BR112019015044A2 - Processo de produção em grande escala para cisteínas de anticorpo capeadas e não capeadas e seu uso na conjugação de proteínas terapêuticas - Google Patents

Processo de produção em grande escala para cisteínas de anticorpo capeadas e não capeadas e seu uso na conjugação de proteínas terapêuticas Download PDF

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Abstract

a presente invenção refere-se a otimização da produção de cisteínas seletivamente capeadas e não capeadas em anticorpos através da manipulação das condições de crescimento celular incluindo a depleção deliberada da cisteína e/ou cistina no processo de cultura celular por meio de componentes do meio, duração de batelada, ou densidade celular para alcançar uma produção eficiente de proteínas incluindo conjugados de anticorpos-fármaco (adcs); conjugação de uma proteína contendo cisteína capeada com tnb através da sua reação com um agente redutor capaz de separar os componentes de capeamento com tnb da proteína sem reduzir significativamente as ligações de enxofre intercadeias de anticorpos, e conjugação das ligações de enxofre reduzidas na proteína com uma carga útil através de um componente de ligação reativa.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para PROCESSO DE PRODUÇÃO EM GRANDE ESCALA PARA CISTEÍNAS DE ANTICORPO CAPEADAS E NÃO CAPEADAS E SEU USO NA CONJUGAÇÃO DE PROTEÍNAS TERAPÊUTICAS. CAMPO DA INVENÇÃO [0001] O campo da invenção é a otimização da produção de cisteínas capeadas por 5-tio-2-nitrobenzoato (TNB) em anticorpos através da manipulação das condições de crescimento celular, o que leva em conta uma produção mais eficiente de conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs).
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [0002] Os conjugados de anticorpo-fármaco (ADCs) são um tipo de terapia direcionada que consiste tipicamente em um anticorpo munido com fármacos citotóxicos potentes (Chudasama et al. Nature Chemistry, 2016; Junutula and Gerber, ACS medicinal chemistry letters 2016). Os ADCs oferecem assim a prospecção da liberação seletiva de cargas úteis tóxicas para tumores, ao mesmo tempo que evitam toxicidades fora do alvo que frequentemente limitam ou excluem o uso de quimioterapias de períodos prolongados de tratamento. Como uma plataforma terapêutica promissora, existem atualmente peto menos dois produtos de ADC aprovados no mercado (brentuximab vedotina e trastuzumab entansina). Em seu crescimento exponencial, os ADCs possuem um número significativo de candidatos terapêuticos que passam por avaliação clínica.
[0003] Para que os ADCs alcancem seus potenciais terapêuticos, tecnologias de conjugação sofisticadas são requeridas para conectar os fármacos citotóxicos ao anticorpo. A maioria dos candidatos de ADC atuais, incluindo os dois ADCs comerciais, utiliza métodos convencionais de conjugação não específica através de lisina de superfície aleatória ou cisteínas livres de quatro díssulfetos
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2/56 intercadeias reduzidos. Isto gera misturas de ADC altamente heterogêneas, que não apenas criam estímulos de reprodutíbilidade de fabricação, mas também reduzem significativamente o índice terapêutico.
[0004] Para tratar estas questões, o campo de ADC foi movido para tecnologias de conjugação específicas do sítio, tais como ADCs específicos do sítio com base em cisteína (Cys) (Junutula et al., Nat Biotechnol 2008). Cadeias laterais robustas de tiol nucleofílico compreendendo resíduos de cisteína não correlacionados planejados permitem uma reação de conjugação química rápida e simples para fixar vários conectores/cargas úteis para fornecer produtos de ADC homogêneos. Melhores perfis de farmacocinética definidos e melhorados (PK) para estas moléculas de ADC resultantes foram relatados. A plataforma específica do sítio possui seus próprios desafios técnicos. Quando produzidos em células de mamífero, os grupos de tiol nos resíduos de cisteína introduzidos formam dissulfetos com cisteínas livres ou glutationas (GSH). As assim chamadas modificações de capeamento Cys necessitam ser removidas antes da conjugação de fármacos através de uma etapa de redução parcial. Visto que tal tratamento também reduz os dissulfetos intercadeias de anticorpos, estes dissulfetos intercadeias de anticorpos reduzidos devem então ser reformados através de um processo de reoxidação incluindo agentes redutores da diálise, cisteína ou glutationa, e tratamento com reagentes de oxidação (Junutula et al., Nat Biotechnol 2008). O processo de redução e reoxidação tedioso potencialmente introduz o embaralhamento de dissulfeto e a deformação sobre o anticorpo, o que pode afetar adversamente a duplicação da proteína e a qualidade da proteína, e também provocar problemas tais como PK mais fraca para os ADCs resultantes.
[0005] Para resolver este problema potencial, uma nova estratégia
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3/56 de redução seletiva de capeamento de Cys utilizando tionitrobenzoato (TNB) foi desenvolvida (ver PCT/IB2016/054789, incorporada nesta invenção por referência) sem afetar os dissulfetos intercadeias do anticorpo. O capeamento de TNB, um produto de reação de reagente de Ellman (5,5’-ditiobis(2-nitrobenzoato, DTNB) com grupo de tio! livre de cisteína, é um capeamento instável devido ao seu potencial de reação de oxirredução fraco. Foi mostrado que o agente redutor tris(3sulfonatofenil)fosfina (TSPP) pode seletivamente remover o capeamento de TNB sem reduzir os dissulfetos endógenos. Este processo TNB/TSPP seguido pela conjugação direta elimina as condições severas das etapas de reação de oxirredução convencionais, mantendo a duplicação do anticorpo original intacto. No entanto, métodos mais eficientes de capeamento de TNB são requeridos para otimizar a produção comercial de ADCs.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO [0006] A presente invenção baseia-se na descoberta de que a condição de capeamento de resíduos de cisteína em anticorpos pode ser modificada através da otimização de parâmetros tais como crescimento celular, densidade celular e/ou cultivo celular. Assim a invenção refere-se a um processo de produção de anticorpos em células de mamífero em que os resíduos de cisteína não correlacionados planejados permanecem não capeados com tiol livre, o que leva em conta a modificação eficiente , tipicamente o capeamento com tionitrobenzoato (TNB) quando várias concentrações de ditionitrobenzoato (DTNB) são adicionadas em diferentes estágios da cultura celular ou densidades celulares.
[0007] A invenção refere-se ainda aos conjugados de anticorpofármaco (ADCs) ou conjugados de fármaco de proteína terapêutica produzidos utilizando estes anticorpos capeados com TNB, em particular ADCs formados pela redução seletiva dos resíduos de
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4/56 cisteína de anticorpos capeados com TNB, que evitam a redução de dissulfetos intercadeias e assim eliminam a necessidade de uma etapa de (re)oxidação antes da conjugação. A invenção ainda refere-se a novos anticorpos capeados cobertos com tionitrobenzoato produzidos de acordo com os métodos aqui descritos que levam em conta a redução seletiva com TSPP ou agentes relacionados para a conjugação direta com eficiência melhorada de conjugação.
[0008] Mais especificamente, nesta invenção, demonstrou-se que a condição de capeamento de cisteínas de superfície não correlacionados em um anticorpo pode ser melhorada pela manipulação cuidadosa do crescimento celular, da densidade celular ou condições de cultura celular. Na cultura celular de mamífero, a cisteína é um aminoácido chave. A cisteína e sua forma oxidada (Ctn), no meio de cultura, é preferivelmente utilizada para o crescimento celular, presumivelmente através do transportador de aminoácidos Xc' (Sato et al., J Biol Chem 1999; figura abaixo). A reação de capeamento Cys por cisteína/cistina/glutationa fora das células é um processo lento e, consequentemente, as cisteínas de superfície não correlacionados permanecem não capeadas com tióis livres durante o cultivo de alta densidade celular. Quando o DTNB foi adicionado à cultura de células em um estágio particular, foi gerado um anticorpo capeado com TNB quase homogêneo. Estas descobertas forneceram uma estratégia possível para produzir um anticorpo capeado com TNB em grande quantidade - vide Figura 18.
[0009] Além do mais, os processos de cultura celular são tipicamente projetados para garantir que os aminoácidos, tais como cisteína e seus equivalentes, não sejam limitados ou esgotados, a fim de maximizar o crescimento celular, a densidade e a titulação de células viáveis e evitar substituições de aminoácido (isto é, má incorporação de aminoácidos) (Ver a Patente U.S. No. 8.232.075 B). A
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5/56
L-cisteína e sua forma oxidada, L-cistina, são consideradas aminoácidos essenciais em cultura de células de mamífero como geração de cisteína a partir da conversão de metionina na taxa que limita o crescimento celular, metabolismo celular e produtividade. Entretanto, nesta invenção, vários métodos que limitam ou esgotam deliberadamente a quantidade de cisteína/cisteína disponível na cultura celular, foram utilizados para promover a condição de capeamento apropriado dos resíduos de cisteína no anticorpo com TNB.
[0010] Assim, em uma modalidade da invenção, é fornecido um processo para a geração de proteínas contendo cisteína capaz de ser conjugado a uma carga útil química, o processo compreendendo as etapas de: (a) semeadura de um meio de crescimento celular, o meio compreendendo um ou mais componentes de crescimento selecionados de cisteína, cistina e glutationa, com células capazes de expressar proteínas contendo cisteína; (b) incubação das células para obter uma densidade celular suficiente para esgotar a maioria dos componentes de crescimento presentes no meio de crescimento; e (c) incubação adicional das células para expressar proteínas contendo cisteína tendo um ou mais resíduos de cisteína não capeados compreendendo um tiol livre. Este processo de pode ainda compreender a etapa de: (d) introdução de um componente de capeamento predeterminado, ou um precursor deste, nas proteínas contendo cisteína expressas, por meio das quais uma ou mais cisteínas nas proteínas são capeadas com o componente de capeamento predeterminado. Nesta modalidade, a densidade celular alcançada é tipicamente pelo menos cerca de 1E6 células/ml, e pode ser, por exemplo, pelo menos cerca de 5E6 células/ml, 10E6 células/ml, 50E6 células/ml, 100E6 células/ml ou 500E6 células/ml, preferivelmente acima de 10E6 células/ml, mais preferivelmente acima
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6/56 de 50E6 células/ml.
[0011] Observar que o componente de capeamento predeterminado pode ser um agente de alquilação, em alguns casos atuando como parâmetros identificadores químicos diferentes do TNB ou componentes instáveis similares úteis para tipos adicionais de química de conjugação de fármacos. Estes parâmetros identificadores são anexados ao anticorpo através da adição de novos espaçadores químicos de alquilação no meio de cultura. Os espaçadores químicos de alquilação contêm parâmetros identificadores químicos, tais como aldeídos, cetonas, azidas e alquinas. No caso de cetonas e aldeídos, estes parâmetros identificadores químicos podem reagir com nucleófilos de aminoóxi ou hidrazida com relação à química de conjugação adicional, formando produtos de oxima/hidrazona. No caso de azidas e alquinas, estes parâmetros identificadores químicos podem permitir a conjugação de cicloadição. Os espaçadores químicos de alquilação adicionais incluem domínio funcional de Biotina, que permite uma interação não covalente rígida específica entre Estreptavidina e Biotina. Ver a WO2017/025897 no Exemplo 4 que debate o parâmetro identificador químico de benzamída maleimido trioxa-4-formila (MTFB), dibenzociclooctil-polietileno maleimida (DBCO-PEG4-Maleimida), e Maleimida-PEG2-Biotina (MPB).
[0012] Uma outra modalidade da invenção inclui um processo para a geração de proteínas contendo cisteína capazes de serem conjugadas com uma carga útil química, o processo compreendendo as etapas de: (a) semeadura de um meio de crescimento celular, o meio compreendendo um ou mais componentes de crescimento selecionados de cisteína, cistina e glutationa, com células capazes de expressar proteínas contendo cisteína; (b) incubação das células para expressar proteínas contendo cisteína tendo um ou mais resíduos de cisteína não capeados compreendendo um tiol livre; e (c) na etapa (a),
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7/56 na etapa (b) ou nas etapas tanto (a) quanto (b) manutenção da concentração do um ou mais componentes de crescimento em concentrações abaixo de 0,4 mM, abaixo de 0,3 mM, abaixo de 0,2 mM, abaixo de 0,1 mM ou abaixo de 0,05 mM. Este processo pode ainda compreender a etapa de: (d) introdução de um componente de capeamento predeterminado, ou um precursor deste, nas proteínas contendo cisteína expressas, por meio das quais uma ou mais cisteínas nas proteínas são capeadas com o componente de capeamento predeterminado.
[0013] Mais uma outra modalidade inclui um processo para a geração de proteínas contendo cisteína capazes de serem conjugadas a uma carga útil química, o processo compreendendo as etapas de: (a) semeadura de um meio de crescimento celular, o meio compreendendo um ou mais componentes de crescimento selecionados de cisteína, cistina e glutationa, com células capazes de expressar proteínas contendo cisteína, incluindo, mas não limitadas a estas, onde a concentração inicial dos componentes de crescimento está abaixo de 2 mM, abaixo de 0,4 mM, abaixo de 0,3 mM, abaixo de 0,2 mM, abaixo de 0,1 mM ou abaixo de 0,05 mM, e depois (b) incubação das células para expressar proteínas contendo cisteína tendo um ou mais resíduos de cisteína não capeados compreendendo um tiol livre. Este processo pode ainda compreender a etapa de: (c) introdução der um componente de capeamento predeterminado, ou um precursor deste, nas proteínas contendo cisteína expressas, por meio das quais uma ou mais cisteínas nas proteínas são capeadas com o componente de capeamento predeterminado.
[0014] Também dentro da presente invenção estão as modalidades onde os componentes de crescimento são esgotados na cultura celular, através da limitação deliberada da cisteína e/ou suas formas alternativas no processo. Com o uso do projeto de meios
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8/56 racionais e abordagens estequiométricas ensinadas na US 8.232.075 B5 a quantidade requerida de cisteína/cistina necessária para uma densidade de célula máxima particular e a quantidade de produto produzido podem ser calculadas pela equação abaixo (Equação 1). Esta equação é genérica para culturas de CHO e uma equação mais específica pode ser gerada para uma determinada linhagem celular através da determinação da taxa de consumo de cisteína para esta linhagem celular em um dado processo.
[0015] Equação 1. Concentração de Cisteína Requerida [0016] Concentração de Cisteína Requerida = [(x*m) + (x*m*k) + (p*n)]*f [0017] x: concentração de cisteína necessária para E6 células/ml (0,09 mM) [0018] m: densidade máxima de células (E6 células/ml) [0019] k: fator de manutenção (10 a 15%) [0020] p: concentração de cisteína requerida para 1 g/l de anticorpo (0,19 mM) [0021] n: concentração final de anticorpos (1 g/l) [0022] f: fator de segurança (1,1 a 1,3) [0023] Após a determinação da quantidade necessária de cisteína para uma linhagem celular particular em um dado processo, a equação de relação de limitação de cisteína fracionada pode ser utilizada para determinar a quantidade de cisteína/cistina para suprir em um processo para direcionar uma relação de limitação específica (Equação 2), a fim de limitar ou esgotar deliberadamente a cisteína/cistina na cultura. Dentro da presente invenção estão as modalidades onde os componentes de crescimento são esgotados mediante a limitação da relação de limitação de cisteína fracionada no meio de crescimento celular para menos do que cerca de 1,0X. Estas relações podem ser, por exemplo, ao redor de: 0,95x, 0,90x, 0,85x,
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9/56
0,80χ, 0,75χ, 0,70χ, 0,65χ, 0,60χ, 0,55χ, 0,50χ, 0,45χ, 0,40χ, 0,35χ,
0,30χ, 0,25χ, 0,20χ, 0,15χ, 0,10χ ou 0,05χ.
Equação 2. Relação de Limitação de Cisteína Fracionada
Relação de Limitação de Cisteína Fracionada = Cisteína
Fornecida no Processo
Cisteína Requerida da Equação 1 [0024] Naturalmente, as proteínas contendo cisteína da invenção incluem uma ampla variedade de componentes, incluindo, mas não limitados a anticorpos e proteínas de fusão. Estes podem ser um anticorpo anti-EDB e um anticorpo anti-HER2 incluindo trastuzumab.
[0025] Nos processos aqui descritos, o componente de capeamento predeterminado pode ser selecionado do grupo que consiste em ácido 5-tio-2-nitrobenzóico (TNB), 2-mercaptopiridína, ditiodipiridina (DTDP), ácido 4-tiobenzóico, ácido 2-tiobenzóico, ácido 4-tiobenzenossulfônico, ácido 2-tiobenzenossulfônico, sulfonate de metila (EM), p-toluenossulfonato (Ts) e trifluorometanossulfonato (Tf); e/ou o componente de capeamento predeterminado é selecionado de um grupo reativo que consiste em moléculas semelhantes a benzamida maleimido trioxa-4-formila (MTFB) com um parâmetro identificador de aldeído ou moléculas semelhantes a azido-lisina maleimidas com um parâmetro identificador de azlda, ou moléculas semelhantes a dibenzocicloctila-polietileno maleimida (DBCO-PEG4Maleimida) com um parâmetro identificador de alquina. Frequentemente, o componente de capeamento predeterminado é o TNB, e muitas vezes o precursor é o DTNB.
[0026] Da mesma forma nos processos aqui descritos, as proteínas capeadas são sujeitas a processamento adicional que consiste em um ou mais de isolamento, purificação e concentração, em um ou mais pontos diferentes no processo. Assim, em certas modalidades da invenção, pelo menos 50% das células são separadas
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10/56 das proteínas contendo cisteína expressa antes da introdução do componente de capeamento predeterminado ou seu precursor. Esta separação pode ser executada através da centrifugação ou filtração. [0027] A invenção fornece ainda modalidades para a conjugação de uma proteína contendo cisteína capeada por TNB (ou de outra forma capeada), compreendendo as etapas de: (a) reação da proteína contendo cisteína capeada com TNB com um agente redutor capaz de separar os componentes de capeamento com TNB da proteína sem reduzir significativamente as ligações de enxofre intercadeias de anticorpos; (b) filtragem da mistura de reação para remover o excesso de agente redutor, TNB capeado, ou ambos; e (c) sem a introdução de um agente oxidante, a conjugação de uma ou mais ligações de enxofre reduzidas no anticorpo com uma carga útil através de um componente de ligação reativa.
[0028] A invenção ainda fornece modalidades para a conjugação de uma proteína contendo cisteína capeada com TNB (ou de outra forma capeada), compreendendo as etapas de: (a) reação da proteína contendo cisteína capeada com TNB com excesso estequiométrico de agente redutor capaz de separar os componentes de capeamento com TNB da proteína sem reduzir significativamente as ligações de enxofre intercadeias de anticorpos, opcionalmente na presença de sais tais como cloreto de sódio ou outros sais (ver o Exemplo 8); (b) filtração da mistura de reação para remover um ou mais de agentes redutores em excesso, TNB separado; (c) introdução de um agente oxidante para reparar as ligações de enxofre intercadeias reduzidas provocadas por excesso de agente redutor; e (d) conjugação de uma ou mais ligações de enxofre reduzidas no anticorpo com uma carga útil através de um componente de ligação reativo. O excesso estequiométrico é tipicamente de cerca de 4:1 a 6:1 de agente redutor para o resíduo de cisteína capeado (por exemplo, 16:1 a 24:1 de agente redutor para um
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11/56 anticorpo com quatro cisteínas capeadas) e, de preferência, ao redor de 5:1. A etapa (c) deste processo pode ser executada em temperaturas ambientes, por exemplo, ao redor de 25 graus Celsius, a fim de encurtar os tempos de oxidação e evitar mudanças de temperatura do processo. O desempenho em temperaturas baixas, por exemplo, ao redor de 4 graus Celsius, requer tempo de oxidação mais longo, mas é menos sensível à perda de rendimento se o tempo de oxidação alvo for excedido. O processo acima descrito pode ainda compreender uma etapa de: (e) adição de cisteína em excesso após a etapa (d) para suprimir a reação do componente de ligação; e (f) separação do conector suprimido-carga útil do conjugado. A supressão da cisteína leva em conta a separação melhorada da carga útil de conector-carga útil por meio da cromatografía ou diafiltração. Além disso, no processo acima descrito, a separação pode ser executada por diafiltração ou coluna cromatográfica, tipicamente cromatografía de interação hidrofóbica (HIC). O uso de tampões contendo isopropanol para executar a purificação por HIC resulta na recuperação aumentada de conjugado purificado.
DESCRIÇÃO DAS FIGURAS [0029] Figura 1. Anticorpo mutante de cisteína completamente não capeado foi gerado por alta densidade celular de expressão de CHO estável em meio de CD CHO regular. Células CHO-K1, que estavelmente expressam mutante de cisteína trastuzumab K290CK334C ou K392C-K334C, foram semeadas em meio de CD CHO com a densidade de 3E6 células/ml ou 6E6 células/ml, e cultivadas durante 72 horas a 37 graus Celsius. Os meios Condicionados foram purificados através da coluna de ProA e coluna de exclusão de tamanho (SEC). As proteínas de anticorpos purificadas foram submetidas à análise de LC/EM, conforme descrito no Exemplo 1.
[0030] Figura 2. Condições de cultura de alta densidade celular de
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12/56 uma linhagem celular de CHO estável em meio CHO com DTNB. Células CHO-K1, que estavelmente expressam um mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C, foram semeadas em meio basal registrado com a densidade de 0,6E6 células/ml em um biorreator de batelada alimentada controlado como descrito no Exemplo 1. O Painel A mostra as condições de cultura dos meios basais, meios de alimentação ou DTNB. O Painel B mostra a densidade de células viáveis (VCD) e a viabilidade de cultura.
[0031] Figura 3. Anticorpo mutante de cisteína completamente capeado com TNB no sítio Fc K290C foi gerado por alta densidade celular de expressão de CHO estável em meio de CHO com DTNB. O meio condicionado das condições de cultura descritas na Figura 2 foi purificado através da coluna ProA/SEC e o mutante de cisteína do anticorpo trastuzumab K183C-K290C foi digerido com IDES (Painel A) e submetido à análise LC/EM, conforme descrito no Exemplo 1.
[0032] Figura 4. Anticorpo mutante de cisteína completamente capeado com TNB no sítio Fab K183C foi gerado por alta densidade celular de expressão de CHO estável em meio de CHO com DTNB. O meio condicionado das condições de cultura descritas na Figura 2 foi purificado através da coluna ProA/SEC e o mutante de cisteína de anticorpo trastuzumab K183C-K290C foi digerido com IDES e submetido à análise LC/EM conforme descrito no Exemplo 1.
[0033] Figura 5. Condições de cultura de alta densidade celular de expressão de CHO estável em processos HiPDOG e de batelada alimentada com DTNB. Células CHO-K1, expressando estavelmente um mutante de cisteína de trastuzumab K183C-K290C, foram semeadas no meio basal registrado com a densidade de 2E6 células/ml ou 0,6E6 células/ml em um biorreator controlado. O Painel A mostra condições de cultura de meios basais, meios de alimentação ou DTNB. O Painel B mostra densidade de células viáveis (VCD).
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13/56 [0034] Figura 6. Anticorpo mutante de cisteína completamente não capeado foi gerado por alta densidade celular de expressão de CHO estável em meio de CHO com DTNB. Meios condicionados a partir das condições de cultura descritas na Figura 5 foram purificados através de coluna ProA/SEC e o mutante de cisteína de anticorpo trastuzumab K183C-K290C foi digerido com IDES e submetido à análise LC/EM (Painel A). O Painel B mostra a tabela de resumo de dados de capeamento.
[0035] Figura 7. O capeamento com TNB de anticorpos K183CK290C trastuzumab mutantes de cisteína gerados. O capeamento foi determinado pela análise LC/EM, que mostra a espécie de capeamento dos resíduos de cisteína modificados. Anticorpos modificados de cisteína foram gerados em cultura de alta densidade celular utilizando meios basais e de alimentação registrados com cisteína/cistina intencionalmente esgotada. Uma alimentação de DTNB foi adicionada à cultura durante a batelada de produção. O meio condicionado da cultura foi ProA purificado Antes da análise LC/EM. A espécie primária produzida (> 95%) era o mAb completamente capeado desejado com quatro TNB; níveis baixos de espécies misturadas com menos de quatro caps de TNB estavam presentes.
[0036] Figura 8. Perfis de cisteína de condições com altas e baixas concentrações de cisteína/cistina no meio de alimentação. As concentrações foram obtidas através da análise de aminoácido executada por UPLC; as concentrações de cistina obtidas a partir da análise de UPLC foram estequiometricamente convertidas em cisteína. Ambas as condições utilizaram células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183CK290C e foram ativadas em biorreatores em escala de bancada de 1 L com meio basal e de alimentação registrado. Ambas as condições tiveram concentrações iniciais similares de cisteína/cistina no meio
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14/56 basal, com diferentes concentrações de cistina no meio de alimentação. Amostras de meios condicionados de cada condição foram analisadas começando no dia 4 para se obter um período de depleção de cisteína/cistina por toda a batelada.
[0037] Figura 9. Perfis de cisteína de condições com altas e baixas concentrações de cistina suplementares. As concentrações foram obtidas através da análise de aminoácido executada por UPLC; as concentrações de cistina obtidas a partir da análise de UPLC foram estequiometricamente convertidas em cisteína. Todas as condições utilizaram células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína anti-EDB K183C-K290C e foram ativadas em biorreatores em escala de bancada de 1 L com meio basal e de alimentação registrado. Todas as condições tiveram concentrações de partida similares de cisteína/cistina no meio basal através da condição de densidade de semente. Amostras de meios condicionados de cada condição foram analisadas iniciando no dia 0 para se obter um período de depleção de cisteína/cistina por toda a batelada.
[0038] Figura 10. Perfis de cisteína das condições com relações de limitação de cisteína fracionada alvo. As concentrações foram obtidas através da análise de aminoácido executada por UPLC; as concentrações de cistina obtidas a partir de análise de UPLC foram convertidas em cisteína. Todas as condições utilizaram células CHOK1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C e foram ativadas em biorreatores em escala de bancada de 1 L com meio basal e de alimentação registrado. As relações de limitação de cisteína fracionadas foram determinadas através do uso de Equações 1 e 2 como anteríormente descrito; todas as condições tiveram diferentes níveis de cistina em seus respectivos meios para direcionar a relação de limitação de cisteína fracionada desejada. Amostras de meios condicionadas de
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15/56 cada condição foram analisadas começando no dia 4 para se obter um período de depleção de cisteína/cistina por toda a batelada.
[0039] Figura 11. Densidade celular viável e perfis de concentração de cisteína das condições de densidade celular máxima superior e inferior. As densidades celulares máximas superiores e inferiores foram obtidas com células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183CK290C. Ambas as condições foram ativadas em biorreatores em escala de bancada de 1 L com meio basal e de alimentação registrado; embora alguns parâmetros de processo diferirem para as duas condições para atingir e manter diferentes densidades máximas, as concentrações de cisteína/cistina foram similares nos meios basais e idênticas nos meios de alimentação. O Painel A mostra a densidade de células viáveis. O Painel B mostra as concentrações de cisteína durante a batelada. As amostras de meios condicionados de cada condição foram analisadas a partir do dia 0 para obter um período de depleção de cisteína/cistina por toda a batelada. A análise de aminoácido foi executada por UPLC; as concentrações de cistina obtidas a partir da análise de UPLC foram convertidas estequiometricamente em cisteína.
[0040] Figura 12. Resultados de DAR4 bruto da adição de DTNB aos meios de condição. Células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C foram cultivadas em biorreatores de 1 L utilizando meios basais e de alimentação registrados. Depois que o cultivo no biorreator atingiu um ponto de tempo particular na duração da batelada, as células foram separadas do meio condicionado através da centrifugação e filtração de 0,2 μιτι. O meio condicionado foi transferido para um recipiente separado e dosado com DTNB 2 mM e incubado durante vários períodos de tempo. As amostras dos diferentes tempos de incubação
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16/56 foram purificadas e conjugadas com ProA utilizando o processo de base de conjugação de TNB (ver Exemplo 5), determinando a porcentagem de DAR4 em bruto que é utilizada como um marcador substituto de anticorpos completamente capeados com TNB.
[0041] Figura 13. Resultados de DAR4 bruto da adição de DTNB aos meios de condição. Células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína anti-EDB K183C-K290C foram cultivadas em biorreatores de 1 L utilizando meios basais e de alimentação registrados. Depois que o cultivo no biorreator atingiu um ponto de tempo particular na duração da batelada, as células foram separadas do meio condicionado através da centrifugação e filtração de 0,2 μιτι. O meio condicionado foi transferido para um recipiente separado e dosado com DTNB 2 mM e incubado durante vários períodos de tempo. As amostras dos diferentes tempos de incubação foram purificadas e conjugadas com ProA utilizando o processo de base de conjugação de TNB (ver Exemplo 5), determinando a porcentagem de DAR4 em bruto que é utilizada como um marcador substituto de anticorpos completamente capeados com TNB.
[0042] Figura 14. Impacto da troca de tampão pós-redução. O anticorpo trastuzumab K183C-K290C capeado com TNB foi reduzido com 6 equivalentes de TSPP (37 Ό durante 3 h) e co njugado com quantidades variáveis de mcvcPABC0101; quadrados: troca de tampão após a redução, losangos: nenhuma troca de tampão. A %DAR4 foi medida por cromatografia de interação hidrofóbica analítica.
[0043] Figura 15. Impacto da etapa de reoxidação. Traços de cromatografia de interação hidrofóbica analítica (detecção a 280 nm) após a redução com 20 equivalentes de TSPP, troca de tampão, e conjugação com 10 equivalentes de mcvcPABC0101; traço preto: nenhuma reoxidação, traço cinza: reoxidação com ácido
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17/56 desidroascórbico antes da conjugação. Espécies super-conjugadas resultam da conjugação com ligações de dissulfeto intercadeias reduzidas.
[0044] Figura 16. Comparação de conjugados brutos de anticorpo anti-EDB mutante de cisteína K183C-K290C e anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C. Conjugados foram gerados seguindo o protocolo descrito abaixo no Exemplo 9 e analisados por cromatografia de interação hidrofóbica analítica (detecção em 280 nm).
[0045] Figura 17. Purificação por cromatografia de interação hidrofóbica de um conjugado de trastuzumab mutante de cisteína. Conjugado bruto preparado após o procedimento descrito no Exemplo 9 e purificado utilizando a coluna e as condições descritas no Exemplo 14.
[0046] Figura 18. A reação de capeamento Cys por cisteína/cistina/glutationa.
[0047] Figura 19. Relação de fármaco para anticorpo de 4:1, em que quatro cargas úteis de fármaco são ligadas a uma proteína, em que R representa a carga útil.
[0048] Figura 20. O anticorpo ou conjugado sendo tratado com uma enzima que corta abaixo da dobradiça e uma segunda enzima que corta acima da dobradiça.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO [0049] Procedimentos Gerais [0050] Métodos de cultura celular [0051] Os termos cultura e cultura celular como aqui utilizados referem-se a uma população celular que é colocada em suspensão em um meio sob condições adequadas para a sobrevivência e/ou crescimento da população celular. Como ficará evidente para aqueles de habilidade prática na técnica, em algumas modalidades, estes
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18/56 termos como aqui utilizados referem-se à combinação compreendendo a população de células e o meio no qual a população é colocada em suspensão. Em algumas modalidades, as células da cultura celular compreendem células mamíferas.
[0052] A presente invenção pode ser utilizada com qualquer método de cultura celular que seja acessível ao processo desejado (por exemplo, a produção de uma proteína recombinante (por exemplo, anticorpo)). Como um exemplo não limitativo, as células podem ser cultivadas em culturas em batelada ou batelada alimentada, onde a cultura é concluída após expressão suficiente da proteína recombinante (por exemplo, anticorpo), após o que a proteína expressa (por exemplo, anticorpo) é colhida. Alternativamente, como outro exemplo não limitativo, as células podem ser cultivadas por realimentação em batelada, onde a cultura não é concluída, e novos nutrientes e outros componentes são periódica ou continuamente adicionados à cultura, durante o qual a proteína recombinante expressa (por exemplo, anticorpo) é colhida periódica ou continuamente. Outros métodos apropriados (por exemplo, culturas de tubo giratório) são conhecidos na técnica e podem ser utilizados para a prática da presente invenção.
[0053] Em algumas modalidades, uma cultura celular adequada para a presente invenção é uma cultura em batelada alimentada. O termo cultura em batelada alimentada conforme aqui utilizado, referese a um método de cultivo de células nas quais os componentes adicionais são fornecidos à cultura em um momento ou momentos subsequentes ao início do processo de cultura. Tais componentes fornecidos tipicamente compreendem componentes nutricionais para as células que foram esgotadas durante o processo de cultura. A cultura em batelada alimentada é tipicamente interrompida em algum ponto e as células e/ou componentes no meio são colhidos e
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19/56 opcionalmente purificados. Em algumas modalidades, a cultura em batelada alimentada compreende um meio de base suplementado com meios de alimentação. Em algumas modalidades o lactato é mantido em níveis baixos utilizando a liberação controlada por pH de alta extremidade de glicose (processo HiPDOG) apresentada em Gagnon et al.
[0054] Em algumas modalidades, uma cultura celular adequada para a presente invenção é um processo de perfusão. O termo perfusão, conforme aqui utilizado, refere-se a um método de cultivo de células em que as células recebem meio de base de inoculação, e no momento em que as células atingem uma densidade desejada de células, a perfusão celular é iniciada de tal modo que o meio gasto é substituído por meio fresco. O processo de perfusão permite que a cultura alcance alta densidade celular, e assim permite a produção de uma grande quantidade de produto. No entanto, pelo menos algumas formas do processo de perfusão requerem o fornecimento de uma grande quantidade de meio e resultam em algumas partes do produto que estão contidas em um grande volume de meio gasto, ao invés de serem concentradas em uma única colheita.
[0055] O termo biorreator como aqui utilizado refere-se a qualquer recipiente utilizado para o crescimento de uma cultura celular procariótica ou eucariótica (por exemplo, uma cultura de células de mamífero). O biorreator pode ter qualquer tamanho, contanto que seja útil para o cultivo de células (por exemplo, células de mamífero). As células podem ser cultivadas em qualquer volume conveniente selecionado pelo profissional. Por exemplo, as células podem ser cultivadas em recipientes de reação de pequena escala, variando em volume a partir de alguns mililitros até vários litros. Alternativamente, as células podem ser cultivadas em biorreatores comerciais de grande escala variando em volume de aproximadamente pelo menos 1 litro a
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10, 50, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000, 12000, 15000, 20000 ou 25000 litros ou mais, ou qualquer volume entre estes.
[0056] Em algumas modalidades, as células podem ser cultivadas durante a fase de crescimento inicial (ou fase de crescimento) por uma quantidade maior ou menor de tempo, dependendo das necessidades do profissional e da necessidade das próprias células. Em algumas modalidades, as células são cultivadas durante um período de tempo suficiente para a obtenção de uma densidade celular pré-definida. Em algumas modalidades, as células são cultivadas durante um período de tempo suficiente para alcançar uma densidade celular que é uma dada porcentagem da densidade celular máxima que as células eventualmente alcançariam se deixados crescer sem perturbação. Por exemplo, as células podem ser cultivadas durante um período de tempo suficiente para se obter uma densidade desejada de células viáveis de 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 ou 99 por cento da densidade celular máxima. Em algumas modalidades, as células são cultivadas até que a densidade celular não aumente em mais do que 15%, 14%, 13%, 12%, 11%, 10%, 9%, 8%, 7%, 6%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% por dia de cultivo. Em algumas modalidades, as células são cultivadas até que a densidade celular não aumente em mais de 5% por dia de cultivo.
[0057] Em algumas modalidades, as células são deixadas crescer durante um período de tempo definido. Por exemplo, dependendo da concentração inicial da cultura celular, da temperatura na qual as células são cultivadas e da taxa de crescimento intrínseca das células, as células podem ser cultivadas durante 0, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,
11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias, preferivelmente durante 4 a 10 dias. Em alguns casos, as células podem ser deixadas crescer durante um mês ou mais. O profissional da presente invenção será capaz de escolher a duração da fase de crescimento inicial,
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21/56 dependendo das necessidades de produção de proteína e das necessidades das próprias células.
[0058] Em algumas modalidades, as células podem ser mantidas na fase de produção subsequente até que uma densidade celular desejada ou título de produção seja alcançado. Em outra modalidade da presente invenção, permite-se que as células são deixadas crescer por um período de tempo definido durante a fase de produção subsequente. Por exemplo, dependendo da concentração da cultura celular no início da fase de crescimento subsequente, da temperatura na qual as células são cultivadas e da taxa de crescimento intrínseca das células, as células podem ser cultivadas durante 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais dias. Em alguns casos, as células podem ser deixadas crescer durante um mês ou mais. O profissional da presente invenção será capaz de escolher a duração da fase de produção subsequente, dependendo das necessidades de produção de polipeptídeo ou proteína e das necessidades das próprias células.
[0059] Em algumas modalidades, as células expressam uma proteína recombinante e o método de cultura celular da invenção compreende uma fase de crescimento e uma fase de produção.
Células [0060] Qualquer célula suscetível à cultura celular pode ser utilizada de acordo com a presente invenção. Em algumas modalidades, a célula é uma célula de mamífero. Exemplos não limitativos de células de mamífero que podem ser utilizadas de acordo com a presente invenção incluem a linhagem de mieloma de camundongo BALB/c (NSO/I, ECACC No: 85110503); retinoblastos humanos (PER.C6, CruCell, Leiden, The Netherlands); linhagem CV1 de rim de macaco transformada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linhagem de rim embriônico humano (293 ou células 293 subclonadas
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22/56 para crescimento em cultura de suspensão, Graham et al., J. Gen Virol., 36:59,1977); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário de hamster chinês +/- DHFR (CHO, Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216, 1980); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod., 23:243-251, 1980); células de rim de macaco (CV1 ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano (VERO-76, ATCC CRL-1 587); células de carcinoma cervical humane (HeLa, ATCC CCL 2); células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A, ATCC CRL 1442); células pulmonares humanas (W138, ATCC CCL 75); células hepáticas humanas (Hep G2, HB 8065); tumor mamário de camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51); células TRI (Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68, 1982); células MRC 5; células FS4; e uma linhagem de hepatoma humano (Hep G2). Em algumas modalidades preferidas, as células são células de CHO. Em algumas modalidades preferidas, as células empregam o sistema de expressão de gene de glutamina sintetase (GS).
[0061] Adicionalmente, qualquer número de linhagens celulares de hibridoma comercialmente e não comercialmente disponíveis pode ser utilizado de acordo com a presente invenção. O termo hibridoma conforme aqui utilizado, refere-se a uma célula ou progênie de uma célula que resulta da fusão de uma célula imortalizada e de uma célula produtora de anticorpos. Um tal hibridoma resultante é uma célula imortalizada que produz anticorpos. Células individuais utilizadas para criar o hibridoma podem ser de qualquer fonte de mamífero, incluindo, mas não limitado a estes, rato, porco, coelho, ovelha, porco, cabra e ser humano. Em algumas modalidades, um hibridoma é uma linhagem celular de trioma, que resulta quando a progênie de fusões de mieloma heteroíbrida, que são o produto de uma fusão entre células humanas e uma linhagem celular de mieloma de murino, são subsequentemente
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23/56 fundidas com uma célula plasmática. Em algumas modalidades, um hibridoma é qualquer linhagem celular híbrida imortalizada que produz anticorpos tais como, por exemplo, quadromas (Ver, por exemplo, Milstein et al., Nature, 537:3053, 1983). Uma pessoa versada na técnica irá observar que as linhagens celulares de hibridoma podem ter diferentes requisitos de nutrição e/ou podem requerer diferentes condições de cultura para o crescimento ideal, e será capaz de modificar as condições conforme necessário.
Crescimento celular e produtividade [0062] A densidade celular elevada como utilizada nesta invenção, refere-se à densidade celular acima de 1E6 células/ml, 5E6 células/ml, 10E6 células/ml, 50E6 células/ml, 100E6 células/ml ou 500E6 células/ml, preferivelmente acima de 10E6 células/ml, mais preferivelmente acima de 50E6 células/ml.
[0063] Em algumas modalidades, o crescimento celular é determinado pela densidade de células viáveis (VCD), densidade máxima de células viáveis ou contagem de células viáveis integradas (IVCC). Em algumas modalidades, o crescimento celular é determinado pela densidade máxima de células viáveis.
[0064] O termo densidade de células viáveis conforme aqui utilizado, refere-se ao número de células presentes em um dado volume de meio. A densidade de células viáveis pode ser medida por qualquer método conhecido pela pessoa versada. Por exemplo, a densidade de células viáveis é medida utilizando um contador de células automatizado tal como Bioprofile Flex® (Nova Biomedical, Waltham, MA). O termo densidade máxima de célula conforme aqui usado, refere-se à densidade máxima de célula obtida durante a cultura celular. O termo viabilidade celular, conforme aqui utilizado, refere-se à capacidade de células em cultura de sobreviver sob um dado conjunto de condições de cultura ou variações experimentais.
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Aqueles de habilidade prática na técnica irão observar que um dos muitos métodos para determinar a viabilidade celular é incluído nesta invenção. Por exemplo, pode-se utilizar um corante (por exemplo, azul de tripano) que não passa através da membrana de uma célula viva, mas pode passar através da membrana rompida de uma célula morta ou morrendo a fim de determinar a viabilidade celular.
[0065] O termo contagem de células viáveis integradas (IVCC) conforme aqui utilizado, refere-se a uma área sob a curva de densidade de células viáveis (VCD). A IVCC pode ser calculada utilizando a seguinte fórmula:
IVCCt+1=IVCCt4-(VCDt4-VCDt+1)*(AQ/2 onde At é a diferença de tempo entre pontos de tempo t e t + 1. A IVCCXo pode ser considerada desprezível. VCDt e VCDí+i são densidades de células viáveis em pontos de tempo t e t + 1.
[0066] Em algumas modalidades dos métodos acima descritos, a produtividade é determinada por título e/ou produtividade volumétrica.
[0067] O termo título como aqui utilizado refere-se, por exemplo, à quantidade total de proteína expressa produzida de modo recombinante por uma cultura celular em uma dada quantidade de volume de melo. O título é expresso tipicamente em unidades de gramas de proteína por litro de meio.
[0068] Em algumas modalidades dos métodos acima descritos, a produtividade é determinada por título. Em algumas modalidades, a produtividade é aumentada em pelo menos 5%, 10%, 15%, 20% ou 25% em comparação com a cultura de controle. Em algumas modalidades, a produtividade é aumentada em pelo menos 10% em comparação com uma cultura de controle. Em algumas modalidades, a produtividade é aumentada em pelo menos 20% em comparação com uma cultura de controle.
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Meio de Cultura Celular [0069] Os termos meio, meio de cultura celular e meio de cultura como aqui utilizados referem-se a uma solução contendo componentes ou nutrientes que alimentam células de mamífero em crescimento. Tipicamente, os nutrientes incluem aminoácidos essenciais e não essenciais, vitaminas, fontes de energia, lipídeos e microelementos requeridos pela célula para crescimento e/ou sobrevivência mínimo. Uma tal solução também pode conter outros nutrientes ou componentes suplementares que intensificam o crescimento e/ou a sobrevivência acima da taxa mínima, incluindo, mas não limitado a hormônios e/ou outros fatores de crescimento, íons particulares (tais como sódio, cloreto, cálcio, magnésio e fosfato), tampões, vitaminas, nucleosídeos ou nucleotídeos, microelementos (compostos inorgânicos geralmente presentes em concentrações finais muito baixas), compostos inorgânicos presentes em altas concentrações finais (por exemplo, ferro), aminoácidos, lípídios e/ou glicose ou outra fonte de energia. Em algumas modalidades, um meio é vantajosamente formulado em um pH e concentração de sal ideais para a sobrevivência e proliferação celular. Em algumas modalidades, um meio é um meio de alimentação que é adicionado após o início da cultura celular.
Métodos para medir a concentração de aminoácido [0070] A concentração de aminoácido pode ser medida por qualquer método conhecido pela pessoa versada. Métodos preferidos para medir a concentração de aminoácidos em métodos on-line ou offline incluem, por exemplo, a cromatografia em fase líquida tal como HPLC, UPLC ou LCMS, RMN ou GCMS.
[0071] Em algumas modalidades, a concentração de aminoácido é medida desconectada tomando uma amostra do meio de cultura celular e medindo a concentração de dito pelo menos um aminoácido
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26/56 na dita amostra. Em algumas modalidades, a concentração de aminoácido é medida como divulgado nos exemplos 3.1, 3.2, e 3.3.
Um método preferido para medir a concentração de aminoácidos em um método desconectado é a UPLC.
[0072] Em algumas modalidades, a concentração de aminoácido é medida desconectada. Em algumas modalidades, a concentração de aminoácido é medida conectada utilizando a espectroscopia de Raman. Em algumas modalidades, a concentração de aminoácido é medida conectada utilizando a espectroscopia de Raman. Em algumas modalidades, a concentração de aminoácido é medida conectada utilizando uma tecnologia baseada em HPLC ou UPLC com um autocoletor de amostras que puxa a amostra do reator e transfere para o equipamento de uma maneira programada.
[0073] Os procedimentos adicionais conforme descritos na WO2015/140708 também podem ser empregados na presente invenção, e são aqui incorporados por referência.
Métodos para medir a relação de fármaco para anticorpo [0074] A relação de fármaco para anticorpo (DAR) pode ser medida por qualquer método conhecido pela pessoa versada. Os métodos preferidos para medir a DAR incluem, por exemplo, cromatografia em fase líquida tal como HPLC, UPLC ou LCMS, espectrometria de massa e RMN.
[0075] Em algumas modalidades, a DAR é medida por tomar uma amostra da mistura de conjugação, fração de cromatografia, ou outro material purificado e medir a concentração de dita amostra. Os métodos conhecidos para medir a DAR são cromatografia de interação hídrofóbica (HIC HPLC) e HPLC de fase reversa.
Definições Adicionais [0076] Adicional às definições fornecidas acima, as seguintes definições adicionais são fornecidas:
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27/56 [0077] CHO é aqui descrito como células de ovário de hamster chinês (CHO) que são derivadas do ovário do hamster chinês utilizado para a produção de proteínas terapêuticas, conforme divulgado nos exemplos fornecidos. O CHO-K1 é descrito nesta invenção como a linhagem celular hospedeira ancestral subclonada da linhagem celular de CHO de origem que compreende um sistema de expressão de glutamina sintase (GS) comercialmente disponível da Lonza.
[0078] HiPDOG conforme aqui utilizado refere-se à liberação controlada por pH de alta extremidade de glicose (HiPDOG), é um método de alimentação de nutriente que libera uma solução concentrada de glicose acionada pelo aumento do pH para suprimir o acúmulo de lactato na cultura celular.
[0079] O Termo mAb como aqui utilizado refere-se a anticorpos monoclonais.
[0080] O Termo DAR4 conforme aqui utilizado refere-se à relação de fármaco para anticorpo de 4:1, em que quatro cargas úteis de fármaco são ligadas a uma proteína (por exemplo, vide Figura 19 que representa um tal caso onde R representa a carga útil). O termo DAR4 bruta descreve a relação de fármaco para anticorpo após o processo de conjugação, mas antes da etapa de purificação final.
[0081] O Termo UF/DF conforme utilizado nesta invenção, referese à ultrafiltração/diafiltração.
Exemplos [0082] Os seguintes Exemplos ilustram as características importantes da invenção.
Exemplo 1: Geração de anticorpos mutantes de cisteína completamente não capeados por alta densidade celular de expressão de CHO estável em meio de CD CHO regular [0083] Células de CHO-K1 que estavelmente expressa o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K290C-K334C ou K392C-K334C,
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28/56 foram semeadas em meio CD CHO regular (Thermo Fisher, Waltham, MA) com a densidade de 3E6 células/ml ou 6E6 células/ml, foram cultivadas e mantidas em uma incubadora umidificada com CO2 a 5% a 37 graus Celsius. Em uma condição, cisteína 5 mM foi adicionada ao meio CD CHO. As células foram cultivadas durante 72 horas a 37 graus Celsius. A viabilidade celular foi medida e os meios condicionados foram colhidos. As células eram mais do que 98% viáveis.
[0084] A proteína de anticorpo foi purificada através de ProA e colunas de exclusão de tamanho como se segue. Os meios condicionados foram filtrados com filtros de 0,2 pm e passados através da resina de Proteína A (GE Healthcare, Piscataway, NJ) préequilibrada com Tris 50 mM, NaCI 150 mM, pH 7,5 (TBS). A coluna foi lavada com 2 volumes de coluna (CV) de TBS, 5CVs de CaCb, pH 7,5, 3CVs de Tris 10 mM, NaCI 10 mM, pH 7,5, antes da proteína ter sido eluída utilizando a etapa de 100% de Glicina 150 mM, NaCI 40 mM, pH 3,5. A proteína foi ajustada para 0 pH 7,0 utilizando HEPES 2M, pH 8,0, e a proteína foi carregada em uma coluna Superdex 200 equilibrada com PBS (NaCI 137 mM, KCI 2,7 mM, Na2HPO4, KH2PO4 2,7 mM, pH 7,2). As frações máximas foram reunidas concentradas em 10 mg/ml utilizando um dispositivo de centrífuga 50 kDa MWCO.
[0085] As amostras de proteína foram analisadas por espectrometria de massa para a medição da condição de capeamento Cys como se segue. A análise de espectrometria de massa por cromatografía em forma líquida (LC/EM) foi executada utilizando um espectrômetro de massa Waaters Xevo Q-TOF G2 (Waters, Miliford, MA) acoplado a uma HPLC capilar Agilent 1200 (Santa Clara, CA). As amostras de proteína foram tratadas com IdeS protease (Promega, Madison, Wl) na temperatura ambiente durante 2 horas. As amostras de proteína foram acidificadas através da diluição de 1:1 com 0,05%
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TFA (Sigma-Aldrich, St Louis, MO), seguido por análise de espectrometria de massa por cromatografia em fase líquida. As amostras foram separadas por uma coluna Waters BEH300 04, 1,7 pm (1,0 x 50 mm) mantida a 80 € com uma taxa de fluxo de 65 μΙ/min. A fase móvel A ter era água com 0,05% TFA, e a fase móvel B era acetonitrila com 0,05% TFA. As proteínas foram eluídas da coluna utilizando um gradiente: 2% a 20% B em 0,5 min, 20% a 40% B em 6 min e 40% a 100% B em 4 min. O espectrômetro de massa operou apenas no modo EM positivo que explora de 800 a 3500 m/z e os dados foram adquiridos com o software MassLynx (Waters) 4.1. O sinal TOF-EM que correspondem ao anticorpo foi resumido e desenrolado utilizando o programa MaxEntl (Waters). As espécies capeadas de cisteína e glutationa foram determinadas por deslocamento de massa (Cys: 119,004 Da, GSH: 305,068 Da).
[0086] Conforme mostrado na Figura 1, para o meio CD CHO, o anticorpo mutante de cisteína foi completamente submetido a cisteína quando a cisteína 5 mM foi adicionada ao meio. No meio CD CHO regular, as células de CHO produziram proteína mutante de cisteína não capeada substancial na densidade celular de 3E6 células/ml. Quando as células de CHO foram aumentadas para 6E6 células/ml, o anticorpo mutante de cisteína completamente não capeado foi gerado, sugerindo que a maior parte da cistina no meio foi utilizada para o crescimento celular. O aumento da densidade celular pode esgotar o meio de cistina e consequentemente afetar a condição de capeamento das cisteínas de superfície não correlacionadas.
Exemplo 2: Geração de anticorpos mutantes de cisteína completamente capeados com TNB através da alta densidade celular de CHO estável em meio de CHO regular [0087] Como mostrado no Exemplo 1, o crescimento celular em alta densidade pode consumir quantidades significativas de cisteína ou
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30/56 de cistina no meio. O anticorpo mutante de cisteína completamente não capeado foi consequentemente gerado. A formação no Exemplo 1 permitiu a geração de anticorpos mutantes de cisteína completamente capeados com TNB em grande quantidade através da adição de várias concentrações de DTNB na cultura celular em diferentes momentos. O DTNB eficientemente alquilou os tióis livres em anticorpos mutantes não capeados, o que resulta na geração de anticorpos capeados com TNB.
[0088] Assim, as linhagens celulares de CHO que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183CK290C foram semeadas em um biorreator controlado (Applikon, Inc., Schiedam, Netherlands) com um volume de trabalho inicial de 1 L. Como mostrado, oito condições foram operadas avaliando diferentes concentrações de cisteína e/ou de cistina no meio basal, como mostrado na Figura 2A. O processo de cultura em batelada alimentada foi semeado em 0,6E6 células/ml e controlado com alimentações de nutrientes de porcentagem fixa com base no volume de cultura e foi administrado a partir do dia 3; condições que produzem anticorpos capeados com TNB utilizaram meio de alimentação que estava livre tanto da cisteína quanto da cistina. No dia 7, DTNB 1 mM foi adicionado à cultura e a cultura celular continuou durante mais cinco dias.
[0089] Conforme mostrado na Figura 2B, a duplicação e a viabilidade de células foram normais sob todas as condições testadas.
[0090] Quando as proteínas de anticorpo foram purificadas, elas foram submetidas à análise de capeamento Cys. Conforme mostrado na Figura 3A, o anticorpo foi digerido por Ides protease para gerar fragmento Fc e Fragmento Fab2. A mistura foi analisada por LC/EM conforme descrito no Exemplo 1 acima. Como mostrado na Figura 3B, para o sítio K20C localizado por Fc exposto com menos solvente,
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31/56 todas as condições adicionadas com TNB (Operações 2-8) produziram >95% de materiais capeados com TNB. Conforme mostrado na Figura 4, para o sítio Fab K183C localizado por cadeia leve mais exposto a solvente, as condições adicionadas com TNB (Operações 5-8) também geraram predominantemente materiais capeados com TNB. [0091] Para melhorar ainda mais a eficiência de capeamento com TNB, as condições de cultura com densidade celular mais elevada foram testadas. Um processo HiPDOG controlado por glicose para melhor controle de lactato foi utilizado (Gagnon et al., Biotechnol Bioeng 2011). As condições experimentais com densidades de semente e concentrações de meio de cisteína/cistina são mostradas na Figura 5A. O processo HiPDOG controlado por lactato (Operação 3) gerou uma densidade celular máxima significativamente mais elevada do que a condição em batelada alimentada correspondente (Operação 7) (Figura 5B).
[0092] O anticorpo foi purificado a partir do meio condicionado e submetido à análise de capeamento Cys por LC/EM. Como mostrado na Figura 6, o sítio Fab K183C atingiu mais de 95% de capeamento com TNB para a condição Operações 3-7, enquanto que o sítio Fc K290C atingiu ao redor de 98% de capeamento com TNB para a condição Operações 3-7.
Exemplo 3. Geração de anticorpos mutantes de cisteína completamente capeados com TNB em processos que direcionam uma exposição limitada de cisteína/cistina [0093] Nos exemplos abaixo, leituras de eficiência de capeamento para os anticorpos mutantes de cisteína são representadas por porcentagens de DAR4 bruta (relação de fármaco para anticorpo) que são obtidas após a conjugação de conector-carga útil ao anticorpo antes da purificação final. Valores de DAR4 bruta estão sendo utilizados nesses exemplos como um marcador substituto para a
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32/56 eficiência de capeamento; entretanto, a determinação da condição de capeamento de cada resíduo de cisteína submetido à mutação no anticorpo pode ser determinada por uma análise de LC/EM mais prolongada (descrita no Exemplo 1) antes do processo de conjugação. Um exemplo da análise de LC/EM pode ser encontrado na Figura 7, em que as diferentes espécies de capeamento por anticorpo são identificadas e quantificadas. A amostra utilizada para esta análise foi um processo de cisteína/cistina baixo com uma alimentação de DTNB para produzir anticorpo capeado com TNB. A espécie alvo desejada é quatro TNB por anticorpo, que é responsável por >95% nos resultados de LC/EM deste exemplo específico com baixos níveis de capeamentos não redutíveis e algumas espécies de anticorpo sub-4.
Exemplo 3.1: Deliberadamente limitar cisteína/cistina na cultura através da diminuição da concentração formulada no meio de alimentação [0094] Abordagem 1: Este exemplo demonstra intencionalmente a limitação das concentrações de cisteína e/ou de cistina na cultura, através da diminuição da quantidade de cada componente formulado no meio de alimentação suplementar. As duas condições utilizadas neste exemplo tiveram concentrações de partida similares de cisteína e/ou cistina no meio basal; no entanto, uma condição não teve nenhum componente de cisteína ou cistina no meio de alimentação de nutriente enquanto que a segunda condição utilizou meio de alimentação que continha apenas cistina (Tabela 1); todos os outros parâmetros do processo foram idênticos para as duas condições. Processos de cultura celular de mamífero padrão incorporam cisteína e/ou cistina em alimentações suplementares adicionais devido aos estímulos de solubilidade destes componentes no meio de cultura celular.
[0095] Para este exemplo, células CHO-K1 que estavelmente
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33/56 expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183CK290C foram utilizadas com meios basais e de alimentação registrados em biorreatores de 1 L Applikon (Applikon, Inc., Schiedam, Netherlands), que operam com controladores modulares BioNet (Broadley-James Corp., Irvine, CA) com bomba peristáltica e módulos controladores de fluxo de massa gasosa. A cultura foi semeada em aproximadamente 2E6 células/ml, a temperatura foi mantida em torno de 37 graus Celsius, enquanto que o pH foi controlado próximo a 7,0 mediante a adição de uma solução de carbonato de sódio/potássio ou CO2. Os níveis de oxigênio dissolvido foram controlados >20% de saturação de ar através da pulverização de oxigênio puro. Para 0 capeamento com TBN dos anticorpos, uma alimentação de DTNB foi iniciada após a fase de crescimento atingir uma faixa de concentração de DTNB de 4 mM no biorreator. A duração da batelada para os exemplos fornecidos abaixo foi de aproximadamente 12 dias.
[0096] Os valores de DAR4 bruta normalizados demonstram que a remoção de cistina do meio de alimentação provou ser um método bem-sucedido no esgotamento da cisteína/cistina disponível na cultura, que por sua vez levou em conta um melhor capeamento do anticorpo com TNB e uma porcentagem mais elevada de conjugados de anticorpo-fármaco de DAR4, sem efeitos prejudiciais sobre 0 crescimento ou produtividade da célula.
Tabela 1. Abordagem 1 - Concentrações de Cisteína e Cistina no Meio e DAR4 Bruta Normalizada com Trastuzumab K183C-K290C
Operação Descrição Meio Basal Meio Alimentai Nutriente de ?ão de s VCD Máxima (E6 células/ml) DAR4 Bruta (%)
Cisteína (mM) Cistina (mM) Cisteína (mM) Cistina (mM)
1 Controle 0,4 1,50 0 4,7 47,3 1x
2 Sem cisteína/cistina na alimentação 0,4 1,57 0 0 40,4 1,24x
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34/56 [0097] A UPLC por acuidade (Waters Corp, Miliford, MA) foi utilizada para a análise de aminoácido das condições a partir de um experimento de acompanhamento em que a condição de controle foi dosada com cistina 0,5 mM nos dias 7, 9 e 11 para evitar a limitação de cistina em qualquer ponto na batelada por projeto de meio racional conforme descrito anteriormente (Tabela 2); a concentração alvo de DTNB utilizada foi de 5 mM para capeamento de TNB. Todos os outros parâmetros de processo foram idênticos ao experimento anteriormente descrito na Tabela 1.
Tabela 2. Abordagem 1 - Concentrações de Meio de Cisteína e
Cistina e Tempo de Depleção com Trastuzumab K183C-K290C
Operação Descrição Meio Basal Meio de Alimentação de Nutrientes Adições de Cistina (mM) Depleção de Cisteína/Ci stina (<0,5 mM)
Cisteína (mM) Cistina (mM) Cisteína (mM) Cistina (mM)
3 Controle 0,4 1,50 0 4,7 0,5 mM nos dias 7, 9,11 n/a
4 Sem cisteína/cistin a na alimentação 0,4 1,57 0 0 n/a Dia 6
[0098] Os resultados claramente ilustram que a remoção da cisteína/cistina do meio de alimentação resulta em concentrações de cisteína/cistina esgotadas na cultura entre os dias 6 a 7 para este exemplo específico; as concentrações de cistina obtidas a partir de análise de UPLC foram estequiometricamente convertidas em cisteína e graficamente mostradas na Figura 8.
[0099] Fica entendido que a duração da batelada deste exemplo particular foi somente através do dia 5, a cisteína/cistina em excesso
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35/56 estaria disponível na cultura da Operação 4 levando ao capeamento com TNP sub-ideal do anticorpo. Neste exemplo, estendendo a duração da batelada até o dia 8 ou mais tarde foi um método eficaz para esgotar o excesso de cisteína/cistina que leva ao ambiente apropriado para o capeamento com TNB ideal.
[00100] Adicionalmente, fica entendido que uma estratégia de troca de meios, tal como perfusão, pode ser implementada a fim de esgotar a cisteína/cistina da cultura de Operação 4 posteriormente no processo. Meios de alimentação com níveis mais elevados de cisteína/cistina poderiam ter sido utilizados durante a fase de crescimento da batelada e depois que a densidade de células viáveis máxima fosse alcançada, uma troca de meios podería ter ocorrido com meios contendo baixos níveis de cisteína/cistina, a fim de imitar um perfil muito semelhante de depleção de cisteína/cisteína, comparável à Figura 8.
[00101] Abordagem 2: Este exemplo demonstra a mesma estratégia apresentada na Abordagem 1, de intencionalmente limitar as concentrações de cisteína e/ou de cistina na cultura através da diminuição da quantidade de cada componente formulado no meio de alimentação suplementar, mas com uma segunda linhagem celular produtora de anticorpos. As condições utilizadas neste exemplo foram agrupadas em condições elevadas ou baixas de sementes e tiveram concentrações de partida similares de cisteína e/ou cistina no meio basal. Uma condição de alta ou baixa densidade de semente não teve nenhuma suplementação de cisteína ou cistina com exceção das concentrações de partida no meio basal, enquanto que as condições remanescentes tiveram uma alimentação de cistina suplementar separada (Tabela 3); todas as condições tiveram uma alimentação de nutrientes sem cisteína ou cistina. Todos os outros parâmetros do processo foram idênticos para as duas condições de acordo com sua
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36/56 condição de semente (por exemplo, condições de densidade de sementes mais elevadas requeridas para uma taxa de alimentação de nutrientes suplementar mais elevada).
[00102] Para este exemplo, células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína para anti-EDB K183CK290C foram utilizadas com meios basais e de alimentação registrados em biorreatores de 1 L Applikon (Applikon, Inc., Schiedam, Netherlands), que operam com controladores modulares BioNet (Broadley-James Corp., Irvine, CA) com bomba peristáltica e módulos controladores de fluxo de massa gasosa. A cultura foi semeada em aproximadamente 0,6E6 células/ml ou 3E6 células/ml, a temperatura foi mantida em torno de 37 graus Celsius enquanto que o pH foi controlado próximo a 7,0 mediante a adição de uma solução de carbonato de sódio/potássio ou CO2. Os níveis de oxigênio dissolvido foram controlados >20% de saturação de ar através da pulverização de oxigênio puro. Para 0 capeamento com TBN dos anticorpos, uma alimentação de DTNB foi iniciada após a fase de crescimento atingir uma faixa de concentração de DTNB de 4 mM no biorreator. A duração da batelada para os exemplos fornecidos abaixo foi de aproximadamente 12 dias.
[00103] A avaliação de uma segunda linhagem celular demonstra que a remoção de cisteína e/ou de cistina de quaisquer alimentações suplementares é uma estratégia robusta no esgotamento da cisteína/cistina disponível na cultura, que então leva em conta melhor capeamento do anticorpo com TNB. A estratégia no final conduz a uma porcentagem mais elevada de conjugados de anticorpo-fármaco de DAR4 bruta sem efeitos prejudiciais sobre 0 crescimento ou produtividade das células (Tabela 3).
Tabela 3. Abordagem 2 - Concentrações do Meio de Cisteína e Cistina e DAR4 Bruta Normalizada com anti-EDB K183C-K290C
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Operação Descrição Semente Elevada/Baixa Meio Basal Alimentação de Cistina Suplementar (Dia 4 início) VCD Máxima (E6 células/ml) DAR4 Bruta (%)
Cisteína (mM) Cistina (mM)
1 Nenhuma alimentação de cístina Elevada 0,4 1,5 n/a 24,8 1,2x
2 + alimentação de cístina Elevada 0,4 1,5 0,25 mM/dia 26,2 1x
3 Nenhuma alimentação de cístina Baixa 0,4 1,1 n/a 16,4 1,2x
4 + alimentação de cístina Baixa 0,4 1,1 0,25 mM/dia 13,9 1x
5 ++ alimentação de cístina Baixa 0,4 1,1 0,50 mM/dia 14,9 0,9x
[00104] A UPLC por acuidade (Waters Corp, Miliford, MA) foi utilizada para a análise de aminoácido das condições de Abordagem 2 (Tabela 4). Todas as concentrações de cístina obtidas da análise de UPLC foram convertidas em cisteína e mostradas na Figura 9. Os resultados ilustram claramente que a remoção da suplementação de cisteína/cistina resulta em concentrações esgotadas na cultura tão mais cedo quanto o dia 7 (Figura 9), levando ao ambiente apropriado para capeamento com TNB ideal, conforme indicado pelos valores de DAR4 bruta.
Tabela 4. Abordagem 2 - Concentrações de Meio de Cisteína e Cístina e Time de Depleção com anti-EDB K183C-K290C
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Operação Descrição Semente Elevada/Baixa Meio Basal Alimentação de Cistina Suplementar (Dia 4 de início) Depleção de Cisteína/Cistina (<0,5 mM)
Cisteína (mM) Cistina (mM)
1 Nenhuma alimentação de cistina Elevada 0,4 1,5 n/a Day 7
2 + alimentação de cistina Elevada 0,4 1,5 0,25 mM/dia n/a
3 Nenhuma alimentação de cistina Baixa 0,4 1,1 n/a Dia 81
4 + alimentação de cistina Baixa 0,4 1,1 0,25 mM/dia n/a
5 alimentação de cistina Baixa 0,4 1,1 0,50 mM/dia n/a
1 Valor do Dia 7 foi de 0,54 mM; depleção assumida abaixo de 0,5 mM pelo Dia 8 com base no desempenho de crescimento e produtividade da cultura
Exemplo 3.2: Limitar cisteína/cistina na cultura utilizando uma abordagem estequiométrica e relações de limitação de cisteína fracionada direcionada [00105] Utilizando o projeto de meio racional e abordagens estequiométricas como descrito anteriormente, a quantidade necessária de cisteína/cistina necessária para uma densidade celular máxima particular e quantidade de produto produzido pode ser calculada e utilizada para projetar o meio ideal para esse processo específico (Equação 1). Neste exemplo, a quantidade necessária de cisteína/cistina foi calculada com base no projeto de meio racional utilizando a densidade de células viáveis máxima estimada e título de colheita do processo. Uma faixa de diferentes relações de limitação de
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39/56 cisteína fracionada abaixo da quantidade requerida calculada de cisteína/cistina (por exemplo, em comparação com as relações ensinadas na US 8.232.075 B) foi avaliada para encontrar uma relação alvo ideal que irá limitar ou esgotar a cisteína/cistina de modo a promover o capeamento com TNB do anticorpo enquanto ainda alcança densidades de células viáveis máximas e títulos de colheita aceitáveis (ver a Equação 2).
[00106] Todas as concentrações de cisteína/cistina requeridas foram calculadas com base na relação de limitação de cisteína fracionada alvo e foram adicionadas somente ao meio basal.
[00107] Células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C foram utilizadas com meios basais e de alimentação registrados em biorreatores de 1 L Applikon (Applikon, Inc., Schiedam, Netherlands), que operam com controladores modulares BioNet (Broadley-James Corp., Irvine, CA) com bomba peristáltica e módulos controladores de fluxo de massa gasosa. A cultura foi semeada em aproximadamente 2E6 células/ml, a temperatura foi mantida em torno de 37 graus Celsius, enquanto que o pH foi controlado próximo a 7,0 mediante a adição de uma solução de carbonato de sódio/potássio ou CO2. Os níveis de oxigênio dissolvido foram controlados >20% de saturação de ar através da pulverização de oxigênio puro. Para 0 capeamento com TBN dos anticorpos, uma alimentação de DTNB foi iniciada após a fase de crescimento atingir uma faixa de concentração de DTNB de 4 mM no biorreator. A duração da batelada para os exemplos fornecidos abaixo foi de aproximadamente 12 dias. Com exceção das concentrações de cisteína/cistina nos meios basais, todos os parâmetros do processo foram idênticos para todas as condições avaliadas.
[00108] A Tabela 5 mostra claramente que à medida que a relação de limitação de cisteína fracionada aumenta, a porcentagem de DAR4
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40/56 bruta (θ, portanto, o capeamento do anticorpo) diminui; isto indica que uma relação de limitação de cisteína fracionada mais baixa é a mais ideal para o capeamento do anticorpo, e neste exemplo as relações de 0,63x e 0,76x forneceram densidades de células viáveis máximas, títulos de colheita e resultados de capeamento similares aceitáveis (Tabela 5). O título de colheita e os valores de DAR4 bruta foram normalizados.
Tabela 5. Comparações da Relação de Limitação de Cisteína Fracionada
Operação Relação de Limitação de Cisteína Fracionada Real VCD Máxima (E6 células/ml) Título de Colheita (g/L) DAR4 Bruta (%)
1 0,63x 32,2 1x 1,40x
2 0,76x 37,0 1,1x 1,35x
3 1,15x 47,0 1,8x 1x
[00109] A UPLC por acuidade (Waters Corp, Miliford, MA) foi utilizada para a análise de aminoácido das condições similares daquelas descritas na Tabela 5. Todas as concentrações de cistina obtidas da análise de UPLC foram estequiometricamente convertidas em cisteína. Os resultados mostram claramente que as relações de limitação de cisteína fracionada mais baixas levam a níveis esgotados de cisteína/cisteína mais no início na cultura em comparação com a condição 1,15x, indicando que o uso de uma relação de limitação de cisteína fracionada alvo pode levar a um nível baixo consistente e previsível de capeamento Cys e alta eficiência de capeamento com TNB (Figura 10).
Exemplo 3.3: Limitação da cisteína/cistina em cultura através do aumento da densidade celular máxima
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41/56 [00110] Conforme anteriormente demonstrada por duas linhagens celulares no Exemplo 3.1, se a cisteína/cistina forem limitadas a baixas concentrações ou esgotadas inteiramente durante a batelada, a eficiência de capeamento com TNB é aumentada. Um segundo exemplo de concentrações de cisteína/cistina em níveis intencionalmente decrescentes ou de esgotamento na cultura pode ser realizado através do uso da densidade de células viáveis máxima. Visto que a densidade de células viáveis aumenta em uma dada cultura, o consumo e a demanda de aminoácidos tipicamente também aumentam (US 8.232.075 B). Neste exemplo, duas condições separadas foram avaliadas em que diferentes densidades de células viáveis máximas foram alcançadas.
[00111] Células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C foram utilizadas com meios basais e de alimentação registrados em biorreatores de 1 L Applikon (Applikon, Inc., Schiedam, Netherlands), que operam com controladores modulares BioNet (Broadley-James Corp., Irvine, CA) com bomba peristáltica e módulos controladores de fluxo de massa gasosa. As condições foram semeadas em aproximadamente 0,6E6 ou 2E6 células/ml, a temperatura foi mantida em torno de 37 graus Celsius, enquanto que o pH foi controlado próximo a 7,0 mediante a adição de uma solução de carbonato de sódio/potássio ou CO2. Os níveis de oxigênio dissolvido foram controlados >20% de saturação de ar através da pulverização de oxigênio puro. A duração da batelada para os exemplos fornecidos abaixo foi de aproximadamente 12 dias; uma condição foi colhida no começo devido à baixa viabilidade. Alguns parâmetros de processo, tais como taxas de alimentação de nutrientes, para as duas condições, diferiram de modo a alcançar e sustentar diferentes densidades de células máximas. No entanto, as concentrações de cisteína e cistina no meio basal foram semelhantes
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42/56 e as concentrações de cistina do meio de alimentação foram as mesmas (Tabela 6).
Tabela 6. Concentrações de Meio de Cisteína e Cistina
Operação Descrição Meio Basal Meio de Alimentação de Nutrientes VCD Máxima (E6 células/ml)
Cistina (mM) Cisteína (mM) Cistina (mM) Cisteína (mM) Taxa de Alimentação
1 Semente Baixa 1,10 0,4 4,7 0 1x 15,2
2 Semente Elevada 1,50 0,4 4,7 0 3,4x 40,0
[00112] A UPLC por acuidade (Waters Corp, Miliford, MA) foi utilizada para a análise de aminoácido das condições descritas na Tabela 6. Todas as concentrações de cistina obtidas da análise de UPLC foram convertidas em cisteína. A análise de aminoácido destas condições mostrou que a condição com a densidade de células viáveis máxima mais elevada esgotou com sucesso a cisteína/cistina mais no início na batelada, em comparação com a condição com a densidade de células viáveis máxima mais baixa (Figura 11B) que manteve uma concentração residual de cisteína/cistina até a colheita. A DAR4 bruta não foi analisada para estas amostras, mas com base nos dados de análise de aminoácido; cisteína/cistina foi esgotada mais no início com relação à condição de semente elevada. A partir destes dados pode ser inferido que um ambiente ideal de baixa cisteína/cistina para o capeamento com TNB eficiente foi induzido pela densidade de células viáveis máxima mais elevada. Isto demonstra que as condições estimulantes que podem promover as culturas para atingir densidades de células mais elevadas podem ser um método alternativo eficaz na manutenção de cisteína/cistina em níveis baixos ou esgotados na cultura celular para promover um ambiente desejável para o capeamento com TNB do anticorpo.
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Exemplo 4. Geração de anticorpo mutante Cys capeado com TNB na ausência de células.
[00113] A geração de um anticorpo ou uma proteína de fusão em uma forma de modo que ela possa ser subsequentemente utilizada em uma etapa de conjugação para gerar um conjugado de fármaco de anticorpo desejado é rotineiramente conseguida como parte do desenvolvimento de uma linhagem celular de fabricação e/ou obtida como parte da parcela de processo a montante / cultura celular de um processo de fabricação. No caso de geração de anticorpo capeado com TNB, a abordagem até aqui descrita tem sido através da inclusão de uma alimentação de DTNB como parte do processo de cultura celular junto com ou sem várias modificações adicionais do processo de cultura celular (tal como, mas não limitado a ajustes das concentrações de alimentação de cisteína/cistina, modificações do comprimento de batelada) como anteriormente descrito. Embora isto permita a produção do anticorpo capeado desejado, estas abordagens dependem da porção de cultura celular do processo de fabricação, e podem reduzir a produtividade total da unidade de fabricação. Assim, a produção do anticorpo capeado com TNB é limitada por causa da utilização subideal da instalação, especificamente do biorreator de produção ou fermentador utilizado para a cultura celular.
[00114] Neste exemplo, uma proteína recombinante mutante de cisteína, tal como um anticorpo mutante de cisteína, uma proteína de fusão mutante de cisteína, ou similar, é produzida por meio de técnicas de cultivo/fermentação de células. O meio condicionado contendo proteína pode então ser separado das células por centrifugação, mícrofiltração ou outra técnica de separação de células adequada. A separação de células pode ser completa ou parcial. A próxima etapa é a exposição/incubação da proteína recombinante cys mutante com DTNB para gerar proteína capeada com TNB. Através da separação
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44/56 das etapas de a) geração de proteína recombinante mutante de cisteína e b) capeamento de proteína recombinante mutante de cisteína, o processo e a unidade de fabricação podem ser otimizados para maximizar a produtividade evitando o uso do biorreator/fermentador de cultura celular na parte de capeamento do processo e minimizando assim o tempo de ciclo requerido para o biorreator/fermentador. A minimização do tempo de ciclo do biorreator/fermentador dessa maneira leva em conta uma maior produtividade (através de um número mais elevado de ciclos executados por período de tempo).
[00115] Abordagem 1: Para este exemplo, células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C foram utilizadas com meios basais e de alimentação em biorreatores de 1 L Applikon (Applikon, Inc., Schiedam, Netherlands), que operam com controladores modulares BioNet (Broadley-James Corp., Irvine, CA) com bomba peristáltica e módulos controladores de fluxo de massa gasosa. A temperatura da cultura celular foi mantida em torno de 37 graus Celsius, enquanto que o pH foi controlado próximo a 7,0 mediante a adição de uma solução de carbonato de sódio/potássio ou CO?. Os níveis de oxigênio dissolvido foram controlados >20% de saturação de ar através da pulverização de oxigênio puro. Após 0 cultivo de cultura celular, 0 meio condicionado contendo proteína foi separado por meio de centrifugação e filtragem de 0,2 um. O meio condicionado foi então transferido para um recipiente separado. A este recipiente, uma concentração particular de DTNB foi diretamente adicionada ao meio condicionado contendo proteína. A reação foi deixada ocorrer por vários períodos de tempo, de modo a demonstrar a robustez do procedimento para gerar 0 material desejado. Como pode ser visto na Figura 12 (trastuzumab K183C-K290C), 0 produto desejado foi gerado utilizando uma faixa de
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45/56 períodos de incubação, com tempos mais longos levando a um desempenho melhorado.
[00116] Abordagem 2: para este exemplo uma segunda linhagem celular de células CHO-K1 que estavelmente expressam o anticorpo mutante de cisteína anti-EBD K183C-K290C foi utilizada com meios basais e de alimentação em biorreatores de 1 L Applikon (Applikon, Inc., Schiedam, Netherlands), que operam com controladores modulares BioNet (Broadley-James Corp., Irvine, CA) com bomba peristáltica e módulos controladores de fluxo de massa gasosa. A temperatura da cultura celular foi mantida em torno de 37 graus Celsius, enquanto que o pH foi controlado próximo a 7,0 através de uma solução de carbonato de sódio/potássio ou CO2. Os níveis de oxigênio dissolvido foram controlados >20% de saturação de ar através da pulverização de oxigênio puro. Após 0 cultivo da cultura celular, 0 meio condicionado contendo proteína foi separado por centrifugação e filtragem de 0,2 pm. O meio condicionado foi então transferido para um recipiente separado. A este recipiente, uma concentração particular de DTNB foi adicionada diretamente à proteína contendo meio condicionado. A reação foi deixada ocorrer durante vários períodos de tempo de modo a demonstrar a robustez do procedimento para gerar 0 material desejado. Como podem ser visto na Figura 13 (anti-EDB K183C-K290C), 0 produto desejado foi gerado utilizando uma faixa de períodos de incubação, com tempos mais longos levando a um desempenho melhorado que demonstra a mesma tendência observada em duas linhagens celulares de expressão de anticorpos diferentes.
Exemplo 5. Processo de Conjugação de TNB [00117] O anticorpo mutante de cisteína capeado com TNB é seletivamente reduzido com TSPP. Os grupos de tiol livres gerados permitem a conjugação direta do fármaco sem as etapas de
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46/56 ultrafiltração/diafiltração (UF/DF) e reoxidação, o que simplifica o processo. O anticorpo mutante de cisteína trastuzumab K183C-K290C completamente capeado com TNB na forma de 4 capeamentos por anticorpo (DAR4) foi gerado e conjugado direto após o tratamento com
TSPP com uma eficiência de 70%.
[00118] Como um outro exemplo, o capeamento com TNB e conjugação (em K183C-K290C) são aqui tratados. O protocolo de conjugação capeado com TNB para a conjugação de mutante de cisteína consiste em duas etapas que levam ao conjugado bruto: redução e conjugação seletivas. Na primeira etapa uma redução seletiva de cisteínas mutantes é executada para se obter a remoção dos grupos de proteção de resíduos de cisteína mutantes com redução mínima ou nenhuma de dissulfetos intercadeías. Tipicamente isto é feito utilizando um excesso (~7 equivalentes) de um agente redutor tal como tris(3-sulfonatofenil)fosfina (TSPP) na temperatura ambiente durante 2 h. Em uma segunda etapa, as cisteínas mutantes não protegidas são conjugadas à carga útil do conector. Tipicamente, um excesso (~12 equivalentes) de conector-carga útil é adicionado à reação e a reação é realizada na temperatura ambiente durante 1 h para produzir o conjugado bruto. O conjugado final mantém as ligações de dissulfeto intercadeías nativas, visto que elas não foram rompidas durante a etapa de redução.
[00119] Em um caso específico: A 1,0 g (6,9 pmol; 25 mg/ml em histidina 60 mM, pH 7; 38,9 ml) de anticorpo trastuzumab K183CK290C foi adicionado 27,5 mg de TSPP (7 equivalentes; 48,3 pmol; 10 mM em água; 4,83 ml). A mistura de reação foi incubada em temperatura ambiente durante 2 h. A esta mistura de reação foram adicionados 111 mg de conector-carga útil mcvcPABC0101 (12 equivalentes, 82,7 pmol; 25 mM de dimetilsulfóxido; 3,31 ml). A mistura de reação foi incubada em temperatura ambiente durante 1 h
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47/56 para proporcionar o conjugado bruto.
Exemplo 6: Processo de Conjugação de TNB com Diafiltração PósRedução [00120] A quantidade de conector-carga útil em excesso utilizada no processo descrito no Exemplo 5 pode ser reduzida pela adição de uma etapa de diafiltração (troca de tampão) após a redução de TSPP para remover as espécies que reagem com conector-carga útil. Como mostrados na Figura 14, DAR4 a 70% é obtida com 6 equivalentes de carga útil de conector após a troca de tampão, enquanto que equivalentes significativamente mais elevados são necessários quando a troca de tampão não é executada. Da mesma forma, a quantidade de TSPP pode ser ligeiramente reduzida pelo aumento da temperatura e/ou tempo de redução.
[00121] Em um caso específico: A 4,0 g (27,6 pmol; 25 mg/ml em histidina 60 mM, pH 7; 156 ml) de anticorpo trastuzumab K183CK290C foram adicionados 93,8 mg de TSPP (6 Equivalentes; 165 pmol; 10 mM em água; 16,5 ml). A mistura de reação foi incubada a 37Ό durante 3 h, e depois o tampão foi trocado por diafiltração (membrana TangenX ProStream 50 kD, 110 a 210 g/m2, 10 diavolumes de histidina 60 mM, pH 7). Após a diafiltração, 222 mg de conector-carga útil mcvcPABC0101 (6 equivalentes, 165 pmol; 25 mM em dimetilsulfóxido; 6,62 ml) foram adicionados. A mistura de reação foi incubada a 25 Ό durante 1 hora para proporcionar o conjugado bruto.
Exemplo 7: Processo de Conjugação de TNB com Estequiometria de TSPP Aumentada, Diafiltração Pós-Redução e Reoxidação.
[00122] A quantidade de agregado produzido pelo processo descrito no Exemplo 6 pode ser reduzida pelo aumento da estequiometria de TSPP. Uma estequiometria de TSPP aumentada mais rapidamente remove o TNB das cisteínas submetidas à mutação e impede a
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48/56 formação de ligações de dissulfeto entre anticorpos. No entanto, a estequiometria de TSPP aumentada também resulta na redução de uma pequena fração de ligações de dissulfeto intercadeias. A presença de cloreto de sódio e outros sais (ver o Exemplo 8) diminui a extensão da redução de dissulfeto intercadeia em uma estequiometria de TSPP mais elevada. A adição de uma etapa de reoxidação após a diafiltração repara algumas das ligações de dissulfeto intercadeias reduzidas. Conforme mostrado na Figura 15, a conjugação após a redução com 20 equivalentes de TSPP e troca de tampão, sem a etapa de reoxidação, resulta em baixos níveis de espécies superconjugadas devido à redução de ligação de dissulfeto intercadeia. Quando a reoxidação é adicionada ao processo, espécies superconjugadas não são formadas.
[00123] Em um caso específico: A 24,7 g (0,170 mmol; 26 mg/ml em histidina 60 mM, NaCI 150 mM, pH 7; 961 ml) de anticorpo trastuzumab K183C-K290C foi adicionado 1,94 g de TSPP (20 equivalentes; 3,41 mmol; 100 mM de água; 34,1 ml). A mistura de reação foi agitada a 37 Ό durante 3 horas, e em se guida o tampão foi trocada por diafiltração (membrana TangenX ProStream 50 kD, 110 a 210 g/m2, 10 divolumes de histidina 60 mM, NaCI 150 mM, pH 7). Após a diafiltração, a mistura foi esfriada para 4 Ό, 0,45 g de ácido deidroascórbico (15 equivalentes; 2,56 mmol; 50 mM em DMSO/água 1:1; 51,2 ml) foi adicionado e a mistura foi agitada a 4 € durante 16 h. A mistura foi aquecida para 25 Ό, 1,37 g de conector-carga útil mcvcPABC0101 (6 equivalentes, 1,02 mmol; 25 mM em dimetilsulfóxido; 40,9 ml) foi adicionado, e a mistura foi agitada a 25 Ό durante 1,5 h para proporcionar o conjugado bruto.
Exemplo 8: Processo de Conjugação de TNB com Estequiometria de TSPP aumentada, Diafiltração Pós-Redução, Reoxidação e Supressão de Conector-Carga Útil
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49/56 [00124] A presença de sais na mistura de redução, tal como cloreto de sódio no Exemplo 7, diminui a extensão da redução de dissulfeto intercadeia na estequiometria de TSPP mais elevada.
[00125] Como um outro exemplo, a utilização da medida da Figura 15 de espécies super-conjugadas formadas quando nenhuma reoxidação é executada, a redução de dissulfeto intercadeia diminuiu de -'33% quando nenhum sal estava presente em 10 a 20% na presença de sais 150 a 500 mM. Sais tais como cloreto de sódio, acetato de sódio, nitrato de potássio, hidrogeno fosfato de potássio, nitrato de magnésio, sulfato de magnésio, cloreto de guanidínio e sulfato de amônio diminuíram a redução de dissulfeto intercadeia.
[00126] Em um caso específico, a redução de dissulfeto intercadeia foi diminuída de 33% quando nenhum sal foi adicionado em 15%, 14% e 12% na presença de cloreto de sódio 150 mM, 250 mM e 500 mM, respectivamente.
Exemplo 9: Processo de Conjugação de TNB com Estequiometria de TSPP aumentada, Diafiltração Pós-Redução, Reoxidação e Supressão de Conector-Carga Útil [00127] Este exemplo é similar ao Exemplo 7, mas caracteriza-se por (1) operação de reoxidação a 25 Ό, que reduz significativamente o tempo de reoxidação e elimina o esfriamento demorado após a diafiltração e aquecimento antes da conjugação, e (2) supressa de conector-carga útil através da reação com cisteína, que melhora a purificação a jusante sob certas condições (ver o Exemplo 14 abaixo). [00128] Em um caso específico: A 80,0 g (0,541 mmol; 26 mg/ml em histidina 60 mM, NaCI 150 mM, pH 7; 3053 ml) de anticorpo trastuzumab K183C-K290C foram adicionados 6,14 g de TSPP (20 equivalentes; 10,8 mmol; 100 mM em água; 108 ml). A mistura de reação foi agitada a 37 Ό durante 3 horas, e depoi s o tampão trocado por diafiltração (membrana TangenX ProStream 50 kD, 110 a 210
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50/56 g/m2, 10 diavolumes de histidina 60 mM, NaCI 150 mM, pH 7). Após a diafiltração, 0,19 g de ácido desidroascórbíco (2 equivalentes; 1,08 mmol; 50 mM em DMSO/água 1:1; 21,6 ml) foi adicionado, e a mistura foi agitada a 25 Ό durante 0,5 h. Então, 4,35 g de conector-carga útil mcvcPABC0101 (6 equivalentes, 3.24 mmol; 25 mM de dimetilsulfóxido; 130 ml) foram adicionados e a mistura foi agitada a 25Ό durante 1 h. For fim, 0,79 g de cisteína (12 equivalentes, 6,48 mmol; 100 mM em água; 64,9 ml) foi adicionado, e a mistura foi agitada a 25 Ό durante 1 hora para fornecer o conj ugado bruto.
Exemplo 10: Processo de Conjugação de TNB - Reparo de Fragmento de Anticorpo através da Reoxidação.
[00129] A adição de uma etapa de reoxidação, como nos Exemplos 7 e 9, os fragmentos reparados presentes no anticorpo de entrada, melhorando assim a qualidade e o rendimento do conjugado final. Os fragmentos se originam de anticorpos nos quais uma ou mais das ligações de dissulfeto intercadeias não estão intactas. Assim, a conjugação de grandes porções de anticorpos contendo níveis de fragmento de 15 a 35% utilizando o processo descrito no conjugado produzido no Exemplo 9 com níveis baixos e comparáveis de fragmentos.
[00130] Em um caso específico: Anticorpo com 35% de fragmentos produziu o conjugado bruto com aproximadamente 10% de fragmentos; a maior parte dos fragmentos foi reparada pela reoxidação. O conjugado purificado final continha menos do que 3% de fragmentos.
Exemplo 11: Processo de Conjugação de TNB com Anticorpo AntiEDB K183C-K290C [00131] O processo de conjugação de TNB é adequado para anticorpos capeados com TNB diferentes de trastuzumab.
[00132] Em um caso específico: Processamento de anticorpo antiPetição 870190069206, de 22/07/2019, pág. 84/121
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EDB K183C-K290C capeado com TNB utilizando o procedimento descrito no Exemplo 9 proporcionou um conjugado bruto comparável àquele obtido com o anticorpo trastuzumab K183C-K290C. Conforme mostrado na Figura 16, os conjugados brutos destes anticorpos são altamente similares com -75% de DAR4.
Exemplo 12: Purificação de Conjugados Produzidos pelo Processo de Conjugação de TNB.
[00133] O conjugado bruto produzido pelo processo pode ser purificado por cromatografia de interação hídrofóbica (HIC). A purificação por HIC remove ou significativamente reduz o conectorcarga útil livre, agregados, fragmentos e conjugados DAR inferiores.
[00134] Como um exemplo adicional, a purificação por HIC pode ser executada utilizando uma coluna de resina Capto™ Butyl ImpRes (GE) e uma coluna Toyopearl® PPG-600M (Tosoh) conectadas em série. A Capto™ Butyl ImpRes fornece remoção adequada dos agregados, fragmentos e conjugados de DAR inferiores, e a Toyopearl® PPG600M retém o conector-carga útil livre mcvcPABC0101 livre. O conjugado purificado pode ser concentrado e o tampão trocado por ultrafiltração/diafiltração (UF/DF). A UF/DF também pode remover o conector-carga útil livre residual se presente após a purificação por HIC.
[00135] Em um caso específico: O conjugado bruto (4,0 g, 26 mg/ml) produzido pelo processo descrito no Exemplo 6 foi diluído com um volume de fosfato de sódio 10 mM, pH 7. A mistura bruta diluída foi ainda diluída 1:1 com fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7, para proporcionar a solução de carga da HIC. A purificação por HIC foi executada utilizando uma coluna de resina Capto™ Butyl ImpRes (GE) (24 cm (h) x 2,6 cm (d)) e uma coluna Toyopearl® PPG600M (Tosoh) (4 cm (h) x 2,6 cm (d)) conectadas em série. Após a introdução da solução de carga na coluna Capto™ Butyl ImpRes, o
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52/56 conjugado purificado foi eluído da série de duas colunas com um gradiente de 50 a 100% de tampão B no tampão A sobre 25 volumes de coluna; tampão A: fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7; tampão B: fosfato de sódio 10 mM, pH 7. As frações contendo o conjugado desejado foram reunidas e submetidas à UF/DF para concentração e troca de tampão (membrana TangenX ProStream 50 kD, 110 a 210 g/m2, 10 divolumes de histidina 20 mM, pH 5,8).
Exemplo 13: Purificação de Conjugados Produzidos pelo Processo de Conjugação por TNB com Recuperação Aumentada [00136] Quando se purifica por HIC, a recuperação da DAR4 de ADC pode ser melhorada pela adição de isopropanol ao tampão de fase móvel B, aumentando assim o rendimento do processo.
[00137] Em um caso específico: O conjugado bruto (12,4 g, 26 mg/ml) produzido pelo processo descrito no Exemplo 7 foi diluído com um volume de fosfato de sódio 10 mM, pH 7, isopropanol 5% (v/v). A mistura bruta diluída foi ainda diluída 1:1 com fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7, para proporcionar a solução de carga por HIC. A purificação por HIC foi executada utilizando uma coluna de resina Capto™ Butyl ImpRes (GE) (22 cm (h) x 5 cm (d)) e uma coluna Toyopearl® PPG-600M (Tosoh) (4 cm (h) x 5 cm (d)) conectadas em série. Após a introdução da solução de carga na coluna Capto™ Butyl ImpRes, o conjugado purificado foi eluído da série de duas colunas com um gradiente de 50 a 100% de tampão B no tampão A sobre 25 volumes de coluna; tampão A: fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7; tampão B: fosfato de sódio 10 mM, pH 7, isopropanol 5% (v/v). As frações contendo o conjugado desejado foram reunidas e submetidas à UF/DF para concentração e troca de tampão (membrana TangenX ProStream 50 kD, 110 a 210 g/m2, 10 divolumes de histidina 20 mM, pH 5,8). O rendimento de ADC para o processo global, em que isopropanol estava presente no tampão B na
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53/56 purificação por HIC, foi melhorado em aproximadamente 50% sobre aquele que utilizou o processo de purificação no Exemplo 12.
Exemplo 14: Purificação de Conjugados Produzidos pelo Processo de
Conjugação por TNB com Supressão de Conector-Carga Útil.
[00138] Quando o conector-carga útil mcvcPABC0101 é capeado com cisteína em uma etapa de supressão, como no Exemplo 9, a purificação por HIC pode ser executada utilizando uma coluna de resina Capto™ Butyl ImpRes (GE) isoladamente. O mcvcPABC0101 capeado com cisteína elui mais cedo do que o conjugado de DAR4 e é bem separado em uma coluna Capto™ Butyl ImpRes. Como mostrado na Figura 17, o conjugado de DAR4 é separado do mcvcPABC0101 capeado com cisteína, conjugados de DAR inferiores, agregados e fragmentos utilizando as condições descritas neste exemplo. O mcvcPABC0101 capeado com cisteína também é facilmente purificado por diafiltração.
[00139] Em um caso específico: O conjugado bruto (40,0 g, 26 mg/ml) produzido pelo processo descrito no Exemplo 9 foi diluído com um volume de fosfato de sódio 10 mM, pH 7, isopropanol 5% (v/v). A mistura bruta diluída foi ainda diluída 1:1 com fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7, para proporcionar a solução de carga por HIC. A purificação por HIC foi executada utilizando uma coluna de resina Capto™ Butyl ImpRes (GE) (24,5 cm (h) x 10 cm (d)). Após a introdução da solução de carga na coluna, o conjugado purificado foi eluído com um gradiente de 50 a 100% de tampão B no tampão A sobre 10 volumes de coluna; tampão A: fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7; tampão B: fosfato de sódio 10 mM, pH 7, isopropanol 5% (v/v). As frações contendo o conjugado desejado foram reunidas e submetidas à UF/DF para concentração e troca de tampão (membrana TangenX ProStream 50 kD, 110 a 210 g/m2, 10 divolumes de histidina 20 mM, pH 5,8).
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54/56 [00140] Em um caso específico separado: O conjugado bruto (0,83 g, 23 mg/ml) produzido pelo processo descrito no Exemplo 9 foi diluído com um volume de fosfato de sódio 10 mM, pH 7, isopropanol 5% (v/v). A mistura bruta diluída foi ainda diluída 1:1 com fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7, para proporcionar a solução de carga por HIC. A purificação por HIC foi executada utilizando uma coluna de resina Butyl HP (GE) (24 cm (h) x 1,6 cm (d)) e uma coluna Toyopearl® PPG-600M (Tosoh) (5,3 cm (h) x 1,6 cm (d)) conectadas em série. Após a introdução da solução de carga na coluna, o conjugado purificado foi eluído com um gradiente de 50 a 100% de tampão B no tampão A sobre 10 volumes de coluna; tampão A: fosfato de sódio 20 mM, sulfato de amônio 1M, pH 7; tampão B: fosfato de sódio 10 mM, pH 7, isopropanol 5% (v/v). As frações contendo o conjugado desejado foram reunidas. Uma recuperação elevada foi alcançada junto com a separação de conector-carga útil mcvcPABC0101 do conjugado de DAR4.
Exemplo 15: Ensaio para Analisar a Mistura de Dissulfeto na Região de Dobradiça do Anticorpo.
[00141] Um benefício do processo de conjugação com TNB é a redução significativa ou eliminação completa da redução de dissulfeto da dobradiça no anticorpo, e assim a produção de um conjugado tendo as ligações de dissulfeto intercadeias nativa. Um ensaio foi desenvolvido para medir o nível de mistura da articulação tanto no anticorpo quanto no conjugado. No ensaio, o anticorpo ou conjugado é tratado com uma enzima que corta abaixo da dobradiça e uma segunda enzima que corta acima da dobradiça, vide Figura 20.
[00142] O fragmento da dobradiça é então analisado por HPLC ou LC-EM para determinar a quantidade de dobradiça nativa e misturada que estava presente no anticorpo ou conjugado.
[00143] Uma amostra de 1 mg/ml de ADC foi tratada com IdeS
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55/56 (Enzima 1, 1 unidade/pg de ADC) a 37 Ό durante 30 minutos seguido por tratamento com Lys-C (Enzima 2, 1 pg/150 pg de ADC) a 37 Ό durante 5 minutos. A reação foi então suprimida com ácido trifiuoroacético. A amostra foi analisada por HPLC: coluna Waters XBridge BEH C185 temperatura de coluna: 60 Ό, fase móvel A: TFA 0,1% em água, fase móvel B: TFA 0,1% em acetonitrila, gradiente: 20 a 30% fase móvel B durante 30 minutos, taxa de fluxo: 0,2 ml/min, detecção de UV em 214 nm. Os picos foram confirmados por EM.
Exemplo 16: Comparação com Conjugação para Anticorpo Capeado com Cisteína.
[00144] O ADC produzido do anticorpo capeado com cisteína contém produto misturado da dobradiça. Para conjugar um anticorpo capeado com cisteína, o anticorpo deve ser completamente reduzido com o excesso de cloridreto de tris(2-carboxietil)fosfina (TCEP) e as ligações de dissulfeto intercadeias reduzidas reoxidadas com ácido desidroascórbico, deixando apenas os resíduos de cisteína submetidos à mutação disponíveis como tióis livres para conjugação. Os resíduos de cisteína submetidos à mutação são então conjugados com o conector-carga útil para proporcionar o ADC bruto. A etapa de reoxidação produz tanto ligações de dissulfeto intercadeias nativas quanto ligações de dissulfeto misturadas na região de dobradiça do anticorpo. Para os ADCs produzidos por este processo de redução/reoxidação total, o nível de mistura de dobradiça medido pelo ensaio descrito no Exemplo 15 é tipicamente de 5 a 20%. Observar que toda a mistura de dobradiça se origina do processo de conjugação de ADC, já que a mistura de dobradiça não foi detectada no anticorpo de partida.
[00145] A 4,0 g (27,6 μιτιοΙ; 27 mg/mL em histidina 60 mM, pH 7; 144 ml) de anticorpo trastuzumab K183C-K290C capeado com cisteína foi adicionado 1,65 ml de TCEP 0,5 M (30 equivalentes; 0,827
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56/56 mmol; solução em água 0,5M). A mistura de reação foi incubada a 37QC durante 5 h, e depois o tampão é trocado por diafiltração (membrana TangenX ProStream 50kD, 110 a 210 g/m2, 10 diavolumes de histidina 60 mM, pH 7). Após a diafiltração, a mistura foi esfriada para 4 QC, 0,144 g de ácido desidroascórbico (30 equivalentes; 0,827 mmol; 50 mM em 1:1 DMSO/água; 16,5 ml) foi adicionado, e a mistura foi incubada a 4 QC durante aproximadamente 16 h. A mistura foi aquecida para 25 QC, 0,185 g de conector-carga útil mcvcPABC0101 (5 quivalentes, 0,138 mmol; 25 mM em dimetilsulfóxido; 5,51 ml) foi adicionado, e a mistura foi incubada a 25 QC durante 1 h para proporcionar o conjugado bruto. Após a purificação por HIC, o nível de mistura de dobradiça no ADC medido pelo ensaio descrito no Exemplo 15 foi de 18%.
[00146] Para comparação, os ADCs produzidos de anticorpo capeado com TNB, como nos Exemplos 6, 7 e 9 acima, não contêm nenhuma mistura de dobradiça detectável após a purificação por HIC, conforme medido pelo ensaio descrito no Exemplo 15.

Claims (31)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Processo para a geração de proteínas contendo cisteína capazes de serem conjugadas com uma carga útil química, dito processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) semear um meio de crescimento celular, dito meio compreendendo um ou mais componentes de crescimento selecionados de cisteína, cistina e glutationa, com células capazes de expressar proteínas contendo cisteína;
    (b) incubar ditas células para obter uma densidade celular suficiente para esgotar a maior parte dos componentes de crescimento presentes em dito meio de crescimento; e (c) incubar ainda ditas células para expressar as proteínas contendo cisteína tendo um ou mais resíduos de cisteína não capeados compreendendo um tiol livre.
  2. 2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de:
    (d) introduzir um componente de capeamento predeterminado, ou um precursor deste, nas ditas proteínas contendo cisteína expressas;
    por meio das quais uma ou mais cisteínas nas ditas proteínas são capeadas com dito componente de capeamento predeterminado.
  3. 3. Processo para a geração de proteínas contendo cisteína capazes de serem conjugadas com uma carga útil química, dito processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) semear um meio de crescimento celular, dito meio compreendendo um ou mais componentes de crescimento selecionados de cisteína, cistina e glutationa, com células capazes de expressar proteínas contendo cisteína;
    (b) incubar ditas células para expressar proteínas contendo
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    2/6 cisteína tendo um ou mais resíduos de cisteína não capeados compreendendo um tio! livre; e (c) na etapa (a), na etapa (b) ou nas etapas tanto (a) quanto (b), manutenção da concentração de dito um ou mais componentes de crescimento em concentrações abaixo de 0,4 mM, abaixo de 0,3 mM, abaixo de 0,2 mM, abaixo de 0,1 mM ou abaixo de 0,05 mM.
  4. 4. Processo de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa de:
    (d) introduzir um componente de capeamento predeterminado, ou um precursor deste, em ditas proteínas contendo cisteína expressas;
    por meio das quais uma ou mais cisteínas nas proteínas são capeadas com dito componente de capeamento predeterminado.
  5. 5. Processo para a geração de proteínas contendo cisteína capazes de serem conjugadas com uma carga útil química, dito processo caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) semear um meio de crescimento celular, dito meio compreendendo um ou mais componentes de crescimento selecionados de cisteína, cistina e glutationa, com células capazes de expressar proteínas contendo cisteína, incluindo, e (b) incubar ditas células para expressar proteínas contendo cisteína tendo um ou mais resíduos de cisteína não capeados compreendendo um tiol livre, por meio das quais a concentração de ditos componentes de crescimento após dita incubação está abaixo de 2,0 mM, abaixo de 0,4 mM, abaixo de 0,3 mM, abaixo de 0,2 mM, abaixo de 0,1 mM ou abaixo de 0,05 mM.
  6. 6. Processo de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que ainda compreende a etapa, após dita etapa de incubação, de:
    (c) introduzir um componente de capeamento
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    3/6 predeterminado, ou um precursor deste, em ditas proteínas contendo cisteína expressas;
    por meio das quais uma ou mais cisteínas em ditas proteínas são capeadas com dito componente de capeamento predeterminado.
  7. 7. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que ditos componentes de crescimento são esgotados através da limitação da relação de limitação de cisteína fracionada em dito meio de crescimento celular para menos do que 1,0x.
  8. 8. Processo de acordo com a reivindicação 7, caracterizado pelo fato de que dita relação é de cerca de: 0,95x, 0,90x, 0,85x, 0,80x, 0,75x, 0,70x, 0,65x, 0,60x, 0,55x, 0,50x, 0,45x, 0,40x, 0,35x, 0,30x, 0,25x, 0,20x, 0,15x, 0,1 Ox ou 0,05x.
  9. 9. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que ditas proteínas contendo cisteína são selecionadas do grupo que consiste em anticorpos e proteínas de fusão.
  10. 10. Processo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que dita densidade celular alcançada é de pelo menos cerca de 1E6 células/ml.
  11. 11. Processo de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que dita densidade celular é de pelo menos cerca de: 5E6 células/ml, 10E6 células/ml, 50E6 células/ml, 100E6 células/ml ou 500E6 células/ml.
  12. 12. Processo de acordo com a reivindicação 2, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que dito componente de capeamento predeterminado é selecionado do grupo que consiste em ácido 5-tio-2nitrobenzóico (TNB), 2-mercaptopiridina, ditiodipiridina (DTDP), ácido 4-tiobenzóico, ácido 2-tiobenzóico, ácido 4-tíobenzenossulfônico, ácido
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    HQ
    2-tiobenzenossulfônico, sulfonato de metila (Ms), p-toluenossulfonato (Ts) e trifluorometanossulfonato (Tf).
  13. 13. Método de acordo com a reivindicação 2, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que dito componente de capeamento predeterminado é selecionado de um grupo reativo que consiste em moléculas semelhantes a maleimido trioxa-4-formil benzamida (MTFB) com um parâmetro identificador de aldeído ou moléculas semelhantes a azido-lisina maleimido com um parâmetro identificador de azida, ou moléculas semelhantes a dibenzociclooctila-polietileno maleimida (DBCO-PEG4-maleimida) com um parâmetro identificador de alquina.
  14. 14. Processo de acordo com a reivindicação 2, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que dito componente de capeamento predeterminado é TNB.
  15. 15. Processo de acordo com a reivindicação 2, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que dito precursor é DTNB.
  16. 16. Processo de acordo com a reivindicação 2, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que ditas proteínas capeadas são submetidas a outro processamento que consiste em um ou mais de isolamento, purificação e concentração.
  17. 17. Processo de acordo com a reivindicação 2, 4 ou 6, caracterizado pelo fato de que pelo menos 50% de ditas células são separadas de ditas proteínas contendo cisteína expressas antes da introdução de dito componente de capeamento predeterminado ou seu precursor.
  18. 18. Processo de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pelo fato de que dita separação é executada por centrifugação ou filtração.
  19. 19. Processo para a conjugação de uma proteína contendo cisteína capeada com TNB, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
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    5/6 (a) reação de dita proteína contendo cisteína capeada com TNB com um agente redutor capaz de separar ditos componentes de capeamento com TNB da dita proteína sem reduzir significativamente as ligações de enxofre intercadeias de anticorpos;
    (b) filtragem opcional de dita mistura de reação para remover o excesso de agente redutor, TNB separado, ou ambos; e (c) sem a introdução de um agente oxidante, conjugação de uma ou mais ligações de enxofre reduzidas em dito anticorpo com uma carga útil através de um componente de ligação reativa.
  20. 20. Processo para a conjugação de uma proteína contendo cisteína capeada com TNB, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de:
    (a) reagir dita proteína contendo cisteína capeada com TNB com um excesso estequiométrico de 4:1 a 6:1 do agente redutor capaz de separar ditos componentes de capeamento com TNB de dita proteína sem reduzir significativamente as ligações de enxofre intercadeias de anticorpos, opcionalmente na presença de cloreto de sódio;
    (b) filtrar dita mistura de reação para remover um ou mais de agentes redutores em excesso, TNB separado;
    (c) introduzir um agente oxidante; e (d) conjugar uma ou mais ligações de enxofre reduzidas em dito anticorpo com uma carga útil através de um componente de ligação reativo.
  21. 21. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que o excesso estequiométrico é de cerca de 5:1.
  22. 22. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é executada em temperaturas ambientes.
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    6/6
  23. 23. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é executada ao redor de 25 graus Celsius.
  24. 24. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que a etapa (c) é executada ao redor de 4 graus Celsius.
  25. 25. Processo de acordo com a reivindicação 20, caracterizado pelo fato de que ainda compreende as etapas de: (e) adicionar cisteína em excesso após a etapa (d) para suprimir a reação de dito componente de ligação; e (f) separar dito conector-carga útil suprimido de dito conjugado.
  26. 26. Processo de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a dita separação é executada por diafiltração ou cromatografia em coluna.
  27. 27. Processo de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que dita cromatografia em coluna é a cromatografia de interação hidrofóbica (HIC).
  28. 28. Processo de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que um ou mais tampões contendo isopropanol são utilizados para executar dita purificação por HIC.
  29. 29. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado peto fato de que dita proteína contendo cisteína é um anticorpo.
  30. 30. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 28, caracterizado peto fato de que dita proteína contendo cisteína é um anticorpo selecionado de um anticorpo antiEDB e um anticorpo anti-HER2.
  31. 31. Processo de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que dito anticorpo anti-HER2 é trastuzumab.
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