FI105319B - Menetelmä multikomponentti-alfa-interferonin valmistamiseksi - Google Patents
Menetelmä multikomponentti-alfa-interferonin valmistamiseksi Download PDFInfo
- Publication number
- FI105319B FI105319B FI981338A FI981338A FI105319B FI 105319 B FI105319 B FI 105319B FI 981338 A FI981338 A FI 981338A FI 981338 A FI981338 A FI 981338A FI 105319 B FI105319 B FI 105319B
- Authority
- FI
- Finland
- Prior art keywords
- interferon
- ifn
- bound
- detergent
- subtypes
- Prior art date
Links
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 title claims description 119
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 title claims description 119
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims description 10
- OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N n-methyl-1-(2-naphthalen-1-ylsulfanylphenyl)methanamine Chemical compound CNCC1=CC=CC=C1SC1=CC=CC2=CC=CC=C12 OHDXDNUPVVYWOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 39
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 32
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 claims description 28
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 claims description 28
- 229940079593 drug Drugs 0.000 claims description 27
- 239000003814 drug Substances 0.000 claims description 27
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 claims description 27
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 claims description 25
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 21
- 239000000047 product Substances 0.000 claims description 19
- 238000011282 treatment Methods 0.000 claims description 17
- 239000003599 detergent Substances 0.000 claims description 15
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 15
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 14
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims description 13
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 12
- 239000002904 solvent Substances 0.000 claims description 10
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 claims description 6
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 claims description 6
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 claims description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 claims description 4
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 claims description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 claims description 3
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 2
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 claims description 2
- 238000001641 gel filtration chromatography Methods 0.000 claims description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 claims description 2
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 claims description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 2
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 2
- 239000011148 porous material Substances 0.000 claims description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 claims description 2
- 238000012371 Aseptic Filling Methods 0.000 claims 1
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 claims 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 claims 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 claims 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 16
- 108010058846 Ovalbumin Proteins 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 10
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 10
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 10
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 9
- 229940092253 ovalbumin Drugs 0.000 description 9
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 9
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 8
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 8
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 7
- 235000010482 polyoxyethylene sorbitan monooleate Nutrition 0.000 description 7
- 229920000053 polysorbate 80 Polymers 0.000 description 7
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 7
- 238000011100 viral filtration Methods 0.000 description 7
- 102100040019 Interferon alpha-1/13 Human genes 0.000 description 6
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 6
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 6
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 6
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 6
- 239000000244 polyoxyethylene sorbitan monooleate Substances 0.000 description 6
- 229940068968 polysorbate 80 Drugs 0.000 description 6
- 230000002779 inactivation Effects 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 241000711408 Murine respirovirus Species 0.000 description 4
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 4
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 4
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 4
- 235000021317 phosphate Nutrition 0.000 description 4
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 4
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 230000000840 anti-viral effect Effects 0.000 description 3
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 3
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 3
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 3
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 3
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 244000309711 non-enveloped viruses Species 0.000 description 3
- 150000003013 phosphoric acid derivatives Chemical class 0.000 description 3
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 239000007858 starting material Substances 0.000 description 3
- 238000011146 sterile filtration Methods 0.000 description 3
- STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N tributyl phosphate Chemical compound CCCCOP(=O)(OCCCC)OCCCC STCOOQWBFONSKY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 208000005176 Hepatitis C Diseases 0.000 description 2
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 2
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 2
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 2
- 102000029797 Prion Human genes 0.000 description 2
- 108091000054 Prion Proteins 0.000 description 2
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M Thiocyanate anion Chemical compound [S-]C#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000711975 Vesicular stomatitis virus Species 0.000 description 2
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 2
- 239000008364 bulk solution Substances 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 229960003964 deoxycholic acid Drugs 0.000 description 2
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- -1 fatty acid esters Chemical class 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 2
- 230000002538 fungal effect Effects 0.000 description 2
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 2
- ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N hydrogen thiocyanate Natural products SC#N ZMZDMBWJUHKJPS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000000984 immunochemical effect Effects 0.000 description 2
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 2
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 2
- 229940047124 interferons Drugs 0.000 description 2
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 2
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 2
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 2
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 2
- 230000004797 therapeutic response Effects 0.000 description 2
- CQXYINNETWHZTR-UHFFFAOYSA-N tritert-butyl phosphate Chemical compound CC(C)(C)OP(=O)(OC(C)(C)C)OC(C)(C)C CQXYINNETWHZTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 208000002109 Argyria Diseases 0.000 description 1
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 1
- 101000999354 Bos taurus Interferon alpha-H Proteins 0.000 description 1
- 208000014644 Brain disease Diseases 0.000 description 1
- 102000004127 Cytokines Human genes 0.000 description 1
- 108090000695 Cytokines Proteins 0.000 description 1
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 1
- 239000006145 Eagle's minimal essential medium Substances 0.000 description 1
- 208000032274 Encephalopathy Diseases 0.000 description 1
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001034829 Homo sapiens Interferon alpha-10 Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102100039734 Interferon alpha-10 Human genes 0.000 description 1
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 1
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 1
- 241000609499 Palicourea Species 0.000 description 1
- 229920003171 Poly (ethylene oxide) Polymers 0.000 description 1
- 229920001214 Polysorbate 60 Polymers 0.000 description 1
- 241000125945 Protoparvovirus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- GTVWRXDRKAHEAD-UHFFFAOYSA-N Tris(2-ethylhexyl) phosphate Chemical compound CCCCC(CC)COP(=O)(OCC(CC)CCCC)OCC(CC)CCCC GTVWRXDRKAHEAD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 230000009471 action Effects 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 150000001298 alcohols Chemical class 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000001028 anti-proliverative effect Effects 0.000 description 1
- 210000000628 antibody-producing cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012298 atmosphere Substances 0.000 description 1
- 244000309466 calf Species 0.000 description 1
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N chlorotetracycline Natural products C1=CC(Cl)=C2C(O)(C)C3CC4C(N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)C4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N chlortetracycline Chemical compound C1=CC(Cl)=C2[C@](O)(C)[C@H]3C[C@H]4[C@H](N(C)C)C(O)=C(C(N)=O)C(=O)[C@@]4(O)C(O)=C3C(=O)C2=C1O CYDMQBQPVICBEU-XRNKAMNCSA-N 0.000 description 1
- 229960004475 chlortetracycline Drugs 0.000 description 1
- 235000019365 chlortetracycline Nutrition 0.000 description 1
- 239000000470 constituent Substances 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 230000001186 cumulative effect Effects 0.000 description 1
- 238000010908 decantation Methods 0.000 description 1
- 235000014113 dietary fatty acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000008034 disappearance Effects 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 210000002919 epithelial cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000194 fatty acid Substances 0.000 description 1
- 229930195729 fatty acid Natural products 0.000 description 1
- 230000001605 fetal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012467 final product Substances 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 230000002519 immonomodulatory effect Effects 0.000 description 1
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 108010045648 interferon omega 1 Proteins 0.000 description 1
- 229960001388 interferon-beta Drugs 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 238000011694 lewis rat Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 210000004779 membrane envelope Anatomy 0.000 description 1
- 125000004108 n-butyl group Chemical group [H]C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])* 0.000 description 1
- 230000001613 neoplastic effect Effects 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 230000002085 persistent effect Effects 0.000 description 1
- 238000002962 plaque-reduction assay Methods 0.000 description 1
- 229940093430 polyethylene glycol 1500 Drugs 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 239000012898 sample dilution Substances 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002594 sorbent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010257 thawing Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- SFENPMLASUEABX-UHFFFAOYSA-N trihexyl phosphate Chemical compound CCCCCCOP(=O)(OCCCCCC)OCCCCCC SFENPMLASUEABX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000003643 water by type Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
- C07K14/52—Cytokines; Lymphokines; Interferons
- C07K14/555—Interferons [IFN]
- C07K14/56—IFN-alpha
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
105319 1 .
MENETELMÄ MULTIKOMPONENTTI-ALFA-INTERFERONIN VALMISTAMISEKSI
Tämä keksintö koskee α-interferonilääkkeen valmistamista ihmisen leukosyytti- tai lymfo-5 blastoidisoluviljelmästä. Keksintö koskee erityisesti hyvin puhdistetun ja virusturvallisen α-interferoniliuoksen valmistamista, jolloin liuos sisältää pääasialliset luonnolliset a-interferonin alatyypit.
α-interferonit (IFN-a) ovat tärkeitä lääkkeitä, joilla on antiproliferatiivisia, antiviraalisiaja 10 immunomodulatorisia vaikutuksia. Ihmisen leukosyyttien tiedetään tuottavan useita IFN-a:n alatyyppejä viljelmässä Sendai-viruksella indusoituna (Nyman et ai., Biochem. J. 329, 295 - 302,1998). Ihmisen lymfoblastoidisolut tuottavat samoin useita IFN-a:n alatyyppejä Sendai-viruksella tehdyn induktion jälkeen (Zoon et ai., J. Biol. Chem. 267, 15210 -15216, 1992). Sekä leukosyytti- että lymfoblastoidi-IFN-a:aa (joita kutsutaan tästä lähtien 15 ”multikomponentti-a-interferoniksi” eli "monikomponentti-a-interferoniksi") käytetään lääkkeinä hoidettaessa neoplastisia sairauksia ja virussairauksia.
IFN-a-lääkkeitä tuotetaan myös yhdistelmä-DNA-tekniikalla bakteereissa. Toisin kuin leukosyytti- ja lymfoblastoidi-IFN-α, rekombinanttituotteet sisältävät ainoastaan yhtä IFN-20 or.n alatyyppiä, joka eroaa rakenteellisesti vastaavista luonnollisista alatyypeistä. Rekom-binantti-IFN-α voi indusoida vasta-aineita interferoneja vastaan potilaissa, mikä saattaa johtaa terapeuttisen vasteen häviämiseen. Monikomponentti-IFN-a-tuotteet ovat palauttaneet terapeuttisen vasteen näille potilaille, ja näillä tuotteilla voi olla myös muita terapeut-tisia etuja verrattuna yhdistelmä-tuotteisiin (Farrell, Hepatology 26, 96S - 100S, 1997).
25 Tärkeä päämäärä IFN-a:n puhdistamisessa leukosyytti- tai lymfoblastoidisoluviljelmästä on sisällyttää kaikki pääasialliset luonnolliset alatyypit valmiiseen tuotteeseen. Tämän tulee tapahtua toistettavalla tavalla, jotta tuotteen alatyyppikoostumus on vakio, mikä taas on t . edellytys lääkkeen laadun pysyvyydelle. Lisäksi on yhtä tärkeää IFN-a:n puhdistamisessa 30 leukosyytti- tai lymfoblastoidisoluviljelmästä, että aloitusmateriaaleissa olevat virukset ·- inaktivoidaan ja poistetaan. Leukosyytit ja seerumi tai sen fraktiot, joita käytetään leuko syytti-ja lymfoblastoidi-interferonin tuottamiseen, voivat sisältää erilaisia fysikaaliskemi-allisia ominaisuuksia omaavia viruksia, joita ei voi inaktivoida tehokkaasti yhdellä virusten inaktivointikäsittelyllä. Verestä peräisin oleviin viruksiin, joita mahdollisesti on seerumi-35 fraktioissa ja leukosyyteissä, kuuluu vaipallisia viruksia, kuten HI-viruksia, hepatiitti C- ja B-viruksia, ja myös vaipattomia viruksia, jotka ovat resistenttejä monille fysikaaliskemial- 2 105319 lisille käsittelyille, kuten parvovirus B19. Lymfoblastoidisolulinjat voivat sisältää esim. retroviruksia.
On kehitetty useita valmistusmenetelmiä, joissa käytetään ihmisen leukosyyttiviljelmiä 5 lähtömateriaalina, jotta saadaan monikomponentti-IFN-a-lääke.
US-patentissa 5.391.713 kuvataan leukosyytti-interferonin puhdistusprosessi. Tämä käsittää immunoaffiniteettikromatografiavaiheen, jossa käytetään polyklonaalista vuohen vasta-ainetta IFN-a:aa vastaan. Puhdistusprosessi käsittää saostusvaiheet tiosyanaattiliuoksella ja 10 vesipitoisella etanolilla, mutta ei muita spesifisiä virusten inakti vointi- tai poisto vaiheita. Polyklonaalisten vasta-aineiden käyttö puhdistuksessa voi olla ongelmallista, koska eri immunisointiaikoina saatujen vasta-aineiden spesifisyys voi olla erilainen, mikä johtaa muutoksiin erilaisilla vasta-aine-erillä puhdistetun lääkkeen alatyyppikoostumuksessa ja epäpuhtausprofiilissa.
15 US-patentti 5.503.828 koskee leukosyytti-interferonin puhdistusprosessia, joka käsittää immunoaffiniteettikromatografian monoklonaalisella vasta-aineella NK2. Tämän mono-klonaalisen vasta-aineen käyttö johtaa koostumukseen, joka käsittää vähintään 50 % IFN-a:n alatyyppejä a2 ja a8, ja lisäksi alatyyppejä joukosta <x4, <x7, α 10, a 16, a 17 ja oc21.
20 Puhdistusprosessin aikana kuitenkin vähintään alatyypit IFN-al ja IFN-al4 häviävät. Näistä alatyypeistä IFN-al on runsain luonnollinen alatyyppi (Nyman et ai., Biochem. J. 329,295 - 302,1998). Puhdistusprosessi sisältää käsittelyn alhaisessa pH:ssa vähintään 2 päivän ajan, mutta ei muita spesifisiä virusten inaktivointi- tai poistovaiheita.
« 25 Voi olla mahdollista saada kaikki pääasialliset IFN-a:n alatyypit immunoaffiniteettikro-matografialla polyklonaalisen vasta-aineen avulla, mutta käytännössä näyttää mahdottomalta saada polyklonaalisia vasta-aineita, jotka sitovat ainoastaan lFN-a:aa, eivätkä muita läheisiä sytokiinejä. Lisäksi ei ole mahdollista pitää yllä jatkuvaa tarjontaa polyklonaali-sista vasta-aineista, joiden sitoutumisspesifisyys on identtinen. Sen vuoksi polyklonaalisten 30 vasta-aineiden käyttö puhdistuksessa ei varmista muuttumatonta alatyyppikoostumusta ja epäpuhtausprofiilia tuotteelle pitkän ajanjakson aikana. Monoklonaalisen vasta-aineen käyttö immunoaffiniteettikromatografiassa tekee mahdolliseksi muuttumattoman sitoutu-misspesifisyyden pitkäaikaisessa tuotannossa. Kuitenkin, ainakin NK2-vasta-aineen tapauksessa, yhden monoklonaalisen vasta-aineen käyttö johti pääasiallisten IFN-α-alatyyppien 35 häviämiseen tuotteesta.
3 105319
Nykyiset menetelmät leukosyytti-interferonin puhdistamiseksi ja tuottamiseksi eivät sisällä useita spesifisiä virusten inaktivointi- tai poistovaiheita, joiden toimintatavat ovat erilaiset, eivätkä ne mahdollista sellaisten virusten inaktivointia, jotka ovat resistenttejä esim. alhaiselle pH:lle tai vesipitoiselle etanolille ja tiosyanaatille.
5 Tämän keksinnön tarkoituksena on poistaa ongelmat, jotka liittyvät aikaisempaan, alalla tunnettuun tekniikkaan, ja saada aikaan menetelmä hyvin puhdistetun IFN-a-liuoksen tuottamiseksi leukosyytti- tai lymfoblastoidisoluviljelmästä. Keksinnön tarkoitus on erityisesti tuottaa uusi menetelmä hyvin puhdistetun, virusturvallisen monikomponentti-IFN-a-10 liuoksen tuottamiseksi leukosyytti- tai lymfoblastoidi-raakainterferonista.
Edellä esitetty, ja muut keksinnön tarkoitukset, samoin kuin sen edut verrattuna tunnettuihin menetelmiin, tulevat ilmeisiksi seuraavasta keksinnön yksityiskohtaisesta kuvauksesta, ja ne saavutetaan keksinnöllä, kuten seuraavassa on kuvattuja kuten patenttivaatimuksissa 15 esitetään.
Esillä olevan keksinnön mukaisesti saadaan aikaan menetelmä monikomponentti-IFN-a:n valmistamiseksi, joka menetelmä käsittää monta virustenpoistovaihetta. Keksintö perustuu siihen havaintoon, että tekemällä IFN-a:n eristysprosessin välituotteena olevalle proteiini-20 koostumukselle immunoadsorptiokromatografia vähintään kahdella monoklonaalisella vasta-aineella, joilla on komplementaariset alatyyppispesifisyydet, on mahdollista, ei ainoastaan erottaa toistettavalla tavalla kaikki IFN-a:n pääasialliset alatyypit, vaan myös poistata tehokkaasti kaikkein sitkeimmät infektoivat aineet IFN-a:sta, mukaanluettuna vaipat-'. tomat virukset ja fysikaaliskemiallisesti resistentit infektoivat aineet, kuten tarttuvia sieni- 25 mäisiä enkefalopatioita aiheuttavat ("prionit").
Täsmällisemmin sanottuna keksinnölle on tunnusomaista se, mikä on esitetty patenttivaatimuksen 1 tunnusmerkkiosassa.
9 * 30 Keksinnöllä saadaan aikaan huomattavia etuja. Niinpä, lyhyesti esitettynä; yhdistämällä j immunoadsorptiokromatografia sitä edeltävän liuotin/detergenttikäsittelyn kanssa, ja sen jälkeen tehtävän käsittelyn kanssa alhaisessa pH:ssa, sekä virustenpoistosuodattimella tehtävän suodatuksen kanssa, on mahdollista saada neljä tehokasta virustenpoistovaihetta, joista vähintään kaksi eliminoi kaikkia virustyyppejä ja infektoivia aineita, jotka ovat mah-35 dollisesti läsnä soluviljelmissä. Tällä käsittelyllä on kapasiteetti puhdistaa perusteellisesti kaikki päasialliset, luonnolliset IFN-a:n alatyypit hyvällä saannolla, ja saada jatkuvasti 4 105319 aikaan tuote, jonka alatyyppikoostumus on vakio.
Seuraavassa keksintöä tarkastellaan lähemmin yksityiskohtaisen kuvauksen avulla, ja viittaamalla muutamaan sovellutusesimerkkiin.
5
Miikaan liitetyissä piirustuksissa,
Kuvio 1 esittää virtauskaavion muodossa edullisen sovellutuksen tästä prosessista hyvin puhdistetun, virusturvallisen, kaikki pääasialliset IFN-a:n alatyypit sisältävän IFN-a-lääkkeen valmistamiseksi ja 10 kuvio 2 esittää tyypillisen käänteisfaasi-HPLC-profiilin puhdistetusta leukosyytti IFN-a-lääkeaineesta.
Tämä keksintö esittää menetelmän hyvin puhdistetun monikomponentti-IFN-a:n valmistamiseksi. Aloittaen leukosyyteistä, prosessi sisältää yleisesti esitettynä vaiheet, joissa 15 poistetaan solut leukosyyttiviljelmästä, konsentroidaan näin saatu raakainterferoni, suodatetaan raakainterferonikonsentraatti ja tehdään sille liuotin/detergenttikäsittely (seuraavassa kutsutaan tätä myös lyhenteellä S/D-käsittely), sidotaan S/D-käsitellystä raakainterfe-ronikonsentraatista saatu IFN-α vähintään kahden monoklonaalisen vasta-aineen avulla immunoadsorptiokromatografialla, eluoidaan IFN-α pylväästä ja pidetään sitä alhaisessa 20 pH:ssa vähintään 16 tuntia, neutraloidaan eluaatti ja erotetaan hiiren vasta-aineiden jäännökset geelisuodatuksella, ja lopuksi tehdään näin saadulle puhdistetulle lääkeaineelle vi-russuodatus ja steriilisuodatus koostumuksessa, joka on sopiva valmiille tuotteelle. Samanlaisia menetelmävaiheita käytetään interferonin eristämiseksi ihmisen lymfoblas- « toidisoluviljelmästä.
25
Tuotteen virusturvallisuus varmistetaan käyttämällä vähintään kahta tehokasta virusten poistovaihetta kaikille viruksille, jotka edustavat erilaisia fysikaaliskemiallisia ominaisuuksia. Ensin, S/D-käsittely inaktivoi tehokkaasti kaikkia vaipallisia viruksia. Toiseksi, immu-noadsorptiokromatografia ja sen yhteydessä tehokkaat pesuvaiheet, poistaa kaikentyyppisiä 30 viruksia. Kolmanneksi, inkubointi alhaisessa pH:ssa inaktivoi tehokkaasti useimmat virukset, lukuunottamatta joitain happoresistenttejä viruksia. Lopulta virussuodatus poistaa kaikki virukset, mukaanluettuna jopa pienimmät, vaipattomat virukset. Lisäksi muut fysi-kaaliskemiallisesti resistentit infektoivat aineet, kuten "prionit", poistetaan myös tehokkaasti immunoadsorptiokromatografia- ja virussuodatusvaiheilla. Näin ollen menetelmä 35 käsittää vähintään kaksi tehokasta vaihetta kaiken tyyppisiä fysikaaliskemiallisesti resistenttejä infektoivia aineita vastaan, ja jopa neljä vaihetta kaikkein tärkeimpiä verestä tule- 5 105319 via viruksia, HI-viruksia ja hepatiitti B- ja C-viruksia vastaan Joilla on lipidivaippa Ja jotka inaktivoidaan tehokkaasti S/D-käsittelyllä ja alhaisella pH:lla,ja poistetaan immunoad-sorptiokromatografialla ja virussuodatuksella.
5 Tuotantoprosessin edullinen suoritusmuoto on esitetty kuviossa 1.
Viitaten kuvioon 1, voidaan havaita, että edullisen suoritusmuodon ensimmäinen vaihe käsittää raakainterferonin tuottamisen leukosyyttiviljelmässä, erityisesti Sendai-virus-induktiolla (Cantell et ai., Methods Enzymol. 78,29 - 38, 1981). Aloitusmateriaali voi 10 myös olla raakainterferonia, joka on saatu ihmisen lymfoblastoidisoluviljelmästä Sendai-virusinduktiolla (Mizrahi et ai., Methods Enzymol. 78, 54 - 66, 1981).
Solut poistetaan viljelmästä dekantoimalla, mikrosuodattamalla ja/tai sentrifugoimalla. Suodos tai supematantti konsentroidaan ultrasuodattamalla, jotta saadaan raaka IFN-15 konsentraatti, suodatetaan ja käsitellään S/D-reagensseilla, jotta hajotetaan lipidivaipalliset virukset. S/D-käsittelyt on kuvattu alan tunnetussa tekniikassa, erityisesti US-patenteissa 4.540.573,4.764.369 ja 4.820.805Jotka sisällytetään tähän kiijallisuusviitteiksi. Orgaaninen liuotin valitaan edullisesti dialkyylifosfaateista ja trialkyylifosfaateista Joiden alkyyli-ryhmissä on 1 - 10 hiiliatomia. Esimerkkejä trialkyylifosfaateista ovat tri-(n-butyyli)-20 fosfaatti, tri-(t-butyyli)fosfaatti, tri-(n-heksyyli)fosfaatti ja tri-(2-etyyliheksyyli)fosfaatti. Liuottimen konsentraatio on alueella 0,01 g/1 -100 g/1, edullisesti noin 0,1 g:sta/l noin 10 g:aan/l, tyypillinen tri-(n-butyyli)-fosfaatin konsentraatio on noin 0,3 %. Liuotinta voidaan käyttää yhdessä myrkyttömän detergentin kanssa, joka kykenee lisäämään liuottimen te-ν' hokkuutta. Tällaisista aineista ovat esimerkkeinä ionittomat pinta-aktiiviset aineet, esim.
25 oksietyloidut alkyylifenolit, polyoksietyleenisorbitaani-rasvahappoesterit, polyoksiety- leenialkoholit ja natriumdeoksikolaatti. Detergentin määrä on alueella 0,001 -10 %, edullisesti noin 0,01 - 1,5 %. Tyypillisesti detergentti käsittää 1 % polysorbaatti 80:aa (Tween 80), 1 % Triton X-100:aa tai 0,2 % natriumdeoksikolaattia. S/D-aineita voidaan käyttää , . jopa korkeampina konsentraatioina, kuten 2 % tri(n-butyyli)fosfaattia ilman detergenttiä.
30 Käsittelyaika voi olla 4 - 50 tuntia, ja lämpötila 24 - 30 °C.
Proteiiniepäpuhtaudet, DNA, mahdolliset virukset ja S/D-kemikaalit poistetaan sitomalla IFN-α immunoadsorbenttiin, joka käsittää monoklonaalisia vasta-aineita kytkettynä kiinteään matriisiin. Jotta saataisiin kaikki pääasialliset IFN-a:n alatyypit, tulisi käyttää vähin-35 tään kahta monoklonaalista vasta-ainetta, joilla on komplementaariset alatyyppi spesifisyydet.
6 105319
Monoklonaaliset vasta-aineet voidaan tuottaa käyttämällä puhdistettua leukosyytti-interferonia immunogeeninä. Vasta-ainetta tuottavat solukloonit valikoidaan testaamalla vasta-aineiden kyky sitoa leukosyytti-interferonia immunoadsorptiossa (esimerkki 1). Mo-noklonaalisten vasta-aineiden tulisi yhdessä sitoa vähintään 90 % raakainterferonissa ole-5 vasta interferoniaktiivisuudesta, ja alhaisessa pH:ssa eluoidun interferoniaktiivisuuden saannon tulisi olla vähintään 80 % sitoutuneesta aktiivisuudesta. Vasta-aineilla tulisi olla komplementaariset sitoutumisspesifisyydet IFN-a:n alatyyppien suhteen niin, että ne sitovat yhdessä kaikkia IFN-a:n pääasiallisia alatyyppejä. Vasta-aineiden tulisi erityisesti sitoa vähintään IFN-a:n alatyyppejä ai, a2, a8, a 10, a 14, a 17, ja <x21. On edullista, että vä-10 hintään yksi vasta-aine sitoo alatyyppiä ai ja yksi sitoo alatyyppiä a2.
Immunoadsorbenttipylväs pestään huolellisesti ja sitoutunut IFN-α eluoidaan puskurilla, jonka pH on alhainen (pH 2 - 2,5). Eluointipuskuri voi sisältää albumiinia tai muita stabilointiaineita, kuten ionitonta detergenttiä, IFN-α.η stabiloimiseksi. Eluaattia inkuboidaan 15 alhaisessa pH:ssa vähintään 16 tuntia mahdollisten jäljellä olevien virusten inaktivoimisek-si. Eluaatti neutraloidaan lisäämällä emäksistä puskuria tai natriumhydroksidia. Neutraloidu eluaatti konsentroidaan ultrasuodattamalla. Vaihtoehtoisesti IFN-α voidaan sitoa ioninvaihtokromatografiageeliin.
20 Hiiren IgG ja sen fragmentit, jotka vuotavat immunoadsorbentista, ja mahdollisesti stabi lointiaineena oleva albumiini, poistetaan geelisuodattamalla tai ioninvaihtokromatografi-alla. IFN-a:n sisältävät fraktiot yhdistetään ja näin saatu puhdistettu IFN-a-lääkeaine säilötään jäädytettynä -70 °C:seen.
• · 25 IFN-a-lääkeaine stabiloidaan sopivalla stabilointiaineella, kuten albumiinilla tai ionitto-malla detergentillä ja suodatetaan virustenpoistosuodattimella, jonka huokoskoko on 10 -20 nm, jotta poistetaan jopa pienimmät vaipattomat virukset. IFN-a:n saanto virussuoda-tuksesta ja suodattimen kapasiteetti ovat selkeästi suuremmat kun käytetään albumiinin \ asemesta stabilointiaineena ionitonta detergenttiä, kuten polysorbaatti 80:aa, kuten esimer- 30 kissä 4 on kuvattu. Jos halutaan, voidaan käyttää kahta virustenpoistosuodatinta peräkkäin. Virussuodatus voidaan tehdä myös formuloidun bulkkiliuoksen steriilisuodatuksen jälkeen. Muita stabilointiaineita voidaan lisätä bulkkiliuokseen virussuodatuksen jälkeen.
On mahdollista myös formuloida IFN-a-lääkeaine sopivaan farmaseuttiseen koostumuk-35 seen ennen virussuodatusvaihetta, kuten kuvassa 1 on osoitettu.
7 105319 Tämän keksinnön mukainen menetelmä poistaa tehokkaasti kaiken tyyppiset leukosyytti-ja lymfoblastoidisoluviljelmissä olevat epäpuhtaudet, mitä osoittaa DNA:n enemmän kuin miljoonakertainen poistuminen, ja ovalbumiinin, joka on pääasiallinen heterologinen proteiini raakainterferonissa, noin miljoonakertainen poistuminen (esimerkki 2). Immunoad-5 sorbentista vuotavan hiiri-IgG:n taso on tyypillisesti alle 10 ng/3 mill. IU puhdistettua IFN-a:aa.
Tämä menetelmä on taloudellinen, koska se sisältää vain kaksi kromatografiavaihetta, ja se antaa hyvän saannon puhdistetusta lääkeaineesta, keskiarvon ollessa noin 60 % (laskettu 10 IFN-a:n immunokemiallisesta konsentraatiosta), kuten esimerkissä 2 on osoitettu.
Tällä menetelmällä on mahdollista saada IFN-α, jonka alatyyppikoostumus on vakio, mikä on osoitettu esimerkissä 3 vertaamalla 13:n eri lääkeaine-erän alatyyppikoostumusta. Vasta-aineiden eri tuotantoeristä peräisin olevien monoklonaalisten vasta-aineiden käyttö joh-15 taa hyvin samanlaiseen IFN-a:n alatyyppikoostumukseen, mikä kuvaa menetelmän kapasiteettia saada aikaan tuote, jonka laatu on pysyvä pitkäaikaisessa tuotannossa.
Seuraavat esimerkit selventävät keksintöä rajoittamatta sitä: 20 Esimerkeissä käytetyt analyyttiset menetelmät IFN-a-konsentraatio IFN-a-konsentraatio mitattiin aikaerotteisella fluoroimmunoanalyysillä (FIA) mikrotiitte- V rilevyillä. Ihmisen leukosyytti-IFN-a:n vastaista naudan antiseerumin IgG-fraktiota käy- 25 tettiin IFN-oc:n sitomisessa ja hiiren kahden IFN-a:n vastaisen Eu-Ieimatun monoklonaali- sen IgG-vasta-aineen seosta osoitukseen. Monoklonaaliset vasta-aineet olivat samat, joita käytettiin IFN-a:n puhdistuksessa. Analyysin yksityiskohdat on kuvattu toisaalla (Rönn- blom et ai., APMIS 105, 531 - 536,1997). IFN-a-konsentraatio ilmaistiin IU/ml käyttäen «. . laboratoriostandardia, joka kalibroitiin virusplakkien vähenemisanalyysillä interferonin « 30 kansainvälistä vertailuvalmistetta vastaan (the International Reference Preparation of Inter-, feron, Human Leukocyte 69/19 (NIBCS, U.K.)).
Interferonin antiviraalinen aktiivisuus IFN:n antiviraalinen aktiivisuus määritettiin virusplakkien vähenemisanalyysillä 35 mm 35 petrimaljoilla käyttäen ihmisen epiteelisoluja (Human Epithelial 2 (HEp2)), jotka oli altistettu vesicular stomatitis -virukselle (VSV). IFN-a-näytteistä, kontrollista ja standardista 8 105319 tehtiin Iaimennussaija 0,25 login välein konsentraatioon 0,3 -3 IU/ml ravintoalustaan Eagle's Minimum Essential Medium (EMEM), johon oli lisätty vasikansikiönseerumia (FCS), 7 %, ja aureomysiiniä, 0,004 %. Näytteet analysoitiin kolmena verrokkina neljänä laimennoksena vähintään kahtena analyysisarjana. Maljoille lisättiin 1 ml solususpensiota (2 x 106 5 solua/ml) EMEMiissä ja 1 ml näytelaimennosta. Kuhunkin analyysisarjaan sisällytettiin viruskontrollimaljat ilman IFNiia. Yli yön tapahtuneen inkuboinnin jälkeen 37 °C:ssa 3-4 % C02 ilmakehässä liuokset poistettiin konfluenteilta solukerroksilta ja lisättiin 150 - 200 PFU VSVitä 1 mlissä EMEMiiä. 40 - 45 minuutin inkuboinnin jälkeen virus poistettiin ja solut peitettiin 2 milliä 0,8 % agaria EMEMiissä. Yli yön kestäneen inkuboinnin jälkeen 10 virusplakit laskettiin. Yksi IFN-aktiivisuuden yksikkö on se näytteen suurin laimennos, joka inhiboi 50 % virusplakeista verrattuna viruskontrolliin. Interferoniaktiivisuus ilmaistiin kansainvälisinä yksiköinä (International Units, IU) käyttäen laboratoriostandardia, joka oli kalibroitu interferonin kansainvälistä vertailuvalmistetta vastaan (International Reference Preparation of Interferon, Human Leukocyte 69/19 (NIBCS, Iso-Britannia)).
15
Kokonaisproteiini
Kokonaisproteiinikonsentraatio määritettiin Lowryn menetelmällä käyttämällä standardina ihmisen albumiinia (Kokonaisproteiinistandardi, Suomen Punainen Risti, Veripalvelu, Helsinki, Suomi).
20
Hiiren IeG
Hiiren IgG-konsentraatio määritettiin entsyymi-immunoanalyysillä (EIA) mikrotiitterile-vyillä. Polyklonaalista vuohen anti-hiiri IgG, (Fc) F(ab')2 -fragmenttia (Jackson Immuno : Research Laboratories, USA) käytettiin IgGin sitomisessa ja polyklonaalista peroksidaasi- 25 konjugoitua vuohen anti-hiiri IgGitä (H+L) (Jackson Immuno Research Laboratories, USA) osoitukseen. Standardina käytettiin hiiren myelooma-IgG,:tä (Cappel, Belgia).
Ovalbumiini
Ovalbumiinikonsentraatio mitattiin aikaerotteisella fluoro-immunoanalyysillä (FIA) mik-,l 30 rotiitterilevyillä. Polyklonaalista kaniinin IgGitä kananmunan albumiinia vastaan (Organon Teknika Co, USA) käytettiin albumiinin sitomisessa ja polyklonaalista Eu-leimattua vuohen IgGitä kananmunan albumiinia vastaan osoituksessa (Organon Teknika Co, USA). Standardina käytettiin kananmunan albumiinia (Sigma, USA). Fluoresenssi mitattiin aikaerotteisella fluorometrillä (1234 Delfia Research Fluorometer, Wallac, Finland).
: 35 105319 9 '
Kokonais-DNA
Näytteet käsiteltiin natriumdodekyylisulfaatilla ja proteinaasi K:lla pH:ssa 11, ja DNA:n konsentraatio määritettiin Treshold Total DNA Kitillä (Molecular Devices, USA).
5 IFN-a:n alatvvppikoostumu?
IFN-a:n alatyypit eroteltiin käänteisfaasi-korkean erotuskyvyn nestekromatografialla (RP-HPLC). IFN-a-näyte (n. 1 mill. IU 400 μΐ-.ssa) syötettiin Delta-Pak™ HP1 C4-pylvääseen (Waters, USA.) ja eluoitiin lineaarisella gradientilla 40 - 55 % asetonitriiliä 0,1 % (v/v) trifluorietikkahapossa 57 min ajan virtausnopeudella 0,1 ml/min. Absorbanssia mitattiin 10 214 nm:ssa. Ihmisen albumiinia sisältävät IFN-a-näytteet ajettiin ensin Superdex 75 HR
10/30-pylväässä (Pharmacia Biotech, Uppsala, Sweden) 50 mmol/1 Tris puskurissa, pH 7,5, joka sisälsi 0,15 mol/1 NaCkia, albumiinin poistamiseksi IFN-a:sta.
IFN-a:n alatyyppien tunnistamiseksi RP-HPLC-huipuista, fraktioille tehtiin N-15 terminaalisen pään sekvensointi ja peptidimassakartoitus joko suoraan tai SDS-PAGE:lla tehdyn lisäerottelun jälkeen, muualla yksityiskohtaisesti kuvattujen menettelytapojen mukaisesti (Nyman et ai., Biochem. J. 329, 295 - 302, 1998).
Esimerkit 20
Esimerkki 1
Monoklonaalisten vasta-aineiden tuottaminen IFN-a:aa vastaan Tässä esimerkissä kuvataan menetelmän immunoadsorpti o vaiheessa käytettyjen monoklo-25 naalisten vasta-aineiden valmistus- ja valintakriteerit. Immunisaatiossa käytetty IFN-α oli osittain puhdistettua leukosyytti-interferonia (Finnferon-alpha, Suomen Punainen Risti, Veripalvelu). Sitä oli puhdistettu lisää immunoadsorptiolla käyttämällä naudan polyklo-naalisia anti-IFN-a-vasta-aineita, jotka oli kytketty CN-Br-Sepharoseen (Pharmacia Biotech, Ruotsi). Sitoutunut IFN-α eluoitiin alhaisessa pH:ssa ja stabiloitiin natriumdodekyy-.· 30 lisulfaatilla (SDS). Immunisaatiossa naaraspuolisille Balb/c-hiirille annettiin yksi intrape- ritoneaalinen injektio 5 mill. IU IFN-a:aa 0,25 ml:ssa täydellistä Freundin adjuvanttia, mitä seurasi 4 injektiota 5 -10 mill IU ilman adjuvanttia n. 14 vrk välein. Immunisoiduista hiiristä otettuja pernasoluja valmisteltiin fuusiota varten 4. päivänä viimeisen injektion jälkeen. Fuusiopartnerisolulinja oli ei-erittävä hiiren myeloomasolulinja Sp2/0-Agl4 ; 35 (ATCC CRL 1581), ja tymosyyttejä, jotka oli valmisteltu Lewis-rotista, käytettiin syöt- m täjäsoluina. Fuusioiva aine oli polyetyleeniglykoli 1500 ja ravintoalusta oli DMEM, joka 10 105319 oli täydennetty HTrlla ja 10 % FCS:llä.
Fuusion jälkeen solut alakloonattiin ja niistä testattiin hiiren monoklonaalisten vasta-aineiden tuotto ihmisen IFN-a:aa vastaan entsyymi-immunoanalyysillä käyttämällä puh-5 distettua ihmisen leukosyytti-IFN-a:aa IFN-a:n sitomisessa. Seuraavassa seulonta- vaiheessa valittiin lisätestausta varten monoklonaaliset vasta-aineet, jotka olivat voimakkaasti positiiviset. Pääasiallisessa seulonnassa, jossa tutkittiin sitoutumista, monoklo-naalisia vasta-aineita inkuboitiin ihmisen leukosyytti-interferonin kanssa. Lisättiin kaniinin anti-hiiri-IgG-vasta-aineita, jotka oli kytketty Sepharose 4B -geeliin (Pharmacia, Biotech), 10 ja inkubaation jälkeen geeli, jossa olivat sitoutuneet hiiren monoklonaaliset vasta-aineet ja IFN-a, erotettiin sentrifugoinnilla. Supernatant!sta määritettiin interferoniaktiivisuus. Vasta-aineet, jotka sitoivat vähintään 70 % interferoniaktiivisuudesta, valittiin lisätestausta varten kahden eri vasta-aineen yhdistelminä, ja vasta-aineita, jotka seoksena sitoivat vähintään 90 % aktiivisuudesta, pidettiin sopivina ehdokkaina immunoadsorptiokromatogra-15 fiavaihetta varten. Lisätestaus toteutettiin kytkemällä monoklonaaliset vasta-aineet CNBr-Sepharose 6B:hen (Pharmacia, Biotech) ja testaamalla niiden sitoutumisominaisuudet im-munoadsorptiolla. Valintakriteerinä oli, että kahden monoklonaalisen vasta-aineen tulisi yhdessä sitoa vähintään 90 % interferoniaktiivisuudesta, joka on läsnä leukosyyttiraakain-terferonissa, ja että alhaisessa pH:ssa eluoidun interferoniaktiivisuuden saannon tulisi olla 20 vähintään 80 % sitoutuneesta aktiivisuudesta. Kaksi hiiren monoklonaalista IgG vasta-ainetta, jotka valittiin puhdistusprosessiin, sitovat yhdessä kaikkia leukosyytti-IFN-<x:n pääasiallisia alatyyppejä (IFN-α 1, IFN-a2, IFN-a8, IFN-a 10, IFN-a 14, IFN-a 17, ja IFN-a21). Kumpikaan niistä ei sido beeta- tai omega-interferonia. Kuvassa 2 on esitetty tyypil-’ linen RP-HPLC-kromatogrammi tuotteesta, joka on puhdistettu käyttämällä näitä kahta 25 monoklonaalista vasta-ainetta immunoadsorptiossa.
Esimerkki 2 IFN -α-lääkeaineen puhdistaminen raakainterferonista ' 30 Tämä esimerkki toteutettiin seuraamalla vaiheita raakainterferonista puhdistetuksi lääkeaineeksi kuvan 1 esittämän kaavan mukaisesti. Solut poistettiin leukosyyttiviljelmästä ensin dekantoimalla ja mikrosuodatuksella käyttämällä 0,3 pm membraaneja. Suodos konsentroitiin 20-kertaisesti ultrasuodattamalla käyttäen 10 kD:n membraaneja. Jos konsent-raattia ei käytetty välittömästi, se varastoitiin jäädytettynä -40 °C:seen. Sulatuksen jälkeen • 35 konsentraatti suodatettiin 1,2 pm ja 0,22 pm suodattimien läpi, ja kirkastunut konsentraatti käsiteltiin 0,3 % tri(n-butyyli)fosfaatilla ja 1 % polysorbaatti 80:11a 16 tuntia 26 °C:ssa.
11 105319 S/D-käsitelyn jälkeen konsentraatti syötettiin imunoadsorbenttipylvääseen, joka sisälsi kaksi monoklonaalista vasta-ainetta (4 mg/tnl kumpaakin) kytkettynä CNBr-Sepharose 4FF-geeliin (Pharmacia Biotech). Kuormitus oli 30 - 40 mill. IU IFN-a:aa ml:aa geeliä 5 kohti. Immunoadsorbenttipylväs pestiin 40 keltaisella tilavuudella 0,011 mol/1 natriumfos-faattipuskuria, pH 7, 0,14 mol/1 NaCl (PBS), joka sisälsi 0,1 % polysorbaatti 80:aa, mitä seurasi 10 tilavuutta PBS:ää ilman polysorbaatti 80:aa. Sitoutunut IFN-α eluoitiin pH 2 -puskurilla. IFN-a:n stabiloimiseksi pH 2 -puskuriin lisättiin ihmisen albumiinia 0,2 g/1 (Suomen Punainen Risti, Veripalvelu). 18-20 tunnin inkuboinnin jälkeen pH:ssa 2, elu-10 aatti neutraloitiin lisäämällä hitaasti 0,5 mol/1 NaOHiia ja konsentroitiin noin 30-kertaisesti ultrasuodatuksella käyttämällä 10 kD:n membraaneja.
Konsentroitu eluaatti lisättiin Superdex 75 -pylvääseen (Pharmacia Biotech), joka oli tasapainotettu PBS:llä. IFN-a:aa sisältävät fraktiot yhdistettiin ja varastoitiin jäätyneenä -70 15 °C:seen. IFN-a:n saanto 11 puhdistuserästä on esitetty taulukossa 1.
Taulukko 1. IFN-a:n saanto puhdistusprosessista; esitettynä on keskiarvot, jotka _on laskettu IFN-a;n 11 puhdistuserän FIA-tuloksista_ 20
Menetelmävaihe Saanto Kumulat.
vaihetta kohti saanto _%_%_ 25 Raakainterferoni 100 100
Raakainterferonikonsentraatti 95 95 S/D-käsitelty konsentraatti 98 93
Immunoadsorptioeluaatti 80 74
Neutraloitu ja konsentroitu eluaatti 89 66 30 Puhdistettu lääkeaine_91_60_ » Mitään muita proteiiniainesosia IFN-a:n alatyyppien lisäksi ei voida osoittaa puhdistetussa " 35 lääkeaineessa SDS-PAGE-geelien hopeaväijäyksellä. Kun immunoadsorptiovaiheessa käytetään albumiinia stabiloijana, puhdistettu lääkeaine voi sisältää jopa 20 % albumiinia. Pääasiallisten heterologisten proteiiniepäpuhtauksien, joita ovat ovalbumiini ja hiiren IgG, määrittämiseksi on käytetty herkkiä immunokemiallisia analyysejä. Lääkeaine-erissä oval-bumiinin määrä standardiannoksessa 3 mill. IU IFN-a:aa on ollut 0,1 - 0,3 ng ja hiiren 40 IgG:n 1 - 9 ng. IFN-a:n puhdistuminen on ollut n. miljoonakertainen suhteessa ovalbumii- 12 105319 niin (taulukko 2).
Pääprosessista tulleen epäpuhtauden, tri(«-butyyli)fosfaatin määrä on ollut vähemmän kuin 0.2 pg per 3 mill. IU IFN-a:aa kolmessa analysoidussa lääkeaine-erässä. DNA:n määrä 5 mitattiin kahdesta lääkeaine-erästä, ja sen havaittiin olevan vähemmän kuin 60 pg per 3 mill. IU IFN-a:aa. IFN-a:n puhdistuminen oli enemmän kuin miljoonakertainen suhteessa DNA:han (taulukko 2).
10 Taulukko 2 IFN -<x:n puhdistuminen suhteessa ovalbumiiniin ja DNA:han puhdistus-prosessissa
Menetelmävaihe Ovalbumiini IFN-a:n DNA IFN-a:n puh- ng/3 mill. IU puhdistu- pg/3 mill. IU distuminen IFN-α minen IFN-a suhteessa suhteessa DNA:han ovalbumiiniin
Raaka-IFN 1,8 x 105 1,1 x 10® konsentraatti
Puhdistettu lääke- 0,2 0,9 xl O6 <60 >2xl06 aine 15 Esimerkki 3 IFN-a:n alatyyppikoostumus eri lääkeaine-erissä ' : Kuviossa 2 esitetään puhdistetun lääkeaineen tyypillinen RP-HPLC-kromatogrammi, joka saatiin käyttämällä esimerkissä 2 kuvattua menetelmää. RP-HPLC-kromatogrammi jaettiin 20 seitsemään huippuryhmään, kuten kuvion 2 pystysuorilla viivoilla osoitetaan. 11 lääkeaine-erän vertailu osoittaa, että huippujen suhteelliset alueet, ja niin ollen alatyyppikoostumus, säilyivät hyvin samanlaisena eri erissä (taulukko 3).
t » ,3 105319
Taulukko 3. IFN-a:n alatyyppikoostumus 11 lääkeaine-erässä. Esitetään RP-HPLC:llä analysoitujen eri alatyyppien osuus RP-HPLC IFN-a:n alatyyppi Keskiarvo RSD Alue huippu- (%) (%) (%) ryhmä 1 IFN-al4 7,2 15,8 6- 10 2 IFN-cc2 19,7 4,7 18-22 3 IFN-a21, mukana IFN-a4 9,9 12,4 8- 11 4 IFN-alO 8,7 7,7 7- 10 5 IFN-a 17, mukana IFN-a7 15,6 10,9 13-18 6 IFN-a 8 6,7 13,1 5-8 7 IFN-a 1 32,0 7,8 28 - 35 5
Kun immunoadsorbentin valmistuksessa käytettiin kahden monoklonaalisen vasta-aineen eri valmistuseriä, kummallakin immunoadsorbentilla saatiin hyvin samanlainen IFN-a:n alatyyppikoostumus (taulukko 4).
10
Taulukko 4. IFN-a:n alatyyppikoostumus lääkeaine-erissä, jotka on puhdistettu kahdesta vasta-aineen valmistuserästä saaduilla monoklonaalisilla vasta-aineilla valmistetuilla immunoadsorbenteilla, . RP-HPLC IFN-a-erät (n=2),puhdistettu IFN-a-erät (n=l 1), puhdistettu ; huippuryhmä vasta-aineilla ensimmäisistä vasta-aineilla toisista eristä eristä Huipun suhteellinen ala (%)
Huipun suhteellinen ala (%) 1 2 3 4 5 6 7 : 15 7,9 7,2 2 20,6 19,8 3 10,7 9,9 • l 4 8,2 8,7 5 14,2 15,7 6 6,1 6,7 7 32,4 32,0 h 105319
Esimerkki 4
Puhdistetun, valmiin IFN-a-tuotteen valmistus Tämä esimerkki toteutettiin formuloimalla puhdistettu lääkeaine ja tekemällä sille virus-5 suodatus ja steriilisuodatus kuviossa 1 esitetyn kaavan mukaisesti. Puhdistettu IFN-a-lääkeaine laimennettiin konsentraatioon noin 4 mill. IU/ml PBS:llä, joka sisälsi 1 mg/ml albumiinia. Formuloitu liuos esisuodatettiin 0,1 pm partikkelisuodattimella ja sen jälkeen Planova 15N -suodattimena (Asahi Chemical Industry Co, Japani). Planova-suodatus toteutettiin huoneenlämmössä käyttämällä vakiopainetta (0,9 baaria). IFN-a-saanto Planova-10 suodatuksesta oli n. 90 %.
IFN-a:n parantunut saanto (n. 100 %) ja monikertaisesti parempi suodatuskapasiteetti saavutettiin virussuodatusvaiheessa, kun albumiini korvattiin ionittomalla detergentillä, kuten polysorbaatti 80:11a, 0,2 g/1, puhdistettua lääkeainetta sisältävässä koostumuksessa.
15
Virussuodatettu IFN-a-liuos suodatettiin 0,1 tai 0,22 pm:n steriilisuodattimella ja annosteltiin aseptisesti lopputuotepulloihin.
• f -«
Claims (14)
105319
1. Menetelmä hyvin puhdistetun ja virusturvallisen α-interferonituotteen valmistamiseksi leukosyytti- tai lymfoblastoidi-interferonin raakavalmisteesta, tunnettu siitä, että 5 a) raakainterferonivalmisteelle tehdään liuotin/detergenttikäsittely, b) liuotin/detergenttikäsitelty koostumus saatetaan yhteyteen immunoadsorptiovaiheessa hiiren monoklonaalisten IgG-vasta-aineiden kanssa olennaisesti kaikkien pääasiallisten, luonnollisten α-interferonin alatyyppien puhdistamiseksi, c) monoklonaalisiin vasta-aineisiin sitoutuneet α-interferonin alatyypit puhdistetaan, 10 d) eluaatista poistetaan hiiren IgG:n jäämä ja muut epäpuhtaudet puhdistetun a- interferoniliuoksen tuottamiseksi, e) liuos stabiloidaan ja suodatetaan virustenpoistosuodattimella ja f) tuotteen lopullinen koostumus säädetään aseptista täyttöä varten.
2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että liuotinreagenssi on di- tai tri-(alkyyli)fosfaatti ja sitä käytetään valinnaisesti yhdessä ionittoman detergentin kanssa.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että raakainterfe-20 ronivalmiste, jolle tehdään liuotin/detergenttikäsittely, käsittää supematantin, joka on saatu 10-...40-kertaisesti konsentroidusta leukosyytti- tai lymfoblastoidisoluviljelmästä.
4. Jonkin patenttivaatimuksen 1 - 3 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että b- ·': vaiheessa IFN-α sidotaan immunoadsorbenttiin, joka sisältää vähintään kahta monoklo- 25 naalista vasta-ainetta, joilla on komplementaariset alatyyppispesifisyydet, kytkettynä kiinteään matriisiin.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että immunoadsorbentti „ sitoo vähintään 90 % leukosyyttiraakainterferonin aktiivisuudesta, ja että alhaisessa pH:ssa ·· 30 eluoidun interferoniaktiivisuuden saanto on vähintään 80 % sitoutuneesta aktiivisuudesta. 1 2 Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että monoklonaaliset vasta-aineet kykenevät sitomaan vähintään IFN-a:n alatyyppejä ai, a2, a8, a 10, a 14, ai7 jaa21. : 35 2 Jonkin patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että b-vaiheen 105319 jälkeen immunoadsorbenttipylväs pestään huolellisesti ja sitoutunut a-interferoni eluoidaan alhaisen pH:n omaavalla puskurilla, jonka pH on alle 3,0.
8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että käytetty eluoin-5 tipuskuri sisältää α-interferonin stabiloijan.
9. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että elu-aattia inkuboidaan alhaisessa pH:ssa 1 - 70 tuntia.
10. Patenttivaatimuksen 7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että eluaatti neutraloi daan ja konsentroidaan 20-.. .40-kertaisesti.
11. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että d-vaihe toteutetaan geelisuodatuksella tai ioninvaihtokromatografialla. 15
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä,ettäa-interferonia sisältävät fraktiot yhdistetään, ja siten saatu puhdas α-interferonilääkeaine varastoidaan -70 °C:seen.
13. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, t unn ett u siitä, että a- interferonilääkeaine formuloidaan sopivaan farmaseuttiseen koostumukseen ja suodatetaan virustenpoistosuodattimella, jonka huokoskoko on 10-20 nm, jotta poistetaan pienet vaipattomat virukset ja muut infektoivat aineet, jotka eivät ole inaktivoituneet käsittelyissä « ’ ' liuottimella/detergentillä ja alhaisessa pH:ssa, tai jotka eivät ole poistuneet immunoadsorp- 25 tiokromatografialla.
14. Jonkin edellisen patenttivaatimuksen mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että leukosyyteistä aloitettaessa menetelmä käsittää seuraavan yhdistelmän: - poistetaan leukosyytti viljelmän solut, 30. konsentroidaan näin saatu raakainterferoni, - ultrasuodatetaan raakainterferoni, - tehdään sille liuotin/detergenttikäsittely - adsorboidaan immunoadsorptiokromatografiaa käyttäen α-interferonit vähintään kahdella monoklonaalisella vasta-aineella, joilla on komplementaariset • 35 alary hmäspesifisyydet, - käsitellään immunoadsorptiokromatografiasta saatu eluaatti pH:ssa 2 - 2,5, ]7 105319 - neutraloidaan ja konsentroidaan eluaatti, - vähennetään vasta-aineiden jäämää geelisuodatuksella, - lisätään näin saatuun lääkeaineeseen stabilointiainetta ja tehdään virussuodatus ja - säädetään tuotteen lopullinen koostumus ja steriilisuodatetaan se ja täytetään asepti- 5 sesti. · · * I f 105319
Priority Applications (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI981338A FI105319B (fi) | 1998-06-10 | 1998-06-10 | Menetelmä multikomponentti-alfa-interferonin valmistamiseksi |
| PCT/FI1999/000506 WO1999064440A1 (en) | 1998-06-10 | 1999-06-09 | Alpha-interferon manufacturing process using immunoadsorption and virus removal filtration |
| AU47835/99A AU4783599A (en) | 1998-06-10 | 1999-06-09 | Alpha-interferon manufacturing process using immunoadsorption and virus removal filtration |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| FI981338A FI105319B (fi) | 1998-06-10 | 1998-06-10 | Menetelmä multikomponentti-alfa-interferonin valmistamiseksi |
| FI981338 | 1998-06-10 |
Publications (3)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| FI981338A0 FI981338A0 (fi) | 1998-06-10 |
| FI981338A FI981338A (fi) | 1999-12-11 |
| FI105319B true FI105319B (fi) | 2000-07-31 |
Family
ID=8551962
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| FI981338A FI105319B (fi) | 1998-06-10 | 1998-06-10 | Menetelmä multikomponentti-alfa-interferonin valmistamiseksi |
Country Status (3)
| Country | Link |
|---|---|
| AU (1) | AU4783599A (fi) |
| FI (1) | FI105319B (fi) |
| WO (1) | WO1999064440A1 (fi) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US8268974B2 (en) | 2003-05-29 | 2012-09-18 | Academia Sinica | Process to produce fibrillar proteins |
| CA2597754A1 (en) * | 2005-02-12 | 2006-08-17 | Viranative Ab | Methods and uses of antibodies in the purification of interferon |
| GB2460966B (en) * | 2008-03-13 | 2010-05-19 | Academia Sinica | Fibrillar fibronectin and uses thereof |
| US8357652B2 (en) | 2009-11-20 | 2013-01-22 | Academia Sinica | Anti-tumor fibrillar human serum albumin methods and compositions |
Family Cites Families (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPH0611235B2 (ja) * | 1980-04-11 | 1994-02-16 | セルテック・リミテッド | モノクロ−ナル抗体 |
| US4680175A (en) * | 1984-02-07 | 1987-07-14 | Interferon Sciences, Inc. | Interferon administration vehicles |
| SE468251B (sv) * | 1989-06-20 | 1992-11-30 | Bionative Ab | Reningsprocess foer interferon |
-
1998
- 1998-06-10 FI FI981338A patent/FI105319B/fi active
-
1999
- 1999-06-09 AU AU47835/99A patent/AU4783599A/en not_active Abandoned
- 1999-06-09 WO PCT/FI1999/000506 patent/WO1999064440A1/en active Application Filing
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| FI981338A (fi) | 1999-12-11 |
| WO1999064440A1 (en) | 1999-12-16 |
| FI981338A0 (fi) | 1998-06-10 |
| AU4783599A (en) | 1999-12-30 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Conlon et al. | Localization of human mononuclear cell interleukin 1. | |
| USRE43655E1 (en) | Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies | |
| KR100501263B1 (ko) | 정맥 주사용 면역글로불린의 제조 방법 및 그 외의 면역글로불린 제품 | |
| EP0433827B1 (en) | Cytotoxic lymphocyte maturation factor | |
| KR101119448B1 (ko) | 단백질 정제 방법 | |
| US7074404B2 (en) | Protein purification | |
| US6090923A (en) | Murine monoclonal antibody binding TNFα | |
| FI110002B (fi) | Menetelmä puhdistetun IgG-vasta-ainevalmisteen saamiseksi | |
| KR101293504B1 (ko) | 혼합형 또는 다중형 수지를 사용하는 인자 ｖⅰⅰⅰ의 정제 | |
| EP1308455B9 (en) | A composition comprising anti-HER2 antibodies | |
| DK169627B1 (da) | Monoklonale antistoffer mod human interleukin-4, hybridomaer producerende sådanne, fremgangsmåde og sæt til påvisning af human interleukin-4 samt fremgangsmåde til immunoprensning af human interleukin-4 | |
| JPH0794480B2 (ja) | 抗体及びその製造法 | |
| US6955917B2 (en) | Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies | |
| FI105319B (fi) | Menetelmä multikomponentti-alfa-interferonin valmistamiseksi | |
| US20100322943A1 (en) | Therapeutic and diagnostic affinity purified specific polyclonal antibodies | |
| KR940010024B1 (ko) | α-인터페론의 제조 및 정제 방법 | |
| US20190002537A1 (en) | Method for enriching a preparation of immunoglobulins with anti rsv immunoglobulins and preparation enriched in this way | |
| Evtushenko et al. | Blood protein purification and simultaneous removal of nonenveloped viruses using tangential‐flow preparative electrophoresis | |
| KR100297927B1 (ko) | 인간에리스로포이에틴의정제방법 | |
| Tölö et al. | Development of a Highly Purified Multicomponent Leukocyte IFN-α Product | |
| WO2023007445A1 (en) | Method of purifying immunoglobulin g and uses thereof | |
| CA3182315A1 (en) | An improved process of affinity chromatography | |
| IE84906B1 (en) | Cytotoxic Lymphocyte Maturation Factor |