KR102146617B1 - 캐핑된 및 캐핑되지 않은 항체 시스테인, 및 항체-약물 접합에서 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 유전자조작된 짝이 없는 시스테인 잔기가 번역후 변경되고 특정 화학적 실체로 캐핑된 포유동물 세포에서의 항체의 생산 방법으로서, 항체-약물 접합체(ADC) 또는 단백질-약물 접합체를 형성하는 추가의 부위-특이적 접합 단계에 매우 적합한 항체의 생산 방법; 이들 캐핑된 항체를 사용하여 생산된 ADC, 예컨대 특히 캐핑된 항체의 시스테인 잔기의 선택적인 환원에 의해 형성된 ADC, 및 추가적인 약물 접합 화학반응을 가능하게 하는 알데하이드/아자이드/알킨 배직교 기(biorthogonal group)와 같은 화학적 핸들을 사용하여 형성된 ADC; 및 저 시스테인, 시스틴 및 글루타치온 배지에서 세포에 의해 생산된 캐핑되지 않은 항체, 및 이들 캐핑되지 않은 항체에 대한 직접 접합을 통해 생산된 ADC에 관한 것이다.

Description

캐핑된 및 캐핑되지 않은 항체 시스테인, 및 항체-약물 접합에서 이들의 용도
본 발명은 항체 상의 시스테인 잔기의 캐핑(capping) 상태가 살아있는 세포에서 변형될 수 있다는 발견에 기초한다. 따라서, 본 발명은 유전자조작된 짝이 없는 시스테인 잔기가 번역후 변경되고 특정 화학적 실체로 캐핑된 포유동물 세포에서의 항체의 생산 방법으로서, 항체-약물 접합체(ADC) 또는 단백질-약물 접합체를 형성하는 추가의 부위-특이적 접합 단계에 매우 적합한 항체의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 캐핑된 항체를 사용하여 생산된 ADC, 특히 쇄간 다이설파이드의 환원을 회피하고, 이에 따라 접합 전의 (재)산화 단계에 대한 요구를 배제하는, 캐핑된 항체의 시스테인 잔기의 선택적인 환원에 의해 형성된 ADC에 관한 것이다. 본 발명은 또한 트리스(3-설포나토페닐)포스핀(TSPP)도 직접 접합을 위한 관련 약품에 의한 선택적인 환원을 가능하게 하고, 이에 따라 쇄간 다이설파이드 환원-재-산화 단계의 처리를 배제하는 신규한 니트로벤조에이트-캐핑된 항체에 관한 것이다. 본 발명은 또한 추가적인 약물 접합 화학을 가능하게 하는 알데하이드/아자이드/알킨 배직교 기(biorthogonal group)와 같은 화학적 핸들(handle)로 이루어진 유전자조작 신규 Cys-캐핑에 관한 것이다. 본 발명은 또한 저 시스테인, 시스틴 및 글루타치온 배지에서 세포에 의해 생산된 캐핑되지 않은 항체, 및 이들 캐핑되지 않은 항체에 대한 직접 접합을 통해 생산된 ADC에 관한 것이다.
ADC는 항체 요법 또는 전통적인 화학요법에 대한 임상적인 효능 및 내성을 개선하는 상당한 잠재력을 갖는 유망한 부류의 표적화된 치료제로서 나타났다. 임상적으로 유용한 ADC는 매우 강력한 세포독성 약물을 종양 세포로 항원-특이적으로 전달할 수 있다. ADC의 단클론성 항체 성분은 건강한 세포보다 종양 세포에서 실질적으로 더욱 상승된 세포 표면 항원을 특이적으로 인지할 수 있고, 이에 따라 종양 세포에 의해 비-특이적 흡수가 감소되고 접합된 약물의 특이적인 업데이트가 증가한다. 최근의 임상 데이터는 2개의 FDA-승인된 ADC 제품, 예컨대 브렌툭시맙 베도틴(항-CD30 단클론성 항체 접합체) 및 아도-트라스트주맙 엠탄신(항-HER2 단클론성 항체 접합체)의 상용화를 야기하였다. 세 번째 시판된 ADC는 겜투주맙 오조가미신(항-CD33 단클론성 항체 접합체)이고 일본에서 시판 중이다.
약물이 항체에 부착되는 접근법(즉, 접합)은 ADC 개발의 중요한 양상이다. 언급된 3개의 시판 중인 ADC 제품은 모두 통상적인 비-특이적 접합 방법을 이용한다. 브렌툭시맙 베도틴은 용매-노출된 다이설파이드 중에서 천연 시스테인 측쇄 티올의 변형에 의해 생산되는 반면, 아도-트라스트주맙 엠탄신 및 겜투주맙 오조가미신은 표면 리신 측쇄 아민의 변형을 통해 생산된다. 이러한 비-특이적 접합 방법은 불균일한 ADC 혼합물을 생성하였다.
ADC의 치료 인덱스 및 약동학을 개선하기 위하여, 시스테인-기반 부위-특이적 ADC가 약물 부착 부위에 걸쳐 더욱 큰 제어를 갖는 더욱 균일한 약물 제품을 생성하도록 최근에 개발되었다. 짝이 없는 시스테인 잔기는 오랫동안 부위-특이적 표지 및 약물 접합을 위해 단백질에 도입되었다(문헌[Lyons et al., Protein Eng. 3, 703-708 (1990)]; 문헌[Zheng et al., Biochemistry, 30, 9125-9132 (1991)]; 문헌[Stimmel, et al., J. Biol. Chem. 275, 30445-30450 (2000)]; 문헌[Junutula et al., Nat. Biotechnol., 26, 925-932 (2008)]; 문헌[Voynov et al., Biocnjug. Chem. 21, 385-392 (2010)]; 및 문헌[Shen et al., Nat. Biotechnol., 30, 184-189 (2012)] 참고). 이들 유전자조작된 시스테인 잔기는 단백질의 표면 상에 전형적으로 위치하고, 단백질 구조 및 기능을 변경시키지 않는다. 최근에, 시스테인-기반 부위-특이적 ADC가 통상적인 Cys 접합체 및 Lys 접합체보다 개선된 치료 인덱스 및 감소된 독성을 가짐이 확인되었다(문헌[Junutula et al., Nat. Biotechnol., 26, 925-932 (2008)]; 문헌[Junutula et al., Clin. Cancer Res. 16, 4769-47788 (2010)]; 문헌[Shen et al., Nat. Biotechnol., 30, 184-189 (2012)]; 및 문헌[Kung et al., Blood 122, 1455-1463 (2013)] 참고).
그러나, 시스테인-기반 부위-특이적 ADC는 약물 접합 공정을 복잡하게 한다. 포유동물 세포에서 생산될 때, 시스테인 돌연변이 항체의 짝이 없는 시스테인 잔기의 티올 기는 다른 시스테인(시스테인일화) 또는 글루타치온(글루타치온일화)과 다이설파이드를 형성하는 것으로 밝혀졌다(문헌[Junutula, Raab et al. 2008, Chen, Nguyen et al. 2009] 참고). 이러한 번역-후 변형은 시스테인-캐핑 또는 Cys-캐핑으로 지칭된다. 이러한 시스테인-캐핑은 접합을 방지하거나 억제하는 티올 연결된 블로킹 기를 생성하고, 이에 따라 약물 접합 전에, 티올 기는 환원제를 사용하는 부분적인 환원 단계를 통해 재생되어야 한다. 이러한 처리가 또한 항체 쇄간 다이설파이드(또한, "짝지어진(paired)" 시스테인)를 환원시키므로, 이렇게 환원된 항체 쇄간 다이설파이드는 개질되어야 한다. 이것은 환원제, 시스테인 또는 글루타치온의 투석 및 산화 시약에 의한 처리를 포함하는 재-산화 공정에서 달성된다. 이러한 환원 및 재-산화는 잠재적으로 다이설파이드 셔플링(shuffling)(또한 다이설파이드 스크램블링(scrambling)으로 공지됨, 하기 반응식의 점선 타원형 참고) 및 트위스팅(twisting)을 항체 상에 도입한다. 트위스팅된 항체는 단백질 폴딩(folding) 및 단백질 질에 부정적인 영향을 주고, 또한 생성되는 ADC에 대한 더욱 불량한 PK와 같은 문제를 일으킨다. 이러한 현상은 하기 제시된다:
Figure 112018024016848-pct00001
이러한 "천연" 시스테인일화 및 글루타치온일화 캐핑을 뒷받침하는 기전은 불명확하다. 2개의 변형 모두 다이설파이드 결합의 형성을 포함하므로, 이러한 변형이, 다이설파이드 결합 형성이 발생하는 소포체(ER)의 루멘에서 일어날 수 있는 것으로 오랫동안 추측되었다. ER 루멘이 시토솔보다 더 산화되는 것이 널리 공지되어 있고(문헌[Hwang, Sinskey et al. 1992]), 고도로 보존된 산화 분자 경로에 기인한다(문헌[Frand, Cuozzo et al. 2000], 문헌[Sevier and Kaiser 2006]). 플라빈-함유 막-단백질 Ero1(문헌[Frand and Kaiser 1998], 문헌[Pollard, Travers et al. 1998])은 산소의 산화력을 이용하여 다이설파이드 결합을 그 안에 도입하고, 이어서 다이설파이드 결합을 단백질 다이설파이드 이성질화효소(PDI)(세포외 단백질 상으로 통과시킬 수 있음)에 전달한다(문헌[Tu, Ho-Schleyer et al. 2000]). 대안의 Ero1-독립적 산화의 경우, 예컨대 퀴신 설피드릴 산화효소/Erv 초과 및 비타민 K 에폭사이드 환원효소가 또한 포유동물 세포에서의 다이설파이드 결합 형성에 기여한다(문헌[Margittai and Banhegyi 2010], 문헌[Sevier 2010]). GSH는 막 내의 운송체(문헌[Hwang, Sinskey et al. 1992], 문헌[Banhegyi, Lusini et al. 1999]) 또는 공극(문헌[Le Gall, Neuhof et al. 2004])에 기인하여 ER 루멘에 존재한다. Cys는 또한 아마 운송 활성에 기인하여 존재한다(문헌[Hwang, Sinskey et al. 1992]). 따라서, 산화성 ER 루멘에 더해 GSH 및 Cys의 존재가 ER 루멘을 글루타치온일화 또는 시스테인일화에 대한 합리적인 위치로 만들었다. 그러나, 이러한 가정을 지지하는 어떠한 결론적인 증거도 존재하지 않았다.
본 발명은 유전자조작된 짝이 없는 시스테인 잔기가 번역-후 변경되고 특정 화학적 실체로 캐핑된 포유동물 세포에서의 항체의 생산 방법으로서, 항체-약물 접합체(ADC)를 형성하는 추가의 부위-특이적 접합 단계에 매우 적합한 항체의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은 또한 이들 캐핑된 항체를 사용하여 생산된 ADC, 특히 쇄간 다이설파이드의 환원을 회피하고, 이에 따라 접합 전의 (재)산화 단계에 대한 요구를 배제하는, 캐핑된 항체의 시스테인 잔기의 선택적인 환원에 의해 형성된 ADC에 관한 것이다. 본 발명은 또한 신규한 니트로벤조에이트-캐핑된 항체, 특히 5-티오-2-니트로벤조산(TNB)-캐핑된 항체에 관한 것이고, 이러한 유형의 캐핑된 항체는 트리스(3-설포나토페닐)포스핀(TSPP) 또한 직접 접합을 위한 관련 또는 유사-작용 환원제에 의한 선택적인 환원을 가능하게 하고, 이에 따라 쇄간 다이설파이드 환원-재-산화 단계의 처리를 배제한다. 본 발명은 또한 추가적인 약물 접합 화학반응을 가능하게 하는 알데하이드/아자이드/알킨 배직교 기와 같은 화학적 핸들로 이루어진 유전자조작 신규 시스테인-캐핑에 관한 것이다.
배양 배지의 최적화는 다양한 캐핑 상태를 갖는 시스테인-돌연변이 항체, 예컨대 시스테인일화된, 글루타치온일화된, 캐핑되지 않은, 또는 니트로벤조에이트 캐핑된 항체의 생성을 가능하게 한다. 신규한 니트로벤조에이트-캐핑된 항체는 특히 TSPP에 의한 선택적인 환원을 가능하게 하고, 이어서 직접 접합에 의해 쇄간 다이설파이드 환원/재-산화 단계의 거친 처리를 사용할 필요성을 배제한다. 본 발명의 특정 양태에 제공된 접합 공정의 핵심 특징은 하기 반응식에 제시된다.
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이때, 통상적으로 시스테인에 의해 캐핑되고(시스테인일화된), 이에 따라 상기 환원 및 산화 단계에 의해 접합될 수 있는 항체가 대신에 TNB로 캐핑된다. TNB 캐핑이 제거되고, 동시에 접합이 하기 제시된 바와 같이 선택적인 환원(예컨대, TSPP를 사용함)에 의해 달성된다:
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재-산화가 회피되므로, 개시된 공정은 항체가 원래의 폴딩을 유지하고 온전하게 남아 있도록 한다. 따라서, 본 발명은 시스테인-기반 부위-특이적 ADC의 약물 접합 공정을 심오하게 개선하고 간략하게 하는 신규한 방법을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 특정 양태에서, 시스테인 돌연변이 항체는 다이티오니트로벤조에이트가 배지에 첨가될 때, 니트로티오벤조에이트로 캐핑된다. 이러한 양태에서, 엘만 시약(Ellman's reagent)(또한 5,5'-다이티오비스-(2-니트로벤조산) 및 DTNB로 공지됨)은 티오니트로벤조에이트(TNB)를 세포주, 예를 들어 CHO 세포주에 의해 발현된 항체에 첨가하는 작용을 한다. 이어서, 항체 정제가 수행되고, 티오니트로벤조에이트 캐핑을 갖는 다수의 단백질 종을 생산할 수 있다(본 발명의 실시예 1 참고).
본 발명의 다른 양태에서, 항체의 TNB 캐핑은, 예를 들어 DSC에 의해 측정된 열적 안정성을 감소시키지 않아서, 시스테인일화된, 캐핑되지 않은 및 TNB-캐핑된 항체가 거의 동일하게 거동하도록 한다(본 발명의 실시예 2 참고).
본 발명의 또 다른 양태에서, TNB-캐핑된 항체는 TSPP에 의해 선택적으로 환원된다. 이러한 양태에서, 이러한 공정에서 생성된 유리 티올 기는 쇄간 환원 및 재-산화 단계 없이 직접 약물 접합을 가능하게 하고, 이에 따라, 시험관내 조작 공정의 속도를 높인다(실시예 3 참고).
본원에 기술된 바와 같이, 본 발명의 다른 양태는 추가적인 유형의 약물 접합 화학반응에 유용한 TNB 또는 유사한 불안정한 성분 이외에 화학적 "핸들"을 포함하는 유전자조작된 시스테인 캐핑의 형성을 포함한다. 이러한 핸들은 신규한 알킬화 화학 스페이서를 배양 배지에 첨가함으로써, 항체에 추가된다. 알킬화 화학 스페이서는 화학적 핸들, 예컨대 알데하이드, 케톤, 아자이드 및 알킨을 함유한다. 케톤 및 알데하이드의 경우, 이러한 화학적 핸들은 추가적인 접합 화학반응을 위해 아미노옥시 친핵체 또는 하이드라자이드와 반응하여 옥심/하이드라존 생성물을 형성할 수 있다. 아자이드 및 알킨의 경우, 이러한 화학적 핸들은 환첨가 접합을 허용할 수 있다. 추가적인 알킬화 화학 스페이서는 바이오틴의 작용성 도메인을 포함하고, 이는 스트레파비딘과 바이오틴 사이의 특정한 단단한 비-공유 상호작용을 가능하게 한다(화학적 핸들 말레이미도 트라이옥사-4-폼일 벤즈아미드(MTFB), 다이벤조사이클로옥틸-폴리에틸렌 말레이미드(DBCO-PEG4-말레이미드) 및 말레이미드-PEG2-바이오틴(MPB)을 논의하는 실시예 4 참고).
따라서, 본 발명자들은 알킬화 화학 스페이서를 배양 배지에 첨가함으로써, 화학적 핸들, 예컨대 알데하이드 기로 이루어진 신규한 Cys-캐핑이 유전자조작될 수 있음을 추가적으로 증명하였다. 이러한 신규한 캐핑은 추가적인 약물 접합 화학반응을 위한 화학적 핸들(부분적으로 본원에 도시됨)을 제공할 수 있다:
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R - 알킬, 아릴, 헤테로아릴, 아자이드, 알킨, 알데하이드, 케톤, 세포독성 페이로드(payload)(오리스타틴, 칼리치아미신, 메이탄시노이드, 스플리서스타틴, CPI/CTI 이량체 등)
추가 양태는 0 또는 낮은 수준의 시스테인, 시스틴 및 글루타치온을 갖는 배양 배지에서 HEK293 일과성 또는 CHO 안정한 발현을 통한 완전히 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체의 생성을 포함한다(실시예 5 및 6 참고).
본원에서, 0 또는 낮은 수준의 시스테인, 시스틴 및 글루타치온을 갖는 배양 배지의 인용 또는 논의는 0 내지 5 mM 시스테인, 바람직하게는 0 내지 1 mM 시스테인, 가장 바람직하게는 0.2 mM 시스테인; 및 0 내지 5 mM 글루타치온, 바람직하게는 0 내지 1 mM 글루타치온, 가장 바람직하게는 0.2 mM 글루타치온을 갖는 배지를 지칭한다. 이러한 특징적인 성분 수준을 갖는 배지는 시판 중이거나 통상적인 기술을 사용하여 시판 중인 배지로부터 용이하게 제조될 수 있다. 때때로, 0 또는 낮은 수준의 시스테인, 시스틴 및 글루타치온을 갖는 배양 배지는 "삼중-부재(triple-free)" 배지 또는 "삼중-저(triple-low)" 배지로 지칭된다.
본원에 사용된 용어 "알킬"은, 자체로 또는 다른 용어의 일부로, 표시된 수의 탄소 원자를 갖는 직쇄 또는 분지쇄 포화 탄화수소를 지칭한다(예컨대, "C1-C6" 알킬은 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기를 지칭함). 알킬 기는 전형적으로 1 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소 원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 4개의 탄소 원자를 포함한다. 탄소 원자의 수가 표지되지 않은 경우, 알킬 기는 1 내지 8개 또는 1 내지 6개의 탄소 원자를 갖는다. 대표적인 직쇄 C1-C8 알킬은, 비제한적으로, 메틸, 에틸, n-프로필, n-부틸, n-펜틸, n-헥실, n-헵틸 및 n-옥틸을 포함하고; 분지쇄 C1-C8 알킬은, 비제한적으로, 이소프로필, sec-부틸, 이소부틸, tert-부틸, 이소펜틸 및 2-메틸부틸을 포함하고; 불포화된 C2-C8 알킬은, 비제한적으로, 비닐, 알릴, 1-부텐일, 2-부텐일, 이소부틸렌일, 1-펜텐일, 2-펜텐일, 3-메틸-1-부텐일, 2-메틸-2-부텐일, 2,3-다이메틸-2-부텐일, 1-헥실, 2-헥실, 3-헥실, 아세틸렌일, 프로핀일, 1-부틴일, 2-부틴일, 1-펜틴일, 2-펜틴일 및 3-메틸-1-부틴일을 포함한다. 본원에서 "알킬"에 대한 언급은 상기 비치환된 및 치환된 성분을 지칭한다.
본원에 사용된 용어 "아릴"은, 자체로 또는 다른 용어의 일부로, 모 방향족 고리 시스템의 단일 탄소 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도된 5 내지 20개, 바람직하게는 5 내지 14개 또는 6 내지 14개의 탄소 원자의 치환된 또는 비치환된 1가 탄소환형 방향족 탄화수소 라디칼을 의미한다. 전형적인 아릴 기는, 비제한적으로, 벤젠, 치환된 벤젠, 나프탈렌, 안트라센, 바이페닐 등으로부터 유도된 라디칼을 포함한다.
"헤테로아릴"은 2 내지 10개, 2 내지 14개 또는 2 내지 20개의 탄소 원자, 바람직하게는 3 내지 8개의 탄소 원자(또한 고리원으로서 지칭됨), 및 N, O, P 및 S로부터 독립적으로 선택되는 1 내지 4개의 헤테로원자 고리원을 갖고, 모 고리 시스템의 고리 원자로부터 하나의 수소 원자를 제거함으로써 유도되는 1가 치환된 또는 비치환된 방향족 일환형, 이환형 또는 삼환형 고리 시스템을 지칭한다. 헤테로사이클릴 중 하나 이상의 N, C 또는 S 원자는 산화될 수 있다. 헤테로아릴은 일환형, 이환형 또는 삼환형 고리 시스템일 수 있다. 대표적인 헤테로아릴은 비제한적으로 트라이아졸일, 테트라졸일, 옥사다이아졸일, 피리딜, 퓨릴, 벤조퓨라닐, 티오페닐, 벤조티오페닐, 퀴놀린일, 피롤릴, 인돌일, 옥사졸일, 벤족사졸일, 이미다졸일, 벤즈이미다졸일, 티아졸일, 벤조티아졸일, 이속사졸일, 피라졸일, 이소티아졸일, 피리다진일, 피리미딘일, 피라진일, 트라이아진일, 신놀린일, 프탈라진일, 퀴나졸린일, 피리미딜, 아제핀일, 옥세핀일 및 퀴녹살린일을 포함한다. 헤테로아릴은 선택적으로 치환된다.
본원에 사용된 용어 "소정"은 우연히 존재하는 화학 성분과는 반대로, 본 발명의 실시자에 의해 선택되는 화학 성분을 지칭한다. 따라서, "소정 캐핑 성분"은 항체의 시스테인 잔기 상의 배치(즉, 이로의 공유 결합)를 위해 본 발명의 실시자에 의해 선택되는 캐핑 성분이다. 소정 캐핑 성분은 전형적으로 항체 상의 특정하고 바람직한 캡의 존재를 야기하도록 배양 배지에 첨가하기 위해 선택되는 성분이다. 소정 캐핑 성분은 일반적인 목적의 배양 배지에서 발견되지 않는다.
추가 양태는 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체로의 페이로드 또는 연결기-페이로드의 직접 접합을 포함한다.
단지 매우 낮은 백분율의 유리 시스테인 잔기가 IgG1, IgG2 및 IgG4의 재조합 항체에서 종전에 검출되었으므로(문헌[Zhang and Czupryn 2002]), 포유동물 세포의 항체에서 완전히 캐핑되지 않은 용매-노출된 짝이 없는 Cys의 생산이 특별함은 주목할 만하다. 통상적인 IgG에 대한 표준적인 Cys 잔기는 아마 다이설파이드-결합된다. 낮은 수준의 유리 Cys는 아마 2개의 원인에 기인한다: 하나의 원인은 중쇄들 사이 또는 중쇄와 경쇄 사이의 쇄간 다이설파이드 결합의 열화이다. 쇄간 다이설파이드 결합을 형성하는 Cys 잔기는 환원되기 쉬운데(문헌[Liu and May 2012]), 이들이 고도로 용매-노출되기 때문이다. 염기성 조건 하에, 다이설파이드 결합은 데하이드로알라닌 및 퍼설파이드로 분해될 수 있고, 다시 Cys로 돌아갈 수 있다(문헌[Florence 1980]). 다른 원인은 생합성 중에 쇄간 다이설파이드 결합의 불완전한 형성이다. 쇄간 Cys 및 다이설파이드 결합은 역평행 β-시트 구조 내에 묻히고 용매-노출되지 않는다. 본 연구의 항체에 존재하지 않는 비-표준적인 생식 계열 Cys는 항체 가변 영역에 존재하는 것으로 공지되어 있다. 인간 생식 계열에서 이의 빈도는 비교적 드물고 6 내지 10%의 범위이다(문헌[Ehrenmann, Kaas et al. 2010, Buchanan, Clementel et al. 2013]). 몇몇 보고서(문헌[Kroon, Baldwin-Ferro et al. 1992], 문헌[Johnson, Oliver et al. 1997], 문헌[Gadgil, Bondarenko et al. 2006], 문헌[Banks, Gadgil et al. 2008], 문헌[Buchanan, Clementel et al. 2013])는 이러한 비-표준적인 Cys가 단백질 안정성 및 응집에 대해 적은 효과를 가짐을 나타낸다. 이러한 비-표준적인 Cys의 일부는 용매-노출되고 시스테인일화되는 것으로 밝혀졌다(문헌[Banks, Gadgil et al. 2008], 문헌[Buchanan, Clementel et al. 2013]). 본 연구의 발명에 따르면, 이러한 비-표준적인 Cys의 시스테인일화는 아마 포유동물 세포의 외부에서 발생한다.
티올 민감성은 외인성 인자, 예컨대 산화성 환경뿐만 아니라 내인성 인자, 예컨대 용매 민감성 및 국지적인 Cys 환경에 의존한다. Fab, Fc, 중쇄 또는 경쇄 영역에서의 Cys 인자는 시스테인일화 변형에 영향을 주는 인자가 아닌 것으로 나타났다(문헌[Banks, Gadgil et al. 2008], 문헌[Junutula, Raab et al. 2008], 문헌[Chen, Nguyen et al. 2009], 문헌[Buchanan, Clementel et al. 2013]). 시스테인일화 또는 글루타치온일화의 생물학적 결론은 불명확하다. 다수의 단백질, 예컨대 티로신 포스파타제 및 분자 차페론은 산화환원-민감성 Cys를 함유한다(문헌[Georgiou 2002], 문헌[Barford 2004]). 항체의 경우, 비-표준적인 Cys로부터의 시스테인일화의 제거는 단백질 2차 구조에 영향을 주지 않지만, 응집을 감소시키고 융점을 상승시킴으로써, 단백질 3차 또는 4차 구조를 개선한다(문헌[Banks, Gadgil et al. 2008]). 본 연구에서 Fc Cys의 경우, 시스테인일화는 단백질 구조 안정성에 전혀 효과가 없다.
밝혀진 신규한 세포 기전: 본 연구로부터의 데이터에 근거하면 짝이 없는 표면 시스테인의 Cys-캐핑은 아마도 포유동물 세포의 외부에서 발생할 것이고, Cys-캐핑 변형에 대한 가정적인 모델이 제안된다(도 7). 항체 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드는 Sec61 복합체를 통해 ER 루멘으로 전좌된다(문헌[Schwartz and Blobel 2003]). 천연 다이설파이드 결합은 Ero1 경로 또는 다른 산화 공급원으로부터의 산화력을 갖는 PDI 단백질 계열을 통해 형성된다. 부정확한 다이설파이드 결합은 시토솔 글루타치온 환원효소로부터 생성되는 GSH에 의해 환원되고(문헌[Chakravarthi, Jessop et al. 2006]), 막 운송체를 통해 수입된다(문헌[Hwang, Sinskey et al. 1992], 문헌[Banhegyi, Lusini et al. 1999], 문헌[Le Gall, Neuhof et al. 2004]). 완전히 어셈블링된 Cys 돌연변이 항체는 캐핑되지 않은 채로 남아있고, 결과적으로 배양 배지로 분비된다. 배양 배지 내의 Ctn 및 GSH는 다이설파이드 교환을 통해 항체의 유리 Cys와 다이설파이드 결합을 형성하고, 이어서 배지 중의 용해된 산소가 산화된다.
완전히 캐핑되지 않은 Cys가 포유동물 세포에서 생성될 수 있다는 사실은 ER 루멘에 대한 일부 흥미로운 생리학적 산화환원 상태를 나타냈다. 먼저, ER 루멘은 세포외 공간보다 상당히 덜 산화된다. 이것은 적절한 다이설파이드 형성이 ER 루멘에서 산화 및 환원 반응을 둘 다 필요로 하는 개념과 일치한다. 천연 및 비-천연 다이설파이드는 일시적으로 형성되고 정확한 형태를 획득하기 위하여 환원된다. ER에서 산화와 환원 사이의 정확한 평형이, 단백질 폴딩이 완료될 때까지 동력을 보유하는 공유 연결기를 위해 중요한 것으로 제안되었다. ER의 과산화, 비-천연 결합의 안정화, ER의 환원 또는 다이설파이드 형성의 방지는 ER 스트레스 반응을 유발할 수 있다(문헌[Margittai and Sitia 2011]). Ero1 및 다른 산화성 경로는 다이설파이드 형성을 위한 산화력에 공헌하고(문헌[Frand, Cuozzo et al. 2000], 문헌[Sevier and Kaiser 2006], 문헌[Margittai and Banhegyi 2010], 문헌[Sevier 2010]), ER 루멘이 시토솔보다 더 산화되도록 한다(문헌[Hwang, Sinskey et al. 1992]). 동시에, 시토솔 GSH 환원효소에 의해 생성된 GSH의 환원된 형태가 ER 루멘에 수입되어 환원력을 제공할 수 있다(문헌[Jessop and Bulleid 2004], 문헌[Chakravarthi, Jessop et al. 2006], 문헌[Gomez, Vinson et al. 2010]). 효모 세포는 GSH 합성 경로 없이 생존할 수 있고, 이는 효모의 ER 루멘이 포유동물 ER보다 더 산화됨을 시사한다. 효모가 독특한 세포 유기체이므로, 다이설파이드 결합을 갖는 보다 적고 단순한 세포외 단백질이 포유동물 세포보다 덜 복잡한 세포 기능을 수행하는데 요구되는 것이 가능하다. 또한, 덜 산화된 ER은 PDI가 ER 중 미스폴딩(misfolding)된 단백질을, 열화를 위한 역-전좌를 위해 환원시킬 수 있고(문헌[Kopito and Sitia 2000]), 시토솔 운송을 위한 콜레라-톡신 A1 쇄를 언폴딩하고(문헌[Tsai, Rodighiero et al. 2001]), 세포 표면으로 수출될 때 환원효소로서 역할을 할 수 있다(문헌[Yoshimori, Semba et al. 1990], 문헌[Jordan and Gibbins 2006])는 발견에 의해 지지된다.
ER 루멘에 대한 두 번째 사실은 ER 루멘 중 유리 GSH 또는 Cys, 및 단백질의 유리 Cys 잔기가 다이설파이드 결합을 함께 형성하는 경우 PDI의 불량한 기재라는 것이다. 세포외 단백질의 다이설파이드 결합 형성은 PDI 및 산화환원효소 계열 구성원에 의해 촉진되고, 이들의 다이설파이드 결합은 Ero1로부터 전달된다. 어떠한 다이설파이드 결합도 ER 중 항체의 GSH/Cys와 유전자조작된 Cys 사이에 형성되지 않으므로, GSH가 산화된 PDI를 환원시킬 수 있더라도, 이들은 산화환원효소의 기재가 아니다(문헌[Chakravarthi, Jessop et al. 2006]). ER-배치된 GSH의 주요 분획이 ER 단백질과 혼합된 다이설파이드에서 발견되었음이 보고되었다(문헌[Bass, Ruddock et al. 2004)]. GSH와 혼합된 다이설파이드를 형성하는 ER 단백질이 PDI 및 다른 산화환원효소인 것이 가능하다. 시스테인일화 및 글루타치온일화 이외에, 제3 유형의 캐핑이 유전자조작된 Cys와 다이설파이드 결합을 형성하는 여분의 경쇄로서 확인되었음을 언급할만 하다(문헌[Gomez, Vinson et al. 2010]). 삼중 경쇄 형성이 세포내 GSH 생산 및 LC와 HC 사이의 mRNA 비에 의해 영향을 받는 것으로 밝혀졌으므로, 상기 변형의 현장은 아마도 ER 루멘이다.
캐핑률이 로트마다(lot-to-lot) 변하는 이유는 오랫동안 알려지지 않았다(문헌[Banks, Gadgil et al. 2008], 문헌[Junutula, Raab et al. 2008], 문헌[Chen, Nguyen et al. 2009], 문헌[Gomez, Vinson et al. 2010], 문헌[Buchanan, Clementel et al. 2013]). 본 발명자들의 데이터는 이것이 세포 성장 및 배지 제조에 의해 영향을 받을 수 있는 배지 중 불충분한 Cys/Ctn에 기인함을 나타낸다. 글루타치온일화된 물질이 HEK293 일과성 배양물 또는 안정한 CHO의 단기 배양물에서 검출되지 않음을 유의하는 것은 흥미롭다. 이것은 전형적인 포유동물 배양 배지 중 GSH 농도가 매우 낮다는 사실과 일치한다. 한편, 시토솔은 약 2 내지 10 mM GSH를 함유한다(문헌[Meister and Anderson 1983]). 글루타치온일화된 물질은 안정한 CHO 12-일-배양 물질에서 검출될 수 있고(미공개 데이터), 이는 GSH 공급원이 아마 세포 용해로부터 유래됨을 시사한다. 실제로, 배양 배지 중 GSH 농도가 더 긴 배양 일수에 따라 점진적으로 증가하였고 200 μM까지 거의 10-배 더 높아질 수 있음이 보고되었다(문헌[Gomez, Vinson et al. 2010]). 본 연구에서, 과량의 GSH 또는 Ctn을 배양물로 첨가하는 것은 완전히 글루타치온일화된 또는 시스테인일화된 Cys 돌연변이 항체를 생산할 수 있다. 정제된 Cys 항체 종의 글루타치온일화가 Cys/Ctn 산화환원 쌍을 사용함으로써 효과적으로 제거되고 시험관 내에서 시스테인일화와 교환될 수 있음이 종래 보고되었다(문헌[Chen, Nguyen et al. 2009]). GSH에 의한 시스테인일화의 제거 및 시험관내 글루타치온일화의 생성은 아직 보고되지 않았다.
본 발명의 특정 양태에서, 소정 캐핑 성분을 항체 상의 하나 이상의 짝이 없는 시스테인 잔기에 결합하는 방법이 제공되고, 상기 방법은 항체-발현 세포주를, 상기 소정 캐핑 성분, 또는 상기 소정 캐핑 성분의 전구체를 함유하는 배양 배지에서 성장시키는 단계로서, 상기 세포주가 상기 항체를 발현하고, 상기 소정 캐핑 성분이 공유 결합에 의해, 상기 발현된 항체 상의 상기 하나 이상의 짝이 없는 시스테인 잔기에 부착되는 단계를 포함한다. 캐핑 성분은 5-티오-2-니트로벤조산(TNB), 2-머캡토피리딘, 다이티오다이피리딘(DTDP), 4-티오벤조산, 2-티오벤조산, 4-티오벤젠설폰산, 2-티오벤젠설폰산, 메틸 설포네이트(Ms), p-톨루엔설포네이트(Ts) 및 트라이플루오로메탄설포네이트(Tf)로 이루어진 군으로부터 선택되는 것일 수 있지만, 다른 캐핑 성분도 가능하다.
이러한 다른 캐핑 성분은 상기한 바와 같은 소위 화학적 핸들 캐핑 성분, 예컨대 말레이미도 트라이옥사-4-폼일 벤즈아미드(MTFB), 더욱 일반적으로 연결된 아자이드 및 알킨(추가적인 클릭(click) 화학반응을 용이하게 함), 연결된 알데하이드 및 케톤(추가적인 옥심 화학반응을 용이하게 함), 연결된 할로아세틸(티올 및 아민 화학반응을 용이하게 함), 및 연결된 말레이미드(추가적인 티올 화학반응을 용이하게 함)를 포함한다. 첨가 연결 화학반응은 본원에 기술된 바와 같이 또는 공지된 기술에 따라 수행될 수 있다.
본 발명은 또한 (a) 캐핑된 항체를 세포 배양물에서 생산하는 단계(이때, 항체 상의 하나 이상의 짝이 없는 시스테인 잔기는 황 결합을 통해 하나 이상의 소정 캐핑 성분에 공유 결합됨); (b) 상기 캐핑된 항체를, 항체 쇄간 황 결합을 환원시키지 않으면서 상기 항체로부터 상기 캐핑 성분을 제거할 수 있는 환원제에 노출시키는 단계; 및 (c) 환원제를 도입하지 않으면서 상기 항체 상의 하나 이상의 환원된 황 결합을, 연결 성분을 통해 페이로드에 접합시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 접합체(ADC) 또는 단백질 접합체의 생산 방법을 제공한다. 캐핑 성분이 5-티오-2-니트로벤조산(TNB), 2-머캡토피리딘 및 다이티오다이피리딘(DTDP)으로 이루어진 군으로부터 선택되는, ADC를 생산하는 상기 방법이 수행될 수 있다. 5-티오-2-니트로벤조산(TNB)을 갖는 캐핑이 특히 흥미롭다.
이러한 캐핑이 전형적으로 발생하고, 이어서 짝이 없는 시스테인 잔기에서 선택적인 환원이 발생한다.
상기 방법에 사용된 페이로드는 가장 빈번하게는 오리스타틴, 스플리서스타틴, 칼리치아미신, 또는 하나 이상의 CBI, CPI 및 CTI 단량체를 포함하는 이량체이다. 오리스타틴의 경우, (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트라이플루오로아세트산 염); (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트라이플루오로아세트산 염); 모노메틸 돌라스타틴 10; (N-메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-노레페드린); 및 (N-메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌)으로부터 선택될 수 있다.
상기 방법에 사용된 연결기는 종종 mc 또는 mcvcPABC이지만, 예컨대 국제특허공개 제15/110935호에 기술된 것들을 비롯한 많은 다른 연결기도 본 발명의 범주에 속한다. 본원에 사용된 바와 같이, "PABC"는 p-아미노벤질옥시카보닐 및 이로부터 유도된 성분, 예를 들어 하기 구조 또는 이의 변형을 지칭한다:
Figure 112018024016848-pct00006
.
"VC" 또는 "vc"는 펩티드 발린-시트룰린을 지칭한다. "MC" 또는 "mc"는
Figure 112018024016848-pct00007
를 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이, "mcvcPABC"는 하기 연결기를 지칭한다:
Figure 112018024016848-pct00008
.
특정 양태에서, 상기 방법에 사용된 환원제는 전형적으로
Figure 112018024016848-pct00009
또는 R4-S-H이고, 이때 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 (C1-C6)알킬, (C5-C7)아릴 및 (C5-C7)헤테로아릴로 이루어진 군으로부터 선택되고, 각각의 R1, R2, R3 및 R4는 독립적으로 SO3Na, COOH, OH, OMe, NO2 및 NH2로부터 선택되는 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환된다.
종종, 환원제는 하기 화학식의 트리스(3-설포페닐)포스핀(TSPP)이다:
Figure 112018024016848-pct00010
.
본 발명의 양태는 하기 화학식의 다이-TNB(또한 엘만 시약으로 공지됨)를 사용하여, 캐핑 성분 TNB를 항체에 부착하여 세포 배양물 중에서 캐핑된 항체를 생산하는 것을 포함한다:
Figure 112018024016848-pct00011
.
또한, 본 발명의 양태는 하나 이상의 캐핑되지 않고 짝이 없는 시스테인을 포함하는 항체의 생산 방법을 포함한다. 캐핑되지 않고 짝이 없는 시스테인은 노출된 티올 측쇄를 갖는 시스테인 잔기로 정의된다. 이러한 유리 티올 기는 임의의 다른 화학물질과 어떠한 공유 또는 비-공유 결합도 형성하지 않고, 이에 따라 화학적 접합에 반응성이다. 항체 중 캐핑되지 않은 시스테인 잔기의 개략도는 다음과 같다:
Figure 112018024016848-pct00012
.
이러한 방법은 (a) 항체-발현 세포를 저 시스테인, 저 시스틴 및 저 글루타치온 배양 배지에서 성장시키는 단계; 및 (b) 발현된 캐핑되지 않은 항체를 수집하는 단계를 포함한다. 이러한 방법에서, 배양 배지는 전형적으로 5 mM 미만, 1 mM 미만 또는 0.2 mM 미만의 시스테인, 5 mM 미만, 1 mM 미만 또는 0.2 mM 미만의 시스틴 및 5 mM 미만, 1 mM 미만 또는 0.2 mM 미만의 글루타치온을 포함한다. 또한, 이러한 방법에서, 세포주는 CHO, HEK293 및 NSO로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있지만, 물론, 다른 세포주도 본 발명의 범주에 속한다.
추가적으로, 본 발명의 양태는 항체-약물 접합체(ADC) 또는 단백질 접합체의 생산 방법으로서, 상기 방법은 (a)항체-발현 세포를 저 시스테인, 저 시스틴 및 저 글루타치온 배양 배지에서 성장시키는 단계, (b) 하나 이상의 캐핑되지 않고 짝이 없는 시스테인을 포함하는 발현된 항체를 수집하는 단계; 및 (c) 연결기-페이로드를 상기 수집된 항체에 접합시키는 단계를 포함한다.
유사하게, 본 발명은 연결기-페이로드를, 하나 이상의 캐핑되지 않고 짝이 없는 시스테인을 포함하는 단리된 항체에 접합시키는 단계를 포함하는, 항체-약물 접합체(ADC) 또는 단백질 접합체의 생산 방법을 포함한다.
도 1. 도 1a: Fc 영역에 유전자조작된 표면 Cys 돌연변이를 갖는 항체의 시스테인일화 및 글루타치온일화의 개략도. 도 1b: 안정한 CHO-DUKX 세포에서 발현된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광법 도표. 도 1c: HEK293 일과성 발현에서 발현된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광법 도표.
도 2. 배양 배지에 첨가된 과량의 GSH 또는 시스틴은 완전히 글루타치온일화된 또는 시스테인일화된 종의 생성을 야기한다. 도 2a: 과량의 시스틴 또는 글루타치온을 갖는 HEK293 세포에서 일시적으로 발현된 Cys 돌연변이 항체의 SEC 분석. 도 2b: 도 2a에 도시된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석.
도 3. 완전히 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체는 저 시스테인, 시스틴 및 글루타치온("삼중-저") 배지에서 HEK293 일과성 발현에 의해 생성된다. 도 3a: 삼중-저 배지 중에서 HEK293 세포에서 일시적으로 발현된 시스테인 돌연변이 항체의 SEC 분석. 도 3b: 도 3a에 도시된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석.
도 4. 완전히 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체는 삼중-저(저 시스테인, 저 시스틴 및 저 글루타치온) 배지에서 안정한 CHO 발현에 의해 생성된다. 도 4a: 삼중-저 배지 중에서 안정한 CHO-DUKX에서 발현된 시스테인 돌연변이 항체의 SEC 분석. 도 4b: 도 4a에 도시된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석.
도 5. 시스테인 돌연변이 항체는, 다이티오니트로벤조에이트(DTNB, 또한 엘만 시약으로 지칭됨)가 배지에 첨가될 때, 니트로티오벤조에이트(TNB)로 추가로 캐핑된다. 도 5a: CD-CHO 배지(써모-피셔(Thermo-Fischer)(본원에서, CD-CHO 배지는 시판 중인 CD-CHO 배지 또는 등가의 전매 배지 제형을 지칭한다), CD-CHO + 0.5 mM DTNB, 및 삼중-저 배지 중에서 안정한 CHO-DUKX에서 발현된 시스테인 돌연변이 항체의 SDS-PAGE 분석 및 SEC 분석. 도 5b: 도 5a에 도시된 Cys 돌연변이 항체의 질량 분광 분석.
도 6. 시스테인일화된, 캐핑되지 않은 및 니트로벤조에이트-캐핑된 시스테인 돌연변이 항체의 융점을 비교하는 DSC 써모그램, 및 수반되는 데이터 표.
도 7. 포유동물 세포에서 시스테인 돌연변이 항체의 시스테인일화 및 글루타치온일화 변형의 이해되는 가능성 있는 기전.
도 8. TSPP 선택적인 환원 및 직접 접합은 쇄간 다이설파이드 환원/재-산화를 제거한다.
도 9. TNB-캐핑된 항체는 TSPP 환원/접합을 갖는 90% DAR2 ADC를 생산한다. 도 9a: L443C의 온전한 항체에 대해 PNGase F로 분해된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석. 도 9b: mcvcPABC0101 연결기 페이로드의 TSPP 선택적인 환원 및 후속적인 직접 접합.
도 10. TNB-캐핑된 Herc-K290C/K334C는 TSPP 환원/접합을 갖는 90% DAR4 ADC를 생산한다. 도 10a: Fc 영역 K290C/K334C에 대해 PNGase F 및 IdeS로 분해된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석. 도10b: mcvcPABC0101 연결기 페이로드의 TSPP 선택적인 환원 및 후속적인 직접 접합.
도 11. 반응성 티올과는 다른 신규한 화학적 핸들에 의한 신규한 시스테인-캐핑된 화학 스페이서의 생산.
도 12. 안정한 CHO 세포에서 MFTB-캐핑된 HAB08 L443C의 생산. 도 12a: 삼중-저 배지 중에서 MFTB 또는 DTNB의 존재 하에 안정한 CHO 세포의 세포 카운트 및 세포 생존력. 도 12b: MFTB를 갖는 삼중-저 배지 중에서 안정한 CHO 세포에서 발현된 시스테인 돌연변이 항체의 SEC 분석. 도12c: L443C의 온전한 항체에 대해 PNGase F에 의해 분해된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석.
도 13: mcvcPABC0101과의 캐핑되지 않은 항체의 직접 접합을 나타내는 HIC 프로파일. 비교를 위해, 항체 및 통상적인 프로토콜(전체 환원 및 이어지는 재-산화 및 접합)에 의해 합성된 ADC의 HIC 프로파일이 도시된다.
도 14. 일과성 HEK293 세포에서 DBCO-PEG4-말레이미드-캐핑된 K290C 1-암(arm) 항체 8D3의 생산. K290C 1-암 항체 8D3의 온전한 분자에 대해 PNGase F에 의해 분해된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석.
도 15. 안정한 CHO 세포에서 말레이미드-PEG2-바이오틴-캐핑된 HAB08 L443C의 생산. HAB08 L443C의 온전한 항체의 질량 분광 분석.
도 16. 니트로티오벤조에이트-캐핑된 Cys-돌연변이체 K290C 항체는 세포 배양물로의 DTNB 첨가가 적정될 때, 통상적인 시스테인-함유 배지에서 HEK293F 일과성 발현 시스템에 의해 효율적으로 생성된다. K290C 시스테인 돌연변이 항체의 Fc 부분에 대해 Ides 효소에 의해 분해된 시스테인 돌연변이 항체의 질량 분광 분석.
일반적인 과정
세포 배양, 형질감염 및 세포주 개발: 포유동물 세포주를, 37℃에서 5 또는 7% CO2를 갖는 가습된 인큐베이터에서 성장시키고 유지시켰다. CHO 세포 및 HEK293F 세포[아메리칸 타입 컬쳐 콜렉션(American Type Culture Collection: ATCC), 미국 버지니아주 마나사스 소재]를 프리스타일(FreeStyle: 상표) 293 발현 배지(인비트로겐(Invitrogen), 미국 뉴욕주 그랜드 아일랜드 소재)에서 배양하였다. 문헌[Zhong, Kieras et al., J. Biol. Chem. 288(2): 1490-1419 (2013)]에 기술된 대규모 일과성 HEK293 형질감염 공정을 항체 생산을 위해 사용하였다. 안정한 형질감염을 위해, CHO-DUKX 세포를 아데노신(10 mg/L), 데옥시아데노신(10 mg/L) 및 티미딘(10 mg/L)이 보충된 최소 필수 배지 이글 알파 변형(Minimum Essential Medium Eagle Alpha Modification)(시그마-알드리치(Sigma-Aldrich), M0644) 알파 배지에서 성장시켰다. CHO-DUKX 세포를 시스테인 돌연변이체 재조합 항체 단백질을 코딩하는 DNA로 형질감염시키고, 100 nM 메토트렉세이트 및 1 mg/mL G418로 선택하였다. 안정한 풀(pool)은 3주 동안 선택을 가능하게 하였고, 이어서 37℃의 무-혈청 현탁액으로 2 e5 세포/mL로 시딩하였다. 안정한 CHO-DUKX 세포를 100 nM 메토트렉세이트 및 1 mg/mL G418이 보충된 알파 배지에서 유지시켰다. 생산 중에, 세포를 CD-CHO 배지에 시딩하고, 컨디셔닝된 배지를 생산 종료시 수확하고, 정제 전에 원심분리로 제거하였다. 삼중-부재 배지는 포유동물 세포 배양을 위한 최소 필수 배지 이글 알파 변형(시그마-알드리치)-유사 배지이고, 이는 GSH, Cys 및 Ctn을 함유하지 않았다. 이러한 배지는 성장 인자인 인슐린 및 전단 보호제인 중합체(폴리비닐 알코올)를 함유한다.
단백질 정제: rmp단백질 A 수지(지이 헬스케어(GE Healthcare), 미국 뉴저지주 피스카타웨이 소재)를 50 mM 트리스(Tris)(트리스(하이드록시메틸)아미노메탄), 150 mM NaCl, pH 7.5(TBS)로 밤새 4℃에서 사전-평형화시켰다. 상기 수지를 0.2 PES 필터로 여과하고, 컬럼에 패킹하고, 여기에서 2CV의 TBS, 5CV의 CaCl2, pH 7.5, 3CV의 10 mM 트리스, 10 mM NaCl, pH 7.5로 세척하고, 이어서 단백질을 100% 단계의 150 mM 글리신, 40 mM NaCl, pH 3.5로 용리하였다. 단백질을 2 M 글리신, pH 7.2로 pH 3.5까지 적정한 후, 2 M HEPES, pH 8.0을 사용하여 pH를 7.0으로 조정하였다. 단백질을 PBS(137 mM NaCl, 2.7 mM KCl, 8.1 mM Na2HPO4, 2.7 mM KH2PO4, pH 7.2)에 투석한 후, 농축하고, PBS, pH 7.2로 평형화된 슈퍼덱스(Superdex) 200 컬럼 상에 로딩하였다. 피크 분획을 풀링하고, 20 mM 히스티딘, 8.5% 수크로즈, pH 5.8에 투석하고, 이어서 50 kDa MWCO 원심분리 장치를 사용하여 10 mg/mL까지 농축하였다.
N-연결된 글리칸의 탈글리코실화: PNGase F(엔이 바이오랩스(NE BioLabs), 미국 매사추세츠주 소재)를 첨가함으로써, 항체 샘플을 탈글리코실화시켰다. 0.05% TFA(시그마-알드리치, 미국 미주리주 세인트루이스 소재)로 1:1 희석함으로써, 상기 샘플을 산성화시키고, 이어서 액체 크로마토그래피 질량 분광 분석을 수행하였다.
액체 크로마토그래피 질량 분광법: 아길런트(Agilent, 미국 캘리포니아주 산타 클라라 소재) 1200 모세관 HPLC에 커플링된 워터스 제보(Waters Xevo) Q-TOF G2 질량 분광기(워터스(Waters), 미국 매사추세츠주 밀포드 소재)를 사용하여 액체 크로마토그래피 질량 분광(LC-MS) 분석을 수행하였다. 탈글리코실화된 샘플을 65 μL/분의 유량으로 80℃에서 유지된 워터스 BEH300 C4, 1.7 μm, (1.0 x 50 mm) 컬럼 상에서 분리하였다. 이동상 A는 물과 0.05% TFA였고, 이동상 B는 아세토니트릴과 0.05% TFA였다. 단백질을 하기 구배를 사용하여 컬럼으로부터 용리하였다: 0.5분 내에 2% → 20% B, 6분 내에 20% → 40% B, 및 4분 내에 40% → 100% B. 질량 분광기를 800 내지 3,500 m/z를 스캐닝하는 양성 MS 온리 모드로 실행하고, 데이터를 매스린크스(MassLynx)(워터스) 4.1 소프트웨어로 획득하였다. MaxEnt1(워터스) 프로그램을 사용하여 항체에 상응하는 TOF-MS 시그널을 요약하고 데컨벌루팅(deconvoluting)하였다. 시스테인, GSH, TNB 또는 MTFB(말레이미도 트라이옥사-4-폼일 벤즈아미드) 캐핑된 종을 질량 시프트에 의해 측정하였다(Cys: 119.004 Da, GSH: 305.068 Da, TNB:198.175, MTFB: 503.54 Da).
시차 주사 열량계(DSC): Cys 돌연변이 항체 단백질의 열적 안정성을 마이크로칼(MicroCal) 모세관 DSC 시스템, VP-DSC(미국 매사추세츠주 노스햄프턴 소재)로 분석하였다. 히스티딘 수크로즈 제형 중 0.002 mM의 농도의 단백질 샘플을 1시간 당 100℃의 스캔 속도로 10℃부터 110℃까지 가열하였다. 생성된 열 용량은 블랭크 히스티딘/수크로즈 제형 스캔에 대해 차감함으로써 보정되고 마이크로갈로부터의 오리진(Origin)7.0 소프트웨어(오리진랩 코포레이션(OriginLab Corporation), 미국 매사추세츠주 노스햄프턴 소재)로 비-2 스테이트 전이 함수로 정합된 기준선이었다.
참고 실시예
대체로 하기 논의되는 참고 실시예는 본 발명의 실시예에 기술된 발명에 의해 개선된 당해 분야의 중요한 특징의 기술적 수준을 기술한다.
참고 실시예 1: HEK293 일과성 발현에 의해 생산된 시스테인 돌연변이 항체에서 캐핑되지 않은 시스테인 잔기의 검출: CH3 영역에서 시스테인에 대해 변형된 표면 류신을 갖는 모델 항체 HAB08(도 1a)을 조사하였다. 이러한 돌연변이체는 CHO-DUKX 세포에서 안정하게 발현될 때 완전히 시스테인일화되는 것으로 밝혀졌다(대표적인 질량 분광 데이터는 도 1b에 도시됨). 매우 적은 백분율의 글루티온일화된 종을 또한 검출하였다. 본 발명자들이 HEK293 세포로의 일과성 형질감염에 의해 이러한 돌연변이체를 발현시켰을 때, 놀랍게도, 본 발명자들은 약 10% 완전히 캐핑되지 않은 Cys 돌연변이 항체 + 30% 단일 캐핑되지 않은 물질이 검출되었음을 발견하였다. 캐핑되지 않은 Cys 항체의 검출은 일치한 반면에, 백분율은 로트마다 변하였다. 대표적인 질량 분광 데이터는 도 1c에 도시된다. 매우 적은 글루타치온일화된 종을 HEK293 일과성 물질에서 검출하였다. 일과성 HEK293 및 안정한 CHO로부터의 단백질 물질은 둘 다 대체적인 리더-서열 절단을 갖는 소량의 단백질 종을 함유하였다.
참고 실시예 2: 배양 배지 중 과량의 글루타치온 또는 시스틴은 완전히 글루타치온일화된 또는 시스테인일화된 종의 생성을 야기하였다: 참고 실시예 1에서 증명된 바와 같이, 안정한 CHO 세포에 의해 생산된 시스테인 돌연변이 항체는 시스테인일화에 의해 완전히 캐핑되는 것으로 밝혀졌다. HEK293 물질에서 검출된 캐핑되지 않은 종이 프리스타일(상표) 293 발현 배지 중 시스테인 및 시스틴의 불충분한 존재에 기여하는지 여부를 결정하기 위하여, 과량의 이러한 분자를 배양 배지에 첨가하였다. 따라서, HEK293 일과성 생산을, 과량의 시스테인 또는 글루타치온을 갖는 배지에서 수행하였다. HEK293 세포를, 약 1 mM 시스틴을 함유하는 것으로 평가된 프리스타일 배지에서 형질감염시켰다. 형질감염을 24시간에 수행한 후, 형질감염된 세포를 신선한 배지, 또는 추가적인 5 mM Ctn 또는 5 mM GSH(환원된:산화된=1:4)를 함유하는 배지에 재현탁시킴으로써, 배지 교환을 수행하였다. 96시간에 세포 생존력을 측정하고, 컨디셔닝된 배지를 수확하고, 항체를 정제하였다. 배양 조건은 둘 다 SDS-PAGE에서 거의 동일한 세포 성장 생존력(>80%), 단백질 발현 수준(약 30 mg/L), proA 용리 프로파일 및 단백질 이동 패턴을 공유하였다. 도 2a는 분석적인 크기-배제 컬럼(SEC)의 데이터를 도시하고, 이는 1% 미만의 단백질 응집을 갖는 거의 동일한 크로마토그래피를 나타낸다. 도 2b에 도시된 바와 같이, 이의 캐핑 상태를 측정하기 위해 단백질 샘플을 질량 분광법으로 분석하였다. 대조군과 달리, 프리스타일(상표) 293 발현 배지 샘플은 캐핑되지 않은, 1-캐핑된 및 2-캐핑된 불균일한 캐핑 종을 가졌다(도 1c에 도시된 바와 같음). 추가적인 5 mM Ctn을 갖는 배양 배지로부터의 단백질 샘플을 완전히 시스테인일화-캐핑하고, 추가적인 GSH를 갖는 배양 배지로부터의 단백질 샘플을 완전히 글루타치온일화-캐핑하였다. 따라서, 충분한 양의 시스테인 또는 글루타치온을 배양 배지에 첨가함으로써, 완전히 시스테인일화된 또는 글루타치온일화된 시스테인 돌연변이 항체를 생산하였다.
상기 참고 실시예 및 하기 본 발명의 실시예는 시스테인-캐핑이 포유동물 세포 내부에서가 아니라 외부에서 발생함을 증명한다. 이는 다른 시약에 의한 시스테인 캐핑이, 이러한 시약이 세포 배양 중에 배지에 직접 첨가되는 경우에 생산될 수 있음을 암시한다. 신규한 캐핑된 물질은 약물 접합 공정에 대한 이점을 잠재적으로 제공할 수 있다.
실시예
하기 실시예는 본 발명의 중요한 특징을 설명한다.
실시예 1: 시스테인 돌연변이 항체는 다이티오니트로벤조에이트가 배지에 첨가될 때 니트로티오벤조에이트로 캐핑된다: 엘만 시약, 5,5'-다이티오비스-(2-니트로벤조산)(DTNB)을 티오니트로벤조에이트(TNB)를 첨가하기 위한 캐핑제로서 조사하였다. (DTNB는 단백질에서 유리 티올 함량을 검정하기 위해 통상적으로 사용된다. 이러한 시약은 다이설파이드 결합을 파괴할 수 있지만, 유리 Cys와 반응할 수 있다. 이것은 항체 물질을 부분적으로 생성하여 약물 접합을 위한 4개의 유리 Cys를 생성하는데 사용될 수 있다.) 시스테인 돌연변이 항체를 안정하게 발현하는 CHO 세포주를 CD-CHO 배지에서 4 x 10 e6/mL까지 성장시킨 후, 신선한 CD-CHO 배지, 0.5 mM DTNB를 갖는 신선한 CD-CHO 배지, 또는 대조군으로서 삼중-저 배지로 스위칭하였다. 세포를 이러한 조건 하에 72시간 동안 배양하고, 세포 생존력을 측정하고, 컨디셔닝된 배지를 수확하였다. DTNB를 갖는 배지에서 안정한 CHO 세포의 세포 생존력은 40%까지 떨어지고, 이는 아마도 DTNB가 CHO 세포에 독성임을 나타낸다. DTNB 세포 배양의 색은 황색으로 변하고, 이는 유리 티오니트로벤조에이트가 배양물에 존재하고 세포 표면 단백질에 대한 알킬화가 발생함을 시사한다. DTNB-함유 배지에서의 단백질 발현은 또한 CD-CHO에서보다 5배 더 낮았다. ProA 컬럼으로부터의 항체 정제, 및 모든 3개의 배양 조건 물질로부터의 SDS-PAGE에서의 단백질 이동은 도 5a에 도시된 바와 같이 거의 동일하였다. SEC 분석에서 모든 3개의 샘플은 매우 적은 응집을 갖는 단량체 종을 나타낸다. 표 1에 제시된 바와 같이, 모든 3개의 캐핑 형태는 약 2% 응집을 가지면서 약 10 mg/mL까지 농축될 수 있고, 단백질은 동결-해빙 처리 후에 안정하였다.
[표 1]
Figure 112018024016848-pct00013
도 5b에 도시된 바와 같이, 질량 분광 데이터는 대조군 CD-CHO 배지가 완전히 시스테인일화된 물질을 생산하였고(238 Da의 질량 증가) 삼중-저 배지가 완전히 캐핑되지 않은 물질을 생성하였음을 나타낸다. DTNB 배지는 티오니트로벤조에이트 캐핑을 갖는 다수(>70%)의 단백질 종을 생산하였다(약 396 Da의 질량 증가). 약 1 mM 시스틴이 배지에 존재하므로, 작은 백분율의 완전히 시스테인일화된 종이 또한 존재하였다. 따라서, DTNB는 시스틴보다 더 시스테인-캐핑에 효율적이었다. DTNB이 하전된 분자이지만 막 투과성이 아니므로, 이러한 결과는 시스테인 캐핑이 세포 외부에서 발생하였음을 나타내는 추가 증거를 제공한다.
실시예 2: 항체의 TNB 캐핑은 열적 안정성을 감소시키지 않는다: TNB 캐핑의 결과를 조사하여 이러한 캐핑에 의해 유도된 구조적 변화가 항체를 불안정하게 하는지 여부를 결정하였다. DSC를 사용하여 시스테인일화, 캐핑되지 않은 또는 티오벤조에이트-캐핑된 항체의 열적 안정성을 모니터링하였다. 도 6에 도시된 바와 같이, 시스테인일화된, 캐핑되지 않은 및 TNB-캐핑된 항체는 69℃ 초과의 Tm1을 갖고 거의 동일하게 거동하였다. 캐핑되지 않은 물질에 비해 융점의 6℃ 감소를 야기하는 것으로 공지된 Fab 영역에서의 시스테인일화(문헌[Banks, Gadgil et al. 2008])와 대조적으로, CH3 영역에서 짝이 없는 Cys의 시스테인일화 및 니트로벤조에이트-캐핑은 항체의 구조적 안정성에 대한 영향을 나타내지 않았다. 이는, 캐핑되지 않은 Cys를 갖는 항체가, 단백질 응집이 거의 없이, 10 mg/mL까지 농축될 수 있다는 관찰과 일치하고, 반응성 티올이 단백질 올리고머화를 유발한다는 가정에 반박한다.
실시예 3: TSPP에 의한 TNB-캐핑된 항체의 선택적인 환원: TNB로 캐핑된 시스테인 돌연변이 항체는 TSPP에 의해 선택적으로 환원된다(도 8). 생성된 유리 티올 기는 쇄간 환원 및 재-산화 단계 없이 직접 약물 접합을 가능하게 하고, 이는 시험관내 조작 공정을 빠르게 한다. 또한, 도 9a에 도시된 바와 같이, TNB로 완전히 캐핑된 허셉틴 L443C(항체 당 2개의 캐핑, 또는 DAR2)를 생성하고, 질량 분광법을 통해 분석하였다. DAR2 TNB-캐핑된 항체를 HIC에 의해 분석된 90% 효율로 TSPP 처리 후에 직접-접합시켰다(도 9b). 유사하게, 항체 당 4개의 캐핑의 형태(DAR4)인 TNB로 완전히 캐핑된 허셉틴 K290CK334C를 생성하고, IDES 및 PNGase F 분해 후에 질량 분광법을 통해 분석하고(도 10a), 90%의 효율로 TSPP 처리 후에 직접-접합시켰다(도 10b).
추가의 예로서, TNB-캐핑 및 접합(K290C/K334C)이 본원에서 논의된다. 시스테인 돌연변이체 접합에 관한 TNB-캐핑된 접합 프로토콜은 조질 접합체를 야기하는 2개의 단계로 이루어진다: 선택적인 환원 및 접합. 제1 단계에서, 돌연변이체 시스테인(쇄간 다이설파이드가 아님)의 선택적인 환원이 수행되어 돌연변이체 시스테인 잔기로부터의 보호기의 제거를 달성한다. 전형적으로, 과량(약 10 당량)의 환원제, 예컨대 트리스(3-설포페닐 포스핀)(TSPP)을 25℃에서 2시간 동안 사용하여 수행된다. 특정한 경우에, 0.5 mL 에펜도르프 튜브 중 1 mg(6.9 nmol; PBS 중 7.6 mg/mL; 131.58 μL)의 K290C/K334C 항체에 39.2 μg의 TSPP(10 당량; 69.05 nmol; 물 중 50 mM; 1.38μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 2시간 동안 항온처리하였다.
제2 단계에서, 비보호된 돌연변이체 시스테인을 연결기-페이로드에 접합시켰다. 전형적으로, 과량(약 10 당량)의 연결기-페이로드를 반응에 첨가하고, 반응을 25℃에서 1시간 동안 수행하여 조질 접합체를 생산하였다. 따라서, 특정한 경우에, 상기 단계 1로부터의 반응 혼합물에 92.6 μg의 mcvcPABC0101 연결기-페이로드(10 당량, 69.05 nmol; 다이메틸설폭사이드 중 10 mM; 6.9 μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 검정을 사용하여 반응 혼합물을 분석하였다.
실시예 4: 추가적인 약물 접합 화학반응을 위한 화학적 핸들을 갖는 추가적인 유전자조작된 시스테인 캐핑: 본 발명의 다른 적용은 신규한 알킬화 화학 스페이서를 배양 배지에 첨가함으로써, 신규한 캐핑(즉, TNB가 아님)을 유전자조작하는 것이다. 도 11에 도시된 바와 같이, 이러한 알킬화 화학 스페이서는 화학적 핸들, 예컨대 알데하이드 또는 아자이드 작용기를 함유하고, 추가적인 약물 접합 화학반응을 가능하게 한다. 케톤/알데하이드의 경우, 이들은 추가적인 접합 화학반응을 위해 아미노옥시 친핵체 또는 하이드라자이드와 반응하여 옥심/하이드라존 생성물을 형성할 수 있다.
말레이미도 트라이옥사-4-폼일 벤즈아미드(MTFB)는 PEG3 연결기 및 4-폼일벤즈아미드를 갖는 말레이미드이다(솔룰링크 인코포레이티드(Solulink Inc), 미국 캘리포니아주 샌 디에고 소재). 하기 제시된 바와 같이, MTFB는 알데하이드 기를 갖는 알킬화 화학 스페이서이다:
Figure 112018024016848-pct00014
.
도 12a에 도시된 바와 같이, 항체 HAB08L443C를 안정하게 발현하는 CHO-DUKX 세포를 CD-CHO 배지에서 약 2.5 e6 세포/mL까지 37℃에서 성장시키고, 이어서 삼중-저 배지(0 또는 저 Cys, Ctn 및 GSH)로 스위칭하였다. DMSO에 용해된 19.8 mM MTFB를 24시간 동안 0.25 mM의 최종 농도로 50 mL 세포 배양에 첨가하였다. 세포 생존력을 측정하고, 컨디셔닝된 배지를 수확하였다. 0.5 mM DTNB를 갖는 제어된 배양물과 비교하여, MTFB를 갖는 조건에서의 세포 생존력 및 세포 카운트는 상당히 적었다. 이어서, 이러한 조건에서의 항체 HAB08L443C를 1 mL-ProA 컬럼으로 정제하였다(도 12b). 이러한 항체는 먼저 PNGF에 의해 분해되어 Fc-글리칸 및 IDES를 제거하여 Fab2를 443 Cys를 함유하는 scFc로부터 분리하는 2-파트 LC/MS 연구를 거쳤다. 도 12c에 도시된 바와 같이, MTFB-캐핑된 HAB08 L443C 항체 종을 생산하였다.
MTFB-캐핑된 항체의 알데하이드 기를 하이드라진 또는 아미노옥시-함유 페이로드, 예컨대 아미노옥시-PEG3-C2-아미드-MMAD와 반응시켰다. 10 μM의 항체 및 페이로드를 0.3 M Na 포스페이트(pH 7.0) 중에서 새로이 제조된 100 mM 아닐린의 존재 하에 항온처리하였다. 반응을 실온에서 24시간 동안 수행하여 하이드라존 또는 옥심 생성물을 생성하였다. 최종 접합된 항체를 HIC 컬럼을 통해 정제하였다.
화학적 핸들, 예컨대 알킨 또는 아자이드 작용기를 함유하는 알킬화 화학 스페이서는 환첨가 접합을 가능하게 한다. 하기 제시된 바와 같이, 다이벤조사이클로옥틸-폴리에틸렌 말레이미드(DBCO-PEG4-말레이미드)는 PEG4 연결기 및 다이벤조사이클로옥틸을 갖는 말레이미드(클릭 케미스트리 툴스(Click Chemistry Tools), 미국 애리조나주 스코츠데일 소재)이다. 아지도-PEG3-말레이미드는 PEG3 연결기 및 아지도 도메인(클릭 케미스트리 툴스, 미국 애리조나주 스코츠데일 소재)을 갖는 말레이미드이다.
Figure 112018024016848-pct00015
(DBCO-PEG4-말레이미드)
Figure 112018024016848-pct00016
(아지도-PEG3-말레이미드)
DBCO-PEG4-말레이미드를 갖는 신규한 Cys-캐핑이 생성되는 것을 증명하기 위하여, HEK293F 세포를, 2 L의 프리스타일 배지 중 1-암 항체 8D3K290C를 사용하여 2.0 e6 세포/mL의 세포 밀도로 37℃에서 일시적으로 형질감염시켰다. 형질감염-후 24시간에, HEK293F 세포를 삼중-저 배지(0 또는 저 Cys, Ctn 및 GSH)로 37℃에서 추가로 96시간 동안 스위칭하였다. 컨디셔닝된 배지를 수확하고, 여과하고, 37℃에서 추가로 24시간 동안 DMSO에 용해된 29.6 mM의 저장 농도로부터 0.14 mM DBCO-PEG4-말레이미드의 최종 농도로 항온처리하였다. 이러한 컨디셔닝된 배지로부터의 1-암 항체 8D3K290C를 5 mL-ProA 컬럼으로 후속적으로 정제하였다. 이러한 항체는 먼저 PNGase F로 분해되어 Fc-글리칸을 제거하는 LC/MS 연구를 거쳤다. 도 14에 도시된 바와 같이, DBCO-PEG4-말레이미드-캐핑된 8D3K290C 항체 종을 생산하였다. 유사하게, 아자이드-PEG3-말레이미드-캐핑된 8D3K290C를 생산하였다.
환첨가 접합 반응을 위하여, PBS 완충액 중 10 μM 아지도-PEG3-말레이미드-캐핑된 항체를 100 μM 다이벤조사이클로옥틸-폴리에틸렌 글리콜(DBCO-PEG)-MMAF(에이씨엠이 바이오사이언스(ACME Bioscience); 미국 캘리포니아주 팔로 알토 소재)와 함께 실온에서 16시간 동안 항온처리하였다. 1 mM 나트륨 아자이드를 첨가하여 구리-부재 클릭 접합 반응을 중단시켰다. 접합된 항체를 HIC 컬럼으로 정제할 수 있다.
추가적인 신규한 Cys-캐핑 예는 바이오틴의 작용성 도메인을 갖는 알킬화 화학 스페이서를 포함한다. 바이오틴에 의한 Cys-캐핑은 세포 이미징 및 단백질 표지를 위한 스트레파비딘과 바이오틴 사이의 특정 비-공유 상호작용을 가능하게 한다. 하기 제시된 바와 같이, 말레이미드-PEG2-바이오틴(MPB)은 PEG2 연결기 및 바이오틴 도메인을 갖는 말레이미드이다.
Figure 112018024016848-pct00017
항체 HAB08L443C를 안정하게 발현하는 CHO-DUKX 세포를 37℃에서 CD-CHO 배지 중에서 약 2.5 e6 세포/mL까지 성장시키고, 이어서 삼중-저 배지(0 또는 저 Cys, Ctn 및 GSH)로 스위칭하였다. 20 mM 말레이미드-PEG2-바이오틴을 50 mL 세포 배양물에 48시간 동안 0.2 mM의 최종 농도로 첨가하였다. 세포 생존력 및 세포 카운트는 MPB-처리에 의해 영향을 받지 않았다. 이어서, 이러한 배양 조건 하에 항체 HAB08L443C를 1 mL-ProA 컬럼에 의해 정제하고, 둘 다 PNGase F에 의해 분해되어 Fc-글리칸 및 IDES를 제거하여 Fab2를, 443 Cys를 함유하는 scFc로부터 분리하는 2-파트 LC/MS 연구를 거치게 하였다. 도 15에 도시된 바와 같이, MPB-캐핑된 HAB08 L443C 항체 종을 생산하였다.
실시예 5: 0 또는 저 시스테인-, 시스틴- 및 글루타치온-배지에서 HEK293 일과성 발현을 통한 완전히 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체의 생성: 배양 배지 내의 과량의 시스테인 또는 글루타치온의 첨가가 시스테인 돌연변이 항체의 캐핑 상태에 영향을 준다는 발견은 시스테인 캐핑이 세포의 외부에서 발생함을 시사한다. 이를 더욱 조사하기 위하여, 시스테인, 시스틴 및 글루타치온이 결핍된 배지(소위 "삼중-저" 배지)를 생성하였다. 특정 이론으로 제한하려는 것은 아니지만, ER 루멘이 충분한 시스테인, 시스틴 및 글루타치온을 함유하므로(다른 배지 성분, 예컨대 세린 및 메티오닌으로부터 합성가능함), 시스테인일화 및 글루타치온일화가 세포 내에서 발생되는 경우(통상적으로 추측되는 바와 같음), 실질적으로 시스테인일화된 또는 글루타치온일화된 항체가 여전히 삼중-저 배지를 사용하여 생성된 항체에서 검출되어야 하는 것으로 의심되었다. 반대로, 배지에 이용가능한 캐핑 공급원이 전혀 존재하지 않으므로, 시스테인일화 및 글루타치온일화가 세포 외부에서 발생하는 경우, 시스테인 돌연변이 항체는 삼중-저 배지에서 생산될 때 완전히 캐핑되지 않아야 한다. 균형잡힌 프리스타일(상표) 293 발현 배지 내의 HEK293 세포를 형질감염시키고, 이어서 신선한 프리스타일(상표) 293 발현 배지(대조군) 또는 삼중-저 배지 내로 재현탁하였다. 형질감염을 24시간에 완료하였다. 96시간에 세포 생존력을 측정하고, 컨디셔닝된 배지를 수확하였다. 삼중-저 배지의 경우, 배양 세포 생존력은 50%인 반면, 프리스타일(상표) 293 발현 배지에서의 세포 생존력은 80%였다. (이러한 생존력 관찰은 예측되지 못했다. Cys가 비필수 아미노산이더라도, 세포는 Cys의 직접 공급을 결여하는 변화로 변경될 시간을 여전히 필요로 할 것이다.) 단백질 합성이 즉각적인 시스테인 공급의 결핍에 기인하여 느려질 것이므로, 삼중-저 배지에서의 단백질 발현은 균형잡힌 배지보다 5-배 낮았다. ProA 컬럼으로부터의 항체 정제 및 SDS-PAGE에서의 단백질 이동은 거의 동일하였다(데이터는 도시되지 않음). 도 3a는 SEC 데이터를 도시하고, 이는 1% 미만의 단백질 응집을 갖는 거의 동일한 크로마토그래피를 나타낸다. 이어서, 단백질 샘플을 이의 캐핑 상태 측정을 위해 질량 분광법에서 분석하였다. 도 3b에 도시된 바와 같이, 균형잡힌 배지가 유사한 불균일한 캐핑 혼합물을 제공하지만, 흥미롭게도, 삼중-저 배지는 완전히 캐핑되지 않은 종만을 생산하였다(시스테인일화된 종은 존재하지 않았음). 이러한 데이터는 HEK293 세포에서, 시스테인일화 캐핑이 세포의 외부에서 발생하는 것으로 나타났음을 보여준다.
실시예 6: 0 또는 저 시스테인, 시스틴 및 글루타치온 배지에서 안정한 CHO 발현을 통한 완전히 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체의 생성: 실시예 5의 관찰이 세포주 특이적이거나 일과성 발현과 관련될 가능성을 배제하기 위하여, 안정한 CHO-DUKX 세포주를 사용하여 실험을 반복하였다. 시스테인 돌연변이 항체를 안정하게 발현하는 CHO-DUKX 세포주를 CD-CHO 배지에서 4 x 10 e6/mL까지 성장시킨 후, 이러한 세포를 CD-CHO 배지(대조군) 또는 삼중-저 배지로 스위칭하였다. 하나 이상의 대조군은 37℃ 대신에 31℃에서 배양하는 신선한 CD-CHO 배지이다. 72시간에 세포 생존력을 측정하고, 컨디셔닝된 배지를 수확하였다. 삼중-저 배지에서 성장된 세포의 경우, 안정한 CHO 세포의 세포 생존력은 60%였다. CD-CHO 배지에서 성장한 세포에 대한 세포 생존력은 95% 초과였다. 삼중-저 배지에서의 단백질 발현은, 아마도 배지 중 시스테인의 결핍에 기인하여, CD-CHO 배지에서 보다 거의 5-배 적었다. ProA 컬럼으로부터의 항체 정제 및 배지 둘 다로부터의 SDS-PAGE에서의 단백질 이동은 거의 동일하였다(데이터는 도시되지 않음). 도 4a는 매우 적은 응집을 갖는 유사한 SEC 데이터를 도시한다. 질량 분광법에 의해 단백질 샘플을 분석하여 캐핑을 측정하였다. 도 4b에 도시된 바와 같이, CD-CHO 배지의 경우, 시스테인 돌연변이 항체는 37℃ 또는 31℃에서 완전히 시스테인일화되어 배양 온도가 캐핑 상태에 영향을 주지 않았음을 나타냈다. 삼중-저 배지 안정한 CHO 세포는 완전히 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이체 단백질을 생산하였다. 따라서, CHO 세포에서 시스테인일화 캐핑은 세포의 외부에서 발생하는 것으로 나타났다. 이러한 데이터는 삼중-저 배지에서 완전히 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체의 생성이 세포-유형 특이적이 아님을 확인한다.
실시예 7: 캐핑되지 않은 시스테인 돌연변이 항체의 직접 접합: 20 mM 히스티딘, pH 5.8 완충액 중에서 실시예 6으로부터의 0.5 mg(3.45 nmol; 10.19 mg/mL; 49.07 μL) IL13Ra2 L443C 캐핑되지 않은 mAb에 32.0 μg의 mcvcPABC0101 연결기-페이로드(10 당량, 34.52 nmol; 다이메틸설폭사이드 중 10 mM; 1.7 μL)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 25℃에서 1시간 동안 항온처리하였다. 소수성 상호작용 크로마토그래피(HIC) 검정을 사용하여 반응 혼합물을 분석하였다. 도 13은 상응하는 비접합된 항체를 갖는 실시예 7 ADC에 대한 HIC 크로마토그램을 통상적인 방법에 의해 제조된 상응하는 ADC와 비교한다.
실시예 8: 니트로티오벤조에이트-캐핑된 Cys-돌연변이체 K290C 항체는, 세포 배양에 대한 DTNB 첨가가 적정되었을 때, 시스테인-함유 정상 배지 프리스타일(상표) 중에서 HEK293F 일과성 발현 시스템에 의해 효율적으로 생성된다: HEK293F 일과성 발현 중에 니트로티오벤조에이트-캐핑이 통상적인 세포 배양 배지 하에 생성될 수 있는지를 측정하기 위하여, 다양한 농도의 DTNB 용액을 DNA 형질감염 후에 HEK293F 배양물에 첨가하였다. 간략하게, HEK293F 세포를 프리스타일(상표) 배지 중에서 약 1.0 e6/mL까지 성장시켰고, 1 mg의 DNA(Cys-돌연변이체 K290C 항체의 0.5 mg 중쇄 DNA 및 0.5mg 경쇄 DNA)를 실온에서 20분-항온처리 동안 3.5 mg의 형질감염제와 혼합하였다. 혼합물을 1 L의 HEK293F 세포와 항온처리하고, 형질감염된 세포를 37℃에서 배양하였다. 형질감염-후 16시간에 0.5 mM, 1 mM, 2 mM, 3 mM, 4 mM 또는 6 mM의 최종 농도의 DTNB를 40 mM의 저장 농도로부터 1 L 형질감염된 세포 배양물의 50 mL-세포 배양 분취액까지 항온처리하였다. 이러한 세포 배양을 추가로 5일 동안 계속하였다. 컨디셔닝된 배지를 수확하고, 여과하고, 1 mL-ProA 컬럼 정제를 거치게 하였다. 단백질 용리액을 PBS 완충액에 대해 투석하고, 센트리콘을 통해 농축하였다.
도 16에 도시된 바와 같이, 질량 분광 데이터는, DTNB 농도의 증가와 함께, 티오니트로벤조에이트 캐핑을 갖는 단백질 종(약 396 Da의 질량 증가)이 상당히 개선되었음을 나타낸다. 3 mM 초과의 DTNB의 농도에서, 거의 모든 단백질 종이 티오니트로벤조에이트-캐핑되었다. 이러한 결과는 티오니트로벤조에이트-캐핑이 시스테인을 갖는 통상적인 배양 배지 중에서 HEK293F 일과성 발현 동안 생성될 수 있고 티오니트로벤조에이트-캐핑 생성이 시스테인일화 캐핑보다 훨씬 더 효율적인 것으로 보임을 나타낸다.

Claims (21)

  1. 삭제
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. (a) 캐핑된 항체를 세포 배양물에서 생산하는 단계로서, 상기 항체 상의 하나 이상의 짝이 없는 시스테인 잔기가 하나 이상의 소정 캐핑 성분에 황 결합을 통해 공유 결합되는, 단계;
    (b) 상기 캐핑된 항체를, 항체 쇄간 황 결합을 환원시키지 않으면서 상기 캐핑 성분을 상기 항체로부터 제거할 수 있는 환원제에 노출시키는 단계; 및
    (c) 산화제를 도입하지 않으면서 상기 항체 상의 하나 이상의 환원된 황 결합을, 연결 성분을 통해 페이로드(payload)에 접합시키는 단계
    를 포함하며,
    소정 캐핑 성분이 5-티오-2-니트로벤조산(TNB)이고,
    상기 환원제가 하기 화학식의 트리스(3-설포페닐)포스핀(TSPP)이고:
    Figure 112020043051267-pct00046

    상기 페이로드가 오리스타틴, 스플리서스타틴, 칼리치아미신, 또는 하나 이상의 CBI, CPI 및 CTI 단량체를 포함하는 이량체인,
    항체-약물 접합체(ADC) 또는 단백질 접합체의 생산 방법.
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 제4항에 있어서,
    환원이 짝이 없는 시스테인 잔기에서 발생하는, 생산 방법.
  8. 삭제
  9. 제4항에 있어서,
    오리스타틴이 (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-2-메틸-3-옥소-3-{[(1S)-2-페닐-1-(1,3-티아졸-2-일)에틸]아미노}프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트라이플루오로아세트산 염); (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-3-메톡시-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-1-메톡시-3-{[(2S)-1-메톡시-1-옥소-3-페닐프로판-2-일]아미노}-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸알란일-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S,2R)-1-하이드록시-1-페닐프로판-2-일]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드); (2-메틸-L-프롤릴-N-[(3R,4S,5S)-1-{(2S)-2-[(1R,2R)-3-{[(1S)-1-카복시-2-페닐에틸]아미노}-1-메톡시-2-메틸-3-옥소프로필]피롤리딘-1-일}-3-메톡시-5-메틸-1-옥소헵탄-4-일]-N-메틸-L-발린아미드, 트라이플루오로아세트산 염); 모노메틸 돌라스타틴 10; (N-메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-노레페드린); 및 (N-메틸발린-발린-돌라이소류신-돌라프로인-페닐알라닌)으로부터 선택되는, 생산 방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 제4항에 있어서,
    세포 배양물이 캐핑 성분의 전구체를 함유하고, 상기 캐핑 성분의 전구체가 엘만 시약(Ellman's reagent)인, 생산 방법.
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 삭제
  19. 제4항에 있어서,
    연결 성분이 mc 또는 mcvcPABC인, 생산 방법.



  20. 삭제
  21. 삭제
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Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3334760B1 (en) * 2015-08-12 2021-03-10 Pfizer Inc Capped and uncapped antibody cysteines, and their use in antibody-drug conjugation
AU2018218548A1 (en) * 2017-02-08 2019-07-25 Pfizer Inc. Large scale production process for capped and un-capped antibody cysteines and their use in therapeutic protein conjugation
EP3661562B1 (en) * 2017-08-04 2024-10-02 Amgen Inc. Method of conjugation of cys-mabs
US12109273B2 (en) 2019-02-15 2024-10-08 Wuxi Xdc Singapore Private Limited Process for preparing antibody-drug conjugates with improved homogeneity
JP7232925B2 (ja) 2019-02-15 2023-03-03 ウーシー バイオロジクス アイルランド リミテッド 改善された均一性を有する抗体薬物コンジュゲートの調製するプロセス
CA3205650A1 (en) * 2020-12-22 2022-06-30 Novartis Ag Methods for reducing the oxidation level of cysteine residues in a secreted recombinantly-expressed protein during cell culture
WO2023067626A1 (en) * 2021-10-20 2023-04-27 Dr. Reddy's Laboratories Limited A cell culture process to produce an antibody composition

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042175A1 (en) * 1999-01-14 2000-07-20 Bolder Biotechnology Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues

Family Cites Families (20)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5241078A (en) * 1988-06-14 1993-08-31 Cetus Oncology Coupling agents and sterically hindered disulfide linked conjugates prepared therefrom
US7018809B1 (en) * 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
JP4249028B2 (ja) * 2001-12-04 2009-04-02 田辺三菱製薬株式会社 蛋白質の活性化方法
JP5335422B2 (ja) * 2005-06-17 2013-11-06 ノボ ノルディスク ヘルス ケア アクチェンゲゼルシャフト 少なくとも１つの非天然のシステインを含んでいる操作されたタンパク質の選択的な還元および誘導体化
AU2007267798A1 (en) * 2006-05-26 2007-12-06 Ipsen Pharma S.A.S. Methods for site-specific pegylation
US8612161B2 (en) * 2008-03-19 2013-12-17 Intelligent Biosystems Inc. Methods and compositions for base calling nucleic acids
US20090053786A1 (en) * 2007-07-09 2009-02-26 Yung-Hsiang Kao Prevention of disulfide bond reduction during recombinant production of polypeptides
EP2244729B1 (en) * 2008-01-18 2016-11-02 MedImmune, LLC Cysteine engineered antibodies for site-specific conjugation
SG176947A1 (en) 2009-07-03 2012-01-30 Avipep Pty Ltd Immuno-conjugates and methods for producing them
WO2011041721A1 (en) * 2009-10-02 2011-04-07 Biogen Idec Ma Inc. Methods of preventing and removing trisulfide bonds
CN107337734A (zh) * 2009-12-04 2017-11-10 弗·哈夫曼-拉罗切有限公司 多特异性抗体、抗体类似物、组合物和方法
EP2579897A1 (en) 2010-06-08 2013-04-17 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
MX339533B (es) * 2011-05-27 2016-05-30 Abbvie Biotechnology Ltd Composiciones y metodos de daclizumab (dac) del proceso de alto rendimiento (hyp).
MX353608B (es) * 2012-02-24 2018-01-19 Alteogen Inc Anticuerpo modificado en el que el tema que comprende residuos de cisteina esta ligado, conjugado de farmaco de anticuerpo modificado que comprende el anticuerpo modificado y metodo de produccion para el mismo.
WO2014052650A2 (en) 2012-09-26 2014-04-03 Massachusetts Institute Of Technology Modification of peptides via snar reactions of thiols with fluorinated aromatics
EP3065780A1 (en) * 2013-11-04 2016-09-14 Pfizer Inc. Anti-efna4 antibody-drug conjugates
WO2015085003A1 (en) 2013-12-04 2015-06-11 Immunogen, Inc. Compositions and methods for antibody production
PL3099692T3 (pl) 2014-01-27 2019-08-30 Pfizer Inc. Dwufunkcyjne środki cytotoksyczne
SG11201706991YA (en) 2015-03-20 2017-10-30 Pfizer Bifunctional cytotoxic agents containing the cti pharmacophore
EP3334760B1 (en) * 2015-08-12 2021-03-10 Pfizer Inc Capped and uncapped antibody cysteines, and their use in antibody-drug conjugation

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042175A1 (en) * 1999-01-14 2000-07-20 Bolder Biotechnology Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
FASEB J. Feb 2015, 29(2), 1763-1779.*

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