JPS62244441A

JPS62244441A - 抗体固定化担体

Info

Publication number: JPS62244441A
Application number: JP61087838A
Authority: JP
Inventors: Toshiharu Motokubota; 本窪田　利晴; Yutaka Morise; 森勢　裕
Original assignee: Green Cross Corp Japan
Current assignee: Mitsubishi Tanabe Pharma Corp
Priority date: 1986-04-16
Filing date: 1986-04-16
Publication date: 1987-10-24
Also published as: JPH0439380B2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】〔産業上の利用分野〕本発明は細胞培養液から蛋白質を回収するために使用さ
れる抗体固定化担体に関する。さらに詳しくは、細胞培
養液からの蛋白質の精製において、閉鎖系において特に
有効に使用することの出来る抗体固定化担体に関する。

〔従来技術〕

抗体固定化担体は抗体を水不溶性担体（抗体固定化担体
）に結合さ−けだものであり、生体成分（血液、尿等）
、細胞培養液、蛋白抽出液等から特定成分を精製する際
に使用されるアフィニティークロマトグラフィー用担体
として用いられてきた。

ところで、従来の精製工程は開放系で行われていたため
、当該工程における滅菌処理についてはほとんど考慮が
されず、また、滅菌の意義もなかった。ところが、最近
では開放系ではな（、全ての工程を連続して行う閉鎖系
（インライン系）での処理が種々検耐されている。この
インライン系による精製は自動化、小型化、省力化等の
各種の利点がある。また、使用するカラムは必要に応じ
て交換、取替が出来るようにカートリッジタイプのもの
を用いることも可能となる。

〔発明が解決しよ・うとする問題点〕

このようなインライン系においては、外部からの細菌の
侵入がないので、無菌的に精製処理をすることが可能と
なる。従って、精製工程中の当該ライン系内部からの汚
染を防止することは極めて意義あることである。

一方、細胞培養により有用物質を生産する場合、培地に
血清等を添加するので、コス１−の大部分が培地費用と
なるが、もし有用物質を回収した後の培地が無菌であれ
ば、そのまま再利用が可能となり、培地コストを大幅に
軽減することが可能となる。

従って、精製工程中の細菌の汚染を防止すること、特に
、有用物質を回収した後の培地を無菌にすることが待望
される。

本発明の目的は、そのために使用されうる抗体固定化担
体を捉供することである。

〔問題点を解決するための手段〕

かかる目的を達成するために、本発明の抗体固定化担体
ば滅菌処１’！ｌｌを施したことを特徴とするものであ
る。

本発明において使用される抗体は、アフィニティークロ
マトグラフィーで使用されうるちのであれば特に制限は
なく、千ツク１１−ナル抗体、ポリクローナル抗体のい
ずれでもよい。抗体としては具体的には、たとえば、各
種インターフェロン（ＩＦＮ−α、［ＦＮ−β、ＩＦＮ
−ｒ）抗体、組織プラスミノーゲン活＋ｊｌ化因子（Ｔ
ＰＡ）抗体、各種インターロイ−トン（ＩＬ−１、ＩＬ
−２、ＩＬ−３）抗体、コロニー形成刺激因子（ＣＳ　
Ｆ）抗体、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）抗体、上皮増殖因子
（ＥＧＦ）抗体、リンフォトキシン（１，Ｔ）抗体、Ｂ
細胞成長因子（ＢＣＧＦ）抗体、ウロキナーゼ（ｔＪＫ
）抗体、プロウロキナーゼ（Ｐｒｏ−ＵＫ）抗体、エリ
スロボエチン（ＥＰＯ）抗体、カリクレイン（ＫＬ）抗
体、アルファフェトブ■コテイン（ＡＰＩＩ）抗体、ア
ンチトロンビン■（ＡＴ−■）抗体、プラスミノーゲン
抗体、ＨＢｓ抗体、ＨＢ　ｅ抗体、Ｈｒ３　ｃ抗体、癌
胎児性抗原（ＣＥＡ）抗体、フェリチン抗体、β２−マ
クログロビン抗体などが用いられる。

固定化用担体としても公知のものが使用される。

好ましくは、たとえば、セルロース、デキストラン、多
孔性ガラス〔シリカゲル、コンドロールド・ブア・グラ
ス（ＣＰＧ）等〕、キトサン、アガロース、ポリアクリ
ルアミド、セラミック、ナイロン、アミノ酸共重合体等
が例示される。特に好ましくは、セルロース、多孔性ガ
ラス、キサトン等が使用される。

固定化担体の形状にも特に限定はなく、球状、破砕状、
膜状、繊維状、管状、板状等が例示される。

固定化用担体の市販品としては、たとえば、５ｅ−ｐｈ
ａｒｏｓｅ　＠（ファルマシア社）、ホルミルセルロフ
ァイン（生化学工業）　、ＣＰＧ　（エレクトロ・ニュ
クレオニソク社）、マイクロビーズシリカゲル（富士デ
ビソン）、ＴＲｌ５ＡＣＲＹＬ■　（ＬＫＢ社）、キト
パール＠（富士紡）、ＺＲＴＡＰＦＴＮＩＴＹＯ（キュ
ノ社）などがある。

固定化用担体への抗体の固定化も公知の手段によって行
えばよく、たとえばシアン化ブロム法、グルクルアルデ
ヒド法、過ヨウ素酸法、シラン化法等が例示される。

かくして得られた抗体固定化担体は滅菌される。

抗体固定化担体を滅菌する方法として、加熱処理、紫外
線照射処理などが挙げられるが、好適には、加熱処理が
用いられる。加熱処理は夾雑する可能性のあるウィルス
または細菌が不活化する条件下で行われる。例えば、５
５〜７０℃で１〜１５時間程時間和れる。また、この時
、抗体固定化担体は水溶液中に浸消し、１１１５〜８の
条件下で処理することが望ましい。

さらに加熱時は固定化抗体の安定化のため安定化剤を存
在させることが好ましい。安定化剤としては、糖、糖ア
ルコール、アミノ酸などが用いられる。これらは併用す
ることもできる。

糖としてはサッカｌ−１−ス、マルトース、ラフィノー
スなどが、糖アルコールとしてはソルビ１−一ルなどが
、アミノ酸としてはグリシン、アラニン、リジン、アル
ギニンなどが用いられる。

その添加量は、糖、糖アルコールで３０〜９０ｗ／ｖ％
、アミノ酸で５〜２０ｗ／ｖ％程度が例示される。

滅菌処理した抗体固定化担体はｐｌ（６〜８の低イオン
強度の水性溶媒を封入し、４°Ｃ前後で保存しておくこ
とが望ましい。この場合、公知の防腐剤（例えば、アジ
化す１〜リウムなど）を用いることもできる。

本発明の抗体固定化担体は、通常カラムあるいはカート
リッジとして用いられる。

滅菌処理を施した抗体固定化担体の精製工程への導入は
、たとえば次のようにして行・うことが出来る。

培養容器（タンク等）や粗製バルクプールタンク（無菌
）の出口ラインにフィルターを接続し、その後に抗体固
定化担体を、たとえばカラムまたはカーＩ・リッジの態
様として接続する。フィルターは処理溶液中の細胞、細
胞片、不溶性物の除去を目的とし、その孔径は、処理溶
液に応じ選択できる。フィルターも）滅菌されているこ
とが好ましく、滅菌処理、たとえばオーＩ・クレープ滅
菌やスチーム滅菌が可能な材質を選択する。」二記のシ
ステムは容易に構築でき、当該システムを通過した試料
液、たとえば培養液は無菌であり、そのまま再利用が可
能である。

〔作用・効果〕

本発明により得られた固定化担体は滅菌処理が施されて
おり、精製工程に、試料溶液を汚染することがない。

従って、本発明による滅菌処理を施した固定化担体は、
たとえば閉鎖系（インライン系）でのアフィニティクロ
マトグラフィー用担体として極めて有用である。ずなわ
ら試料溶液（培養液等）をフィルター（１ｉ１常の方法
により滅菌したもの）に１ｆｆｉ／ｐｉ、Ｌ、精製対象
物中の細胞、細胞片、不溶物等を除去した後、本発明の
滅菌固定化Ｉ」１体を連続して、有用物質を取り除いた
試料液は無菌であるため再利用が容易となり、その結果
、有用物質の生産コストを大幅に低減することができる
。

〔実施例・実験例〕

本発明の詳細な説明するために実施例、実験例を挙げる
が本発明はこれらによって限定されるものではない。

以下に示した滅菌処理の実施例においては、大腸菌に１
２株を使用し、その滅菌効果の判定には、ミリボア社製
：ウメ−ターサンプラ（Ｃｏｌｉ−ｃｏｕｎ　ｔ）によ
るコロニー数測定によった。

実施例１精製ＩＦＮ−αをウマに免疫して得られたポリクローナ
ルＩＦＮ−α抗体をシラン化法で処理したシリカゲル（
富士デビソン社製二マイクロビーズシリカゲル、５００
人）固定化し、このゲルを３０〜９　Ｑ　ｗ　／　ｖ％
の糖、糖アルコール及び５〜２０ｗ　／　ｖ％のアミノ
酸水溶液（各２０ｍ１）に固定化ゲル（各２ｇ）を懸濁
した。その後、大腸菌の希薄溶液を添加し、ｐ１１７の
条件下、６０℃で１〜１５時間加熱した。加熱処理後の
各懸濁液についてコロニー数を測定した。その結果を表
１に示した。

表１：抗体固定化担体の糖、糖アルコール及びアミノ酸
存在下での滅菌加熱処理前の大腸菌濃度ニア８１１コロニー／　ｍ１表
中の数字は加熱処理後の大腸菌（生菌）濃度（コロニー
／「り実施例２（ｉｏｗ／ｖ％の糖、糖アルコール及び２０ｗ／■％の
アミノ酸水溶液（各２００ｍ／）に大腸菌の希薄水溶液
を添加した溶液を、モノクローナル■ＦＮ−γ抗体をＣ
ＮＢ　ｒ活性化法により固定化した７、ｌ１ＴＡｌ？Ｆ
ＩＮＩＴＹ＠　　（ギュノ社製）カートリッジに循環し
、ｐＨ１７で５５〜７０℃で１０時間加熱処理を実施し
た。加熱処理後、循環液の大腸菌（生菌）濃度を測定し
た。その結果、表２に示すように、５５〜７０℃での加
熱処理後、大腸菌（生菌）は検出されなかった。

（以下余白）表２：抗体固定化担体の１０時間加熱処理による滅菌加熱処理前の大腸菌温度：４５９４コロニー／　ｍ１表
中の数字は加熱処理後の大腸菌（生菌）ｉｓ度（コロニ
ー／　ｍｌ　）実施例３抗体固定化担体の加熱滅菌後、固定化担体の安定性を調
べた。

［１，１ポリクローナルＩＦＮ−α抗体固定化シリカゲ
ルを６０Ｗ／Ｖ％ソルビトール調製し、６０℃、１０時間加熱処理した後、Ｉ　Ｆｌｌ
−αの精製を行い、ＩＦＮ−α回収率を非加熱の抗体固
定化ゲルと比較した。

加熱、非加熱の抗体固定化シリカゲルをカラム（１０Ｘ
２０ｍｍ）にそれぞれ充填し、０．１Ｍリン＃緩衝液（
ｐＨ　７．　５　）で平衡化した後、粗製ＩＦＮ−αを
チャージし、ＩＦＮ−αを担体に吸着させた。その後、
未吸着蛋白質などを、前述の緩衝液で洗浄した後、０．
１Ｍクエン酸緩衝液（ｐｌ＋　２．　０　）で溶出を行
い、ＩＦＮ−αを回収した。その結果を表３に示す。加
熱処理後も抗体固定化担体は抗原結合能を保持していた
。

表３（２）　　モノクローナルＴＮＦ抗体を過ヨウ素酸法に
よす固定化したホルミルセルロファイン（生化学工業製
）を５Ｑｗ／ｖ％蔗糖水溶液中でｐｌ＋を７に調製し６
０℃、１０時間の加熱処理を行った。加熱、非加熱の抗
体固定化ホルミルセルロファインをそれぞれカラム（１
０×２０１１１Ｉ１１）に充填し、ＴＮＦの精製回収率
を比較した。０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７、５）で平
衡化したカラムに粗製ＴＮＦをチャージした後、未吸着
蛋白質を前述の緩衝液で洗浄した。カラムに吸着したＴ
ＮＦは３．５Ｍ　　ＫＳＣＮ（ｐＨ８．０）溶液で溶出
回収した。その結果を表４に示す。

表４（３）　　モノクローナルＩＦＮ−ｒ抗体を固定化した
Ｚ［１ＴＡＰＦＩＮＩＴＹ■カートリツジ（キュノ社製
）に、ｐ１１７の条件下で６０℃に加熱した２０ｗ／ｖ
％グリシン水溶液を１０時間循環させ、加熱処理を行っ
た。加熱、非加熱の抗体固定化カートリッジを用い、粗
製ＩＦＮ−ｒの精製を行った。

０．１Ｍリン酸緩衝液（ｐｌ（７，５）で平衡化したカ
ートリッジに粗製ＩＦＮ−ｒをヂャージし、ＩＦＮ−γ
を吸着させた。前述の緩衝液でカートリッジを洗浄した
後、３．５Ｍ　　ＫＳＣＮ　（ｐｌ＋８．０）溶液でＩ
ＦＮ−γを回収した。表５にその結果を示す。

表５特許出願人　株式会社　ミドリ十字手金ノと主市１１三書（自発）昭和６１年６月１３日１、事件の表示昭和６１年特許願第８７８３８号２、発明の名称抗体固定化担体３、補正をする者事件との関係　特許出願人氏名（名称）　株式会社　ミドリ十字４、代理人　■５４１住所　大阪市東区平野町４丁目５３番地３二１−ライフ
平野町４０６号置　（Ｏ［ｉ）　２２７−１１５６明細書の１発明の詳細な説明」の欄６、補正の内容（１）明細書第５頁第７行、［プアー１を「ボア」に訂
正する。

（４）明細書第８頁第１６行、「方法」のあとに「であ
る高温高圧蒸気」を加入する。

（５）明細書第１１頁第５行、ｒｃＮＢｒ活性化法」を
「過ヨウ素酸法」に訂正する。

（６）　　明細書第１２頁表２中、（７）　　明細書第１３頁最下行、「過ヨウ素酸法」を
「ホルミル化法」に訂正する。

（８）　　明細書第１４頁第２〜３行、「調製」を「調
整」に訂正する。

Claims

【特許請求の範囲】

（１）滅菌処理を施したことを特徴とする細胞培養液か
ら蛋白質を回収するために使用される抗体固定化担体。
（２）固定化担体がセルロース、デキストラン、多孔性
ガラス、キトサン、アガロース、ポリアクリルアミドお
よびアミノ酸共重合体から選ばれた一種である特許請求
の範囲第（１）項記載の抗体固定化担体。
（３）滅菌処理が５５〜７０℃で１〜１５時間の加熱処
理である特許請求の範囲第（１）項記載の抗体固定化担
体。
（４）加熱処理が糖、糖アルコール、およびアミノ酸か
ら選ばれる少なくとも一種の安定化剤の存在下に行われ
ることを特徴とする特許請求の範囲第（３）項記載の抗
体固定化担体。