HUT64601A - Method for producing purified immunoglobulin - Google Patents
Method for producing purified immunoglobulin Download PDFInfo
- Publication number
- HUT64601A HUT64601A HU9202000A HU200092A HUT64601A HU T64601 A HUT64601 A HU T64601A HU 9202000 A HU9202000 A HU 9202000A HU 200092 A HU200092 A HU 200092A HU T64601 A HUT64601 A HU T64601A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- antibody
- column
- formulation
- protein
- campath
- Prior art date
Links
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 13
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 title description 4
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 title description 4
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 47
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 36
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 32
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 31
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 claims description 12
- 238000009472 formulation Methods 0.000 claims description 12
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 8
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 claims description 7
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 claims description 7
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 5
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 claims description 4
- 208000015914 Non-Hodgkin lymphomas Diseases 0.000 claims description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 claims description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 claims description 2
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 claims description 2
- 239000003929 acidic solution Substances 0.000 claims description 2
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 claims description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 claims description 2
- 208000032839 leukemia Diseases 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 claims description 2
- 208000023275 Autoimmune disease Diseases 0.000 claims 1
- 206010062016 Immunosuppression Diseases 0.000 claims 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 claims 1
- 230000001506 immunosuppresive effect Effects 0.000 claims 1
- 238000007911 parenteral administration Methods 0.000 claims 1
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 62
- 229940112129 campath Drugs 0.000 description 37
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 32
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 21
- FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N L-methotrexate Chemical compound C=1N=C2N=C(N)N=C(N)C2=NC=1CN(C)C1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 FBOZXECLQNJBKD-ZDUSSCGKSA-N 0.000 description 20
- 229960000485 methotrexate Drugs 0.000 description 20
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 19
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 18
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 14
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 13
- WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N Acetonitrile Chemical compound CC#N WEVYAHXRMPXWCK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 12
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 11
- 239000012071 phase Substances 0.000 description 11
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 11
- 239000012505 Superdex™ Substances 0.000 description 10
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 10
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 10
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 10
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 10
- FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N hypoxanthine Chemical compound O=C1NC=NC2=C1NC=N2 FDGQSTZJBFJUBT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 239000000463 material Substances 0.000 description 10
- BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N methanoic acid Natural products OC=O BDAGIHXWWSANSR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 10
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 10
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 10
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 9
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 9
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 8
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 8
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 8
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 8
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 7
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 7
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 7
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 7
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 7
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 6
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 6
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N Hypoxanthine nucleoside Natural products OC1C(O)C(CO)OC1N1C(NC=NC2=O)=C2N=C1 UGQMRVRMYYASKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 5
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 5
- 235000019253 formic acid Nutrition 0.000 description 5
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 5
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 5
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 5
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 5
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 5
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 5
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 5
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 4-(3-methoxyphenyl)aniline Chemical compound COC1=CC=CC(C=2C=CC(N)=CC=2)=C1 OSWFIVFLDKOXQC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 4
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 4
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 4
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 4
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 102000005396 glutamine synthetase Human genes 0.000 description 4
- 108020002326 glutamine synthetase Proteins 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 4
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 3
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 3
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 3
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 3
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 3
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 3
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 3
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 3
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 3
- 238000011109 contamination Methods 0.000 description 3
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 3
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 3
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 3
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 3
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 3
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 3
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 3
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 3
- 238000004659 sterilization and disinfection Methods 0.000 description 3
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 3
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 1,2-Divinylbenzene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1C=C MYRTYDVEIRVNKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 1-palmitoyl-2-arachidonoyl-sn-glycero-3-phosphocholine Chemical compound CCCCCCCCCCCCCCCC(=O)OC[C@H](COP([O-])(=O)OCC[N+](C)(C)C)OC(=O)CCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCC IIZPXYDJLKNOIY-JXPKJXOSSA-N 0.000 description 2
- HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 2-Aminoethan-1-ol Chemical compound NCCO HZAXFHJVJLSVMW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102100022900 Actin, cytoplasmic 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010085238 Actins Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 2
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 108020004635 Complementary DNA Proteins 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011993 High Performance Size Exclusion Chromatography Methods 0.000 description 2
- 101000756632 Homo sapiens Actin, cytoplasmic 1 Proteins 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N Hydrogen peroxide Chemical compound OO MHAJPDPJQMAIIY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 2
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 2
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N L-tyrosine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-QMMMGPOBSA-N 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 108090000295 Nucellin Proteins 0.000 description 2
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 2
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 108010040201 Polymyxins Proteins 0.000 description 2
- ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N Proline Natural products OC(=O)C1CCCN1 ONIBWKKTOPOVIA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N Threonine Natural products CC(O)C(N)C(O)=O AYFVYJQAPQTCCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004473 Threonine Substances 0.000 description 2
- DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N Trifluoroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(F)(F)F DTQVDTLACAAQTR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 208000018756 Variant Creutzfeldt-Jakob disease Diseases 0.000 description 2
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 description 2
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 230000002238 attenuated effect Effects 0.000 description 2
- 208000005881 bovine spongiform encephalopathy Diseases 0.000 description 2
- 230000001413 cellular effect Effects 0.000 description 2
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 2
- 238000012761 co-transfection Methods 0.000 description 2
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 description 2
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 2
- 239000000645 desinfectant Substances 0.000 description 2
- BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L disodium hydrogen phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].OP([O-])([O-])=O BNIILDVGGAEEIG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- 229910000397 disodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000019800 disodium phosphate Nutrition 0.000 description 2
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 2
- VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N dithiothreitol Chemical compound SC[C@@H](O)[C@H](O)CS VHJLVAABSRFDPM-QWWZWVQMSA-N 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 2
- 229940050410 gluconate Drugs 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 2
- 238000012781 high pressure - size exclusion chromatography Methods 0.000 description 2
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 2
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N iodoacetic acid Chemical compound OC(=O)CI JDNTWHVOXJZDSN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 2
- 150000002605 large molecules Chemical class 0.000 description 2
- 239000000787 lecithin Substances 0.000 description 2
- 229940067606 lecithin Drugs 0.000 description 2
- 235000010445 lecithin Nutrition 0.000 description 2
- 229920002521 macromolecule Polymers 0.000 description 2
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 2
- SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N methionine sulfoximine Chemical compound CS(=N)(=O)CCC(N)C(O)=O SXTAYKAGBXMACB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 2
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 2
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 2
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 230000001954 sterilising effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 2
- 239000003104 tissue culture media Substances 0.000 description 2
- 239000003656 tris buffered saline Substances 0.000 description 2
- OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N tyrosine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CC=C(O)C=C1 OUYCCCASQSFEME-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000013621 viresolve pro solution Substances 0.000 description 2
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 description 2
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 description 2
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 description 2
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 description 2
- DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N (2R)-6-amino-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2R,3S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[(2S,3S)-2-[[(2R)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[(2S)-2-[[2-[[(2S)-2-[[(2R)-2-[[2-[[2-[[2-[(2-amino-1-hydroxyethylidene)amino]-3-carboxy-1-hydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxypropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1,5-dihydroxy-5-iminopentylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxybutylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1,3-dihydroxypropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]-1-hydroxy-3-sulfanylpropylidene]amino]-1-hydroxyethylidene]amino]hexanoic acid Chemical compound C[C@@H]([C@@H](C(=N[C@@H](CS)C(=N[C@@H](C)C(=N[C@@H](CO)C(=NCC(=N[C@@H](CCC(=N)O)C(=NC(CS)C(=N[C@H]([C@H](C)O)C(=N[C@H](CS)C(=N[C@H](CO)C(=NCC(=N[C@H](CS)C(=NCC(=N[C@H](CCCCN)C(=O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)N=C([C@H](CS)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](CO)N=C([C@H](C)N=C(CN=C([C@H](CO)N=C([C@H](CS)N=C(CN=C(C(CS)N=C(C(CC(=O)O)N=C(CN)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O)O DIGQNXIGRZPYDK-WKSCXVIASA-N 0.000 description 1
- BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N (2r,3r,4r,5r)-2-[(1s,2s,3r,4s,6r)-4,6-diamino-3-[(2s,3r,4r,5s,6r)-3-amino-4,5-dihydroxy-6-[(1r)-1-hydroxyethyl]oxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-5-methyl-4-(methylamino)oxane-3,5-diol Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H]([C@@H](C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-DJWUNRQOSA-N 0.000 description 1
- 239000001149 (9Z,12Z)-octadeca-9,12-dienoate Substances 0.000 description 1
- WTTJVINHCBCLGX-UHFFFAOYSA-N (9trans,12cis)-methyl linoleate Natural products CCCCCC=CCC=CCCCCCCCC(=O)OC WTTJVINHCBCLGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LNJCGNRKWOHFFV-UHFFFAOYSA-N 3-(2-hydroxyethylsulfanyl)propanenitrile Chemical compound OCCSCCC#N LNJCGNRKWOHFFV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 4-[4-(dimethylamino)phenyl]-n,n-dimethylaniline Chemical compound C1=CC(N(C)C)=CC=C1C1=CC=C(N(C)C)C=C1 YRNWIFYIFSBPAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010002199 Anaphylactic shock Diseases 0.000 description 1
- RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M D-gluconate Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)C([O-])=O RGHNJXZEOKUKBD-SQOUGZDYSA-M 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004533 Endonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010042407 Endonucleases Proteins 0.000 description 1
- 108060002716 Exonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000009109 Fc receptors Human genes 0.000 description 1
- 108010087819 Fc receptors Proteins 0.000 description 1
- 101150074355 GS gene Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 108700028146 Genetic Enhancer Elements Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 1
- 102000018071 Immunoglobulin Fc Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010091135 Immunoglobulin Fc Fragments Proteins 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000699673 Mesocricetus auratus Species 0.000 description 1
- 102000003792 Metallothionein Human genes 0.000 description 1
- 108090000157 Metallothionein Proteins 0.000 description 1
- PKIXXJPMNDDDOS-UHFFFAOYSA-N Methyl linoleate Natural products CCCCC=CCCC=CCCCCCCCC(=O)OC PKIXXJPMNDDDOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010028289 Muscle atrophy Diseases 0.000 description 1
- 108010062010 N-Acetylmuramoyl-L-alanine Amidase Proteins 0.000 description 1
- 239000007832 Na2SO4 Substances 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N Orthosilicate Chemical compound [O-][Si]([O-])([O-])[O-] BPQQTUXANYXVAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000045595 Phosphoprotein Phosphatases Human genes 0.000 description 1
- 108700019535 Phosphoprotein Phosphatases Proteins 0.000 description 1
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 1
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 241000220317 Rosa Species 0.000 description 1
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 1
- 208000021386 Sjogren Syndrome Diseases 0.000 description 1
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 241000191967 Staphylococcus aureus Species 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 1
- 208000024799 Thyroid disease Diseases 0.000 description 1
- 101710120037 Toxin CcdB Proteins 0.000 description 1
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 1
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 1
- 206010052779 Transplant rejections Diseases 0.000 description 1
- 102000004142 Trypsin Human genes 0.000 description 1
- 108090000631 Trypsin Proteins 0.000 description 1
- 206010047115 Vasculitis Diseases 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 230000003213 activating effect Effects 0.000 description 1
- 230000006978 adaptation Effects 0.000 description 1
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 230000002152 alkylating effect Effects 0.000 description 1
- 230000029936 alkylation Effects 0.000 description 1
- 238000005804 alkylation reaction Methods 0.000 description 1
- 208000003455 anaphylaxis Diseases 0.000 description 1
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 1
- 239000012062 aqueous buffer Substances 0.000 description 1
- 208000006673 asthma Diseases 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 230000006696 biosynthetic metabolic pathway Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000008366 buffered solution Substances 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 1
- 239000006285 cell suspension Substances 0.000 description 1
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000004154 complement system Effects 0.000 description 1
- 239000002131 composite material Substances 0.000 description 1
- 238000007906 compression Methods 0.000 description 1
- 230000006835 compression Effects 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 1
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 206010012601 diabetes mellitus Diseases 0.000 description 1
- MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N diethylene glycol Chemical compound OCCOCCO MTHSVFCYNBDYFN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 1
- AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N dimethyl 2-(3-ethyl-3-methylpentyl)propanedioate Chemical compound CCC(C)(CC)CCC(C(=O)OC)C(=O)OC AIUDWMLXCFRVDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N ethane-1,2-diol;propane-1,2-diol Chemical compound OCCO.CC(O)CO HQPMKSGTIOYHJT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000013165 exonuclease Human genes 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000006260 foam Substances 0.000 description 1
- 239000012737 fresh medium Substances 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 239000011544 gradient gel Substances 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000000987 immune system Anatomy 0.000 description 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000003018 immunosuppressive agent Substances 0.000 description 1
- 229940125721 immunosuppressive agent Drugs 0.000 description 1
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000005764 inhibitory process Effects 0.000 description 1
- 238000011081 inoculation Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N iodoacetamide Chemical compound NC(=O)CI PGLTVOMIXTUURA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 1
- 239000010410 layer Substances 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 238000012454 limulus amebocyte lysate test Methods 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M lipoate Chemical compound [O-]C(=O)CCCCC1CCSS1 AGBQKNBQESQNJD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019136 lipoic acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 206010025135 lupus erythematosus Diseases 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 230000005012 migration Effects 0.000 description 1
- 238000013508 migration Methods 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 201000000585 muscular atrophy Diseases 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 210000001672 ovary Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000006174 pH buffer Substances 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920001993 poloxamer 188 Polymers 0.000 description 1
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 description 1
- OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L potassium sulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S([O-])(=O)=O OTYBMLCTZGSZBG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 229910052939 potassium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011151 potassium sulphates Nutrition 0.000 description 1
- 239000012460 protein solution Substances 0.000 description 1
- 230000001698 pyrogenic effect Effects 0.000 description 1
- 238000003908 quality control method Methods 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 239000004627 regenerated cellulose Substances 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 206010039073 rheumatoid arthritis Diseases 0.000 description 1
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 1
- 238000010187 selection method Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 239000000741 silica gel Substances 0.000 description 1
- 229910002027 silica gel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N sodium chromate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-][Cr]([O-])(=O)=O PXLIDIMHPNPGMH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 1
- 229910001220 stainless steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010935 stainless steel Substances 0.000 description 1
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000013589 supplement Substances 0.000 description 1
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 1
- 230000009885 systemic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 229960002663 thioctic acid Drugs 0.000 description 1
- 208000021510 thyroid gland disease Diseases 0.000 description 1
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 239000012588 trypsin Substances 0.000 description 1
- 238000000825 ultraviolet detection Methods 0.000 description 1
- 238000011144 upstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/06—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies from serum
- C07K16/065—Purification, fragmentation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/2893—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against CD52
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
- C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
- C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
- C07K2319/75—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor containing a fusion for activation of a cell surface receptor, e.g. thrombopoeitin, NPY and other peptide hormones
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Mycology (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Public Health (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Steroid Compounds (AREA)
- Saccharide Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
A találmány tárgya rekombináns antitestek tisztított készítménye, ezek alkalmazása a terápiában, és eljárás az előállításukra.
Az antitestek vagy immunoglobulinok fehérjeszerű bifunkciós molekulák. Egy, a különböző antitestekben eltérő régió felelős az antigénekhez, például a különböző, a szervezettel kölcsönhatásba kerülő fertőző anyagokhoz való kötődésért, míg a második, konstans régió felelős a sejtek Fc receptoraihoz való kötődésért és a komplement rendszer aktiválásáért. Ilymódon az antitestek az emlősök immunrendszerének egy lényeges részét képezik az idegen mikroorganizmusok és vírusok elpusztítása során. Ha egy állatot egy antigénnel immunizálunk, ennek eredményeképpen poliklonális antitesteket termel, másszóval különböző antitesteket, amelyek különböző specifitással és affinitással rendelkeznek. A gyógyászati alkalmazásokban előnyös, ha antitesteket egyetlen limfocita kiónnal állítunk elő - ezeket az antitesteket hívják monoklonális antitesteknek, és ezek az eredeti antigénnek egy bizonyos determinánsára specifikusak. A monoklonális antitesteket Koehler és Milstein módszerével lehet előállítani [Natúré, 256, 495-497 (1975)].
Az IgG osztályba tartozó antitest molekula két könnyű láncból és két nehéz láncból áll, amelyeket diszulfid hidak tartanak össze. Mindegyik könnyű lánc diszulfid híddal kötődik egy nehéz lánchoz, és a két nehéz láncot is diszulfid hidak kötik össze. Mindegyik nehéz láncnak a végén van egy variábilis dómén, ezt számos konstans dómén követi, és mindegyik könnyű láncnak az egyik végén van egy variábilis dómén, valamint egy
- 3 konstans dómén a másik végén. A könnyű lánc variábilis doménje a nehéz lánc variábilis doménjéhez illeszkedik. A könnyű lánc konstans doménje a nehéz lánc első konstans doménjéhez illeszkedik. A nehéz láncok megmaradó konstans dóménjei egymáshoz illeszkednek, ezek alkotják az Fc fragmentet, a polipeptid lánc korlátozott, részleges hasítása után. A nehéz és könnyű láncokból álló párok variábilis doménjei alkotják az antigén kötőhelyét. A polipeptid lánc korlátozott, limitált hasítása után a nehéz lánc első konstans doménje és a könnyű lánc konstans doménje képezik a Fab fragmentet. A nehéz és könnyű láncokból képzett párok variábilis doménjei ugyanazzal az általános szerkezettel rendelkeznek, négy régióból álló keretet tartalmaznak, amelyeknek a szekvenciája viszonylag konzervált, és ezeket három komplementaritást meghatározó régió (CDR) köti össze. A négy keret régió általában β-lemez konformációt vesz fel, a CDR-ek képezik az összekötő hurkokat, és néhány esetben tartalmazzák a β-lemez struktúra részét is. A CDR-eket a keret régiók tartják szoros közelségben, és a más doménekből származó CDR-ekkel együtt hozzájárulnak az antigén kötőhely kialakulásához.
A gyógyászatban való felhasználásra szánt antitesteket ismételten kell beadni, ezért az idegen immunoglobulinok eltávolítása fontos, mivel az ilyen adagolás immunválaszt eredményezhet, nefrotoxicitást, szérum-betegséget és súlyos esetekben anafilaxiás sokkot indukálhat. A teljes állati szérum vagy szérum albumin tartalmaz más fehérjéket, lipideket és szénhidrátokat; ezek a molekulák önmagukban is immunválaszt gerjesztenek, de nagyobb veszélyt jelentenek azért, mert • ·
- 4 patogéneket tartalmazhatnak, például a Bovine Spongiform Encephalopathy (BSE) nevű betegséget okozó ágenst. Endotoxinok is lehetnek jelen, amelyek nem kívánatosak, mivel potenciálisan halálos kimenetelű pirogén válaszokat keltenek.
Az expresszált antitestet tartalmazó tenyészlében más szennyezések is lehetnek, például a gazdasejt és vírus nukleinsav. Előfordulhatnak ezen kívül antitest aggregátumok, ezek szintén immunogénként működhetnek és nem kívánatos immunválaszt okozhatnak.
A jelen találmány tárgya tehát rekombináns antitest tisztított készítménye, amely
I) méretkizárásos kromatográfiával nem-redukáló körülmények között egyetlen csúcsot ad, míg denaturáló és redukáló körülmények között két fő csúcsot ad;
II) szokványos SDS poliakrilamid gélelektroforézissel nem-redukált mintából egyetlen fő csíkot ad, míg redukált mintából két fő csíkot ad;
III) fordított fázisú HPLC-vel nem-redukáló körülmények között egyetlen éles csúcsot ad, míg redukáló körülmények között két fő csúcsot ad; és
IV) specifikus aktivitása nagyobb mint 0.8 kiloegység/mg.
A méretkizárásos kromatográfia, amint az a nevéből következik, a fehérjék mérete alapján végzi a fehérjék elválasztását. Általánosságban azt mondhatjuk, hogy elválasztás akkor történik, ha a nagy molekulák nem tudnak belépni a porózus stacioner fázisba, ezért egyenesen áthaladnak az oszlopon, míg az egyre kisebb molekulák egyre inkább képesek arra, hogy
- 5 belépjenek a stacioner fázisba, és ennek következtében sokkal hosszabb az elúciós idejük. Tehát a stacioner fázis porozitása szabja meg az elérhető elválasztást. Ez az analitikai technika különösen arra jó, hogy meghatározzuk az aggregátumok szintjét a tisztított preparátumban. A stacioner fázis egy nagy pórusú szilikagél, amelyet diói csoportokkal lehet módosítani; ilyen előnyös gél például a Zorbax GF450-GF250 (DuPont termék), vagy a TSK G3000 SWXL vagy G4000 SWXL gél. A mobil fázis pH értéke 4 és 8 között változik, előnyösen 6 és 7,5 között változik, legelőnyösebb, ha értéke 6,8. Ez a fázis előnyösen egy foszfát, például dinátrium-hidrogén-ortofoszfát valamint egy szulfát, például nátrium- vagy kálium-szulfát keveréke, vízben oldva. Az ilyen keverék molaritása általában 25 mmol és 1 mól között változik, előnyösen 50 mmol körül van.
Az SDS poliakrilamid gélelektroforézis (SDS PAGE) információt ad az elegyben levő fehérjék számáról és típusáról, viszonylagos mennyiségükről, valamint molekulasúlyukról. Az SDS egy anionos detergens, ez reagál a fehérjékkel az elektroforézis előtt. A legtöbb fehérje SDS komplex vízben oldódik, és így vándorol a poliakrilamid gélen keresztül az anód felé, az elektromos töltés hatására. A vándorlás sebessége általában fordítottan arányos a fehérje molekulasúlyának logaritmusával. Kényelmes, ha az SDS elemzést gradiens gélen végezzük, horizontális vagy vertikális géllapon vagy rúdon. A gradiens általában 10-22% között változik, előnyösen 8-18% között. A gél előnyösen Pharmacia Excel (Trademark) gél.
A fordított fázisú HPLC a hidrofobicitás alapján választ el. Csakúgy mint a többi HPLC technikáknál, itt is van egy • ·
- 6 polimer stacioner fázis, például polisztirol/divinil-benzol polimer. A mobil fázis általában egy gyenge vizes puffer vagy híg sav és egy vízzel elegyedő szerves oldószer kombinációja. A fehérjék hatékony elválasztása érdekében a mobil fázis általában egy gradiens rendszer, ez szükséges az elválasztáshoz, és kényelmi szmpontból lineáris.
Az immunoglobulin elemzéshez használt stacioner fázis lehet egy szerves polimer hordozó, például a Polymer Labs PLRPS, a részecskeméret általában 8 μΜ; a pórusméret előnyösen 300 A vagy 1000 A. A mobil fázis előnyösen egy sav, például hangyasav, ecetsav vagy trifluor-ecetsav, víz és acetonitril elegye. A sav és a víz aránya előnyösen 5:3.
Egy antitestet az alkotóelemeire, azaz a könnyű és nehéz láncokra bonthatunk redukcióval, melynek során a diszulfid hidakat denaturáló körülmények között, például guanídiumkloriddal és ditiotreitollal redukáljuk. A szabad tiol-csoportok ezt követő alkilezésével (például jód-acetamiddal, jódecetsavval) meg lehet akadályozni, hogy a kötések újra kialakuljanak.
A tisztaságot az antitest készítmény specifikus aktivitásának mérésével lehet meghatározni. A specifikus aktivitást a példákban megadott módszerekkel lehet meghatározni. A találmány szerinti készítmény specifikus aktivitása előnyösen 0.8 kiloegység/mg-nál nagyobb, ideális esetben 0,9 kiloegység/mg-nál nagyobb, legelőnyösebb, ha 1,0 kiloegység/mg körül van.
A találmány szerinti tisztított antitest készítmény ideális esetben mentes a gazdasejt szennyezéseitől, például a
·*· gazdasejt fehérjéktől, nukleinsavaitól és endotoxinjaitól. A specifikus aktivitás információt ad a gazdasejt fehérje mennyiségéről a készítményben. Az endotoxin szinteket LAL módszerrel (Limulus Amoebocyte Lysate) lehet mérni [Parenteral Quality Control, M.J. Alles et al., Marcel Dekker Inc., New York].
Egy találmány szerint készítmény továbbá aggregátumoktól mentes, amint azt a méretkizárásos kromatográfia alapján meg lehet határozni. Kívánatos, hogy ez a szint 2%-nál alacsonyabb legyen, ideális esetben 0,5%-nál kevesebb. A találmány szerinti antitesteket rekombináns expressziós rendszer segítségével lehet előállítani, az előnyös rendszer egy emlős expressziós rendszer, amely az aranyhörcsög petesejteket (CHO) használja. Ezek lehetnek dihidrofolát-reduktáz (dhfr) deficiensek, és így növekedésük timidintől és hipoxantintól függ (Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 4216-4220 (1980)]. A szülői dhfr- CHO sejtvonalat az antitest génjével és a dhfr génnel transzformáljuk, ami lehetővé teszi a dhfr pozitív fenotípusú CHO sejt transzformánsok szelekcióját. A szelekciót úgy hajtjuk végre, hogy a telepeket olyan táptalajon tenyésztjük, amelyből hiányzik a timidin és a hipoxantin, és ennek következtében a transzformálatlan sejtek nem képesek növekedni, míg a transzformált sejtek képesek helyreállítani a foát bioszintézis utat, és ezzel kikerülik a szelekciós rendszert. Ezek a transzformánsok általában alacsony szinten expresszálják a génterméket, annak következtében, hogy együtt integrálódik mindkét transzfektált gén. Az antitest gén expressziójának szintjét meg lehet növelni metotrexáttal (MTX) • · « ·
- 8 végzett amplifikáció útján. Ez az anyag a dhfr enzim közvetlen inhibitora, és így lehetővé teszi olyan rezisztens telepek izolálását teszi lehetővé, amelyekben a dhfr gén kópiaszáma elegendő mértékben amplifikálódott ahhoz, hogy ezeket a körülményeket túlélje. Mivel a dhfr és az antitest gének szorosabban kapcsolódnak az eredeti transzformánsokban, ezért ezzel együtt jár a kiválasztott antitest gén amplifikációja és ennek következtében megnövekedett expressziója.
Egy másik, a CHO vagy mieloma sejteket felhasználó expressziós rendszer a glutamin szintetáz (GS) amplifikációs rendszer, amelyet a WO 87/04462 jelű szabadalmi bejelentésben közöltek. Ebben a rendszerben a sejtet egy GS enzimet kódoló valamint a kiválasztott antitest génnel transzformálják. Azokat a sejteket szelektálják, amelyek glutamin-mentes táptalajon képesek növekedni. Ezeket a szelektált kiónokat vetik alá a GS enzim gátlásának metionin-szulfoximin (Msx) alkalmazásával. A sejtek, a túlélésük érdekében amplifikálják a GS génjüket, és ezzel együtt az antitestet kódoló gént is.
Az antitestet előnyösen olyan formában kapjuk meg, amilyenben a táptalajba szekretálódik. A kinyert táptalajt azután szűrjük, és/vagy egy ultraszűrési lépéssel töményítjük, hogy egy vizes oldatot kapjunk, amelyet tisztítási eljárásnak vetünk alá. Eszerint az antitest vizes oldatát:
a) egy Protein A oszlopra visszük, az antitest az oszlopra abszorbeálódik, majd az antitestet egy savas oldattal leoldjuk;
b) a savas eluátumot egy töltött részecskéket tartalmazó ioncserélő oszlopra visszük, hogy abszorbeáljuk az antitestet, majd az antitestet egy ellentétes töltésű ionokat tartalmazó vizes oldattal eluáljuk;
c) a vizes eluátumot egy porózus részecskékből álló méretkizárásos oszlopra visszük, hogy a molekula méret szerinti elválasztást kapjunk, és hogy a kiválasztott antitestet az oszlopról eluálódó kiválasztott frakciókban megkapjuk.
A Protein A egy csoportspecifikus ligand, amelyik a legtöbb IgG Fc régiójához kötődik. Ezt néhány Staphylococcus aureus törzs szintetizálja, és a tenyészetek felülúszójából lehet izolálni, majd agaróz-gyöngyökhöz vagy szilikáthoz kapcsolva lehet immobilizálni. Egy másik módszer egy olyan törzs teljes baktériumainak alkalmazása, amelyek a baktérium sejtfelszínén nagy mennyiségben tartalmaznak Protein A-t. Mindkét típusú gélpreparátum hozzáférhető a kereskedelmi forgalomban (Protein A - Pharmacia; teljes baktérium Calbiochem, IgG szorb) [Alán Johnstone and Robin Thorpe, Immunochemistry in practice, Blackwell Scientific Publn., Chpt. 10.) A Protein A egy alternatívája a Protein G [Analytical Chem., 61(13), 1317 (1989) ] .
A legelőnyösebben használható oszlop egy Protein A Sepharose oszlop, főleg a Protein A Sepharose Fást Flow (Trade Mark). Az oszlopot ideális esetben TRISZ vagy foszfáttal puffereit sóoldat pufferrel (pH =7,0) mossuk, majd az antitestet savas pH-η (pH=3,0-3,5), előnyösen pH=3,0 értéken eluáljuk, például citromsavat alkalmazva körülbelül 0,1 mól koncentrációban.
Az ioncserélő kromatográfia a stacioner fázisban levő töltött csoportok és a mobil fázisban levő minta közötti • ·♦ ··· • ·
- 10 kölcsönhatást használja ki. Egy ioncserélő oszlop stacioner fázisa lehet egy pozitív töltésű kationcserélő, vagy egy negatív töltésű anioncserélő. A töltött csoportokat a mobil fázisban levő ellentétes töltésű ellenionok semlegesítik, és az ellenionikat a kromatográfia során a sokkal nagyobb töltésű minta molekulák leszorítják. Előnyös térhálóa oszlopokat alkalmazni, például agaróz alapúakat, például az S-Sepharose Fást Flow (Trademark) kationcserélő oszlopot, különösen az SSepharose Fást Flow kationcserélőt (Trademark). Egy változat szerint membrán alapú oszlop is használható. Az oszlopot általában a Protein A oszlopról származó eluátum után mossuk 20 mmol HEPES pufferrel (pH=7,5), és az antitestet ugyanazzal a pufferrel eluáljuk, amely nátrium-kloridot tartalmaz 0,2 mól és 0,075 mól koncentráció-tartományban.
A méretkizárásos kromatográfia, amint az a nevéből következik, a fehérjék mérete alapján választ el.
Általánosságban azt mondhatjuk, hogy elválasztás akkor történik, ha a nagy molekulák nem tudnak belépni a porózus stacioner fázisba, ezért egyenesen áthaladnak az oszlopon, míg az egyre kisebb molekulák egyre inkább képesek arra, hogy belépjenek a stacioner fázisba, és ennek következtében sokkal hosszabb az elúciós idejük. Tehát a stacioner fázis porozitása szabja meg az elérhető elválasztást. Az alkalmas anyagok kémiailag kötődnek és rezisztenciát biztosítanak a kompresszióval szemben; ilyen például egy agaróz és/vagy dextrán kompozíció, úgymint a Superdex (Trademark). Egy előnyös oszlop a Superdex 200 méretkizárásos anyag. Az ioncserélő oszlopról lejövő eluátumot előnyösen egy Superdex oszlopra visszük, és egy pH=5-8-as
pufferben fejlesztjük ki, előnyösen pH=7,2-es PBS-ben.
Mindegyik oszlopot előnyösen egy szűrő védi, amely lehet egy 0,2 μ-os Gelman Acro sterilező szűrő, illetve a Protein A oszlop esetében egy PÁLL posidyne SLK 7002 NFZP vagy egy PÁLL DSLK szűrő (megvásárolható a Pali Proces Filtration Ltd. European House-nál, Havant Street, Portsmouth 301 3PD), a másik két oszlop esetében egy Milipak szűrő, előnyösen Millipak 100 az ioncserélő oszlophoz, és Millipak 20 vagy 60 a méretkizárásos kromatográfiához (megvásárolható a Millipore-nál, The Boulevard, Blackmore Lane, Watford, Herts). Az oszlopokat felhasználás előtt előnyösen fertőtlenítjük egy megfelelő fertőtlenítőszerrel, például 0,5 mól NaOH-val 16 órán át (bármelyik oszlopot) , vagy 2%-os hibitán-glükonát 20%-os etanolban készült oldatával a Protein A oszlop esetében, vagy 1 mól/liter NaOH-val a másik két oszlop esetében. A fertőtlenítőszereket a megfelelő steril pufferekkel kimossuk, mielőtt a fehérje oldatokat felvinnénk. Az eljárásban használt összes oldatot előnyösen sterilezzük, és endotoxin mentesek.
További lépéseket adhatunk a fentiekben ismertetett tisztítási eljáráshoz. Az ultraszűrés arra használható, hogy tovább csökkentsük a vírus, illetve a sejt nukleinsav szennyezést. Ezt úgy hajthatjuk végre, hogy a kereskedelmi forgalomban kapható ultraszűrő egységeket használunk, például a Viresolve/70' vagy a Viresolve/180 membránokat, emellett a PMLK regenerált cellulóz 300k vágási értékű membrán is kapható a Millipore-nál (The Boulevard, Blackmore Lane, Watford, Herts). Egy másik módszer a vírus szennyezés csökkentésére a mikroszűrés, tartókban levő Nylon membránt alkalmazva, például a ·· ·♦ · · β * · · * ·· ··» «· * · . · · ·· ·· * *· ·♦ ·» ·· »·
Nylon 66, 0,04 M membránt a PALL-tól.
Egy további tisztítási lépést vezethetünk be a szennyező DNS eltávolítására, például a Protein A oszlopot mossuk 1-3 mólos koncentrációjú NaCl-dal semleges pH-jú pufferben, előnyösen PBS-ben pH=7,2-nél. A NaCl-hoz előnyösen glicint adhatunk 1,5 mól koncentrációban, pH=8,8-9,0.
A rekombináns DNS technológia biztosítja annak lehetőségét, hogy két alaptípusú megváltoztatott antitestet állítsunk elő. Az első típus, amelyet kiméra antitestekként említenek, az, amelyben csak a rágcsáló konstans doméneket helyettesítjük az ekvivalens humán eredetű doménekkel [Morrison et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 81, 6851-6855 (1984); Boulianne et al., Natúré, 314, 268-270 (1985); Neuberger et al, Natúré, 314, 268-270 (1985)]. A másodíik típus az, ahol a rágcsáló konstans doméneket és a rágcsáló keret régiókat is mind kicserélik az ekvivalens humán eredetű doménekkel és régiókkal. Ezt a második típusú antitestet humanizált, vagy CDS-graftolt antitestnek hívják [Jones et al., Natúré, 321, 522-525 (1986); Riechmann et al., Natúré, 332. 323327 (1988)]. Ezek az antitestek még jobban hasonlítanak a humán antitestekhez, ha humán betegeknek adják be, és így nem váltanak ki ugyanolyan mértékű anti-antitest választ. Humán antitest is használható.
Az antitest előnyösen egy megváltoztatott antitest, például egy hibrid antitest, amelyben a nehéz és könnyű láncok homológok egy természetes antitesttel, de olymódon vannak kombinálva, amely nem fordul elő a természetben. Az az antitest lehet kiméra antitest, amelyben a variábilis régió egyik antitestből származik, a konstans régió egy másikból. Azaz a kiméra antitestek lehetnek faj/faj kimérák, illetve osztály/osztály kimérák. Ezek a kiméra antitestek tartalmazhatnak egy vagy több további módosítást az antigén kötő képesség növelése érdekében, vagy az effektor funkció megváltoztatása érdekében. A megváltoztatott antitest egy másik fajtája a humanizált vagy CDR-graftolt antitest, beleértve a kompozit antitesteket, ahol a CDR-ek mellett a hipervariábilis régiók egyes részei is transzferálódnak a humán keretre. Az ilyen antitestekben további aminosavak vagy konstans régiók is megváltoztathatók.
A tisztított rekombináns antitestek a gyógyászatban használhatók számos humán rendellenesség kezelésére, általában immunszuppresszív szerekként, pontosabban T-sejtek által közvetített rendellenességek, például súlyos érgyulladás, reuamtoid artrítisz, szisztémás lupis, valamint autoimmun rendellenességek, például szklerózis multiplex, graft versus hőst betegség, pszoriázis, fiatalkori cukorbetegség, Sjogren betegség, tiroid betegség, izomsorvadás, átültetett szerv kilökődése és asztma kezelésére.Ezek az antitest használhatók még rákok, például nem-Hodgkin limfóma és leukémiák kezelésében.
A találmány tárgya tehát rekombináns antitestek tisztított készítményeinak alkalmazása 'az előzőkben említett rendellenességek közül bármelyiknek a kezelésére szolgáló gyógyszer előállításában. A találmány tárgya továbbá eljárás az említett betegségek közül bármelyikben szenvedő beteg kezelésére, azzal jellemezve, hogy az említett egyednek egy terápiásán hatékony mennyiséget adunk be egy rekombináns
- 14 * « * · · «· ·· antitest tisztított készítményéből.
Ezeknek az antitesteknek a dózisa változik a kezelendő állapottal, valamint függ a kezelt betegtől, de 1-100 mg-os tartományban van egy felnőtt beteg esetében, előnyösen 1-10 mg, általában naponta beadva 1-30 napos időtartamig. Egy kétrészes dózistartomány előnyösen a következő: 1-5 mg adagolása 5-10 napig, majd 6-15 mg adagolása 5-10 napig.
A találmány tárgyát képezik továbbá egy rekombináns antitest tisztított készítményét tartalmazó formulák. Az lyen formulák előnyösen tartalmaznak, az antitest mellett, egy fiziológiásán elfogadható hígító anyagot vagy hordozót, lehetőleg más anyagokkal elkeverve, például más antitestekkel vagy antibiotikummal. Az elfogadható hordozók közé tartoznak, de nem korlátozó jelleggel a fiziológiás sóoldat, foszfáttal puffereit sóoldat, foszfáttal puffereit sós glükóz és a puffereit sóoldat. Egy másik változat szerint az antitestet liofilezhetjük (fagyasztva-szárítjuk), majd használatkor rehidráljuk, a fentiekben leírt vizes, puffereit oldat hozzáadásával. Az adagolás útja rutinszerűen parenterális, beleértve az intravénás, intramuszkuláris, szubkután és intraperitonális injekciózást vagy bejuttatást.
A mellékletben megadott ábrák leírása:
1. ábra (a) a pLD9 konstrukció tartalmazza a sérült dhfr szelekciós/amplifikációs markert, és a Campath-1H könnyű lánc DNS-t. A kis négyszög a sötét nyíllal a legyengített SV40 promoter; a nagyobb, pontozott négyszög egy nyíllal a β-aktin promoter; a poliA jelentése a megfelelő eredetű poliadenilezési • · · · « ·· ·· . φ ·® ·· és terminációs szignál; a kis négyszög az ori-val az SV40 replikációs origót jelenti;
(b) a pNH316 konstrukció expressziós kazettát tartalmaz a neomicin szelekciós markerhez és a Campath-1H nehézlánc cDNS számára. A négyszög egy nyíllal és Mikrotiter-vel jelölve az egér metallotionein promotert jelenti. A jelölt restrikciós hasítási helyek: H, Hindin; Bg, BglII; B, BamHI; RÍ, EcoRI.
2. ábra
A nem- redukált és redukált Campath 1H SDS poliakrilamid gélje, amely egyetlen fő csíkot mutat.
3. ábra
A nem-redukált Campath 1H fordított fázisú HPLC kromatogramja, egyetlen csúcsot mutat.
4. ábra
A redukált és karboximetilezett Campath 1H fordított fázisú HPLC kromatogramja, amely két elválasztott csíkot mutat, amelyek megfelelnek az antitest könnyű és nehéz láncának.
5. ábra
A nem-redukált Campath 1H nagyteljesítményű méretkizárásos kromatográfiája, egyetlen csíkot mutat.
6. ábra
A redukált Campath 1H nagyteljesítményű méretkizárásos kromatográfiája, két fő csíkot mutat.
1. Példa
A Campath 1H előállítása CHO sejtekből
1A Példa: A Campath 1H nehéz és könnyű lánc cDNS-ének klónozása • ·
- 16 A patkány Campath 1G monoklonális antitestből származó komplementaritást meghatározó régiókat eredetileg közvetlenül genomiális humán nehéz láncba és könnyű lánc keretbe graftolták [Winter et al, Natúré, 322, 323-327 (1988)]. Ezeket a konstrukciókat változtatták meg úgy, hogy az YO mielóma sejtvonalban expresszáljon, és ennek eredménye a Campath 1H expressziója 5 Mg/ml koncentrációban, 10-14 napos tenyésztést követően [Halé et al., Tissue Antigens, .35, 118-127 (1990); Winter et al., Natúré, 322323-327 (1988)]. A TF57 mieloma sejtvonalat [Halé et al., Tissue Antigens, 35. 118-127 (1990)] használtuk méretre szelektált cDNS frakciók előállítására 0,9-1,2 kb és 1,4-1,7 kb méretben a könnyű és nehéz lánc cDNSekhez. Ezeket használtuk EcoRI linkerekkel ellátott cDNS könyvtárak előállítására lambda gtlO vektorban. Az összes eljárást a Huynh és munkatársai által leírt módon végezzük [DNA Cloning, Vol I: A Practical Approach (1984) Glover, D (Editor), IRL Press, Oxford]. A könyvtárakat [32P] nick transzlációval jelzett próbákkal vizsgáljuk át, amelyek a variábilis régióra specifikusak, hogy teljes hosszúságú cDNS kiónokat izoláljunk. A könnyű lánc cDNS esetében az 5' nem-transzlálódó leader részt a -32-es pozícióig eltávolítjuk Bal31 exonukleáz alkalmazásával, és Hindin linkért adunk hozzá. A 3' vég esetében a stopkodon előtt 47 bázispárral található egyetlen SacI hasítási helyet használjuk ki. Egy SacI-HindlII szintetikus oligonukleotid párt használunk ennek a szekvenciának a regenerálására, és a Hindin hasítási hely közvetlenül a stop kodon után való helyezésére. A nehéz lánc cDNS 5' vége esetében az ATG startkodont átlapoló egyetlen Ncol hasítási helyet használjuk ki a 29 bp méretű nem • ·
- 17 transzlálódő leader szekvencia újból való létrehozására, amely azonos a könnyű láncéval, egy HindlII-NcoI oligonukleotid pár alkalmazásával. A 3' végen a stop kodon után 12 bázispárral található egyetlen Nael hasítási helyet konvertáljuk linkerek felhasználásával Hindin hasítási hellyé.
1B Példa: A vektorok konstrukciója
A humán β-aktin promoterét kihasítjuk a pHBAPr-3-neo vektorból {(ami megfelel a pHBAPr-l-neo vektornak) [Gunning etal., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 84, 493-35 (1987)], azzal a különbséggel, hogy az SV40 poliadenilezési/terminációs jelet a megfelelő humán B-aktin jelekkel helyettesítjük} egy 2860 bp méretű PvuII-HindlII fragment formájában, amelyben a PvuII véget linkerek segítségével BglII véggé alakítjuk. A humán β-aktin poliadenilezési és terminációs szignáljainak a pHBAPr-3-neo-ból való izolálására egy, az egyetlen HindlII hasítási helytől 3' irányban 1,4 kb távolságra levő Sphl hasítási helyet alakítunk át linkerek felhasználásával BamHI hasítási hellyé. A kiindulási dhfr vektort, jele pl04, az alábbiak szerint állítunk elő. A pSV2dhfr vektor SV40 promoterében [Subramani et al., Molecular and Cellular Biology, 1, 854-864 (1981)] a -128-as pozícióban levő Sphl hasítási helyet Sáli hasítási hellyé konvertáljuk, hogy a promoterből eltávolítsuk az összes enhanszer elemet. A meggyengített dhfr expresszióx egységet ezután szubklónozzuk egy SalI-BamHI fragment formájában a pSVOd [Mellon et al., Cell, 27., 279-288 (1981)] homológ hasítási helyeire.
A pLD9 előállításához a p!04 vektort Bamhl restrikciós ···· ·· · · . t ·· • ·.*? ·*
- 18 enzimmel emésztjük, foszfatázzal kezeljük, majd három másik fragmenttel ligáljuk, amelyek a következők: BglII-HindlII, Baktin promoter; Hindin, Campath-1H könnyű lánc cDNS; és a HindlII-BamHI β-aktin poliA/terminációs szignál. A pNH316 készítéséhez a pdBPV-MMTneo konstrukciót [Law et al., Mól. Cell. Bioi., 3., 2110-2115 (1983)] BamHI restrikciós enzimmel emésztjük, foszfatázzal kezeljük, majd a neomicin gént tartalmazó fragmentet agaróz gélen való elválasztás után izoláljuk. Ezt ligáljuk a két B-aktin fragmenthez és a Campath1H nehéz lánc cDNS-hez. A pLD9 és pNH316 konstrukciókat az 1. ábrán mutatjuk be.
IC Példa: A Campath-1H expressziója CHO sejtekben
A DUK-B11 dhfr- CHO sejtvonalat [Urlaub et al., Proceedings of the National Academy of Sciences, USA, 77, 42164220 (1980)] 10%-os borjúmagzat savóval és 4 Mg/ml hipoxantinnal illetve tmidinnel kiiegészített Iscove féle MEM-ben növesztjük. A pLD9 és a pNH316 plazmidból 10-10 Mg-ot ko-precipitálunk a sejtek felszínére, a kalcium-foszfát módszer alkalmazásával [Gorman et al., DNA Cloning, Vol II, 143-190 (1985) Academic Press, N.Y.), majd a dhfr+/neo rezisztencia kettős fenotípus alapján szelektálunk, az említett táptalajon, azzal a különbséggel, hogy 10% dializált szérumot használunk, a hipoxantin/timidint kihagyjuk, és G418-at (Gibco) teszünk bele 500 Mg/ml koncentrációban. Néhány kísérletben az első szelekciós lépésben közvetlenül MTX-et használunk a dhfr+ transzformánsokhoz. Néhány száz transzformábst egyesítünk, és vizsgáljuk a Campath-Immun antitest termelődését a táptalajban.
- 19 Az átlagos termelési szint 0,5 μg/ml a nem-amplifikált, első körből származó transzformánsoknál.
Mindegyik egyesített sejtpopulációt 10-7 mól MTX jelenlétében tenyésztjük, majd két hét elteltével a rezisztens telepeket ismét egyesítjük és megmérjük a Campath-1H termelődésüket. 80-szoros növekedés is megfigyelhető a termelési szintben (1. Táblázat). Ezeket a sejteket hígítással klónozzuk, vizsgáljuk a Campath-1 termelési szintjüket, és két magasabban termelő vonalat izoláltunk, ezek jele A37 és 3D9 (1. Táblázat). Mindkettőt tovább amplifikáljuk 10“6 mól MTX jelenlétében, majd hígítással klónozzuk és a fentiek szerint átvizsgáljuk. Az ebben a második, végső amplifikációs lépésben megfigyelt növekedés nam olyan dramatikus mint az előzőben megfigyelt; mindazonáltal, ha egybefolyó állapotban a sejteket újra tápláljuk, és további 4 napig hagyjuk, akkor ezek a sejtvonalak (A39 és 3D11) képesek egészen 200 μg/ml Campath-lH-t termelni.
• ·
- 20 1. Táblázat
A Campath-1H expressziós szintje lépésenként!
amplifikálássál
Konstrukció Szelekciós állapot Akkumulált
Campath-1H (/zg/ml) pLD9+pNH316 dhfr+/neo alap pool0,5
10-7 M MTX-szel amplifikált pool18-40
A37 és 3D9 sejtvonalak40
ΙΟ-6 M MTX-szel amplifikált pool60-90
A39 sejtvonal100
3D11 sejtvonal 150-200
A sejteket hagyjuk, hogy egybenőjenek egy T-175 szövettenyésztő lombikban, majd ismét tápláljuk 50 ml friss szövettenyésztő táptalajjal, és további 4 napig hagyjuk növekedni. A táptalajban ezalatt az idő alatt felhalmozódott Campath-1H antitestet ELISA módszerrel mérjük. A vizsgálat napján a teljes sejtszám általában 2,5 x 107. A 3D11 sejtvonal termelési szintje 100 Mg/106 sejt/nap termelőképességet mutat.
A pLD9 és a pNH316 ko-transzfekciós vektor úokat a továbbiakban is alkalmazzuk egy, az előzőktől eltérő, alternatív amplifikációs stratégia kidolgozásához. A dhfr~ sejteket kotranszf ektál juk, a előzőkben leírt módon, majd két nappal később közvetlenül szétosztjuk olyan lombikok sorozatába, amelyek G418 antibiotikumot tartalmaznak ( a neomicin szelekcióhoz), valamint növekvő koncentrációjú MTX-et (3 x 109 - 10“7 M). Miután két hétig szelektáltuk az említett módon, a rezisztens telepek számát megszámláljuk, és minden egyes lombiknál egyesítjük őket. Mikir a sejt-populációk stabilizálódnak, akkor megvizsgáljuk a Campath-1H mennyiségét. Az eredmények a 2. táblázatban láthatók. Ahogy az MTX szin növekszik, úgy jelentkezik egy markáns csökkenés a túlélő dhfr+ telepek számában, de ugyanakkor arányosan több Campeth-lH-t expresszálnak. így egy egylépéses direkt szelekcióval magas MTX koncentrációnál lehetséges olyan sejtpopulációkat izolálni, amelyek 60-szor több antitestet termelnek, mint az alap dhfr szinten szelektált populációk.
2. Táblázat
A Campath-1H expressziós szintjeinek összehasonlítása direkt szelekció alkalmazása esetén
| Szelekció (M MTX) | dhfr+ telepek | Akkumulált Campath-1H (gg/ml) |
| Nincs MTX | 500 | 0,5 |
| 3 x 109 | 40 | 2 |
| 10-8 | 5 | 7 |
| 3 x 108 | 5 | 30 |
| 107 | - | - |
Az egyes MTX szelekciós lépésekben kinőtt telepeket egyesítjük, majd az 1. Táblázat lábjegyzetében leírt módszerrel vizsgáljuk őket.
Ezt a szelekciós eljárást megismételjük, a sejtek más ko-transzfekcióját követően, majd ebben a példában a teljes populációt szelektáljuk G418-antitest és 3 x 10-8 M MTX-et tartalmazó táptalajban. Ez a rezisztens telepeknek nagyobb tömegét hozza létre, amelyeket ezután kétszer újra amplifikálunk 6 x 10-7 mól majd 3 x 10-6 mól MTX alkalmazásával. Ebben az állapotban a sejteket hígítással klónozzuk, és átvizsgáljuk a Campath-1H termelési szintjüket. A két legjobban termelő sejtvonalat izoláljuk, amelyek 100-150 gg/ml antitestet képesek termelni, ezek jelzése 4F11 és 5E10.
Ezeknek a sejtvonalaknak a növekedési sebessége, valamint az előzőkben leírt A39/3D11 sejtvonalak növekedési
sebesség lényegesen kisebb mint a kiindulási,, nem transzformált dhfr CHO sejteké. Ez egy általános jelenség ezeknél a sejteknél, ha egyszer úgy lettek módosítva, hogy egy génterméket nagy mennyiségben expresszáljanak. Az 5E10 és 4F11 sejtvonalak termelőképessége nagyon változik az idővel, az utóbbi csak korlátozott átoltási idővel rendelkezik, amely 3 hétig tart mielőtt beáll a krízis és a pusztulás. Ez az instabilitás egyáltalán nem volt nyilvánvaló a többi sejtvonalnál, jóllehet nagy általánosságban, a második amplifikációs lépésből izolált sejtvonalakat, beleértve az 5E10-et, általában nagyon bizonytalanul lehet tenyészteni. Az összes sejtvonal közül a 3Dll-ben kapcsolódik össze a jó növekedés és stabilitás a magas Campath-1H termeléssel. Ahhoz, hogy biztosítsuk ezeknek a tulajdonságoknak a szaporítását, a 3D11 sejtvonal újra klónoztuk higításos módszerrel, így kaptuk a 3D11* sejtvonalat, és ez hasonlóképpen 200 ^g/ml Campath-1H termelési szintet mutatott.
··«·
- 24 2. Példa
Növekedés és termelés a C1H 3D11— 44-ből szérummentes táptalajban
A C1H 3D11* sejtek, amelyek egysejtréteg formájában növekednek Iscoves + 10% FBS Flow nem-esszenciális aminosavak, 10~6 mól metotrexát és antibiotikum tartalmú táptalajon, körülbelül 90%-ban egybefüggő réteget képeznek. Ezeket a sejteket eltávolítjuk a műanyag felületről tripszin/versene kezeléssel, kiegészítőket nem tartalmazó Iscoves táptalajban mossuk, centrifugáljuk, majd 5 x 104/ml koncentrációban szuszpendáljuk WCM4 táptalajban, amelynek összetételét az alábbi táblázatban mutatjuk be, és amely emellett 0,25% peptont, 0,1% polietilén-glikolt és 0,5% borjúmagzat szérumot (FBS) tartalmaz, de metotrexátot (MTX) nem. Három 25 cm2-es felületű lombikot készítünk, amely 10 ml sejtszuszpenziót, hipoxantint (H), timidint (T) vagy HT-t tartalmaz. Ezeket a lombikokat 36,5°C-on inkubáljuk 5% CO2~t tartalmazó inkubátorban.
Hat nap elteltével a lombikok tartalmát egyesítjük, és azonos térfogatú táptalajhoz adjuk, amely MTX-et tartalmaz, de sem peptont, sem PEG-et nem, majd egy 75 cm2 felszínű lombikba visszük át.
Ezeket a sejteket használjuk arra, hogy egy 500 ml-es Techne spinnert oltsunk vele, amelyet 40/perc fordulatszámmal inkubálunk 36,5°C-on. A sejtek szérum távollétében is folytatják a növekedést körülbelül öt hónapig, és jóllehet a megfigyelés szerint a sejteknek egy adaptációs periódusra volt szükségük, a növekedési sebesség és az életképesség folyamatosan javult. A populáció kétszerezési ideje a számítások szerint 73,1 óra körülbelül 7 hét elteltével; ez az utána következő 20 nap alatt 47,4 órára csökken, majd stabilizálódik. Az antitest szekréció szintje magas maradt, 60 Mg/ml fölött. A meghatározások szerint a gén kópiaszáma nem csökkent ezekben a sejtekben. A meghatározást a Northern biot elemzéssel kapott csíkok intenzitásának elemzésével végeztük.
Fermentorokban ezek a sejtek 70 Mg/ml fölötti mennyiségben termelnek antitestet, rendszerint elérik a 100 μg/ml-t, vagy még magasabb szintet. Ezeknek a sejteknek a jelzése C1H 3D11*44.
WCM4 táptalaj
Iscoves DMEM (Iscoves N. and Melcher, J. Exp. Med., 1,
47, 923 (1978)], úgy módosítva, hogy nem tartalmaz BSA-t,
| ferrint és lecitint | ||
| + | 5 ml/liter | 200 mmol L glutamin |
| + | 50 mg/liter | L prolin |
| + | 50 mg/liter | L treonin |
| + | 50 mg/liter | L netionin |
| + | 50 mg/liter | L cisztein |
| + | 50 mg/liter | L tirozin |
| + | 25 mg/liter | aszkorbinsav |
| + | 0,062 mg/liter | B6 vitamin |
| + | 1,36 mg/liter | B12 vitamin |
| + | 0,2 mg/liter | liponsav |
| + | 0,088 mg/liter | metil-linoleát |
| + | 1 μη | metotrexát |
| + | 1 mg/liter | FeSO4 |
| + | 1 mg/liter | ZnSO4 |
+ 0,0025 mg/liter + 5 mg/liter + 50 000 NE/liter + 20 000 NE/liter + 0,16 mg/liter
CUSO4 rekombináns inzulin (Nucellin) polimixin neomicin putreszcin-2 HC1
Az előző lépésből származó C1H 3D11*44 sejteket, amelyeket több mint két hónapig szérummentes táptalajban növesztettünk, egy SGi 1 literes fermentorba visszük át, amely 70/perc fordulatszámmal működő rozsfamentes acél keverőt tartalmaz. A hőmérsékletet 37°C-ra állítjuk, az oldott oxigén szintjét 10%-ra, és a pH-t 7-7,2 között szabályozzuk. A fermentort a 0. napon oltjuk be 0,22 x 106 sejt/ml koncentrációjú oltóanyaggal WCM4 táptalajba, amely 0,1% polietilén glikolt (PEG 10 000) és 0,25% szójapeptont tartalmaz, majd felülről oxigén bekeverésével levegőztetjük. A sejteket rutinszerűen átoltjuk friss táptalajba, a vágási érték általában 1:2 és 1:4 között van.
A 33. napon a felülről való levegőztetést felváltjuk a levegő alulról való bekeverésével, amiről várható, hogy nagyobb fizikai károsodást okoz a sejteknek.
Az 50. naptól kezdődően WCM4 helyett WCM5 táptalajt (lásd az alábbi táblázatot) használunk peptonnal és PEG-gel.
Az 53. napon a PEG-et 0,1% pluronic F68-ra cseréljük. A kapott növekedés és antitest szint a fermentorokban 100 μg/ml fölött van.
- 27 WCM5 táptalaj
Iscoves DMEM táptalaj, úgy módosítva, hogy kihagyjuk a
BSA-t, transzferrint és lecitint + 5 ml/liter +50 mg/liter + 50 mg/liter + 50 mg/liter + 50 mg/liter +50 mg/liter +25 mg/liter + 0,062 mg/liter + 1,36 mg/liter + 2 mg/liter + 1 mg/liter + 0,0025 mg/liter + 5 mg/liter + 50 000 NE/liter + 20 000 NE/liter + 0,16 mg/liter + 3 ^liter/liter
200 mmol L glutamin
L prolin
L treonin
L metionin
L cisztein
L tirozin aszkorbinsav
B6 vitamin
B12 vitamin vas(III)-citrát
ZnSŰ4
CUSO4 rekombináns inzulin (Nucellin) polimixin neomicin putreszcin-2 HC1 etanolamin
Mind a WCM4-ben, mind a WCM5-ben az összes komponens kereskedelmi forgalomban van.
3. Példa
A Campath 1H (G Dev-95) tisztítása
Anyagok és módszerek
A tisztítási eljárás három oszlopon való kromatográfián • · ♦ ·
- 28 alapul. Az alkalmazott gélek: 7,85 ml Protein A Sepharose 4 Fást Flow, Pharmacia kódszám 17-0974-04 (10 cm x 1 cm); 7,85 ml S Sepharose Fást Flow kationcserélő, Pharmacia kódszám 17-0511-01 (10 cm x 1 cm); és 120 ml Superdex 200 méretkizárásos közeg, Pharmacia kódszám 17-1046-01 (60 cm x 1,6 cm). Mindegyik oszlopot Gelman Acro sterilizáló szűrővel védjük.
A berendezések és oldatok készítése
A Protein A rendszer berendezését 1 mol/1 NaOH-val mossuk át, majd az endotoxinok eltávolítására 24 órán át ebben az oldatban hagyjuk állni. A gélt azután a Pharmacia C10/20 oszlopba töltjük, és 2%-os hibitán-glükonát 20%-os etanolban készített oldatával fertőtlenítjük. Mivel a gyártó szerint az S Sepharose és a Superdex 200 gél is hosszú ideig stabil 1 mol/1 NaOH-ban, ezért ezeket a géleket oszlopaikba töltjük (egy Pharmacia C10/20 és egy C16/100 oszlopba), 1 mol/1 NaOH-val átmossuk, majd ebben az oldatban hagyjuk állni 24 óra hosszat, hogy eltávolítsuk az endotoxinokat és fertőtlenítsük az oszloprendszereket.
Az oszlop-műveletekhez és a fertőtlenítéshez az oszlopokat pirogénmentes desztillált víz felhasználásával készítjük, majd 0,2 μιη-es Millipore Millipack 100 szűrőkön keresztül sterilre szűrjük.
Oszlop műveletek
Protein A Sepharose 4 Fást Flow gél
Az 1. példából származó, Campath 1H antitestet tartalmazó szövettenyésztő táptalajt sterilre szűrünk egy 0,2 μιη-es steril Sealkleen házban levő PÁLL posidyne SLK7002 NFZP szűrőn. A Protein A oszloprendszer fertőtlenítésére használt 2% hibitán-glükonát tartalmú 20 %-os etanolt desztillált vízzel eltávolítjuk, majd a rendszert TRIS-szel puffereit sóoldattal (pH=7,5) (T.B.S) hozzuk egyensúlyba. A Protein A oszlopra ezután
1,75 liter nyers Campath 1H oldatot viszünk (71,4 mg) 300 cm/óra (235 ml/óra) áramlási sebességgel, 20±5°C-os hőmérsékleten. A megkötetlenül maradt anyagot lemossuk az oszloprendszerről 5 ágytérfogatnyi T.B.S oldattal (pH=7,5) (39,25 ml), ugyanezzel az áramlási sebességgel. A Protein A gélt 300 cm/óra elúciós sebességgel eluáljuk szobahőmérsékleten, 0,1 mól citromsavval (pH=3,0) <24 óra alatt. Az elúciós profilt 280 nm-en mérjük, Pharmacia UV1 egyutas monitort alkalmazva, majd a fehérje csúcsot izoláljuk. Az elúciós csúcs térfogata 18,9 ml, ebből 1 ml-t eltávolítunk, és ELISA-val megmérjük a Campath 1H tartalmát (lásd az alábbiakban).
S. Sepharose Fást Flow gél
Az 1 mol/1 NaOH-t 20 mmol HEPES-sel (pH=7,5) mossuk ki az S.Sepharose oszlop rendszerből, egészen addig, amíg az oszlopról lejövő oldat pH-ja 7,5 nem lesz. A maradék 17,9 ml Protein A oszlop eluátumot 300 cm/óra (235 ml/óra) áramlási sebességgel felvisszük az oszlopra. A megkötetlen anyagot 7 ágytérfogat (55 ml) 20 mmol HEPES (pH=7,5) oldattal mossuk ki a rendszerből, azonos áramlási sebességgel. Az S.Sepharose gélt lépcsői elúcióval oldjuk le, 0,2 mól NaCl 20 mmol HEPES pufferben (pH=7,5) készült oldatával, 300 cm/óra áramlási sebességgel. Az elúciós csúcsot követéssel gyűjtjük össze, Pharmacia UV1 monitor alkalmazásával A280 nm-nél (2 mm-es • · · · • ·
- 30 úthossz 0,5 AUFS). Az eluátum gyűjtését körülbelül 20 %-os eltérésnél kezdjük, majd addig folytatjuk, amíg a a jel 70%-os eltérésig csökken. Az elúciós térfogat 10 ml, és ebből a mintából 1 ml-t használunk arra hogy ELIS módszerrel megmérjük benne a Campath 1H mennyiségét.
Superdex 200 gél
Az 1 mol/1 NaOH-t pH=7,2-es PBS-sel mossuk ki a Superdex oszloprendszerből, amíg a mosóié pH-ja 7,2 nem lesz. Az S Sepharose eluátum megmaradt 9 ml-ét a Superdex oszlopra visszük egy fecskendővel, Millipore GV szűrőn keresztül, majd a szűrőt 2 ml PBS (pH=7,2) pufferrel mossuk át. Az oszlopot PBSsel (pH=7,2) fejlesztjük ki, 30 cm/óra (60 ral/óra) áramlási sebesség mellett. A méretkizárásos csúcsokat Pharmacia UV1 monitorral követjük (A280 nm). Ahogy a csúcsok eluálódnak, a frakciókat sorba vesszük, hogy az aggregátumokat tartalmazó csúcsot elválasszuk a monomer csúcstól. A monomer csúcs frakció térfogat 17,6 ml.
Enzimhez kapcsolt immunszorbens vizsgálat (ELISA)
Ez egy standard szendvics enzim immunesszé, amelyben anti-humán IgG-t, amelyet immuntisztított kecske antiszérumból állítunk elő, kötünk a szilárd fázishoz mint befogó réteget. A befogott antigén (Campath 1H) kimutatását peroxidázzal jelzett kecske anti-humán IgG-vel végezzük. Ez egy soros vizsgálat, amelyet kazeint és hidrolizált zselatint tartalmazó pufferrel hígított Campath 1H mintákkal végzünk. Az inkubáció ideje 1,5 óra, a használt hőmérséklet 37°C. Tetrametil-benzidin (TMB) ···· · ·· ar> *· • · · ·· ··· · * kromogént plusz hidrogén-perxid szubsztrátot adunk hozzá, hogy felfedjük a kötött peroxidázt. Az optikai sűrűséget 450 nmendonukleáz határozzuk meg, és a Campath 1H koncentrációkat ismert koncentrációk alapján készített standard görbéről olvassuk le (3,9 ng-tól 250 ng-ig terjed a használt tisztított Campath 1H mennyisége).
A tisztított Campath 1H vizsgálata
A monomer csík fehérje tartalmát A280 nm-en határozzuk meg, 1,35-ös (esetleg 1,32-es) extinkciós koefficiens (E1^icm) alkalmazásával, és egy mintának HPLC méretkizárásos kromatográfiával meghatározzuk az aggregátum tartalmát. A megmaradó anyagot sterilre szűrjük egy Millipore Millex GV szűrőn (0,2 Mm pórusméret), majd 29 db 0,5 ml-es alikvot részre osztjuk steril Sarstedt csövekben. A minta csöveket 4°C-on tároljuk, de hat csövet -70°C-on tárolunk. A 4°C-on tárolt mintákat különböző vizsgálatokra küldjük, amelyeket az alábbi példákban részletezünk.
Eredmények
A Campath ELISA eredményeket az alábbi táblázatban mutatjuk be.
• ·
| Campath 1H | ||||
| Minta ELISA | A minta | A C1H összes | A következő | %-os |
| titer | térfogat | mennyisége | oszlopra | kinyerés/ |
| ml | mg-ban | vitt menny. | oszlop |
| Nyers | 40,8/xg/ml | 1750 | 71,4 | 71,4 ------ | |
| Protein | 4,2mg/ml | 18,9 | 79,4 | 75,4 | 111,2 |
| A eluátum | |||||
| S Sepha- | 6,4 mg/ml | 10,0 | 64,0 | 57,6 | 85,0 |
| rose eluátum | |||||
| Superdex | 2,5 mg/ml | 17,6 | 44,0 | 76,4 |
A három oszloprendszer után a teljes kinyerés 61,6%.
Endotoxin tartalom LAL vizsgálattal
Minta Eu/ml
Nyers 1,25
Superdex monomer csúcs <0,625
4. Példa
Szokványos SDS poliakrilamid gélelektroforézist végzünk egy horizontális 8-18%os Pharmacia Excelgel-en. Az eredmények a 2. ábrán láthatók.
5. Példa
A Campath 1H jellemzése fordított fázisú HPLC-vel
A 3. példában előállított termékből egy 50 gliter-es mintát (jele G-Dev-95), amely foszfáttal puffereit sóoldatban • · ···· · ·· ·· • · · · · ··· · ·
- 33 (PBS) van 2,4 mg/ml koncentrációban oldva, fordított fázisú HPLC vizsgál atnak vetjük alá, az alábbi körülmények között:
Oszlop: PLRP-S 1000°A (pórusméret) ; 8 μτπ (részecskeméret) ; 15 x 0,46 cm a Polymer Laboratories Ltd-től (Anglia).
A mobil fázis egy hangyasav/víz/acetonitril rendszer:
A komponens - hangyasav:víz (5:3)
B komponens - CH3CN az alábbi gradiensben:
| % | A | 80 | 80 | 65 | 0 | 0 | 80 | 80 |
| % | B | 20 | 20 | 35 | 100 | 100 | 20 | 20 |
| Idő | (perc) | 0 | 5 | 38 | 41 | 50 | 51 | 65 |
Az elválasztást szobahőmérsékleten végezzük 1 ml/perc áramlási sebességgel és UV detektálással változtatható hullámhosszú LDC Spectro Monitor D-n 280 nm-en, 0,1 a.u.f.s. érzékenység mellett.
Eredmények
Amint az a 3. ábrán látható, az előző rendszer alkalmazásával a Campath 1H kromatográfiája egyetlen éles csúcsot ad. A 30 perc után eluálódó csúcsok a mobil fázis következményei.
6. Példa
A redukált és karboximetilezett Campath 1H jellemzése fordított fázisú HPLC-vel
6a. A Campath 1H redukciója és karboximetilezése
A Campath ΙΗ-t redukálhatjuk az alkotó nehéz és könnyű • · »
- 34 ~ láncokra, standard redukciós és karboximetilezési eljárások alkalmazásával, amelyek először redukálják a diszulfid hidakat, majd megakadályozzuk az újból való kialakulásukat azzal, hogy a szabad tiol csoportokat alkilezzük.
A 3. példában előállított 1 ml Campath 1H G Dev-95 mintához, amely foszfáttal puffereit sóoldatban van 2,4 mg/ml koncentrációban, 1 ml 8 mólos guanidium-kloridot adunk, amely 0,5 mól TRIS-HC1 pH=9,0 pufferben van oldva, és emellett 120 Mliter 7%-os ditiotreitolt tartalmaz. Az elegyet két óra hosszat 37°C-on inkubáljuk.
Az inkubálás után 120 μΙϊΰθΓ 9%-os jód-ecetsavat (0,5 mólos TRIS-HC1 pufferben) adunk hozzá, és az elegyet sötétben hagyjuk állni egy óra hosszat. A keletkező redukált karboximetilezett anyag jelzése Campath 1H RCM.
6b A Campath 1H RCM jellemzése fordított fázisú HPLC-vel
A 6. példában előállított 30 ^liter anyagot fordított fázisú HPLC-nek vetjük alá, az alábbi körülmények között:
Oszlop: PLRP-S 1000°A (pórusméret); 8 pm (részecskeméret); 15 x 0,46 cm a Polymer Laboratories Ltd-től (Anglia).
A mobil fázis egy hangyasav/víz/acetonitril gradienst alkalmaz, amelyet az alábbi táblázatban ismertetünk:
A=hangyasav
B=víz
C=acetonitril
| % | A | 50 | 50 | 29,4 | 0 | 0 | 50 | 0 |
| % | B | 35 | 35 | 20,6 | 0 | 0 | 35 | 35 |
| % | C | 15 | 15 | 50 | 100 | 100 | 15 | 15 |
| Idő (perc) | 0 | 5 | 70 | 72 | 82 | 82,1 | 95 |
Eredmények
Amint az a 4. ábrán látható, a keletkező anyag két csúcsra bontható, amelyek megfelelnek a nehéz és könnyű láncoknak.
7. Példa
A Campath 1H jellemzése nagynyomású méretkizárásos kromatográfiával, a Campath ΙΗ-ban levő nagy molekulasúlyú komponensek meghatározására jiliter, a 3. példából származó (G-Dev-95) mintát (foszfát puffer, 2,4 mg/ml) nagynyomású méretkizárásos kromatográfiának vetjük alá, az alábbi körülmények között:
Oszlop - TSK gél G3000 SW x 1 30 cm x 0,78 cm i.d.
Mobil fázis - 0,05 mól Na2HPŰ4 +0,1 mól Na2SO4, pH-ja
H3PO4-gyel 6,8-ra állítva
Áramlási sebesség - 0,75 ml/perc
Az oszlopot 20 percig futtatjuk szobahőmérsékleten, és az UV abszorbanciát követjük 280 nm-endonukleáz.
Egy második 50 ;iliter-es mintát is elemzünk az előzőkben leírt módon, azzal a különbséggel, hogy redukált CampethiH-t tartalmaz.
Eredmények: Az 5. ábrán látható eredmények azt mutatják, hogy egyetlen tiszta csúcsot lehet kimutatni, ami az aggregátumok alacsony szintjére utal. 0,5-2,0 % közötti szintet lehet általában elérni. A 6. ábrán látható eredmények két fő csúcsot mutatnak, ami megfelel annak, hogy nehéz és könnyű lánc van jelen, a várt arányban. A teljes áthatolási térfogatnál (körülbelül 15-18 perc) megfigyelt csúcsok a reagenseket mutatják.
A tisztított Campath 1H biológiai vizsgálatai
A Campath 1H komplement lízise
A komplement lízis a specifikus aktivitásban kifejezett antitest funkció mértéke, amit úgy lehet meghatározni, hogy az anti-CDW52 antitest tisztított készítményét ismert koncentrációban hagyjuk kötődni előre meghatározott számú sejthez, és vizsgáljuk a sejt lízist.
A vizsgálatot Campath ΙΗ-val végezzük Karpas 422 sejteken (B-sejt non-Hodgkin limfóma sejtvonalból lett létrehozva) [Dyer et al., Blood, 75, 704-714 (1990)], amelyek Campath antigént expresszálnak a sejt felszínén. l,2xl07 sejtet látunk el radioaktív jelöléssel, olymódon hogy 2 óra hosszat 37°C-on inkubáljuk egy CO2 inkubátorban, 600 mCí 51Cr (nátriumkromát) jelenlétében.
A táptalajban levő jelzett sejtekből (össztérfogat 23,5 ml) 5,3 ml-t adunk normál emberi szérumhoz, és az elegyből 150 μΐΐίθ^ pipettázunk egy mikrotiter lemez lukaiba.
A három tisztítási lépés után keletkező végső eluátumból 50 μΙΐίθΓθε mintákat keverünk össze a sejtekkel, majd 30 percig inkubáljuk 4°C-on, majd 90 percig 37°C-on. A tenyészetet 5 percig centrifugáljuk 2000/perc fordulatszámmal, majd 100 μΙϊίβΓ sejt felülúszó radioaktivitását egy gamma számlálóval meghatározzuk. A komplemet lízis aktivitást kilo egység/ml-ben egy referencia készítménnyel készített (1000 egység/ml) standard görbe alapján határozzuk meg.
Az eredmények a 3. tálázatban láthatók.
A végső eluátumok 50 μΙίίθΓβε mintáiban a Campath 1H koncentrációját PBS pH=7,2-ben, spektrofotométerrel 280 nm-en • 9 9 99 ··
- 37 leolvasott adatok alapján határozzuk meg. A eredményeket a 3. táblázatban optikai sűrűség formájában fejezzük ki.
Ezekből az adatokból a kilo egység/mg formájú specifikus aktivitást a KU/ml/OD egyenlet alapján határozzuk meg.
3. Táblázat
Minta Komplement lízis Fehérje Specifikus aktivitás
| Kilo egység/ml | konc, mg/ml | Kilo egységekben | |
| A | 11,2 | 11,1 | 1,0 |
| B | 14,8 | 14,2 | 1,0 |
| C | 13,7 | 13,6 | 1,0 |
Az eredmények azt mutatják, hogy a Campath 1H tisztított készítmények működőképesek.
Claims (19)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Eljárás egy anti-CDW-52 antitest tisztítására, azzal jellemezve, hogy az antitest vizes oldatát a következő lépéseknek vetjük alá:a) egy Protein A oszlopra visszük az antitestnek az oszlopra való kötése céljából, majd az antitestet savas oldattal eluáljuk;b) a savas eluátumot egy töltött részecskéket tartalmazó ioncserélő oszlopra visszük az antitestek abszorbeálására, majd az antitestet ellentétes töltésű ionokkal eluáljuk;c) a vizes eluátumot egy porózus részecskéket tartalmazó méretkizárásos oszlopra visszük, hogy a nem-antitest molekulák abszorbeálódjanak a porózus részecskékbe, és a keresett antitestet az oszlopon képződő, kiválasztott frakciókban megkapjuk.
- 2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Protein A oszlopot savas pH-η eluáljuk.
- 3. A 2. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Protein A oszlopot citromsavval eluáljuk.
- 4. Az 1-3 igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a Protein A oszlop egy Sepharose oszlop.
- 5. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ioncserélő oszlop egy kationcserélő oszlop.
- 6. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az ioncserélő oszlop egy anioncserélő oszlop.
- 7. Az 1-6 iénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy hogy az antitestet szérummentes táptalajban ···· állítjuk elő.
- 8. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy rekombináns antitest.
- 9. A 8. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy megváltoztatott antitest.
- 10. A 9. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest egy CDR-graftolt antitest.
- 11. Az 1-7. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy az antitest humán antitest.
- 12. Eljárás egy anti-CDW52 antitest készítményt tartalmazó kiszerelési forma előállítására, azzal jellemezve, hogy az antitestet az 1-7. igénypontok bármelyike szerint állítjuk elő, majd egy fiziológiásán elfogadható hordozóval vág hígítóval keverjük össze.
- 13. A 12. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a készítményt liofilezzük.
- 14. A 12. vagy 13. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiszerelési forma alkalmas parenterális vagy szubkután adagolásra.
- 15. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiszerelési formát immunszuppressziós célra használjuk.
- 16. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiszerelési formát T-sejtek által közvetített rendellenességek kezelésére használjuk.
- 17. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiszerelési formát autoimmun rendellenességek kezelésére használjuk.*··· • Μ» ·* «· • · · · · · · « · · ·· ··« »*
- 18. A 12-14. igénypontok bármelyike szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiszerelési formát rákos megbetegedések kezelésére használjuk.
- 19. A 18. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a kiszerelési formát non-Hodgkin limfóma vagy leukémia kezelésére használjuk.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GB909022547A GB9022547D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-10-17 | Purified immunoglobulin |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9202000D0 HU9202000D0 (en) | 1992-10-28 |
| HUT64601A true HUT64601A (en) | 1994-01-28 |
Family
ID=10683866
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9202000A HUT64601A (en) | 1990-10-17 | 1991-10-17 | Method for producing purified immunoglobulin |
Country Status (29)
| Country | Link |
|---|---|
| US (1) | US5644036A (hu) |
| EP (1) | EP0504363B2 (hu) |
| JP (1) | JP2638680B2 (hu) |
| KR (2) | KR960015399B1 (hu) |
| AT (2) | ATA900791A (hu) |
| AU (3) | AU658926B2 (hu) |
| BE (1) | BE1004226A5 (hu) |
| BR (1) | BR1100358A (hu) |
| CA (1) | CA2069481C (hu) |
| CH (2) | CH681305A5 (hu) |
| DE (1) | DE69128774T3 (hu) |
| DK (1) | DK0504363T4 (hu) |
| ES (2) | ES2081742B1 (hu) |
| FI (2) | FI110003B (hu) |
| FR (2) | FR2668164A1 (hu) |
| GB (2) | GB9022547D0 (hu) |
| GR (3) | GR910100425A (hu) |
| HU (1) | HUT64601A (hu) |
| IE (1) | IE913560A1 (hu) |
| IL (3) | IL102726A (hu) |
| IT (1) | IT1250064B (hu) |
| LU (1) | LU88122A1 (hu) |
| MX (1) | MX9203794A (hu) |
| MY (2) | MY119030A (hu) |
| NZ (2) | NZ240247A (hu) |
| PT (2) | PT99248B (hu) |
| TW (1) | TW283710B (hu) |
| WO (1) | WO1992007084A1 (hu) |
| ZA (2) | ZA926191B (hu) |
Families Citing this family (53)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB9022545D0 (en) | 1990-10-17 | 1990-11-28 | Wellcome Found | Culture medium |
| CA2120911A1 (en) * | 1991-10-15 | 1993-04-29 | Geoffrey Hale | Medicaments |
| GB9125768D0 (en) * | 1991-12-04 | 1992-02-05 | Hale Geoffrey | Therapeutic method |
| GB9300501D0 (en) * | 1993-01-09 | 1993-03-03 | Wellcome Found | Purification of immunoglobulin |
| EP0841942B2 (fr) † | 1995-08-01 | 2007-12-12 | Sanofi Pasteur | Procede de production industrielle d'un vaccin contre l'encephalite japonaise et vaccin obtenu |
| US6090382A (en) * | 1996-02-09 | 2000-07-18 | Basf Aktiengesellschaft | Human antibodies that bind human TNFα |
| BRPI9715219B8 (pt) | 1996-02-09 | 2015-07-07 | Abbvie Biotechnology Ltd | Vetor recombinante de expressão, e célula hospedeira procariótica. |
| GB9603256D0 (en) * | 1996-02-16 | 1996-04-17 | Wellcome Found | Antibodies |
| US20030023043A1 (en) * | 2000-03-02 | 2003-01-30 | Kazuhisa Uchida | Method of separating and purifying protein |
| WO2002072615A1 (fr) * | 2001-03-09 | 2002-09-19 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | Methode de purification de proteines |
| ATE421536T1 (de) * | 2001-06-05 | 2009-02-15 | Genetics Inst Llc | Verfahren zur reinigung stark anionischer proteine |
| GB0220894D0 (en) * | 2002-09-09 | 2002-10-16 | Millipore Uk Ltd | Method of separation |
| JP5525118B2 (ja) | 2002-09-11 | 2014-06-18 | 中外製薬株式会社 | タンパク質精製方法 |
| AU2003274011B2 (en) | 2002-10-15 | 2010-03-04 | Intercell Ag | Nucleic acids coding for adhesion factor of group B streptococcus, adhesion factors of group B streptococcus and further uses thereof |
| GB0304576D0 (en) * | 2003-02-28 | 2003-04-02 | Lonza Biologics Plc | Protein a chromatography |
| CA2548947A1 (en) * | 2003-12-22 | 2005-07-14 | Genzyme Corporation | Anti-cd52 antibody treatment for diabetes |
| DK1869065T3 (da) | 2005-03-11 | 2020-06-08 | Wyeth Llc | Fremgangsmåde til kromatografi med svag opdeling |
| PL2275443T3 (pl) | 2008-04-11 | 2016-05-31 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Cząsteczka wiążąca antygen zdolna do wiązania dwóch lub więcej cząsteczek antygenu w sposób powtarzalny |
| MX342907B (es) | 2009-05-13 | 2016-10-17 | Genzyme Corp * | El uso de un anticuerpo anti-cd52 monoclonal para el tratamiento de lupus. |
| CN102459628A (zh) | 2009-05-13 | 2012-05-16 | 基酶有限公司 | 抗人cd52 免疫球蛋白 |
| EP2519536A4 (en) * | 2009-12-29 | 2013-06-05 | Reddys Lab Ltd Dr | PROTEIN PURIFICATION BY ION EXCHANGE |
| EP2583973B1 (en) | 2010-06-21 | 2018-03-21 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method for purifying protein using amino acid |
| RU2467783C2 (ru) * | 2010-07-30 | 2012-11-27 | Закрытое акционерное общество "БиоХимМак СТ" | Способ хроматографического выделения иммуноглобулина |
| MX365235B (es) | 2010-11-30 | 2019-05-28 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Molécula de unión a antígeno capaz de unir repetidamente a la pluralidad de moléculas de antígeno. |
| EP2702077A2 (en) | 2011-04-27 | 2014-03-05 | AbbVie Inc. | Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins |
| GB201109238D0 (en) * | 2011-06-01 | 2011-07-13 | Antitope Ltd | Antibodies |
| US9067990B2 (en) | 2013-03-14 | 2015-06-30 | Abbvie, Inc. | Protein purification using displacement chromatography |
| WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
| US9150645B2 (en) | 2012-04-20 | 2015-10-06 | Abbvie, Inc. | Cell culture methods to reduce acidic species |
| US9249182B2 (en) | 2012-05-24 | 2016-02-02 | Abbvie, Inc. | Purification of antibodies using hydrophobic interaction chromatography |
| US9650411B2 (en) | 2012-08-07 | 2017-05-16 | Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. | Method of purifying protein |
| US9512214B2 (en) | 2012-09-02 | 2016-12-06 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| US9206390B2 (en) | 2012-09-02 | 2015-12-08 | Abbvie, Inc. | Methods to control protein heterogeneity |
| CA2905010A1 (en) | 2013-03-12 | 2014-09-18 | Abbvie Inc. | Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same |
| WO2014151878A2 (en) | 2013-03-14 | 2014-09-25 | Abbvie Inc. | Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides |
| WO2014159579A1 (en) | 2013-03-14 | 2014-10-02 | Abbvie Inc. | MUTATED ANTI-TNFα ANTIBODIES AND METHODS OF THEIR USE |
| US9017687B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-04-28 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography |
| AR095199A1 (es) | 2013-03-15 | 2015-09-30 | Genzyme Corp | Anticuerpos anti-cd52 |
| AU2013203043B2 (en) | 2013-03-15 | 2016-10-06 | Takeda Pharmaceutical Company Limited | Methods to produce a human plasma-derived igg preparation enriched in brain disease-related natural iggs |
| EP3052640A2 (en) | 2013-10-04 | 2016-08-10 | AbbVie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
| US9085618B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-07-21 | Abbvie, Inc. | Low acidic species compositions and methods for producing and using the same |
| US8946395B1 (en) | 2013-10-18 | 2015-02-03 | Abbvie Inc. | Purification of proteins using hydrophobic interaction chromatography |
| US9181337B2 (en) | 2013-10-18 | 2015-11-10 | Abbvie, Inc. | Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same |
| WO2015073884A2 (en) | 2013-11-15 | 2015-05-21 | Abbvie, Inc. | Glycoengineered binding protein compositions |
| JP6722455B2 (ja) | 2013-12-27 | 2020-07-15 | 中外製薬株式会社 | 等電点の低い抗体の精製方法 |
| KR102650420B1 (ko) | 2014-12-19 | 2024-03-21 | 추가이 세이야쿠 가부시키가이샤 | 항-마이오스타틴 항체, 변이체 Fc 영역을 함유하는 폴리펩타이드, 및 사용 방법 |
| WO2017022651A1 (ja) | 2015-07-31 | 2017-02-09 | 中外製薬株式会社 | アニオン性ポリマーによる抗体を含有する組成物の精製方法 |
| US10688412B2 (en) | 2016-07-25 | 2020-06-23 | Cehpalon, Inc. | Affinity chromatography wash buffer |
| EP3494991A4 (en) | 2016-08-05 | 2020-07-29 | Chugai Seiyaku Kabushiki Kaisha | COMPOSITION FOR PREVENTING OR TREATING DISEASES RELATING TO IL-8 |
| US20220177518A1 (en) | 2019-03-29 | 2022-06-09 | Asahi Kasei Medical Co., Ltd. | Method for purifying protein |
| CN113692420B (zh) | 2019-04-08 | 2023-09-12 | 旭化成医疗株式会社 | 用于纯化含蛋白质的溶液的聚酰胺介质及其制造方法 |
| SG11202110986YA (en) | 2019-04-10 | 2021-11-29 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Method for purifying fc region-modified antibody |
| WO2022260091A1 (ja) | 2021-06-10 | 2022-12-15 | 三菱ケミカル株式会社 | 合成吸着剤、抗体の精製方法及び抗体の製造方法 |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US5118796A (en) * | 1987-12-09 | 1992-06-02 | Centocor, Incorporated | Efficient large-scale purification of immunoglobulins and derivatives |
| AU618989B2 (en) * | 1988-02-12 | 1992-01-16 | British Technology Group Limited | Improvements in or relating to antibodies |
-
1990
- 1990-10-17 GB GB909022547A patent/GB9022547D0/en active Pending
-
1991
- 1991-10-16 ZA ZA926191A patent/ZA926191B/xx unknown
- 1991-10-16 IL IL10272691A patent/IL102726A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 NZ NZ240247A patent/NZ240247A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 PT PT99248A patent/PT99248B/pt not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 MY MYPI91001909A patent/MY119030A/en unknown
- 1991-10-16 NZ NZ244114A patent/NZ244114A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 GR GR910100425A patent/GR910100425A/el unknown
- 1991-10-16 IE IE356091A patent/IE913560A1/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 FR FR9112738A patent/FR2668164A1/fr active Granted
- 1991-10-16 BE BE9100946A patent/BE1004226A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 ZA ZA918259A patent/ZA918259B/xx unknown
- 1991-10-16 IT ITRM910788A patent/IT1250064B/it active IP Right Grant
- 1991-10-16 TW TW080108178A patent/TW283710B/zh not_active IP Right Cessation
- 1991-10-16 MY MYPI92001385A patent/MY136210A/en unknown
- 1991-10-16 IL IL99761A patent/IL99761A0/xx unknown
- 1991-10-17 DK DK91917891T patent/DK0504363T4/da active
- 1991-10-17 HU HU9202000A patent/HUT64601A/hu unknown
- 1991-10-17 JP JP3516509A patent/JP2638680B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 WO PCT/GB1991/001816 patent/WO1992007084A1/en active IP Right Grant
- 1991-10-17 ES ES09250029A patent/ES2081742B1/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 KR KR1019920701427A patent/KR960015399B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1991-10-17 CH CH1901/92A patent/CH681305A5/fr not_active IP Right Cessation
- 1991-10-17 DE DE69128774T patent/DE69128774T3/de not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 AT AT0900791A patent/ATA900791A/de not_active Application Discontinuation
- 1991-10-17 ES ES91917891T patent/ES2112865T5/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 AT AT91917891T patent/ATE162552T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-17 EP EP91917891A patent/EP0504363B2/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 CA CA002069481A patent/CA2069481C/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-17 CH CH2655/92A patent/CH681455A5/fr not_active IP Right Cessation
-
1992
- 1992-02-28 GB GB9209529A patent/GB2253397A/en not_active Withdrawn
- 1992-05-25 FI FI922380A patent/FI110003B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-05-27 LU LU88122A patent/LU88122A1/xx unknown
- 1992-06-17 FI FI922824A patent/FI110002B/fi not_active IP Right Cessation
- 1992-06-29 MX MX9203794A patent/MX9203794A/es unknown
- 1992-08-04 IL IL102726A patent/IL102726A0/xx unknown
- 1992-08-13 FR FR9209998A patent/FR2677997A1/fr not_active Withdrawn
- 1992-09-23 AU AU25321/92A patent/AU658926B2/en not_active Expired
- 1992-10-20 PT PT100988A patent/PT100988B/pt not_active IP Right Cessation
- 1992-10-20 GR GR920100471A patent/GR920100471A/el unknown
- 1992-10-30 KR KR1019920702699A patent/KR100193314B1/ko not_active IP Right Cessation
-
1994
- 1994-08-11 AU AU70242/94A patent/AU7024294A/en not_active Abandoned
- 1994-10-07 US US08/319,598 patent/US5644036A/en not_active Expired - Lifetime
-
1997
- 1997-04-28 BR BR1100358-8A patent/BR1100358A/pt active IP Right Grant
- 1997-11-13 AU AU45218/97A patent/AU716402B2/en not_active Expired
-
1998
- 1998-04-10 GR GR980400777T patent/GR3026588T3/el unknown
Also Published As
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| HUT64601A (en) | Method for producing purified immunoglobulin | |
| IE84931B1 (en) | Purified IgG Antibodies | |
| CA2053585C (en) | Antibody production in chinese hamster ovary cells | |
| CA2330170C (en) | Process for producing immunoglobulins for intravenous administration and other immunoglobulin products | |
| US5750106A (en) | Human monoclonal antibodies to cytomegalovirus | |
| CN116547298A (zh) | 猫抗体恒定区中的突变 | |
| KR102578087B1 (ko) | 숙주세포 갈렉틴(galectins) 및 다른 오염물(contaminant)로부터 글리코실화 단백질을 정제하는 방법 | |
| AU649078C (en) | Purified CDW52-specific antibodies | |
| JP4249028B2 (ja) | 蛋白質の活性化方法 | |
| Hanashiro et al. | Production of a monoclonal dinitrophenyl-specific rat IgE and establishment of an IgE capture ELISA for estimating the concentration of rat IgE antibodies to dinitrophenyl-Ascaris suum | |
| WO1994015950A1 (en) | Purification of immunoglobulin | |
| NZ795260A (en) | Manufacturing Optimization of GL-2045, a Multimerizing Stradomer | |
| Kanoksilapatham | Production of anti-leukemic monoclonal antibodies |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFC4 | Cancellation of temporary protection due to refusal |