 투여 방법은 주사이지만, 경피, 경점막, 경비, 경폐, 경구 등의 투여 형태를 이용할 수도 있다. 특히 바람직한 주사에서의 투여 방법으로서는 정맥 내, 피하 조직 내 또는 근육 내에 주사하는 방법이다. 또 적절한 투여 장치를 이용해서 예를 들면 종양, 염증 등의 병변부위로 직접 투여할 수 있다.

또 본 발명의 제제는 사용시에 제제를 희석액으로 희석한 후에 사용할 수 있다. 희석액으로서는 생리 식염수, 당액 등의 수액 등을 들 수 있다. 희석된 제제는 점적, 실린지 펌프 등에 의해 속도를 제어하면서 생체 내로 투여할 수 있다.

본 발명의 용액상 항체 제제는 예를 들면 무균 여과 등의 일반적인 수법에 의해 멸균한 후, 무균적 환경하에서 앰플, 바이알, 실린지 등의 주사제 용기 중에 봉입함으로써 주사제로서 사용할 수 있다. 또 용액상 항체 조성물을 용기 중에 봉입할 때에, 질소나 아르곤 등의 불활성 가스를 이용해서 용기 공간부의 가스 치환을 하는 것도 가능하다.

이하에 실시예를 나타내고, 본 발명을 구체적으로 설명한다. 그러나 본 발명은 이들 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1 시료 제제의 조제

표 1에 나타내는 처방 1 내지 5의 용액 조성물을 각각 조제하여 무균 여과 후, 유리제 바이알에 주입하고, 고무마개, 알루미늄 캡으로 밀봉하여 시료 제제로 했다. 이들 조작은 모두 무균적 환경하에서 행했다. 항체는 일본 특허공개 평5-304989 기재의 방법으로 제조한 강그리오시드 GD3에 대한 인간형 키메라 항체 KM-871을 이용했다.

	항체 농도(mg/mL)	첨가물	pH
처방 1	2	인산:10m㏖/L	6
처방 2	2	시트르산:10m㏖/L	6
처방 3	2	시트르산:10m㏖/L 만니톨:50mg/mL	6
처방 4	2	시트르산:10m㏖/L 글리신:23mg/mL	6
처방 5	2	시트르산:10m㏖/L 글리신:23mg/mL 폴리소르베이트80:0.1mg/mL	6

실시예 2 안정성 시험

실시예 1에서 조제된 각 시료 제제를 40℃에서 1개월간 보존한 후, 이하의 시험 항목에 대해 안정성 시험을 행했다.

(1) 내용액의 목시 관찰

각 시료 제제의 내용액을 백색 형광등 하에서 완만하게 교반하면서 목시로 관찰하여 탁함의 유무를 판정했다.

(2) 탁도 측정

시료 제제의 내용액을 석영 미크로 셀에 채취하고, 자외선 분광 광도계(히타치(Hitachi) U-3300형)로 파장 400㎚에 있어서의 흡광도(O.D.400)를 측정했다.

(3) 겔 여과 HPLC

시료 제제의 내용액에 대해서 이하의 조건으로 HPLC에 의한 분석을 행했다.

(HPLC 조건)

컬럼:TSKgel G3000 SWXL(도소(Tosoh Co.))

이동상:0.3mol/L 염화 나트륨을 포함하는 0.5mol/L 인산염 완충액

측정 파장:280㎚

유속:1mL/분

주입량:40μL

장치:LC-10A 시스템(시마즈 제작소(Shimadzu Corporation))

HPLC 차트상에서 미변화체 피크로부터 고분자량측으로 용출된 성분의 피크 면적의 총계를 가용성 회합체 피크 면적으로 해서 이하의 식 (1)에 의해 가용성 회합체 함량을 산출했다.

또 HPLC 차트상에서 미변화체 피크로부터 저분자량측으로 용출된 성분의 피크 면적의 총계를 화학적 분해물 피크 면적으로 해서 이하의 식 (2)에 의해 화학적 분해물 함량을 산출했다.

(1) 내용액의 목시 관찰 및 (2) 탁도(O.D.400) 측정의 결과를 표 2에 나타냈다.

표 2에 있어서 탁도(O.D.400)의 값은 측정치로부터 초기치를 빼고, 보존기간(40℃, 1개월) 중의 증가량을 나타낸 것이다.

40℃, 1개월 보존
	탁함의 유무(목시 관찰)	O.D.400의 증가량
처방 1	무	0.O02
처방 2	무	0.O02
처방 3	무	0.O02
처방 4	무	0.O02
처방 5	무	0.O02

모든 처방(처방 1 내지 5)에 있어서 내용액의 목시 관찰의 결과, 탁함은 관찰되지 않았다. 또 모든 처방에 있어서 탁도(O.D.400)의 증대는 거의 인지되지 않았다.

겔 여과 HPLC의 결과를 표 3에 나타냈다. 표 3의 값은 측정치로부터 초기치를 빼고, 보존기간(40℃, 1개월간) 중의 증가량을 나타낸 것이다.

40℃, 1개월 보존에 있어서의 증가량
	가용성 회합체(％)	화학적 분해물(％)
처방 1	0.20	1.48
처방 2	0.20	0.59
처방 3	0.22	0.47
처방 4	0.02	0.51
처방 5	0.04	0.42

처방 1(인산)과 처방 23(시트르산)의 비교에 있어서 화학적 분해물의 증가량은 처방 1보다 처방 2 및 3이 적었다. 이상으로부터 용액 중으로의 시트르산의 첨가에 의해 화학적 분해물의 증가를 저감시킬 수 있는 것이 분명해졌다.

또 처방 2 및 처방 4의 비교에 있어서 가용성 회합체의 증가량은 처방 2보다 처방 4가 적어 용액 중의 글리신의 첨가에 의해 가용성 회합체의 증가를 저감시킬 수 있는 것이 분명해졌다.

또한 처방 4에 폴리소르베이트 80을 첨가한 처방 5에 있어서도 용액의 안정성이 유지되었다.

실시예 3 불용성 응집체 억제 효과의 확인 1(시료 조제)

표 4에 나타내는 처방 7 내지 11의 용액 조성물을 각각 조제하고, 공경 0.2㎛의 필터로 여과하여 유리제 시험관에 주입했다. 시험관의 입구를 실리콘제 마개로 밀봉하여 시료 제제로 했다. 항체는 일본 특허공개 평5-304989에 개시되어 있는 강그리오시드 GD3에 대한 인간형 키메라 항체 KM-871을 이용했다.

	항체 농도(mg/mL)	첨가물	pH
처방 7	2	인산:50m㏖/L	6
처방 8	2	시트르산:0.1m㏖/L 글리신:10mg/mL	6
처방 9	2	시트르산:0.1m㏖/L 글리신:30mg/mL	6
처방 10	2	시트르산:50m㏖/L 글리신:10mg/mL	6
처방 11	2	시트르산:50m㏖/L 글리신:30mg/mL	6

실시예 4 불용성 응집체 억제 효과의 확인 1(안정성 시험)

실시예 3에서 조제한 각 시료 제제를 70℃, 270초간 보존한 후, 이하의 시험 항목에 대해 안정성 시험을 행했다.

(1) 내용액의 목시 관찰

(2) 탁도 측정

시료 제제의 내용액을 석영 미크로 셀에 채취하고, 자외선 분광 광도계(히타치 U-3300형)로 파장 400㎚에 있어서의 흡광도(O.D.400)를 측정했다.

(1) 내용액의 목시 관찰 및 (2) 탁도(O.D.400) 측정의 결과를 표 5에 나타냈다.

70℃, 270초간 보존 후
	탁함의 유무(목시 관찰)	O.D.400
처방 7	분명하게 백탁	2.471
처방 8	무	0.009
처방 9	무	0.011
처방 10	무	0.020
처방 11	무	0.033

처방 7에서는 목시 관찰의 결과, 분명한 백탁이 인지되고, 탁도(O.D.400)도 높은 값을 나타냈다. 한편, 처방 8, 처방 9, 처방 10 및 처방 11에서는 내용액의 목시 관찰의 결과, 탁함은 관찰되지 않고, 또 탁도(O.D.400)의 값도 처방 7에 비해 현저하게 낮은 것이 확인되었다.

실시예 5 불용성 응집체 억제 효과의 확인 2(시료 조제)

표 6에 나타내는 처방 12 내지 16의 용액 조성물을 각각 조제하고, 공경 0.2㎛의 필터로 여과하여 유리제 시험관에 주입했다. 시험관의 입구를 실리콘제 마개로 밀봉하여 시료 제제로 했다. 항체는 WO03/18635에 개시되어 있는 CCR4에 대한 인간형 CDR 이식 항체 KM8760을 이용했다.

	항체 농도(mg/mL)	첨가물	pH
처방 12	2	인산:50m㏖/L	6
처방 13	2	시트르산:0.1m㏖/L 글리신:10mg/mL	6
처방 14	2	시트르산:0.1m㏖/L 글리신:30mg/mL	6
처방 15	2	시트르산:50m㏖/L 글리신:10mg/mL	6
처방 16	2	시트르산:50m㏖/L 글리신:30mg/mL	6

실시예 6 불용성 응집체 억제 효과의 확인 2(안정성 시험)

실시예 5에서 조제된 각 시료 제제를 70℃에서 210초간 보존한 후, 이하의 시험 항목에 대해 안정성 시험을 행했다.

(1) 내용액의 목시 관찰

(2) 탁도 측정

(1) 내용액의 목시 관찰 및 (2) 탁도(O.D.400) 측정의 결과를 표 7에 나타냈다.

70℃, 210초간 보존 후
	탁함의 유무(목시 관찰)	O.D.400
처방 12	분명하게 백탁	0.698
처방 13	무	0.079
처방 14	무	0.006
처방 15	무	0.056
처방 16	무	0.024

처방 12에서는 목시 관찰의 결과, 분명한 백탁이 인지되고, 탁도(O.D.400)도 높은 값을 나타냈다. 한편, 처방 13, 처방 14, 처방 15 및 처방 16에서는 내용액의 목시 관찰의 결과, 탁함은 관찰되지 않고, 또 탁도(O.D.400)의 값도 처방 12에 비해 현저하게 낮은 것이 확인되었다.

실시예 7 가용성 회합체 및 화학적 분해물 억제 효과의 확인(시료 조제)

표 8에 나타내는 처방 17 내지 21의 용액 조성물을 각각 조제하여 무균 여과를 실시 후, 유리제 바이알에 주입하고, 고무마개, 알루미늄 캡으로 밀봉하여 시료 제제로 했다. 이러한 조작은 모두 무균적 환경하에서 행했다. 항체는 WO03/18635에 개시되어 있는 CCR4에 대한 인간형 CDR 이식 항체 KM8760을 이용했다.

	항체 농도(mg/mL)	첨가물	pH
처방 17	2	인산:50m㏖/L	6
처방 18	2	시트르산:0.1m㏖/L 글리신:10mg/mL	6
처방 19	2	시트르산:0.1m㏖/L 글리신:30mg/mL	6
처방 20	2	시트르산:50m㏖/L 글리신:10mg/mL	6
처방 21	2	시트르산:50m㏖/L 글리신:30mg/mL	6

실시예 8 가용성 회합체 화학적 분해물 억제 효과의 확인(안정성 시험)

실시예 8에서 조제된 각 시료 제제를 40℃에서 1개월간 보존한 후, 내용액을 이하의 조건으로 겔 여과 HPLC에 의해 분석해서 안정성을 평가했다.

(HPLC 조건)

컬럼:TSKgel G3000 SWXL(도소)

이동상:0.3mol/L 염화 나트륨을 포함하는 0.05mol/L 인산염 완충액

측정 파장:280㎚

유속:1mL/분

주입량:40μL

장치:LC-10A 시스템(시마즈 제작소)

HPLC 차트상에서 미변화체 피크로부터 고분자량측으로 용출된 성분의 피크 면적의 총계를 가용성 회합체 피크 면적으로 해서 이하의 식에 의해 가용성 회합체 함량을 산출했다.

<수학식 (1)>

또 HPLC 차트상에서 미변화체 피크로부터 저분자량측으로 용출된 성분의 피크 면적의 총계를 화학적 분해물 피크 면적으로 해서 이하의 식에 의해 화학적 분해물 함량을 산출했다.

<수학식 (2)>

겔 여과 HPLC의 결과를 표 9에 나타냈다. 결과는 측정치로부터 초기치를 빼고, 보존 기간(40℃, 1개월) 중의 증가량을 나타내고 있다.

40℃, 1개월간 보존에 있어서의 증가량
	가용성 회합체(％)	화학적 분해물(％)
처방 17	0.11	0.96
처방 18	-0.02	0.44
처방 19	0.02	0.47
처방 20	-0.05	0.35
처방 21	0.05	0.38

가용성 회합체 화학적 분해물 중 어느 것에 있어서나 처방 17과 처방 18, 처방 19, 처방 20 및 처방 21을 비교한 결과, 뛰어난 안정성을 가지는 것이 분명해졌다.

실시예 9 제제의 안정성 확인(시료 조제)

표 10에 나타내는 처방 22의 용액 조성물을 조제하여 무균 여과를 실시 후, 유리제 바이알에 주입하고, 고무마개, 알루미늄 캡으로 밀봉하여 시료 제제로 했다. 이들 조작은 모두 무균적 환경하에서 행했다. 항체는 W003/18635에 개시되어 있는 CCR4에 대한 인간형 CDR 이식 항체 KM8760을 이용했다.

	항체 농도(mg/mL)	첨가물	pH
처방 22	4	시트르산:2m㏖/L 글리신:22.5mg/mL 폴리소르베이트 80:0.2mg/mL	5.5

실시예 10 제제의 안정성 확인(40℃ 보존)

실시예 9에서 조제된 시료 제제를 40℃에서 1개월간 보존한 한, 내용액을 이하의 조건으로 겔 여과 HPLC에 의해 분석해서 안정성을 평가했다.

(HPLC 조건)

컬럼:TSKgel G3000 SWxL(도소)

이동상:0.3㏖/L 염화 나트륨을 포함하는 0.05mol/L 인산염 완충액

측정 파장:280㎚

유속:1mL/분

주입량:40μL

장치:LC-10A 시스템(시마즈 제작소)

<수학식 (1)>

<수학식 (2)>

겔 여과 HPLC의 결과를 표 11에 나타냈다. 결과는 측정치로부터 초기치를 빼고, 보존 기간(40℃, 1개월) 중의 증가량을 나타내고 있다.

40℃, 1개월간 보존에 있어서의 증가량
	가용성 회합체(％)	화학적 분해물(％)
처방 22	-0.02	0.46

시트르산 및 글리신을 포함하는 처방 22는 가용성 회합체 및 화학적 분해물의 어느 점에 있어서나 뛰어난 안정성을 가지는 것이 확인되었다.

실시예 11 제제의 안정성 확인(70℃ 보존)

실시예 9에서 조제한 제제의 내용액을 공경 0.2㎛의 필터로 여과하여 유리제 시험관에 주입했다. 시험관의 입구를 마개로 밀봉하여 시료로 했다. 70℃, 210초동안 보존한 후, 이하의 시험 항목에 대해 안정성 시험을 행했다.

(1) 내용액의 목시 관찰

(2) 탁도 측정

(1) 내용액의 목시 관찰 및 (2) 탁도(O.D.400) 측정의 결과를 표 12에 나타냈다.

70℃, 210초간 보존 후
	탁함의 유무(목시 관찰)	O.D.400
처방 22	무	0.014

시트르산 및 글리신을 포함하는 제제인 처방 22는 불용성 응집체의 점에 있어서도 뛰어난 안정성을 가지는 것이 확인되었다.

본 발명에 의해 용액 중에서의 항체의 안정화 방법 및 안정화된 용액상 항체 제제를 제공할 수 있다.

Claims

용액 중에서의 항체의 가용성 회합체의 생성, 화학적 분해물의 생성 및 불용성 응집체의 생성을 억제하는 방법이며, 0.01 내지 150mg/mL의 항체에 10 내지 30mg/mL의 글리신 및 0.1 내지 50m㏖/L의 시트르산을 첨가하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 비이온성 계면활성제를 더 첨가하는 것인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 용액의 pH가 4 내지 7의 범위 내인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인 방법.
제1항 또는 제2항에 있어서, 항체가 강그리오시드 GD3에 대한 항체 및 CC 케모카인 수용체 4(이하, CCR4라고 한다)에 대한 항체 중 어느 한 항체인 방법.
10 내지 30mg/mL의 글리신, 0.1 내지 50m㏖/L의 시트르산 및 0.01 내지 150mg/mL의 항체를 함유하는 것을 특징으로 하는, 항체의 가용성 회합체의 생성, 화학적 분해물의 생성 및 불용성 응집체의 생성이 억제된 용액상 항체 제제.
제6항에 있어서, 비이온성 계면활성제를 더 함유하는 것인 제제.
제6항 또는 제7항에 있어서, 용액의 pH가 4 내지 7의 범위 내인 제제.
제6항 또는 제7항에 있어서, 항체가 인간화 항체 또는 인간 항체인 제제.
제6항 또는 제7항에 있어서, 항체가 강그리오시드 GD3에 대한 항체 및 CCR4에 대한 항체 중 어느 한 항체인 제제.
용액 중에서의 항체의 가용성 회합체의 생성, 화학적 분해물의 생성 및 불용성 응집체의 생성을 억제하는 생성 억제제이며, 10 내지 30mg/mL의 글리신 및 0.1 내지 50m㏖/L의 시트르산을 유효 성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 생성 억제제.
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