FR2668164A1 - Immunoglobuline purifiee. - Google Patents

Abstract

L'invention concerne l'industrie pharmaceutique. Elle a pour objet une préparation purifiée d'un anticorps anti-CDw52 qui présente à la chromatographie d'exclusion dimensionnelle un pic unique en conditions non réductrices (Fig. 5) et deux pics majeurs en conditions réductrices et qui présente de préférence aussi en SDS-PAGE classique une bande principale pour un échantillon non réduit et deux bandes principales pour un échantillon réduit. La préparation présente à la HPLC avec inversion de phase un pic aigu unique en conditions non réductrices et deux pics majeurs en conditions réductrices. Cette préparation est préférée pour exercer une immunosuppression prophylactique ou thérapeutique.

Description

Immunoglobuline purifiée.

La présente invention concerne une préparation purifiée d'anticorps monoclonaux contre l'antigène C Dw 52, leur utilisation en thérapeutique et des procédés pour les produire. Les anticorps ou immunoglobulines sont des molécules protéiques bifonctionnelles, dont une région, qui est hautement variable entre les différents anticorps, est responsable de la liaison avec un antigène, par exemple de nombreux agents infectieux différents que le corps peut rencontrer, tandis que la seconde région, qui est constante, est responsable de la liaison avec les récepteurs Fc des cellules et active aussi le complément De cette façon, les anticorps constituent un composant vital de la réponse immunitaire des mammifères dans la destruction des micro-organismes et virus étrangers L'immunisation d'un animal à l'aide d'un antigène se traduit par la production d'anticorps polyclonaux, en d'autres termes, d'anticorps

différents ayant des spécificités et affinités différentes.

Pour des applications thérapeutiques, il est avantageux d'être à même de produire des anticorps à partir d'un clone lymphocytaire unique; ces anticorps sont appelés anticorps monoclonaux et sont spécifiques pour un déterminant particulier de l'antigène d'origine Ils peuvent être obtenus par le procédé de Kohler et Milstein (Nature, 1975,

256, 495-497).

Une molécule d'anticorps unique de la classe Ig G est formée de deux chaînes légères et, de deux chaînes lourdes qui sont maintenues ensemble par des ponts disulfure intercaténaires Chaque chaîne légère est unie à une chaîne lourde par une liaison disulfure et les deux chaines lourdes

sont liées l'une à l'autre par des liaisons disulfure.

Chaque chaîne lourde comprend à une extrémité un domaine variable suivi d'un certain nombre de domaines constants et chaque chaîne légère comprend un domaine variable à une extrémité et un domaine constant à l'autre extrémité Le domaine variable de la chaîne légère est aligné sur le domaine variable de la chaîne lourde Le domaine constant de la chaîne légère est aligné sur le premier domaine constant de la chaîne lourde Les domaines constants restants des chaînes lourdes sont alignés les uns sur les autres et forment le fragment Fc après coupure limitée de

la chaîne polypeptidique.

Les domaines variables de chaque paire de chaînes

légère et lourde forment le site de liaison de l'antigène.

Conjointement avec le premier domaine constant de la chaîne lourde et le domaine constant de la chaîne légère, ils forment, après coupure limitée de la chaîne polypeptidique, le fragment Fab Les domaines variables de chaque paire de chaînes lourde et légère ont la même structure générale, chaque domaine comprenant une charpente de quatre régions, dont les séquences sont relativement conservées, connectées part trois régions déterminantes de complémentarité (CDR), dites aussi hypervariables Les quatre régions charpente adoptent largement une conformation en feuillet B et les CDR forment des boucles qui connectent la structure en feuillet B et dans certains cas en font partie Les CDR sont maintenues à proximité étroite par les régions charpente et, avec les CDR de l'autre domaine, contribuent & la formation

du site de liaison de l'antigène.

L'antigène C Dw 52 (GHale et al, Tissue Antigens 1990 35, pages 118 à 127) est une molécule abondante largement répartie sur la plupar't-des lymphocytes humains sinon tous Il est présent aussi à la surface de la plupart des lymphocytes malins, mais non des cellules hématopoïétiques, et il n'est pas exprimé sur les granulocytes, les plaquettes et les cellules érythroïdes ou myéloïdes de la moelle osseuse Un certain nombre d'anticorps monoclonaux de différents isotypes ont été produits contre cet antigène et ont été décrits dans la littérature, (G Hale et al Tissue Antigens, 1990, 35, pages 118 à 127) L'un de ces anticorps, qui est un anticorps Ig Gl, a été humanisé (Nature, 1988, 322, 323-327 et EPO 328 404) Cet anticorps est appelé Campath 1 H (Campath est une marque de commerce de la Société The Wellcome Foundation Ltd) Une préparation de cet anticorps a été utilisée pour traiter des patients souffrant d'un lymphome non hodgkinien, (G Hale et al, Lancet, 1988, pages

1394 à 1399).

Le Campath 1 H a été purifié à l'origine par un procédé en un stade sur une colonne de protéine A sur Sépharose (EPO 328 404) La protéine A est un ligand spécifique de groupe qui se lie à la région Fc de l'immunoglobuline; pour cette raison, les autres immunoglobulines contenues dans le sérum en présence dans le milieu de culture sont purifiées en même temps que l Uimmunoglobuline intéressante et contaminent ainsi le produit final (P A Underwood et al, Meths in Enzymol 121, pages 301 à 306 ( 1986), et P A Underwood et al, J Immunol. Meths 60, 33, 1983) Les anticorps qui sont destinés à la thérapeutique médicale peuvent devoir être administrés à plusieurs reprises, de sorte que la nécessité d'éliminer les immunoglobulines étrangères est importante parce que dette administration peut provoquer une réponse immune et induire la néphrotoxicité, la maladie du sérum et le choc anaphylactique dans les cas graves Le sérum animal complet ou l'albumine du sérum contiennent d'autres protéines, des lipides et des- hydrates de carbone et ces molécules peuvent elles-mêmes susciter une réponse immune, mais exposent au danger plus grand d'héberger des agents pathogènes tels que celui qui provoque l'encéphalopathie spongiforme bovine (BSE) Des endotoxines indésirables parce qu'elles produisent des réponses fébriles potentiellement fatales

peuvent être présentes aussi.

D'autres contaminants du milieu de culture contenant l'anticorps exprimé sont notamment les acides nucléiques viraux et cellulaires de l'hôte, de même que des agrégats d'anticorps parce qu'ils peuvent aussi agir comme

immunogènes et provoquer une réponse immune indésirable.

La présente invention a donc pour objet une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 qui présente à la chromatographie d'exclusion dimensionnelle un pic unique dans des conditions non réductrices et deux pics

majeurs dans des conditions dénaturantes et réductrices.

De préférence, la préparation présente aussi à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec SDS classique une bande principale pour un échantillon non réduit et deux bandes principales pour un échantillon réduit. De surcroît, la préparation présente à la HPLC avec inversion de phase un pic aigu unique dans des conditions non réductrices et deux pics majeurs dans des

conditions réductrices.

*l La chromatographie d'exclusion dimensionnelle, comme le nom le suggère, opère la séparation sur la base de la dimension des protéines En règle générale, la séparation a lieu du fait que les grosses molécules sont empêchées d'entrer dans la phase stationnaire poreuse et sont entraînées directement à travers la colonne, tandis que les molécules progressivement plus petites sont de plus en'plus à même de pénétrer dans la phase stationnaire et présentent donc des temps d'élution particulièrement plus longs C'est la porosité de la phase stationnaire qui détermine donc-la séparation réalisée Cette technique analytique est particulièrement bonne pour la détermination des taux d'agrégats dans la préparation purifiée La phase stationnaire est un gel de silice à grands pores qui peut être modifié par des radicaux, diol, de préférence un gel tel que le Zorbax GF 450-GF 250 (marque de commerce de la Société Dupont) ou le gel G 3000 SWXL ou G 4000 SWXL TSK La phase mobile a généralement un p H de l'intervalle de 4 à 8, de

préférence de 6 à 7,5 et avantageusement d'environ 6,8.

Cette phase est avantageusement un mélange d'un phosphate, comme l'hydrogéno-orthophosphate de disodium, d'un sulfate, comme le sulfate de sodium ou de potassium, et d'eau La molarité d'un tel mélange est généralement 25 m M à 1 M, plus avantageusement voisine de 50 m M. L'électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec SDS (SDS PAGE) donne des informations & propos du nombre et du type des protéines contenues dans un mélange et de leur abondance relative et permet une mesure de leurs poids moléculaires Le SDS est un détergent anionique qui réagit avec les protéines avant l'électrophorèse La plupart des complexes protéine- SDS sont solubles et migrent dans un gel de polyacrylamide-en direction de l'anode sous l'influence d'un champ électrique La vitesse de migration est généralement en raison inverse du logarithme du poids moléculaire de la protéine Il est commode d'exécuter l'analyse avec SDS sur un gel à gradient, qui peut être un lit plat ou une plaque ou un bâton vertical Le gradient est avantageusement de 10 à 22 %, de préférence de 8 à 18 % De préférence, le gel est le gel Pharmacia Excel (marque de commerce). La HPLC avec inversion de phase opère la séparation sur la base du caractère hydrophobe Comme dans les autres techniques HPLC, il y a une phase stationnaire polymère, par exemple de poly(styrène/divinylbenzène) La phase mobile est habituellement une combinaison d'un tampon aqueux faible ou d'un acide dilué et d'un solvant organique miscible à l'eau Pour une séparation efficace des protéines, la phase mobile est généralement un système à gradient qui est nécessaire pour opérer la séparation et est

de préférence linéaire pour la commodité.

La phase stationnaire pour l'analyse des immunoglobulines peut être unze matrice polymère organique, comme le PLRP-S de Polymer Labs, généralement d'une granulométrie voisine de 8 Sla; la dimension des pores est de préférence de 300 ou 1 ooo La phase mobile est avantageusement, un mélange d'un acide, comme l'acide formique, acétique ou trifluoroacétique, d'eau et d'acétonitrile L'acide et l'eau sont de préférence présents

dans le rapport de 5:3.

Un anticorps peut être réduit en ses chaînes lourdes et légères constitutives par réduction des ponts disulfure dans des conditions dénaturantes, par exemple au

moyen de chlorure de guanidinium et de dithiothréitol.

L'alcoylation ultérieure des radicaux thiol libres, par exemple par l'iodoacétamide et l'acide iodoacétique, aide à empêcher la reformation des liaisons. Une mesure de la pureté est donnée par l'activité spécifique de la préparation d'anticorps L'activité spécifique peut être déterminée par le procédé exposé dans les exemples Une préparation conforme à l'invention a de préférence une activité spécifique supérieure à 0,8 kilo-unité par mg, idéalement supérieure à 0,9 kilo-unité par mg et plus avantageusement voisine de

1,0 kilo-unité par mg.

Une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 conforme à l'invention est idéalement une substance exempte de contaminants cellulaires de l'hôte, comme des protéines, acides nucléiques et endotoxines cellulaires de l'hôte L'activité spécifique procure une information à propos des taux de protéines cellulaires de l'hôte dans la préparation Les taux d'endotoxines peuvent être mesurés par le procédé LAL (lysat d'amibocytes de limule) décrit dans Parenteral Quality Control, M J Alles

et al, Marcel Dekker Inc, New York.

Une préparation conforme à l'invention est aussi en substance exempte d'agrégats, tels que déterminés par chromatographie d'exclusion dimensionnelle Il est souhaitable que ces taux soient inférieurs à 2 %, idéalement

inférieurs à 0,5 %.

Les anticorps conformes à l'invention peuvent être préparés à l'aide d'un système d'expression recombinant; le système préféré est un système d'expression sur mammifère avec des cellules d'ovaire de hamster de Chine (CHO) Ces cellules peuvent être déficientes en dihydrofolate réductase (dhfr) et donc dépendantes de la thymidine et de l'hypoxanthine pour leur croissance (PNAS 77 1980, 4216-4220) La lignée cellulaire CHO dhfr' parentale est transfectée avec le gène pour l'anticorps et le gène dhfr qui permet la sélection des transformants des cellules CHO du phénotype dhfr positif La sélection est effectuée en cultivant les colonies sur des milieux exempts de thymidine et d'hypoxanthine dont l'absence empêche les cellules non transformées de croître et empêche les cellules transformées de reconstituer le trajet du folate et ainsi de contourner le système de sélection Ces transformants expriment habituellement de faibles taux du produit de gène

en raison de la co-intégration des deux gènes transfectés.

Les taux d'expression du gène pour l'anticorps peuvent être augmentés par amplification avec du méthotrexate (MTX) Cet agent est un- inhibiteur direct de l'enzyme dhfr et permet d'isoler les colonies résistantes qui amplifient leur nombre de copies du gène dhfr suffisamment pour survivre dans ces conditions Comme les gènes dhfr et pour l'anticorps sont plus étroitement liés dans les transformants d'origine, il y à habituellement amplification concomitante et par conséquent expression accrue du gène pour l'anticorps qui

est souhaité.

Un autre système d'expression à utiliser avec les cellules CHO ou des cellules de myélome est le système d'amplification par la glutamine synthétase (GS) décrit dans le document W 087/04462 Ce système implique la transfection d'une cellule avec un gène codant pour l'enzyme GS et le gène pour l'anticorps souhaité Les cellules qui croissent sur un milieu exempt de * glutamine sont ensuite sélectionnées Ces clones sélectionnés sont ensuite soumis à l'inhibition de l'enzyme GS au moyen de méthionine sulfoximine (Msx) Pour survivre, les cellules amplifient le gène GS avec amplification concomitante du gène codant

pour l'anticorps.

De préférence, l'anticorps est obtenu sous une forme sous laquelle il est sécrété dans le milieu de culture Le milieu récolté peut être ensuite filtré et/ou concentré par ultrafiltration pour donner une solution aqueuse qui est soumise à une technique de purification qui comprend l'application d'une solution aqueuse de l'anticorps a) sur une colonne de protéine A de -façon & absorber l'anticorps sur la colonne, puis l'élution de l'anticorps avec une solution acide; b) l'application de l'éluat acide sur une colonne échangeuse d'anions de particules chargées afin d'absorber l'anticorps, puis l'élution de l'anticorps avec une solution aqueuse d'ions de charge opposée; c) l'application de l'éluat aqueux sur une colonne d'exclusion dimensionnelle de particules poreuses afin d'opérer la séparation suivant la dimension moléculaire et d'obtenir l'anticorps souhaité dans des fractions

sélectionnées éluées de la colonne.

La protéine A est un ligand spécifique du groupe qui se lie à la région Fc de la plupart des Ig G Elle est synthétisée par certaines souches de Staphylococcus aureus et peut être isolée des surnagents de culture, puis insolubilisée par fixation sur des perles d'agarose ou de silice Une variante opératoire consiste à utiliser des bactéries entières d'une souche qui porte de grandes quantités de protéines A à la surface des cellules bactériennes Les préparations de gel des deux types sont disponibles sur le marché (Protéine A Pharmacia Whole bacteria Calbiochem, Ig G sorb) (Alan Johnstone et Robin Thorpe Immunochemistry in practice, Blackwell Scientific Publn Chpt 10) Une variante à la protéine A est la

protéine G (Analytical Chem vol 61 ( 13) 1989 1317).

La colonne qui est utilisée par préférence est une colonne de protéine A sur Sépharose, en particulier

protéine A sur Sépharose Fast Flow (marque de commerce).

Idéalement, la colonne est' lavée avec de la solution physiologique salée tamponnée au tris ou au phosphate au voisinage de p H 7,0 et l'anticorps est élué à un p H acide de 3,0 à 3,5, avantageusement à p H 3,0, à l'aide d'un acide comme l'acide citrique, par exemple d'une concentration environ 0,1 M. La chromatographie par échange d'ions exploite les interactions entre les radicaux chargés d'une phase stationnaire et de l'échantillon qui se trouve dans la phase mobile La phase stationnaire d'une colonne échangeuse d'ions peut être un échangeur de cations portant des charges positives ou un échangeur d'anions portant des charges négatives Les radicaux chargés sont neutralisés par des contre ions de charge opposée dans la phase mobile, les contre ions étant remplacés pendant la chromatographie par des molécules plus fortement chargées de l'échantillon Il est préférable d'utiliser des colonnes réticulées à base, par exemple d'agarose, comme une colonne S-Sépharose Fast Flow (marque de commerce), en particulier une colonne échangeuse de cations S-Sépharose Fast Flow (marque de commerce) En variante, une colonne à membrane pourrait être utilisée La colonne est d'habitude lavée, après l'application de l'éluat provenant de la colonne de protéine A, avec du tampon HEPES 20 m M de p H 7,5 et l'anticorps est élué avec le même tampon contenant du chlorure de sodium 0,2 M jusqu'à 0,075 M. La chromatographie d'exclusion dimensionnelle, comme le nom le suggère, opère la séparation sur la base de la dimension des protéines En général, la séparation a lieu du fait que les grosses molécules sont empêchées de pénétrer dans la phase stationnaire poreuse et sont entraînées directement à travers la colonne, tandis que les molécules progressivement plus petites sont de plus en plus à même de pénétrer dans la phase stationnaire et ont donc des temps d'élution particulièrement plus Éongs C'est la porosité de la phase stationnaire qui détermine donc la séparation réalisée Des matières appropriées sont Chimiquement liées et offrent de la résistance-& la compression, par exemple une composition d'agarose et/ou de dextrane comme le Superdex (marque de commerce) Une colonne préférée est une colonne d'exclusion dimensionnelle Superdex 200 L'éluat de la colonne échangeuse d'ions est de préférence appliqué sur la colonne de Superdex, puis développé eans- un tampon d'un p H de 5 à 8, de préférence dans de la solution physiologique

salée tamponnée au phosphate de p H 7,2.

Chaque colonne est de préférence protégée par un filtre qui peut être un filtre stérilisant Gelman Acro de 0,2 m ou, dans le cas de la colonne de protéine A, un filtre PALL posidyne SLK 7002 NFZP ou PALL DSLK 2 (disponible chez Pall Process Filtration Ltd European House, Havant Street, Portsmouth 301 3 PD) et pour les deux autres colonnes, un filtre Millipak, de préférence Millipak 100 pour la colonne échangeuse d'ions et Millipak 20 ou 60 pour la colonne d'exclusion dimensionnelle (disponible chez

Millipore, The Boulevard, Blackmore Lane, Watford, Herts).

Les colonnes sont de préférence désinfectées avant usage à l'aide d'un agent désinfectant approprié, par exemple du Na OH 0,5 M pendant 16 heures pour l'une quelconque des colonnes, ou du gluconate d'hibitane à 2 % dans l'éthanol à 20 % pour la colonne de protéine A et du Na OH 1 N pour les deux autres colonnes Les agents désinfectants sont éliminés par, lavage avec les tampons stériles appropriés avant l'application de la solution de protéine Toutes les solutions utilisées dans le procédé sont de préférence

stériles et exemptes d'endotoxines.

Des stades supplémentaires peuvent être adjoints

à la technique de purification exposée ci-dessus.

L'ultrafiltration peut être appliquée pour réduire davantage la contamination par les acides nucléiques viraux et cellulaires de l'hôte Ceci peut être exécuté à l'aide d'unités d'ultrafiltration commercialisées, comme les membranes Viresolve/70 ' ou Viresolve/180 ', outre des membranes de cellulose régénérée PLMK opérant la coupure à 300 k, toutes disponibles chez Milliporç, The Boulevard, Blackmore Lane, Watford, Herts Une variante opératoire pour réduire la contamination virale est la microfiltration avec une membrane de Nylon dans une cartouche, par exemple une

membrane de Nylon 66 0,04 M de PALL.

Un stade de purification pour séparer l'ADN contaminant peut être introduit, par exemple un lavage de la colonne de protéine A avec du Na Cl 1 M-3 M dans du tampon à p H neutre, de préférence de la solution physiologique 1 i salée tamponnée au phosphate à p H 7,2 De la glycine peut être ajoutée au Na Cl, de préférence à peu près 1,5 M, à un

p H de-8,8 à 9,0.

Un anticorps anti-C Dw 52 de la présente invention peut être un anticorps monoclonal obtenu à partir d'un hybridome de souris ou de rat et/ou peut être obtenu suivant

la technique de l'ADN recombinant.

La technique de l'ADN recombinant a procuré la possibilité de développer des anticorps modifiés de deux types fondamentaux Le premier type, appelé anticorps chimère, est celui o les domaines constants du rongeur seul sont remplacés par des domaines équivalents d'origine humaine (Morrison et al, P N A S, 1984, 81, 6851-6855; Boulianne et al, Nature, 1985, 314, 268-270; et Neuberger et al, Nature, 1985, 314, 268- 270) Le deuxième type est celui o les domaines constants de la souris et les régions charpente de la souris sont tous remplacés par les domaines et régions équivalents d'origine humaine Le deuxième type d'anticorps est appelé anticorps humanisé ou CDR-greffé (Jones et al, Nature, 1986, 321, 522-525; et Riechmann et al, Nature, 1988, 332, 323-327) Ces anticorps ressemblent davantage aux anticorps humains lorsqu'ils sont administrés à un patient humain et ne suscitent pas de réponse anti-anticorps au même degré Un anticorps humain

pourrait être utilisé aussi.

Par conséquent, l'anticorps anti-C Dw 52 purifié de l'invention peut être un anticorps de rat, de souris ou d'être humain dont les séquences d'acides aminés des chaînes lourdes et légères sont homologues des séquences de l'anticorps produit par les lymphocytes de l'espèce in vivo ou par des hybridomes in vitro De préférence, l'anticorps anti-C Dw 52 est un anticorps modifié tel qu'un anticorps hybride dans lequel les chaînes lourdes et légères sont homologues de celles d'un anticorps naturel, mais sont

combinées d'une façon qui n'existeraitpas naturellement.

L'anticorps peut être un anticorps chimère qui comprend des régions variables d'un anticorps et des régions constantes d'un autre Ainsi, les anticorps chimères peuvent être des chimères espèce/espèce ou des chimères classe/classe Ces anticorps chimères peuvent comprendre une ou plusieurs modifications supplémentaires pour améliorer l'aptitude de liaison de l'antigène ou modifier la fonction de l'effecteur Une autre forme d'anticorps modifié est un anticorps humanisé ou CDR- greffé comprenant un anticorps mixte, dans lequel des parties des régions hypervariables en plus des CDR sont transférées à la charpente humaine Des acides aminés supplémentaires dans la charpente ou les

régions constantes de ces anticorps peuvent être modifiés.

Le cadre de l'invention comprend donc aussi tout anticorps modifié anti- C Dw 52 dans lequel la séquence des acides aminés n'est pas celle existant dans l'état naturel Cependant, les anticorps CDR-greffés sont spécialement préférés et le Campath 1 H (marque de commerce de la Société The Wellcome Fouhdation Ltd) en est un exemple Les séquences d'ADN des chaînes de l'anticorps, notamment des CDR de Campath 1 H sont détaillées dans le document EPO 328 404 mentionné ici à titre de référence L'invention a donc aussi pour objet une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52, dont l'anticorps comprend une ou plusieurs des séquences CDR

décrites dans le document EPO 328 404.

Les anticorps anti-C Dw 52 purifiés sont utiles en thérapeutique médicale pour le traitement de nombreuses affections humaines, généralement immunosuppressives, plus particulièrement, par exemple, les affections à médiation par les cellules-T, notamment la vasculite sévère, l'arthrite rhumatoïde, le lupus systémique, outre les affections auto-immunes, comme la sclérose en plaques, la maladie greffe contre hôte, le psoriasis, le début du diabète juvénile, la maladie de Sjogren, l'affection thyroidale, lamyasthénie grave, la réjection de transplant et l'asthme Ces anticorps sont utiles aussi pour le traitement de cancers tels que le lympjome non-hodgkinien

et les leucémies.

L'invention a donc pour objet l'utilisation d'une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 dans la fabrication d'un médicament pour le traitement de l'une quelconque des affections précitées Elle a aussi pour objet un procédé de traitement d'un être humain atteint d'une telle affection, qui comprend 1 'administration à l'intéressé d'une quantité thérapeutiquement efficace d'une préparation

purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52.

Les doses de ces anticorps varient avec l'état à traiter et avec le receveur du traitement, mais se situent dans l t intervalle de 1 à environ 100 mg pour un patient adulte, de préférence de 1 à 10 mg, d'habitude en administration quotidienne pendant une durée de 1 à jours Un régime d'administration en deux phases peut être préférable, avec administration de 1 à 5 mg pendant 5

à 10 jours, puis de 6 à 15 mg pendant encore 5 à 10 jours.

L'invention a aussi pour objet des compositions contenant une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 Ces compositions comprennent de préférence, outre l'anticorps, un diluant ou excipient physiologiquement acceptable facultativement en mélange avec d'autres agents tels que d'autres anticorps ou des antibiotiques Des excipients appropriés sont entre autres, mais non limitativement, la solution physiologique salée, la solution physiologique salée tamponnée au phosphate, la solution physiologique salée glucosée tamponnée au phosphate et la solution physiologique salée tamponnée En variante, l'anticorps peut être lyophilisé (séché par le froid) et reconstitué suivant les besoins pour l'administration par addition d'une solution aqueuse tamponnée, telle que décrite ci-dessus Les voies d'administration sont les voies parentérales habituelles comprenant l'injection ou la perfusion intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. Dans les dessins annexés: la Fig 1 représente: (a) le produit construit p LD 9 contenant des cassettes d'expression pour le marqueur de sélection/amplification dhfr "infirme" et le c ADN de la chaîne légère de Campath-l H La petite boîte avec la flèche en traits interrompus est le promoteur de SV 40 affaibli; la boîte plus grande en traits interrompus avec une flèche est le promoteur B-actine; poly A désigne respectivement les signaux de début et de fin de polyadénylation; la petite boîte avec ori contient l'origine de réplication de SV 40; (b) le produit construit p NH 316 contenant des cassettes d'expression pour le marqueur de sélection néomycine et le c ADN de la chaîne lourde de Campath-l H La boite avec une flèche et MT indique le promoteur métallothionéine de souris Les sites de restriction indiqués sont H, Hind III; Bg, Bgl II; B, Bam HI; RI, Eco Rl; la Fig 2 représente un gel de polyacrylamide avec SDS de Campath 1 H non réduit et réduit montrant une bande principale unique; la Fig 3 est un chromatogramme à haute performance à inversion de phase du Campath 1 H non réduit montrant un pic unique; la Fig 4 est un chromatogramme à haute performance à inversion de phase du Campath 1 H réduit et carboxyméthylé montrant deux pics résolus qui correspondent aux chaînes lourdes et légères de l'anticorps; la Fig 5 est un chromatogramme d'exclusion dimensionnelle à haute performance du Campath 1 H non réduit montrant un pic unique; la Fig 6 est un cÉromatogramme d'exclusion dimensionnelle à haute performance du Campath 1 H réduitmontrant deux pics majeurs.

EXEMPLE 1

Production de Campath 1 H à partir de cellules CHO.

EXEMPLE 1 A -

Clonaqe des c ADN des chaînes lourdes et légères pour Campath-l H. On a greffé à l'origine les régions déterminantes de complémentarité du Campath-l G monoclonal de rat directement dans les charpentes des chaînes lourdes et légères génomiques humaines (Winter et &l, Nature, 1988, 322, 323-327) On a manipulé ces produits construits en vue de l'expression dans la lignée cellulaire de myélome YO, ce qui a donné des productions de Campath-l H s'élevant jusqu'à 5 pg/ml après 10 à 14 jours en culture (Hale et al, Tissue Antiqens, 1990, 35, 118-127 et Winter et al, Nature, 1988, 322, 323-327) On a utilisé la lignée cellulaire de myélome TF 57 (Hale et al, ibid,) pour engendrer des fractions de c ADN sélectionnées suivant dimension de 0,9 à 1,2 kb et de 1,4 à 1,7 kb pour les c ADN des chaînes légères et lourdes respectivement On les a utilisées pour produire des banques de c ADN comprenant un linker avec Eco R 1 dans Xgtl O Toutes les opérations ont été faites comme décrit par Huynh et al, lDNA Cloning, vol I: A Practical Approach, 1984, Glover, D (Editor), IRL Press, Oxfordl On a trié les banques avec des sondes à coupure déplacée au l 32 pl spécifiques pour les régions variables aux fins d'isoler des clones de c ADN en longueur complète Pour le c ADN des chaînes légères, on a supprimé l'amorce 5 ' (leader) non traduite jusqu'à la position -32 en utilisant l'exonucléase Bal-31 et un li'nker avec Hind III ajouté Pour l'extrémité 3 ', on a fait usage d'un site Sac I unique à 47 paires de base à l'amont du codon d'arrêt On a utilisé une paire d'oligonucléotides synthétiques Sac I-Hind III pour régénérer cette séquence et la position du site Hind I Ii immédiatement après le codon d'arrêt Pour l'extrémité 5 ' du c ADN des chaînes lourdes, on a utilisé le site Nco I unique -chevauchant le codon de départ ATG pour reconstruire une amorce (leader) non traduite de 29 paires de base, identiques à celle de la chaîne légère, en utilisant une paire d'oligonucléotides Hind III-Nco I A l'extrémité 3 ', on a converti le site Nae I unique à 12 paires de base en aval du codon d'arrêt en un

site Hind III en utilisant des linkers.

EXEMPLE 1 B -

Construction des vecteurs.

/ On a excisé le promoteur de B-actine humaine de p HBA Pr-3-neo lqui correspond à p HSA Pr-1-neo (Gunning et al, P.N A S, 1987, 84, 483-35), sauf que le signal de polyadénylation/terminaison de SV 40 a été remplacé par les signaux de B-actine humaine respectifsl sous la forme d'un fragment Pvu II-Hind III de 2860 paires de base dans lequel le site Pvu II a été ensuite converti en un site Bg III au moyen de linkers Pour isoler de p HBA Pr-3-neo les signaux de polyadénylation et de terminaison de la B-actine humaine, on a converti un site Sph I & 1,4 kilobase en aval du site Hind III unique en un site Bam HI avec des linkers On a construit comme décrit ci-après le vecteur dhfr fondamental appelé p 104 On a converti le site Sph I à la position -128 dans le promoteur de SV 40 dans p SV 2 dhfr (Subramani et al, Mol Cell Biol, 1981, 1, 854-864) en un site Sal I pour

éliminer tous les éléments accélérateurs du promoteur.

Ensuite, on a sous-cloné l'unité d'expression dhfr affaiblie, sous la forme d'un fragment Sal I-Bam HI, dans les sites homologues dans p SV Od (Mellon et al, Cell, 1981, 27,

279-288).

Pour construire p LD 9, on a soumis le vecteur p 104 à la digestion avec Bam HI, à l'action de la phosphatase et à la ligation avec trois autres fragments consistant en le promoteur de B-actine Bgl II-Hind III, le c ADN de cha Ine légère de Campath-l H Hind III et les signaux poly A/terminaison de B-actine Hind III-Bam HI Pour construire p NH 316, on a soumis le produit construit pd BPV-MM Tneo (Law et al, Mol Cell Biol, 1983, 3, 2110-2115) à la digestion avec Bam HI et à l'action de la phosphatase et on a isolé le fragment contenant le gène néomycine après une séparation sur un gel d'agarose On a assemblé ce fragment par ligation aux deux fragments de B-actine et au c ADN de chaîne lourde de Campath-l H Les produits construits p LD 9 et p NH 316 sont

représentés à la Fig 1.

EXEMPLE 1 C

Expression de Campath-l H dans des cellules CHO.

On a cultivé la lignée cellulaire CHO dhfr' J DUK-Bll (Urlaub et al, P N A S, 1980, 77, 4216-4220) dans du MEM d'Iscove additionné de 10 % de sérum foetal de veau, de 4 Mg/ml d'hypoxanthine et de 4 gg/ml de thymidine On a coprécipité 10 g de p LD 9 et de p NH 316 sur les cellules par le procédé au phosphate de calcium (Gorman et al, DNA Cloning, 1985, vol II, 143-190, Academic Press, N Y) et on a sélectionné celles-ci d'après le double phénotype de dhfr+/résistance neo en recourant au milieu ci-dessus, mais en utilisant 10 % de sérum dialysé, en omettant l'hypoxanthine/thymidine et en ajoutant du G 418 (Gibco) à raison de 500 gg/ml Pour certaines expériences, on a ajouté du MTX directement au premier tour de sélection pour les transformants dhfr+ On a rassemblé plusieurs centaines de colonies résistantes et on y a recherché la production de l'anticorps Campath-l H dans le milieu de culture La production moyenne a été de 0,5 gg/ml pour les transformants

non amplifiés du premier tour.

Ensuite, on a cultivé la population de cellules rassemblées en présence de MTX 10-7 M et après deux semaines, on a rassemblé à nouveau les colonies résistantes sur lesquelles on a titré la production de Campath- l H Il y a eu une augmentation considérable de production jusqu'à fois (Tableau I) On a cloné ces cellules par dilution, on les a triées en fonction de la production de Campath-l H et on a isolé deux lignées hautement productives dites A 37 et 3 D 9 (Tableau I) On les amplifiées toutes deux davantage en présence de MTX 10-M, puis on les a clonées par dilution et triées comme ci-dessus L'augmentation d'expression à ce deuxième stade d'amplification final n'a pas été aussi importante que celle observ 4 e antérieurement, mais après remise an culture jusqu'à confluence, puis pendant encore 4 jours, les lignées cellulaires A 39 et 3 D 11 ont été capables de produire jusqu'à 200 pg/ml de Campath-l H. Taux d'expression de Campath-l H avec amplification bas à pas Produit construite Stade de sélection Campath-l H accumulé (Ag/ml) p LD 9 + p NH 316 pool de base dhfr+/neo 0,5 pool amplifié par 18-40

MTX 10-M

Lignées cellulaires 40 A 37 et 3 D 9 pool amplifié par 60-90

MTX 10-'M

Lignée cellulaire A 39 100 Lignée cellulaire 3 D 11 150-200 A cet effet, on a laissé les cellules atteindre la confluence dans des flacons pour culture de tissu T-175, puis on les a alimentées de 50 ml de milieu frais pour culture de tissu et on les a fait croître pendant encore 4 jours On a mesuré suivant la technique ELISA l'anticorps

Campath-l H accumulé dans le milieu au cours de cette durée.

Les nombres totaux de cellules, au jour du dosage ont été habituellement de 2,5 x 107 La'production par la lignée cellulaire 3 D 11 traduit une productivité de 100 pg/106

cellules et par jour.

On a utilisé aussi les vecteurs de cotransfection p LD 9 et p NH 316 pour évaluer une stratégie d'amplification constituant une variante à celle décrite ci-dessus On a cotransfecté les cellules CHO dhfr de la façon habituelle et deux jours plus tard, on les a réparties directement dans une série de flacons contenant du G 418 (pour la sélection par la néomycine) et des concentrations croissantes en MTX s'échelonnant de 3 x 10-M à 10-7 M Après deux semaines de cette sélection, on a établi par comptage le nombre de colonies résultantes et on a rassemblé celle-ci pour chaque flacon Après stabilisation des populations cellulaires, on les a dosées pour connattre les titres en anticorps Campath-l H; les résultats sont donnés au Tableau II A mesure de l'augmentation de la concentration en MTX, on a observé une diminution marquée du nombre de colonies dhfr* survivantes, mais celles-ci exprimaient proportionnellement plus de Campath-l H Par conséquent, par une sélection directe en un stade avec de fortes concentrations de MTX, il est possible d'isoler des populations de cellules qui offrent une augmentation de la production d'anticorps s'élevant jusqu'à 60 fois par comparaison avec les populations cellulaires sélectionnées pour des taux de dhfr

de base.

TABLEAU II

Taux d'expression de Campath-1 H avec sélection directe.

Sélection (MTX M) Colonies dhfr' Campath-l H accumulé (pg/ml) Pas de MTX 500 0,5 3 x 10-9 40 2

-8 5 7

3 x 10-8 5 30

10-7 _

On a rassemblé les colonies de chaque stade de sélection par le MTX et on a procédé au dosage comme décrit dans la légende du Tableau I. On a répété cette technique de sélection après une autre cotransfection de cellules et, en l'occurrence, on a sélectionné la population complète dans du milieu contenant du G 418 et du MTX 3 x 10-8 M Ceci a donné une quantité plus importante de colonies résistantes qu'on a ensuite rassemblées et amplifiées à nouveau deux fois en prenant des concentrations en MTX de 6 x 10-7 M, puis de 3 x 10 _ 6 M A ce stade, on a cloné les cellules par dilution et on les a triées en fonction des taux de Campath-l H Les deux lignées cellulaires les plus productives isolées ont été capables de produire des taux d'anticorps s'élevant jusqu'à 100 à 150 g/ml et ont été appelées lignées 4 F 11

et 5 E 10.

Les vitesses de croissance de ces lignées cellulaires et des lignées A 39/3 D 11 décrites ci-dessus étaient considérablement plus faibles que celles des cellules CHO dhfr non transformées d'origine Ceci est une particularité commune de ces cellules lorsqu'elles ont été manipulées pour exprimer de hautes quantités d'un produit de gène Les rendements des lignées cellulaires 5 E 10 et 4 F 11 se sont révélés très variables dans le temps et la dernière lignée s'est révélée n'avoir qu'une durée de vie de passage limitée s'étendant sur environ 3 semaines avant d'entrer en crise et de mourir Cette instabilité n'a nullement été évidente dans les autres lignées cellulaires, bien qu'en général, les lignées isolées par la seconde technique d'amplification, y compris 5 E 10, aient habituellement été plus aléatoires à cultiver Parmi toutes ces lignées, la lignée 3 D 11 a associé une croissance et une stabilité bonnes avec de hauts rendements en Campath-IH Pour assurer la propagation de ces caractéristiques, on a cloné par dilution la lignée cellulaire 3 DI 1 une fois de plus pour obtenir la lignée 3 D 11 * et celle-ci a de même donné des productions de

Campath-l H s'élevant jusqu'à 200 Mg/ml.

EXEMPLE 2

Croissance et production avec des cellules Cl H 3 D 11 * 44 dans

un milieu exempt de sérum.

On a fait croître des cellules Cl H 3 D 11 * en monocouche dans du milieu d'Iscoves additionné de 10 % de sérum foetal de veau, d'acides aminés,non-essentiels, de Méthotrexate 10-M et d'antibiotiques jusqu'à environ 90 % de confluence On a dégagé les cellules de la matière plastique avec le système trypsine/versène, on les a lavées dans du milieu d'Iscoves sans supplément et on les a centrifugées et remises en suspension à 5 x 104/ml dans du milieu WCM 4 détaillé au Tableau ci- après additionné de 0,25 % de peptone, de 0,1 % de polyéthylène glycol (PEG) 10 000 et de 0,5 % de sérum foetal de veau (FBS) sans méthotrexate (MTX) On a introduit dans trois flacons de 25 cm 2 10 ml de la suspension de cellules additionnée d'hypoxanthine (H), de thymidine (T) ou de HT On a incubé les flacons à 36,50 C

dans un incubateur à 5 % de CO 2.

Après 6 jours, on a rassemblé les contenus des flacons et on les ajoutés à un volume égal de milieu additionné de Méthotrexate sans peptone ni PEG, puis on a

transféré le tout dans un flacon de 75 cm 2.

On a utilisé ces cellules pour ensemencer un appareil rotatif Techne de 500 ml avant une incubation à 36,5 SC avec rotation à 40 tours par minute Les cellules ont continué de croître sans sérum pendant plus de cinq mois et bien qu'on ait observé que les cellules nécessitaient une période d'adaptation, la vitesse de croissance et la viabilité se sont améliorées de façon constante Le calcul a indiqué un temps de doublement de la population de 73,1 heures pendant environ 7 semaines, qui est tombé & 47,4 heures au cours des 20 jours suivants et s'est stabilisé ensuite La sécrétion d'anticorps est restée élevée avec des valeurs de plus de 60 pg/ml L'intensité des bandes dans une analyse par transfert Northern a permis de déterminer que le nombre des copies du gène n'a pas diminué

dans ces cellules.

Dans des fermenteurs, ces cellules ont produit de l'anticorps à raison de plus de 70 pg/ml et ont atteint avec régularité des taux de 100 gg/ml et davantage Ces cellules

sont dites Cl H 3 D 1 * 44.

Milieu WCM 4 Iscoves DMEM lIscove N et Melcher ( 1978), J Exp Med 1, 47, 923 l modifiés pour exclure l'albumine de sérum de boeuf, la

transférine et la lécithine.

+ 5 ml/litre + 50 mg/litre-, + 50 mg/litre + 50 mg/litre + 50 mg/litre + 50 mg/litre + 25 mg/litre +e 0,062 mg/litre + 1,36 mg/litre + 0,2 mg/litre + 0,088 mg/litre

+ 1,M

+ 1 mg/litre + 1 mg/litre + 0,0025 mg/litre + 5 mg/litre + 50 000 UI/litre + 20 000 UI/litre + 0,16 mg/litre L glutamine 200 m M L proline L thréonine L méthionine L cystéine L tyrosine acide ascorbique vitamine B 6 vitamine B 12 acide lipoïque linoléate de méthyle méthotréxate Fe SO 4 Zn SO 4

CU 504

insuline recombinante (Nucelline) polymyxine néomycine putrescine 2 H Cl On a transféré des cellules C 1 H 3 D 11 * 44 du stade précédent qui avait eu une croissance deplus de 2 mois en l'absence de sérum dans un fermenteur S Gi de 1 litre équipé d'un agitateur en acier inoxydable tournant à 70 tours par minute On a réglé la température à 37 C, d O 2 à 10 % et le p H à 7-7,2 On a ensemencé le fermenteur au jour O avec 0,22 x 106 cellules/ml dans du milieu WCM 4 contenant 0,1 % de polyéthylène glycol (PEG) 10 000 et 0 < 25 % de peptone de soya, et on y a introduit du 02 par le dessus On a soumis les cellules à des passages en routine avec du milieu frais avec une allure de scission se situant typiquement entre 1

à 2 et 1 à 4.

Au jour 33, on a remplacé l'admission de gaz par le dessus par l'injection profonde, dont il est à prévoir qu'elle induise davantage de dégâts physiques dans les cellules. A partir du jour 50, on a utilisé le milieu WCM 5 (voir tableau ci-après) conjointement avec de la peptone et

du PEG au lieu du milieu WCM 4.

Au jour 53, on a remplacé le PEG par 0,1 % de Pluronic F 68 La croissance résultante et les taux d'anticorps atteints ont été supérieurs à 100 plg/ml dans les fermenteurs. Milieu WCM 5 Iscoves DMEM modifié pour exclure l'albumine de sérum de

boeuf, la transférine et la lécithine.

ml/litre mg/litre

mg/litre-

mg/litre mg/litre mg/litre mg/litre 0,062 mg/litre 1,36 mg/litre 2 mg/litre 1 mg/litre 0,0025 mg/litre 50.000 UI/litre 20.000 UI/litre 3 gl/litre 0,16 mg/litre mg/litre glutamine 200 m M L L proline L thréonine L méthionine L cystéine L tyrosine acide L ascorbique vitamine B 6 vitamine B 12 citrate ferrique sulfate de zinc sulfate de cuivre polymyxine néomycine éthanolamine putrescine insuline recombinante (Nucelline) Tous les composants des milieux WCM 4 et WCM 5 sont

disponibles sur le marché.

f

EXEMPLE 3 -

Purification du Campath-l H (G Dev-95).

Matériels et procédés.

Le procédé de purification qui a été appliqué est basé sur la chromatographie dans trois colonnes Les gels utilisés consistaient en 7, 85 ml de protéine A Sépharose 4 Fast Flow, Pharmacia, n de code 170974-04 ( 10 cm x 1 cm); en 7,85 ml d'échangeur de cations S Sépharose Fast Flow, Pharmacia, n de code 17-0511-01 ( 10,cm x 1 cm); et en ml de milieu d'exclusion dimensionnelle Superdex 200, Pharmacia, n de code 17-1046-01 ( 60 cm x 1,6 cm) Chaque + + + + + + + + +? + + + + + + + colonne était protégée par un filtre stérilisant Gelman Acro

de 0,2 gm.

Préparation de l'équipement et des solutions.

On a lavé la vaisselle des colonnes de protéine A soigneusement avec du Na OH i N et on l'a mise à reposer dans

cette solution pendant 24 heures pour éliminer l'endotoxine.

Ensuite, on a tassé le gel dans la colonne Pharmacia C 10/20 et on l'a désinfecté avec 2 % de gluconate d'hibitane dans de l'éthanol à 20 % Du fait que suivant l'avis du fabricant, les gels S Sépharose et Superdex 200 sont tous deux stables dans le Na OH i N pendant de longues durées, on a tassé ces gels dans leurs colonnes (une colonne Pharmacia C 10/20 et une colonne Pharmacia C 16/100, respectivement) et on les a lavés au Na OH i N, puis on les a mis à reposer dans cette solution pendant 24 heures pour éliminer l'endotoxine et désinfecter les colonnes On a préparé les solutions pour le fonctionnement et la désinfection des colonnes avec de l'eau distillée apyrogène rendue stérile par filtration sur des filtres Millipore Millipack 100 de 0,2 gm On a dosé l'endotoxine par LAL dans toutes les solutions et on a

utilisé uniquement celles donnant lieu à de faibles valeurs.

Fonctionnement des colonnes.

Gel de protéine A Sépharose 4 Fast Flow.

On a recueilli le milieu pour culture de tissu de l'exemple 1 contenant l'anticorps Campath-l H et on l'a filtré dans une enceinte Sealkleen à travers un filtre de 0,2 gm stérile PALL posidyne S Lk 7002 NFZP Avec de l'eau distillée, on a éliminé le gluconate d'hibitane à 2 % dans l'éthanol à 20 % ayant servi à désinfecter la colonne de protéine A et on amené le système à l'équilibre avec de la solution physiologique salée tamponnée au tris de p H 7,5 (T.B S) Ensuite, on a chargé la colonne de protéine A avec 1,75 litre de Campath-l H brut ( 71, 4 mg) à la vitesse de

300 cm/heure ( 235 ml/heure) à une température de 20 C 5 C.

On a entraîné la matière non fixée hors de la colonne par lavage avec 5 volumes de lit ( 39,25 ml) de T B S de p H 7,5 à la même vitesse d'écoulement On a élué le gel de protéine A à 300 cm/heure avec de l'acide citrique 0,1 M de p H 3,0 pendant < 24 heures à la température ambiante, On a surveillé le profil d'élution à A 280 nm avec un moniteur Pharmacia UV 1 à trajet unique et on a isolé le pic de la protéine Le volume d'élution du pic a été de 18,9 ml et on a prélevé 1 ml de ce volume pour y doser le Campath-l H par

ELISA, comme décrit ci-après.

Gel de S Sépharose Fast Flow.

En utilisant de l'Hepes 20 m M de p H 7,5, on a éliminé le Na OH i N par lavage de la colonne de S Sépharose jusqu'à ce que les liqueurs de lavage sortant de la colonne aient un p H de 7,5 On a introduit les 17, 9 ml restants de l'éluat de la colonne de protéine A dans la colonne à la vitesse de 300 cm/heure ( 235 ml/heure) On a éliminé la matière non fixée de la colonne par lavage avec 7 volumes de lit ( 55 ml) d'Hepes 20 m M de p H 7,5 à la même vitesse d'écoulement On a élué le gel de S Sépharose pas à pas avec du Na Cl O,2 M dans de l'Hepes 20 m M de p H 7,5 à la vitesse de 300 cm/heure On a collecté le pic d'élution en surveillant la trace avec un moniteur Pharmacia U Vl à A 2 '80 nm (longueur du trajet 2 mm, 0,5 unité d'absorption en fin d'échelle) On a commencé de collecter l'éluat à environ 20 % de déflexion et on a poursuivi l'opération jusqu'à ce que la trace ait baissé jusqu'à 70 % de déflexion Le volume d'élution était de 10 ml et on en a prélevé 1 ml pour le

dosage du Campath-l H par ELISA comme décrit ci-après.

Gel de Superdex 200 En utilisant de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate de p H 7,2, on a éliminé le Na OH 1 N de la colonne de Superdex par lavage jusqu'à ce que les

liqueurs de lavage sortant de la colonne aient un p H de 7,2.

On a chargé les 9 ml restants de l'éluat de S Sépharose sur la colonne de Superdex avec une seringue en passant par un filtre Millipore Millex GV et on a lavé le filtre soigneusement avec 2 ml de solution physiologique salée tamponnée au phosphate de p H 7,2 à 30 cm par heure ( 60 ml/heure) On a surveillé les pics d'exclusion dimensionnelle avec un moniteur Pharmacia UVI à A 280 nm A mesure de l'élution des pics, on a prélevé des fractions pour séparer le pic de l'agrégat du pic du monomère La fraction contenant le pic du monomère avait un volume de 17,6 ml -

Dosage par immunosorption avec enzyme liée (ELISA).

Cette technique est un immunodosage avec enzyme en sandwich standard (étalon) o de l'Ig G anti-humaine, isolée d'antisérum de chèvre purifié par immunité, est fixée sur la phase solide comme couche de capture La détection de l'antigène piégé (Ig Campath-l H) est réalisée avec de l'Ig G anti-humaine de chèvre marquée à la peroxydase Le dosage est séquentiel, les échantillons de Campath-l H étant dilués dans un tampon qui contient de la caséine et de la gélatine hydrolysée On utilise des durées d'incubation de 1 heure et de 30 minutes à la température de 37 C On ajoute de fla 3 ',3 ',5,5 '-tétraméthylbenzidine (TMB) chromogène additionnée de peroxyde d'hydrogène comme substrat pour révéler toute peroxydase non liée On peut déterminer les densités optiques à 450 nm et lire les concentrations en Campath-l H sur une courbe d'étalonnage établie d'après des concentrations connues qui s'échelonnent de 3,9 ng à 250 ng

de Campath-l H purifié.

Essai du Campath-l H purifié.

On a estimé la teneur en protéine du pic de monomère à A 280 nm en prenant un coefficient d'extinction (E 1 X 1 =) de 1,35 (facultativement 1,32) et on a déterminé la teneur en agrégat d'un échantillon sur une colonne d'exclusion dimensionnelle HPLC On a stérilisé la matière restante par filtration à travers un filtre Millipore Millex GV (pores de 0,2 pm) et on l'a répartie dans 29 tubes de Sarstedt stériles en aliquotes de 0,5 ml On a conservé la plupart des tubes d'échantillon à 4 WC, mais on a conservé 6 tubes à -70 WC On a utilisé les échantillons conservés à 4 C pour les dosages tels que détaillés dans les exemples suivants.

Résultats et discussions.

Les résultats de l'ELISA sur Campath sont

présentés au Tableau ci-dessous.

Campath-l H. Echantillon Titre par ELISA Volume (ml) de la masse mg de C 1 H au total dans la masse Poids de

C 1 H ap-

pliqué sur la colonne suivante Collecte/ colonne % ,8 gg/ml

1750 71,4

Eluat de protéine A Eluat de S Sépharose Monomère de Superdex 4,2 mg/ml 18,9 6,4 mg/ml 10,0 2,5 mg/ml 17,6 La collecte totale pour le système des trois colonnes, sur la base de la collecte à chaque colonne, est

de 61,6 %.

Teneur en endotoxine par test LAL.

Echantillon Brut Pic du monomère de Superdex _ UE/ml 1,25

< 0,625

EXEMPLE 4 -

On a exécuté une électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec SDS classique sur un lit plat avec un gradient de 8 à 18 % dans de l'Excelgel Pharmacia Les

résultats sont présentés à la Fig 2.

Brut 71,4 79,4 64,0 ,2 57,6 44,0 111,2 ,0 76,4

EXEMPLE 5 -

Caractérisation du Campath-l H par chromatographie liquide

à haute performance avec inversion de phase.

On a soumis un échantillon de 50 Al du produit de l'exemple 3 (dit G-Dev-95) dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate (PBS) d'une concentration de 2,4 mg/ml à la chromatographie liquide à haute performance avec inversion de phase (RP-HPLC) dans les conditions suivantes: Colonne: PLRP-S 100 ooo O A (dimension des pores); 8 gm (dimension des particules) 15 cm x 0,46 cm de Polymer

Laboratories Ltd UK.

Phase mobile utilisée: système acide formique/eau/acéto-

nitrile dans lequel: Composant A Acide formique: eau ( 5:3) Composant B CH 3 CN dans le gradient suivant:

% A 80 80 65 O O 80 80

% B 20 20 35 100 100 20 20

Temps (min) O 5 38 41 50 51 65 On a fait fonctionner la colonne à la température ambiante au débit de 1 ml/minute avec détection dans l'UV sur un moniteur D LDC Spectro à longueur d'onde variable, à une longueur d'onde de 280 nmt avec une sensibilité de

0,1 unité d'absorption en fin d'échelle.

Résultat. Comme le montre la Fig 3, la chromatographie du Campath-l H avec le système ci-dessus donne un pic aigu unique Les pics élués après 30 minutes sont dus à la phase mobile

EXEMPLE 6 -.

Caractérisation du Campath-l H réduit etcarboxyméthylé par chromatographie liquide à haute performance avec inversion

de phase (RP-HPLC).

2668164 -

6 a Réduction et carboxvméthylation du Campath-lig.

Le Campath-l H peut être réduit en ses chaînes lourdes et légères constitutives suivant les techniques habituelles de réduction et de carboxymnéthylation, qui consistent à rédu-ire d'abord les liaisons disulfure, puis à les empêcher de se reconstituer en alcoylant les radicaux

thiol libres.

A 1 ml -de Campath-l H G Dev-95 de l'exemple 3, dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate, à une concentration de 2,4 mg/ml, on a ajouté 1 ml de chlorure de guanidinium 8 M dans du tampon au Tris H Cl 0,5 M de p H 9,0 et 120 il de dithiothréitol à 7 % dans le même tampon On a incubé le mélange à 37 C pendant

2 heures.

Après l'incubation, on a ajouté 120 g 1 d'acide iodoacétique à 9 % dans du tampon au Tris H Cl 0,5 M et on a

mis'le mélange à reposer à l'obscurité pendant 1 heure.

Le produit réduit et carboxyméthylé résultant est

appelé Campath-l H RCM.

6 b Caractérisation du Campath-l H RCM par RP HPLC.

On a soumis 30 il du produit de l'exemple 6 a à la chromatographie liquide à haute performance avec inversion

de phase dans les conditions détaillées ci-après.

Colonne PLRP-S 10 ooo 00 A (dimension des pores); 8 gm (dimension des particules) 15 x 0,46 x cm,, de Polymer Laboratories

Ltd UK.

Phase mobile avec un gradient d'eau, d'acide formique et d'acétonitrile comme indiqué au Tableau çi-dessous: A = acide formique B = eau C = acétonitrile

% A 50 50 29,4 O O 50 O

% B 35 35 20,6 O O 35 35

% C 15 15 50 100 100 15 15

Temps (min) O 5 70 72 82 82,1 95 On a fait fonctionner la colonne au débit de 1 ml/minute à la température ambiante, en suivant

l'absorbance dans l'UV à la longueur d'onde de 280 nm.

* Résultat. 1 Comme le montre la Fig 4, le produit résultant se résout en deux pics qui correspondent aux chaînes lourdes

et légères.

EXEMPLE 7 -

Caractérisation du Campath-l H par chromatographie d'exclusion dimensionnelle à haute performance pour la détermination des composants de haut poids moléculaire du Campath-l H. On a soumis un échantillon de 50 Al du produit de l'exemple 3 (G-Dev-95) dans de la solution physiologique tamponnée au phosphate (à une concentration de 2, 4 mg/ml) à la chromatographie d'exclusion dimensionnelle à haute performance dans les conditions suivantes: z Colonne gel TSK G 3000 S Wxl, 30 cm x 0,78 cm de diamètre intérieur Phase mobile Na 2 HPO 4 0, 05 M Na 2 SO 4 0,1 M ajusté avec H 3 PO 4

à p H 6,8.

Débit 0,75 ml/minute.

On a fait fonctionner la colonne pendant 24 minutes à la température ambiante en surveillant

l'absorbance dans l'UV à la longueur d'onde de 280 nm.

On a analysé de la même façon un deuxième

2668164 -

échantillon de 50 pl de Campath-l H réduit conformément à

l'exemple 6 a).

Résultats. Les résultats à la Fig 5 montrent un pic unique net indiquant deux taux d'agrégat Des taux entre 0,5 et 2,0 % sont généralement atteints Les résultats à la Fig 6 montrent deux pics principaux correspondants auxchaînes lourdes et légères dans le rapport prévu Les pics au volume de perméation totale (environ 15 à 18 minutes) sont dus aux

réactifs.

Dosage biologique du Campath-l H purifié fonctionnel.

Dosage par lyse du complément pour Campath-l H. Le dosage par lyse du complément est une mesure de la fonction anticorps exprimée en activité spécifique, déterminée par l'aptitude d'une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dx 52 de concentration connue à se fixer sur un nombre déterminé au préalable de cellules et à provoquer

la lyse des cellules.

Le dosage est exécuté sur du Campath-l H avec des cellules Karpas 422 létablies à partir d'une lignée de cellules B d'un lymphome nonhodgkinien; Dyer et al,, ( 1990) Blood, 75 704-714 l exprimant l'antigène de Campath à la surface des cellules Par incubation pendant 2 heures à 370 C dans un incubateur à CO 2 en présence de 600 g Ci de 51 Cr (chromate de sodium), on a chargé 1,2 x 107 cellules d'un

marqueur radioactif.

On a ajouté 5,3 ml des cellules chargées dans un milieu (volume total de 23,5 ml) à 12,5 ml de sérum humain normal et on a introduit à la pipette 150 jl du mélange dans

les puits d'une plaque de microtitrage.

On a mélangé des échantillons de 50,l de l'éluat final des trois tours de purification avec les cellules et on a procédé à l'incubation pendant 30 minutes à 40 C, puis pendant 90 minutes à 370 C On a centrifugé la culture à 2000 tours par minute pendant 5 minutes,et avec un compteur gamma, on a compté la radioactivité dans 100 Ml du surnagent des cellules D'après une courbe étalon d'une préparation de référence ( 1000 unités/ml), on a calculé l'activité de

lyse du complément en kilo-unités/ml.

Les résultats sont détaillés au Tableau III.

On a estimé la concentration du Campath-l H dans les échantillons de 50 pl de l'éluat final en prenant des échantillons dans de la solution physiologique salée tamponnée au phosphate de p H 7,2 lus sur un spectrophotomètre à 280 nm Les résultats sont exprimés au

Tableau III sous la forme densité optique en mg/ml.

D'après ces données, l'activité spécifique en kilo-unités/mg est donnée par la relation: KU/ml

DO

TABLEAU III

Echantillon A B c Lyse du complément kilo-unités par ml 11,2 14,8 13,7

Concen-

tration de la protéine mg/ml 11,1 14,2 13,6 Activité spécifique kilounités 1,0 1,0 1,0 z Les résultats montrent que les préparations

purifiées de Campath-l H sont-fonctionnelles.

f

Claims (19)

R E V E N D I C A T I O NS

1. Préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 qui présente à la chromatographie d'exclusion dimensionnelle un pic unique dans des conditions non réductrices et deux pics majeurs dans des conditions réductrices.

2. Préparation purifiée suivant la revendication 1, qui-présente à l'électrophorèse sur gel de polyacrylamide avec SDS classique une bande principale pour un échantillon non réduit et deux bandes principales pour

un échantillon réduit.

3. Préparation purifiée suivant la revendication 1 ou 2, qui présente à la chromatographie liquide à haute performance avec inversion de phase un pic unique dans des conditions non réductrices et deux pics

principaux dans des conditions réductrices.

4. Préparation purifiée suivant l'une Quelconque

des revendications 1 à 3, caractérisée en ce qu'elle a une

activité spécifique supérieure à 0,8 kilo-unité/mg.

5. Préparation purifiée suivant l'une quelconque

des revendications 1 à 4, caractérisée en ce qu'elle est en

substance exempte de contaminants des cellules hôtes et/ou d'agrégats.

6 Préparation purifiée suivant l'une quelconque

des revendications 1 à 5, caractérisée en ce que l'anticorps

est un anticorps modifié.

7. Préparation purifiée suivant la revendication 6, caractérisée en ce que l'anticorps est un

anticorps CDR-greffé.

8. Procédé de purification d'un anticorps anti-C Dw 52, qui comprend l'application d'une solution aqueuse de l'anticorps sur: a) une colonne de protéine A de façon à absorber l'anticorps sur la colonne, et l'élution de l'anticorps avec une solution acide; b) l'application de l'éluat acide sur une colonne échangeuse d'ions de particules chargées de façon & absorber l'anticorps, puis l'élution de l'anticorps avec une solution aqueuse d'ions de charge opposée; c) l'application de l'éluat aqueux sur une colonne d'exclusion dimensionnelle de particules poreuses de façon à retenir les molécules qui ne sont pas l'anticorps dans les particules poreuses et obtenir l'anticorps recherché dans les - fractions sélectionnées produites par la colonne.

9 Procédé suivant la revendication 8, caractérisé en ce que la colonne de protéine A est éluée à

un p H acide.

10. Procédé suivant la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que la colonne de protéine A est éluée

avec de l'acide citrique.

11. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications 8 à 10, caractérisé en ce que la colonne de

protéine A est une colonne de protéine A Sépharose.

12. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications 8 à 11, caractérisé en ce que la colonne

échangeuse d'ions est une colonne échangeuse de cations.

13. Procédé suivant l'une quelconque des

revendications 8 à 11, caractérisé en ce que la colonne

échangeuse d'ions est une colonne échangeuse d'anions.

14 Composition contenant une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 suivant l'une quelconque

des revendications 1 à 7 et un diluant ou excipient

physiologiquement acceptable.

15. Préparation purifiée d'un anticorps

anti-C Dw 52 suivant l'une quelconque des revendications 1,

à 7 à utiliser en thérapeutique.

16. Utilisation d'une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 suivant l'une quelconque des

revendications 1 à 7 dans la fabrication d'un médicament

propre à l'immunosuppression, pour le traitement des affections à médiation par les cellules-T, de la vasculite sévère, de l'arthrite rhumatoïde, du lupus systémique, de la sclérose en plaques, de la maladie greffe contre hôte, du psoriasis, du début du diabète juvénile, de la maladie de Sjogren, de l'affection thyroïdienne, de la myasthénie

grave, de la réjection de transplant ou de l'asthme.

17 Composition contenant une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 obtenu par un procédé

suivant l'une quelconque des revendications 8 à 13, et un

diluant ou excipient physiologiquement acceptable.

18. Préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 obtenu par un procédé suivant l'une quelconque

des revendications 8 à 13 à utiliser en thérapeutique.

19. Utilisation d'une préparation purifiée d'un anticorps anti-C Dw 52 obtenu par un procédé suivant l'une

quelconque des revendications 8 à 13 dans la production d'un

médicament propre à l'immunosuppression, pour le traitement des affections à médiation par les cellules-T, de la vasculite sévère, de l'arthrite rhumatoïde, du lupus systémique, de la sclérose en plaques, de la maladie greffe contre hôte, du psoriasis, du début du diabète juvénile, de la maladie de Sjogren, de l'affection thyroïdienne, de la myasthénie grave, de la réjection de transplant ou de l'asthme. J