PT99248B

PT99248B - Processo para a purificcao de anticorpos

Info

Publication number: PT99248B
Application number: PT99248A
Authority: PT
Inventors: Paul Ian Nicholas Ramage; Geoffrey Allen
Original assignee: Wellcome Found
Priority date: 1990-10-17
Filing date: 1991-10-16
Publication date: 1999-04-30
Also published as: WO1992007084A1; AU658926B2; GB9022547D0; FI110003B; FI922380L; GB2253397A; KR100193314B1; BR1100358A; FI110002B; MX9203794A; ES2112865T5; HUT64601A; EP0504363A1; ATA900791A; AU2532192A; CA2069481C; PT99248A; ES2112865T3; PT100988B; GB9209529D0

Description

Descrição referente à patente de invenção de THE WELLCOME FOUNDATION LIMITED, britânica, industrial e comercial, com sede em, Unicorn House, 160 Euston Road, London NW1 ΞΒΡ, Inglaterra, (inventores: Paul Ian Nicholas Ramage e Geoffrey Allen, residentes na Inglaterra) para PROCESSO PARA A PURIFICAÇÃO DE ANTICORPOS

DESCRIÇÃO

A presente invenção refere-se a uma preparação purificada de anticorpos monoclonais contra o antigénio CD„52, à utilização destes anticorpos em terapia e a um procss-so para a sua produção.

Os anticorpos e as imunoglobulinas são moléculas bi-funcionais proteicas. Uma região que é altamente variável entre os diferentes anticorpos é responsável pela ligação a um antigénio, por exemplo muitos agentes infecciosos diferentes que o corpo pode encontrar, enquanto que a segunda região constante é responsável pela ligação aos receptores Fc das células e que activa também o complemento. Deste modo, os anticorpos representam um componente vital da resposta imune dos mamíferos na destruição de microorganismos e virus estranhos. A imunização de um animal com um antigénio tem como resultado a produção de anticorpos policlonais ou, por outras palavras, de diferentes anticorpos com diferentes especificidades e afinidades. Para aplicaçães terapêuticas é vantajoso poder—se produzir anticorpos a partir de um único clone de linfócito - estes anticorpos são designados por anticorpos morrocl onai s e são específicos em relação a um determinante . particular do antigénio original. Estes anticorpos monoclonais

I

extremidades constantes e

1975, 256, 493-497).

Uma molécula isolada de um anticorpo da classe IgB é constituída por duas cadeias leves e duas cadeias pesadas que são mantidas ligadas por meio de ligaçães de dissulfureto entre as cadeias. Cada uma das cadeias leves está ligada a uma cadeia pesada por uma ligação de dissulfureto e as duas cadeias pesadas esteta ligadas uma à outra por ligaç&es de dissulfureto. Cada uma das cadeias pesadas possui numa das um domínio variável seguido por vários domínios cada uma das cadeias leves possui um domínio variável numa das extremidades e um domínio constante na outra extremidade. 0 domínio variável das cadeias leves está alinhado com o domínio variável das cadeias pesadas. Os restantes domínios constantes das cadeias pesadas encontram-se alinhados entre si e formam o fragmento Fc, após cisão limitada da cadeia polipeptídica.

Os domínios variáveis de cada par de cadeias leves e pesadas formam locais de ligação de antigénios. Em conjunto com o primeiro domínio constante da cadeia pesada e com o domínio constante da cadeia leve aqueles domínios formam, após cisão limitada da cadeia polipeptídica, o fragmento Fab. Os domínios variáveis de cada par de cadeias pesadas e leves possuem a mesma estrutura geral, contendo cada domínio uma estrutura de quatro regiSfes cujas sequências são relativamente conservadas, ligadas por três regiftes determinantes complementares (RDCs). As quatro regi&es estruturais adoptam predominantemente a conformação em folha J3 e as RDCs formam laçadas que ligam, e em alguns casos compreendem parcialmente, a estrutura em folha J8. As RDCs são mantidas muito próximas pelas regi&es estruturais e, com as RDCs do outro domínio, contribuem para a formação do local de ligação dos antigénios.

O antigénio CD_W52 (B. Halle et al.. Tissue Antigens 1990, 55, págs. 118-127) é uma molécula abundante largamente distribuída na maioria dos linfócitos humanos, se não em todos estes. Encontra-se também presente na superfície • da maioria dos linfócitos malignos, mas não nas células hematopos

A presente invenção proporciona por conseguinte uma preparação purificada de um anticorpo anti-CD_w52 que apresenta, em cromatografia de exclusão por dimensão:

um único pico sob condiçães não redutoras e dois picas principais sob condiçães de desnaturação e redutoras.

A preparação de preferência apresenta também em electroforese em gel de SDS-poliacrilamida:

uma banda principal usando uma amostra não reduzida e duas bandas principais usando uma amostra reduzida.

Adieionalmente a preparação apresenta em

HPL.C da fase inversa:

um pico único e bem marcado sob condiçães não redutoras e dois picos principais sob condiç&es redutoras.

Por cromatografia de exclusão por dimensão, como sugere o próprio nome, separam-se as proteínas por dimensão. Em geral a separação ocorre quando as moléculas maiores são excluídas à entrada da fase porosa estacionária e são transportadas directamente através da coluna enquanto que as moléculas pragressivamente mais pequenas são capazes de penetrar na fase estacionária cada vez mais e em connsequência possuem tempos de eluição especial mente prolongados. Deste modo é a porosidade da fase estacionária que determina a separação. Esta técnica analítica é especialmente boa para determinar níveis de agregação na preparação purificada. A fase estacionária é um gel de sílica de poro largo que pode ser modificado com grupos diol, de preferência um gel como Zorbax GF450-GF250 (marca registada de Dupond) ou gel TSK G3000 SWXL ou G4000 SWXL. A fase móvel tem um valor de pH geral mente entre 4 a S, de preferência entre 6 e 7,5, de modo particularmente vantajoso de cerca de pH 6,8. Esta fase é ds preferência uma mistura de um fosfato, como hidrogenoortofosfato de dissódio, e um sulfato, como sulfato de sódio ou de potássio, e água. A molaridade desta mistura é geralmente de 25 mM a 1 M, de modo especialmente preferido de cerca ds 50 mM.

A electroforese em gel de SDS-poliacrilamida (SDS PAGE) dá infarmaç&es sobre o número e o tipo de proteínas presentes numa mistura, a sua abundância relativa e uma medida dos seus pesos moleculares. 0 SDS é um detergente aniónico que reage com as proteínas antes da electroforese. A maior parte dos complexos SDS-proteínas são solúveis e migram através do gel da electroforese em direcção ao ânodo, sob a influência de uma carga eléctrica. A velocidade de migração está geralmente relacionada inversamente com o logaritmo do peso molecular da proteína, é conveniente efectuar as análises de SDS num gel com gradiente que pode ser preparado sobre uma placa horizontal ou vertical ou sobre uma vareta. D gradiente é de preferência de 10 a 2.2% ou de modo especialmente preferido de B a 1S%. □ gel é de preferência o gel Excel de Pharmacia í mar ca registada).

A HPLC de fase invertida efectua uma separação na base da hidrofabicidade. Como com outras técnicas de HPLC há uma fase estacionária polimérica, de por exemplo poliestirenoZ-divinilbenzeno. A fase móvel é normalmente uma combinação de um tampão aquoso fraco ou um ácido diluído e um solvente orgânico miscível com a água. Para uma separação de proteínas eficaz a fase móvel é geral mente um sistema de gradiente, necessário para conseguir a separação e é de preferência linear.

A fase estacionária para a análise de imunoglobulinas pode ser uma matriz polimérica, como seja o Polymer Labs PLRP-S, geralmente de dimensão de partícula de cerca de S uM; a dimensão dos poros é de preferência 3002A ou 10002A. A fase móvel é de modo vantajoso uma mistura de um ácido, como seja o ácido fórmico, acético ou trifluoroacético, água e acetonitrilo. 0 ácido e a água estão de preferência presentes numa proporção de 5:3«

Um anticorpo pode ser reduzida às suas cadeias pesadas e leves componentes por redução das ligaçães de dissulfureto sob condiç&es de desnaturação por exemplo com cloreto de guanidínio e diclorotreitol. Por alquilação subse• quente dos grupos tiol livres, por exemplo com iodoacetamida/á• 5 ut»nõ

eido iodoacético, evita-se a formação de novo das ligaçães.

A actividade específica constitui medida da pureza na preparação do anticorpo. A actividade er determinada pelo método descrito nos iOdc?

exemplos. Uma preparação de acordo com a presente invenção tem de preferência uma actividade específica superior a 0,8 Kilo— unidades por mg, idealmente superior a 0,9 Kilounidades por mg, de modo especialmente preferido de cerca de 1,0 Kilounidades por mg.

Uma preparação purificada de um anticorpo anti-CD_w52 de acordo com a presente invenção idealmente é isenta substancialmente de contaminantes das células hospedeiras, como por exemplo proteínas, ácidos nucleicos e endotoxinas das células hospedeiras. A actividade específica proporciona informação acerca dos níveis das proteínas das células hospedeiras na preparação. Os níveis de enndotoxinas podem ser medidos pelo método de LAL (lisado de Limulus amoebocyte) descrito em Parenteral Duality Control, M.J. Alies et al.. Mareei Dekker Inc., Nova Iorque.

Uma preparação de acordo com a presente invenção é também substancialmente isenta de agregados, o que pode ser determinado por cromatografia de exclusão por dimensão, é desejável que estas células sejam menos de 2%, ideal mente menos de 0,5%.

Os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser preparados usando um sistema de expressão recombinante, sendo o sistema preferida um sistema de expressão de mamífero que usa células de ovário de hamster chinês (CHO). Estas podem ser deficientes em redutase de di-hidrofoliato (dhfr) e par connseguinte dependentes de timidina e de hipoxantina para o crescimento (PNAS 77 1980, 4216-4220). A linha de células progenitora dhfr-CHO é transfectada com o gene do anticorpo e com o gene da dhfr, o que permite uma selecção de transformantes de células CHO de fenótipo positivo em relação a dhfr. A selecção é feita por cultura das colónias num meio sem timidina e hipoxantina, cuja ausência evita o crescimento das • células não transformadas e que as células transformadas possam *

ΒβΚ^Λ»

ÍI.UÍ ..

recuperar a via do foliato contornando deste modo o sistema de selecçâo. Estes transformantes normalmente expressam níveis baixos do produto do gene em virtude da co-integraçâo dos dois genes transfectados. Os níveis de expressão do gene do, anticorpo podem sor aumentados por amplificação usando metotrexato <MTX). Esta substância é um inibidor directa da enzima dhfr e permite o isolamento de colónias dificientes que amplificam o seu número de cópias do gene da dhfr de modo suficiente para a sobrevivência nestas cortdiçSfes. Uma vez que a dhfr e os genes dos anticorpos estão em geral ligados infimamente nos transformantes originais, há normalmente uma amplificação concomitante e por conseguinte uma expressão aumentada do gene do anticorpo pretendi do.

□utro sistema de expressão para utilização com células CHO ou de mielama é o sistema de amplificação da sintetase de glutamina (GS) descrito em W087/04462. Este sistema implica a transfecçào de uma célula com um gene que codifica para a enzima BS e o gene do anticorpo pretendido. Seleccionam-se em seguida as células que crescem em meio isento de glutamina. Estes clones seleccionados são em seguida submetidos a inibição da enzima BS usando metionina-sulfoximina (l*lsx). As células, a fim ds sobreviver, amplificam o gene da GS com a amplificação concomitante do gene que codifica para o anti corpo.

Os anticorpos são de preferência obtidos numa forma na qual são segregados para o meio de cultura. O caldo de cultura pode em seguida ser filtrado e/ou concentrado por uma fase de ultrafi. 1 tração a fim de obter uma solução aquosa que é sebmetida a um procedimento de purificação que inclui a aplicação de uma solução do anticorpo a:

a) uma coluna de proteína A de modo a absorver o anticorpo na coluna, e em seguida a eluição do anticorpo com uma solução ácida;

b) a aplicação do eluído acídico a uma coluna de permuta iónica de partículas carregadas de modo a absorver o anticorpo, e em seguida a eluição do anticorpo com uma solução aquosa de iSfes de carga contrária;

c)

a aplicação do eluído aquoso a uma coluna de exclusão por dimensão de partículas porosas de modo a efectuar uma separação de acordo com a dimensão molecular e a obter o anticorpo pretendido em fracções seieccionadas eluídas da coluna.

A proteína A é um ligando específico de grupo que se liga à região Fc da maioria das IgB. Esta proteína é sintetizada por algumas estirpes de Staphyl ococclis aursus e pode ser isolada a partir do sobrenadante da cultura e em seguida insolubilizada por acoplamento a pérolas de agarose ou a sílica. Um método alternativo é a utilização das bactérias inteiras de uma estirpe que possua grandes quantidades de proteínas A sobre a superfície das células bacterianas. Ambos os tipos de preparações de gel podem ser obtidas no comércio (Protein A - Pharmacial; Whole bactéria Calbiochem, IgG sorb?. Alan Johnstone e Robin Thorpe Immunochemistry in Practice, Blackwell Scientific Publn. Cap. 10?. Uma alternativa à proteína A é a proteína G (Analytical Chem. Vol. 61 (13? 1989 1317?.

□ tipo de coluna usado de preferência é uma coluna de Sepharose-proteína A, em especial a Protein A Sepharose Fast Flow (Marca registada). Ideal mente a coluna é lavada com salina tamponizada com tris ou com fosfato de pH de cerca de 7,0 e o anticorpo é eluído sm meio ácido com um pH de 3,0 e

3,5, de modo vantajoso a pH 3,0 usando um ácido como seja ácido cítrico por exemplo numa concentração de cerca de 0,1 M.

A cromatografia de permuta iónica explora as interacções entre os grupos carregados numa fase estacionária e a amostra que se encontra na fase móvel. A fase estacionária de uma coluna de permuta iónica pode ser um permutador catiónico carregado positivamente ou um permutador aniónico carregado negativamente. Os grupos carregados são neutralizados por contra-iões de carga oposta na fase móvel, sendo os contra-iões substituídos durante a cromatografia por moléculas de amostra de carga mais elevada, έ preferível usar colunas com ligações cruzadas baseadas por exemplo em agarose, por exemplo

S-Sepharose Fast Flow (marca registada?, em especial uma coluna de permutador catiónico de S„Bepharose Fast Flow (marca regis8

tada). Em alternativa pode empregar-se uma coluna com base em membranas. A coluna ê normal mente lavada após aplicação do eluído de uma coluna de proteína A, com tampão HEPES 20 mM de pH 7,5 e o anticorpo é eluído com o mesmo tampão contendo cloreto de sódio na gama de 0,2 M a 0,075 M.

A cromatografia de exclusão por dimensão, como o nome sugere, efectua uma separação na base da dimensão das proteínas. Em geral a separação ocorre quando se exclui a entrada de moléculas de grande dimensão na fase estacionária porosa e são transportadas directamente através da coluna enquanto que as moléculas progressivamente mais pequenas são cada vez mais capazes de penetrar na fase estacionária e em consequência possuem tempos de eluição particularmente prolongados. Por conseguinte é a porosidade da fase estacionária que determina o grau de separação. Os materiais adequados possuem ligaçães químicas e possuem resistência à compressão por exemplo uma composição de agarose e/ou de dextrano como por exemplo Superdex (marca registada). Um meia preferido para uma coluna é o meio de exclusão Superdex de dimensão 200. O eluído da coluna de permuta iónica é de preferência aplicado a uma coluna de Superdex e é desenvolvido num tampão na gama de pH de 5 a S, de preferência PBS de pH 7,2.

Cada coluna é de preferência protegida par um filtro que pode ser um filtro esteri1izants Beiman Acro de 0,2 pm ou, no caso de se usar uma coluna de proteína A, um um filtro PALL. DSL.K2 Ltd. European House, para as outras duas filtro PALL posidyns SLK 7002 NFZP ou (obtenível de Pall Process Filtration l-lavant Street, Portsmouth 301 3PD) e colunas um filtro Millipak, de preferência Millipak 100 para a coluna de permuta iónica e Millipak 20 ou 60 para a coluna de exclusão por dimensão (obtenível de Millipore, The Boulevard, Blsckmore Lane, Watford, Herts). As colunas são de preferência desinfectadas antes da utilização com um desinfectante apropriado, por exemplo NaOH 0,5 M durante 16 horas para qualquer das colunas, ou gluconato de hibitano a 2% em etanol a 20% para a coluna de proteína A ou NaOH 1 N para as outras duas colunas. Os desinfectantes foram eliminados por lavagem com os tampães

estéreis apropriados antes da aplicação da solução proteica. Todas as soluçães usadas no processo eram de preferencia estéreis e isentas de toxinas.

Podem ser acrescentadas fases adicionais ao procedimento de purificação descrito anteriormente. Pode usar-se ultrafiltraçâo para reduzir ainda a contaminação virai e de ácidos nucleicos das células hospedeiras. Esta operação pode efectuar-se usando unidades de ultrafiltraçâo comerciais como por exemplo membranas de Viresolve/70' ou Vi resolve/ISO' ou uma membrana PLMK de celulose regenerada de limiar de corte 300 k, todas obteníveis da Millipore, The Boulevard, blackmore Lane, Watford, Herts. Um método alternativo para reduzir a contaminação por virus é a microfi1 tração usando uma membrana de Nylon sob a forma de cartuxos, por exemplo uma membrana de Nylon 66 de 0,04 M de PALL.

Pode introduzir-se uma fase de purificação para eliminar o ADN contaminante, por exemplo uma lavagem da coluna de proteína A usando NaCl na gama de 1 M a 3 M em tampão a um pH neutra de preferência PBS de pH 7,2. Pode adicionar-se glicina ao NaCl de preferência com uma concentração de cerca de

1,5 M e com um pH na gama de Β,Β e 9,0.

Um anticorpo anti-CD„52 da presente invenção pode ser um anticorpo monoclonal obtido a partir de um hibridoma de origem murina ou de ratazana e/ou pode ser obtido usando tecnologia de ADN recombinante.

A tecnologia de ADN recombinante proporcionou a capacidade de desenvolver anticorpos modificados de dois tipos básicos. No primeiro tipo, designado por anticorpos quiméricos, apenas os domínios constantes do roedor são substituídos por domínios equivalentes de origem humana (Morrison et_ al.., P.N.A.S. . 1984, Bi, 6851-6855; Bouliartne et al. Nature.

1985, 314, 268-270; e Neuberger et al., Nature, 1985, 314,

26S-270). No segundo tipo os domínios constantes de murina e as regiães estruturais de murino são integral mente substituídos por domínios e regiães equivalentes de origem humana. Este segundo tipo de anticorpos é designado por anticorpo humanizado ou enxertado por RDCs ÍJones et al., Nature, 19S6, 521, 52210

525; e Riechmann et al. , Mature, 19SB, 552, 525-527), Estes anticorpos assemelham-se mais aos anticorpos humanas quando administrados a um paciente humano e deste modo não desencadeiam uma resposta anti-anticorpo com a mesma intensidade. Também é possível usar um anticorpo humano.

Deste modo, o anticorpo anti-CD„52 purificado da presente invenção pode ser um anticorpo de ratazana, de rato ou humano em que as sequências de ácidos aminados das cadeias pesadas e leves são homólogas em relação às sequências do anticorpo produzido pelos linfócitos da espécie respectiva in vivo ou in vitro por hibridomas. De preferência, o anticorpo anti-CD_w52 é um anticorpo modificado como seja um anticorpo híbrido no qual as cadeias pesadas e leves são homólogas em relação a um anticorpo natural mas estão combinadas de modo que não ocorre naturalmente . Os anticorpo pode ser um, anticorpo quimérico que possua regiões variáveis de um anticorpo e regiões constantes de outro. Deste modo, os anticorpos quiméricos podem ser quimeras espécie/espécie ou quimeras classe/classe. Estes anticorpos quiméricos podem ter uma ou várias modificações adicionais para melhorar a capacidade de ligação aos antigénios ou para modificar o funcionamento do efector. Uma outra forma de um anticorpo modificado é um anticorpo humanizado ou enxertado por RDCs incluindo um anticorpo composto em que além dos RDCs são transferidas para a estrutura humana partes das regiões hipervariáveis» Podem modificar-se ácidas aminados adicionais na estrutura ou regiõss constantes destes anticorpos, Por conseguinte o ‘âmbito da presente invenção inclui qualquer anticorpo modificado anti-CD_w52 no qual a sequência de ácidos aminados não seja uma sequência que exista na natureza. No entanto são especialmente· preferidos os anticorpos enxertados por RDCs, de que é um exemplo o anticorpo Campath 1H (marca registada de The Wellcome Foudation Ltd.). As sequências do ADN das cadeias do anticorpo incluídas nos RDCs do anticorpo Campath ÍH são apresentadas na Patente EP032S404, cuja especificação se dá como aqui reproduzida por referência. A presente invenção inclui por conseguinte um preparado purificado de um • anticorpo anti-CD„52 no qual o anticorpo contém uma ou várias <’Λ ι esclerose múltipla, a a psoríase, a diabetes das afecreferido sequências RDC descritas na Patente EP032S404.

Os anticorpos anti-CD„ 52 purificados sèto úteis na terapia médica para o tratamento de numerosas afecçães humanas, geralmente como imunossuprssores, mais em especial por exemplo em afecçães mediadas por células T incluindo a vasculite grave, a artrite; reumatóide, o lupus sistémico e também as afecçêes autoimunes como por exemplo doença de enxerto contra hospedeiro, juvenil, a doença de Sjogrens, as doenças da tiróide, a miastenia grave, as rejeiçães de transplantes e a asma. Estes anticorpos são também úteis no tratamento de cancros como por exemplo o linfoma não de Hodgkin e leucemias.

A presente invenção proporciona por conseguinte a utilização de um preparado purificado de um anticorpo anti-CD„52 para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento de qualquer das afecçêes anteriormente mencionadas. A presente invenção também proporciona um método para o tratamento de um ser humano atingido por uma çftes referidas que compreende a administração ao indivíduo de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um preparado purificado de um anticorpo ant.i-CD„52.

As dosagens destes anticorpos podem variar com a afseção que se pretende tratar e com o estado do paciente mas normal mente situam-se entre 1 e cerca de 100 mg para um adulto, de preferência entre 1 e 10 mg, normalmente administrados diariamente durante um período de 1 a 30 dias. Pode ser preferível um regime de dosagem em duas partes no qual se administram la 5 mg durante 5 a 10 dias seguidas de 6 a 15 mg durante um período de outros 5 a 10 dias.

Também se consideram incluídas na presente invenção as composiçães farmacêuticas que contêm um preparado purificado de um anticorpo anti-CD„52. Estas composiçães farmacêuticas contêm de preferência para além do anticorpo um diluente ou uma substância veicular fisiologicamsnts aceitável em conjunto com outros agentes como por exemplo outros anticorpos ou um antibiótico. São exemplos não limitativos de substâncias veiculares adequadas salina fisiológica, salina tamponiza12

da por fosfata, salina com glucose tamponizada por fosfato e salina tamponizada. Em alternativa, o anticorpo pode ser liofilizado e reconstituído para utilização quando necessário por adição de uma solução tamponizada aquosa conforme descrito antsriormente. As vias de administração normais são a injecção ou a perfusão parenteral incluindo a via intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperitoneal.

As figuras apresentadas em anexo representam;

Figura 1.

(a) a construção pLD9 que contém blocos integrados (cassettes) de expressão para o marcador de selecção/amplificaçâo de dhfr mutilado e o ADMc da cadeia leve do anticorpo Campath-1H. □ pequeno sector representado com a flecha a tracejado é o promotor SV40 enfraquecido; o sector maior representado a ponteado com uma flecha é o promotor de JBactina; poli A refere-se respectivamente a poliadenilação original e sinais de terminação; o sector menor com ori contém origem de rep1i csção de SV40;

(b) a construção que contém os blocos integrados de expressão para o marcador de selecção pela neomicina e o ADMc da cadeia pesada do anticorpo Campath-ÍH. D sector com uma flecha s MT refere-se ao promotor de metalotioneína de rato. Os locais de restrição indicados são: - H, HindIII; Bg, BglII; B, BamHI; Rl, EcoRÍ.

Figura 2.

Sei de SDS-poliacri1amida de Campath-1H não reduzido e reduzido mostrando uma única banda principal.

Figura 5.

Cromatografia líquida de alta eficiência de . fase invertida de Campath 1H não reduzido mostrando um único pico.

Figura 4.

Cromatografia líquida de alta eficiência ds fase invertida de Campath 1H reduzido e carboximetilado apresentando dois picos resolvidos correspondentes às cadeias pesada e leve do anticorpo.

Figura 5.

Cromatografia de exclusão de alta eficiência de Campath 1H não reduzido mostrando um único pico.

Figura 6.

Cromatografia de exclusão de alta eficiência de Campath 1H reduzido mostrando dois picos principais.

Exemplo 1

Froducão de Campath 1H a partir de Células CHD

EXEMPLO lfti Clonagem dos ADNcs das cadeias pesadas e leves de Campath-1H

Enxertaram-se original mente as regiões determinantes complementares de Campath-IG monoclonal de ratazana directamente nas estruturas das cadeias pesadas e leves do genoma humano (Winter et al.. Nature. 19B8, 522, 323327). Estas construções foram projectadas de modo a que se desse a expressão da linha de células de miei orna YO s tiveram como resultado rendimentos de Campath-IH até 5 pg/ml após 10 a 14 dias ds cultura CHale et al.„ Tissue Antigens, 1990, 55,

118-127 e Winter et al.. Nature, 1988, 522, 323-327). Usou-se a linha de células TF57 CHale et al.. ibid,) a fim de gerar • f r acções de ADNc seleccionadas por dimensão de 0,9 a 1,2 Kb e ε pesadas respec-

1,4 a 1,7 Kb para os ADMcs das cadeias leves tivamente. Estes ADANcs -foram usados para preparar bancos de ADNc ligado em EcoRI em ygtlO. Todos os procedimentos -foram descritos por Huynn et al. (DNA cloninq, Vol, I: A Praticai Approach, 1934, G1over, D (Editor), IRL Press, Oxford). Procedeu-se a buscas nos bancos usando sondas com transiacção de encaixe E³⁵F3 específicas para as regiífes variáveis para isolar os clones de ADNc de comprimento integral. Para o ADNc da cadeia leve, eliminou-se o guia 5' não traduzido até à posição -32 usando exonuclease Bal-31 e um adaptador hindIII adicionado. Para a extremidade 3' usou-se o local singular Saci 47 pta a montante do codão d© paragem. Usou-se um par de oligonucleótidos sintéticos SacI-HindIII a fim de regenerar esta sequência e posicionar o local HindIII imediatamente após o codão de paragem. Para a extremidade 5' do ADNc da cadeia pesada, usou-se o local Ncol singular sobreposto ao codão de início ATG a fim de reconstruir um guia de 29 pb não traduzido idêntico ao da cadeia leve, usando um par de oligonucleótidos HindIII~NcoI. Na extremidade 3' converteu-se o local singular Nael de 12 pb a juzante da codão de paragem num local HindIII usando adaptadores.

EXEMPLO IB; Construção de vectores;

Cortou-se o promotor da β-actina humana do plasmídeo pHE^APr-3-neo (que corresponde ao plasmídeo pHBAPr-1neo (Gunning et al., P.N.A.S.., 1937, 34, 433-35) excepto em que o sinal de poliadenilação/terminação de SV40 foi substituído pelos sinais de p-actina humana respectivos) sob a forma de um fragmento PvulI-HindIII de 2360 pb, no qual o local PvuII foi subsequentemente convertido num local BglII usando adaptadores. A -fim de isolar os sinais de pol iadeni 1 ação e de terminação da p-actina humana do plasmídeo pHJBAPr-3-neo converteu-se um local Sphl 1,4 Kb a juzante do local singular HindIII num local BamHI usando adaptadores. 0 vector de dhfr basal designado por pl04 foi construído como se segue. Converteu-se o local Sphl na posição -123 do promotor de SV40 no plasmídeo pSV2dhfr

(subramant et al. , Mal. CísI 1 Biol.. 1981, 1, 854-864) nuns local Sali a fim de eliminar todos os elementos de intensificação do promotor. A unidade de expressão de dhfr enfraquecida foi em seguida subclonada sob a forma de um fragmento SaliBamHI nos locais homólogos em pSVOd (Mellon et al.. Cel1.

InrH *t-t nTrj—S . 7t3I » jí. Z q Λ.Ζ V n

A fim de construir o plasmídeo pLD9, digeriu-se- o vector pl04 com BamHI, tratou-se com fosfstase e ligou-se com três outros fragmentos constituídos pelo promotor da p-actina BglII-HindIII, o ADNc da cadeia leve de Campath-1H HindIII e os sinais de poliA/terminação da J3-actina HindlIIBamHI. fí fim de construir o plasmídeo pNH31ó, digeriu-se a construção pdBPV-MMTneo (Law et al., Mal. Cell. Biol., 1933, 3, 2110-2115) com BamHI, tratou-se com fosfatase e isolou-se o fragmento que continha o gene da neomicina após separação num gel de agarose. Ligou-se este aos dois fragmentes de JS~actina e ao ADNc da cadeia pesada de Campath-1H. As construç&ss pLD9 e pNH316 são apresentadas na Figura 1.

EXEMPLO 1C: Expressão de Campath-1H em células CHO;

Cultivou-se a linha de células dhfr CHO

DUK-Bll (Urlaub et_al_. , P.N.A.5.. 1980, 77, 4216-4220) em meio

MEM de Isocove suplementado com 10% de soro fetal de bovino e 4 pg/ml de hipoxantina e outro tanto de timidina. Coprecipitaramse 10 ug de pLD9 e pNH316 em células usando o método de fosfato de cálcio, (Gorman et al.. DNA Cloninq, 1985, Vol. II. 143-190. Academic Press, Nova Iorque) e seleccionou-se o fenótipo duplo de resistência a dhfr* /nso usando o meio descrito excepto em que se usou 10% de soro dialisado, omitiram-se a hipoxantina e a timidina e incluiu-se 8418 (Bibco) a 500 pg/ml. Em algumas experiências incluiu-se MTX directamente na primeira fase da selecção para transformantes dhfr*. Reuniram-se vários centos de colónias s analisaram-se para detectar a produção do anticorpo Campath-1H no meio de cultura. 0 rendimento médio foi de 0,5 pg/ml para os transformantes não amplificadas da primeira • fase.

lê

Cada população ds ctíílulas seleccionada foi em seguida cultivada na presença de MTX 10“⁷ M e após duas semanas reuniram-se novamente as colónias resistentes e deter— minou-se a produção de Campath-1H. Houve um aumento considerável no rendimento atingindo um máximo de SO vezes (Quadro 1). Estas células foram danadas com diluição e seleccionadas em relação ao rendimento em Campath-1H tendo-se isolado duas linhas de alto grau ds produção designadas A37 e 3D9 (Quadro 1). Estas foram ambas amplificadas novamente na presença de MTX IO* M, em seguida d onadas com diluição e submetidas a nova selecção. □ aumento da expressão nesta segunda e última fase de amplificação não foi tão drástico como o primeiro, no entanto, quando real imantado em confluência e deixado durante mais 4 dias, as linhas de células A39 e 3D11 foram capazes de produzir até um máximo ds ΞΟΟ jug/ml de Campath-IH.

QUADRO 1

Níveis de expressão de Campath-IH usando amplificação faseada


Construção	Fase de selecção	Campath-IH acumulado (ug/ml)
pLD9 + pNH316	conjunto dhfr*/neo basal conjunto amplificado com linhas de células A37 e Ϊ conjunto amplificado com linha ds células A39	0,5 MTX 10“⁷M 18 a 40 5D9 4O MTX 10*M 60 a 90 100

linha de células

3D11

ISO a Ξ00

Deixaram-se as células atingir a confluência num balão de cultura de tecidos T-175 e em seguida realimentaram-ss com 50 ml de meio de cultura ds tecidos fresca e deixaram-se em repouso durante mais 4 dias. Mediu-se a quanti17

dade do anticorpo Campath-1H que se tinha acumulado no meio durante este período por análise de ELISA. As contagens de células no dia da análise -foram normalmente de 2,5 x 10⁷. O rendimento a partir da linha de células 3D11 re-flecte uma produtividade de 100 pg/10⁶ células/dia.

Empregaram-se ainda os vectores de cotransfecção pL.D9 e pNH316 a -fim de avaliar uma estratégia alternativa de amplificação à descrita anteriorments. Co-trans-fec taram-se as células dh-fr CHO como habitual mente e dois dias mais tarde distribuiram-se directamente por uma série de balões que continham, G41S (para selecção de neomicina) e concentração crescentes de MTX de 3 x IO^-’ M até 10^_7M. Após duas semanas desta sei seção contou-se o número de colónias resistentes e reuniram-se estas para cada balão. Quando as populações celulares estabilizaram, -foram analisadas para determinar os títulos de anticorpos Campath-1H, apresentando-se os resultados no Quadro 2. A medida que o nível de MTX -foi aumentado, veri-ficou-se uma diminuição considerável no número de colónias dh-fr* * sobreviventes, mas estas expressavam proporcionalmente mais Campath-1H. Deste modo, numa selecção directa de uma única -fase a altas concentrações de MTX é possível isolar populaçães celulares que produzem um aumento de até 60 vezes no rendimento de anticorpo em comparação com as populações celulares seieccionadas para os níveis de dh-fr basais»

QUADRO 2

Níveis de expressão de Campath-1H usando selecção directa

Selecção (M de MTX) Colónias dh-fr*

Sem MTX 3 x 10’ '⁸ • 3 x IO^-8

Campath-1H acumu1ad o (ug/m1)

500

IS

10~⁷

Reuniram-se e analisaram-se as colónias de cada fase de selecção por MTX conforme descrito na legenda do Quadro 1..

Este procedimento de selecção foi repetido após uma nova co-transfecção de células e neste caso toda a seleccionada num meio que contém B41B e MTX 3 x modo obteve-se um grande conjunto de colónias que foram em seguida reunidas e reamplifiçadas população foi 1Q“^B M. Deste resistentes ainda duas seguida » di1 ui ção path-lH» j vezes usando concentrsçães de MTX de 6 x 10~⁷ M e em 5 x IO^-6 M« Nesta fase as células foram,, clonadas por e seleccionadas no que se refere aos níveis de Cam-As duas linhas de células de maior produção isoladas eram capazes de produzir níveis de enticorpos até um máxima de 100 a 150 pg/ml e foram designadas por linhas 4F11 ε 5E10»

As velocidades de crescimento destas linhas de células e das linhas A39/3D1Í descritas anteriormente eram inferiores às consi deravelmente transformadas progenitoras» Este rística normal mente comum destas das células dhfr CHO não facto constitui uma caractecélulas uma vez que foram projsctadas para expressar quantidades elevadas de um produto génico. Verificou-se que os rendimentos das linhas de células 5E10 s 4F11 são muito variáveis ao longo do tempo e observou-se que a última tem apenas um tempo ds vida limitado de cerca ds tr®‘s semanas antes de entrar em crise e morrer» Esta instabilidade não se nota noutras linhas de células, se bem que em geral 55 linhas isoladas a partir do segundo procedimento de amplificação, incluindo a linha 5E10, sejam usualmente mais instáveis em cultura» De todas as linhas de células, a linha 3Dii aprs senta simultaneamente um bom cresci mento e níveis de Campath-1H elevados. A fim de assegurar a propagação destas caracteristicas, clonou-se a linha de células 3Dii por diluição uma vez mais a fim de dar origem á linha 3DÍÍ* e esta produziu também níveis de Campath-1H até um máximo de 200 pg/ml.

Exemplo 2

Crescimento de células C1H 5D11* 44 e produção a partir destas células em meio isento de soro

As células C.1H 3D11# cultivadas em monocamada em Iscoves + ácidos aminados não essenciais a 10% em FBS Flow, metotrexato IO^-6 M e antibióticos eram aproximadamente 90% confluentes. Removeram-se estas células do plástico com tripsina/versene, lavaram-se em meio Iscoves sem suplementos centrifugado e ressuspenso a 5 x ÍO⁴/ml em meio WCM4 apresentado no Ouadro seguinte + 0,25% de peptona + 0,1% de polipropi leno-gl icol (F‘ES) 10 000 + 0,5% de soro fetal de bovino (FBS) Mediram-se 10 ml da suspensão celular + m .

=.em metotrexato (MTX) hipoxantina (Η), timidina (T) ou HT para balães de Ξ5² cr Incubaram-se estes balftes a 36,52C num incubador com CO a 5%.

Após seis dias, recolheram-se os conteúdos dos balães e adicionaram-se a um volume igual de meio + MTX sem peptona nem FEO e tranferiram-se para um balão de 75 cm^z„

Estas células foram usadas para inocular um agitador rotativo Techne de 500 ml incubada a uma rotação de 40 rpm s a 3ó,52C. As células continuaram o crescimento sem soro durante um período de cinco meses e, se bem que se tenha verificado que as células necessitavam de um período de adaptação, a velocidade de crescimento e a viabilidade melhoraram rapidamente. 0 período de duplicação da população foi calculado em 73,1 horas durante aproximadamente 7 dias: baixou para 47,4 horas nos 20 dias subsequentes e em seguida estabilizou. A secreção de anticorpo manteve-se elevada a níveis acima de 60 ug/ml. Determinou-se que o número de cópias o gene nestas células não diminuiu de acordo com a intensidade da banda usando uma análise de mancha de Northern.

Em fermentadores, estas células produziram o anticorpo a mais de 70 pg/ml e regularmente atingiram níveis de 100 pg/ml ou mais. Estas células foram designadas C1H 3D11* 44.

Meio WCM4

DMEM Iscoves (Iscoves N e Melcher 923) modificado para excluir BSA, ml /litro mg/1itro mg/1itro «mg/l i tro mq/1i tro mg/1itro mg/1i tro • t»?

+ 50 < 50 + 50 :· 50

4- 50

+	0,062 mg/1i tro
+	1,36 mg/1itro
+	0,2 mg/1itro
+	0,088 mg/1itro
+	1 jiM
+	1 mg/1itro
+	1 mg/1itro
+	0,0025 mg/litr

+ 50 000 Iu/litro + 20 000 Iu/litro + 0,16 mg/1itro (197S), J. Exp. Med., 1, 47, transferrina e lecitina.

de L glutamina 200 mil de L. prol ina de L treonina de L metionina de L cisteína d(5 L. tirosina de ácido ascórbico de vitamina B6 de vitamina B12 de ácido lipóico de linoleato de metilo metotrexato de FeS0₄ de ZnS0₄ de CuSO₄ insulina recombinante (Mucel1in) de poli mi. xina de neomicina de putrescina.2 HCí.

As células C1H 3011# 44 da fase anterior que tinham sido cultivadas sem soro durante mais de 2 meses foram transferidas para um fermentador SGi de 1 litro com um agitador de impulsor em Sngulo de aço inoxidável girando a 70 rpm., A temperatura foi ajustada a 37âC, o d0₂ a 10% e o pH entre 7 e 7,2. D fermentador foi inoculado no dia 0 com 0,22 x 10 célula/ml em meio WCM4 com 0,1% de polietileno-glicol (PEG) 10 000 e 0,25% de peptona de soja e foi arejado na parte superior com 0. As células foram evacuadas sistematicamente usando meio fresco e uma taxa de partilha normal mente entre 1 para 2 e 1 para 4

No dia 33 o arejamento superior foi substituído por borbulhamsnto em profundidade, o que se pensa que possa provocar mais dano físico às células»

A partir do dia 50 usou-se meia WCM5 (ver Busdro seguinte) juntamente com peptona ε PEB em vez de WCM5.

No dia 53 o PEG foi substituído por plurónico F68 a 0,114» 0 crescimento resultante e os níveis do anticorpo alcançados foram superiores a 100 pg/ml nos fermentadores.

Meio WCM5

DMEM Iscoves modificado para excluir BSA, transferrina e lecitina.

+	5	ml/litro	de	L glutamina 200 mM
+	50	mg/1i tro	de	L prolina
+	50	mg/litro	de	L treonina
+	50	mg/1i tro	de	L metionina
+	50	mg/1i tro	de	L cisteína
·!·	50	mg/1i tro	de	L tirosina
+		mg/1i tro	de	ácido L ascórbico
+	0,	062 mg/1itro	de	vitamina B6
+	1,	36 mg/1itro	de	vitamina B12
+		mg/1itro	ds	citrato férrico
+	1	mg/1itro	de	sulfato de cinco
+	0,	0025 mg/1itro	de	sulfato de cobre
+	50	000 Iu/litro	de	polimixina
+	20	000 Iu/litro	de	neomicina
+	?·	pg/1itro	de	etanolamina
+	01.	16 mg/1itro	de	putrescina.2 HCI.
4	cr	mg/1itro	de insulina	recombinante (Nucel1in)

Todos os constituintes dos meios WCN4 e

WCM5 podem ser adquiridos no comércio.

Exemplo 3

Purificação da Campath 1H (G. Dev-95)

Materiais e Métodos

método de purificação usado foi baseado em cromatografia através de três colunas. Os géis usados foram 7,05 ml de proteína A Sepharose 4 Fast Fl ow, Pharmacia código nâ. 17-0974-04 (10 cm x 1 cm); 7,S5 ml ds permutador iónico S Sepharose Fast Flow, Pharmacia código n2. 17-0511-01 ¢10 cm x 1 cm); e 120 ml de meio de exclusão por dimensão Superdex 200, Pharmacia código n2. 17-1046-01 (60 cm x 1,6 cm). Cada coluna foi protegida por um filtro esterilizante Gslman Acro de 0,2 um.

Preparação de equipamento e solucães equipamento do sistema da coluna de proteína A foi lavado por NaDH 1 M e foi deixado nesta solução durante 24 horas a fim de remover as endotoxinas. 0 gel foi em seguida carregado numa coluna Pharmacia CC10/20 e desinfectada com gluconato de hibitano a 2% em etanol a 20%. Uma vez que, de acordo com o fornecedor, os géis de S Sepharose e Superdex 200 são os dois estáveis em NaOH 1 N durante longos períodos estes géis foram carregados nas suas colunas (uma coluna Pharmacia C10/20 e uma coluna Pharmacia C16/100 respectivamente) lavadas com NaOH 1 N e em seguida deixadas em repouso nesta solução durante 24 horas para remover as endotoxinas e desinfectar os sistemas de colunas. As soluçães para a operação das colunas e para a desinfecção foram preparadas usando água destilada isenta de pirogénios e estéril filtrada através de filtros Millipack 100 da Millipore de 0,2 j.im. Analisaram-se amostras de todas as soluçães para detectar a presença de endotoxinas pelo •T?

ensaio de LAL e apenas se usaram em seguida as que apresentaram vai ores fcsai xos.

Operação das colunas

Bei de proteína ft Sepharose 4 Fast Flow

Filtrou-se um meio de cultura de tecidos do Exemplo 1 contendo o anticorpo Campath 1H através de um filtro PALL posidyne SLK7002 NFZF‘ de 0,2 um para um tubo Sealkleen. Eliminou-se a solução de gluconato de hibitanc a 2% em etanol a 20¾ usada para a desinfecção do sistema de colunas de proteína A com água destilada e equilibrou-se o sistema com a salina tamponizada com tris a pH 7,5 (S.T.T.). Carregou-se em seguida a coluna de proteína A com 1,5 litros de Campath 1H não purificado ¢71,4 mg) a um caudal de 300 cm/hora Í235 ml/hora) a uma temperatura de 202C + 52C.

do sistema de S.T.T. de pH colunas com produto não ligado 5 volumes de leito foi arrastado (39,25 ml) de

7,5 ao mesmo caudal„ D gel de proteína A foi eluído a 300 cm/hora com ácido cítrico 0,1 M de pH 3,0 durante <24 horas à temperatura ambiente. Monitorizou-se o perfil da eluição a 2S0 nm usando um monitor de feixe simples Pharmacia volume do pico da eluição deste e anal :í. sou-se para

UV1 e isolou-se o pico proteico. 0 foi de 13,9 ml e removeu-se 1 ml verificar a presença de Campath 1H por análise de ELISA conforme descrita seguidamente.

Bei de S. Sepharose Fast Flow

Eliminou-se a NaDH 1 N do sistema de colunas de S. Sepharose por lavagem com hepes 20 mM de pH 7,5 até que o líquido de lavagem da coluna apresentá-se um pH de 7,5. Os restantes 17,9 ml de eluído da coluna de proteína A foram carregados na coluna com um caudal de 300 cm/hora C235 ml/hora). Eliminou-se o produto não ligado por lavagem do sistema de colunas com 7^r volumes de leito Í55 ml) de hepes 20 • mM de pH 7,5 com o mesmo caudal. Eluiu-se o gel de S. Sepharose

por uma eluição faseada usando NaCl 0,2 M em hepes 20 mM de pH

7,5 com caudal de 300 cm/hora. Reuniu-se o pico da eluição detectado por meio de um monitor Pharmacia UV1 a 280 nm (2 mm de percurso óptica 0,5 AUFS). Iniciou-se a recolha do eluido a aproximadamente 20% de deflecção e continuou-se até o registo se ter reduzido para 70% de deflecção. D volume da eluição foi de 10 ml e tomou-se uma aliquota de 1 ml deste para análise do anticorpo Campath ÍH por análise de ELISA conforme se descreve seguidamente.

Sei Superdex 200

N do sistemí de o

colunas de Superdex

7,2 até que

Eliminou-se a NaOH 1 por lavagem com PBS de pH líquido de lavagem da coluna apresentá-se um pH de 7,2. Os restantes 9 ml de eluido da coluna ds S.Sspharose foram carregados na coluna de Superdex com uma seringa através de um filtro Millex GV da Millipore s lavou-se o filtro com 2 ml de PBS de pH 7,2. Eluiu-se a coluna com PBS de pH 7,2 a 30 cm/hora <60 ml/hora). Monitorizaram-se os picos de exclusão por dimensão usando u.m monitor Pharmacia UVi a 2S0 nm„ Recolheram-se as fracçães dos eluídos dos picos a fim de separar c pico do agregada do pico do monómero. 0 pica do monómero tinha um volume de 17,6 ml.

Análise de Imunossorvente ligado a enzima (ELISA?

Usou-se uma análise imunοIógica enzimática de sanduíche normal na qual IgG anti-humana, feita a partir de snti-soro de cabra imuno-purifiçado, se encontra ligada & fase sólida como camada de captura. A detecção do antigénio (Campath 1.H Ig) capturado é efectuada com uma IgG anti-humana de cabra marcada com peroxidase. A análise é sequencial, sendo as amostras de Campath 1H diluídas num tampão que contém caseína e gelatina hidrolisada. Usam-se períodos de incubação de uma hora e 30 minutos a uma temperatura de 372C. Adiciona-se como cromogénio 3', 3', 5,5'-tetrametilbenzidina

CTMB) e substrato de peróxido de hidrogénio a fim de revelar qualquer peroxidase ligada. Podem determinar-se as densidades ópticas a 450 nm e ler as concentrações de Campath 1H a partir de uma curva padrão de concentrações conhecidas entre 3,9 ng e 250 ng e Campath ÍH purificado.,

Análise de Campath 1H purificado

Estimou-se o conteúdo proteico do pico do monómero a 280 nm usando um coeficiente de extinção ÍE¹* _lcm) de 1,35 (opcionalmente de 1,32) e examinou-se uma amestra para conteúdo de agregado por HPLC numa coluna de determinar exclusão por dimensão. Esterilizou—se o restante material por filtração através de um filtro Millex SV da Millipore (dimensão ds paro 0,2 pm) e carregou-se sm aliquotas ds 0,5 ml em 29 tubos Sarstedt estéreis. Conservou-se a maioria dos tubos das amostras a 4£C mas 6 tubos foram guardados a -70£C. Enviaram-se para análise amostras das armazenadas a 42C conforme descrito nos exemplos que se seguem.

Resultados e discussão

Os resultados da análise ELISA são apresentados no Quadro seguinte.

Campath 1H

Amostra Título Vol.. (ml) C1H total Peso de C1H % de por ELISA do conjunto mg no aplicado recuperaconjunto prox. col. ção/coluna

Bruta	40,8	pg/ml	1750	71,4	71,4	—
Eluído da
proteína A	4,2	mg/ml	18,9	79,4	Ύ vJ 9 ai.	111,2
Eluído da
S„ Spheross	Λ Λ W η -τ	mg/ml	10,0	64,0	57,6	85,0
Monómero	o cr .jí. y uí	mg/ml	17,6	44,0		76,4

D rendimento global de recuperação ao longo do sistema das três colunas, com base na recuperação em cada coluna, é de 61,6¾

Conteúdo em endotoxinas pelo ensaio de LAL

Amostra

Bruta

Pico do monómero de Superde:·

Exemplo 4 <>

Eu/ml ·; Λ A'?^e!

Levou-se a efeito uma electoforese em gel de SDS-poliacrilamida sobre uma placa horizontal Excel gel Pharmacia com um gradiente de 8 a 13%« Os resultados são apresentados na figura 2»

Exemplo 5

Caracterização do anticorpo Campath ÍH por cromatografia líquida de -alta eficiência de fase invertida.

Submeteu-se uma amostra de 50 μΐ do produto do Exemplo 3 (designado por B-Dev-95) sm salina tamponizada por fosfato (PBS) a uma concentração de 2,4 mg/ml a cromatografia líquida de alta eficiência de fase invertida (RP-HPLC) nas condições seguintess

Colunas PLRP-S 10002A (dimensão do poro); S psa (dimensão das partículas) 15 x 0,46 cm de Polymer Laboratories Ltd LJK.

Para fase móvel utilizou-se um sistema ácido fórmico/água/acetonítri 1 o:

Componente A - ácido fórmico; água (5;3)

B - CH, CN.

com o seguinte gradiente

% de A	80	£30	65 0 0	80	80
% ds B		20	35 100 100	20	20
Tempo (min)	o	5	38 41 50	51	65
		Desen v o1veu-«® a	c	al una

ambiente com um caudal d© 1 ml /min¹ è temperatura dstectou-se por UV num monitor LDC Bpectro D de comprimento cks onda variável a um comprimento a., lu f. s...

de onda de 280 nm com uma sensibilidade de 0,1

Resultado

Conforme se pode ver na Figura 3 a cromatografia de Campath 1H usando o sistema descrito anteriormente deu um pico único pronunciado. Os picos que são eluídos após 30 minutos são derivados à fase móvel.

Exemplo 6

Caracterização de Campath 1 reduzido e carboximetilado por cromatográfia líquida de alta eficiência de fase invertida CRPHPLC).

6ê. Redução e Carboximeti1ação de Campath 1H

Pode reduzir-se Campath 1H nas suas cadeias pesadas e leves componentes utilizando procedimentos normais de redução e de carboximetilação, por meio dos quais se reduz em primeiro lugar as ligaçftes de dissulfureto e se evita a reformação destas por alquilação dos grupos tiol livres.

A í ml ds Campath 1H B Dev-95 do Exemplo 3 em salina tamponizada por fosfato a uma concentração de 2,4 mg/ml adieionionou-se 1 ml ds cloreto de guanidínio S M em tampão de tris.HCl 0,5 M de pH 9,0 e 120 p.l de ditiotreitol a 7% no mesmo tampão. Incubou-se a mistura durante duas horas a 37SC „ incubação adicionaram-se 120 pl de

ácido iodoacético a 9H em tampão de tris.HCI 0,5 Μ ε deixou-se a mistura em repouso ao abrigo da luz durante uma hora.

Designou.....se o material reduzido e carboximetilado resultante por Campath 1H RCM.

6ã. Caracterização por RF HPLC de Campath 1H RCH

Submeteu-se uma amostra de 30 pl do produto do Exemplo &a a cromatografia líquida de alta eficiência de fase invertida «ias condições seguintess

Colunas PLRP-S Í0002A (dimensão do poro); 3 um (dimensão das partículas) 15 x 0,46 cm de Polymsr Laboratories Ltd UK.

Para a fase móvel utilizou-se um gradiente de água, ácido fórmico s acetonitrilo conforme se esquematiza no quadro seguintes

A ss ácido fórmico B - água C - acetonitrilo

%	de	A	50	50	29,4	0	0	50	0
tf ft	de	B	*CT ~'f u.¹	35	20,6	0	0	35	35
V ft	de	C	15	15	50	100	100	15	15
T smp o	Cmi n)	0	5	70	72	32	32, 1	95
				Desenvolveu-se	a	coluna	è	temperatura
ambiente com um	caudal	dc 1	ml / mi n	-¹ e	segui-se a	absorvância

de UV s um comprimento de onda de 2S0 nm a.u.f.s».

Resultado.

Conforme ss pode ver na Figura 4, o produto resultante ê resolvido em dois picos, correspondentes às cadeias pesadas e leves.

emplo 7

Caracterização de Campath 1H por crornatografia de exclusão por dimensão de alta eficiência para a determinação de componentes de alto peso molecular de Campath

1H.

Submeteu-se uma amostra de 50 p.l do produto do Exemplo 3 (G-Dsv~95) em salina tamponizada por fosfato (a uma concentração de 2,4 mg/ml) a cromatcgrafia de exclusão por dimensão de alta eficiência nas condiçães seguintes.

Coluna - gel TSK G3000 SWx1 30 cm x 0,78 cm d.i.

Fase móvel - Na_zHF'Q 0,05 M + Na_zS0₄ 0,l M ajustado com H ₃F'O₄a pH 6,8

Caudal - 0,75 ml/min^-1

Desenvolveu-se a coluna durante vinte e quatro minutos à temperatura ambiente e segiu-se a absorvãncia de UV a um comprimento ds onda de 280 nm»

Analisou-se pelo mesmo método uma segunda amostra de 50 j-tl usando Campath 1H reduzido de acordo com o Exemplo 6a).

Resultados; Os resultados apresentados na Figura 5 mostram um pico único nítida qus indica baixos níveis ds agregado. Alcançaifi-se geral mente níveis entre 0,5 e 2,0%. Os resultados apresentados na Figura 6 mostram dois picos principais correspondentes às cadeias pesadas e leves na proporção prevista. Os picos correspondentes ao volume total ds permeação (cerca de 15 a IS minutos) são devidos aos reagentes.

Análises biológicas para Campath 1H purificado funcional

Análise por lise complementar de Campath 1H por lise complementar é uma medida da função de anticorpo expressa como actividade espec í· f ic , determinada pela capacidade ds um preparado purificado de um anticorpo anti-CD_w52 de concentração conhecida para se ligar a um número pré-determinado de células e para provocar a lise das células.

A análise é efectuada com Campath 1H usando

células Karpas 422 (estabelecidas a partir de uma linha de células de linfoma não de Hodgkin de células B - Dyer et al.

(1990) Blood, sobre a superfície celular, que expressa um antigénio Campath

Carregaram-se 1,2

10’ células ·!·>£ g ι alvéolos de uma com uma marcação radioactiva por incubação durante duas horas a 375C num incubador de C0₂ na presença de 600 pCi de_slCr (cromato de sódio).

Adicionaram-se 5,3 ml das células carregadas num meio nutriente (volume total 23,5 ml) humano normal e pipetaram-se 150 μϊ para os placa de microtitulaçào.

Misturaram-se amostras de 50 p.l do eluído final de três fases de purificação com as células e incubaramse durante 30 minutos a 4£>C seguidos de 90 minutos a 372C. Centrifugou-se a cultura a 2000 rpm durante 5 minutos e contou-se a redi oacti vi dade em 100 μϊ do sobrenadante celular num contador gama. Calculou-se a actividade de liss complementar em quilo-unidades/ml a partir de uma curva padrão de um preparado de referência (1000 unidades/ml).

Os resultados são apresentados no Quadro 3.

Estimou-se a concentração de Campath 1H nas amostras de 50 pl do eluído final usando amostras em PBS de pH 7,2 analisadas num espeetrofotómetro a 280 nm. Qs resusltados estão reunidos no Quadro 3 em densidade óptica em mg/ml.

A partir destes dados determina-se a actividade específica em quilo-unidades usando a equação:

DO

Amostra

Li se comp1ementar

KU/ml

11,2

14,8

13,7

QUADRO 5

Conc. de proteína mg/ml

11,1

14,2

13,6

Actividade específica em KLJ

1,0

Os resultados indicam que os preparados purificados de Campath ÍH são funcionais.

Claims

Processo para a purificação de um anticorpo anti-CD_w52 caracterizado por se aplicar uma solução aquosa do sn t i c o r p o a»

a) uma coluna de proteína A de medo a que o anticorpo seja absorvido na coluna s eluir o anticorpo com uma solução ácida;

b> aplicar o eluído ácido a uma coluna de permuta iónica de partículas carregadas de modo a que o anticorpo seja absorvido e em seguida eluir o anticorpo com uma solução

c) aquosa de iães ds carga contrária;

aplicar o eluído aquoso a uma coluna de exclusão por dimensão de partículas porosas de modo a que não sejam do anti po sejam retirad porosas e a obter o anticorpo pretendido seleccionadas obtidas da coluna.

que as moléculas s nas parti cuias em fraeçães

Processo de acordo com a rei vindicação í, caracterizado por o anticorpo anti-CD_w52 purificado obtido apresentar numa cromatografia de exclusão por dimensão um único pico sob conriiçães não redutoras a dois picos maioritários sob condiçãss redutoras.

caracterizado por a coluna de proteina A ser eluída com ácido cí tri co.

- 4ã. Processo de acordo com qualquer das rei vindicações 1, Ξ ou 3, caracterizado por a coluna de proteína A ser uma coluna de proteína A Sepharose.

caracterizado por p er mu t a c at i ó n i c a.

Processo de acordo com a reivindicação 1, coluna de permuta iónica ser uma coluna de êã.

car ac t er i z ad o por permuta ard óni ca.

Processo de acordo . coluna de permuta com a reivindicação i, ónica ser uma coluna de

7ã. Processo de acordo com qualquer das reivindicações í a ó, caracterizado por c anticorpo ser preparado num meio isento de soro.

- Sã. Processo de acordo com qualquer das reivindicações í a 7, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo recombinante.

9ã

Processo de acordo com a reivindicação S, caracterizado por o anticorpo ser um anticorpo alterado.

Processo d© acordo com a reivindicação *?, caractarrizado por o anticorpo ser um anticorpo RDG (de regiães determinantes d© complementaridade) enxertado,

- ilsL Processo d© acordo com qualquer das reivindicações la. 7, caracterizado por o anticorpo ser um -anticorpo humano.

- 12â. Processo para a preparação de uma for mui ração que contém um anticorpo anti-CBW52 purificada caracterizado por se incorporar uma preparação de anticorpo CDW52 purificado obtida de acordo com qualquer das reivindicaçães la 7 em conjunto com um diluente ou substância veicular fisiologicamente aceitável.

13ã.

Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por a formulação ser liofilizada.

Í4â.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 ou 13, caracterizado por a formulação ser adequada para administração parenteral ou subcutânea.

·- í 5â. Processo de acordo com qualquer das rei.vindicações 12 a 14, caracterizado por a formulação se destinar a ser utilizada para imunosuprsssão.

16ãe Processo de· acordo com qualquer das reivindicações 12 a 14, caracterí zado por a -formulaçãa se destinar a ser utilizada para o tratamento de s-f seções mediadas por células T.

- 173. Processo ds acordo com qualquer das rsivindicações 12 a 14, caracterisadc por a -formulação se destinar a ser utilizada para o tratamento ds afecções autoimunes.

18S.

Processo de acordo com qualquer das reivindicações 12 a 14, caracterí zado por a -formulação se destinar a ser utilizada para o tratamento ds cancro.

- 193. Processo de acordo com a reivindicação 18, caracterizado por a -formulação se destinar a ser utilizada para c.« tratamento de lin-foma não ds Hodgkin ou leucemia.

A requerente reivindica a prioridade do pedido ds patente britânico apresnetado em 17 ds Outubro de 1990, sob ο N2. 902 254.5.