FI110002B - Menetelmä puhdistetun IgG-vasta-ainevalmisteen saamiseksi - Google Patents

Description

110002

Menetelmä puhdistetun IgG-vasta-ainevalmisteen saamiseksi

Jakamalla erotettu hakemuksesta 922 380.

Tämä keksintö koskee puhdistettua valmistetta, joka 5 sisältää yhdistelmävasta-aineita, niiden käyttöä terapiassa ja menetelmiä niiden tuottamiseksi.

Vasta-aineet tai immunoglobuliinit ovat proteiineista koostuvia kaksitoimintaisia molekyylejä. Toinen alue, joka on hyvin vaihteleva eri vasta-aineiden kesken, 10 on vastuussa antigeeniin sitoutumisesta, esimerkiksi erilaisiin infektiivisiin agensseihin joita elimistö saattaa kohdata, kun taas toinen, vakioalue on vastuussa solujen Fc-reseptoreihin sitoutumisesta ja aktivoi myös komplementin. Tällä tavalla vasta-aineet edustavat nisäkkäiden im-15 muunivasteen elintärkeää osaa vieraitten mikro-organismien ja virusten tuhoamisessa. Eläimen immunisointi antigeenillä johtaa polyklonaalisten vasta-aineiden tuotantoon, toisin sanoen vasta-aineiden joilla on eri spesifiteetit ja affiniteetit. Terapeuttisia sovellutuksia varten on edul- . 20 lista kyetä tuottamaan vasta-aineita yhdestä lymfosyytti- « · · *;· # kloonista - sellaisia vasta-aineita nimitetään monoklonaa- • · · '· ’’ lisiksi vasta-aineiksi ja ne ovat spesifisiä alkuperäisen antigeenin tietylle determinantille. Ne voidaan hankkia Kohlerin ja Milsteinin menetelmällä (Nature, 1975, 256.

25 495 - 497) .

:**: Yksittäinen IgG-luokan vasta-ainemolekyyli koostuu kahdesta kevyestä ketjusta ja kahdesta raskaasta ketjusta, .·. : joita ketjujen väliset disulfidisidokset pitävät yhdessä.

Kukin kevyt ketju on kytketty raskaaseen ketjuun disulfi-30 disidoksella ja kaksi raskasta ketjua on kytketty toisiin-sa disulf idisidoksella. Kullakin raskaalla ketjulla on ’ yhdessä päässä vaihteleva alue, jota seuraa joukko vakio- alueita, kullakin kevyellä ketjulla on vaihteleva osa yh-. . dessä päässä ja vakio-osa toisessa päässä. Kevyen ketjun ’ ’ 35 vaihteleva osa on rinnakkain raskaan ketjun vaihtelevan 2 110002 osan kanssa. Kevyen ketjun vakio-osa on rinnakkain raskaan ketjun ensimmäisen vakio-osan kanssa. Raskaiden ketjujen jäljellä olevat vakio-osat ovat rinnakkain keskenään ja muodostavat Fc-fragmentin polypeptidiketjun rajoitetun 5 katkaisun jälkeen.

Kunkin kevyen ja raskaan ketjun muodostaman parin vaihtelevat osat muodostavat antigeeniä sitovan kohdan. Yhdessä raskaan ketjun ensimmäisen vakio-osan ja kevyen ketjun vakio-osan kanssa ne muodostavat Fab-fragmentin 10 polypeptidiketjun rajoitetun katkaisun jälkeen. Raskaan ja kevyen ketjun muodostaman kunkin parin vaihtelevilla osilla on sama yleisrakenne kuin kullakin osalla, ja ne muodostavat rungon, johon kuuluu neljä aluetta, joiden sekvenssit ovat suhteellisen konservoituneita, ja joita yh-15 distää kolme komplementaarisuuden määräävää aluetta (CDR).

Neljä runko-aluetta ottavat suurelta osalta β-levy-konfor-maation ja CDR:t muodostavat silmukoita, jotka yhdistävät β-levyrakenteen, ja joissakin tapauksessa muodostavat osan siitä. Runkoalueet pitävät CDR:t lähellä toisiaan ja toi-20 sesta alueesta peräisin olevien CDR:ien kanssa ne osallis- « · · ·.·’ tuvat antigeeniä sitovan kohdan muodostumiseen.

Antigeeni CDW52 (G. Hale ym. Tissue Antigens 1990 • · • ,ί,ί 3_5, s. 118-127) on runsaslukuinen molekyyli, joka löytyy : ·.: useimmista, ellei kaikista, ihmisen lymfosyyteistä. Se on 25 myös läsnä useimpien pahanlaatuisten lymfosyyttien pinnalla, muttei hemopoieettisten solujen pinnalla, eikä sitä liioin ekspressoida granulosyyteissä, verihiuta- . . leissa, ertyroidisissa tai myeloidisissa luuydinsoluissa.

• # · I.,' Tätä antigeeniä vastaan on tehty lukuisia isotyypeiltään 30 erilaisia monoklonaalisia vasta-aineita, jotka on : ’.'l raportoitu kirjallisuudessa (G. Hale ym. Tissue Antigens 1990 35, s. 118-127). Yksi näistä vasta-aineista, IgGl-vasta-aine, on humanisoitu (Nature, 1988, 322, 323 - 327 ja EPO 328 404) . Tämä vasta-aine tunnetaan nimellä Campath • * * ’· ’· 35 1H (Campath on The Wellcome Foundation Ltd:n tavara- 110002 3 merkki). Tämän vasta-aineen valmistetta on käytetty niiden potilaiden hoidossa, jotka kärsivät Non-Hodginin lymfoo-masta (G. Hale ym. Lancet, 1988, s. 1394-1399).

Campath 1H puhdistettiin alunperin yksivaiheisella 5 prosessilla proteiini A Sepharose -pylväällä (EPO 328404) . Proteiini A on ryhmäspesifinen ligandi, joka sitoutuu immunoglobuliinin Fc-alueelle; näin ollen muut immunoglo-buliinit, jotka ovat mukana viljelyelatusaineessa olevassa seerumissa, puhdistuvat halutun immunoglobuliinin mukana 10 ja näin kontaminoituvat lopputuotteen (P.A. Underwood ym. Meths. in Enzymol. 121 s. 301-306 (1986), ja P.A.

Underwood ym. J. Immunol. Meths. 60., 33, 1983).

Niitä vasta-aineita, joita aiotaan käyttää lääketieteellisessä terapiassa, tarvitsee kenties antaa toistu-15 vasti, joten tarve poistaa vieraat immunoglobuliinit on tärkeä, koska sellainen antaminen voi saada aikaan immuu-niresponssin ja aiheuttaa nefrotoksisuutta, seerumitautia ja vakavissa tapauksissa anafylaktisen shokin. Kokonainen eläimen seerumi tai seerumialbumiini sisältää muita pro-20 teiineja, lipidejä ja hiilihydraatteja; nämä molekyylit • · · ···’ voivat itse aiheuttaa immuunivasteen, mutta ovat suurem- maksi vaaraksi sikäli että ne voivat sisältää patogeenejä, • kuten agenssin joka aiheuttaa nautojen aivojen pehmennys-tautia (BSE) . Läsnä voi olla myös endotoksiineja, jotka 25 ovat epäsuotavia, koska ne aiheuttavat mahdollisesti koh-talokkaita pyrogeenisia responsseja.

Muihin epäpuhtauksiin ekspressoitua vasta-ainetta . . sisältävässä viljelmäelatusaineessa kuuluvat isäntäsolun *,.1 ja viruksen nukleiinihappo. Myös vasta-aineaggregaatit, •y1 30 koska nekin voivat toimia immunogeeneina ja aiheuttaa epä- : : : suotavan immuuniresponssin.

Tämä keksintö tarjoaa näin ollen yhdistelmävasta- * . aineen puhdistetun valmisteen, joka antaa # 1 1 1 1 · · • · 4 110002 1) kokoekskluusiokromatografiässä: yhden piikin ei -pelkistävissä olosuhteissa ja kaksi pääpiikkiä denaturoivissa ja pelkistävissä olosuhteissa; 2) tavanomaisessa SDS-polyakryyliamidigeelielektro- 5 foreesissa: yhden pääjuovan ei-pelkistettyä näytettä käy tettäessä ja kaksi pääjuovaa pelkistettyä näytettä käytettäessä; 3) käänteisfaasi-HPLC: ssä: yhden terävän piikin ei-pelkistävissä olosuhteissa ja kaksi pääpiikkiä pelkistä- 10 vissä olosuhteissa; ja 4) ominaisaktiivisuuden, joka on suurempi kuin 0,8 kiloyksikköä/ng.

Kokoekskluusiokromatografia, kuten sen nimi ehdottaa, erottelee proteiinien koon perusteella. Yleensä erot-15 telu tapahtuu niin, että suuret molekyylit eivät pääse sisälle huokoiseen stationäärifaasiin ja ne kuljetetaan suoraan pylvään läpi, samalla kun progressiivisesti pienemmät molekyylit kykenevät enenevässä määrin menemään sisälle stationäärifaasiin ja vastaavasti niiden eluutioajat 20 ovat erityisesti pitempiä. Juuri stationäärifaasin huokoi-suus määrää näin saavutetun erottelun. Tämä analyyttinen tekniikka on erityisen hyvä kun halutaan määrittää puhdis-tetun valmisteen aggregaattitaso. Stationäärif aasi on laa-jahuokoinen piidioksidigeeli, joka voidaan muokata dioli-25 ryhmillä, edullisesti sellainen geeli kuin Zorbax GF450-GF250 (DuPontin tavaramerkki) tai TSK geeli G3000 SWXL tai G4000 SWXL. Liikkuvan faasin pH on yleensä alueella 4-8, . . edullisemmin 6 - 7,5, edullisesti noin pH 6,8. Tämä faasi *it* on edullisesti fosfaatin, kuten dinatriumvetyortofosfaa- ·;*’ 30 tin, ja sulfaatin kuten natrium- tai kaliumsulfaatin, ja veden seos. Sellaisen seoksen molaarisuus on yleensä 25 mM - 1 M, edullisimmin noin 50 mM.

* . SDS-polyakryyliamidigeelielektroforeesi (SDS PAGE) i * * I » ’ ’ antaa tietoa seoksessa olevien proteiinien lukumäärästä ja ’· 35 tyypistä, niiden suhteellisesta runsaudesta ja arvion nii- 5 110002 den molekyylipainoista. SDS on anioninen detergentti, se saatetaan reagoimaan proteiinien kanssa ennen elektroforeesia. Useimmat proteiini-SDS-kompleksit ovat liukoisia ja liikkuvat polyakryyliamidigeelin läpi anodia kohti 5 sähkövarauksen vaikutuksen alaisena. Liikkumisnopeus on yleensä kääntäen verrannollinen proteiinin molekyylipainon logaritmiin. On mukavaa suorittaa SDS-analyysi gradient-tigeelissä joka voi olla vaakasuora levy tai pystysuoria levyjä tai sauvoja. Gradientti on edullisesti 10-22 % 10 tai edullisemmin 8 - 18 %. Geeli on edullisesti Pharmacia Excel (tavaramerkki) geeli.

Käänteisfaasi-HPLC erottelee hydrofobisuuden perusteella. Samoin kuin muissakin HPLC-tekniikoissa, on olemassa polymeerinen stationäärifaasi, esimerkiksi polysty-15 reeni/divinyylibentseeni. Liikkuva faasi on yleensä heikon vesiliukoisen puskurin tai laimean hapon ja veteen sekoittuvan orgaanisen liuottimen seos. Proteiinien tehokasta erottelua varten liikkuva faasi on yleensä gradienttijärjestelmä, joka vaaditaan erottelun aikaansaamiseksi, ja on 20 edullisesti lineaarinen mukavuussyistä.

Immunoglobuliinin analyysiä varten stationäärifaasi voi olla orgaaninen polymeerinen matriisi kuten Polymer : Labs PLRP-S, partikkelikooltaan yleensä noin 8 μτα; huokos- :*·.* koko on edullisesti 300 Ä tai 1 000 Ä. Liikkuva faasi on 25 edullisesti hapon, kuten muurahaishapon, etikkahapon tai trifluorietikkahapon, veden ja asetonitriilin seos. Happo • · * ja vesi ovat edullisesti läsnä suhteessa 5:3.

. . Vasta-aine voidaan pelkistää raskas- ja kevytketju- komponentteihinsa pelkistämällä disulfidisidokset denatu- ·;·’ 30 roivissa oloissa esimerkiksi guanidiumkloridilla ja ditio-;Y: treitolilla. Tätä seuraava vapaiden tioliryhmien alkyloin- ti, esimerkiksi jodiasetamidi-jodietikkahapolla, auttaa • » · * . estämään sidosten uudelleenmuodostumista.

Puhtausaste voidaan arvioida vasta-ainevalmisteen *· " 35 spesifisen aktiivisuuden perusteella. Spesifinen aktiivi- 6 110002 suus voidaan määrittää esimerkeissä annetulla menetelmällä. Keksinnön mukaisella valmisteella on edullisesti suurempi spesifinen aktiivisuus kuin 0,8 kiloyksikköä/mg, ideaalisesti suurempi kuin 0,9 kiloyksikköä/mg, edullisim-5 min noin 1,0 kiloyksikköä/mg.

Keksinnön mukainen puhdas vasta-ainevalmiste on ideaalisesti olennaisesti vapaa isäntäsoluepäpuhtauksista, kuten isäntäsolun proteiineista, nukleiinihapoista ja en-dotoksiineista. Spesifinen aktiivisuus antaa tietoa isän-10 täsoluproteiinin tasoista valmisteessa. Endotoksiinitasot voidaan mitata LAL-menetelmällä (Limulus-amebosyyttily-saatti), joka on kuvattu teoksessa Parenteral Quality Control, M.J. Alles ym., Marcel Dekker Inc., New York.

Keksinnön mukainen valmiste on myös olennaisesti 15 aggregaatt ivapaa kokoekskluusiokromatograf iällä mitattuna . Näiden tasojen on suotavaa olla alle 2 %, ideaalisesti alle 0,5 %. Keksinnön mukaiset vasta-aineet voidaan valmistaa rekombinanttiekspressiojärjestelmää käyttäen, edullinen järjestelmä on nisäkkään ekspressiojärjestelmä 20 joka käyttää kiinanhamsterin munasarjasoluja (CHO). Näistä ...* voi puuttua dihydrofolaattireduktaasi (dhfr) aktiivisuus ja niiden kasvu voi näin ollen olla riippuvainen tymidii-nistä ja hypoksantiinista (PNAS 77 1980, 4216 - 4220) .

Kantasolulinja dhfr" CHO transfektoidaan vasta-ainegeenillä :\j 25 ja dhfr-geenillä, joka mahdollistaa fenotyypiltään dhfr-positiivisten CHO-solutransformanttien selektion. Selektio • · * suoritetaan viljelemällä pesäkkeet elatusalustalla, josta . . puuttuu tymidiini ja hypoksantiini, joiden poissaolo estää • · · transformoitumattomien solujen kasvun ja transformoituja • · ···* 30 soluja kääntämästä folaattireittiä uudelleen kierrätys- :V: suuntaan (from resalvaging the folate pathway) ja näin ohittamasta selektiojärjestelmää. Nämä transformantit * . ekspressoivat yleensä alhaisia tasoja tuotegeeniä, mikä ’ * johtuu molempien transfektoitujen geenien kointegraa- ' " 35 tiosta. Vasta-ainegeenin ekspressiotasoja voidaan kohottaa 7 110002 monistamalla metotreksaattia (MTX) käyttäen. Tämä lääke on dhfr-entsyymin suora inhibiittori ja mahdollistaa sellaisten resistenttien pesäkkeiden eristyksen, jotka monistavat dhfr-geenin kopiolukua tarpeeksi, jotta ne 5 selviytyvät näissä oloissa. Koska dhfr- ja vasta-aine-geenit ovat läheisemmin kytkeytyneinä alkuperäisissä transformanteissa, tapahtuu yleensä yhteistä monistumista, ja näin ollen halutun vasta-ainegeenin ekspressio lisääntyy.

10 Toinen ekspressiojärjestelmä, jota voidaan käyttää CHO- tai myeloomasolujen kanssa, on glutamiinisyntetaasi (GS) monistusjärjestelmä, joka on kuvattu WO87/04 462:ssa. Tämä järjestelmä sisältää solun transfektoimisen geenillä, joka koodittaa GS-entsyymiä, ja halutulla vasta-ainegee-15 nillä. Sitten selektoidaan soluja, jotka kasvavat gluta-miinittomassa elatusaineessa. Nämä valitut kloonit alistetaan sitten GS-entsyymin inhibitioon käyttäen metioniini-sulfoksimiinia (Msx). Solut monistavat selviytyäkseen GS-geeniä, jolloin vasta-ainetta koodattava geeni monistuu 20 vastaavasti.

Vasta-aine saadaan edullisesti siinä muodossa, jos-sa se eritetään viljelmän elatusaineeseen. Kerätty elatus-aine voidaan sitten suodattaa ja/tai konsentroida ultra-·’·.· suodatusvaiheella, jolloin saadaan vettä sisältävä liuos, •\j 25 joka alistetaan puhdistusmenetelmään, johon kuuluu se että vasta-aineen vesiliuos pannaan • · · a) proteiini A -pylvääseen vasta-aineen absorboi- , . miseksi pylvääseen, ja vasta-aine eluoidaan sitten happa- • · » maila liuoksella; • * ·;·* 30 b) hapan eluaatti pannaan varauksellisia partikke- :V: leja sisältävään ioninvaihtopylvääseen vasta-aineen absor- boimiseksi, ja vasta-aine eluoidaan sitten varaukseltaan * , vastakkaisten ionien vesiliuoksella; ’ * c) vesiliuoksessa oleva eluaatti pannaan huokoisia ’·’· 35 partikkeleja sisältävään kokoeksluusiopylvääseen, jotta „ 110002 saadaan aikaan erottelu molekyylikoon perusteella ja haluttu vasta-aine saadaan pylväästä eluoiduissa valituissa fraktioissa.

Proteiini A on ryhmäspesifinen ligandi, joka sitou-5 tuu useimpien IgG-molekyylien Fc-alueeseen. Sitä tuottavat jotkut Staphylococcus aureus -kannat, ja se voidaan eristää viljelmän supernatanteista, sitten tehdä liukenemattomaksi agaroosipalloihin tai piidioksidiin kytkemällä. Vaihtoehtoinen menetelmä on käyttää kokonaisia bakteereja 10 sellaisesta kannasta, joka kantaa suuria määriä proteiini A: ta bakteerisolun pinnalla. Molemmat geelipreparaattityy-pit ovat saatavilla kaupallisesti. (Proteiini A - Pharmacia. Kokonaiset bakteerit - Calbiochem, IgG sorb). (Alan Johnstone ja Robin Thorpe, Immunochemistry in practice, 15 Blackwell Scientific Publications, kappale 10). Vaihtoehto proteiini A:lie on proteiini G (Analytical Chem. voi 61 (13) 1989, 1317).

Edullisimmin käytetty pylväs on Protein A Sepharose -pylväs, erityisesti Protein A Sepharose Fast Flow (tava-20 ramerkki). Pylväs pestään ideaalisesti tris:lla tai fos-..." faatilla puskuroidulla suolaliuoksella, pH noin 7,0, ja vasta-aine eluoidaan happamassa pH.-ssa 3,0 - 3,5, edulli-sesti pH 3,0, käyttäen happoa kuten esimerkiksi sitruuna-happoa noin 0,1 M konsentraationa.

;*·,· 25 Ioninvaihtokromatografia hyödyntää varattujen ryh- mien välisiä vuorovaikutuksia stationäärifaasissa ja näytettä joka on liikkuvassa faasissa. Stationäärifaasi voi . . ioninvaihtopylväässä olla positiivisesti varautunut katio- )tt* ninvaihtaja tai negatiivisesti varautunut anioninvaihtaja.

·;*’ 3 0 Varatut ryhmät neutraloidaan varaukseltaan vastakkaisilla ; vastaioneilla liikkuvassa faasissa ja vastaionit korvataan kromatografiän aikana voimakkaammin varautuneilla näytteen ’ . molekyyleillä. On edullista käyttää ristisidoksisia pyl väitä, jotka perustuvat esimerkiksi agaroosiin, esimerkik-*· ”35 si S.Sepharose Fast Flow (tavaramerkki) -kationinvaihto- , 110002 y pylvääseen, erityisesti S.Sepharose Fast Flow -kationin-vaihtoon (tavaramerkki). Vaihtoehtoisesti voitaisiin käyttää membraanipohjaista pylvästä. Pylväs pestään tavallisesti, sen jälkeen kun proteiini A -pylväästä peräisin 5 oleva eluaatti on pantu siihen, 20 mM HEPES-puskurilla pH 7,5, ja vasta-aine eluoidaan samalla puskurilla joka sisältää natriumkloridia alueella 0,2 M - 0,075 M.

Kokoekskluusiokromatografia erottelee, kuten sen nimikin viittaa, proteiinien koon perusteella. Yleensä 10 erottelu tapahtuu kun suuret molekyylit eivät mahdu sisään huokoiseen stationäärifaasiin ja ne kuljetetaan suoraan pylvään läpi, samalla kun progressiivisesti pienemmät molekyylit kykenevät enenevässä määrin menemään sisään stationäärifaasiin ja niillä on vastaavasti erityisesti pi-15 temmät eluutioajat. Juuri stationäärifaasin huokoisuus määrittää täten saavutetun erottumisen. Soveliaat materiaalit ovat kemiallisesti sitoutuneita ja ne antavat resistenssin kokoonpuristumiselle, esimerkiksi agaroosi ja/tai dekstraanikoostumus, kuten Superdex (tavaramerkki). Edul-20 linen pylväs on Superdex 200 -kokoekskluusioväliaine.

• · *

Ioninvaihtopylväästä peräisin oleva eluaatti pannaan edullisesti Superdex-pylvääseen ja ajetaan puskurissa pH-alueella 5-8, edullisesti PBSrssä pH 7,2. s*·,; Kukin pylväs on edullisesti suojattu suodattimena, : 25 joka voi olla 0,2 μ Gelman Aero -sterilointisuodatin tai proteiini A -pylvään tapauksessa PALL posidyne SLK 7002 • · k NFZP tai PALL DSLK2-suodatin (saatavilla Pall Process . . Filtration Ltd:stä, European House, Havant Street, Ports- mouth 301 3PD) ja kahta muuta pylvästä varten Millipak-··’ 30 suodatin, edullisesti Millipak 100 ioninvaihtopylvästä :Y: varten ja Millipak 20 tai 60 kokoekskluusiopylvästä varten (saatavilla Milliporelta, The Boulevard, Blackmore Lane, • , Watford, Herts.) . Pylväät sanitoidaan mielellään ennen

* ‘ käyttöä soveliaalla sanitointiaineella, esimerkiksi 0,5 M

’· H 35 NaOH:lla 16 tuntia minkä tahansa pylvään tapauksessa tai 10 1 10002 2 %:lla Hibitane-glukonaatilla 20 % etanolissa proteiini A -pylvään tapauksessa tai 1 N NaOH.-lla kahden muun pylvään tapauksessa. Sanitointiaineet pestiin soveliailla steriileillä puskureilla ennen proteiiniliuoksen applikointia.

5 Kaikki menetelmässä käytetyt liuokset olivat edullisesti steriilejä ja endotoksiinittomia.

Edellä hahmoteltuun puhdistusmenetelmään voidaan lisätä lisävaiheita. Voidaan käyttää ultrasuodatusta vi-rusepäpuhtauksien ja isäntäsolun nukleiinihappoepäpuhtauk-10 sien vähentämiseksi edelleen. Tämä voidaan suorittaa käyttämällä kaupallisesti saatavilla olevia ultrasuodatusyk-sikköjä kuten Viresolve/70' tai Viresolve/180' -membraa-neja, lisäksi PLMK-regeneroituja selluloosamembraaneja 300k poissuljentarajalla, jotka kaikki ovat saatavilla 15 Milliporelta, The Boulevard, Blackmore Lane, Watford, Herts. Vaihtoehtoinen menetelmä viruskontaminaation vähentämiseksi on mikrofiltraatio jossa käytetään nailonmemb-raania pakettimuodossa, esimerkiksi Nylon 66, 0,04M -memb-raania PALLilta.

20 Mukaan voidaan tuoda puhdistusvaihe DNA-epäpuhtauk- sien poistamiseksi, esimerkiksi proteiini A -pylvään pesu • jossa käytetään NaCl:ia puskurissa alueella IM - 3M neut-raalissa pH:ssa, edullisesti PBS:ssä, pH 7,2. NaCl:iin

:\j voidaan lisätä glysiiniä, edullisesti pitoisuutena 1,5 M

: 25 pH-alueella 8,8 - 9,0.

• ♦ *

Rekombinantti-DNA-teknologia on mahdollistanut muu- i · i tettujen vasta-aineiden tuottamisen, joita on kahta perustyyppiä. Ensimmäinen tyyppi, jota nimitetään kimeerisik- • I · ’· '* si vasta-aineiksi, on sellainen jossa jyrsijäperäiset ·>’ 30 vakio-osat pelkästään korvataan vastaavilla ihmisperäi- sillä osilla (Morrison ym. P. N. A. S. , 1984, 6851 - 6855,-

Boulianne ym., Nature. 1985, 314. 268 - 270; ja Neuberger • t ym., Nature. 1985, 314, 268 - 270). Toinen tyyppi on sel lainen, jossa kaikki hiiriperäiset vakio-osat ja hiiripe-

> I

1 · * 35 räiset runkoalueet on korvattu ihmisperäisillä vastaavilla 1X 110002 osilla ja alueilla. Tämä toinen vasta-ainetyyppi tunnetaan nimellä humanisoitu vasta-aine tai sellainen vasta-aine, johon CDR-osat on siirretty. (Jones ym. Nature. 1986, 321, 522 - 525; ja Riechmann ym. , Nature. 1988, 322. 323 -5 327) . Nämä vasta-aineet muistuttavat läheisemmin ihmisen vasta-aineita kun niitä annetaan ihmispotilaalle, eivätkä ne näin ollen saa aikaan samantasoista vasta-aineen vastaista responssia. Voitaisiin myös käyttää ihmisen vasta-ainetta .

10 Vasta-aine on edullisesti muutettu vasta-aine, ku ten hybridivasta-aine, jossa raskaat ja kevyet ketjut ovat homologisia luonnolliselle vasta-aineelle, mutta ovat yhdistyneitä tavalla jota ei luonnossa ilmenisi. Vasta-aine voi olla kimeerinen vasta-aine, jolla on vaihtelevat 15 alueet yhdestä vasta-aineesta ja vakioalueet toisesta. Täten kimeeriset vasta-aineet voivat olla laji/laji -kameroita tai luokka/luokka -kimeroita. Sellaisissa kimeeri-sissä vasta-aineissa voi olla yksi tai useampi lisä-muokkaus, jolla parannetaan vasta-aineen sitoutumiskykyä 20 tai muutetaan toimintaa efektorina. Toinen muutetun vasta-aineen muoto on humanisoitu vasta-aine tai sellainen vas- « » t':| ta-aine, johon CDR-osat on siirretty, mukaanlukien kooste- : vasta-aine, jossa CDR:ien lisäksi osia hypervaihtelevista *’·,· alueista siirretään ihmisrunkoon. Sellaisten vasta-ainei- • * : 25 den rungossa tai vakioalueissa voidaan muuttaa muitakin « » aminohappoja.

Puhtaat yhdistelmävasta-aineet ovat hyödyllisiä , , lääketieteellisessä terapiassa hoidettaessa erilaisia ih- misen sairauksia, yleensä immuunijärjestelmää suppressoi-·* 30 vina aineina, erityisemmin esimerkiksi T-soluvälitteisiä sairauksia, mukaanlukien vakava suonitulehdus, nivelreuma, systeeminen lupis, samoin autoimmuunisairaudet kuten mul-* r tippeliskleroosi, "graft versus host" syndrooma, psoria sis, nuoruusiän diabetes, Sjögrenin tauti, kilpirauhas- 1 · t 35 sairaus, myasthenia gravis, siirrännäisen hylkimisreaktio ! 12 1 10002 ja astma. Nämä vasta-aineet ovat myös hyödyllisiä hoidettaessa syöpiä kuten ei-Hodginin lymfoomaa ja leukemioita.

Keksintö tarjoaa näin ollen yhdistelmävasta-aineen puhtaan valmisteen valmistettaessa lääkettä minkä tahansa 5 yllä mainitun sairauden hoitoa varten. Tarjotaan myös menetelmä jolla hoidetaan ihmisolentoa, jolla on mikä tahansa sellainen sairaus, joka sisältää sen että annetaan mainitulle yksilölle terapeuttisesti tehokas määrä yhdistelmävasta-aineen puhdasta valmistetta.

10 Sellaisten vasta-aineiden annokset vaihtelevat hoi dettavan tilan mukaan ja hoidon vastaanottajan mukaan, mutta ovat alueella 1 - noin 100 mg aikuiselle potilaalle, edullisesti 1-10 mg, yleensä annetaan päivittäin 1-30 päivän jakson ajan. Kaksiosainen annostusohje voi olla 15 edullinen, jossa 1 - 5 mg annetaan 5-10 päivän ajan, jota seuraa 6-15 mg vielä 5-10 päivän ajan.

Keksintöön kuuluvat myös formulaatiot, jotka sisältävät yhdistelmävasta-aineen puhtaan valmisteen. Sellaisiin formulaatioihin kuuluvat edullisesti vasta-aineen 20 lisäksi fysiologisesti sovelias laimennusaine tai kantaja, mahdollisesti seoksena muiden aineiden kanssa, kuten muut . ·:: vasta-aineet ja antibiootti. Soveliaisiin kantajiin kuu- luvat, näihin rajoittumatta, fysiologinen suolaliuos, fos-faattipuskuroitu suolaliuos, fosfaattipuskuroitu suola-,·. ; 25 liuos-glukoosi ja puskuroitu suolaliuos. Vaihtoehtoisesti vasta-aine voidaan lyofilisoida (kylmäkuivattaa) ja tarvittaessa palauttaa uudelleen entiseen tilaansa lisäämällä yllä kuvatun kaltaista vesiliukoista puskuriliuosta. Anto- 1 1 » ‘> ’·’ reitit ovat rutiininomaisesti parenteraalisia, mukaan- 30 lukien laskimonsisäinen, lihaksensisäinen, ihonalainen ja vatsaontelon sisäinen injektio tai anto.

Liitteenä olevat kuviot esittävät: I *

Kuvio 1 « (a) pLD9-konstruktiota, joka sisältää ekspressio-\ 1: 35 kasetit "toimintakyvytöntä" dhfr-selektio/monistusmarkke- 13 1 10002 ria ja Campath-ΙΗ-kevytketjun cDNA:ta varten. Katkoviiva-nuolella osoitettu pieni laatikko on β-aktiinin promoottori; polyA viittaa vastaavasta lähteestä peräisin oleviin polyadenylaatio- ja terminaatiosignaaleihin; pieni laatik-5 ko, jossa on ori, sisältää SV40:n replikaatio-aloituskoh-dan; (b) pNH316-konstruktio, joka sisältää ekspressio-kasetit neomysiini-selektiomarkkeria ja Campath-1H-raskas-ketjun cDNA:ta varten. Laatikko, jossa on nuoli ja MT, 10 viittaa hiiren metallotioneiinipromoottoriin. Osoitetut restriktiokohdat ovat: - H, HindiII; Bg, Bglll; B, BamHI; Rl, EcoRI.

Kuvio 2 SDS-polyakryyliamidigeeli ei-pelkistetystä ja pel-15 kistetystä Campath lHzsta, jossa näkyy yksi pääjuova.

Kuvio 3

Korkean suorituskyvyn käänteisfaasikromatografia-käyrä ei-pelkistetystä Campath lH:sta, jossa näkyy yksittäinen piikki.

2 0 Kuvio 4

Korkean suorituskyvyn käänteisfaasikromatograf ia--'">1 käyrä pelkistetystä ja karboksimetyloidusta Campath ,Y: lH:sta, jossa näkyy kaksi toisistaan eroavaa piikkiä, jotka vastaavat vasta-aineen raskasta ja kevyttä ketjua.

.·, : 25 Kuvio 5

Korkean suorituskyvyn kokoekskluusiokromatografia-

t * I

käyrä ei-pelkistetystä Campath lH:sta, jossa näkyy yksit-. , täinen piikki.

Kuvio 6 ···' 3 0 Korkean suorituskyvyn kokoekskluusiokromatografia- käyrä ei-pelkistetystä Campath lH:sta, jossa näkyy kaksi pääpiikkiä.

14 1 10002

Esimerkki 1

Campath 1Η:η tuotanto CHO-soluista

Esimerkki IA: Campath-lH:n raskaan ja kevyen ketjun cDNA:n kloonaus 5 Rotan monoklonaalisesta Campath-1G:stä siirrettiin alunperin komplementaarisuuden määrittävät alueet suoraan ihmisen genomisiin raskaan ja kevyen ketjun runkoihin (Winter ym. Nature, 1988, 322, 323 - 327). Nämä konstruktiot muokattiin ekspressiota varten myeloomasolulinjassa 10 YO ja ne johtivat jopa 5 μg/ml Campath-lH-saaliisiin sen jälkeen kun oli viljelty 10 - 14 päivää viljelmässä (Hale ym. , Tissue Antigens, 1990, 35., 118 - 127 ja Winter ym. ,

Nature, 1988, 322, 323-327). Myeloomasolulinja TF57 (Hale ym. ibid.) käytettiin tuottamaan koon perusteella valitut 15 cDNA-fraktiot kooltaan 0,9 - 1,2 kiloemästä ja 0,4 - 1,7 kiloemästä, kevyiden ja vastaavasti raskaiden ketjujen cDNA.-ille. Näitä käytettiin tehtäessä EcoRI-linkkereillä varustettuja cDNA-kirjastoja lambda gtlO:ssä. Kaikki menetelmät olivat Huynhin ym. kuvaamia (DNA Cloning. Voi. I: 20 A Practical Approach, 1984, Glover, D (toimittaja), IRL Press, Oxford) . Täyspitkien cDNA-kloonien eristämisestä varten kirjastot seulottiin käyttäen [32P] nick-transloitu-ja koettimia, jotka olivat spesifisiä vaihteleville alu-.‘.j eille. Kevyen ketjun cDNA:ta varten 5'-pään transloituma- a · : 25 ton leader poistettiin kohtaan -32 saakka Bal-31 -eksonuk-» < · leaasia käyttäen ja Hindlll-linkkeri lisättiin. 3'-päätä varten hyödynnettiin ainutkertaista Sacl-kohtaa 47 emäspa-, , ria ylävirtaan lopetuskodonista. Käytettiin synteettistä « I * ’·"· SacI-Hindlll-oligonukleotidiparia tämän sekvenssin luomi- • ♦ 30 seksi uudelleen ja sijoittamiseksi HindiII-kohtaan heti lopetuskodonin jälkeen. Raskaan ketjun cDNA:n 5'-päätä .···. varten käytettiin ainutkertaista Ncol-kohtaa, jolla on • ( yhteisiä jaksoja ATG-aloituskodonin kanssa, jotta saatiin

• I I I I

rakennettua uudelleen 29 emäsparin transloitumaton leader, :* 3 5 joka on identtinen kevyen ketjun leaderin kanssa, niin is 110002 että käytettiin Hindlll-NcoI-oligonukleotidiparia. 31-päässä ainutkertainen Nael-kohta 12 emäsparia lopetus-kodonista alavirtaan muutettiin HindiII-kohdaksi linkke-reitä käyttäen.

5 Esimerkki IB:Vektorien muodostaminen:

Ihmisen β-aktiinipromoottori irrotettiin pHSAPr-3-Neo:sta, (joka vastaa ρΗβΑΡΓ-1-neo:ta (Gunning ym. P.N.A. S. . 1987, 84., 483-35) paitsi että SV40:n polyadeny-laatio/terminaatiosignaali on korvattu vastaavilla ihmisen 10 β-aktiinisignaaleilla) 2 680 emäsparin PvuII-HindIII-frag-menttina, jossa PvuII-kohta muutettiin tämän jälkeen BglII-kohdaksi linkkereitä käyttäen. Jotta ihmisen β-ak-tiinin polyadenylaatio- ja terminaatiosignaalit olisi saatu eristettyä pHfiAPr-3-neo:sta, SphI-kohta ainutkertaises-15 ta HindiII-kohdasta 1,4 kiloemästä alavirtaan muutettiin BamHI-kohdaksi linkkereitä käyttäen. Perus-dhfr-vektori nimeltään pl04 muodostettiin seuraavasti. SphI-kohta kohdassa -128 SV40-promoottorissa pSV2dhfr:ssä (Subramani ym. Mol. Cell. Biol.. 1981, 1, 854-864) muutettiin Sall-koh- 20 daksi, jotta kaikki tehostajaelementit saataisiin poistet-tua promoottorista. Heikennetty dhf r-ekspressioyksikkö t‘'.j subkloonattiin sitten Sali-BamHI-fragmenttina pSVOd:n ho- ,Y: mologisiin kohtiin (Mellon ym. , Cell. 1981, 2J7, 279 - • · 288) .

* · ; 25 pLD9:n muodostamiseksi pl04-vektori digestoitiin • ·

BamHI :11a, käsiteltiin fosfataasilla ja ligoitiin kolmen • · · muun fragmentin kanssa, jotka olivat Bglll-Hindlll β-ak-, , tiinipromoottori, Hindlll Campath-lH-kevytketjun cDNA ja '·’· Hindlll-BamHI β-aktiinin polyA/terminaatiosignaalit.

...* 30 pNH316:n muodostamiseksi konstruktio pDBPV-MMTneo (Law ym. , Mol. Cell. Biol. . 1983, 3., 2110 - 2115) digestoitiin i *

BamHI :11a, käsiteltiin fosfataasilla ja neomysiinigeenin • t sisältävä fragmentti eristettiin sen jälkeen kun oli suo-

» I I I I

ritettu erottelu agaroosigeelillä. Tämä ligoitiin kah-*.·: 35 teen β-aktiinifragmenttiin ja Campath-1H -raskaan ketjun 1β 1 10002 16 cDNA:han. Konstruktiot, pLD9 ja pNH316, esitetään kuviossa 1.

Esimerkki 1C: Campath-1H:n ekspressio CHO-soluissa dhfr" CHO-solulinjaa DUK-B11 (Urlaub ym. , P.N.A.S., 5 1980, 77, 4216-4220) kasvatettiin Iscoven MEM:ssa, jos sa oli lisäksi 10 % naudan vasikan seerumia ja 4 μ$/τα1 sekä hypoksantiinia että tymidiiniä. 10 μg pLD9:ää ja pNH316:tta kopresipitoitiin soluihin kalsiumfosfaatti-menetelmää käyttäen (Gorman ym. , DNA Cloning. 1985, Voi 10 II, 143-190, Academic Press, N.Y.) ja selektoitiin dhfr+/-neo-resistenssin kaksoisfenotyyppiä käyttämällä yllä kuvattua elatusainetta paitsi että käytettiin 10 % dialysoi-tua seeruia, hypoksantiini/tymidiini jätettiin pois ja G418 (Gibco) sisällytettiin mukaan (500 μg/ml) . Joissakin 15 kokeissa MTX pantiin suoraan mukaan dfhr+-transformanttien ensimmäiseen selektiokierrokseen. Useita satoja resistenttejä pesäkkeitä yhdistettiin ja tutkittiin Campath-1H-vasta-aineen tuotantoa viljelyelatusaineessa. Keskimääräinen saanto oli 0,5 μg/τal ei-monistetuille ensimmäisen vaiheen 20 transformanteille.

Y' Kutakin yhdistettyä solupopulaatiota viljeltiin *·:I sitten 10~7 MTX:n läsnäollessa ja kahden viikon kuluttua t ♦ resistentit pesäkkeet yhdistettiin taas ja titrattiin • · : Campath-lH:n tuotanto. Saanto oli noussut merkittävästi, » · t«f j 25 jopa 80-kertaiseksi (taulukko 1) . Nämä solut kloonattiin laimennossarjaa käyttäen, seulottiin Campath-lH:n saalista * 2 » i « i ' silmälläpitäen ja eristettiin kaksi hyvätuottoista linjaa nimeltään A37 ja 3D9 (taulukko 1). Nämä monistettiin mo-'> *: lemmat 10"6 MTX:n läsnäollessa, kloonattiin sitten laimen- ’,,,· 3 0 nossarjaa käyttäen ja seulottiin kuten yllä. Ekspression t lisääntyminen tässä toisessa ja viimeisessä monistusvai-,*>, heessa ei ollut niin dramaattinen kuin aikaisemmin ha- t > ’·’ vaittu; kuitenkin kun niiden annettiin kasvaa konfluen- teiksi ja jätettiin vielä 4 päiväksi, solulinjat A39 ja * * 35 3D11 kykenivät tuottamaan jopa 200 μ9/ηι1 Campath-1H: ta.

110002 17

Taulukko 1

Campath-lH:n ekspressiotasot vaiheittaista monistusta käyttäen 5 Konstruktio Selektiovaihe Kerääntynyt

Campath-1H (pg/ml) pLD9 + pNH316 dhfr*/neo-peruspooli 0,5 10 10‘7 M MTX monistettu pooli 18-40 solulinjat A37 ja 3D9 40 10"6 M MTX monistettu pooli 60-90

Solulinja A39 100

Solulinja 3D11 150-200 15

Solujen annettiin kasvaa konfluenteiksi T-175 ku-dosviljelypullossa, sitten ne ravittiin uudelleen tuoreella 50 ml:lla kudosviljelyelatusainetta ja jätettiin vielä 4 päiväksi. Campath-lH-vasta-aine, joka oli kerääntynyt 20 elatusaineeseen tämän vaiheen aikana, mitattiin ELISAlla.

Solujen kokonaismäärät määrityspäivänä olivat yleensä ...* 2,5 x 107. Saanto 3Dll-solulinjasta viittaa tuottavuu- teen 100 ^g/106 solua/päivä.

• « .:: Kotransfektiovektoreita PLD9 ja pNH316 käytettiin 25 vielä arvioitaessa vaihtoehtoista monistusstrategiaa yllä kuvatulle. dhfr~ CHO-solut kotransfektoitiin tavanomaiseen tapaan, ja kahta päivää myöhemmin jaettiin suoraan sarjaan * * · pulloja, jotka sisälsivät G418:aa (neomysiiniselektiota , . varten) ja kasvavia MTX-pitoisuuksia alueella 3 x 10~9 M - • · · *,,* 30 10"7 M. Kaksi viikkoa tämän selektion jälkeen kunkin pullon * · ·”’ resistenttien pesäkkeiden määrä laskettiin ja yhdistet- :V: tiin. Kun solupopulaatiot olivat stabiloituneet, niistä määritettiin Campath-1H -vasta-ainetiitterit ja tulokset ‘ . esitetään taulukossa 2. MTX-tason kasvaessa selviytyvien 35 dhf r+-pesäkkeiden määrä väheni merkittävästi, mutta ne eks- • * t • · « • · 110002 18 pressoivat suhteellisesti enemmän Campath-1H:ta. Täten on mahdollista eristää yksivaiheisella korkeita MTX-pitoi-suuksia käyttävällä selektiolla solupopulaatioita, joiden tuottama vasta-ainesaalis on jopa 60-kertainen verrattuna 5 solupopulaatioihin, jotka on selektoitu perus-dhfr-tasojen perusteella.

Taulukko 2

Campath-1H:n ekspressiotasot suoraa selektiota 10 käyttäen

Selektio (M MTX) dhfr+-pesäkkeet Kasaantunut

Campath-1H

{μ$/ταΙ) 15 _

Ei MTX:ää 500 0,5 3 X 10’9 40 2 10~8 5 7 3 x 10'8 5 30 20 10’7

Kussakin MTX-selektiovaiheessa pesäkkeet yhdistet- ·.!· tiin ja määritettiin kuten on kuvattu taulukon 1 tekstis- . :: sä.

• · :*·,· 25 Tämä selektiomenetelmä toistettiin sen jälkeen kun | oli tehty toinen kotransfektio soluille, ja tässä tapauk- sessa koko populaatiota selektoitiin elatusaineessa, joka sisälsi G418:aa ja 3 x 10"8 M MTX:n. Tämä tuotti suuremman . . poolin resistenttejä pesäkkeitä, jotka yhdistettiin sen • · · 30 jälkeen ja saatettiin uudelleen monistumaan vielä kahdesti ···’ käyttäen MTX-konsentraatioita 6 x 10“7 M, sitten 3 x 10"6 M.

Tässä vaiheessa solut kloonattiin laimennossarjaa käyttäen ja seulottiin Campath-1H-tasoja silmälläpitäen. Kaksi eni- • · · * , ten tuottavaa solulinjaa, jotka eristettiin, kykenivät 19 110Q02 tuottamaan vasta-ainetasoja jopa 100 - 150 μg/ml ja niille annettiin nimiksi 4F11 ja 5E10.

Näiden solulinjojen, ja ylläkuvattujen A39/3D11-linjojen, kasvunopeudet olivat merkittävästi hitaampia 5 kuin ei-transformoitujen dhfr" CHO-kantasolujen. Tämä on yleensä näiden solujen yhteinen piirre, koska ne on muokattu ekspressoimaan suuria määriä tuotegeeniä. Saannot 5E10- ja 4Fll-solulinjoista osoittautuivat olevan varsin vaihtelevia ajan mittaan, ja jälkimmäisen solusukupol-10 vi-ikä osoittautui vain rajoitetuksi, ja se kesti noin 3 viikkoa ennen kriisiin saapumista ja kuolemaa. Tämä epävakaus ei ollut lainkaan ilmeinen muissa solulinjoissa, vaikkakin yleensä toisesta monistusmenetelmästä eristetyt linjat, 5E10 mukaanlukien, olivat yleensä epävakaisempia 15 viljellä. Kaikista linjoista 3Dll:ssä yhdistyivät hyvä kasvu ja stabiilisuus korkeisiin Campath-lH-saaliisiin. Näiden piirteiden jatkumisen varmistamiseksi 3Dll-solulin-ja kloonattiin laimentamalla vielä kerran, jolloin saatiin 3Dll*-linja ja tämä tuotti vastaavasti jopa 200 μg/ml:n 20 Campath-lH-saantoja.

Esimerkki 2 C1H 3D11* 44 :n kasvatus ja tuotanto seerumittomassa » · . elatusaineessa • · C1H 3D11* -solut, jotka kasvoivat yksikerrosviljel- .*· : 25 mänä Iscoven elatusaineessa + 10 % FBS, Flow, ei-välttä-• · · : mättömät aminohapot, 10"6 metotreksaatti ja antibiootit, ·;·_ olivat arviolta 90 %:n konfluentteja. Nämä solut poistet tiin muovin pinnalta trypsiini/versenellä, pestiin Iscoven elatusaineessa ilman lisäaineita, sentrifugoitiin ja re- * · · *· ’* 30 suspendoitiin 5 x 104/ml WCM4-elatusaineessa, joka on tuotu ...* julki taulukossa alla + 0,25 % peptoni + 0,1 % polyetylee- niglykoli (PEG) 10 000 + 0,5 % fetaalinaudan seerumia .··. (FBS) ilman metotreksaattia (MTX) . Kolme 25 cm2 pulloa pan- • · · • ^ tiin kasvamaan 10 ml :11a solususpensiota + hypoksantiini 110002 20 (H), tymidiini (T) tai HT. Näitä pulloja inkuboitiin 36,5 °C:n lämpötilassa 5 % C02-lämpökaapissa.

Kuuden päivän kuluttua pullojen sisällöt yhdistettiin ja lisättiin yhtäsuureen tilavuuteen elatusainetta + 5 MTX ilman peptonia tai PEG:ia, ja siirrettiin 75 cm2 pulloon .

Näitä soluja käytettiin jaettaessa soluja 500 ml:n Techne-spinneriin, jota inkuboitiin 36,5 °C:n lämpötilassa 40 rpm:n kierrosnopeudella. Solut jatkoivat kasvamista 10 seerumittomassa elatusaineessa yli viiden kuukauden ajan ja vaikkakin havaittiin, että solut tarvitsivat sopeutumisajan, kasvunopeus ja elävien solujen osuus kasvoi tasaisesti. Populaation jakautumisajan laskettiin olevan 73,1 tuntia noin 7 viikon aikana; tämä laski 47,4 tuntiin 15 seuraavan 20 päivän aikana ja vakautui sitten. Vasta-ainetta erittyi edelleen paljon yli 60 ^g/ml:n tasoina. Northern blottaus-analyysistä saatua juovan intensiteettiä käyttäen määriteltiin, että geenin kopioluku ei laskenut näissä soluissa.

20 Fermenttereissä nämä solut tuottivat vasta-ainet ta jopa 70 ^g/ml ja saavuttivat säännöllisesti tasoja ...· 100 μg/ml tai enemmän. Näille soluille annettiin nimeksi ·/:; C1H 3D111 2 3 4 44.

: WCM4-elatusaine 25 Iscoven MEM (Iscoven N ja Melcher (1978) J. Exp.

: Med. 1, 47, 923) jota muokattiin niin että siitä poistettiin BSA, transferriini ja lesitiini · ^__^^^__^_ 2 • · · " 3 30 + 5 ml/litra 200 mM L-glutamiinia 4 + 50 mg/litra L-proliinia :Y: + 50 mg/litra L-treoniinia + 50 mg/litra L-metioniinia + 50 mg/litra L-kysteiiniä ‘ ‘ 35 + 50 mg/litra L-tyrosiinia • · · • · 110002 + 25 mg/litra askorbiinihappoa + 0,062 mg/litra vitamiini B6:tta + 1,36 mg/litra vitamiini B12:ta + 0,2 mg/litra rasvahappoa (lipoic acid) 5 + 0,088 mg/litra metyylilinoleaattia + 1 μΜ metotreksaatti + 1 mg/litra FeS04:ää + 1 mg/litra ZnS04:ää + 0,0025 mg/litra CuS04: ää 10 + 5 mg/litra rekombinantti-insuliinia (Nucellin) + 50 000 IU/litra polymyksiiniä + 20 000 IU/litra neomysiiniä + 0,16 mg/litra putreskiini-2 HCl-.ää.

15

Aikaisemmasta vaiheesta peräisin olevat C1H 3Dll*44-solut jotka olivat kasvaneet seerumittomasti yli 2 kuukautta, siirrettiin 1 litran SGi-fermentteriin jossa oli ruostumattomasta teräksestä valmistettu viistolapainen 20 sekoitin, joka pyöri nopeudella 70 rpm. Lämpötila asetettiin 37°C:seen, d02 10 %:iin ja pH-kontrolli 7 - 7,2:een. Fermentteriin jaettiin päivänä 0 0,22 x 106 solua/ml WCM4-·/:· elatusaineessa 0,1 % polyetyleeniglykolissa (PEG) 10 000 ja 0,25 % soijapeptonia, ja kaasutila täytettiin 02:lla. 25 Soluja kasvatettiin rutiininomaisesti käyttäen tuoretta .·. : elatusainetta ja harvennusta tyypillisesti suhteiden 1:2 » ♦ ♦ ja 1:4 välillä.

• i t Päivänä 33 kaasutilan hapetus vaihdettiin liuoksen läpi kuplitukseen, jonka odotetaan aiheuttavan soluille • · 30 enemmän fysikaalista vauriota.

Päivästä 50 eteenpäin WCM5:tä (katso taulukko alla) käytettiin yhdessä peptonin kanssa ja PEG: ia WCM4:n sijas-ta.

t » • · · » > · > · 110002 22 Päivänä 53 PEG korvattiin 0,1 % pluronisella (plu-ronic) F68:lla. Tuloksena olevat saavutetut kasvu- ja vasta-ainetasot olivat yli 100 μg/ml fermenttereissä.

5 WCM5-elatusaine

Iscoven DMEM, jota oli muokattu niin että siitä puuttuivat BSA, transferriini ja lesitiini + 5 ml/litra 200 mM L-glutamiinia 10 + 50 mg/litra L-proliinia + 50 mg/litra L-treoniinia + 50 mg/litra L-metioniinia + 50 mg/litra L-kysteiiniä + 50 mg/litra L-tyrosiinia 15 + 25 mg/litra L-askorbiinihappoa + 0,062 mg/litra vitamiini B6:tta + 1,36 mg/litra vitamiini B12:ta + 2 mg/litra rauta(III)sitraattia + 1 mg/litra sinkkisulfaattia 20 + 0,0025 mg/litra kuparisulfaattia + 50 000 IU/litra polymyksiiniä + 20 000 IU/litra neomysiiniä . + 3 μΐ/litra etanoliamiinia + 0,16 mg/litra putreskiinia /•j 25 + 5 mg/litra rekombinantti-insuliinia ,·. : (Nucellin)

Kaikki ainesosat WCM4:ssä ja WCM5:ssä ovat kaupal- • * » lisesti saatavilla.

Esimerkki 3 • · · 3 0 Campath lH:n puhdistus (G Dev-95)

Materiaalit ja menetelmät Käytetty puhdistusmenetelmä perustui kromato-.··. grafiaan kolmen pylvään läpi. Käytetyt geelit olivat • 7,85 ml:n Protein A Sepharose 4 Fast Flow, Pharmacian 35 koodi nro 17-0974-04 (10 cm x 1 cm); 7,85 ml:n S Sepha- *,*: rose Fast Flow -kationinvaihtaja, Pharmacian koodi nro 23 1 10 0 0 2 17-0511-01 (10 cm x 1 cm); ja 120 ml:n Superdex 200 kokoekskluusioväliaine, Pharmacian koodi nro 17-1046-01 (60 cm x 1,6 cm). Kukin pylväs suojattiin 0,2 μιη Gelman Aero -sterilointisuodattimellä .

5 Laitteiston ja liuoksien valmistus

Proteiini A -pylväsjärjestelmän laitteisto pestiin 1 N NaOHrn läpi ja jätettiin tähän liuokseen 24 tunniksi endotoksiinin poistamiseksi. Geeli pakattiin sitten Pharmacia C10/20 -pylvääseen ja sanitoitiin 2 % Hibitane-glu-10 konaatilla 20 % etanolissa. Koska valmistajan mukaan S Sepharose ja Superdex 200 -geelit ovat molemmat stabiileja 1 N NaOH:ssa pitkiä aikoja, nämä geelit pakattiin pylväisiinsä (Pharmacia C10/20 ja vastaavasti C16/100 -pylväs), pestiin läpikotaisin 1 N NaOH:lla ja jätettiin 15 seisomaan tähän liuokseen 24 tunniksi endotoksiinin poistamiseksi ja pylväsjärjestelmien sanitoimiseksi.

Pylvään toimintaa ja sanitointia varten liuokset valmistettiin käyttäen pyrogeenitonta tislattua vettä joka oli steriilisuodatettu 0,2 μτη:ϋη asti Millipore Millipack 20 100 -suodattimien läpi. Kaikista liuoksista otettiin näyt teet LAL-testiin perustuvaa endotoksiinimääritystä varten ...' ja vain niitä käytettiin, joiden arvot olivat alhaiset.

·,“· Pylvään toiminta . : Proteiini A Sepharose 4 Fast Flow -geeli :*·.* 25 Esimerkistä 1 peräisin oleva kudosviljelyelatusai- j ne, joka sisälsi Campath 1H -vasta-ainetta, toimitettiin ja suodatettiin 0,2 μιη:ϋη saakka steriilin PALL posidyne SLK7002 NFZP-suodattimen läpi Sealkleen-kotelossa. 2 % . , Hibitane-glukonaatti 20 % etanolissa, jota käytettiin sa- I · I • I * 30 nitoimaan proteiini A -pylväs, poistettiin tislatulla ve-;·* della ja järjestelmä tasapainotettiin Tris-puskuroidulla suolaliuoksella, pH 7,5 (T .B.S.). Proteiini A -pylväs la-dattiin sitten 1,75 litralla epäpuhdasta Campath lH:ta • , (71,4 mg) virtausnopeudella 300 cm/tunti (235 ml/tunti) ‘ [ 35 lämpötilassa 20 °C ± 5 °C. Sitoutumaton materiaali pestiin I I I » » » 24 1 10 0 0 2 pylväsjärjestelmästä 5 geelin tilavuudella (39,25 ml) T.B.S:ia, pH 7,5, samalla virtausnopeudella. Proteiini A -geeli eluoitiin nopeudella 300 cm/tunti 0,1 M sitruunahapolla, pH 3,0, < 24 tuntia huoneenlämpötilassa. Eluutio-5 profiilia monitoroitiin A280 nm-.ssa Pharmacia UV1 yksiva-loteistä monitoria käyttäen ja proteiinipiikki eristettiin. Eluutiopiikin tilavuus oli 18,9 ml ja 1 ml tästä otettiin sivuun ja Campath 1H määritettiin ELISA:11a kuten alla kuvataan.

10 S. Sepharose Fast Flow -geeli 1 N NaOH pestiin S. Sepharose -pylväsjärjestelmästä 20 mM HEPES:llä, pH 7,5, kunnes ulostulleiden pylvään pe-suliuosten pH oli 7,5. Jäljelläoleva 17,9 ml proteiini A -pylvään eluaatista ladattiin pylvääseen virtausnopeudella 15 300 cm/tunti (235 ml/tunti). Sitoutumaton materiaali pestiin pylväsjärjestelmästä 7:llä geelin tilavuudella (55 ml) 2 0 mM HEPES: ia, pH 7,5, samalla virtausnopeudella.

S. Sepharose geeli elutoitiin portaittaisella eluutiolla, jossa käytettiin 0,2 M NaCl: ia 20 mM Hepesissä, pH 7,5, 20 virtausnopeudella 300 cm/tunti. Eluutiopiikki kerättiin piirturitulostuksen mukaan käyttäen Pharmacia UVl-monito-../1 ria A280nm:ssa (2 mM valotien leveys 0,5 AUFS). Eluaatin . ':i keräys aloitettiin kun piirturitulostus oli noussut 20 %:n poikkeamaan ja jatkettiin kunnes piirturitulostus oli las-25 kenut 70 %:n poikkeamaan. Eluutiotilavuus oli 10 ml ja • · ,·, : 1 ml tätä kerättiin Campath lH:n ELISA-määritykseen kuten alla kuvataan.

* » » » » «

Superdex 200 -geeli IN NaOH pestiin Superdex-pylväsjärjestelmästä • » · '· ’· 30 PBS : llä, pH 7,2, kunnes pylväästä ulostulevien pesuliuos-ten pH oli 7,2. Jäljelläoleva 9 ml S Sepharose -eluaatista ladattiin Superdex-pylvääseen ruiskulla Millipore Millex »’·, GV-suodattimen avulla ja suodatin pestiin läpikotaisin • t 2 ml :11a PBS:ää, pH 7,2. Pylväs ajettiin PBS:llä, pH 7,2, 35 nopeudella 30 cm/tunti (60 ml/tunti). Kokoekskluusio- » · „ 110002 Δ 3 piikkejä monitoroitiin käyttäen Pharmacia UVl-monitoria A280nm:ssa. Piikkien eluoituessa otettiin fraktioita, jotta saataisiin erotettua aggregaattipiikki monomeeripiikis-tä. Monomeeripiikkifraktion tilavuus oli 17,6 ml.

5 Entsyymiin kytketty immunosorbenttimääritys (ELISA) Tämä on standardinomainen kerros-entsyymi-immuno-määritys, jossa anti-humaani-IgG, joka on tehty immuuni-puhdistetusta vuohen antiseerumista, kiinnitetään kiinteään faasiin pyydystyskerrokseksi. Pyydystetyn antigeenin 10 detektio (Campath 1H Ig) saadaan aikaan peroksidaasileima-tulla vuohen anti-humaani-IgG:llä. Määritys on sarjassa Campath ΙΗ-näytteiden kanssa jotka laimennetaan puskuriin joka sisältää kaseiinia ja hydrolysoitua gelatiinia. Käytetään inkubaatioaikoja 1 tunti ja 30 minuuttia 37 °C:n 15 lämpötilassa. 3 ' , 3 ' , 5,5'-tetrametyylibentsidiini (TMB) kromageenia ja vetyperoksidisubstraattia lisätään jotta saadaan paljastettua kaikki sitoutunut peroksidaasi. Optiset tiheydet voidaan määrittää 450 ntrt:ssa ja Campath 1H -pitoisuudet voidaan lukea tunnetuista konsentraatioista 20 peräisin olevasta standardikäyrästä, joka ulottuu 3,9 ng:sta 250 ng:aan puhdistettua Campath lH:ta. Puhdistetun Campath lH:n testaus • · •/’l Monomeeripiikin proteiinipitoisuus arvoitiin A280 .V: nm:ssa käyttäen ekstinktiokerrointa (E 1%lcm) 1,3 5 (valin- • · j\· 25 naisesti 1,32) ja näytteen aggregaattipitoisuus tutkittiin • 1 j HPLC-kokoekskluusiopylväällä. Jäljelläoleva materiaali • · steriilisuodatettiin Millipore Millex GV-suodattimen läpi (0,2 μιη huokoskoko) ja täytettiin 2 9 0,5 ml:n eräksi ste- . . riileihin Sarstedt-putkiin. Suurin osa näyteputkista va- ’· ’1 30 rastoitiin 4 °C:n lämpötilaan, 6 putkea varastoitiin kui- ...1 tenkin -70 °C:n lämpötilaan. 4 °C:n varastosta lähetettiin ;Y: näytteet määritykseen kuten seuraavissa esimerkeissä ku- * » vataan.

i · • » » t i » » » ► » 1 • · 26 1 10 0 0 2

Tulokset ja pohdinnat

Tulokset Campath-ELISAsta esitetään alla taulukossa .

Campath 1H

5 Näyte Tiitteri Erän Erässä Seuraavaan % saalis ELiSAn tila- ClH:ta pylvääseen /pylväs mukaan vuus yhteensä pannun (ml) mg ClH:n paino

Epäpuhdas 40,8 μ9/ιτι1 1750 71,4 71,4 -----

Proteiini 4,2 mg/ml 18,9 79,4 75,2 111,2 A -eluaatti S Sepharose 6,4 mg/ml 10,0 64,0 57,6 85,0 15 eluaatti

Superdex- 2,5 mg/ml 17,6 44,0 ---- 76,4 monomeeri

Yhteissaalis kolmen pylväsjärjestelmän kautta, jo-20 ka perustuu kunkin pylvään kautta saatuun saaliiseen, on 61,6 %.

Endotoksiinipitoisuus LAL-testillä Näyte Eu/ml 25 Epäpuhdas 1,25

Superdex-monomeeri- <0,625 piikki

Esimerkki 4 ...* Tavanomainen SDS-polyakryyliamidigeelielektrofo- 30 reesi suoritettiin vaakatason levyllä, 8 - 18 % gradient- * * • : : ti, Pharmacia Excelgel. Tulokset esitetään kuviossa 2.

Esimerkki 5 : Campath lH:n karakterisointi korkean suorituskyvyn käänteisfaasikromatografiän perusteella.

35 50 μΐ näyte esimerkin 3 tuotetta (nimeksi annet- . . tu G-Dev-95) fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (PBS) • I ft |<t* pitoisuutena 2,4 mg/ml alistetaan korkean suorituskyvyn • * ·;·' käänteisf aasikromatograf iaan (RP-HPLC) seuraavissa olois- :V: sa: j*’*: 40 Pylväs: PLRP-S 1 000 Ä (huokoskoko); 8 μΜ (partik- ' , kelikoko) 15 x 0,46 cm, Polymer Laboratories Ltd:Itä, Iso-

f I I M

Britannia.

• » t · »

• I

27 1 10002

Liikkuva faasi käytti hyödykseen muurahaishap-po/vesi/asetonitriilij ärj estelmää:

Komponentti A - muurahaishappo:vesi (5:3) B - CH3CN.

5 seuraavassa gradientissa: % A 80 80 65 0 0 80 80 % B 20 20 35 100 100 20 20

Aika (min) 0 5 38 41 50 51 65 10

Pylvästä ajettiin huoneenlämpötilassa virtausnopeudella 1 ml/min'1 ja UV-detektio suoritettiin LDC Spectro Monitor D -laitteella, jonka aallonpituus on muutettavissa, aallonpituudella 280 nm herkkyydellä 0,1 a.u.f.s.

15 Tulos

Kuten kuviosta 3 voidaan nähdä, Campath lH:n kro- matografia, joka hyödynsi ylläolevaa järjestelmää, antoi yhden terävän piikin. 30 minuutin jälkeen eluoituvat piikit johtuvat liikkuvasta faasista.

20 Esimerkki 6

Pelkistetyn ja karboksimetyloidun Campath l:n karakterisointi korkean suorituskyvyn käänteisfaasinestekro-. matografiällä (RPHPLC).

• '· 6a. Campath lH:n pelkistys ja karboksimetylaatio • · ’·*·’ 25 Campath 1H voidaan pelkistää raskas- ja kevytket- • · \ 't jukomponenteikseen käyttämällä hyödyksi standardinomaisia pelkistys- ja karboksimetylaatiomenetelmiä, jotka pelkisty t tävät ensin disulfidisidokset ja estävät niitä muodostu masta uudelleen alkyloimalla vapaat tioliryhmät.

| 30 1 ml:aan Campath 1H G-Dev-95:aa esimerkistä 3 fos- .···, faattipuskuroidussa suolaliuoksessa pitoisuutena 2,4 mg/ml * lisättiin 1 ml 8M guanidiumkloridia 0,5 M Tris/HCl-pusku- rissa, pH 9,0, ja 120 μΐ 7 % ditiotreitolia samassa pusku-

I · I

rissa. Seosta inkuboitiin kaksi tuntia 37°C:een lämpöti- 35 lassa.

» · > ·

I I I

28 1 10002

Inkubaation jälkeen 120 μΐ 9 % jodietikkahappoa lisättiin 0,5 M Tris/HCl-puskurissa ja seos jätettiin pimeään 1 tunniksi. Tuloksena olevalle pelkistetylle karbok-simetyloitulle materiaalille annettiin nimeksi Campath 1H 5 RCM.

6b. Campath 1H RCM:n RP HPLC -karakterisointi 30 μΐ esimerkistä 6a peräisin olevaa materiaalia alistettiin korkean suorituskyvyn käänteisfaasikromatogra-fiaan seuraavissa oloissa.

10 Pylväs PLRP-S 1 000 Ä (huokoskoko) : 8μ (partik kelikoko) 15 x 0,46 cm Polymer Laboratories Ltd:Itä, Iso-Britannia.

Liikkuva faasi käytti vettä, muurahaishappoa ja asetonitriiligradienttia kuten taulukossa alla esitetään: 15 A - muurahaishappo B - vesi C - asetonitriili % A 50 50 29,4 0 0 50 0 % B 35 35 20,6 0 0 35 35 20 % C 15 15 50 100 100 15 15 aika (min) 0 5 70 72 82 82,1 95 ···* Pylvästä ajettiin virtausnopeudella 1 ml/min huo- • · · ” neenlämpötilassa ja seurattiin UV-absorbanssin avulla aal- • · ·.*.· 25 lonpituudella 280 nm a.u.f.s.

ί/·{ Tulos : Kuten kuviosta 4 voidaan nähdä, tuloksena oleva materiaali erottuu kahdeksi piikiksi, jotka vastaavat raskaita ja kevyitä ketjuja.

,·, ; 30 Esimerkki 7 • · *

Campath lH:n karakterisointi korkean suorituskyvyn *Γ kokoekskluusiokromatografiässä Campath lH:ssa olevien mo- ·,·.· lekyylipainoltaan suurien komponenttien määrittämiseksi.

50 μΐ näyte esimerkin 3 tuotetta (G-Dev-95) 35 fosfaattipuskuroidussa suolaliuoksessa (pitoisuutena » * t * » 29 1 10002 2,4 mg/ml) alistettiin korkean suorituskyvyn kokoekskluu-siokromatografiaan seuraavissa oloissa.

Pylväs - TSK geeli G3000 SWxl 30 cm x 0,78 cm i.d. 5 Liikkuva faasi - 0,05 M Na2HP04 + 0,1 M Na2S04 sää detty H3P04: llä pH-arvoon 6,8

Virtausnopeus - 0,75 ml/min'1

Pylvästä ajettiin kaksikymmentäneljä minuuttia huo-10 neenlämpötilassa ja seurattiin UV-absorbanssin perusteella aallonpituudella 280 nm.

Toinen 50 μΐ näyte, jossa käytettiin Campath lH:ta, joka oli pelkistetty esimerkin 6a) mukaisesti, analysoitiin samalla menetelmällä.

15 Tulokset: tulokset kuviossa 5 osoittavat siistin yksittäisen piikin, joka viittaa alhaisiin aggregaattita-soihin. Yleensä saadaan tasoja välillä 0,5 ja 2,0 %. Tulokset kuviossa 6 osoittavat kaksi pääpiikkiä, jotka vastaavat raskaita ja kevyitä ketjuja odotetussa suhteessa. 20 Piikit kokonaispermeaatiotilavuudessa (noin 15 - 18 mi nuuttia) johtuvat reagensseista.

./·’ Biologiset määritykset toimivalle, puhtaalle Cam- 7; path lH:lle

Komplementtihajotusmääritys Campath lH:lle t t «’·tj 25 Komplementtihajotusmäärityksessä määritetään vasta- • · ,·. : aineen toiminta, joka ilmaistaan spesifisenä aktiivisuute-

I It » I

na, joka määritetään sen mukaan miten tunnettu pitoisuus

I I I

anti-CDw52-vasta-aineen puhdasta valmistetta kykenee sito- , , maan ennalta määrätyn lukumäärän soluja ja saamaan aikaan » · · 30 solujen hajoamisen.

i t Määritys suoritetaan Campath lH:lla käyttäen Kar-pas 422 -soluja (saatu aikaan ei-Hodgkinin lymfooman B-so-,·**. lulinjasta - Dyer ym. (1990) Blood, 75., 704 - 714) , jotka » i » • t ekspressoivat Campath-antigeenia solun pinnalla. 1,2 x MM ( 35 107 solua ladattiin radioleimalla inkuboimalla 2 tuntia • t * * » » i » • · 30 1 10002 37 °C:n lämpötilassa C02-lämpökaapissa niin että läsnä oli 600 μΟχ 51Cr (natriumkromaattia) .

5,3 ml ladattuja soluja elatusaineessa (kokonaistilavuus 23,5 ml) lisättiin 12,5 ml:aan normaalia ihmis-5 seerumia ja 150 μΐ seosta pipetoitiin mikrotiitterilevyn kaivoihin.

50 μ1:η näytteet kolmen puhdistusajon lopullisesta eluaatista sekoitettiin solujen kanssa ja inkuboi-tiin 30 minuuttia 4°C:een lämpötilassa jota seurasi 90 mi-10 nuuttia 37°C.-een lämpötilassa. Viljelmää sentrifugoi- tiin 2 000 rpm:ssä 5 minuutin ajan ja radioaktiivisuus 100 μΐ-.ssa solusupernatanttia laskettiin gammalaskurilla. Komplementtihajotusaktiivisuus kiloyksikköä/ml laskettiin referenssivalmisteen standardikäyrästä (1 000 yksik-15 köä/ml).

Tulokset esitetään taulukossa 3.

Campath lH:n pitoisuus lopullisen eluaatin 50 μ1:η näytteissä arvioitiin käyttäen näytteitä PBS:ssä, pH 7,2, joka luettiin spektrofotometrilla 280 nm.-ssa. Tulokset 20 esitetään taulukossa 3 optisena tiheytenä mg/ml:ssa.

Tästä datasta määritetään spesifinen aktiivisuus ,,/* kiloyksikköinä/mg käyttäen yhtälöä: • · i i t * I · • · * V: KU/ml l!: : od I I I • ·

» I i I I I

* » » » » * I I » • I · I * I I »

I I

• I I I I I t · t f * • t I 1 » * · X I > « » MMI I I 1 t I » » 1 I t t * 3i 110002

Taulukko 3 Näyte Komplementin hajotus Proteiini- Spesifinen kiloyksikköä/ml pitoisuus aktiivisuus 5 mg/ml kiloyksik- köinä A 11,2 11,1 1,0 B 14,8 14,2 1,0 10 C 13,7 13,6 1,0

Tulokset osoittavat, että Campath lH:n puhtaat valmisteet ovat toimivia.

Claims (13)

32 1 10 0 0 2

1. Menetelmä puhdistetun IgG-vasta-ainevalmisteen saamiseksi, joka on valmistettu käyttäen rekombinanttieks- 5 pressiojärjestelmää, tunnettu siitä, että: (a) vasta-aineen vesipitoinen liuos viedään proteiini A- tai proteiini G -pylvääseen vasta-aineen absorboimiseksi pylvääseen ja sitten vasta-aine eluoidaan happamalla liuoksella, jonka pH on alueella 3,0 - 3,5; 10 (b) hapan eluaatti viedään varattuja partikkeleita sisältävään ioninvaihtopylvääseen vasta-aineen absorboimiseksi pylvääseen ja sitten eluoidaan vasta-aine varaukseltaan vastakkaisten ionien vesipitoisella liuoksella ja; (c) vesipitoinen eluaatti viedään huokoisia 15 partikkeleita sisältävään kokoeksluusiopylvääseen ei- vasta-ainemolekyy1ien pitämiseksi huokoisissa partikkeleissa ja halutun vasta-aineen saamiseksi valittuihin fraktioihin, jotka eluoidaan pylväästä, ja jotka sisältävät alle 2 % aggregoitunutta vasta-ainetta 20 kokoekskluusiokromatografiällä mitattuna.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että mainittu vasta-aineen ."j vesipitoinen liuos saadaan keräämällä vasta-aine viljelmän elatusaineesta ja kerätty elatusaine suodatetaan ja/tai .’· - 25 konsentroidaan ultrasuodattamalla. • · ·

3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen menetelmä, • · t·;·, tunnettu siitä, että pylväs vaiheessa (a) pestään • · · tris- tai fosfaattipuskuroidulla suolaliuoksella pH:ssa , . noin 7,0 ja sitten vasta-aine eluoidaan pH:ssa 3,0- 3,5. • > I ’·[· 30

4. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista • · ···* mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta- aineen vesipitoinen liuos viedään proteiini A -pylvääseen vaiheessa (a) . t · • i · • • · • · · 33 110002

5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että pylvästä eluoidaan sitruunahapolla.

6. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että ionin- vaihtopylväs on kationinvaihtopylväs vaiheessa (b).

7. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vaiheesta (c) saatu vasta-aine altistetaan ultrasuodatukselle.

8. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine valmistaan käyttäen CHO-soluja.

9. Minkä tahansa vaatimuksista 1-7 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on 15 tuotettu CHO- tai myeloomasoluissa glutamiinisyntetaasi-monistusjärjestelmää käyttäen.

10. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta-aine on kimeerinen vasta-aine.

11. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta- ...1 aine on vasta-aine, johon on siirretty CDR-osa.

• · ·.”· 12. Minkä tahansa patenttivaatimuksista 1-9 • t : mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta- 25 aine on ihmisen vasta-aine.

13. Minkä tahansa edeltävistä patenttivaatimuksista t · mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että vasta- * · · aine on anti-CDw52 -vasta-aine. • · • · · • t i » 1 » 1 · • » » · · 34 110002