FI98218C - Interferonin puhdistusmenetelmä - Google Patents

Description

1 98218

Interferonin puhdistusmenetelmä Tämä keksintö koskee menetelmää ihmisen epäpuhtaan leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi.

5 Interferonit ovat ryhmä proteiineja, joita keho tuottaa luontaisesti vastineena ulkoiseen ärsykkeeseen, esimerkiksi infektion aiheuttavaan virukseen. Interferonia voi myös olla pieniä määriä veressä tiettyjen virus- ja kasvainsairauksien yhteydessä. Interferonit muodostuvat 10 kehossa osana puolustusjärjestelmää infektioita vastaan, ja niiden ajatellaan muodostavan välittömän puolustusmekanismin virusinfektioita vastaan.

Useita interferonityyppejä tunnetaan. Esimerkkeinä voidaan mainita leukosyyttien tuottama α-interferoni, si-15 dekudossolujen tuottama β-interferoni ja immuunivastesolu-jen tuottama gammainterferoni.

Leukosyyttien tuottama luonnollinen interferoni koostuu luonnollisesta seoksesta eri a-interferonin alatyyppejä tai interferonikomponentteja. Eri interferoni-20 komponentit on nimetty interferoni a-l:ksi, interferoni a-2:ksi, interferoni a-3:ksi, jne. Lisäksi eri a-interfe-ronikomponenteissa esiintyy alleelista muuntelua, nämä on nimetty interferoni a-2a:ksi, a-2b:ksi, a-2c:ksi jne.

"Cantellin menetelmän" mukaisesti leukosyyteistä 25 tuotettua interferonia, niin kutsuttua PIF-interferonia .·.·’ tai Cantell-interferonia on käytetty vuodesta 1971 lähtien • · *'! eri virus- ja kasvainsairauksien hoidossa. 1970-luvun ku- • · · *·1. luessa muodostuneet odotukset interferoneista lääkkeinä [ ‘ eri kasvain- ja virussairauksia vastaan, perustuvat yksin- • « · *·1 ' 30 omaan kliinisiin tuloksiin, jotka on saatu Cantell-inter feronia käyttämällä.

• · · Varhaisella 1980-luvulla interferoni kloonattiin, : : : ja rekombinantti-DNA-tekniikkaa käyttämällä tuotettua in- : terferonia käytetään nykyisin lääkkeenä noin viidessäkym- • · · ! 35 menessä maassa.

• · • ♦ • 1 · , 98218

Leukosyyteistä tuotettu luonnon interferoni käsittää seoksen noin kahdestakymmenestä eri a-interferonista. Rekombinantti-interferoni käsittää kloonatun a-interfero-nin alatyypin.

5 Tämä keksintö on uusi menetelmä natiivin leukosyyt- ti-inteferonin puhdistamiseksi. Alkuperäisellä Cantell-interferonilla, jota alunperin tuotettiin Suomessa varhaisella 1970-luvulla, on suhteellisen vähäinen puhtaustaso, noin 1 %:n luokkaa. Se on käyttökelpoinen sellaisenaan, 10 mutta jättää paljon toivomisen varaa tämän päivän ankarille vaatimuksille lääkkeiden puhtauden ja toistettavuuden suhteen.

Tämän keksinnön päätarkoituksena on tarjota käyttöön menetelmä erittäin puhtaan leukosyytti-inteferonin 15 tuottamiseksi kliinistä käyttöä varten.

Toinen keksinnön tarkoitus on tarjota käyttöön sellainen puhdistusmenetelmä, joka on hyvin toistettava, suhteellisen edullinen hinnaltaan, ja joka on suhteellisen helppo toteuttaa.

20 Näitä tarkoituksia varten, ja muita tarkoituksia, jotka selviävät seuraavasta selityksestä, tämä keksintö on menetelmässä ihmisen epäpuhtaan leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi, jolle menetelmälle on tunnusomaista, että a) lisätään mainitun epäpuhtaan interferonin liuos 25 immunoaffiniteettiadsorptiopylvääseen; ,···. b) eluoidaan adsorboitunut interferoni pylväästä • · m’lm käyttämällä puskuriliuosta, jonka pH on hapan; • ♦ · '**. c) konsentroidaan vaiheesta b) saatu eluaatti | * ioninvaihtokromatografiällä; • · *·* '30 d) saostetaan vaiheesta c) saadussa konsentroidussa eluaatissa oleva interferoni käyttäen tiosyanaattia, tri-kloorietikkahappoa tai ammoniusulfaattia; e) saostetaan vaiheesta d) saatu interferoni uudelleen vesipitoisalla etanolilla ja .35 f) otetaan vaiheesta e) saatu interferoni talteen.

98218 3 Tällaisissa prosesseissa on edullista käyttää imrau-noaf finiteettiadsorptiopylvään valmistuksessa rekombinant-ti-interferonia antiseerumin valmistamiseksi, josta poly-klonaaliset vasta-aineet eristetään ja kiinnitetään kova-5 lenttisesti pylvään matriisiin.

Keksinnön mukainen prosessi toteutetaan edullisesti käyttäen lisävaiheena immunoaffiniteettiadsorptiopyl-väästä saadun eluaatin konsentrointia käyttämällä ionin-vaihtopylvästä. Interferoni eluoidaan sopivasti tällaises-10 ta ioninvaihtopylväästä nostamalla pH:ta. Tällainen pH:n nostaminen voidaan saavuttaa lisäämällä pylvääseen puskuriliuosta.

Saostusvaiheen lisäksi, jossa käytetään esimerkiksi tiosyanaattiliuosta, prosessi voi käsittää toisen saostus-15 vaiheen, jossa tällaisesta saostuksesta saatava interferoni saostetaan jälleen etanoliin ennen sen talteenottoa.

Yhden tai kahden saostuksen jälkeen saatu interferoni saatetaan mieluiten geelisuodatukseen ja oikeat ulos-tulevat fraktiot, joiden absorbanssi on 280 nm, kerätään 20 ja otetaan talteen.

Saostusvaiheessa on edullista käyttää kaliumtiosya-naattiliuosta. Muita saostavia aineita ovat trikloorietik-kahappo ja ammoniumsulfaatti. Interferonin eluointi ionin-:··· vaihtopylväästä edellisestä vaiheesta saadun eluaatin kon- : 25 sentroimiseksi toteutetaan edullisesti lisäämällä puskuri- • * .···, liuosta pH:n nostamiseksi. Tällainen pH:n nostaminen to- • · teutetaan mieluiten neutraalin yläpuolella olevaan pH:hon,

I · I

***. kuten pH 8:aan tai sitä korkeampaan.

• f M · • · ... Tätä keksintöä valaistaan nyt edelleen spesifisillä • « '·' * 30 esimerkeillä, joita ei kuitenkaan pidä käsittää keksinnön piiriä rajoittaviksi muuten kuin siten kuin tähän liite-tyissä patenttivaatimuksissa on määritelty.

• * f f

III

4 98218

Esimerkki 1

Antiseerumin valmistus

Antiseerumin valmistuksessa käytetään terveitä, aiemmin immunisoimattomia vuohia. Immunisaatiossa käytetty 5 antigeeni on rekombinantti-interferonia, a-88, joka on tuotettu Umeän yliopistossa ja kuvattu yksityiskohtaisesti julkistetussa EP-patenttihakemuksessa nro 86 903 650,9, julkaisu nro 0 263 102. Tämä rekombinantti-interferoni liuotetaan fysiologiseen fosfaattipuskuriin, niin että 10 liuoksen spesifinen aktiivisuus on noin 2 x 108 iU/mg. Tämä liuos annostellaan vuohiin yhdessä "Freundin täydellisen adjuvantin" kanssa alkuimmunisaationa. Tämän jälkeen immunisaatio "Freundin epätäydellistä adjuvanttia" käyttämällä toteutetaan kerran viikossa tai kahdessa viikossa tila-15 vuuksissa 0,2 - 1,0 ml.

Vuohista otetaan verta kaulalaskimosta kahden viikon välein kolmannen immunisaation jälkeen. Valutettu veri tutkitaan anti-interferoni-vasta-aineiden määrän ja epäspesifisen sitoutumisen suhteen. Vasta-aineiden määrä ana-20 lysoidaan käyttämällä analyysiä, jolla mitataan neutraloivaa tiitteriä, se on tiitteriä, jolla määritetään sen interferonin määrä, joka inaktivoituu vasta-aineilla interferonille herkissä biologisissa järjestelmissä. Spesifinen ja epäspesifinen sitoutuminen määritetään tavallisella 25 "Western blotilla".

,···. Kunakin kertana valutetaan tavallisesti 150 - 200 • · /[·, ml verta. Tuoretta verta pidetään 24 tuntia jääkaapissa ja • · · se koaguloituu tässä ajassa. Veri sentrifugoidaan sen jäi- • < ,,, keen ja seerumi otetaan talteen. Interferonin vastaiset • I ( 30 vasta-aineet sisältävä seerumi saatetaan edelleen puhdistukseen, kuten alla on kuvattu.

·.·.· Esimerkki 2 • · t

Immuno-affiniteettiadsorptiopylvään valmistus : Esimerkistä 1 saatu antiseerumi seostetaan 25 g:11a 4 · _’ 35 ammoniumsulfaattia/100 g antiseerumia hitaalla sekoituk- 4 4 4 · c 98218 5 sella sentrifugiputkissa yli yön. Seuraavana päivänä anti-seerumi sentrifugoidaan 4 000 g 30 minuuttia. Supernatant-ti poistetaan ja sakka pestään kahdesti ammoniumsulfaatilla 1,75 mol/1, jotta vähennetään hemoglobiinin ja albumii-5 nin määrää. Sakka siirretään dialyysiputkeen ja dialysoi-daan vuorotellen vettä ja natriumasetaattipuskuria, 0,05 M NaAc, 0,021 M HAc, pH 5,0 vastaan.

Dialyysin aikana muodostuu lipoproteiineista koostuva sakka, joka poistetaan sentrifugoimalla 4 000 g 30 10 minuuttia. Gammaglobuliinit sisältävä supernatantti lisätään pylvääseen, joka sisältää DEAE SepharoseRFF:ää (25 ml pakattua geeliä/100 ml raaka-antiseerumia), tasapainotettu asetaattipuskurilla, pH 5,0. Dialysoitu antiseerumi saatetaan pylvään läpi ja eluoidaan noin yhdellä pylvästilavuu-15 della asetaattipuskuria.

tilavuus 445 ml absorbanssi 280 nm 35,2 igG konsentraatio 25,3 mg/ml kokonais-IgG 11,3 g 20 saanto 16 mg IgG/ml seerumia

Eluaatin sisältävä immunoglobuliini dialysoidaan kytkentä-puskuria vastaan, natriumbikarbonaatti 0,1 mol/1 ja nat-riumkloridi 0,5 mol/1.

Sepharose 4B:n Br-CN-aktivaatio 25 Sepharose pestään tislatulla vedellä lasisuppilossa :***; ja imetään kuiviin. Noin 40 - 60 g geeliä/g IgG punnitaan • · ·

. .*. ja suspendoidaan kaliumfosfaattipuskuriin, 2 mol/1 pH

11,0. Geeliliete jäähdytetään jäähauteessa. BrCN liuote- « · • taan veteen, 0,05 - 0,1 g BrCN/ml. Lisätään 3,3 g BrCN/ • · · • 30 100 g kuivaksi imettyä geeliä ja sepharosea aktivoidaan 10 minuuttia varovaisessa sekoituksessa magneettisekoittajal- • · · '·'··' la. Geeliliete siirretään lasisuppiloon ja pestään kylmäl- • · · lä tislatulla vedellä, kunnes eluaatin reaktio on neutraa- li. Aktivoitu geeli sekoitetaan immunoglobuliiniliuoksen β 98218

O

kanssa ja inkuboidaan huoneenlämmössä yli yön varovaisessa sekoituksessa.

Geeli siirretään lasisuppiloon ja suodoksen pro-teiinimäärä analysoidaan määrittämällä A280. Geeli suspen-5 doidaan uudelleen kytkentäpuskuriin ja lisätään glysiiniä 0,1 mol/1 sulkemaan jäljelle jääneet liittymiskohdat, ja geeliä inkuboidaan vähintään 1 tunnin ajan huoneenlämmössä. Sulkemisvaiheen jälkeen geeliä pestään toistuvasti fosfaattipuskurilla 0,02 mol/1, natriumkloridilla 0,2 10 mol/1 pH 7,0 ja sitruunahapolla 0,1 mol/1, natriumkloridilla 0,15 mol/1. Geeli säilytetään fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa on 0,4 % natriumatsidia säilöntäaineena .

Ky tkentämene telinä: 15 750 ml Sepharose 4B:tä pestään 2,5 litralla tis lattua vettä lasisuppilossa ja imetään kuiviin, "kuivan" geelin paino on 520 g. Geeli suspendoidaan uudelleen 500 ml:aan kaliumfosfaattipuskuria, 2,0 mol/1 pH 11,0 ja jäähdytetään jäähauteessa. 17,3 g BrCN liuotetaan 200 20 ml:aan vettä ja lisätään geelilietteeseen ja geeliä akti voidaan 10 minuuttia. Geeli pestään 7 litralla kylmää tislattua vettä. Eluaatin reaktio on neutraali.

Geeli sekoitetaan immunoglobuliinifraktion kanssa, joka on dialysoitu kytkentäpuskuria vastaan, natriumbikar-25 bonaattia 0,1 mol/1, natriumkloridia 0,5 mol/1 pH 8,5 ja !./ inkuboidaan yli yön huoneenlämmössä. Seuraavana päivänä • · *** geeli suodatetaan ja pestään yhdellä tilavuudella kytken- • « · ***** täpuskuria ja suodoksen ja pesuliuoksen proteiinikonsen- j ’ traatiot määritetään A280:lla.

V * 30 A280-suodos: 184 mg proteiinia A280—pesu: 165 mg proteiinia ::: kokonaismäärä: 349 mg proteiinia kytkentätehokkuus: 96,9 % .* . Geeli suspendoidaan uudelleen kytkentäpuskuriin, ' 35 jossa on glysiiniä 0,1 mol/1, jotta suljetaan jäljelle « · « · · 7 98218 jääneet aktivaatiokohdat, 1 tunnin ajan. Geeli pestään fosfaattipuskurilla pH 7,0 ja sitruunahapolla. Geeliä säilytetään fosfaatilla puskuroidussa suolaliuoksessa, jossa on 0,04 natriumatsidia säilöntäaineena.

5 Esimerkki 3

Interferonin raakauutteen tuotanto Tässä tuottomenetelmässä käytetään sentrifugoidusta verestä saatua, punasolujen päälle kerrostunutta leuko-syyttikerrosta (buffy coat) raakainterferonin valmistami-10 seksi. Leukosyyttikerrokset ovat tavanomaisen veripankki-toiminnan jätetuotetta sairaaloissa. Käytetyt leukosyyttikerrokset eivät ole vanhempia kuin 48 tuntia, ja suurin osa leukosyyttikerroksista ei ole vanhempia kuin 24 tuntia.

15 Leukosyyttien valmistamiseksi leukosyyttikerroksis ta punaiset verisolut hajotetaan lisäämällä ammoniumklori-dia lopulliseen konsentraatioon 0,83 %. 10 minuutin jälkeen huoneenlämmössä leukosyytit sentrifugoidaan korisent-rifugissa virtausnopeudella 300 ml/min. Leukosyytit sus-20 pendoidaan PBSraan. Menettely toistetaan kerran ja saadut leukosyytit lisätään sitten kasvatusalustaan.

Puhdistetut leukosyytit suspendoidaan Eaglen alustaan, jossa on seuraavat ainelisäykset: neomysiini 25 pg/ml 25 trisiini 3 mg/ml 4 % ihmisen plasmaa, joka on saostettu 6-%:isella ··« . polyetyleeniglykoli 6000:11a (Inglot A et ai., Acta Virol.

19; 250 - 254, 1975) • · PEG:llä fraktioidun plasman käyttö a-gammaseerumin • · · 30 asemesta on ainoa merkittävä ero alkuperäiseen Cantell- 8 98218 esikäsittelyn jälkeen lisätään Sendai-virusta, noin 150 hemagglutoivaa yksikköä/ml (noin 40 ml Sendai-virusta litraa kohti). 20 tunnin kuluttua 37 °C:ssa leukosyytit poistetaan sentrifugoimalla tai suodattamalla. Epäpuhdasta in-5 terferonia säilytetään korkeintaan 7 päivää ennen puhdistusta .

Esimerkki 4

Epäpuhtaan interferonin konsentraatio

Esimerkin 3 mukaisesti saatu epäpuhdas interfero-10 niliuos konsentroidaan ultrasuodatuksella käyttämällä Filtron-systeemiä, MW 10,000 suodatin. Ennen ultrasuoda-tusta epäpuhdas inteferoni suodatetaan 0,45 pm membraanin läpi (Millipore, Prostak), jotta poistetaan solut ja solu-jäte. Interferoniliuos konsentroidaan noin 5-kertaiseksi. 15 Esimerkki 5

Epäpuhtaan interferonin affiniteettikromatografia

Affiniteettipylväs (BP 113/15, Pharmacia, geeliti-lavuus noin 1 1), saatu, kuten esimerkissä 2 on kuvattu, tasapainotetaan 0,02 M Tris-HCl:lla, 0,2 M NaCl, 0,001 M 20 EDTA, pH 8,0 (Tris-puskuri). Esimerkissä 4 saadun interfe-roniliuoksen annetaan sitten läpäistä pylväs virtausnopeudella noin 4 1 tunnissa. Kun interferoniliuos on läpäissyt pylvään, pylväs pestään käyttämällä Tris-puskuria, kunnes eluaatin absorbanssi on nolla tai melkein nolla.

25 Af f initeettipylväs desorboidaan antamalla 0,1 M

:***: sitruunahapon, 0,15 M NaCl:n pH 2,0 valua läpi. Sitruuna- »ti i ·*; happopuskurin annetaan läpäistä pylväs virtausnopeudella «·« ....: noin 3 1 tunnissa. Tämä pylvään happamoittaminen johtaa .···. pylvään läpi otetun interferonin desorptioon. Desorptiota « · · 30 jatketaan, kunnes absorbanssi 280 nm:ssa loppuu ja kerätty . interferoniliuos otetaan talteen. Tilavuus on noin 51.

• · · *···' Esimerkki 6 • « · • « « ·’ Desorboidun interferonin konsentraatio

Esimerkin 5 mukaisesta desorptiosta saadun inter f e-35 ronin annetaan virrata ioninvaihtopylvään läpi (S-Sepharo- « « i « M · · · I « 9 98218

seR), joka on tasapainotettu sitruunahappopuskurilla, pH

2,0. Ioninvaihtaja pestään sitten käyttämällä sitruunahap-popuskuria ja interferoni eluoidaan nostamalla pH:ta Tris-puskurin lisäyksen avulla, mikä johtaa pH:n nousuun noin 5 pH 8:aan.

Esimerkki 7

Interferonin saostus käyttämällä kaliumtiosyanaat-tia

Esimerkistä 6 saatu interferoniliuos lisätään varo-10 vasti 5 M KSCN:ään ja ihmisen seerumialbumiinin (HSA) kanssa sekoittamalla KSCN:n lopulliseen konsentraatioon 0,5 M (painosuhde IFN/HSA noin 1:5 - 10). Sen jälkeen lisätään suolahappoa (1 M), kunnes pH on laskenut noin 8:sta noin 2,0:aan. Samea sakka sentrifugoidaan 5 000 rpm 30 mi-15 nuutin ajan (Beckman J-21). Supernatantti otetaan huolella talteen.

Esimerkki 8 Saostus etanolilla

Interferonisakka kaliumtiosyanaattisaostuksesta 20 esimerkistä 7 lietetään 95 % happamaan etanoliin yhdessä HSA:n kanssa (painosuhde IFN/HSN noin 1:5 - 10) (noin 300 ml), jonka lämpötila on noin -20 °C. Lietettä sentrifugoidaan 30 min 5 000 rpm. Interferonin sisältävä superna-tantti otetaan talteen ja sen pH nostetaan varovasti pH

.·, 25 8,0:aan lisäämällä 0,1 M NaOH:ia. Sakkaa sentrifugoidaan • * #···. sitten 30 minuuttia 5 000 rpm (Beckman J-21). Supernatant- • · ti dekantoidaan ja sakka liuotetaan 10 ml:aan 0,15 M nat- ***. riumfosfaattipuskuria + 0,5 M KSCN, pH 8,0.

• ·

Esimerkki 9 • ♦· • · · *·* * 30 Sakan geelisuodatus

Esimerkistä 8 saatu interferoniliuos sentrifugoi- * ♦ daan ja saatetaan geelisuodatukseen pylväässä (AcA-54, • * · •\· ' IBF, Ranska, 2,5 x 90 cm). Interferonihuippu otetaan sit- : ten talteen, detektoidaan UV-valolla, 280 nm. Saadun in- ! 35 terferonin puhtaus on noin 80 % ja analysoitaessa (Wes- 10 98218 tern-blot) sen havaitaan sisältävän kaikki interferonikom-ponentit, jotka ovat Cantell-tyyppisessä epäpuhtaassa interferoni 1ähtömateriaalissa.

Tämän keksinnön mukainen menetelmä tarjoaa monia 5 etuja, joista voidaan mainita: tehokas virusinfektion riskin eliminointi, suuri saanto, yksinkertainen ja toistettava toteutus.

Edellä annettujen esimerkkien ei pidä tulkita rajoittavan keksinnön piiriä. Ne on esitetty yksinomaan tar-10 koituksessa valaista ja kuvata keksintöä. On ilmeistä, että kuvatun keksinnön valossa monet muunnelmat ja variaatiot ovat mahdollisia alan ammattimiehelle. On tarkoitus, että keksinnön piiri määritetään liitettyjen patenttivaatimusten mukaan.

·· t * · « · • « » • « · • « · ·« · i * · ·♦* • « f • » t * « · • · · * · « »*«

Claims (6)

1. Menetelmä ihmisen epäpuhtaan leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi, tunnettu siitä, että 5 a) lisätään mainitun epäpuhtaan interferonin liuos immunoaffiniteettiadsorptiopylvääseen; b) eluoidaan adsorboitunut interferoni pylväästä käyttämällä puskuriliuosta, jonka pH on hapan; c) konsentroidaan vaiheesta b) saatu eluaatti 10 ioninvaihtokromatografiällä; d) saostetaan vaiheesta c) saadussa konsentroidussa eluaatissa oleva interferoni käyttäen tiosyanaattia, tri-kloorietikkahappoa tai ammoniusulfaattia; e) saostetaan vaiheesta d) saatu interferoni uudel- 15 leen vesipitoisella etanolilla ja f) otetaan vaiheesta e) saatu interferoni talteen.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluaatti vaiheesta b) konsentroidaan käyttämällä ioninvaihtopylvästä, interferonin 20 eluoituessa pylväästä nostamalla pH:ta neutraalin yläpuo lelle, lisäämällä puskuriliuosta pylvääseen.

3. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saostuksesta saatu interferoni saatetaan geelisuodatukseen ja 25 otetaan talteen ulosvirrannut osa, jossa on absorbanssia 280 nm:ssa.

• · , .·, 4. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen * » « mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaihees- • tr f ' 9 • « ... sa a) käytetty pylväs sisältää polyklonaalisia vasta-ai- 1 1 * '* 30 neita, jotka on saatu immunisaatiolla rekombinantti-inter- feronia käyttäen. M.*

5. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen ··· v : mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että saostus ·, : vaiheessa d) toteutetaan kaliumtiosyanaattiliuoksella. 35

6. Minkä tahansa edellä olevan patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mikä : tahansa saostus toteutetaan albumiinin läsnä ollessa. 12 58218