JP2018525990A - キャップ付加および非キャップ付加抗体システイン、および抗体−薬物コンジュゲーションにおけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

操作された不対システイン残基が翻訳後修飾され特定の化学成分でキャップ付加される、哺乳動物細胞における抗体産生プロセスであって、このキャップ付加抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはタンパク質薬物コンジュゲートを形成するためのさらなる部位特異的コンジュゲーションステップによく適している、抗体産生プロセス；特にキャップ付加抗体のシステイン残基の選択的な還元によって形成されるＡＤＣを含む、これらのキャップ付加抗体を用いて生成されたＡＤＣ、および追加の薬物コンジュゲーション化学反応を可能にする、アルデヒド／アジド／アルキン双直交基などのケミカルハンドルを用いて形成したＡＤＣ；ならびに低システイン、シスチンおよびグルタチオン培地中の細胞によって産生される非キャップ付加抗体およびこれらの非キャップ付加抗体への直接的なコンジュゲーションによって生成されるＡＤＣ。【図１】

Description

本発明は、抗体上のシステイン残基のキャッピング状態が生きている細胞内で修飾され得るという発見に基づいている。したがって、本発明は、操作された不対システイン残基が翻訳後修飾され特定の化学成分でキャップ付加される、哺乳動物細胞における抗体産生プロセスに関し、このキャップ付加抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはタンパク質薬物コンジュゲートを形成するためのさらなる部位特異的コンジュゲーションステップによく適している。本発明はさらに、これらのキャップ付加抗体を用いて生成されたＡＤＣ、特に鎖間ジスルフィドの還元を回避し、したがってコンジュゲーション前の（再）酸化ステップの必要性を排除する、キャップ付加抗体のシステイン残基の選択的な還元によって形成されるＡＤＣに関する。本発明はさらに、トリス（３−スルホナトフェニル）ホスフィン（ＴＳＰＰ）または直接的なコンジュゲーションのための関連薬剤による選択的な還元を可能にし、したがって鎖間ジスルフィド還元−再酸化ステップの処理を排除する、新規なニトロベンゾエートキャップ付加抗体に関する。本発明はまた、追加の薬物コンジュゲーション化学反応を可能にする、アルデヒド／アジド／アルキン双直交基（biorthogonal group）などのケミカルハンドルからなる、新規なＣｙｓ−キャッピングを操作することに関する。本発明はさらに、低システイン、シスチンおよびグルタチオン培地中の細胞によって産生される非キャップ付加抗体およびこれらの非キャップ付加抗体への直接的なコンジュゲーションによって生成されるＡＤＣに関する。

ＡＤＣは、抗体療法または伝統的な化学療法に対する臨床効果および耐容性を改善するかなり大きな潜在的可能性のある有望なクラスの標的治療薬として現れてきた。臨床的に有用なＡＤＣは、極めて強力な細胞毒性薬の腫瘍細胞への抗原特異的送達が可能である。ＡＤＣのモノクローナル抗体部分は、健康な細胞よりも腫瘍細胞において実質的に増大している細胞表面抗原を特異的に認識でき、したがって非特異的な取り込みを減少させ、腫瘍細胞によるコンジュゲートした薬物の特異的な取り込みを増加させる。最近の臨床データにより、ブレンツキシマブベドチン：抗ＣＤ３０モノクローナル抗体コンジュゲート、およびアドトラスツズマブエムタンシン：抗ＨＥＲ２モノクローナル抗体コンジュゲートを含めた、２つのＦＤＡ承認ＡＤＣ製品の製品化がもたらされた。第３の市販ＡＤＣは、抗ＣＤ３３モノクローナル抗体コンジュゲートのゲムツズマブオゾガマイシンであり、日本で市販されている。

薬物が抗体と結合する手法（すなわち、コンジュゲーション）は、ＡＤＣ開発の重要な側面である。参照された３つの商用ＡＤＣ製品は全て、従来の非特異的コンジュゲーション法を利用する。ブレンツキシマブベドチンは、溶媒曝露ジスルフィド中の天然システイン側鎖チオールの修飾によって生成されるが、アドトラスツズマブエムタンシンおよびゲムツズマブオゾガマイシンは、表面リジン側鎖アミンの修飾によって作られる。これらの非特異的コンジュゲーション法は、不均一なＡＤＣ混合物をもたらした。

ＡＤＣの治療指数および薬物動態を改善するために、システイン系部位特異的ＡＤＣが最近開発されて、薬物結合部位をより制御するより均一な薬物製品が生成されている。不対システイン残基は、部位特異的標識および薬物コンジュゲーションのためにタンパク質に長い間導入されてきた。Ｌｙｏｎｓら、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．３、７０３〜７０８（１９９０）；Ｚｈｅｎｇら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、３０、９１２５〜９１３２（１９９１）；Ｓｔｉｍｍｅｌら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７５、３０４４５〜３０４５０（２０００）；Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６、９２５〜９３２（２００８）；Ｖｏｙｎｏｖら、Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．２１、３８５〜３９２（２０１０）；およびＳｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３０、１８４〜１８９（２０１２）を参照のこと。これらの操作されたシステイン残基は通常、タンパク質の表面上に配置され、タンパク質構造および機能を変化させない。システイン系部位特異的ＡＤＣは、従来のＣｙｓコンジュゲートおよびＬｙｓコンジュゲートに比べて改善された治療指数および低減された毒性を有することが最近示されている。Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、２６、９２５〜９３２（２００８）；Ｊｕｎｕｔｕｌａら、Ｃｌｉｎ．Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．１６、４７６９〜４７７８８（２０１０）；Ｓｈｅｎら、Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．、３０、１８４〜１８９（２０１２）；およびＫｕｎｇら、Ｂｌｏｏｄ １２２、１４５５〜１４６３（２０１３）を参照のこと。

システイン系部位特異的ＡＤＣは、しかしながら、薬物コンジュゲーションプロセスに複雑さを持ち込む。哺乳動物細胞で生成される場合、システイン突然変異抗体の不対システイン残基のチオール基（複数可）は、他のシステイン（システイン化）またはグルタチオン（グルタチオン化）とジスルフィドを形成することが判明している（Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｒａａｂら ２００８、Ｃｈｅｎ，Ｎｇｕｙｅｎら ２００９）。これらの翻訳後修飾は、システイン−キャッピングまたはＣｙｓ−キャッピングと呼ばれている。このシステイン−キャッピングは、コンジュゲーションを防止または阻害するチオール結合ブロック基を作製し、したがって薬物コンジュゲーションの前に、還元剤を用いた部分還元ステップによってチオール基を再生する必要がある。この処理はまた、抗体鎖間ジスルフィド（別名「対の」システイン）を還元するので、それらの還元された抗体鎖間ジスルフィドは、その後改質されなければならない。これは、還元剤、システインまたはグルタチオンを透析すること、および酸化試薬で処理することを含む、再酸化プロセスにおいて達成される。この還元および再酸化は、潜在的にジスルフィドシャッフリング（ジスルフィドスクランブリングとも呼ばれ、例示には下記の破線の楕円を参照のこと）および抗体のねじれを生じさせる。ねじれた抗体は、タンパク質のフォールディングおよびタンパク質の品質に悪影響を与え、得られたＡＤＣのＰＫがより低いなどの問題も引き起こし得る。この現象を以下に示す：

これらの「天然な」システイン化およびグルタチオン化キャッピングの背後にある（underlining）メカニズムは、明らかではない。どちらの修飾もジスルフィド結合を形成することを含むので、これらの修飾が、ジスルフィド結合形成が生じる小胞体（ＥＲ）の内腔で起こり得ることは長い間推測されてきた。高度に保存された酸化分子経路のために（Ｆｒａｎｄ，Ｃｕｏｚｚｏら ２０００、ＳｅｖｉｅｒおよびＫａｉｓｅｒ ２００６）、ＥＲ内腔が細胞質ゾルよりも酸化されていることはよく知られている（Ｈｗａｎｇ，Ｓｉｎｓｋｅｙら １９９２）。フラビン含有膜タンパク質Ｅｒｏ１（ＦｒａｎｄおよびＫａｉｓｅｒ １９９８、Ｐｏｌｌａｒｄ、Ｔｒａｖｅｒｓら １９９８）は、酸素の酸化力を利用してジスルフィド結合をそれ自体内に導入し、次いでジスルフィド結合を、細胞外タンパク質上に通過させることができるタンパク質ジスルフィドイソメラーゼ（ＰＤＩ）に移す（Ｔｕ，Ｈｏ−Ｓｃｈｌｅｙｅｒら ２０００）。クイエシンスルフヒドリルオキシダーゼ／ＥｒｖスーパーファミリーおよびビタミンＫエポキシドレダクターゼなどの代替的なＥｒｏ１非依存性酸化経路は、哺乳動物細胞におけるジスルフィド結合形成にも寄与する（ＭａｒｇｉｔｔａｉおよびＢａｎｈｅｇｙｉ ２０１０、Ｓｅｖｉｅｒ ２０１０）。ＧＳＨは、膜中の輸送体（Ｈｗａｎｇ，Ｓｉｎｓｋｅｙら １９９２、Ｂａｎｈｅｇｙｉ，Ｌｕｓｉｎｉら １９９９）または細孔（Ｌｅ Ｇａｌｌ，Ｎｅｕｈｏｆら ２００４）のいずれかのために、ＥＲ内腔に存在する。Ｃｙｓも輸送活性のためにたぶん存在する（Ｈｗａｎｇ，Ｓｉｎｓｋｅｙら １９９２）。したがって酸化的ＥＲ内腔とＧＳＨおよびＣｙｓの存在により、ＥＲ内腔がグルタチオン化またはシステイン化のための妥当な場所になった。しかしながら、この仮説を支持する決定的な証拠は存在しない。

本発明は、操作された不対システイン残基が翻訳後修飾され特定の化学成分でキャップ付加される、哺乳動物細胞における抗体産生プロセスに関し、このキャップ付加抗体は、抗体−薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）を形成するためのさらなる部位特異的コンジュゲーションステップによく適している。本発明はさらに、これらのキャップ付加抗体を用いて生成されたＡＤＣ、特に鎖間ジスルフィドの還元を回避し、したがってコンジュゲーション前の（再）酸化ステップの必要性を排除する、キャップ付加抗体のシステイン残基の選択的な還元によって形成されるＡＤＣに関する。本発明はさらに、新規なニトロベンゾエートキャップ付加抗体、特に５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）−キャップ付加抗体に関し、このタイプのキャップ付加抗体は、トリス（３−スルホナトフェニル）ホスフィン（ＴＳＰＰ）または直接的なコンジュゲーションのための関連薬剤もしくは類似作用のある還元剤による選択的な還元を可能にし、したがって鎖間ジスルフィド還元−再酸化ステップの処理を排除する。本発明はまた、追加の薬物コンジュゲーション化学反応を可能にする、アルデヒド／アジド／アルキン双直交基などのケミカルハンドルからなる、新規なシステイン−キャッピングを操作することに関する。

培地の最適化は、システイン化、グルタチオン化、非キャップ付加、またはニトロベンゾエートキャップ付加抗体を含む、多様なキャッピング状態を有するシステイン突然変異抗体の生成を可能にする。新規なニトロベンゾエートキャップ付加抗体は、特にＴＳＰＰによる選択的な還元とそれに続く直接的なコンジュゲーションを可能にし、鎖間ジスルフィド還元／再酸化ステップの過酷な処理を用いる必要性を排除する。本発明のいくつかの実施形態で提供されるコンジュゲーションプロセスの主要な特徴が、以下の概略図に示されている：

ここで、通常システインによってキャップ付加（システイン化）されていてもよく、したがって上記の還元および酸化ステップを用いてコンジュゲートされた抗体は、代わりにＴＮＢでキャップ付加される。ＴＮＢキャッピングは除去され、同時に、ここに示すような選択的還元（例えば、ＴＳＰＰを使用）によってコンジュゲーションが達成される：

再酸化が回避されるので、開示されたプロセスは、抗体がその元のフォールディングを維持し、無傷のままであることを可能にする。したがって、本発明は、このように、システイン系部位特異的ＡＤＣの薬物コンジュゲーションプロセスを大いに改善し簡単にする新規な方法となっている。

したがって、本発明のいくつかの実施形態では、システイン突然変異抗体は、培地にジチオニトロベンゾエートを加える場合、ニトロチオベンゾエートでキャップ付加される。この実施形態では、エルマン試薬、別名５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）およびＤＴＮＢは、細胞株、例えばＣＨＯ細胞株によって発現される抗体にチオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）を加えるように作用する。これに続いて抗体精製が行なわれ、チオニトロベンゾエートキャッピングを用いて大部分のタンパク質種が産生され得る。発明実施例１を参照のこと。

本発明の別の実施形態では、システイン化、非キャップ付加、およびＴＮＢ−キャップ付加抗体がほぼ同じように作用したので、抗体のＴＮＢキャッピングは、例えばＤＳＣによって測定されたように、熱安定性を低下させない。発明実施例２を参照のこと。

本発明のさらに別の実施形態では、ＴＮＢ−キャップ付加抗体は、ＴＳＰＰによって選択的に還元される。この実施形態では、このプロセスで生じた遊離チオール基は、鎖間還元および再酸化ステップなしに直接的な薬物コンジュゲーションを可能にし、言い換えるとｉｎ ｖｉｔｒｏ操作プロセスを速める。実施例３を参照のこと。

本明細書で指摘したように、本発明の別の実施形態には、追加のタイプの薬物コンジュゲーション化学反応に有用なＴＮＢまたは類似の不安定部分以外のケミカル「ハンドル」を含む、操作されたシステインキャッピングの形成が含まれる。これらのハンドルは、新規なアルキル化ケミカルスペーサーを培地に加えることによって、抗体に付加されている。アルキル化ケミカルスペーサーは、アルデヒド、ケトン、アジド、およびアルキンなどのケミカルハンドルを含有する。ケトンおよびアルデヒドの場合には、これらのケミカルハンドルは、追加のコンジュゲーション化学反応のためにアミノオキシ求核試薬またはヒドラジドと反応でき、オキシム／ヒドラゾン生成物を形成する。アジドおよびアルキンの場合には、これらのケミカルハンドルは、付加環化コンジュゲーションを可能にし得る。追加のアルキル化ケミカルスペーサーには、ビオチンの機能的ドメインが含まれ、それはストレプアビジンとビオチンの間の特異的な密接な非共有結合性相互作用を可能にする。ケミカルハンドルのマレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド（ＭＴＦＢ）、ジベンゾシクロオクチル−ポリエチレンマレイミド（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）、およびマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン（ＭＰＢ）について論じている実施例４を参照のこと。

したがって、アルキル化ケミカルスペーサーを培地に加えることによって、アルデヒド基などのケミカルハンドルからなる新規なＣｙｓ−キャッピングが操作され得ることを本発明者らはさらに実証した。これらの新規なキャッピングは、一部分はここで示すように、追加の薬物コンジュゲーション化学反応のためのケミカルハンドルを提供し得る：

ここで：

他の実施形態には、ゼロまたは低レベルのシステイン−、シスチン−およびグルタチオンを有する培地におけるＨＥＫ２９３一過性またはＣＨＯ安定発現による完全な非キャップ付加システイン突然変異抗体の生成が含まれる。実施例５および６を参照のこと。

本出願では、ゼロまたは低レベルのシステイン−、シスチン−およびグルタチオン−を有する培地の記述または考察は：０〜５ｍＭシステイン、好ましくは０〜１ｍＭシステイン、最も好ましくは０．２ｍＭシステイン；および０〜５ｍＭグルタチオン、好ましくは０〜１ｍＭグルタチオン、最も好ましくは０．２ｍＭグルタチオンを有する培地を意味する。これらの特徴的な成分レベルを有する培地は、市販されており、または従来の技術を用いて市販されている培地から容易に調製することができる。時折、ゼロまたは低レベルのシステイン−、シスチン−およびグルタチオン−を有するこれらの培地は、「トリプルフリー」培地、または「トリプルロー」培地と呼ばれる。

本明細書では、用語「アルキル」は、それ自体または別の用語の一部として、示された数の炭素原子を有する、直鎖または分枝状の飽和炭化水素を意味する（例えば、「Ｃ１〜Ｃ６」アルキルは、１〜６個の炭素原子を有するアルキル基を意味する）。アルキル基は通常、１〜２０個の炭素原子、好ましくは１〜６個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子を含む。炭素原子の数が示されないとき、アルキル基は、１〜８個、または１〜６個の炭素原子を有する。代表的な直鎖Ｃ１〜Ｃ８アルキルには、それだけには限らないが、メチル、エチル、ｎ−プロピル、ｎ−ブチル、ｎ−ペンチル、ｎ−ヘキシル、ｎ−ヘプチルおよびｎ−オクチルが含まれ；一方、分枝状Ｃ１〜Ｃ８アルキルには、それだけには限らないが、−イソプロピル、−ｓｅｃ−ブチル、−イソブチル、−ｔｅｎｔ−ブチル、−イソペンチル、および−２−メチルブチルが含まれ；不飽和Ｃ２〜Ｃ８アルキルには、それだけには限らないが、ビニル、アリル、１−ブテニル、２−ブテニル、イソブチレニル、１−ペンテニル、２−ペンテニル、３−メチル−１−ブテニル、２−メチル−２−ブテニル、２，３−ジメチル−２−ブテニル、１−ヘキシル、２−ヘキシル、３−ヘキシル、アセチレニル、プロピニル、１−ブチニル、２−ブチニル、１−ペンチニル、２−ペンチニルおよび３−メチル−１−ブチニルが含まれる。本明細書における「アルキル」への言及は、上記のような非置換および置換部分を意味する。

本明細書では、用語「アリール」は、それ自体または別の用語の一部として、親芳香族環系の単一の炭素原子から１個の水素原子を除去することによって生じる、５〜２０個、好ましくは５〜１４個もしくは６〜１４個の炭素原子からなる置換または非置換の一価の炭素環式芳香族炭化水素基を表す。典型的なアリール基には、それだけには限らないが、ベンゼン、置換ベンゼン、ナフタレン、アントラセン、ビフェニルなどに由来する基が含まれる。

「ヘテロアリール」は、２〜１０個、２〜１４個、または２〜２０個の炭素原子、好ましくは３〜８個の炭素原子（環員とも呼ばれる）および独立にＮ、Ｏ、ＰまたはＳから選択される１〜４個のヘテロ原子環員を有し、親環系の環原子から１個の水素原子を除去することによって生じる、一価の置換または非置換の芳香族単環式、二環式または三環式環系を意味する。ヘテロシクリル中の１個または複数のＮ、ＣまたはＳ原子は、酸化されていてもよい。ヘテロアリールは、単環式、二環式、または三環式環系であってよい。代表的なヘテロアリールには、それだけには限らないが、トリアゾリル、テトラゾリル、オキサジアゾリル、ピリジル、フリル、ベンゾフラニル、チオフェニル、ベンゾチオフェニル、キノリニル、ピロリル、インドリル、オキサゾリル、ベンゾオキサゾリル、イミダゾリル、ベンゾイミダゾリル、チアゾリル、ベンゾチアゾリル、イソオキサゾリル、ピラゾリル、イソチアゾリル、ピリダジニル、ピリミジニル、ピラジニル、トリアジニル、シンノリニル、フタラジニル、キナゾリニル、ピリミジル、アゼピニル、オキセピニル（oxepinyl）、およびキノキサリニルが含まれる。ヘテロアリールは、置換されていてもよい。

本明細書では、用語「所定の」は、たまたま存在している化学成分とは対照的に、本発明の専門家によって選択された化学成分を意味する。したがって、「所定のキャッピング部分」は、抗体のシステイン残基（複数可）上に配置する（すなわち、共有結合する）ための、本発明の専門家によって選択されたキャッピング部分である。所定のキャッピング部分は通常、抗体上に特定および所望のキャップの存在をもたらす培地に添加するために選択された成分である。所定のキャッピング部分は、汎用培地では見られない。

他の実施形態には、ペイロードまたはリンカー−ペイロード種と非キャップ付加システイン突然変異抗体との直接的なコンジュゲーションが含まれる。

ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、およびＩｇＧ４の組換え抗体において非常に低いパーセンテージの遊離システイン残基しか以前に検出されていない（ＺｈａｎｇおよびＣｚｕｐｒｙｎ ２００２）ので、哺乳動物細胞における抗体中での完全な非キャップ付加溶媒曝露不対Ｃｙｓの生成が珍しいことは注目すべきことである。正常なＩｇＧのためのカノニカルＣｙｓ残基は、たぶんジスルフィド結合している。低レベルの遊離Ｃｙｓは、おそらく２つの供給源によるものである：１つの供給源は、重鎖間または重鎖と軽鎖の間の鎖間ジスルフィド結合の分解である。鎖間ジスルフィド結合を形成しているＣｙｓ残基は、高度に溶媒曝露されているので、還元されやすい（ＬｉｕおよびＭａｙ ２０１２）。基本的な条件下では、ジスルフィド結合は、Ｃｙｓに戻ることができるデヒドロアラニンと過硫過塩に分解することができる（Ｆｌｏｒｅｎｃｅ １９８０）。他の供給源は、生合成中の鎖内ジスルフィド結合の不完全な形成である。鎖内Ｃｙｓおよびジスルフィド結合は、反平行β−シート構造内に埋められ、溶媒に曝露されない。本研究の抗体に存在しない非カノニカル生殖細胞系Ｃｙｓは、抗体可変領域に存在することが知られている。ヒト生殖細胞系におけるその頻度は、比較的まれであり、６％〜１０％の範囲である（Ｅｈｒｅｎｍａｎｎ，Ｋａａｓら ２０１０、Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅｌら ２０１３）。いくつかの報告（Ｋｒｏｏｎ，Ｂａｌｄｗｉｎ−Ｆｅｒｒｏら １９９２、Ｊｏｈｎｓｏｎ，Ｏｌｉｖｅｒら １９９７、Ｇａｄｇｉｌ，Ｂｏｎｄａｒｅｎｋｏら ２００６、Ｂａｎｋｓ，Ｇａｄｇｉｌら ２００８、Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅｌら ２０１３）は、これらの非カノニカルＣｙｓがタンパク質の安定性および凝集にほとんど影響を及ぼさないことを示す。これらの非カノニカルＣｙｓのいくつかは、溶媒曝露およびシステイン化されていることがわかっている（Ｂａｎｋｓ，Ｇａｄｇｉｌら ２００８、Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅｌら ２０１３）。これらの非カノニカルＣｙｓのシステイン化は、本研究の発見によれば、おそらく哺乳動物細胞の外で起こる。

チオール感受性は、酸化的環境などの外因性要因だけでなく、溶媒露出度（solvent
accessibility）および局所Ｃｙｓ環境などの内因性要因にも依存するようである。Ｆａｂ、Ｆｃ、重鎖、または軽鎖の領域におけるＣｙｓ位置は、システイン化修飾に影響を及ぼす要因ではない（Ｂａｎｋｓ，Ｇａｄｇｉｌら ２００８、Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｒａａｂら ２００８、Ｃｈｅｎ，Ｎｇｕｙｅｎら ２００９、Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅｌら ２０１３）。システイン化またはグルタチオン化の生物学的重要性は、明らかではない。チロシンホスファターゼおよび分子シャペロンなどのいくつかのタンパク質は、酸化還元感受性Ｃｙｓを含有する（Ｇｅｏｒｇｉｏｕ ２００２、Ｂａｒｆｏｒｄ ２００４）。抗体では、非カノニカルＣｙｓからのシステイン化の除去は、タンパク質の２次構造に影響しないが、凝集を減少させ融解温度を上昇させることによって、タンパク質の３次または４次構造を明らかに改善する（Ｂａｎｋｓ，Ｇａｄｇｉｌら ２００８）。本研究のＦｃ Ｃｙｓでは、システイン化は、タンパク質の構造安定性に全く影響を及ぼさない。

新規な細胞メカニズムが解明された：不対表面システインのＣｙｓキャッピングは哺乳動物細胞の外で起こる可能性がある − 本研究からのデータに基づいて、Ｃｙｓキャッピング修飾の仮説モデルが提案される（図７）。抗体重鎖および軽鎖ポリペプチドは、Ｓｅｃ６１複合体を介してＥＲ内腔に転位される（ＳｃｈｗａｒｔｚおよびＢｌｏｂｅｌ ２００３）。天然なジスルフィド結合は、Ｅｒｏ１経路または他の酸化的供給源からの酸化力を有するＰＤＩタンパク質ファミリーを介して形成される。間違ったジスルフィド結合は、細胞質ゾルグルタチオンレダクターゼから生成されるＧＳＨによって還元され（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ，Ｊｅｓｓｏｐら ２００６）、膜輸送体を通して輸入される（Ｈｗａｎｇ，Ｓｉｎｓｋｅｙら １９９２、Ｂａｎｈｅｇｙｉ，Ｌｕｓｉｎｉら １９９９、Ｌｅ Ｇａｌｌ，Ｎｅｕｈｏｆら ２００４）。完全に組み立てられたＣｙｓ突然変異抗体は、非キャップ付加のままであり、最終的に培地に分泌される。培地中のＣｔｎおよびＧＳＨは、ジスルフィド交換によって抗体の遊離Ｃｙｓとジスルフィド結合を形成し、続いて培地中の溶存酸素を酸化する。

完全な非キャップ付加Ｃｙｓが哺乳動物細胞で生成できるという事実は、ＥＲ内腔についてのいくつかの興味深い生理学的酸化還元状態を明らかにした可能性がある。第一に、ＥＲ内腔は、細胞外空間よりも著しく酸化されていない。これは、適切なジスルフィド形成は、ＥＲ内腔で酸化および還元反応の両方を必要とするという意見と一致している。天然および非天然なジスルフィドは、一時的に形成され、正しい立体構造を達成するために還元される。ＥＲにおける酸化および還元反応の間の正確な平衡は、これらの共有結合がタンパク質フォールディングの完了まで動的なままであるのに重要であることが提案されている。ＥＲを過剰酸化し、非天然な結合を安定させること、またはＥＲを還元し、ジスルフィド形成を防止することのいずれかは、ＥＲストレス反応を誘発し得る（ＭａｒｇｉｔｔａｉおよびＳｉｔｉａ ２０１１）。Ｅｒｏ１および他の酸化経路は、ジスルフィド形成のための酸化力に寄与し（Ｆｒａｎｄ，Ｃｕｏｚｚｏら ２０００、ＳｅｖｉｅｒおよびＫａｉｓｅｒ ２００６、ＭａｒｇｉｔｔａｉおよびＢａｎｈｅｇｙｉ ２０１０、Ｓｅｖｉｅｒ ２０１０）、ＥＲ内腔を細胞質ゾルよりも酸化させる（Ｈｗａｎｇ，Ｓｉｎｓｋｅｙら １９９２）。同時に、細胞質ゾルＧＳＨレダクターゼによって生成された還元型のＧＳＨは、ＥＲ内腔に輸入して還元力をもたらすことができる（ＪｅｓｓｏｐおよびＢｕｌｌｅｉｄ ２００４、Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ，Ｊｅｓｓｏｐら ２００６、Ｇｏｍｅｚ，Ｖｉｎｓｏｎら ２０１０）。酵母細胞は、ＧＳＨ合成経路なしで生存でき、酵母のＥＲ内腔が哺乳動物ＥＲよりも酸化されていることを示唆する。酵母は独特な細胞生物であるので、哺乳動物細胞よりも複雑でない細胞機能を実行するために、ジスルフィド結合を有するより少ないおよびより単純な細胞外タンパク質が必要とされる可能性がある。その上、ＰＤＩが、分解のための逆輸送（retro-translocation）のためのＥＲ中のミスフォールドしたタンパク質を減少させ（ＫｏｐｉｔｏおよびＳｉｔｉａ ２０００）、細胞質ゾル輸送のためのコレラ毒素Ａ１鎖をアンフォールドし（Ｔｓａｉ，Ｒｏｄｉｇｈｉｅｒｏら ２００１）、かつ細胞表面に輸出されたときにレダクターゼとして働くことができる（Ｙｏｓｈｉｍｏｒｉ，Ｓｅｍｂａら １９９０、ＪｏｒｄａｎおよびＧｉｂｂｉｎｓ ２００６）という発見によってＥＲがそれほど酸化されていないことがさらに支持されている。

ＥＲ内腔についての第二の発見は、ＥＲ内腔中の遊離ＧＳＨまたはＣｙｓ、およびタンパク質の遊離Ｃｙｓ残基が、一緒にジスルフィド結合を形成するための不十分なＰＤＩの基質であることである。細胞外タンパク質のジスルフィド結合形成は、ＰＤＩおよび酸化還元酵素ファミリーメンバーによって触媒され、そのジスルフィド結合はＥｒｏ１から移される。ＥＲにおいてＧＳＨ／Ｃｙｓと抗体の操作されたＣｙｓの間でジスルフィド結合が少しも形成されないので、ＧＳＨが酸化されたＰＤＩを還元できるにもかかわらず、それらは酸化還元酵素の基質ではない（Ｃｈａｋｒａｖａｒｔｈｉ，Ｊｅｓｓｏｐら ２００６）。ＥＲに位置するＧＳＨの大部分は、ＥＲタンパク質との混合ジスルフィドであることが判明したことが報告されている（Ｂａｓｓ，Ｒｕｄｄｏｃｋら ２００４）。ＧＳＨとの混合ジスルフィドを形成するＥＲタンパク質は、ＰＤＩおよび他の酸化還元酵素である可能性がある。システイン化およびグルタチオン化の他に、第３のタイプのキャッピングが、操作されたＣｙｓとの余分な軽鎖形成ジスルフィド結合として特定されていることは言及する価値がある（Ｇｏｍｅｚ，Ｖｉｎｓｏｎら ２０１０）。三重軽鎖形成が、細胞内ＧＳＨ生成ならびにＬＣとＨＣの間のｍＲＮＡ比によって影響されることがわかったので、この修飾のための現場はＥＲ内腔である可能性が高い。

キャッピング率がロット間で異なる理由は長い間知られていなかった（Ｂａｎｋｓ，Ｇａｄｇｉｌら ２００８、Ｊｕｎｕｔｕｌａ，Ｒａａｂら ２００８、Ｃｈｅｎ，Ｎｇｕｙｅｎら ２００９、Ｇｏｍｅｚ，Ｖｉｎｓｏｎら ２０１０、Ｂｕｃｈａｎａｎ，Ｃｌｅｍｅｎｔｅｌら ２０１３）。本発明者らのデータは、これが細胞増殖および培地調製によって影響を受け得る培地中の不十分なＣｙｓ／Ｃｔｎに起因することを示す。グルタチオン化された物質は、安定なＣＨＯのＨＥＫ２９３の一過性培養または短期培養で検出されなかったことに注目することは興味深い。これは、典型的な哺乳動物培地中のＧＳＨ濃度が極めて低いという事実と一致する。他方では、細胞質ゾルは、約２〜１０ｍＭ ＧＳＨを含有する（ＭｅｉｓｔｅｒおよびＡｎｄｅｒｓｏｎ １９８３）。グルタチオン化された物質は、安定なＣＨＯ １２日培養した物質で検出でき（未発表データ）、ＧＳＨ供給源が細胞溶解からである可能性が高いことを示唆している。実際には、培地中のＧＳＨ濃度がより長い培養日数に従って徐々に増大し、２００μＭまでほぼ１０倍高くなり得ることが報告されている（Ｇｏｍｅｚ，Ｖｉｎｓｏｎら ２０１０）。本研究では、過剰なＧＳＨまたはＣｔｎを培養物に加えることにより、完全にグルタチオン化されたまたはシステイン化されたＣｙｓ突然変異抗体を生成することができる。精製したＣｙｓ抗体種のグルタチオン化は、Ｃｙｓ／Ｃｔｎ酸化還元対を用いることによってｉｎ ｖｉｔｒｏで効果的に除去しシステイン化と交換できることがこれまでに報告されている（Ｃｈｅｎ，Ｎｇｕｙｅｎら ２００９）。ＧＳＨを用いてシステイン化を除去し、ｉｎ ｖｉｔｒｏでグルタチオン化を生じさせることは、まだ報告されていない。

本発明のいくつかの実施形態では、所定のキャッピング部分を抗体上の１個または複数の不対システイン残基上に結合させる方法を提供しており、前記方法は：抗体発現細胞株を、前記所定のキャッピング部分、または前記所定のキャッピング部分の前駆体を含有する培地中で成長させるステップを含み、ここで前記細胞株は、前記抗体を発現し、かつここで前記所定のキャッピング部分は、前記発現した抗体上の少なくとも１個の前記不対システイン残基に共有結合によって結合している。キャッピング部分は、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）、２−メルカプトピリジン、ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）、４−チオ安息香酸、２−チオ安息香酸、４−チオベンゼンスルホン酸、２−チオベンゼンスルホン酸、スルホン酸メチル（Ｍｓ）、ｐ−トルエンスルホネート（Ｔｓ）およびトリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）からなる群から選択される１種であってよいが、他のキャッピング部分も可能である。

このような他のキャッピング部分には、上記のように、いわゆるケミカルハンドルキャッピング部分、例えばマレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド（ＭＴＦＢ）と、より一般的に、結合したアジドおよびアルキン（追加のクリック化学反応を促進する）、結合したアルデヒドおよびケトン（追加のオキシム化学反応を促進する）、結合したハロアセチル（チオールおよびアミン化学反応を促進する）、および結合したマレイミド（追加のチオール化学反応を促進する）などが含まれる。付加結合化学反応（addition linking chemistry）は、本明細書に記載されているように、また既知の技術に従って行なうことができる。

本発明はまた：（ａ）キャップ付加抗体を細胞培養で生成するステップ（ここで前記抗体上の１個または複数の不対システイン残基が、硫黄結合によって１個または複数の所定のキャッピング部分と共有結合している）；（ｂ）抗体鎖間硫黄結合を還元することなく前記キャッピング部分を前記抗体から除去できる還元剤に前記キャップ付加抗体を曝露するステップ；および（ｃ）酸化剤を導入することなく、前記抗体上の１種または複数の還元された硫黄結合を、結合部分を介してペイロードとコンジュゲートするステップを含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはタンパク質コンジュゲートを生成する方法を提供する。ＡＤＣを生成する前述の方法を行なってもよく、ここでキャッピング部分は、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）、２−メルカプトピリジンおよびジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）からなる群から選択される。５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）によるキャッピングは、特に重要である。

このようなキャッピングが通常起こり、続いて不対システイン残基で選択的な還元が行なわれる。

上記方法で使用されるペイロードは、ほとんどの場合アウリスタチン、スプライソスタチン、カリケアミシンまたは１種もしくは複数のＣＢＩ、ＣＰＩおよびＣＴＩモノマーを含むダイマーである。それがアウリスタチンの場合、（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド，トリフルオロ酢酸塩）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド，トリフルオロ酢酸塩）；モノメチルドラスタチン１０；（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−ノルエフェドリン）；および（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−フェニルアラニン）から選択することができる。

上記方法（複数可）で使用されるリンカーは、しばしばｍｃまたはｍｃｖｃＰＡＢＣであるが、例えば、国際公開ＷＯ１５／１１０９３５に記載されているものを含む、多くの他のリンカーが本発明の範囲内である。本明細書では、「ＰＡＢＣ」は、ｐアミノベンジルオキシカルボニルおよびそれから導出された部分、例えば構造：

またはその変異体を意味する。「ＶＣ」または「ｖｃ」は、ペプチドバリン−シトルリンを意味する。「ＭＣ」または「ｍｃ」は：

を意味する。本明細書では、「ｍｃｖｃＰＡＢＣ」は、リンカー：

を意味する。
いくつかの実施形態では、上記の方法で使用される還元剤は、一般に式：

またはＲ^４−Ｓ−Ｈであり、ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のそれぞれは、独立に、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_５〜Ｃ_７）アリールおよび（Ｃ_５〜Ｃ_７）ヘテロアリールからなる群から選択され、ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のそれぞれは、独立に、ＳＯ_３Ｎａ、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＯ_２およびＮＨ_２から選択される１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよい。

しばしば、還元剤は、トリス（３−スルホフェニル）ホスフィン（ＴＳＰＰ）：

である。

本発明の実施形態には、キャッピング部分ＴＮＢが、ジ−ＴＮＢ、別名エルマン試薬：

を用いて抗体に付加されて、細胞培養においてキャップ付加抗体を産生するものが含まれる。

さらに、本発明の実施形態には、１個または複数の非キャップ付加不対システインを含む抗体を生成する方法が含まれる。非キャップ付加不対システインは、露出したチオール側鎖を有するシステイン残基と定義される。これらの遊離チオール基は、他のいかなる化学物質とも共有または非共有結合を一切形成しておらず、したがってそれらは化学コンジュゲーションへの反応性に富む。抗体中の非キャップ付加システイン残基の略図は次の通りである：

この方法は：（ａ）低システイン、低シスチンおよび低グルタチオン培地中で抗体発現細胞を成長させるステップと、（ｂ）発現された非キャップ付加抗体を回収するステップとを含む。この方法では、培地は通常、５ｍＭ未満、１ｍＭ未満または０．２ｍＭ未満のシステイン、５ｍＭ未満、１ｍＭ未満または０．２ｍＭ未満のシスチンおよび５ｍＭ未満、１ｍＭ未満または０．２ｍＭ未満のグルタチオンを含む。この方法ではまた、細胞株は、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＮＳＯからなる群から選択されてもよいが、もちろん他の細胞株は、本発明の範囲内である。

その上、本発明の実施形態には、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはタンパク質コンジュゲートを生成する方法であるものが含まれ、前記方法は：（ａ）低システイン、低シスチンおよび低グルタチオン培地中で抗体発現細胞を成長させるステップと、（ｂ）１個または複数の非キャップ付加不対システインを含む発現された抗体を回収するステップと、（ｃ）リンカー−ペイロードを前記回収した抗体とコンジュゲートするステップとを含む。

同様に、本発明には、１個または複数の非キャップ付加不対システインを含むリンカー−ペイロードを単離した抗体とコンジュゲートするステップを含む、抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはタンパク質コンジュゲートを生成する方法が含まれる。

Ｆｃ領域における操作された表面Ｃｙｓ変異を有する抗体のシステイン化およびグルタチオン化の概略図である。 安定なＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞で発現されたシステイン突然変異抗体の質量スペクトルプロットである。 ＨＥＫ２９３一過性発現において発現されたシステイン突然変異抗体の質量スペクトルプロットである。 培地に加えられた過剰なＧＳＨまたはシスチンにより、完全にグルタチオン化またはシステイン化された種の生成がもたらされる。 過剰なシスチンまたはグルタチオンを用いてＨＥＫ２９３細胞で一過性発現されたＣｙｓ突然変異抗体のＳＥＣ分析である。 図２Ａに示したシステイン突然変異抗体の質量分析である。 完全な非キャップ付加システイン突然変異抗体は、低システイン−、シスチン−、およびグルタチオン（「トリプルロー」）培地でのＨＥＫ２９３一過性発現によって生成される。 トリプルロー培地中のＨＥＫ２９３細胞で一過性発現されたシステイン突然変異抗体のＳＥＣ分析である。 図３Ａに示したシステイン突然変異抗体の質量分析である。 完全な非キャップ付加システイン突然変異抗体は、トリプルロー（低システイン、低シスチンおよび低グルタチオン）培地での安定なＣＨＯ発現によって生成される。 トリプルロー培地中の安定なＣＨＯ−ＤＵＫＸで発現されたシステイン突然変異抗体のＳＥＣ分析である。 図４Ａに示したシステイン突然変異抗体の質量分析である。 ジチオニトロベンゾエート（ＤＴＮＢ、エルマン試薬とも呼ばれている）を培地に加える場合、システイン突然変異抗体は、ニトロチオベンゾエート（ＴＮＢ）でさらにキャップ付加される。 ＣＤ−ＣＨＯ培地（Ｔｈｅｒｍｏ−Ｆｉｓｃｈｅｒ）（本明細書において、ＣＤ−ＣＨＯ培地は、市販されているＣＤ−ＣＨＯ培地または同等の独自培地配合物のいずれかを意味する）ＣＤ−ＣＨＯ＋０．５ｍＭ ＤＴＮＢ、およびトリプルロー培地において安定なＣＨＯ−ＤＵＫＸで発現されたシステイン突然変異抗体のＳＤＳ−ＰＡＧＥ分析およびＳＥＣ分析である。 図５Ａに示したＣｙｓ突然変異抗体の質量分析である。 システイン化、非キャップ付加、およびニトロベンゾエートキャップ付加されたシステイン突然変異抗体の融解温度を比較したＤＳＣサーモグラムと添付のデータ表である。 哺乳動物細胞におけるシステイン突然変異抗体のシステイン化およびグルタチオン化修飾として可能性があると理解されているメカニズムである。 ＴＳＰＰ選択的還元および直接的なコンジュゲーションは、鎖間ジスルフィド還元／再酸化を排除する。 ＴＮＢキャップ付加抗体は、ＴＳＰＰ還元／コンジュゲーションによって９０％ＤＡＲ２ ＡＤＣを生成する。 Ｌ４４３Ｃの無傷抗体についてＰＮＧアーゼＦで消化したシステイン突然変異抗体の質量分析である。 ｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカーペイロードのＴＳＰＰ選択的還元および後続の直接的なコンジュゲーションである。 ＴＮＢキャップ付加Ｈｅｒｃ−Ｋ２９０Ｃ／Ｋ３３４Ｃは、ＴＳＰＰ還元／コンジュゲーションによって９０％ＤＡＲ４ ＡＤＣを生成する。 Ｆｃ領域Ｋ２９０Ｃ／Ｋ３３４ＣについてＰＮＧアーゼＦおよびＩｄｅＳで消化したシステイン突然変異抗体の質量分析である。 ｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカーペイロードのＴＳＰＰ選択的還元および後続の直接的なコンジュゲーションである。 反応性チオール以外に新規なケミカルハンドルを有する新規なシステインキャップ付加ケミカルスペーサーの生成である。 安定なＣＨＯ細胞におけるＭＦＴＢキャップ付加ＨＡＢ０８ Ｌ４４３Ｃの生成である。 トリプルロー培地中でのＭＦＴＢまたはＤＴＮＢの存在下における安定なＣＨＯ細胞の細胞数および細胞生存度である。 ＭＦＴＢを含むトリプルロー培地中の安定なＣＨＯ細胞で発現されたシステイン突然変異抗体のＳＥＣ分析である。 Ｌ４４３Ｃの無傷抗体についてＰＮＧアーゼＦで消化したシステイン突然変異抗体の質量分析である。 ｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１を有する非キャップ付加抗体の直接的なコンジュゲーションを示すＨＩＣプロファイルである。比較のために、従来のプロトコル（全還元とそれに続く再酸化およびコンジュゲーション）によって合成した抗体およびＡＤＣのＨＩＣプロファイルを示す。 一過性ＨＥＫ２９３細胞におけるＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド−キャップ付加Ｋ２９０Ｃ １アーム抗体８Ｄ３の生成である。Ｋ２９０Ｃ １アーム抗体８Ｄ３の無傷分子についてＰＮＧアーゼＦで消化したシステイン突然変異抗体の質量分析である。 安定なＣＨＯ細胞におけるマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン−キャップ付加ＨＡＢ０８ Ｌ４４３Ｃの生成である。ＨＡＢ０８ Ｌ４４３Ｃの無傷抗体の質量分析である。 細胞培養物へのＤＴＮＢ添加を滴定すると、ニトロチオベンゾエート−キャップ付加Ｃｙｓ突然変異Ｋ２９０Ｃ抗体は、正常なシステイン含有培地中のＨＥＫ２９３Ｆ一過性発現系で効率的に生成される。Ｋ２９０Ｃシステイン突然変異抗体のＦｃ部分についてＩｄｅｓ酵素で消化したシステイン突然変異抗体の質量分析である。

一般的な手順
細胞培養、トランスフェクション、および細胞株の開発：哺乳動物細胞株を成長させ、加湿インキュベーター中３７℃、５％または７％ＣＯ_２で維持した。ＣＨＯ細胞およびＨＥＫ２９３Ｆ細胞［Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）、米国バージニア州Ｍａｎａｓｓａｓ］をＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、米国ニューヨーク州Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ）中で培養した。（Ｚｈｏｎｇ，Ｋｉｅｒａｓら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２８８（２）：１４９０〜１４１９（２０１３））に記載されているように、大規模な一過性ＨＥＫ２９３トランスフェクションプロセスを抗体産生に使用した。安定したトランスフェクションのために、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞は、アデノシン（１０ｍｇ／Ｌ）、デオキシアデノシン（１０ｍｇ／Ｌ）、およびチミジン（１０ｍｇ／Ｌ）を補充した最少必須培地イーグルアルファ改変（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｍ０６４４）アルファ培地中で成長させた。ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞に、システイン突然変異組換え抗体タンパク質をコードするＤＮＡをトランスフェクトし、１００ｎＭメトトレキセートおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８で選択にかけた。安定したプールは、３週間選択を受けさせ、次いで３７℃で無血清懸濁液中に２ｅ５細胞／ｍｌで播種した。安定なＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞は、１００ｎＭメトトレキセートおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｇ４１８を補充したアルファ培地中で維持した。産生中、細胞をＣＤ−ＣＨＯ培地中に播種し、産生の終わりにならし培地を回収し、遠心分離によってきれいにしてから精製した。トリプルフリー培地は、哺乳動物細胞培養のための最少必須培地イーグルアルファ改変（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）様培地であり、これはＧＳＨ、Ｃｙｓ、およびＣｔｎを含有しない。この培地は、増殖因子としてインスリンを、かつ剪断保護剤としてポリマー（ポリビニルアルコール）を含有する。

タンパク質精製：ｒｍｐＰｒｏｔｅｉｎ Ａ樹脂（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ、米国ニュージャージー州Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ）を、４℃で終夜５０ｍＭトリス（トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン）、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５（ＴＢＳ）で予備平衡させた。樹脂は、０．２ＰＥＳフィルターを用いてろ過し、カラム中に充填し、そこでそれを２ＣＶのＴＢＳ、５ＣＶのＣａＣｌ_２、ｐＨ７．５、３ＣＶの１０ｍＭトリス、１０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．５で洗浄してから、タンパク質を、１５０ｍＭグリシン、４０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ３．５の１００％ステップを用いて溶離した。２Ｍグリシン、ｐＨ７．２を用いてタンパク質をｐＨ３．５まで滴定してから、２Ｍ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ８．０を用いてｐＨを７．０に調整した。タンパク質をＰＢＳ（１３７ｍＭ ＮａＣｌ、２．７ｍＭ ＫＣｌ、８．１ｍＭ Ｎａ_２ＨＰＯ_４、２．７ｍＭ ＫＨ_２ＰＯ_４、ｐＨ７．２）中に透析してから、濃縮し、ＰＢＳ、ｐＨ７．２で平衡にしたＳｕｐｅｒｄｅｘ ２００カラムに導入した。ピーク断片を、２０ｍＭヒスチジン、８．５％スクロース、ｐＨ５．８中にプールして透析し、次いで５０ｋＤａ ＭＷＣＯ遠心力装置を用いて１０ｍｇ／ｍｌまで濃縮した。

Ｎ結合型グリカンの脱グリコシル：ＰＮＧアーゼＦ（ＮＥ ＢｉｏＬａｂｓ、米国マサチューセッツ州Ｉｐｓｗｉｃｈ）を加えることによって抗体試料を脱グリコシルした。試料を、０．０５％ＴＦＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ、米国ミズーリ州Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ）を用いて１：１に希釈することによって酸性にし、続いて液体クロマトグラフィー質量分析を行なった。

液体クロマトグラフィー質量分析：Ａｇｉｌｅｎｔ（米国カリフォルニア州Ｓａｎｔａ Ｃｌａｒａ）１２００キャピラリーＨＰＬＣと連結したＷａｔｅｒｓ Ｘｅｖｏ Ｑ−ＴＯＦ Ｇ２質量分析計（Ｗａｔｅｒｓ、米国マサチューセッツ州Ｍｉｌｆｏｒｄ）を用いて液体クロマトグラフィー質量分析（ＬＣ−ＭＳ）を行なった。脱グリコシル試料は、８０℃で維持した流速６５μｌ／分のＷａｔｅｒｓ ＢＥＨ３００ Ｃ４、１．７μｍ（１．０×５０ｍｍ）カラム上で分離した。移動相Ａは、０．０５％ＴＦＡを含む水であり、移動相Ｂは、０．０５％ＴＦＡを含むアセトニトリルであった。勾配：０．５分で２％〜２０％Ｂ、６分で２０％〜４０％Ｂ、および４分で４０％〜１００％Ｂ、を用いてタンパク質をカラムから溶離した。質量分析計は、８００〜３５００ｍ／ｚを走査する正のＭＳのみのモードで行ない、データを、ＭａｓｓＬｙｎｘ（Ｗａｔｅｒｓ）４．１ソフトウェアで取得した。抗体に対応するＴＯＦ−ＭＳシグナルをまとめ、ＭａｘＥｎｔ１（Ｗａｔｅｒｓ）プログラムを用いて解析した。システイン、ＧＳＨ、ＴＮＢ、またはＭＴＦＢ（マレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド）キャップ付加種は、質量シフト（Ｃｙｓ：１１９．００４Ｄａ、ＧＳＨ：３０５．０６８Ｄａ、ＴＮＢ：１９８．１７５Ｄａ、ＭＴＦＢ：５０３．５４Ｄａ）によって決定した。

示差走査熱分析（ＤＳＣ）：ＭｉｃｒｏＣａｌのキャピラリーＤＳＣシステム、ＶＰ−ＤＳＣ（米国マサチューセッツ州Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）を用いてＣｙｓ突然変異抗体タンパク質の熱安定性を分析した。ヒスチジンスクロース配合物中０．００２ｍＭの濃度のタンパク質試料を、１時間当たり１００℃の走査速度において１０〜１１０℃で加熱した。得られた熱容量は、盲験ヒスチジン／スクロース配合物走査に対して引き算することによってベースライン補正し、ＭｉｃｒｏＣａｌ（ＯｒｉｇｉｎＬａｂ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国マサチューセッツ州Ｎｏｒｔｈａｍｐｔｏｎ）製のＯｒｉｇｉｎ７．０ソフトウェアを用いて非２状態遷移関数に適合させた。

参照例
全般的に以下で論じられる参照例は、発明実施例に記載されている本発明によって改善される当技術分野の最新技術のハイライト特徴を説明する。

参照例１：ＨＥＫ２９３一過性発現によって生成されたシステイン突然変異抗体の非キャップ付加システイン残基の検出：ＣＨ３領域においてシステインに修飾された表面ロイシンを有するモデル抗体ＨＡＢ０８（図１Ａ）を調べた。この突然変異体は、ＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞において安定的に発現された場合に完全にシステイン化されていることがわかった（図１Ｂに示されている代表的な質量スペクトルデータを参照のこと）。非常に小さな割合のグルタチオン化種も検出された。本発明者らが、ＨＥＫ２９３細胞に一過的にトランスフェクトすることによってこの突然変異体を発現させたとき、驚くべきことに、約１０％完全非キャップ付加Ｃｙｓ突然変異抗体＋３０％単独非キャップ付加物質が検出されたことが判明した。非キャップ付加Ｃｙｓ抗体の検出は、一貫していたが、割合はロット間で異なっていた。代表的な質量スペクトルデータを、図１Ｃに示す。非常に少ないグルタチオン化種がＨＥＫ２９３一過性物質で検出された。一過性ＨＥＫ２９３および安定なＣＨＯ由来のタンパク質物質は両方とも、代替リーダー配列切断を伴う少量のタンパク質種を含有していた。

参照例２：培地中の過剰なグルタチオンまたはシスチンにより、完全にグルタチオン化またはシステイン化された種の生成がもたらされる：参照例１に実証されるように、安定なＣＨＯ細胞によって生成されたシステイン突然変異抗体は、システイン化によって完全にキャップ付加されていることが判明した。ＨＥＫ２９３物質で検出された非キャップ付加種がＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地中のシステインおよびシスチンの不十分な存在に起因するかどうかを決定するために、過剰量のこれらの分子を培地に加えた。ＨＥＫ２９３一過性生成は、したがって過剰量のシステインまたはグルタチオンを有する培地で実施された。ＨＥＫ２９３細胞に、約１ｍＭシスチンを含有すると推定されたフリースタイル培地中でトランスフェクトした。トランスフェクションを２４時間行なった後、新鮮な培地または追加の５ｍＭ Ｃｔｎもしくは５ｍＭ ＧＳＨ（還元：酸化＝１：４）のいずれかを含有する培地中にトランスフェクトした細胞を再懸濁することによって、培地交換を行なった。９６時間で、細胞生存度を測定し、ならし培地を回収し、抗体を精製した。両方の培養条件は、ほぼ同一の細胞増殖生存度（＞８０％）、タンパク質発現レベル（約３０ｍｇ／Ｌ）、ｐｒｏＡ溶離プロファイル、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥにおけるタンパク質泳動パターンを共有した。図２Ａは、分析用サイズ排除カラム（ＳＥＣ）のデータを示し、これはタンパク質凝集が１％未満のほぼ同一のクロマトグラフィーを示している。図２Ｂに示す通り、タンパク質試料は、それらのキャッピング状態を測定するために質量スペクトルで分析した。図１Ｃに示す通り、非キャップ付加、１−キャップ付加および２キャップ付加された不均一なキャッピング種を有していた対照ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地試料とは対照的に、追加の５ｍＭ Ｃｔｎを有する培地からのタンパク質試料は、完全にシステイン化−キャップ付加されており、追加のＧＳＨを有する培地からのタンパク質試料は、完全にグルタチオン化−キャップ付加されていた。したがって、十分な量のシステインまたはグルタチオンを培地に加えることによって、完全にシステイン化またはグルタチオン化されたシステイン突然変異抗体が生成された。

上記の参照例、および下記の発明実施例は、システイン−キャッピングが哺乳動物細胞の内ではなく、外で起こることを実証する。これは、これらの試薬を細胞培養中に培地に直接加えると、他の試薬とのシステインキャッピングが生じ得ることを意味する。新規なキャップ付加物質は、薬物コンジュゲーションプロセスに利点を潜在的にもたらし得る。

以下の実施例は、本発明の重要な特徴を例示する。

（実施例１）
システイン突然変異抗体は、ジチオニトロベンゾエートが培地に加えられたときにニトロチオベンゾエートでキャップ付加される：エルマン試薬、５，５’−ジチオビス−（２−ニトロ安息香酸）（ＤＴＮＢ）を、チオニトロベンゾエート（ＴＮＢ）を加えるためのキャッピング剤として調べた。（ＤＴＮＢは、タンパク質中の遊離チオール含有量を分析するために一般的に使用される。この試薬は、ジスルフィド結合を破壊できないが、遊離Ｃｙｓと反応することができる。これは、部分的に還元された抗体物質を処理して、薬物コンジュゲーションのための４つの遊離Ｃｙｓを生成するために使用されている。）システイン突然変異抗体を安定して発現するＣＨＯ細胞株を、ＣＤ−ＣＨＯ培地中で４×１０ｅ６／ｍｌまで成長させ、次いで新鮮なＣＤ−ＣＨＯ培地、０．５ｍＭ ＤＴＮＢを含む新鮮なＣＤ−ＣＨＯ培地、または対照としてトリプルロー培地に切り替えた。細胞をこれらの条件で７２時間培養し、細胞生存度を測定し、ならし培地を回収した。ＤＴＮＢを含む培地中での安定なＣＨＯ細胞の細胞生存度は、４０％まで下がり、おそらくＤＴＮＢがＣＨＯ細胞に対して毒性であったことを示す。ＤＴＮＢ細胞培養物の色は黄色に変化し、遊離チオニトロベンゾエートが培養物中に存在しており、アルキル化が細胞表面タンパク質に起こったことを示唆する。ＤＴＮＢ含有培地中のタンパク質発現も、ＣＤ−ＣＨＯ中のものよりも５倍低かった。３つ全ての培養条件物質のＰｒｏＡカラムからの抗体精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質泳動は、図５Ａに示す通り、ほぼ同一であった。ＳＥＣ分析における３つ全ての試料は、ごく少量の凝集を伴うモノマー種を示す。表１に示す通り、３つ全てのキャッピング形態は、約２％未満の凝集を伴って約１０ｍｇ／ｍｌに濃縮でき、タンパク質は、凍結解凍処理後に安定していた。

図５Ｂに示す通り、質量スペクトルデータは、対照のＣＤ−ＣＨＯ培地が完全なシステイン化をもたらし（２３８Ｄａの質量増加）、トリプルロー培地が完全な非キャップ付加物質を生成したことを示す。ＤＴＮＢ培地は、チオニトロベンゾエートキャッピング（約３９６Ｄａの質量増加）を含むタンパク質種の大部分（＞７０％）を生成した。およそ１ｍＭのシスチンが培地中に存在するように、小さな割合の完全なシステイン化種も存在していた。したがってＤＴＮＢは、シスチンよりもシステイン−キャッピングに効率的であった。ＤＴＮＢは荷電分子であり、膜透過性ではないので、この結果は、システインキャッピングが細胞の外で起こることを示すさらなる証拠を提供する。

（実施例２）
抗体のＴＮＢキャッピングは熱安定性を低下させない：ＴＮＢキャッピングの結果を調べて、このようなキャッピングによって誘導される構造変化が抗体を不安定にするかどうかを決定した。ＤＳＣを使用して、システイン化、非キャップ付加、またはチオベンゾエート−キャップ付加を伴う抗体の熱安定性をモニターした。図６に示す通り、システイン化、非キャップ付加、およびＴＮＢ−キャップ付加抗体は、ほぼ同一の挙動を示し、Ｔｍ１が６９℃を超えていた。非キャップ付加物質に対して融解温度が６℃低下することが知られているＦａｂ領域におけるシステイン化（Ｂａｎｋｓ，Ｇａｄｇｉｌら ２００８）とは対照的に、ＣＨ３領域における不対Ｃｙｓのシステイン化およびニトロベンゾエート−キャッピングは、抗体の構造安定性に影響を与えないようである。これは、非キャップ付加Ｃｙｓを含む抗体が、タンパク質の凝集がほとんどなく１０ｍｇ／ｍｌに濃縮でき、反応性チオールがタンパク質のオリゴマー化を誘発するという仮定と矛盾するという観察と一致する。

（実施例３）
ＴＳＰＰによるＴＮＢキャップ付加抗体の選択的還元：ＴＮＢでキャップ付加したシステイン突然変異抗体は、ＴＳＰＰで選択的に還元される（図８）。生成された遊離チオール基は、鎖間還元および再酸化ステップなしに直接的な薬物コンジュゲーションを可能にし、これはｉｎ ｖｉｔｒｏ操作プロセスを迅速にする。さらに、図９Ａに示す通り、ＴＮＢで完全にキャップ付加された（１抗体当たり２キャッピング、またはＤＡＲ２）ハーセプチンＬ４４３Ｃを生成し、質量スペクトルによって分析した。ＤＡＲ２ ＴＮＢキャップ付加抗体は、ＴＳＰＰ処理後に直接的にコンジュゲートし、ＨＩＣによって分析した効率が９０％であった（図９Ｂ）。同様に、１抗体当たり４キャッピング（ＤＡＲ４）の形態で、ＴＮＢで完全にキャップ付加したハーセプチンＫ２９０ＣＫ３３４Ｃを生成し、ＩＤＥＳおよびＰＮＧアーゼＦ消化の後に質量スペクトルによって分析し（図１０Ａ）、ＴＳＰＰ処理後に直接的にコンジュゲートし、効率が９０％であった（図１０Ｂ）。

さらなる例として、ＴＮＢキャッピングおよびコンジュゲーション（Ｋ２９０Ｃ／Ｋ３３４Ｃ）を本明細書において考察する。システイン突然変異コンジュゲーションのためのＴＮＢキャップ付加コンジュゲーションプロトコルは、粗製のコンジュゲートをもたらす２つのステップからなる：選択的還元、およびコンジュゲーションである。第１のステップでは、突然変異システイン（ただし鎖間ジスルフィドではない）の選択的還元を実施して、突然変異システイン残基から保護基（複数可）の除去を達成する。通常、これは、過剰（約１０当量物）のトリス（３−スルホフェニルホスフィン）（ＴＳＰＰ）などの還元剤を使用して２５℃で２時間行なわれる。特定の例では：０．５ｍＬのエッペンドルフ管中のＫ２９０Ｃ／Ｋ３３４Ｃ抗体１ｍｇ（６．９ｎｍｏｌ；ＰＢＳ中７．６ｍｇ／ｍｌ；１３１．５８μＬ）に、ＴＳＰＰ（１０当量物；６９．０５ｎｍｏｌ；５０ｍＭ水溶液；１．３８μＬ）３９．２μｇを加えた。反応混合物を２５℃で２時間インキュベートした。

第２のステップでは、非保護の突然変異システインをリンカー−ペイロードにコンジュゲートした。通常、過剰（約１０当量物）のリンカー−ペイロードを反応に加え、反応が２５℃で１時間行なわれて、粗製のコンジュゲートが生成される。したがって、特定の例では：上記ステップ１からの反応混合物に、ｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロード（１０当量物、６９．０５ｎｍｏｌ；ジメチルスルホキシド中１０ｍＭ；６．９μＬ）９２．６μｇを加えた。反応混合物を２５℃で１時間インキュベートした。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）アッセイを使用して反応混合物を分析した。

（実施例４）
追加の薬物コンジュゲーション化学反応のためにケミカルハンドルを用いた追加の操作されたシステインキャッピング：本発明の別の応用例は、新規なアルキル化ケミカルスペーサーを培地中に加えることによって新規なキャッピング（すなわち、ＴＮＢ以外）を操作することである。図１１に示す通り、これらのアルキル化ケミカルスペーサーは、アルデヒドまたはアジド官能基などのケミカルハンドルを含有し、それが追加の薬物コンジュゲーション化学反応を可能にする。ケトン／アルデヒドの場合には、それらは追加のコンジュゲーション化学反応のためにアミノオキシ求核試薬またはヒドラジドと反応でき、オキシム／ヒドラゾン生成物を形成する。

マレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド（ＭＴＦＢ）は、ＰＥＧ３リンカーおよび４−ホルミルベンズアミド（Ｓｏｌｕｌｉｎｋ Ｉｎｃ、米国カリフォルニア州Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ）を含むマレイミドである。以下に示すように、ＭＴＦＢは、アルデヒド基を有するアルキル化ケミカルスペーサーである：

図１２Ａに示す通り、抗体ＨＡＢ０８Ｌ４４３Ｃを安定して発現するＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞を、ＣＤ−ＣＨＯ培地中３７℃でおよそ２．５ｅ６細胞／ｍｌまで成長させ、次いでトリプルロー培地（ゼロまたは低Ｃｙｓ−、Ｃｔｎ−、およびＧＳＨ）に切り替えた。ＤＭＳＯに溶解させた１９．８ｍＭ ＭＴＦＢを、最終濃度０．２５ｍＭで２４時間、５０ｍｌの細胞培養物に加えた。細胞生存度を測定し、ならし培地を回収した。０．５ｍＭ ＤＴＮＢで制御された培養物と比較して、ＭＴＦＢとの条件における細胞生存度および細胞数は、著しく低かった。このような条件における抗体ＨＡＢ０８Ｌ４４３Ｃを、続いて１ｍｌ−ＰｒｏＡカラムによって精製した（図１２Ｂ）。このような抗体を２部ＬＣ／ＭＳ研究にかけ、まずＦｃ−グリカンを除去するためにＰＮＧＦで、次いで４４３Ｃｙｓを含有するｓｃＦｃからＦａｂ２を分離するためにＩＤＥＳで消化した。図１２Ｃに示す通り、ＭＴＦＢ−キャップ付加ＨＡＢ０８ Ｌ４４３Ｃ抗体種を生成した。

ＭＴＦＢキャップ付加抗体のアルデヒド基は、ヒドラジンまたはアミノオキシ−ＰＥＧ３−Ｃ２−アミド−ＭＭＡＤなどのアミノオキシ含有ペイロードと反応させる。１０μＭの抗体およびペイロードを、０．３Ｍリン酸Ｎａ（ｐＨ７．０）中で調製したばかりの１００ｍＭアニリンの存在下でインキュベートする。反応は、ヒドラゾンまたはオキシム生成物を形成するために室温で２４時間行なわれる。最終的なコンジュゲートされた抗体は、ＨＩＣカラムを通って精製される。

アルキンまたはアジド官能基などのケミカルハンドルを含有するアルキル化ケミカルスペーサーは、付加環化コンジュゲーションを可能にする。以下に示すように、ジベンゾシクロオクチル−ポリエチレンマレイミド（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）は、ＰＥＧ４リンカーおよびジベンゾシクロオクチルを有するマレイミドである（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、米国アリゾナ州Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ）。アジド−ＰＥＧ３−マレイミドは、ＰＥＧ３リンカーおよびアジドドメインを有するマレイミドである（Ｃｌｉｃｋ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｔｏｏｌｓ、米国アリゾナ州Ｓｃｏｔｔｓｄａｌｅ）。

ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドを有する新規なＣｙｓキャッピングが生成されたことを実証するために、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞に、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ培地２Ｌ中に細胞密度２．０ｅ６細胞／ｍｌ、３７℃で１アーム抗体８Ｄ３Ｋ２９０Ｃを一過的にトランスフェクトした。トランスフェクションの２４時間後、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を次いでトリプルロー培地（ゼロまたは低Ｃｙｓ−、Ｃｔｎ−、およびＧＳＨ）に切り替えて３７℃で９６時間追加した。ならし培地を回収し、ろ過し、保存濃度２９．６ｍＭをＤＭＳＯに溶解して最終濃度０．１４ｍＭにしたＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミドと追加の２４時間３７℃でインキュベートした。このようなならし培地から１アーム抗体８Ｄ３Ｋ２９０Ｃを続いて５ｍｌ−ＰｒｏＡカラムによって精製した。このような抗体をＬＣ／ＭＳ研究にかけ、まずＰＮＧアーゼＦで消化してＦｃ−グリカンを除去した。図１４に示す通り、ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド−キャップ付加８Ｄ３Ｋ２９０Ｃ抗体種を生成した。同様に、アジド−ＰＥＧ３−マレイミド−キャップ付加８Ｄ３Ｋ２９０Ｃも生成した。

付加環化コンジュゲーション反応では、ＰＢＳバッファー中の１０μＭアジド−ＰＥＧ３−マレイミド−キャップ付加抗体を、１００μＭジベンゾシクロオクチル−ポリエチレングリコール（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ）−ＭＭＡＦ（ＡＣＭＥ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ；米国カリフォルニア州Ｐａｌｏ Ａｌｔｏ）と室温で１６時間インキュベートする。銅フリークリックコンジュゲーション反応を、１ｍＭアジ化ナトリウムの添加によって停止させる。コンジュゲートした抗体は、ＨＩＣカラムによって精製することができる。

追加の新規なＣｙｓキャッピングの例には、ビオチンの機能的ドメインを含むアルキル化ケミカルスペーサーが含まれる。ビオチンによるこのＣｙｓキャッピングは、細胞イメージングおよびタンパク質ラベリングのためのストレプアビジンとビオチンの間の特異的非共有結合性相互作用を可能にする。以下に示すように、マレイミド−ＰＥＧ２−ビオチン（ＭＰＢ）は、ＰＥＧ２リンカーおよびビオチンドメインを含むマレイミドである。

抗体ＨＡＢ０８Ｌ４４３Ｃを安定して発現するＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞を、ＣＤ−ＣＨＯ培地中３７℃でおよそ２．５ｅ６細胞／ｍｌまで成長させ、次いでトリプルロー培地（ゼロまたは低Ｃｙｓ−、Ｃｔｎ−、およびＧＳＨ）に切り替えた。２０ｍＭマレイミド−ＰＥＧ２−ビオチンを、最終濃度０．２ｍＭで４８時間、５０ｍｌの細胞培養物に加えた。細胞生存度および細胞数は、ＭＰＢ処理によって影響されなかった。このような培養条件下の抗体ＨＡＢ０８Ｌ４４３Ｃを続いて１ｍｌ−ＰｒｏＡカラムによって精製し、２部ＬＣ／ＭＳ研究にかけ、Ｆｃ−グリカンを除去するためにＰＮＧアーゼＦと、４４３Ｃｙｓを含有するｓｃＦｃからＦａｂ２を分離するためにＩＤＥＳの両方で消化した。図１５に示す通り、ＭＰＢキャップ付加ＨＡＢ０８ Ｌ４４３Ｃ抗体種を生成した。

（実施例５）
ゼロまたは低システイン−、シスチン−およびグルタチオン−培地中でのＨＥＫ２９３一過性発現による完全な非キャップ付加システイン突然変異抗体の生成：過剰なシステインまたはグルタチオンを培地に加えることがシステイン突然変異抗体のキャッピング状態に影響するという発見は、システインキャッピングが細胞の外で生じることを示唆する。これをさらに調査するために、システイン、シスチンおよびグルタチオンを欠く培地（いわゆる「トリプルロー」培地）を生成した。特定の理論に限定されるものではないが、細胞内でシステイン化およびグルタチオン化が起こった場合（一般的に推測されたように）、ＥＲ内腔は十分なシステイン、シスチンおよびグルタチオンを有する（セリンおよびメチオニンなどの他の培地成分から合成可能である）ので、実質的なシステイン化またはグルタチオン化された抗体は、トリプルロー培地を用いて生成された抗体中で依然として検出されるはずであることが推察された。逆に、システイン化およびグルタチオン化が細胞の外で起こった場合、システイン突然変異抗体は、トリプルロー培地中で生成されたとき、培地中に利用可能なキャッピング供給源がないため、完全に非キャップ付加であるはずである。通常のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地中のＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトし、次いで新鮮なＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地（対照）またはトリプルロー培地のいずれかに再懸濁させた。トランスフェクションは、２４時間で完了した。９６時間の細胞生存度を測定し、ならし培地を回収した。トリプルロー培地では、培養細胞生存度が５０％であったが、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）２９３発現培地では細胞生存度が８０％であった。（この生存度の観察は予想外ではない。Ｃｙｓは非必須アミノ酸であるけれども、細胞は依然として、Ｃｙｓの直接供給を欠く変化に適応する時間を必要とするはずである）。トリプルロー培地中でのタンパク質発現は、タンパク質合成が即時のシステイン供給の欠如のためにおそらく遅くなったので、通常培地中のものより５倍低かった。ＰｒｏＡカラムからの抗体精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質泳動は、ほぼ同一であった（データを図示せず）。図３Ａは、ＳＥＣデータを示し、これはタンパク質凝集が１％未満のほぼ同一のクロマトグラフィーを示す。次いでタンパク質試料を、それらのキャッピング状態測定のために質量スペクトルで分析した。図３Ｂに示す通り、通常培地は同様の不均一なキャッピング混合物を与えたが、興味深いことに、トリプルロー培地は完全な非キャップ付加種のみを生成し−システイン化種は存在しなかった。このデータは、ＨＥＫ２９３細胞では、システイン化キャッピングが細胞の外で起こるようであることを示す。

（実施例６）
ゼロまたは低システイン−、シスチン−およびグルタチオン−培地中での安定なＣＨＯ発現による完全な非キャップ付加システイン突然変異抗体の生成：実施例５の観察が細胞株特異的または一過性発現に関連した可能性を除外するために、安定なＣＨＯ−ＤＵＫＸ系を用いて実験を繰り返した。システイン突然変異抗体を安定して発現するＣＨＯ−ＤＵＫＸ細胞株は、ＣＤ−ＣＨＯ培地中で４×１０ｅ６／ｍｌまで成長させ、次いでこれらの細胞を、ＣＤ−ＣＨＯ培地（対照）またはトリプルロー培地のいずれかに切り替えた。もう１つの対照は、３７℃の代わりに３１℃で培養する新鮮なＣＤ−ＣＨＯ培地である。７２時間で細胞生存度を測定し、ならし培地を回収した。トリプルロー培地中で成長した細胞では、安定なＣＨＯ細胞の細胞生存度は６０％であった。ＣＤ−ＣＨＯ培地中で成長した細胞の細胞生存度は、９５％を超えた。トリプルロー培地中でのタンパク質発現は、おそらく培地中のシステインの欠乏のために、ＣＤ−ＣＨＯ培地中のものよりもほぼ５倍低かった。両方の培地からのＰｒｏＡカラムからの抗体精製およびＳＤＳ−ＰＡＧＥ中のタンパク質泳動は、ほぼ同一であった（データを図示せず）。図４Ａは、凝集が極めて少ない同様のＳＥＣデータを示す。タンパク質試料を、質量スペクトルによって分析してキャッピングを測定した。図４Ｂに示す通り、ＣＤ−ＣＨＯ培地では、システイン突然変異抗体は、３７℃または３１℃のいずれかにおいても完全にシステイン化されており、培養温度がキャッピング状態に影響しなかったことを示す。トリプルロー培地では、安定なＣＨＯ細胞は、完全な非キャップ付加システイン突然変異タンパク質を生成した。したがってＣＨＯ細胞では、システイン化キャッピングは、細胞の外で起こるようである。このデータは、トリプルロー培地中での完全な非キャップ付加システイン突然変異抗体の生成は、細胞タイプに特異的ではないことを裏付けている。

（実施例７）
非キャップ付加システイン突然変異抗体の直接的なコンジュゲーション：２０ｍＭヒスチジン、ｐＨ５．８バッファー中の、実施例６からのＩＬ１３Ｒａ２ Ｌ４４３Ｃ非キャップ付加ｍＡｂ ０．５ｍｇ（３．４５ｎｍｏｌ；１０．１９ｍｇ／ｍｌ；４９．０７μＬ）に、ｍｃｖｃＰＡＢＣ０１０１リンカー−ペイロード３２．０μｇ（１０当量物、３４．５２ｎｍｏｌ；ジメチルスルホキシド中１０ｍＭ；１．７μＬ）を加えた。反応混合物を２５℃で、１時間インキュベートした。疎水性相互作用クロマトグラフィー（ＨＩＣ）アッセイを使用して反応混合物を分析した。対応する、コンジュゲートしていない抗体を含む実施例７のＡＤＣと、従来の方法によって調製した対応するＡＤＣのＨＩＣクロマトグラムを比較する図１３を参照のこと。

（実施例８）
細胞培養物へのＤＴＮＢ添加を滴定すると、ニトロチオベンゾエートキャップ付加Ｃｙｓ突然変異Ｋ２９０Ｃ抗体は、システインを含有する正常な培地ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）中でＨＥＫ２９３Ｆ一過性発現系によって効率的に生成される：ニトロチオベンゾエートキャッピングが、ＨＥＫ２９３Ｆ一過性発現中に正常な細胞培養培地下で生成され得るかどうかを決定するために、ＤＮＡトランスフェクション後に種々の濃度のＤＴＮＢ溶液をＨＥＫ２９３Ｆ培養物に加えた。簡潔に述べれば、ＨＥＫ２９３Ｆ細胞を、ＦｒｅｅＳｔｙｌｅ（商標）培地中で約１．０ｅ６／ｍｌまで成長させ、ＤＮＡ １ｍｇ（Ｃｙｓ突然変異Ｋ２９０Ｃ抗体の重鎖ＤＮＡ ０．５ｍｇおよび軽鎖ＤＮＡ ０．５ｍｇ）をトランスフェクション剤３．５ｍｇと混合し、室温で２０分のインキュベーションを行なった。混合物をＨＥＫ２９３Ｆ細胞１Ｌと播種し、トランスフェクトした細胞を３７℃で培養した。トランスフェクションの１６時間後に、４０ｍＭの保存濃度から最終濃度０．５ｍＭ、または１ｍＭ、または２ｍＭ、または３ｍＭ、または４ｍＭ、または６ｍＭでのＤＴＮＢを、トランスフェクトした細胞培養物１Ｌの細胞培養アリコート５０ｍｌに播種した。このような細胞培養をさらに５日間継続した。ならし培地を回収し、ろ過し、１ｍｌ−ＰｒｏＡカラム精製にかけた。タンパク質溶離物をＰＢＳバッファーに対して透析し、セントリコンによって濃縮した。

図１６に示す通り、質量スペクトルデータは、ＤＴＮＢ濃度の増大と共に、チオニトロベンゾエートキャッピングを有するタンパク質種（約３９６Ｄａの質量増加）が大幅に改善されたことを示す。３ｍＭ ＤＴＮＢよりも高い濃度では、ほぼ全てのタンパク質種がチオニトロベンゾエートキャップ付加されていた。この結果は、システインを含む正常な培地中でチオニトロベンゾエートキャッピングがＨＥＫ２９３Ｆ一過性発現中に生成され得ること、およびチオニトロベンゾエートキャッピング生成がシステイン化キャッピングのものよりはるかに効率的であるようにみえることを示す。

Claims (19)

1. 所定のキャッピング部分を抗体上の１個または複数の不対システイン残基上に結合させる方法であって：抗体発現細胞株を、前記所定のキャッピング部分、または前記所定のキャッピング部分の前駆体を含有する培地中で成長させるステップを含み、ここで前記細胞株は、前記抗体を発現し、かつここで前記所定のキャッピング部分は、前記発現した抗体上の少なくとも１個の前記不対システイン残基に共有結合によって結合している、方法。
2. 前記所定のキャッピング部分が、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）、２−メルカプトピリジン、ジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）、４−チオ安息香酸、２−チオ安息香酸、４−チオベンゼンスルホン酸、２−チオベンゼンスルホン酸、スルホン酸メチル（Ｍｓ）、ｐ−トルエンスルホネート（Ｔｓ）およびトリフルオロメタンスルホネート（Ｔｆ）からなる群から選択される、請求項１に記載の方法。
3. 前記所定のキャッピング部分が、アルデヒドハンドルを含むマレイミドトリオキサ−４−ホルミルベンズアミド（ＭＴＦＢ）様分子またはアジドハンドルを含むマレイミドアジド−リジン様分子、またはアルキンハンドルを含むジベンゾシクロオクチル−ポリエチレン
   マレイミド（ＤＢＣＯ−ＰＥＧ４−マレイミド）様分子からなる反応性基から選択される、請求項１に記載の方法。
4. 抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはタンパク質コンジュゲートを生成する方法であって：
   （ａ）キャップ付加抗体を細胞培養で生成するステップ（ここで前記抗体上の１個または複数の不対システイン残基が、硫黄結合によって１個または複数の所定のキャッピング部分と共有結合している）と；
   （ｂ）抗体鎖間硫黄結合を還元することなく前記キャッピング部分を前記抗体から除去できる還元剤に前記キャップ付加抗体を曝露するステップと；
   （ｃ）酸化剤を導入することなく、前記抗体上の１種または複数の還元された硫黄結合を、結合部分を介してペイロードとコンジュゲートするステップと
   を含む方法。
5. 前記所定のキャッピング部分が、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）および２−メルカプトピリジンおよびジチオジピリジン（ＤＴＤＰ）からなる群から選択される、請求項４に記載の方法。
6. 前記所定のキャッピング部分が、５−チオ−２−ニトロ安息香酸（ＴＮＢ）である、請求項５に記載の方法。
7. 前記還元が不対システイン残基で主に起こる、請求項４に記載の方法。
8. 前記ペイロードが、アウリスタチン、スプライソスタチン、カリケアミシンまたは１種もしくは複数のＣＢＩ、ＣＰＩおよびＣＴＩモノマーを含むダイマーである、請求項４に記載の方法。
9. 前記アウリスタチンが、（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド，トリフルオロ酢酸塩）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド，トリフルオロ酢酸塩）；モノメチルドラスタチン１０；（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−ノルエフェドリン）；および（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−フェニルアラニン）から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記還元剤が、
    

    

    またはＲ^４−Ｓ−Ｈからなる群から選択され、
    ここで、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のそれぞれは、独立に、（Ｃ_１〜Ｃ_６）アルキル、（Ｃ_５〜Ｃ_７）アリールおよび（Ｃ_５〜Ｃ_７）ヘテロアリールからなる群から選択され、ここでＲ^１、Ｒ^２、Ｒ^３およびＲ^４のそれぞれは、独立に、ＳＯ_３Ｎａ、ＣＯＯＨ、ＯＨ、ＯＭｅ、ＮＯ_２およびＮＨ_２から選択される１個もしくは複数の置換基で置換されていてもよい、請求項４に記載の方法。
11. 前記還元剤が、トリス（３−スルホフェニル）ホスフィン（ＴＳＰＰ）：
    

    

    である、請求項４に記載の方法。
12. 前記細胞培養物が、キャッピング部分の前駆体を含有し、前記キャッピング部分の前記前駆体がエルマン試薬である、請求項４に記載の方法。
13. １個または複数の非キャップ付加不対システインを含む抗体を生成する方法であって、
    （ａ）システインが少なく、シスチンが少なく、かつグルタチオンが少ない培地中で抗体発現細胞を成長させるステップと、
    （ｂ）発現された非キャップ付加抗体を回収するステップと
    を含む方法。
14. 前記培地が、５ｍＭ未満、１ｍＭ未満または０．２ｍＭ未満のシステイン、５ｍＭ未満、１ｍＭ未満または０．２ｍＭ未満のシスチンおよび５ｍＭ未満、１ｍＭ未満または０．２ｍＭ未満のグルタチオンを含む、請求項１３に記載の方法。
15. 前記細胞株が、ＣＨＯ、ＨＥＫ２９３およびＮＳＯからなる群から選択される、請求項１３に記載の方法。
16. 抗体薬物コンジュゲート（ＡＤＣ）またはタンパク質コンジュゲートを生成する方法であって：
    （ａ）低システイン、低シスチンおよび低グルタチオン培地中で抗体発現細胞を成長させるステップと、
    （ｂ）１個または複数の非キャップ付加不対システインを含む発現された抗体を回収するステップと、
    （ｃ）前記回収した抗体を、結合部分を介してペイロードとコンジュゲートするステップと
    を含む方法。
17. 前記ペイロードが、アウリスタチン、スプライソスタチン、カリケアミシンまたは１種もしくは複数のＣＢＩ、ＣＰＩおよびＣＴＩモノマーを含むダイマーである、請求項４および１６の一項に記載の方法。
18. 前記アウリスタチンが、（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソ−３−｛［（１Ｓ）−２−フェニル−１−（１，３−チアゾール−２−イル）エチル］アミノ｝プロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド，トリフルオロ酢酸塩）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−３−メトキシ−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−１−メトキシ−３−｛［（２Ｓ）−１−メトキシ−１−オキソ−３−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチルアラニル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ，２Ｒ）−１−ヒドロキシ−１−フェニルプロパン−２−イル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド）；（２−メチル−Ｌ−プロリル−Ｎ−［（３Ｒ，４Ｓ，５Ｓ）−１−｛（２Ｓ）−２−［（１Ｒ，２Ｒ）−３−｛［（１Ｓ）−１−カルボキシ−２−フェニルエチル］アミノ｝−１−メトキシ−２−メチル−３−オキソプロピル］ピロリジン−１−イル｝−３−メトキシ−５−メチル−１−オキソヘプタン−４−イル］−Ｎ−メチル−Ｌ−バリンアミド，トリフルオロ酢酸塩）；モノメチルドラスタチン１０；（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−ノルエフェドリン）；および（Ｎ−メチルバリン−バリン−ドライソロイイン−ドラプロイン−フェニルアラニン）から選択される、請求項１７に記載の方法。
19. 前記リンカー部分がｍｃまたはｍｃｖｃＰＡＢＣである、請求項４および１６の一項に記載の方法。

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