JPH04506075A - インターフェロン精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 インターフェロン精製方法 本発明は粗製ヒト白血球インターフェロンの精製方法に関する。

インターフェロンは外部刺激例えば感染症を引き起こすウィルス、に応答して体 内で天然に生産される一部のタンパク質である。さらに、インターフェロンはあ る種のウィルスおよび腫瘍疾患に関連して血中に少量存在することもある。イン ターフェロンは感染に対する防衛の一部として体内で形成され、またウィルス感 染に対する防護において直接の防衛機構を構成する。

いくつかのタイプのインターフェロンが知られている。

例えば白血球により産生されるα−インターフェロン、結合組繊細胞により産生 されるβ−インターフェロンおよび免疫能細胞により産生されるγ−インターフ ェロンが挙げられる。

白血球から産生される天然インターフェロンは、種々のα−インターフェロンサ ブタイプまたはインターフェロン成分の天然混合物より成る。それら種々のイン ターフェロン成分はインターフェロンα−１、インターフェロンα−２、インタ ーフェロンα−３などと称される。

さらに、インターフェロンα−２ａ１α−２ｂ、α−２ｃなどと称される種々の α−インターフェロン成分内の対立遺伝子変異が存在する。

“カンチル法（Ｃａｎｔｅｌｌ　ｍｅｔｈｏｄ）　”により白血球から産生され たインターフェロン、いわゆるＰＩＦ−インターフェロンまたはカンチル−イン ターフェロンは１９７１年以来様々なウィルスおよび腫瘍疾患の治療に用いられ ている。１９７０年代中に起こった様々な腫瘍およびウィルス疾患に対する薬剤 としてのインターフェロンへの期待は、専ら、カンチル−インターフェロンを用 いて得られた臨床結果に基づいている。

１９８０年代初期にインターフェロンはクローン化され、そして組換え−ＤＮＡ −技術を用いて製造されたインターフェロンは今日約５０ケ国において医薬とな っている。

白血球から製造された天然インターフェロンは、約２０の異なるα−インターフ ェロンの混合物より成っている。

組換えインターフェロンはクローン化されたα−インターフェロンサブタイプよ り成る。

本発明は天然白血球インターフェロン精製のための新しい技術に関する。１９７ ０年代初期にフィンランドで元々製造された最初のカンチル−インターフェロン は、１％のオーダーという比較的低い純度を有する。それ自体で有用ではあるが 、医薬の純度および再現性についての今日の厳しい要件からすれば、なお望まれ るべき点が多（ある。

本発明の主な目的は、高度に精製された臨床用白血球インターフェロンの製造方 法を提供することにある。

本発明のもう一つの目的は高度に再現性があり、比較的低廉でかつ比較的実施し やすいかかる精製方法を提供することにある。

以下の説明から明確となろうこれらのおよびその他の目的のために、本発明は、 以下の諸段階、すなわち、ａ）粗製ヒト白血球インターフェロンをイムノアフィ ニティー吸着カラムにかける； ｂ）吸着されたインターフェロンを緩衝液を用いて前記カラムから溶出する： Ｃ）段階ｂ）より得られる溶出液をチオシアネート溶液を用いて沈殿または交換 クロマトグラフィーにより濃縮し；そして ｄ）段階Ｃ）で得られた沈殿インターフェロンを回収する段階より成る粗製ヒト 白血球インターフェロンの精製方法を提供する。

かかる方法においては、イムノアフィニティー吸着カラムの調製には、そこから ポリクローナル抗体が単離されカラムマトリックスに共有結合的に結合される抗 血清を発生させるための組換えインターフェロンを用いるのが好ましい。

本発明の方法は好ましくは、イムノアフィニティー吸着カラムからの溶出液をイ オン交換カラムを用いて濃縮するという更なる段階を用いて行われる。インター フェロンはかかるイオン交換カラムからｐＨを増加させることにより適切に溶出 される。かかるｐｎ増加は緩衝溶液をカラムに適用することにより得ることがで きる。

例えばチオシアネート溶液を用いる沈殿段階に加えて、本発明方法は、かかる沈 殿より得られるインターフェロンがその回収前にエタノール中で再度沈殿される もう一つの沈殿段階を含んでいてもよい。

−回または二回の沈殿後に得られるインターフェロンは好ましくはゲル濾過に付 しそして２８０ｎ１１に吸収を有する適切な排出液画分を集めそして回収する。

沈殿段階においてはカリウムチオシアネートの溶液を用いるのが好ましい。他の 沈殿剤はトリクロロ酢酸および硫酸アンモニウムである。前段階よりの溶出液を 濃縮するためのイオン交換カラムよりのインターフェロンの溶出は、緩衝溶液を 適用してｐｎを増加させることによって行うのが適切である。かかるｐｎ増加は 好ましくは中性より高いｐｉ、例えば約８以上まで行われる。

さらに、本発明は、本明細書に記載の方法により調製された精製ヒト白血球イン ターフェロンを包含する。

以下本発明をさらに特定の実施例によって説明するがそれら実施例は請求の範囲 に規定された以外の方法で本発明の範囲を制限するものとして解されてはならな い。

抗血清の生産には、以前に免疫されていない健常ヤギを用いる。免疫に用いる抗 原はＵｍｅａ大学で製造され公開された欧州特許出願第８６９０３６５０．９号 、公開Ｎｏ、　０２６３１０２に詳述されている組換えインターフェロン、α− ８８である。

この組換えインターフェロンを生理学的燐酸緩衝液に溶解し、その溶液の比活性 を約２　Ｘ　１０’　ＩＵ／　ｍｇとする。この溶液を初回免疫として“フロイ ント完全アジュバント“と共にヤギに投与する。次に“フロイント不完全アジュ バント”を用いた免疫を１週間に１回または２週間毎に０、２諺１〜１．０■ｌ の容量を用いて行う。

それらヤギを第３回目の免疫後に２週間毎に頚静脈を介して放血させる。排出血 液を抗−インターフェロン抗体含量および非特異結合について検査する。抗体含 量は中和力価、すなわち、インターフェロン感受性生物学的系（ｂｉｏｌｏｇｉ ｃ　５ｙｓｔｅｓ）における抗体により失活されるインターフェロン量を測定す る力価を測定するアッセイを用いて分析する。特異および非特異結合は慣用の“ ウェスターンプロット”により測定される。

通常各回あたり１５０〜２００ｍ１の血液を放血させる。その鮮血を冷蔵庫に２ ４時間保存するとこの間に凝固する。その血液を次いで遠心分離しそして血清を 回収する。このインターフェロンに対する抗体を含む血清を後述の如くさらなる 精製に付す。

実施例　２ イムノアフィニティー吸着カラムの調製実施例１で得られた抗血清を一夜放置さ れる遠沈ビン内でゆっ（り撹拌しながら硫酸アンモニウム（２５９）　／抗血清 （ｌｏｏｇ）を用いて沈殿させる。翌日に抗血清を４０００ｇで３０分間遠心分 離する。上清を捨てそして沈殿を硫酸アンモニウム（１，７５ｖｏ／／　ｌ’） を用いて２回洗浄してヘモグロブリンおよびアルブミンの量を減少させる。その 沈殿を透析チューブに移しそして透析を水および酢酸ナトリウム緩衝液０．０５ Ｍ　ＮａＡｃ、０．０２１Ｍ　ＨＡｃ、　ｐＨ５，０に対して交互に行う。

透析中にリポタンパク質より成る沈殿が生じるので、その沈殿を４０００ｇで３ ０分間遠心分離して除去する。γ−グロブリン含有上清を酢酸緩衝液、ｐＨ５， ０、で平衡させたＤＥＡＥ　５ｅｐｈａｒｏｓｅ＠　ＦＦ含有カラム（充填ゲル （２５ｍＪ）／粗製抗血清（１００ｍＪ）　）にかける。透析された抗血清をカ ラムに通しそして約１カラム容の酢酸緩衝液で溶出する。

容量＝４４５諺ｌ 吸光度２８０ｎ瀉：　３５．２ ＩｇＧ濃度：　２５．３１１９／　ｍｌ総ＩｇＧ　：　１１．３９ 回収率：　１６ｍｇＩｇＧ／ｍ／血清 免疫グロブリン含有溶出液をカップリング緩衝液、０．５ｍｏｌ／　１重炭酸ナ トリウムおよび０．５ｍｏＪ／　ｌ塩化ナトリウムに対して透析する。

５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４ＢのＢｒＣＮ活性化５ｅｐｈａｒｏｓｅをガラス漏斗上 蒸留水で洗浄しそして吸引乾燥する。約４０〜６０ｇ（ゲル）　／　ｑ　（Ｉｇ Ｇ）を秤量し、そして２　ｍａｄ／　ｌ燐酸カリウム緩衝液、ｐＨ１１，０に懸 濁する。そのゲルスラリーを水浴上で冷却する。ＢｒＣＮを水に溶解する（０． ０５〜０．１ｇ（ＢｒＣＮ）　／　Ｉｌｌり　、　３．３９　（ＢｒＣＮ）　／ 　１００９　（吸引乾燥ゲル）を添加しそしてその５ｅｐｈａｒｏｓｅを磁気撹 拌装置上でゆるやかに撹拌しながら１０分間活性化する。そのゲルスラリーをガ ラス漏斗に移しそして溶出液が中性反応を示すまで冷蒸留水で洗浄する。その活 性化ゲルを免疫グロブリン溶液と混合しそして室温で一夜ゆるやかに撹拌しなが らインキュベートする。

そのゲルをガラス漏斗に移しそしてその濾液のタンパク質含量を＾ｔｓｏ測定に よって分析する。ゲルを再びカップリング緩衝液に懸濁しそして０．　Ｌ鷹ｏ１ ／ｌグリシンを添加して残ったカップリング部位をブロックし、そしてそのゲル を室温で少（とも１時間インキュベートする。このブロッキング手順の後、その ゲルを０．０２ｍｏｊ’／　ｌ燐酸緩衝液、０．２ｍｏｌ／　ｌ塩化ナトリウム 、ｐＨ７，０、および０．１ｙａｌｌｌクエン酸、０．１５ｍｏＵｌ塩化ナトリ ウムで繰り返し洗浄する。そのゲルを０．０４％アジ化ナトリウムを保存剤とし て含む燐酸緩衝食塩水に保存する。

カップリング手順ニ ア５０ｍ／の５ｅｐｈａｒｏｓｅ　４Ｂをガラス漏斗上２．５１の蒸留水で洗浄 し、吸引乾燥する。“乾燥“ゲルの重量は５２ｈである。そのゲルを５００ｍ１ の２．０ｍｏｌ／　ｌ燐酸カリウム緩衝液、ｐｎｉｔ、ｏに再懸濁しそして水浴 上で冷却する。１７．３９のＢｒＣＮを２００ｍ／の水に溶解しそしてゲルスラ リーに添加しそしてそのゲルを１０分間活性化する。そのゲルを７１の冷蒸留水 で洗浄する。溶出液の反応は中性である。

そのゲルをカップリング緩衝液、０．１ｍｏｊ’／１重炭酸ナトリウム、０．５ ■ｏｌ／ｌ塩化ナトリウム、ｐｔｌＬ　５に対して透析された免疫グロブリン画 分と混合し、そして室温で一夜インキユベートする。翌日にそのゲルを濾過しモ して１容のカップリング緩衝液で洗浄し、そして濾液および洗浄液中のタンパク 質濃度を＾ｔｓｏにより測定する。

＾２８゜（濾液）　：　Ｌ８４ｍｇのタンパク質Ａ、。（洗浄液）　：　１６５ ｍｇのタンパク質全体＝３４９■ｇのタンパク質 カップリング効率：　９６．９％ そのゲルをＱ、１ｍｏｌ／ｌ’グリシン含有カップリング緩衝液に再懸濁して残 留活性化部位を１時間ブロックする。

そのゲルを燐酸緩衝液、ｐＨ７，０、およびクエン酸で洗浄する。そのゲルを０ ．０４アジ化ナトリウムを保存剤として含む燐酸緩衝食塩水中に保存する。

この製造においては、軟層（ｂｕｆｆｙ　ｃｏａｔ）を粗製インターフェロンの 調製に用いる。軟層は病院における通常の血液銀行での廃棄物である。使用され る軟層は４８時間より古くはな（、また大部分の軟層は２４時間より古くない。

軟層から白血球を調製するために、その赤血球を、塩化アンモニウムを最終濃度 が０．８３％となるように添加することにより溶解させる。室温で１０分後に、 白血球を３００ｍ１１分の流速でバスケット遠心分離機で遠心分離する。それら 白血球をＰＢＳに懸濁する。このプロセスをもう一度繰り返し、次いで得られた 白血球を培地に添加する。

精製白血球を以下の添加剤を含むイーゲル培地（Ｅａｇｅｌｓ　ｍｅｓ）に懸濁 する：２５１１９／菖ｌ　ネオマイシン ３ｍｑ／ｍｌ　）リシン（７ｒｉｃｉｎｅ）６％ポリエチレングリコール６００ ０で沈殿させた４％ヒト血漿（Ｉｎｇｌｏｔ　ｅｔ　ａｌ、、＾ｃｔａ　Ｖｉｒ ｏｌ、１９　：　２５０〜２５４゜α−ガンマ血清に代えてＰＥＧ−分別血漿を 用いることだけが本来のカンチル法との主な相違点である。細胞は各々約２、Ｏ ｌを含有する４１丸型ビン内で約１０７細胞個７ｍｌの濃度で用いられる。３７ ℃の水浴上で磁気撹拌を行う。

細胞培養液を１００１Ｕ／ｍｌ粗製白血球インターフェロンを添加することによ りプライムする。２時間のブライミングの後、仙台ウィルスを約１５０赤血球凝 集単位／ｗ＋１（約４０ｍ１仙台ウィルス／ｌ）添加する。３７℃で２０時間後 白血球を遠心分離または濾過により除去する。粗製インターフェロンは粗製前に 最長７日間保存されることになる。

実施例３に従って得られた粗製インターフェロン溶液をＦｉｌｔｒｏｎ系、分子 量ｔｏ、　ｏｏｏフィルターを用いて限外濾過により濃縮する。限外濾過を行う 前に、粗製インターフェロンをＱ、　４５１１１膜（ＭｉＬｌｉｐｏｒｅ、　Ｐ ｒｏｓｔａｋ）を通して濾過して細胞および細胞破片を除去する。インターフェ ロン溶液は約５倍濃縮される。

実施例２に記載の如く得られたアフィニティーカラム（ＢＰ　１１３／１５．　 Ｐｈａｒｍａｃｉａ、ゲル容量：約１．７）を０．０２ＭＴｒｉｓ−ＨＣｊ、　 ０．２Ｍ　ＮａＣ／、　０．００１Ｍ　ＥＤＴ＾、ｐＨ８，Ｑ（Ｔｒｉｓ緩衝液 ）で平衡させる。実施例４で得られたインターフェロン溶液を次いで約４１７時 の流速でカラムに通す。インターフェロン溶液がカラムを通過した後、そのカラ ムを溶出液の吸光炭がゼロかほぼゼロになるまでＴｒｉｓ緩衝液を用いて洗浄す る。

アフィニティーカラムをＯ，１Ｍクエン酸、０．１５Ｍ　ＮａＣ／。

ｐＨ２，ｏを通すことによって脱着する。このクエン酸緩衝液は約３１７時の流 速でカラムに通す。このカラムの酸性化によってカラムを介して取り込まれたイ ンターフェロンが脱着される。２８０ｎｓでの吸収が止むまで脱着を続け、そし て集めたインターフェロン溶液を回収する。その容量は約５１である。

実施例５による脱着により得られたインターフェロンをクエン酸緩衝液、ｐＨ２ ，０で平衡させたイオン交換カラム（Ｓ−３ｅｐｈａｒｏｓｅ＠　）に通す。次 にそのイオン交換体をクエン酸緩衝液を用いて洗浄し、そして約ｐＨ８までのｐ ｉ（増加を生じるＴｒｉｓ緩衝液の添加によりｐＨを増加させることによってイ ンターフェロンを溶出させる。

実施例６で得られたインターフェロン溶液に５ＭＫＳＣＮおよびヒト血清アルブ ミン（Ｈ９＾）を撹拌しながら０、５Ｍ　ＫＳＣＮ　（Ｉｆｎ　：　Ｈ９Ａ重量 比約１　：　５〜１０）の最終濃度となるように注意深（添加する。次に（ＩＭ ）塩酸をｐｆｌが約８から約２．０に下がるまで添加する。濁った沈殿を５００ ０　ｒ　７分で３０分間遠心分離する（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ−２１）　ｏ上清を 注意深く回収する。

実施例７におけるナトリウムチオシアネート沈殿で得られたインターフェロン沈 殿を９５％酸性エタノール中で約−２０℃の温度を有するＨ８＾（Ｉｆｎ　：　 Ｉｔｓ＾重量比は約１：５〜１０）（約３００ｍ１）と共にスラリー化する。そ のスラリーを５ｆ１００　ｒ　７分で３０分間遠心分離する。インターフェロン 含有上清を回収しそしてそのｐＨを０．１Ｍ　Ｎａ０ｆｌの添加により徐々にｐ ｆｌｌｌｌ、　０まで増加させる。次にその沈殿を５０００　ｒ／分で３０分間 遠心分離する（Ｂｅｃｋｍａｎ　Ｊ−２１）　ｏ上清を傾瀉しそして沈殿をｌＯ ■ｌの０．１５Ｍ燐酸ナトリウム緩衝液＋０．５Ｍ　ＫＳＣＮ、　ｐＨ８，０に 溶解する。

実施例８で得られたインターフェロン溶液を遠心分離しモしてカラム（八Ｃ＾− ５４、ＩＢＦ、フランス、２．５Ｘ９０ｃ鳳）でのゲル濾過に付す。次にインタ ーフェロンビークを回収し、ＵＶ光、２８０ｎ■で検出する。得られるインター フェロンの純度は約８０％であり、また（ウェスターンプロットによる）アッセ イにより、カンチル型インターフェロン出発材料に存在するすべてのインターフ ェロン成分を含むことがわかる。

本発明方法は多（の長所を提供するが、中でも次の点が挙げられる： ウィルス感染リスクが効率的に排除される、収率が高い、 実施が簡単で、信頼性がある。

以上の実施例は本発明の範囲を制限するものとして解されてはならない。それら は単に本発明の詳細な説明の目的で示したに過ぎない。自明なことであるが、記 載された本発明に照らして多（の改変、変形が当業者に可能である。本発明の範 囲は請求の範囲によって規定されるべきものである。

補正書の翻訳文提出書 （特許法第１８４条の８） 平成３年１２月１９日

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．ａ）粗製ヒト白血球インターフェロンの溶液をイムノアフィニティー吸着カ ラムにかけ； ｂ）吸着されたインターフェロンを緩衝溶液を用いて前記カラムから溶出させ； ｃ）段階ｂ）より得られる溶出液をチオシアネート溶液を用いて沈澱または交換 クロマトグラフィーにより濃縮し；そして ｄ）段階ｃ）で得られた沈澱インターフェロンを回収する 諸段階より成る粗製ヒト白血球インターフェロンの精製方法。
2. ２．段階ｂ）より得られる溶出液はイオン交換カラムを用いて濃縮され、このカ ラムから溶出されるインターフェロンはカラムに緩衝溶液を適用することにより ｐＨを増加させて溶出される請求項１記載の方法。
3. ３．段階ｂ）より得られる溶出液をチオシアネード、トリクロロ酢酸または硫酸 アンモニウムを用いた沈澱により濃縮する請求項１記載の方法。
4. ４．段階ｃ）で得られた沈澱インターフェロンをそれを回収する前にエタノール 中で再び沈澱させる請求項１、２または３記載の方法。
5. ５．その沈澱により得られたインターフェロンをゲル濾過に付し、２８０ｎｍに 吸収を示す流出液を回収する請求項１〜４のいずれかに記載の方法。
6. ６．段階ａ）で用いるカラムが組換えインターフェロンを用いた免疫により得ら れたポリクローナル抗体を含有する請求項１〜５のいずれかに記載の方法。
7. ７．段階ｃ）の沈澱がカリウムチオシアネートの溶液を用いて行われる請求項１ 〜６のいずれかに記載の方法。
8. ８．ａ）粗製ヒト白血球インターフェロンの溶液をイムノアフィニティー吸着カ ラムにかけ； ｈ）吸着されたインターフェロンを緩衝溶液を用いて前記カラムから溶出させ； ｃ）段階ｂ）より得られる溶出液を、該溶出液をイオン交換カラムに通しそして インターフェロンをｐＨを増加させる緩衝溶液を適用することにより溶出するこ とによって濃縮し； ｄ）段階ｂ）より得られる溶出液中に存在するインターフェロンをチオシアネー ト溶液を用いて沈澱させ；ｅ）段階ｄ）より得られるインターフェロンを水性エ タノール中で再沈澱させ；そして ｆ）段階ｅ）で得られるインターフェロンを回収する諸段階より成る粗製ヒト白 血球インターフェロンの精製方法。
9. ９．いずれの沈澱もアルブミンの存在下に行われる請求項１〜８のいずれかに記 載の方法。
10. １０．請求項１〜９のいずれかに記載の方法により調製された精製ヒト白血球イ ンターフェロン。