JP4249028B2 - 蛋白質の活性化方法 - Google Patents
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Description
技術分野
本発明は、遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地を用いて生産する方法及びそれにより得られる蛋白質に関するものである。
背景技術
従来、遺伝子組換技術において動物細胞を宿主とし、蛋白質を生産するためには血清が必要である。血清は高価でかつロット間差が存在し、使用に際しては厳格なロット管理を行わなくてはならない。また、生体物質由来であるため、未知のウイルス等といった病原性伝播物質の混入が否定できないが、これら未知の病原性伝播物質の不活性化、除去は困難である。このため、医薬品用途に用いる蛋白質を生産する際には、血清を使用しない無血清培養を用いることが望ましい。
しかしながら、動物細胞培養の際に血清を使用しないと、細胞の機能維持に必要とされる成分の補給が十分に行えず、十分な有用蛋白質を確保できない場合が多い。また、生産される蛋白質が目的蛋白質と物理的、生化学的、生物学的に微妙に変化していることも想定され、血清を使用せずに培養を行い有用蛋白質の生産を行う際には、十分な注意が必要である。
ところで、一般に分子表面に出ている蛋白質の遊離のシステインのチオール基は、分子内で架橋を形成しているシステインのジスルフィド結合に比べて不安定で、弱い還元条件によって交換反応が起こるものと考えられる。
該チオール基が何らかの望ましくない修飾等を受けている場合、その交換反応を試みる際に、ジチオスレイトールや２−メルカプトエタノールのような強い還元剤を用いると、分子自体の立体構造がもとに戻らなくなる。このため、強い還元剤を用いる場合には、再現性良く特定の部分のみの反応を進めることは非常に困難である。
そこで、弱い還元剤のみの存在によって反応を行わせることが考えられるが、新たに分子間のジスルフィド結合が架橋を形成し重合体の形成が促進される怖れがある。
一方、高分子量の蛋白質に弱い還元処理を施す場合、塩基性の緩衝液中で行うだけでは分子の立体構造による障害により、目的のチオール基部分が試薬に十分さらされないことで、反応が不十分にしか進行しないことが考えられる。
そのため、従来の技術では、高濃度のグアニジン塩酸や尿素などの変性剤を系内に添加することで分子の変性を行い、通常の緩衝液中では分子表面に出にくい構造を試薬にさらす方法が行われている。
しかしながら、これらの強い変性剤は高分子の蛋白質に対して非特異的かつ不可逆的な副反応を起こし、分子構造の変化による分解物生成が引き起こされることになる。
これらの重合体、分解物などの副反応生成物の生成は、目的蛋白質を高純度で大量に得ようとする際に再現性、収率の点で問題となり、活性化された蛋白質を薬剤として利用しようとする場合には大きな障害となる。
発明の開示
本発明の課題は、血清培地において生産される蛋白質と同等の効果を有する蛋白質を、無血清培地で生産することにある。
そこで本発明者らは、反応条件の検討を重ね、反応生成物の解析を詳細に行い、かかる問題点を解決することにより、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
（１）遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地を用いて生産する方法であって、遊離のシステインを有する蛋白質が活性化されて生産されることを特徴とする方法。
（２）蛋白質生産時の蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分な還元剤の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（３）還元剤が、システインであることを特徴とする前記の方法。
（４）抗酸化剤の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（５）抗酸化剤が、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分な抗酸化剤であることを特徴とする前記の方法。
（６）抗酸化剤が、アスコルビン酸であることを特徴とする前記の方法。
（７）遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（８）遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムであることを特徴とする前記の方法。
（９）蛋白質が、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（１０）蛋白質が、組換体蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（１１）蛋白質が、抗体である前記のいずれかに記載の方法。
（１２）抗体が、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１３）抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１４）ヒトモノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１５）ヒトモノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１６）抗体が、Ｆ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１７）前記の方法を用いて、蛋白質を無血清培地を用いた培養によって生産する方法。
（１８）蛋白質が、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（１９）蛋白質が、組換体蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（２０）蛋白質が、抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２１）抗体の可変領域に遊離のシステインを有することを特徴とする前記の方法。
（２２）抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２３）抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２４）抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２５）抗体が、Ｆ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２６）不活性型として生産された遊離のシステインを有する蛋白質を活性化する方法であって、還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われることを特徴とする方法。
（２７）生産された蛋白質の蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分な還元剤の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（２８）還元剤が、システインであることを特徴とする前記の方法。
（２９）抗酸化剤が、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分な抗酸化剤であることを特徴とする前記の方法。
（３０）抗酸化剤が、アスコルビン酸であることを特徴とする前記の方法。
（３１）遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムであることを特徴とする前記の方法。
（３２）蛋白質が、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（３３）蛋白質が、組換体蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（３４）蛋白質が、抗体である前記の方法。
（３５）抗体が、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３６）抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３７）ヒトモノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３８）ヒトモノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３９）抗体がＦ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする前記の方法。
（４０）還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾の還元をしやすくする物質の添加を、抗体精製後のホール抗体存在時に行うことを特徴とする前記の方法。
（４１）前記の方法により得られた蛋白質。
（４２）蛋白質が、血清培地で得られる蛋白質と同等の理化学的性質又は生物学的性質を示すことを特徴とする前記の蛋白質。
（４３）前記の蛋白質を含む医薬組成物。
（４４）抗腫瘍剤であることを特徴とする前記の医薬組成物。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地で生産する方法であって、遊離のシステインを有する蛋白質が活性化されて生産されることを特徴とするものである。
このような方法の一例としては、遊離のシステインを有する蛋白質が活性化されるために、▲１▼還元剤、▲２▼抗酸化剤又は▲３▼遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われる方法が挙げられる。
このような方法においては、上記の▲１▼、▲２▼又は▲３▼の添加を各々単独で施しても良く、上記の２つの組み合わせ（▲１▼及び▲２▼、▲１▼及び▲３▼、又は▲２▼及び▲３▼）の添加を施すことがより好ましく、▲１▼、▲２▼及び▲３▼の全ての添加を施すのが最適である。
また、上記の▲１▼、▲２▼又は▲３▼は、蛋白質生産時のいずれの段階で存在しても良いが、本発明においては上記の▲１▼、▲２▼又は▲３▼を、無血清培地での培養の際に添加したり、結合活性が不活性型の蛋白質を活性型蛋白質に変換する際に添加するのが好ましく、結合活性が不活性型の蛋白質を活性型蛋白質に変換する際に添加するのがより好ましい。例えば、後述の実施例で示したＧＡＨ抗体で行う場合には、第１図に示す通り、無血清培地での培養、生産後、未精製バルクから精製したホール抗体の存在下の時点で添加することが挙げられる。
以下、▲１▼還元剤、▲２▼抗酸化剤、▲３▼遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質について詳述する。
本発明における還元剤としては、例えば蛋白質が抗体の場合には、強い還元剤を用いると抗体分子内の一部もしくは全てのジスルフィド結合が還元されてしまうので、比較的弱い還元剤が適している。すなわち本発明の還元剤は、蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分な還元剤であることがその条件を満たすものである。尚、本発明においては、例えば後述の実施例に記載の方法により本発明に適する還元の程度の判定が可能である。本発明の還元剤は特定の還元剤に限定されるものではないが、例えばシステインが最適である。好ましい一例として、活性型蛋白質への変換時に０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭ、より好ましくは１〜３ｍＭのＬ−システインを添加することが挙げられる。
また本発明における抗酸化剤としては、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を防止することができる抗酸化剤が挙げられる。本発明で用いられる抗酸化剤は、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分な抗酸化剤であることが好ましく、例えば後述の実施例に記載の方法により本発明に適する抗酸化剤の量を決定することが可能である。本発明の抗酸化剤は特定の抗酸化剤に限定されるものではないが、例えばアスコルビン酸が最適である。好ましい一例として、活性型蛋白質への変換時に１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜３０ｍＭ、より好ましくは１０〜２０ｍＭのアスコルビン酸を添加することが挙げられる。
一般的に還元剤とは、電子（水素原子）を与える作用のあるものを指すことから、抗酸化剤も、ジスルフィド結合を還元するという意味においては還元作用を有している（還元剤）ともとらえられる。しかしながら、上述の通り、本発明の還元剤とは、蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分であるものがその条件を満たすものである。また本発明の抗酸化剤とは、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分であることがその条件を満たすものである。
また本発明は、遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われる。本発明で用いられる遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質は、蛋白質が分子構造の変化による分解物生成をおこさない程度に蛋白質分子の柔軟性を増強させ蛋白質分子をときほぐし、蛋白質の遊離のシステイン（チオール基部分）を分子表面にさらけ出すことができる物が好ましい。
遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質としては特定の物質に限定されるものではないが、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムなどの１酸塩基塩が好ましい。具体的には、約０．１〜４Ｍ、好ましくは約０．２５〜３Ｍ、より好ましくは約０．８〜２Ｍの比較的高濃度の塩化ナトリウム等を存在させることが好ましい。このような条件にすることで、副反応はほとんど起こらない。さらに、蛋白質分子の柔軟性が増強され、還元される遊離のシステインは反応にさらされる確率が高くなり、蛋白質の活性型への変換が効率良く行われることになる。その結果、再現性良く反応を進めることができ、分解物の生成が極めて低く抑えられることから、有用蛋白質の調製には特に有用な方法である。
さらに本発明は、培養に先立って無血清培養液中に上述の▲１▼、▲２▼又は▲３▼の試薬を加えることも可能である。例えば▲１▼の還元剤の場合には、培養液中に終濃度０．１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭになる様にＬ−システインをさらに加えて培養することにより、同様な効果を得ることもできる。このような方法により、遊離のシステインへの培地中成分による修飾を防ぎ、活性型の蛋白質を直接培地中に生産させ、これを精製後に直ちに用いることも問題点を解決するための有用な手段のひとつである。
また本発明においては、不活性型として生産された遊離のシステインを有する蛋白質を活性化する方法であって、不活性型として生産された蛋白質が生産された後に上述の▲１▼、▲２▼又は▲３▼の試薬による処理を行うことを特徴とする方法もその要旨として挙げられる。
ここで用いられる還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質としては、前述の定義の通りである。
本発明の生産方法及び活性化方法において用いられる培地としては、培地成分中に牛（胎児）血清などの血清を含まない無血清培地が挙げられる。一例として、本実施例に記載のような無血清培地ＣＤ ＣＨＯ（インビトロジェン社）及びＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）などが挙げられる。尚、本発明の活性化方法においては、不活性型として蛋白質が生産される培地であれば、上記の無血清培地に限定されることなく、血清培地でも良い。血清培地の血清濃度としては、不活性型の蛋白質が生産される濃度であれば特に限定されないが、例えば約５％以下が挙げられる。
本発明の対象となる蛋白質は、その分子構造内に遊離のシステインを有しているのが特徴である。また、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質である。遊離（状態）とは、一般に不対電子をもち、比較的不安定で、反応性に富んだ状態を指し、システインの場合にはそのチオール基部分が反応性に富む。遊離のシステイン、特にそのチオール基部分は蛋白質の結合活性に関与している場合があり、特に蛋白質が抗体の場合は、可変領域に存在する遊離のシステイン、特にそのチオール基部分は抗原との結合活性に関与していると考えられる。具体的には、抗体であることが好ましく、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体が好ましい。より好ましくはモノクローナル抗体であり、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、医薬としてヒトに投与する場合、異種動物の蛋白質ではない点で有利である。
本発明で対象となるヒトモノクローナル抗体の一例としては、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。これらのアミノ酸配列は、通常、重鎖及び軽鎖の各鎖の３つの超可変領域に、Ｎ末端側から、配列番号１、２及び３ならびに配列番号４、５及び６の順でそれぞれ含まれる。超可変領域は、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、抗原との結合活性（反応性）を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明において使用できるヒトモノクローナル抗体に含まれる。
より具体的には、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、すなわちＧＡＨ抗体が挙げられる。ＧＡＨ抗体とは、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされた癌に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体であり（特開平４−３４６９１８号及び特開平５−３０４９８７号各号公報）、この抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択することによって得ることができるし、遺伝子工学的な手法により作製することもできる（特開平５−３０４９８７号公報）。
かかるＧＡＨ抗体においては公知のヒト抗体のアミノ酸配列におけるシステインの位置と比較して、配列表の配列番号７における３２番目のシステインに特徴がある。即ち、これは分子内でのジスルフィド結合形成には関与しない遊離のシステインと推定される。該システイン残基は配列表の配列番号１に示した配列中の４番目のアミノ酸に相当し、重鎖の超可変領域に位置することから、抗原との結合活性に関与していると考えられる。
発明の対象となる抗体としては、Ｆ（ａｂ’）２化抗体が最適であるが、ホール抗体（全長抗体、抗体全体）、抗体断片（抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）など）、又は抗体誘導体なども含まれる。
本発明により活性化された蛋白質、とりわけモノクローナル抗体を特に薬剤として用いようとする場合、ホール抗体の他、Ｆ（ａｂ’）２化した抗体を用いる場合も考えられる。
しかしながら、最終目的物であるＦ（ａｂ’）２化抗体に対して、還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下で本発明の方法を施す場合、２つのＦ（ａｂ’）間を架橋するジスルフィド結合部分の結合強度が立体的に弱いことから、本発明の弱い還元条件における処理によっても容易に還元される分子が存在し、このため二分子のＦ（ａｂ’）が生成されてしまうことが考えられる。このようなＦ（ａｂ’）の生成を避けるため、Ｆ（ａｂ’）２化抗体を最終目的物とする場合は、抗体精製後のホール抗体の段階で本発明の方法を行うことが有効である。すなわち、ホール抗体の段階ではＦｃ部分の架橋及び立体構造が比較的安定であるため、本発明の方法によって容易に１価抗体へと還元はされない。そこでホール抗体の段階で結合活性に関与するチオール基部分のみ活性型に変換し、その後ペプシン消化によりＦ（ａｂ’）２化を行うことで活性型Ｆ（ａｂ’）２化抗体を取得することにより、かかる問題点を克服できる。
本発明の方法で得られる蛋白質は、血清培地で得られる蛋白質と同等の理化学的性質又は生物学的性質を有する。
本発明において、蛋白質の理化学的性質を測定する方法としてはイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（イオン交換ＨＰＬＣ）を用いることが好ましく、後述する実施例中の条件を用いることがより好ましい。この発明において同等の性質とは、活性のある標準品と比較して、メインのピークが標準品と同等のリテンションタイムに観察されることである。標準品のピークが複数ある場合は、１つ或いは複数のピークが標準品と同等のリテンションタイムに観察されることである。後述の実施例で説明すると、標準品として血清培地で得られた活性のある抗体を用い、ＧＡＨ抗体と同等のリテンションタイムにメインのピークが観察されることである。具体的には、ＧＡＨホール抗体に於いては、後述する第７図に示すように約１５．５分、約１７．５分、約２２分にピークが観察されることである。また、Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体に於いては、後述する第１２図に示すように約１５分、約１７分、約２１．５分にピークが観察されることである。このリテンションタイムはあくまでも目安であり、分析機器の違い等によって変化することは充分に起こり得うることであり、同等性は同条件で分析を実施し、標準品との比較の結果判定されるものである。
本発明において、生物学的性質を測定する方法としては固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）による結合活性を用いることが好ましく、後述する実施例中の条件を用いることがより好ましい。この発明において同等の性質とは、標準品と比較して、その活性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％以上に回復していることである。
本発明は、前述の抗体をはじめ、本発明の方法で得られた蛋白質を有効成分として含有する医薬、例えば上記物質と薬学的に許容しうる担体とからなる医薬組成物を提供し、種々の形態の治療用製剤を提供する。薬学的に許容しうるとは、悪心、目眩、吐き気等投与に伴う望ましくない副作用、頻回投与時の製剤に対する免疫応答などがおきないことを意味する。さらに、本発明の蛋白質に例えば毒素等の物質を結合させた抗体も医薬品として使用可能である。例えば、ドキソルビシン等の抗腫瘍剤等の薬剤を封入したリポソーム等に抗体等の蛋白質を結合させたものを挙げることもできる（特開平４−３４６９１８号、特開平５−３０４９８７号及びＷＯ００／６４４１３号各号公報）。抗体が結合した腫瘍性物質含有リポソームは、公知の方法、例えば、脱水法（特表平２−５０２３４８号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭６４−９３３１号公報）、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号公報）等により製剤化することができ、血管内投与、局所投与などの方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の抗腫瘍性物質の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを投与する場合には、有効成分量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
実施例
以下の実施例により、本発明をさらにより詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り以下の実施例によって限定されるものではない。
実施例１ 無血清培養によるＧＡＨ抗体のホール抗体（以下、ＧＡＨホール抗体と称する）の培地中への生産
無血清培地ＣＤ ＣＨＯ（インビトロジェン社）及びＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）１Ｌにそれぞれ４ｍｍｏｌのグルタミン（ＳＩＧＭＡ社）、１０ｍｇのインシュリン（ＳＩＧＭＡ社）を溶解し０．２２μｍボトルトップフィルター（コーニング・コースター社）で無菌ろ過を行い細胞培養培地を調製した。調製した細胞培地を予め高圧蒸気滅菌器（サクラ精機社）で滅菌しておいた１Ｌスピンナーフラスコ（Ｂｅｌｃｏ社）に無菌的に仕込み培養制御装置（バイオット社）に設置し、温度３７℃、溶存酸素濃度３．０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．４、攪拌回転数６０ｒｐｍに調製を行った。
予めローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ社）で培養しておいた遺伝子組換ＧＡＨ抗体産生ＣＨＯ細胞１−６Ｒ（特開平５−３０４９８７号公報実施例参照）にトリプシンを作用させ細胞を剥離し、遠心後上清を廃棄し、それぞれの無血清培地で細胞を２回洗浄して、種細胞とした。その後、それぞれの無血清培地に懸濁し、無菌的に１Ｌスピンナーフラスコに細胞を播種し、培養を開始した。播種後、サンプリングを行い血球計数盤で生細胞密度、生存率を測定したところ、それぞれＣＤ ＣＨＯ：１．０９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ ８２．３％、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ：０．８７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ ８４．１％であった。
播種後３５３ｈｒで培養を終了し、培養液を回収した。培養液は、遠心（３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）後０．２２μｍボトルトップフィルターでろ過し、約８００ｍｌの未精製バルクを得た。
実施例２ 無血清培養により得られた未精製バルクからのＧＡＨホール抗体の精製
実施例１で得られた未精製バルクそれぞれ約８００ｍｌをそれぞれ２回に分け、ＸＫ１６カラム（ｉ，ｄ．１６ｍｍ、アマシャム・バイオサイエンス社製）にＰｒｏｓｅｐ−Ａ樹脂（ミリポア社製）を１４．３ｍｌ充填したカラムクロマトで精製を行った。流速は、１４．３ｍｌ／ｍｉｎで実施し、アプライ、洗浄はｄｏｗｎｆｌｏｗ、溶出、再生はｕｐｆｌｏｗで未精製バルク及び緩衝液をカラムに供給した。洗浄、溶出、再生の緩衝液組成は、４０ｍＭ ＮａＣｌを含む４０ｍＭ酢酸緩衝溶液でありｐＨはそれぞれ６．０、４．０、２．７である。
ＣＤ ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの未精製バルクより、それぞれ４７．２ｍｌ、５０．８ｍｌのホール抗体含有液（ｐＨ４．０）を得た。この溶液の抗体含有量は、紫外吸光度法で測定を行ったところそれぞれ５７ｍｇ、４８ｍｇであった。
上記で述べたＧＡＨ抗体の無血清培養工程を第１図に示す。
実施例３ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＣＤ ＣＨＯ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終０．１ｍＭＬ−システインを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約４０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０（アミコン社）で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ，長さ７．５ｃｍ；東ソー社品）に供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。
操作条件：
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ×長さ７．５ｃｍ）東ソー社品
カラム温度：３０℃付近の一定温度
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
移動相Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
移動相Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．５Ｍ塩化ナトリウム
移動相の送液：濃度勾配制御（以下、表１）
結果を第２図に示した。クロマトグラムは２２．１分のピークを頂点とするブロードな山となっており、後述の図９と比較すると還元剤（システイン）だけでも反応は進行していると考えられる。
実施例４ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＣＤ ＣＨＯ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終１ｍＭＬ−システイン及び３ｍＭアスコルビン酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約８０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第３図に示した。クロマトグラムは２２．１分のピークが頂点となっているが前にもブロードな山がある。後述の図９と比較すると還元剤（システイン）及び抗酸化剤（アスコルビン酸）だけでも反応は進行していると考えられる。
比較例１ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終０．８Ｍグアニジン塩酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約８０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第４図に示した。クロマトグラムは特にピークが見られないブロードな山となっており、グアニジン塩酸によって分解物が生成されたことが想定された。
実施例５ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終２．５Ｍ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約９０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第５図に示した。クロマトグラムは２３．４分ピークを頂点とするブロードな山であった。頂点の高さは比較例１のグアニジン塩酸のみより高く、塩化ナトリウムの添加により強い変性剤と比較して分解生成物は起きにくいことが示唆された。
実施例６ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終１５ｍＭアスコルビン酸及び３Ｍ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約１４０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第６図に示した。クロマトグラムは２２．７分ピークを頂点とするが前にもブロードな山があり、後述の第１１図と比較すると抗酸化剤（アスコルビン酸）及び塩化ナトリウムだけでも反応は進行していると考えられる。
実施例７ ＧＡＨホール抗体の活性化処理
実施例２により取得した、ＣＤ ＣＨＯ培地及びＥＸＣＥＬＬ３２５−ＰＦ培地それぞれを用いたＧＡＨホール抗体溶液各々２０ｍｇをセントリコン３０（アミコン社）を用いて約１．７ｍＬに濃縮した。この液２５０μＬ（３ｍｇ相当）に最終１．６Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭＬ−システイン、１２ｍＭアスコルビン酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約１０ｍｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。セントリコン３０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。
実施例８ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
実施例７で得られた溶液を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行い実施例７の処理を行わなかった試料のクロマトグラムと比較した。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第７図から第１１図に示した。
その結果、実施例７の処理（以下、「本発明の方法」と称する場合もある）を施さないＧＡＨホール抗体のクロマトグラムでは第８図及び第１０図に示す様にヘテロジェナイティに由来する数多くの分子種が存在し、保持時間も全体に早い。他方、本発明の方法を施した後のクロマトグラムでは第９図及び第１１図に示す様にいずれも保持時間２２．６分にメインピークが認められる。このピークは結合活性を有する血清入り培養ＧＡＨホール抗体の結果を示す第７図の２２．１分に見られるピークに相当すると考えられ、本発明の方法においては活性型に相当する分子種への変換が良好に進んでいると考えられる。尚、第７図に示した様に従来の血清入り培養で得られる活性型のＧＡＨホール抗体でも数本のヘテロジェナイティ分子種が認められる。
実施例９ ＧＡＨホール抗体の結合活性測定
実施例２及び実施例７で得られたＧＡＨホール抗体の結合活性の測定は、ＭＫＮ４５細胞固定化プレートを用いたエライザ法により行った。すなわち、ＭＫＮ４５胃癌細胞株（内藤ら、癌と化学療法、５，８９，１９７８、免疫生物研究所から入手）を細胞培養用９６穴プレートの各ウェルに約４×１０４／ｍＬとなるように加えた後２日間培養し、パラホルムアルデヒド溶液により固定化したプレートを用意した。このプレートに段階希釈したＧＡＨホール抗体を加え、３７℃２時間静置した。洗浄後、各ウェルに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加えて３７℃１時間静置した後、ｏ‐フェニレンジアミン溶液を加えて発色させた。２Ｍ硫酸で反応停止後、イムノリーダーを用いて波長４９０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度の差を求めた。希釈した血清入り培養ＧＡＨホール抗体の検量線を作成し、それを基準として同一濃度の試料溶液の吸光度との割合から力価を算出した。結果を表２に示した。表２は、ＧＡＨホール抗体での結合活性を示す表であり、血清入り培養ＧＡＨホール抗体（第７図に相当する試料）の結合活性を１００％として表した。また、相当する試料のイオン交換ＨＰＬＣの図番号を表中の括弧内に示した。
本発明を施さないＧＡＨホール抗体では結合活性は７０％前後と低いが、本発明の方法処理を施すことにより活性が１００％以上へと良好に回復している。
実施例１０ 活性化処理後のホール抗体のペプシン消化によるＦ（ａｂ’）２化及び精製
実施例２で得られた溶液のうち、それぞれ２５ｍｌづつを実施例７の活性化処理を行わずにペプシン消化を行った。すなわちペプシン（ＳＩＧＭＡ社）を１．２ｍｇ／ｇ−ＧＡＨとなる様に加えて、マイレクスフィルター（ミリポア社、０．２２μｍ）で無菌濾過し、３７℃で加温しながら穏やかに１７時間攪拌を行った。
一方、実施例７で得られた活性化処理済試料は、ｐＨを４．０に調整後、同様にペプシン消化を行った。
ペプシン消化後陽イオン交換カラムクロマト法を用いてＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体を精製した。すなわち、ＸＫ１６カラムに陽イオン交換樹脂ＳＰ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャム・バイオサイエンス社）を１５．３ｍｌ充填し、ペプシン消化後の抗体含有液を供した。その後、２０ｍＭ ＮａＣｌ含有４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄を行い、塩濃度を徐々に高めながら、抗体のピークを分取した。流速は、１．５８ｍｌ／ｍｉｎである。活性化処理無しのＣＤ ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの試料の体積はそれぞれ１２．５ｍｌ、２１．８ｍｌであり、活性化処理有りのＣＤ ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの試料はそれぞれ１０．５ｍｌ、１１．６ｍｌであった。
上記で述べたＧＡＨホール抗体の精製後の活性化処理、ペプシン消化及びＦ（ａｂ’）２化抗体の精製工程を第１図に示す。
実施例１１ Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のＨＰＬＣによる分析
実施例１０により得られたＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体を、セントリコン３０を用いて濃縮、脱塩し０．０５％酢酸溶液に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ，長さ７．５ｃｍ；東ソー社品）に供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。溶出条件は実施例３と同様である。そして、実施例７の処理のみを行わずにＦ（ａｂ’）２まで調製した試料のクロマトグラムと比較した。すなわち緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化した上記カラムに各試料を供した後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した。ＣＤ ＣＨＯ培地及びＥＸＣＥＬＬ３２５−ＰＦ培地それぞれについて培養、精製したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体について、実施例７の処理を行った試料と行っていない試料を比較した結果を第１２図から第１６図に示した。
本発明の方法を施さないＧＡＨホール抗体から作製したＦ（ａｂ’）２化抗体のクロマトグラムでは第１３図及び第１５図に示す様にヘテロジェナイティに由来する数多くの分子種が存在し、保持時間も全体に早い。他方、本発明の方法を施した後のＧＡＨホール抗体から第１図に従って作製したＦ（ａｂ’）２化抗体のクロマトグラムでは第１４図及び第１６図に示す様に保持時間２１．６分にメインピークが認められる。このピークは結合活性を有する血清入り培養ＧＡＨホール抗体から作製したＦ（ａｂ’）２化抗体でも第１２図の２１．７分に見られるピークに相当すると考えられ、変換された活性型に相当する分子種は、その後に行うペプシン消化、カラム精製などの工程でも良好に維持されていると考えられる。尚、第１２図に示した様に従来の血清入り培養で得られる活性型のＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体では数本のヘテロジェナイティ分子種が認められるが、第１４図及び第１６図に示したクロマトグラムでも同様のパターンを示した。
実施例１２ Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の結合活性測定
実施例１０で得られたＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体結合活性の測定を、実施例９に記載の方法に従って行った。
結果を表３に示した。表３は、Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体での結合活性を示す表であり、血清入り培養Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体（第１２図に相当する試料）の結合活性を１００％として表した。また、相当する試料のイオン交換ＨＰＬＣの図番号を表中の括弧内に示した。
本発明の方法を施さないＧＡＨホール抗体からペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体では結合活性は６０％前後と低い。他方、本発明の方法の処理を施したＧＡＨホール抗体から同様の処理により得られるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体は、ペプシン消化、イオン交換カラムでの精製などを経ても結合活性が再び低下することなく、１００％以上へと良好に回復しており、ホール抗体の段階で回復が確認された活性が良好に維持されている。
実施例１４ Ｌ−システインの無血清培地への添加によるＧＡＨホール抗体の培地中への生産
無血清培地ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）１Ｌに４ｍｍｏｌのグルタミン（ＳＩＧＭＡ社）、１０ｍｇのインシュリン（ＳＩＧＭＡ社）を溶解し０．２２μｍボトルトップフィルター（コーニング・コースター社）で無菌ろ過を行い細胞培養培地を調整した。予め滅菌しておいた４基の２５０ｍｌ ｓｐｉｎｎｅｒ ｆｌａｓｋ（ベルコ社）に無機的に分取し、そこに無菌的にＬ−システインをそれぞれ０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭになるよう添加した。細胞は、実施例１と同様の方法で調整し、各スピナーフラスコに８．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で播種を行った。その後、３７℃、４０ｒｐｍの条件で培養を２５６ｈｒ実施した。培養液は、遠心（３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）後０．２２μｍボトルトップフィルターでろ過し、それぞれ約１４０ｍｌの未精製バルクを得た。その後、未精製バルクを実施例２と同様の方法でそれぞれアフィニティー精製し、０．２２μｍボトルトップフィルターで無菌ろ過を行った。この抗体精製溶液を用いて実施例４で示したＨＰＬＣによる分析を行った。
結果を第１７図から第２０図に示す。Ｌ−システインを無血清培地中に加えなかった抗体のクロマトグラフ（第１７図）は、アフィニティー精製後本発明の処理を加えなかったもの（第８図及び第１０図）と同等であり抗体活性が低いと推定される。しかし、培地中にＬ−システインを加えたクロマトグラフ（第１８図から第２０図）は、血清入り培養を行ったクロマトグラム（第７図）と同等の位置にピークが存在し、抗体活性を有するものと推測される。したがって、無血清培地にＬ−システインを添加し培養することによって、抗体活性が比較的高い抗体が得られることがわかる。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地で活性型として生産することが可能である。
尚、本出願は、日本特許出願 特願２００１−３７０５４１号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＧＡＨ抗体の製造手順のフローチャートを示す図である。
第２図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にシステインを添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第３図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にシステイン及びアスコルビン酸を添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第４図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にグアニジン塩酸を添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第５図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体に塩化ナトリウムを添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第６図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にアスコルビン酸及び塩化ナトリウムを添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第７図血清入り培養ＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第８図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第９図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１０図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１１図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１２図は、血清入り培養Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１３図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１４図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１５図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１６図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１７図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
第１８図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地にシステイン（１ｍＭ）を加えて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
第１９図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地にシステイン（５ｍＭ）を加えて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
第２０図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地にシステイン（１０ｍＭ）を加えて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
本発明は、遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地を用いて生産する方法及びそれにより得られる蛋白質に関するものである。
背景技術
従来、遺伝子組換技術において動物細胞を宿主とし、蛋白質を生産するためには血清が必要である。血清は高価でかつロット間差が存在し、使用に際しては厳格なロット管理を行わなくてはならない。また、生体物質由来であるため、未知のウイルス等といった病原性伝播物質の混入が否定できないが、これら未知の病原性伝播物質の不活性化、除去は困難である。このため、医薬品用途に用いる蛋白質を生産する際には、血清を使用しない無血清培養を用いることが望ましい。
しかしながら、動物細胞培養の際に血清を使用しないと、細胞の機能維持に必要とされる成分の補給が十分に行えず、十分な有用蛋白質を確保できない場合が多い。また、生産される蛋白質が目的蛋白質と物理的、生化学的、生物学的に微妙に変化していることも想定され、血清を使用せずに培養を行い有用蛋白質の生産を行う際には、十分な注意が必要である。
ところで、一般に分子表面に出ている蛋白質の遊離のシステインのチオール基は、分子内で架橋を形成しているシステインのジスルフィド結合に比べて不安定で、弱い還元条件によって交換反応が起こるものと考えられる。
該チオール基が何らかの望ましくない修飾等を受けている場合、その交換反応を試みる際に、ジチオスレイトールや２−メルカプトエタノールのような強い還元剤を用いると、分子自体の立体構造がもとに戻らなくなる。このため、強い還元剤を用いる場合には、再現性良く特定の部分のみの反応を進めることは非常に困難である。
そこで、弱い還元剤のみの存在によって反応を行わせることが考えられるが、新たに分子間のジスルフィド結合が架橋を形成し重合体の形成が促進される怖れがある。
一方、高分子量の蛋白質に弱い還元処理を施す場合、塩基性の緩衝液中で行うだけでは分子の立体構造による障害により、目的のチオール基部分が試薬に十分さらされないことで、反応が不十分にしか進行しないことが考えられる。
そのため、従来の技術では、高濃度のグアニジン塩酸や尿素などの変性剤を系内に添加することで分子の変性を行い、通常の緩衝液中では分子表面に出にくい構造を試薬にさらす方法が行われている。
しかしながら、これらの強い変性剤は高分子の蛋白質に対して非特異的かつ不可逆的な副反応を起こし、分子構造の変化による分解物生成が引き起こされることになる。
これらの重合体、分解物などの副反応生成物の生成は、目的蛋白質を高純度で大量に得ようとする際に再現性、収率の点で問題となり、活性化された蛋白質を薬剤として利用しようとする場合には大きな障害となる。
発明の開示
本発明の課題は、血清培地において生産される蛋白質と同等の効果を有する蛋白質を、無血清培地で生産することにある。
そこで本発明者らは、反応条件の検討を重ね、反応生成物の解析を詳細に行い、かかる問題点を解決することにより、本発明を完成するに至った。
すなわち本発明の要旨は以下の通りである。
（１）遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地を用いて生産する方法であって、遊離のシステインを有する蛋白質が活性化されて生産されることを特徴とする方法。
（２）蛋白質生産時の蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分な還元剤の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（３）還元剤が、システインであることを特徴とする前記の方法。
（４）抗酸化剤の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（５）抗酸化剤が、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分な抗酸化剤であることを特徴とする前記の方法。
（６）抗酸化剤が、アスコルビン酸であることを特徴とする前記の方法。
（７）遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（８）遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムであることを特徴とする前記の方法。
（９）蛋白質が、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（１０）蛋白質が、組換体蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（１１）蛋白質が、抗体である前記のいずれかに記載の方法。
（１２）抗体が、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１３）抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１４）ヒトモノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１５）ヒトモノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１６）抗体が、Ｆ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする前記の方法。
（１７）前記の方法を用いて、蛋白質を無血清培地を用いた培養によって生産する方法。
（１８）蛋白質が、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（１９）蛋白質が、組換体蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（２０）蛋白質が、抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２１）抗体の可変領域に遊離のシステインを有することを特徴とする前記の方法。
（２２）抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２３）抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２４）抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２５）抗体が、Ｆ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする前記の方法。
（２６）不活性型として生産された遊離のシステインを有する蛋白質を活性化する方法であって、還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われることを特徴とする方法。
（２７）生産された蛋白質の蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分な還元剤の存在下に行われることを特徴とする前記の方法。
（２８）還元剤が、システインであることを特徴とする前記の方法。
（２９）抗酸化剤が、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分な抗酸化剤であることを特徴とする前記の方法。
（３０）抗酸化剤が、アスコルビン酸であることを特徴とする前記の方法。
（３１）遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質が、塩化ナトリウム又は塩化カリウムであることを特徴とする前記の方法。
（３２）蛋白質が、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（３３）蛋白質が、組換体蛋白質であることを特徴とする前記の方法。
（３４）蛋白質が、抗体である前記の方法。
（３５）抗体が、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３６）抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３７）ヒトモノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３８）ヒトモノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする前記の方法。
（３９）抗体がＦ（ａｂ’）２化抗体であることを特徴とする前記の方法。
（４０）還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾の還元をしやすくする物質の添加を、抗体精製後のホール抗体存在時に行うことを特徴とする前記の方法。
（４１）前記の方法により得られた蛋白質。
（４２）蛋白質が、血清培地で得られる蛋白質と同等の理化学的性質又は生物学的性質を示すことを特徴とする前記の蛋白質。
（４３）前記の蛋白質を含む医薬組成物。
（４４）抗腫瘍剤であることを特徴とする前記の医薬組成物。
発明を実施するための最良の形態
以下、本発明をさらに詳細に説明する。
本発明は、遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地で生産する方法であって、遊離のシステインを有する蛋白質が活性化されて生産されることを特徴とするものである。
このような方法の一例としては、遊離のシステインを有する蛋白質が活性化されるために、▲１▼還元剤、▲２▼抗酸化剤又は▲３▼遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われる方法が挙げられる。
このような方法においては、上記の▲１▼、▲２▼又は▲３▼の添加を各々単独で施しても良く、上記の２つの組み合わせ（▲１▼及び▲２▼、▲１▼及び▲３▼、又は▲２▼及び▲３▼）の添加を施すことがより好ましく、▲１▼、▲２▼及び▲３▼の全ての添加を施すのが最適である。
また、上記の▲１▼、▲２▼又は▲３▼は、蛋白質生産時のいずれの段階で存在しても良いが、本発明においては上記の▲１▼、▲２▼又は▲３▼を、無血清培地での培養の際に添加したり、結合活性が不活性型の蛋白質を活性型蛋白質に変換する際に添加するのが好ましく、結合活性が不活性型の蛋白質を活性型蛋白質に変換する際に添加するのがより好ましい。例えば、後述の実施例で示したＧＡＨ抗体で行う場合には、第１図に示す通り、無血清培地での培養、生産後、未精製バルクから精製したホール抗体の存在下の時点で添加することが挙げられる。
以下、▲１▼還元剤、▲２▼抗酸化剤、▲３▼遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質について詳述する。
本発明における還元剤としては、例えば蛋白質が抗体の場合には、強い還元剤を用いると抗体分子内の一部もしくは全てのジスルフィド結合が還元されてしまうので、比較的弱い還元剤が適している。すなわち本発明の還元剤は、蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分な還元剤であることがその条件を満たすものである。尚、本発明においては、例えば後述の実施例に記載の方法により本発明に適する還元の程度の判定が可能である。本発明の還元剤は特定の還元剤に限定されるものではないが、例えばシステインが最適である。好ましい一例として、活性型蛋白質への変換時に０．１〜１０ｍＭ、好ましくは０．５〜５ｍＭ、より好ましくは１〜３ｍＭのＬ−システインを添加することが挙げられる。
また本発明における抗酸化剤としては、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を防止することができる抗酸化剤が挙げられる。本発明で用いられる抗酸化剤は、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分な抗酸化剤であることが好ましく、例えば後述の実施例に記載の方法により本発明に適する抗酸化剤の量を決定することが可能である。本発明の抗酸化剤は特定の抗酸化剤に限定されるものではないが、例えばアスコルビン酸が最適である。好ましい一例として、活性型蛋白質への変換時に１〜５０ｍＭ、好ましくは５〜３０ｍＭ、より好ましくは１０〜２０ｍＭのアスコルビン酸を添加することが挙げられる。
一般的に還元剤とは、電子（水素原子）を与える作用のあるものを指すことから、抗酸化剤も、ジスルフィド結合を還元するという意味においては還元作用を有している（還元剤）ともとらえられる。しかしながら、上述の通り、本発明の還元剤とは、蛋白質分子内のジスルフィド結合を還元せず、かつ、遊離のシステインの修飾を還元するのに十分であるものがその条件を満たすものである。また本発明の抗酸化剤とは、蛋白質間の遊離のシステインを介した重合化を抑制するのに十分であることがその条件を満たすものである。
また本発明は、遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下に行われる。本発明で用いられる遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質は、蛋白質が分子構造の変化による分解物生成をおこさない程度に蛋白質分子の柔軟性を増強させ蛋白質分子をときほぐし、蛋白質の遊離のシステイン（チオール基部分）を分子表面にさらけ出すことができる物が好ましい。
遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質としては特定の物質に限定されるものではないが、例えば塩化ナトリウム又は塩化カリウムなどの１酸塩基塩が好ましい。具体的には、約０．１〜４Ｍ、好ましくは約０．２５〜３Ｍ、より好ましくは約０．８〜２Ｍの比較的高濃度の塩化ナトリウム等を存在させることが好ましい。このような条件にすることで、副反応はほとんど起こらない。さらに、蛋白質分子の柔軟性が増強され、還元される遊離のシステインは反応にさらされる確率が高くなり、蛋白質の活性型への変換が効率良く行われることになる。その結果、再現性良く反応を進めることができ、分解物の生成が極めて低く抑えられることから、有用蛋白質の調製には特に有用な方法である。
さらに本発明は、培養に先立って無血清培養液中に上述の▲１▼、▲２▼又は▲３▼の試薬を加えることも可能である。例えば▲１▼の還元剤の場合には、培養液中に終濃度０．１〜２００ｍＭ、好ましくは５〜１００ｍＭ、より好ましくは１０〜５０ｍＭになる様にＬ−システインをさらに加えて培養することにより、同様な効果を得ることもできる。このような方法により、遊離のシステインへの培地中成分による修飾を防ぎ、活性型の蛋白質を直接培地中に生産させ、これを精製後に直ちに用いることも問題点を解決するための有用な手段のひとつである。
また本発明においては、不活性型として生産された遊離のシステインを有する蛋白質を活性化する方法であって、不活性型として生産された蛋白質が生産された後に上述の▲１▼、▲２▼又は▲３▼の試薬による処理を行うことを特徴とする方法もその要旨として挙げられる。
ここで用いられる還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質としては、前述の定義の通りである。
本発明の生産方法及び活性化方法において用いられる培地としては、培地成分中に牛（胎児）血清などの血清を含まない無血清培地が挙げられる。一例として、本実施例に記載のような無血清培地ＣＤ ＣＨＯ（インビトロジェン社）及びＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）などが挙げられる。尚、本発明の活性化方法においては、不活性型として蛋白質が生産される培地であれば、上記の無血清培地に限定されることなく、血清培地でも良い。血清培地の血清濃度としては、不活性型の蛋白質が生産される濃度であれば特に限定されないが、例えば約５％以下が挙げられる。
本発明の対象となる蛋白質は、その分子構造内に遊離のシステインを有しているのが特徴である。また、ジスルフィド結合を形成していない遊離のシステインを分子内に有し、かつシステインのチオール基が結合活性に関与している蛋白質である。遊離（状態）とは、一般に不対電子をもち、比較的不安定で、反応性に富んだ状態を指し、システインの場合にはそのチオール基部分が反応性に富む。遊離のシステイン、特にそのチオール基部分は蛋白質の結合活性に関与している場合があり、特に蛋白質が抗体の場合は、可変領域に存在する遊離のシステイン、特にそのチオール基部分は抗原との結合活性に関与していると考えられる。具体的には、抗体であることが好ましく、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体が好ましい。より好ましくはモノクローナル抗体であり、最も好ましくはヒトモノクローナル抗体である。ヒトモノクローナル抗体は、医薬としてヒトに投与する場合、異種動物の蛋白質ではない点で有利である。
本発明で対象となるヒトモノクローナル抗体の一例としては、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体が挙げられる。これらのアミノ酸配列は、通常、重鎖及び軽鎖の各鎖の３つの超可変領域に、Ｎ末端側から、配列番号１、２及び３ならびに配列番号４、５及び６の順でそれぞれ含まれる。超可変領域は、免疫グロブリンの抗体としての特異性、抗原決定基と抗体の結合親和性を決定するものであり、相補性決定部とも呼ばれる。従って、かかる超可変領域以外の領域は他の抗体由来であっても構わない。すなわち、抗原との結合活性（反応性）を損なわない範囲で一部のアミノ酸を置換、挿入、削除あるいは追加する等の改変を行ったものも本発明において使用できるヒトモノクローナル抗体に含まれる。
より具体的には、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体、すなわちＧＡＨ抗体が挙げられる。ＧＡＨ抗体とは、胃癌及び大腸癌との反応性からスクリーニングされた癌に特異的に結合するヒトモノクローナル抗体であり（特開平４−３４６９１８号及び特開平５−３０４９８７号各号公報）、この抗体は、癌患者由来リンパ球とマウスミエローマ細胞とのハイブリドーマを作製し、上記の特定のアミノ酸配列を有するものを選択することによって得ることができるし、遺伝子工学的な手法により作製することもできる（特開平５−３０４９８７号公報）。
かかるＧＡＨ抗体においては公知のヒト抗体のアミノ酸配列におけるシステインの位置と比較して、配列表の配列番号７における３２番目のシステインに特徴がある。即ち、これは分子内でのジスルフィド結合形成には関与しない遊離のシステインと推定される。該システイン残基は配列表の配列番号１に示した配列中の４番目のアミノ酸に相当し、重鎖の超可変領域に位置することから、抗原との結合活性に関与していると考えられる。
発明の対象となる抗体としては、Ｆ（ａｂ’）２化抗体が最適であるが、ホール抗体（全長抗体、抗体全体）、抗体断片（抗体フラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）、Ｆ（ａｂ’）２、ｓｃＦｖ（一本鎖抗体）など）、又は抗体誘導体なども含まれる。
本発明により活性化された蛋白質、とりわけモノクローナル抗体を特に薬剤として用いようとする場合、ホール抗体の他、Ｆ（ａｂ’）２化した抗体を用いる場合も考えられる。
しかしながら、最終目的物であるＦ（ａｂ’）２化抗体に対して、還元剤、抗酸化剤及び遊離のシステインの修飾を還元しやすくする物質の存在下で本発明の方法を施す場合、２つのＦ（ａｂ’）間を架橋するジスルフィド結合部分の結合強度が立体的に弱いことから、本発明の弱い還元条件における処理によっても容易に還元される分子が存在し、このため二分子のＦ（ａｂ’）が生成されてしまうことが考えられる。このようなＦ（ａｂ’）の生成を避けるため、Ｆ（ａｂ’）２化抗体を最終目的物とする場合は、抗体精製後のホール抗体の段階で本発明の方法を行うことが有効である。すなわち、ホール抗体の段階ではＦｃ部分の架橋及び立体構造が比較的安定であるため、本発明の方法によって容易に１価抗体へと還元はされない。そこでホール抗体の段階で結合活性に関与するチオール基部分のみ活性型に変換し、その後ペプシン消化によりＦ（ａｂ’）２化を行うことで活性型Ｆ（ａｂ’）２化抗体を取得することにより、かかる問題点を克服できる。
本発明の方法で得られる蛋白質は、血清培地で得られる蛋白質と同等の理化学的性質又は生物学的性質を有する。
本発明において、蛋白質の理化学的性質を測定する方法としてはイオン交換高性能液体クロマトグラフィー（イオン交換ＨＰＬＣ）を用いることが好ましく、後述する実施例中の条件を用いることがより好ましい。この発明において同等の性質とは、活性のある標準品と比較して、メインのピークが標準品と同等のリテンションタイムに観察されることである。標準品のピークが複数ある場合は、１つ或いは複数のピークが標準品と同等のリテンションタイムに観察されることである。後述の実施例で説明すると、標準品として血清培地で得られた活性のある抗体を用い、ＧＡＨ抗体と同等のリテンションタイムにメインのピークが観察されることである。具体的には、ＧＡＨホール抗体に於いては、後述する第７図に示すように約１５．５分、約１７．５分、約２２分にピークが観察されることである。また、Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体に於いては、後述する第１２図に示すように約１５分、約１７分、約２１．５分にピークが観察されることである。このリテンションタイムはあくまでも目安であり、分析機器の違い等によって変化することは充分に起こり得うることであり、同等性は同条件で分析を実施し、標準品との比較の結果判定されるものである。
本発明において、生物学的性質を測定する方法としては固相酵素免疫検定（ＥＬＩＳＡ）による結合活性を用いることが好ましく、後述する実施例中の条件を用いることがより好ましい。この発明において同等の性質とは、標準品と比較して、その活性が８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは１００％以上に回復していることである。
本発明は、前述の抗体をはじめ、本発明の方法で得られた蛋白質を有効成分として含有する医薬、例えば上記物質と薬学的に許容しうる担体とからなる医薬組成物を提供し、種々の形態の治療用製剤を提供する。薬学的に許容しうるとは、悪心、目眩、吐き気等投与に伴う望ましくない副作用、頻回投与時の製剤に対する免疫応答などがおきないことを意味する。さらに、本発明の蛋白質に例えば毒素等の物質を結合させた抗体も医薬品として使用可能である。例えば、ドキソルビシン等の抗腫瘍剤等の薬剤を封入したリポソーム等に抗体等の蛋白質を結合させたものを挙げることもできる（特開平４−３４６９１８号、特開平５−３０４９８７号及びＷＯ００／６４４１３号各号公報）。抗体が結合した腫瘍性物質含有リポソームは、公知の方法、例えば、脱水法（特表平２−５０２３４８号公報）、安定化剤を加え液剤として用いる方法（特開昭６４−９３３１号公報）、凍結乾燥法（特開昭６４−９９３１号公報）等により製剤化することができ、血管内投与、局所投与などの方法で患者に投与することができる。投与量は有効成分の抗腫瘍性物質の種類に応じて適宜選択することができるが、例えばドキソルビシンを封入したリポソームを投与する場合には、有効成分量として５０ｍｇ／ｋｇ以下、好ましくは１０ｍｇ／ｋｇ以下、より好ましくは５ｍｇ／ｋｇ以下で用いることができる。
実施例
以下の実施例により、本発明をさらにより詳細に説明するが、本発明は、その要旨を超えない限り以下の実施例によって限定されるものではない。
実施例１ 無血清培養によるＧＡＨ抗体のホール抗体（以下、ＧＡＨホール抗体と称する）の培地中への生産
無血清培地ＣＤ ＣＨＯ（インビトロジェン社）及びＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）１Ｌにそれぞれ４ｍｍｏｌのグルタミン（ＳＩＧＭＡ社）、１０ｍｇのインシュリン（ＳＩＧＭＡ社）を溶解し０．２２μｍボトルトップフィルター（コーニング・コースター社）で無菌ろ過を行い細胞培養培地を調製した。調製した細胞培地を予め高圧蒸気滅菌器（サクラ精機社）で滅菌しておいた１Ｌスピンナーフラスコ（Ｂｅｌｃｏ社）に無菌的に仕込み培養制御装置（バイオット社）に設置し、温度３７℃、溶存酸素濃度３．０ｍｇ／ｌ、ｐＨ７．４、攪拌回転数６０ｒｐｍに調製を行った。
予めローラーボトル（Ｆａｌｃｏｎ社）で培養しておいた遺伝子組換ＧＡＨ抗体産生ＣＨＯ細胞１−６Ｒ（特開平５−３０４９８７号公報実施例参照）にトリプシンを作用させ細胞を剥離し、遠心後上清を廃棄し、それぞれの無血清培地で細胞を２回洗浄して、種細胞とした。その後、それぞれの無血清培地に懸濁し、無菌的に１Ｌスピンナーフラスコに細胞を播種し、培養を開始した。播種後、サンプリングを行い血球計数盤で生細胞密度、生存率を測定したところ、それぞれＣＤ ＣＨＯ：１．０９×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ ８２．３％、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ：０．８７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌ ８４．１％であった。
播種後３５３ｈｒで培養を終了し、培養液を回収した。培養液は、遠心（３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）後０．２２μｍボトルトップフィルターでろ過し、約８００ｍｌの未精製バルクを得た。
実施例２ 無血清培養により得られた未精製バルクからのＧＡＨホール抗体の精製
実施例１で得られた未精製バルクそれぞれ約８００ｍｌをそれぞれ２回に分け、ＸＫ１６カラム（ｉ，ｄ．１６ｍｍ、アマシャム・バイオサイエンス社製）にＰｒｏｓｅｐ−Ａ樹脂（ミリポア社製）を１４．３ｍｌ充填したカラムクロマトで精製を行った。流速は、１４．３ｍｌ／ｍｉｎで実施し、アプライ、洗浄はｄｏｗｎｆｌｏｗ、溶出、再生はｕｐｆｌｏｗで未精製バルク及び緩衝液をカラムに供給した。洗浄、溶出、再生の緩衝液組成は、４０ｍＭ ＮａＣｌを含む４０ｍＭ酢酸緩衝溶液でありｐＨはそれぞれ６．０、４．０、２．７である。
ＣＤ ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの未精製バルクより、それぞれ４７．２ｍｌ、５０．８ｍｌのホール抗体含有液（ｐＨ４．０）を得た。この溶液の抗体含有量は、紫外吸光度法で測定を行ったところそれぞれ５７ｍｇ、４８ｍｇであった。
上記で述べたＧＡＨ抗体の無血清培養工程を第１図に示す。
実施例３ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＣＤ ＣＨＯ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終０．１ｍＭＬ−システインを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約４０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０（アミコン社）で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ，長さ７．５ｃｍ；東ソー社品）に供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。
操作条件：
検出器：紫外吸光光度計（測定波長２８０ｎｍ）
カラム：ＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ×長さ７．５ｃｍ）東ソー社品
カラム温度：３０℃付近の一定温度
流量：１．０ｍｌ／ｍｉｎ
移動相Ａ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）
移動相Ｂ：５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０）／０．５Ｍ塩化ナトリウム
移動相の送液：濃度勾配制御（以下、表１）
実施例４ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＣＤ ＣＨＯ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終１ｍＭＬ−システイン及び３ｍＭアスコルビン酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約８０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第３図に示した。クロマトグラムは２２．１分のピークが頂点となっているが前にもブロードな山がある。後述の図９と比較すると還元剤（システイン）及び抗酸化剤（アスコルビン酸）だけでも反応は進行していると考えられる。
比較例１ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終０．８Ｍグアニジン塩酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約８０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第４図に示した。クロマトグラムは特にピークが見られないブロードな山となっており、グアニジン塩酸によって分解物が生成されたことが想定された。
実施例５ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終２．５Ｍ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約９０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第５図に示した。クロマトグラムは２３．４分ピークを頂点とするブロードな山であった。頂点の高さは比較例１のグアニジン塩酸のみより高く、塩化ナトリウムの添加により強い変性剤と比較して分解生成物は起きにくいことが示唆された。
実施例６ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地で生産されたＧＡＨホール抗体約１０μｌ（５０μｇ相当）に最終１５ｍＭアスコルビン酸及び３Ｍ塩化ナトリウムを含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約１４０μｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。マイクロコンＹＭ−１０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷに供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第６図に示した。クロマトグラムは２２．７分ピークを頂点とするが前にもブロードな山があり、後述の第１１図と比較すると抗酸化剤（アスコルビン酸）及び塩化ナトリウムだけでも反応は進行していると考えられる。
実施例７ ＧＡＨホール抗体の活性化処理
実施例２により取得した、ＣＤ ＣＨＯ培地及びＥＸＣＥＬＬ３２５−ＰＦ培地それぞれを用いたＧＡＨホール抗体溶液各々２０ｍｇをセントリコン３０（アミコン社）を用いて約１．７ｍＬに濃縮した。この液２５０μＬ（３ｍｇ相当）に最終１．６Ｍ塩化ナトリウム、２ｍＭＬ−システイン、１２ｍＭアスコルビン酸を含む３０ｍＭトリス塩酸緩衝液（ｐＨ９）なる組成になる様に試薬を添加し、約１０ｍｌにした。この液を室温にて１６時間放置した後、トリフルオロ酢酸を加えてｐＨ４にした。セントリコン３０で濃縮し、液組成を０．０５％酢酸に置換した。
実施例８ ＧＡＨホール抗体のＨＰＬＣによる分析
実施例７で得られた溶液を用いて陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行い実施例７の処理を行わなかった試料のクロマトグラムと比較した。操作条件は実施例３と同様である。
結果を第７図から第１１図に示した。
その結果、実施例７の処理（以下、「本発明の方法」と称する場合もある）を施さないＧＡＨホール抗体のクロマトグラムでは第８図及び第１０図に示す様にヘテロジェナイティに由来する数多くの分子種が存在し、保持時間も全体に早い。他方、本発明の方法を施した後のクロマトグラムでは第９図及び第１１図に示す様にいずれも保持時間２２．６分にメインピークが認められる。このピークは結合活性を有する血清入り培養ＧＡＨホール抗体の結果を示す第７図の２２．１分に見られるピークに相当すると考えられ、本発明の方法においては活性型に相当する分子種への変換が良好に進んでいると考えられる。尚、第７図に示した様に従来の血清入り培養で得られる活性型のＧＡＨホール抗体でも数本のヘテロジェナイティ分子種が認められる。
実施例９ ＧＡＨホール抗体の結合活性測定
実施例２及び実施例７で得られたＧＡＨホール抗体の結合活性の測定は、ＭＫＮ４５細胞固定化プレートを用いたエライザ法により行った。すなわち、ＭＫＮ４５胃癌細胞株（内藤ら、癌と化学療法、５，８９，１９７８、免疫生物研究所から入手）を細胞培養用９６穴プレートの各ウェルに約４×１０４／ｍＬとなるように加えた後２日間培養し、パラホルムアルデヒド溶液により固定化したプレートを用意した。このプレートに段階希釈したＧＡＨホール抗体を加え、３７℃２時間静置した。洗浄後、各ウェルに西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ標識ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体を加えて３７℃１時間静置した後、ｏ‐フェニレンジアミン溶液を加えて発色させた。２Ｍ硫酸で反応停止後、イムノリーダーを用いて波長４９０ｎｍと６５０ｎｍの吸光度の差を求めた。希釈した血清入り培養ＧＡＨホール抗体の検量線を作成し、それを基準として同一濃度の試料溶液の吸光度との割合から力価を算出した。結果を表２に示した。表２は、ＧＡＨホール抗体での結合活性を示す表であり、血清入り培養ＧＡＨホール抗体（第７図に相当する試料）の結合活性を１００％として表した。また、相当する試料のイオン交換ＨＰＬＣの図番号を表中の括弧内に示した。
本発明を施さないＧＡＨホール抗体では結合活性は７０％前後と低いが、本発明の方法処理を施すことにより活性が１００％以上へと良好に回復している。
実施例２で得られた溶液のうち、それぞれ２５ｍｌづつを実施例７の活性化処理を行わずにペプシン消化を行った。すなわちペプシン（ＳＩＧＭＡ社）を１．２ｍｇ／ｇ−ＧＡＨとなる様に加えて、マイレクスフィルター（ミリポア社、０．２２μｍ）で無菌濾過し、３７℃で加温しながら穏やかに１７時間攪拌を行った。
一方、実施例７で得られた活性化処理済試料は、ｐＨを４．０に調整後、同様にペプシン消化を行った。
ペプシン消化後陽イオン交換カラムクロマト法を用いてＧＡＨＦ（ａｂ’）２化抗体を精製した。すなわち、ＸＫ１６カラムに陽イオン交換樹脂ＳＰ−Ｓｅｐｈｒｏｓｅ ＦＦ（アマシャム・バイオサイエンス社）を１５．３ｍｌ充填し、ペプシン消化後の抗体含有液を供した。その後、２０ｍＭ ＮａＣｌ含有４０ｍＭ酢酸緩衝液（ｐＨ４．０）で洗浄を行い、塩濃度を徐々に高めながら、抗体のピークを分取した。流速は、１．５８ｍｌ／ｍｉｎである。活性化処理無しのＣＤ ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの試料の体積はそれぞれ１２．５ｍｌ、２１．８ｍｌであり、活性化処理有りのＣＤ ＣＨＯ、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦの試料はそれぞれ１０．５ｍｌ、１１．６ｍｌであった。
上記で述べたＧＡＨホール抗体の精製後の活性化処理、ペプシン消化及びＦ（ａｂ’）２化抗体の精製工程を第１図に示す。
実施例１１ Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のＨＰＬＣによる分析
実施例１０により得られたＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体を、セントリコン３０を用いて濃縮、脱塩し０．０５％酢酸溶液に置換した。この液をＴＳＫｇｅｌ ＣＭ−５ＰＷ（内径７．５ｍｍ，長さ７．５ｃｍ；東ソー社品）に供して陽イオン交換液体クロマトグラフ法を行った。溶出条件は実施例３と同様である。そして、実施例７の処理のみを行わずにＦ（ａｂ’）２まで調製した試料のクロマトグラムと比較した。すなわち緩衝液（５０ｍＭリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ７．０））で平衡化した上記カラムに各試料を供した後、０．５Ｍ ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した。ＣＤ ＣＨＯ培地及びＥＸＣＥＬＬ３２５−ＰＦ培地それぞれについて培養、精製したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体について、実施例７の処理を行った試料と行っていない試料を比較した結果を第１２図から第１６図に示した。
本発明の方法を施さないＧＡＨホール抗体から作製したＦ（ａｂ’）２化抗体のクロマトグラムでは第１３図及び第１５図に示す様にヘテロジェナイティに由来する数多くの分子種が存在し、保持時間も全体に早い。他方、本発明の方法を施した後のＧＡＨホール抗体から第１図に従って作製したＦ（ａｂ’）２化抗体のクロマトグラムでは第１４図及び第１６図に示す様に保持時間２１．６分にメインピークが認められる。このピークは結合活性を有する血清入り培養ＧＡＨホール抗体から作製したＦ（ａｂ’）２化抗体でも第１２図の２１．７分に見られるピークに相当すると考えられ、変換された活性型に相当する分子種は、その後に行うペプシン消化、カラム精製などの工程でも良好に維持されていると考えられる。尚、第１２図に示した様に従来の血清入り培養で得られる活性型のＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体では数本のヘテロジェナイティ分子種が認められるが、第１４図及び第１６図に示したクロマトグラムでも同様のパターンを示した。
実施例１２ Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体の結合活性測定
実施例１０で得られたＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体結合活性の測定を、実施例９に記載の方法に従って行った。
結果を表３に示した。表３は、Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体での結合活性を示す表であり、血清入り培養Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体（第１２図に相当する試料）の結合活性を１００％として表した。また、相当する試料のイオン交換ＨＰＬＣの図番号を表中の括弧内に示した。
本発明の方法を施さないＧＡＨホール抗体からペプシン処理により得られるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体では結合活性は６０％前後と低い。他方、本発明の方法の処理を施したＧＡＨホール抗体から同様の処理により得られるＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体は、ペプシン消化、イオン交換カラムでの精製などを経ても結合活性が再び低下することなく、１００％以上へと良好に回復しており、ホール抗体の段階で回復が確認された活性が良好に維持されている。
無血清培地ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ（ＪＲＨ社）１Ｌに４ｍｍｏｌのグルタミン（ＳＩＧＭＡ社）、１０ｍｇのインシュリン（ＳＩＧＭＡ社）を溶解し０．２２μｍボトルトップフィルター（コーニング・コースター社）で無菌ろ過を行い細胞培養培地を調整した。予め滅菌しておいた４基の２５０ｍｌ ｓｐｉｎｎｅｒ ｆｌａｓｋ（ベルコ社）に無機的に分取し、そこに無菌的にＬ−システインをそれぞれ０ｍＭ、１ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭになるよう添加した。細胞は、実施例１と同様の方法で調整し、各スピナーフラスコに８．２７×１０５ｃｅｌｌｓ／ｍｌの密度で播種を行った。その後、３７℃、４０ｒｐｍの条件で培養を２５６ｈｒ実施した。培養液は、遠心（３０００ｒｐｍ，２０ｍｉｎ）後０．２２μｍボトルトップフィルターでろ過し、それぞれ約１４０ｍｌの未精製バルクを得た。その後、未精製バルクを実施例２と同様の方法でそれぞれアフィニティー精製し、０．２２μｍボトルトップフィルターで無菌ろ過を行った。この抗体精製溶液を用いて実施例４で示したＨＰＬＣによる分析を行った。
結果を第１７図から第２０図に示す。Ｌ−システインを無血清培地中に加えなかった抗体のクロマトグラフ（第１７図）は、アフィニティー精製後本発明の処理を加えなかったもの（第８図及び第１０図）と同等であり抗体活性が低いと推定される。しかし、培地中にＬ−システインを加えたクロマトグラフ（第１８図から第２０図）は、血清入り培養を行ったクロマトグラム（第７図）と同等の位置にピークが存在し、抗体活性を有するものと推測される。したがって、無血清培地にＬ−システインを添加し培養することによって、抗体活性が比較的高い抗体が得られることがわかる。
産業上の利用可能性
本発明の方法によれば、遊離のシステインを有する蛋白質を無血清培地で活性型として生産することが可能である。
尚、本出願は、日本特許出願 特願２００１−３７０５４１号を優先権主張して出願されたものである。
【配列表】
【図面の簡単な説明】
第１図は、ＧＡＨ抗体の製造手順のフローチャートを示す図である。
第２図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にシステインを添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第３図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にシステイン及びアスコルビン酸を添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第４図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にグアニジン塩酸を添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第５図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体に塩化ナトリウムを添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第６図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体にアスコルビン酸及び塩化ナトリウムを添加した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第７図血清入り培養ＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第８図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第９図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１０図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１１図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１２図は、血清入り培養Ｆ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１３図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１４図は、ＣＤ ＣＨＯ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１５図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１６図は、ＥｘＣｅｌｌ３２５−ＰＦ培地を用いて培養したＦ（ａｂ’）２化ＧＡＨ抗体に本発明の処理を施した後のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図である。
第１７図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地を用いて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
第１８図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地にシステイン（１ｍＭ）を加えて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
第１９図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地にシステイン（５ｍＭ）を加えて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
第２０図は、ＥｘＣｅｌｌ−３２５ ＰＦ培地にシステイン（１０ｍＭ）を加えて培養したＧＡＨホール抗体のイオン交換ＨＰＬＣクロマトグラム結果を表す図面である。
Claims (14)
- システイン及び / 又はアスコルビン酸及び / 又は塩化ナトリウム若しくは塩化カリウムの存在下において抗体を無血清培地を用いて生産する方法であって、抗体が活性化されて生産されることを特徴とする方法。
- 抗体が、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
- 抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
- ヒトモノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
- ヒトモノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする請求項３に記載の方法。
- 抗体が、Ｆ（ab’）2化抗体であることを特徴とする請求項１から５のいずれかに記載の方法。
- 請求項１から６のいずれかに記載の方法を用いて、抗体を無血清培地を用いた培養によって生産する方法。
- 不活性型として生産された抗体を活性化する方法であって、システイン及びアスコルビン酸及び塩化ナトリウム若しくは塩化カリウムの存在下に行われることを特徴とする方法。
- 抗体が、抗体の可変領域に遊離のシステインを有する抗体であることを特徴とする請求項８に記載の方法。
- 抗体が、ヒトモノクローナル抗体であることを特徴とする請求項８又は９に記載の方法。
- ヒトモノクローナル抗体が、重鎖の超可変領域に、配列表の配列番号１、２及び３のアミノ酸配列を含み、軽鎖の超可変領域に、配列表の配列番号４、５及び６のアミノ酸配列を含む抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
- ヒトモノクローナル抗体が、配列表の配列番号７のアミノ酸配列を含む重鎖可変領域と、配列表の配列番号８のアミノ酸配列を含む軽鎖可変領域とを含む抗体であることを特徴とする請求項１０に記載の方法。
- 抗体がＦ（ab’）2化抗体であることを特徴とする請求項８から１２のいずれかに記載の方法。
- システイン及びアスコルビン酸及び塩化ナトリウム若しくは塩化カリウムの添加を、抗体精製後のホール抗体存在時に行うことを特徴とする請求項８から１３のいずれかに記載の方法。
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