CN110267983A - 加帽和未加帽抗体半胱氨酸的大规模生产工艺及其在治疗性蛋白缀合中的应用 - Google Patents

加帽和未加帽抗体半胱氨酸的大规模生产工艺及其在治疗性蛋白缀合中的应用 Download PDF

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Abstract

通过操控细胞生长条件来优化生成选择性加帽和未加帽的抗体上半胱氨酸，包括通过培养基组分、批次处理时间或细胞密度故意耗尽细胞培养过程中的半胱氨酸和/或胱氨酸，实现有效产生蛋白，包括抗体‑药物缀合物(ADC)；缀合TNB‑加帽的含半胱氨酸蛋白，这是通过使其与还原剂反应和经反应性连接部分缀合蛋白上还原二硫键与有效载荷，所述还原剂能从蛋白中分离TNB‑加帽部分，而不显著还原抗体链间二硫键。

Description

加帽和未加帽抗体半胱氨酸的大规模生产工艺及其在治疗性 蛋白缀合中的应用
技术领域
本发明的领域是，通过操控细胞生长条件，优化抗体上5-硫代-2-硝基苯甲酸盐(TNB)加帽的半胱氨酸的产生，允许更有效生成抗体药物缀合物(ADC)。
发明背景
抗体药物缀合物(ADC)是通常由抗体组成的一类靶向治疗，所述抗体装有强效的细胞毒性药物(Chudasama等.Nature Chemistry,2016；Junutula和Gerber,ACS medicinalchemistry letters 2016)。因此，ADC提供向肿瘤选择性递送毒性有效载荷的可能性，同时避免脱靶毒性，这通常限制或排除延长治疗期中使用化疗。作为一个有前景的治疗平台，市场上目前有至少2种获批ADC产品(本妥昔单抗(brentuximab vedotin)和曲妥珠单抗(trastuzumab emtansine))。在其指数增长中，ADC应具有大量处于临床评估的治疗候选物。
为使ADC实现其治疗潜能，需要精细的缀合技术以连接细胞毒性药物与抗体。包括2种市售ADC在内的大部分现有ADC候选物采用常规非特异缀合方法，经随机表面赖氨酸或还原的四个链间二硫化物的游离半胱氨酸。这产生高度异质性ADC混合物，不仅带来对生产重复性的挑战，还显著降低治疗指数。
为解决这些问题，ADC领域正移向位点特异性缀合技术，如基于半胱氨酸(Cys)的位点特异性ADC(Junutula等,Nat Biotechnol 2008))。包含工程化的未配对的半胱氨酸残基的强亲核硫醇侧链允许迅速且简单的化学缀合反应以附着多种接头/负荷，从而提供匀质ADC产品。就这些所得ADC分子而言，已报道了更好定义和改善的药代动力学(PK)谱。位点特异性平台有其自身的技术挑战。当在哺乳动物细胞中产生时，所引入半胱氨酸残基上的巯基与游离半胱氨酸或谷胱甘肽(GSH)形成二硫化物。这些所谓的Cys-加帽修饰需要在药物缀合前通过部分还原步骤去除。由于这种处理也使抗体链间二硫化物还原，那些还原的抗体链间二硫化物随后必须通过再氧化过程重新形成，包括透析出还原剂、半胱氨酸或谷胱甘肽，并用氧化试剂处理((Junutula等,Nat Biotechnol 2008)。此繁琐的还原和再氧化过程可能在抗体上引入二硫化物改组及扭曲，这可能对蛋白折叠和蛋白品质产生不利影响，还会导致诸如所得ADC的PK较差等问题。
为解决此潜在问题，开发了使用硝基苯甲酸盐(TNB)的Cys-加帽新型选择性还原策略(参见PCT/IB2016/054789，通过引用纳入本文)，而不影响抗体链间二硫化物。由于其弱氧化还原电位，TNB-加帽(埃尔曼试剂(5,5'-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，DTNB)与半胱氨酸巯基的反应产物)是不稳定加帽。显示还原剂三(3-磺苯基)膦(TSPP)可以选择性去除TNB-加帽，而不还原内源性二硫化物。此TNB/TSPP过程然后进行直接缀合，可消除常规还原-再氧化步骤的严苛条件，使原始抗体折叠保持完整。然而，需要更有效的TNB-加帽方法以优化ADC的商业生产。
发明内容
本发明基于以下发现：抗体上半胱氨酸残基的加帽状态能通过优化参数如细胞生长、细胞密度和/或细胞培养来修饰。因此，本发明涉及哺乳动物细胞中的抗体生产工艺，其中未配对的工程化的半胱氨酸残基保持带有游离巯基的未加帽状态，这允许有效修饰，当各种浓度的二硫代硝基苯甲酸盐(DTNB)在不同细胞培养阶段或细胞密度加入时，通常以硫代硝基苯甲酸盐(TNB)加帽。
本发明还涉及用这些TNB-加帽抗体产生的抗体药物缀合物(ADC)或治疗性蛋白药物缀合物，尤其是通过选择性还原TNB-加帽抗体半胱氨酸残基而形成的ADC，其避免还原链间二硫化物并因而消除对缀合前(再)氧化步骤的需求。本发明仍进一步涉及根据本文所述方法制备的新型硫代硝基苯甲酸盐加帽抗体，这允许用TSPP或相关试剂选择性还原，所述试剂用于直接缀合且缀合效率提高。
更特定地，在本发明中，证明抗体上未配对的表面半胱氨酸的加帽状态能通过仔细操控细胞生长、细胞密度或细胞培养条件来改善。在哺乳动物细胞培养中，半胱氨酸是关键氨基酸，培养基中的半胱氨酸和其氧化型胱氨酸优选用于细胞生长，可能通过氨基酸转运蛋白Xc -(Sato等,J Biol Chem 1999；下图)进行。通过细胞外半胱氨酸/胱氨酸/谷胱甘肽的Cys-加帽反应是个缓慢的过程，且未配对的表面半胱氨酸必然在高细胞密度培养期间保持带有游离巯基的未加帽状态。当向特定阶段的细胞培养物加入DTNB时，产生几乎匀质的TNB-加帽抗体。这些发现提供了产生大量TNB-加帽抗体的可行策略。
此外，细胞培养过程通常设计成确保氨基酸如半胱氨酸和其等价物不受限或耗尽，以使细胞生长、活细胞密度和效价最高并防止氨基酸取代(即氨基酸错掺)(参见美国专利号8,232,075B)。L-半胱氨酸和其氧化型式L-胱氨酸被视作哺乳动物细胞培养中的关键氨基酸，因为从甲硫氨酸转化产生半胱氨酸对细胞生长、细胞代谢和产率而言是限速的。然而，本发明中，对细胞培养而言可用的数种故意限制或耗尽半胱氨酸/胱氨酸量的方法用于促进带TNB的抗体上半胱氨酸残基的合适加帽状态。
因此，在本发明的一个实施方案中，提供产生含半胱氨酸蛋白的工艺，所述蛋白能缀合化学有效载荷，所述工艺包括以下步骤：(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包含选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分；(b)温育细胞以达到足以耗尽生长培养基中所存在大部分生长组分的细胞密度；和(c)进一步温育细胞以表达含半胱氨酸蛋白，该蛋白具有一个或多个包含游离巯基的未加帽半胱氨酸残基。此工艺还可包括以下步骤：(d)将预先确定的加帽部分或其前体引入到表达的含半胱氨酸蛋白，其中蛋白上的一个或多个半胱氨酸用预先确定的加帽部分加帽。在此实施方案中，达到的细胞密度通常是至少约1E6细胞/mL，且可以是例如至少约：5E6细胞/mL,10E6细胞/mL,50E6细胞/mL,10E6细胞/mL或500E6细胞/mL，优选高于10E6细胞/mL，更优选高于50E6细胞/mL。
应注意预先确定的加帽部分可以是烷化剂，在一些情况中用作TNB以外的化学“支链(handle)”或用于药物缀合化学其他类型的类似不稳定部分。这些支链如下附加到抗体：向培养基加入新型烷化化学间隔剂。烷化化学间隔剂包含化学支链如醛、酮、叠氮化物和炔烃。在酮和醛的情况中，这些化学支链能与氨氧基亲核试剂或酰肼反应以用于其它缀合化学，形成肟/腙产物。在叠氮化物和炔烃的情况中，这些化学支链能允许环加成缀合。额外的烷化化学间隔剂包括生物素的功能域，这允许链霉亲和素与生物素之间的特异性紧密非共价相互反应。参见WO2017/025897的实施例4，其讨论化学支链马来酰亚胺三氧杂-4-甲酰苯甲酰胺(MTFB)、二苯并环辛基-聚乙烯马来酰亚胺(DBCO-PEG4-马来酰亚胺)和马来酰亚胺-PEG2-生物素(MPB)。
本发明的另一个实施方案包括产生含半胱氨酸蛋白的工艺，所述蛋白能缀合化学有效载荷，所述工艺包括以下步骤：(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包括选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分；(b)温育细胞以表达含半胱氨酸蛋白，该蛋白具有一个或多个含游离巯基的未加帽半胱氨酸残基；和(c)在步骤(a)、步骤(b)或步骤(a)和(b)中，维持一种或多种生长组分浓度低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM。此工艺还可包括以下步骤：(d)将预先确定的加帽部分或其前体引入到表达的含半胱氨酸蛋白，其中蛋白上的一个或多个半胱氨酸用预先确定的加帽部分加帽。
另一个实施方案包括产生含半胱氨酸蛋白的工艺，所述蛋白能缀合化学有效载荷，所述工艺包括以下步骤：(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包括选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分，包括但不限于其中初始生长组分浓度低于2mM、低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM，和随后(b)温育细胞以表达含半胱氨酸蛋白，该蛋白具有一个或多个含游离巯基的未加帽半胱氨酸残基。此工艺还可包括以下步骤：(c)将预先确定的加帽部分或其前体引入到表达的含半胱氨酸蛋白，其中蛋白上的一个或多个半胱氨酸用预先确定的加帽部分加帽。
本发明还包括实施方案，其中通过在过程中故意限制半胱氨酸和/或其替代形式而耗尽细胞培养物内的生长组分。使用US 8,232,075B中教导的合理培养基设计和化学计量方法，特定峰值细胞密度所需的半胱氨酸/胱氨酸要求量和所生成产品量能通过以下方程式来计算(方程式1)。此方程式对CHO培养物通用，且可以通过测定细胞系在给定工艺中的半胱氨酸消耗速率产生用于特定细胞系的更具体的方程式。
方程式1.所需半胱氨酸浓度
所需半胱氨酸浓度＝[(x*m)+(x*m*k)+(p*n)]*f
x:E6细胞/mL所需的半胱氨酸浓度(0.09mM)
m:峰值细胞密度(E6细胞/mL)
k:维护系数(10-15％)
p:1g/L抗体所需的半胱氨酸浓度(0.19mM)
n:终抗体浓度(1g/L)
f:安全系数(1.1-1.3)
测定特定细胞系在给定工艺中的半胱氨酸所需量后，分数半胱氨酸限制比(fractional cysteine limitation ratio)方程式能用于确定半胱氨酸/胱氨酸的量以在工艺中提供，目标是特定限制比(方程式2)，用于故意限制或耗尽培养物中的半胱氨酸/胱氨酸。在本发明的实施方案中，通过将细胞生长培养基的分数半胱氨酸限制比限到小于1.0x，来耗尽生长组分。这些比可以是例如约：0.95x、0.90x、0.85x、0.80x、0.75x、0.70x、0.65x、0.60x、0.55x、0.50x、0.45x、0.40x、0.35x、0.30x、0.25x、0.20x、0.15x、0.10x或0.05x。
方程式2.分数半胱氨酸限制比
当然，本发明的含半胱氨酸蛋白包括各种部分，包括但不限于抗体和融合蛋白。这些可以是抗-EDB抗体和抗-HER2抗体，包括曲妥珠单抗。
在本文所述的工艺中，预先确定的加帽部分可选自5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)、2-巯基吡啶、二硫代联吡啶(DTDP)、4-硫代苯甲酸、2-硫代苯甲酸、4-硫代苯磺酸、2-硫代苯磺酸、磺酸甲酯(methyl sulfonate，Ms)、对甲苯磺酸盐(p-toluenesulfonate，Ts)和三氟甲基磺酸盐(trifluoromethanesulfonate，Tf)；和/或预先确定的加帽部分可选自由以下组成的反应基：带有醛支链马来酰亚胺三氧杂-4-甲酰苯甲酰胺(MTFB)样分子或带有叠氮化物支链的马来酰亚胺叠氮基-赖氨酸样分子，或带有炔烃支链的二苯并环辛基-聚乙烯马来酰亚胺(DBCO-PEG4-马来酰亚胺)样分子。通常，预先确定的加帽部分是TNB，前体通常是DTNB。
同样在本文所述的工艺中，加帽蛋白进行由在工艺中的一个或多个不同的点分离、纯化和浓缩的一种或多种组成的进一步加工。因此，在发明的某些实施方案中，将至少50％细胞与表达的含半胱氨酸蛋白分离，然后引入预先确定的加帽部分或其前体。此分离可通过离心或过滤来完成。
本发明还提供用于缀合TNB-加帽(或另外加帽)含半胱氨酸蛋白的实施方案，包括以下步骤：(a)使TNB-加帽的含半胱氨酸蛋白与还原剂反应，所述还原剂能使TNB-加帽部分与蛋白脱离而不显著还原抗体链间硫键；(b)过滤反应混合物以去除过量还原剂、脱离的TNB，或两者都有；和(c)不引入氧化剂，经反应性连接部分将抗体上的一个或多个还原硫键与有效载荷缀合。
本发明还提供用于缀合TNB-加帽的(或其他加帽的)含半胱氨酸蛋白的实施方案，包括以下步骤：(a)使TNB-加帽的含半胱氨酸蛋白与化学计量过量的还原剂反应，所述还原剂能使TNB-加帽部分与蛋白脱离而不显著还原抗体的链间硫键，任选地，存在盐如氯化钠或其它盐(参见实施例8)；(b)过滤反应混合物以去除过量一种或多种过量还原剂、脱离的TNB；(c)引入氧化剂以修复过量还原剂导致的还原的抗体链间硫键；和(d)经反应性连接部分缀合抗体上一个或多个还原硫键与有效载荷。化学计量过量通常是还原剂与加帽半胱氨酸残基的比约4:1-6:1(例如，就带有4个加帽半胱氨酸的抗体而言，还原剂与抗体的比为16:1-24:1)，优选约5:1。此工艺的步骤(c)能在环境温度进行，例如约25摄氏度，以缩短氧化时间和避免工艺温度变化。在低温如约4摄氏度进行，需要更长的氧化时间，但如果超过目标氧化时间，则对产量损失不太敏感。上述工艺可进一步包括步骤：(e)在步骤(d)后加入过量半胱氨酸以阻断(quench)连接部分的反应；和(f)分离经阻断的接头-有效载荷与缀合物。半胱氨酸阻断允许通过层析或透析过滤来提高接头-有效载荷分离。此外，上述工艺中，分离可通过透析过滤或柱层析来进行，通常是疏水作用层析(HIC)。使用含异丙醇缓冲液以实施HIC纯化，引起纯化的缀合物回收增加。
附图说明
图1.通过常规CD CHO培养基中高细胞密度的稳定CHO表达来产生完全未加帽的半胱氨酸突变抗体。以3E6细胞/ml或6E6细胞/ml的密度将稳定表达曲妥珠单抗半胱氨酸突变K290C-K334C或K392C-K334C的CHO-K1细胞接种于CD CHO培养基，并在37摄氏度培养72小时。条件培养基经ProA柱和尺寸排阻柱(SEC)纯化。纯化的抗体蛋白如实施例1所述进行LC/MS分析。
图2.具有DTNB的CHO培养基中稳定CHO细胞系的高细胞密度培养条件。以0.6E6细胞/mL的密度将稳定表达曲妥珠单抗半胱氨酸突变K183C-K290C的CHO-K1细胞接种于受控补料分批生物反应器中专有基础培养基，如实施例1所述。A幅显示基础培养基、补料培养基或DTNB的培养条件。B幅显示活细胞密度(VCD)和培养物活力。
图3.通过在有DTNB的CHO培养基中高细胞密度的稳定CHO表达来产生Fc K290C位点处完全TNB-加帽的半胱氨酸突变抗体。来自图2所述的培养条件的条件培养基经ProA柱/SEC纯化，抗体曲妥珠单抗半胱氨酸突变K183C-K290C用IDES(A幅)消化并如实施例1所述进行LC/MS分析。
图4.通过在有DTNB的CHO培养基中高细胞密度的稳定CHO表达来产生Fab K183C位点处完全TNB-加帽的半胱氨酸突变抗体。来自图2所述培养条件的条件培养基经ProA柱/SEC纯化，抗体曲妥珠单抗半胱氨酸突变K183C-K290C用IDES消化并如实施例1所述进行LC/MS分析。
图5.在具有DTNB的HiPDOG和补料分批工艺中稳定CHO表达的高细胞密度培养条件。以2E6细胞/mL的密度将稳定表达曲妥珠单抗半胱氨酸突变K183C-K290C的CHO-K1细胞接种于受控补料分批生物反应器中的专有基础培养基。A幅显示基础培养基、补料培养基或DTNB的培养条件。B幅显示活细胞密度(VCD)。
图6.通过在有DTNB的CHO培养基中高细胞密度的稳定CHO表达来产生完全未加帽的半胱氨酸突变抗体。来自图5所述的培养条件的条件培养基经ProA柱/SEC纯化，抗体曲妥珠单抗半胱氨酸突变K183C-K290C用IDES消化并进行LC/MS分析(A幅)。B幅显示加帽数据汇总表。
图7.所产生的曲妥珠单抗半胱氨酸突变K183C-K290C抗体的TNB-加帽。加帽通过LC/MS分析确定，显示突变半胱氨酸残基的加帽种类。半胱氨酸突变抗体用专有基础和补料培养基以高细胞密度培养产生，所述培养基故意耗尽半胱氨酸/胱氨酸。在生产批次中向培养物加入DTNB补料。来自培养物的条件培养经ProA纯化，然后进行LC/MS分析。生成的主要种类(>95％)是想要的有4个TNB完全加帽的mAb；存在带有小于4个TNB的低水平混合种类。
图8.补料培养基中具有高和低半胱氨酸/胱氨酸浓度的条件的半胱氨酸谱。通过UPLC进行氨基酸分析来获得浓度；获自UPLC分析的胱氨酸浓度由化学计量转换成半胱氨酸。2种条件都使用稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞，并在用专有基础和补料培养基的1L实验室规模生物反应器中运行。2种条件都具有基础培养基中类似的半胱氨酸/胱氨酸起始浓度，补料培养基中的胱氨酸浓度不同。来自各条件的条件培养基样品从第4天开始分析以获得整批中半胱氨酸/胱氨酸耗尽时程。
图9.具有高和低补充胱氨酸浓度的半胱氨酸谱。由UPLC进行氨基酸分析来获得浓度；获自UPLC分析的胱氨酸浓度由化学计量转换成半胱氨酸。所有条件都使用稳定表达半胱氨酸突变抗体抗EDB K183C-K290C的CHO-K1细胞，并在用专有基础和补料培养基的1L实验室规模生物反应器中运行。所有条件在每个接种密度条件下都具有基础培养基中类似的半胱氨酸/胱氨酸起始浓度。来自各条件的条件培养基样品从第0天开始分析以获得整批中半胱氨酸/胱氨酸耗尽时程。
图10.具有目标分数半胱氨酸限制比的条件的半胱氨酸谱。由UPLC进行氨基酸分析来获得浓度；获自UPLC分析的胱氨酸浓度由化学计量转换成半胱氨酸。所有条件都使用稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞，并在用专有基础和补料培养基的1L实验室规模生物反应器中运行。用上述方程式1和2来确定分数半胱氨酸限制比；条件在其各自培养基中都具有不同水平的胱氨酸，目标是所需的分数半胱氨酸限制比。来自各条件的条件培养基样品从第4天开始分析以获得整批中半胱氨酸/胱氨酸耗尽时程。
图11.高和低峰值细胞密度条件的活细胞密度和半胱氨酸浓度谱。高和低峰值细胞密度用稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞实现。2种条件都在1L实验室规模生物反应器中用专有基础和补料培养基运行；尽管2种条件的一些工艺参数不同以达到并维持不同峰值密度，但半胱氨酸/胱氨酸浓度在基础培养基中类似且在补料培养基中相同。A幅显示活细胞密度。B幅显示批次中的半胱氨酸浓度。来自各条件的条件培养基样品从第0天开始分析以获得整批中半胱氨酸/胱氨酸耗尽时程。氨基酸分析由UPLC进行；获自UPLC分析的胱氨酸浓度由化学计量转换成半胱氨酸。
图12.向条件培养基添加DTNB的粗DAR4结果。稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞在1L生物反应器中培养，使用专有基础和补料培养基。生物反应器中培养达到批次处理时间的特定时间点后，细胞通过离心和0.2μm过滤而与条件培养基分离。条件培养基转至单独容器并给予2mM DTNB剂量，温育不同时间长度。不同温育时间的样品经ProA纯化并用TNB缀合基础工艺缀合(参见实施例5)，测定粗DAR4百分比，其用作完全TNB-加帽抗体的替代标记。
图13.向条件培养基添加DTNB的粗DAR4结果。稳定表达半胱氨酸突变抗体抗EDBK183C-K290C的CHO-K1细胞在1L生物反应器中培养，使用专有基础和补料培养基。生物反应器中培养达到批次处理时间的特定时间点后，细胞通过离心和0.2μm过滤而与条件培养基分离。条件培养基转至单独容器并给予2mM DTNB剂量，温育不同时间长度。不同温育时间的样品经ProA纯化并用TNB缀合基础工艺缀合(参见实施例5)，测定粗DAR4百分比，其用作完全TNB-加帽抗体的替代标记。
图14.还原后缓冲液更换的影响。TNB-加帽的曲妥珠单抗K183C-K290C抗体用6当量的TSPP还原(37℃持续3小时)，缀合不同量的mcvcPABC0101；正方形：还原后缓冲液更换，菱形：无缓冲液更换。％DAR4通过分析性疏水作用层析测量。
图15.再氧化步骤的影响。用20当量TSPP还原、缓冲液更换和缀合10当量mcvcPABC0101后，分析性疏水作用层析的痕迹(在280nm检测)；黑色痕迹：无再氧化，灰色痕迹：缀合前用脱氢抗坏血酸再氧化。过度缀合的种类产生自缀合还原的链间二硫键。
图16.半胱氨酸突变抗EDB抗体K183C-K290C和半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的粗缀合物比较。缀合物根据下面实施例9所述操作产生并通过分析性疏水作用层析分析(在280nm检测)。
图17.半胱氨酸突变曲妥珠单抗缀合物的疏水作用层析纯化。粗缀合物根据实施例9所述过程制备并用实施例14所述柱和条件纯化。
发明详述
一般程序
细胞培养方法
本文所用的术语“培养物”和“细胞培养物”指细胞群，其在适合细胞群存活和/或生长的条件下悬于培养基。如本领域普通技术人员所清楚了解的，在一些实施方案中，本文所用的这些术语指含细胞群与该群悬浮其中的培养基的组合。在一些实施方案中，所述细胞培养物的细胞包括哺乳动物细胞。
本发明可使用适合所需工艺(如生成重组蛋白(例如抗体))的任何细胞培养方法。作为非限制性示例，细胞可以分批或补料分批培养生长，其中培养在充足表达重组蛋白(例如抗体)后终止，之后收获表达的蛋白(例如抗体)。或者，作为另一非限制性示例，细胞可以以分批-再补料生长，其中培养未终止且新营养物和其它组分定期或连续加入培养物，其中定期或连续收获表达的重组蛋白(例如抗体)。其它合适方法(如旋转管培养)为本领域已知并能用于实施本发明。
在一些实施方案中，适合本发明的细胞培养是补料分批培养。本文所用的术语“补料分批培养”指细胞培养方法，其中在培养过程开始后的一个或多个时间向培养物提供额外组分。这类提供的组分通常包括用于细胞的营养组分，其在培养过程中耗尽。补料分批培养一般在一些点停止，收获和任选地，纯化培养基中的细胞和/或组分。在一些实施方案中，所述补料分批培养包括补充有补料培养基的基础培养基。在一些实施方案中，通过使用高端pH-控制递送葡萄糖(HiPDOG工艺)来维持低水平乳酸，如Gagnon等所公开。
在一些实施方案中，适合本发明的细胞培养是灌注工艺。本文所用的术语“灌注”指细胞培养方法，其中细胞接受接种基础培养基，且在细胞达到想要的细胞密度的点，开始细胞灌注，从而用尽的培养基(spent medium)被新鲜培养基取代。灌注工艺允许培养物达到高细胞密度，并因而能生成大量产物。然而，至少一些灌注工艺形式需要提供大量培养基并导致一部分产物包含于大体积用尽的培养基，而不是浓缩于单一收获物。
本文所用的术语“生物反应器”指用于原核或真核细胞培养物(如哺乳动物细胞培养物)生长的任何容器。生物反应器可以是任何尺寸，只要其对培养细胞(如哺乳动物细胞)有用。细胞可以由实施者选定的任何方便体积生长。例如，细胞可在小规模反应容器中生长，体积范围从数毫升到数升。或者，细胞可在大规模商业生物反应器中生长，体积范围从约至少1升到10、50、100、250、500、1000、2500、5000、8000、10000、12000、15000、20000或25000升或更多，或之间的任何体积。
在一些实施方案中，所述细胞可在初始生长期(或生长期)中生长，持续更长或更少的时间，这取决于实施者的需求和细胞本身的要求。在一些实施方案中，所述细胞生长的时间段足以达到预先确定的细胞密度。在一些实施方案中，所述细胞生长的时间段足以达到是最大细胞密度给定百分比的细胞密度，最大细胞密度是细胞若允许不受干扰生长则会最终达到的程度。例如，细胞生长的时间段足以达到想要的活细胞密度，为百分之1、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或99的最大细胞密度。在一些实施方案中，所述细胞生长，直至细胞密度不增加超过15％、14％、13％、12％、11％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％或1％每培养日。在一些实施方案中，所述细胞生长，直至细胞密度不增加超过5％每培养日。
在一些实施方案中，所述细胞允许生长确定时间段。例如，根据细胞培养的起始浓度、细胞生长的温度和细胞的内在生长率，细胞可生长0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天，优选4-10天。在一些情况中，所述细胞可允许生长一个月或更长。本发明的实施者能够选择初始生长期的持续时间，这取决于蛋白生成要求和细胞本身需求。
在一些实施方案中，所述细胞可维持于后续生产期，直至达到想要的细胞密度或生产效价。在本发明的另一个实施方案中，所述细胞允许在后续生产期中生长确定时间段。例如，根据后续生长期开始时的细胞培养浓度、细胞生长的温度和细胞的内在生长速率，细胞可生长1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多天。在一些情况中，所述细胞可允许生长一个月或更长。本发明的实施者能够选择后续生产期的持续时间，这取决于多肽或蛋白生成要求和细胞本身需求。
在一些实施方案中，所述细胞表达重组蛋白且本发明的细胞培养方法包括生长期和生产期。
细胞
易受细胞培养影响的任何细胞可根据本发明使用。在一些实施方案中，所述细胞是哺乳动物细胞。可根据本发明使用的哺乳动物细胞非限制性示例包括BALB/c小鼠骨髓瘤系(NSO/l,ECACC No:85110503)；人成视网膜细胞(PER.C6,CruCell,荷兰莱顿)；用SV40转化的猴肾CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651)；人胚肾系(亚克隆用于悬浮培养生长的293或293细胞,Graham等,J.Gen Virol.,36:59,1977)；幼仓鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10)；中国仓鼠卵巢细胞+/-DHFR(CHO,Urlaub和Chasin,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4216,1980)；小鼠塞尔托利细胞(TM4,Mather,Biol.Reprod.,23:243-251,1980)；猴肾细胞(CV1ATCC CCL70)；非洲绿猴肾细胞s(VERO-76,ATCC CRL-1 587)；人宫颈癌细胞(HeLa,ATCC CCL 2)；犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL 34)；布法罗大鼠肝细胞(BRL 3A,ATCC CRL 1442)；人肺细胞(W138,ATCC CCL 75)；人肝细胞(Hep G2,HB 8065)；小鼠乳腺肿瘤(MMT 060562,ATCCCCL51)；TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.Sci.,383:44-68,1982)；MRC 5细胞；FS4细胞；和人肝癌细胞系(Hep G2)。在一些优选实施方案中，所述细胞是CHO细胞。在一些优选实施方案中，所述细胞采用谷氨酰氨合成酶(GS)基因表达系统。
此外，任何数目的商业及非商业可用杂交瘤细胞系能根据本发明使用。本文所用的术语“杂交瘤”指细胞或细胞后代，其产生自永生化的细胞和抗体生成细胞的融合。这类所得杂交瘤是生成抗体的永生化的细胞。用于产生杂交瘤的个体细胞能来自任何哺乳动物来源，包括但不限于大鼠、猪、兔、绵羊、山羊和人。在一些实施方案中，杂交瘤是三源杂交瘤细胞系，其在异源杂交骨髓瘤融合后代随后与浆细胞融合时产生，所述异源杂交骨髓瘤融合是人细胞与鼠骨髓瘤细胞系之间融合的产物。在一些实施方案中，杂交瘤是生成抗体的任何永生化的杂交细胞系，例如四源杂交瘤(参见例如Milstein等,Nature,537:3053,1983)。本领域技术人员应理解杂交瘤细胞系可能有不同营养需求和/或可能要求不同培养条件以用于最佳生长，且能按需修改条件。
细胞生长和产率
本文所用的高细胞密度指高于1E6细胞/mL、5E6细胞/mL、10E6细胞/mL、50E6细胞/mL、100E6细胞/mL或500E6细胞/mL的细胞密度，优选高于10E6细胞/mL，更优选高于50E6细胞/mL。
在一些实施方案中，细胞生长由活细胞密度(VCD)、最大活细胞密度或综合活细胞计数(IVCC)确定。在一些实施方案中，细胞生长由最大活细胞密度确定。
本文所用的术语“活细胞密度”指给定体积培养基中存在的细胞数。活细胞密度能通过技术人员已知的任何方法测量。优选地，活细胞密度用自动细胞计数器测量，如Bioprofile(Nova Biomedical,Waltham,MA)。本文所用的术语最大细胞密度指细胞培养中实现的最大细胞密度。本文所用的术语“细胞活力”指培养细胞在一组给定培养条件或实验变化下存活的能力。本领域普通技术人员应理解，确定细胞活力的许多方法的一种涵盖于本发明。例如，可使用染料(如锥虫蓝)，所述染料不穿过活细胞膜，但能穿过死亡或濒死细胞的受破坏的膜，用于确定细胞活力。
本文所用的术语“综合活细胞计数(IVCC)”指活细胞密度(VCD)曲线下面积。IVCC能用下式计算：
IVCCt+1＝IVCCt+(VCDt+VCDt+1)*(Δt)/2
其中，Δt是t与t+1时间点之间的时间差。IVCCt＝0能假定为可忽略的。VCDt和VCDt+1是在t与t+1时间点的细胞密度。
在上述方法的一些实施方案中，所述产率通过效价和/或体积产率确定。
本文所用的术语“效价”指例如，给定量培养基体积中由细胞培养物生成的重组表达蛋白总量。效价通常以每升培养基的蛋白克数为单位表达。
在上述方法的一些实施方案中，所述产率通过效价确定。在一些实施方案中，所述产率相较对照培养物增加至少5％、10％、15％、20％或25％。在一些实施方案中，所述产率相较对照培养物增加至少10％。在一些实施方案中，所述产率相较对照培养物增加至少20％。
细胞培养基
本文所用的术语“培养基”、“细胞培养基”和“培养基(culture medium)”指含组分或营养物的溶液，所述组分或营养物滋养生长的哺乳动物。通常，营养物包括就最低生长和/或存活而言，细胞所需的必需氨基酸和非必需氨基酸、维生素、能源、脂质和微量元素。这种溶液也可包含进一步的营养物或补充组分，其在最低速率上增强生长和/或存活，包括但不限于激素和/或其它生长因子、特定离子(如钠、氯化物、钙、镁和磷酸盐)、缓冲液、维生素、核苷或核苷酸、微量元素(无机化合物通常以极低终浓度存在)、以终浓度存在的无机化合物(如铁)、氨基酸、脂质和/或葡萄糖或其它能源。在一些实施方案中，培养基有利地配制到对细胞存活和增殖最优的pH和盐浓度。在一些实施方案中，培养基是在细胞培养开始后加入的补料培养基。
测量氨基酸浓度的方法
氨基酸浓度能通过技术人员已知的任何方法测量。以在线或离线方法测量氨基酸浓度的优选方法包括例如液相色谱如HPLC、UPLC或LCMS、NMR或GCMS。
在一些实施方案中，所述氨基酸浓度离线测量，这是通过取细胞培养基样品和测量所述样品中所述至少一种氨基酸的浓度。在一些实施方案中，所述氨基酸浓度如实施例3.1、3.2和3.3所公开测量。以离线方法测量氨基酸浓度的优选方法是UPLC。
在一些实施方案中，所述氨基酸浓度在线测量。在一些实施方案中，所述氨基酸浓度用拉曼光谱学在线测量。在一些实施方案中，所述氨基酸浓度在线测量，使用带自动取样器的基于HPLC或UPLC的技术，所述取样器从反应器中抽样并以程序化的方式转至设备。
WO2015/140708所述的其它程序也可用于本发明，并通过引用纳入本文。
测量药物与抗体的比的方法
药物与抗体的比(DAR)能通过技术人员已知的任何方法测量。测量DAR的优选方法包括例如液相色谱如HPLC、UPLC或LCMS、质谱和NMR。
在一些实施方案中，DAR如下测量：取缀合混合物、色谱级分或其它纯化材料的样品，并测量所述样品中的所述浓度。测量DAR的优选方法是疏水作用色谱(HIC HPLC)和反相HPLC。
其它定义
除了上面提供的定义，提供以下额外定义：
如所提供的实施例所公开的，CHO在本文中描述为中国仓鼠卵巢(CHO)细胞，其源自用于产生治疗蛋白的中国仓鼠卵巢。CHO-K1在本文中描述为宿主祖细胞系，亚克隆自亲代CHO细胞系，包含市售获自龙沙(Lonza)的谷氨酰氨合酶(GS)基因表达系统。
本文所用的HiPDOG指“高末端pH-控制递送葡萄糖”(HiPDOG)，是由上升的pH引发的递送浓缩葡萄糖溶液的营养补料方法，抑制细胞培养物中的乳酸盐积聚。
本文所用的术语mAb指单克隆抗体。
本文所用的术语DAR4指4:1的药物与抗体比率，其中4个药物有效载荷连接1个蛋白(例如，参见描述一个这种例子的下图，其中“R”代表有效载荷)。术语粗DAR4描述缀合过程后但在最终纯化步骤前的药物与抗体的比。
本文所用的术语UF/DF指超滤/透析过滤。
下列实施例阐明本发明的重要特征。
实施例1：通过常规CD CHO培养基中高细胞密度的稳定CHO表达来生成完全未加帽的半胱氨酸突变抗体
CHO-K1细胞稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K290C-K334C或K392C-K334C，该细胞以3E6细胞/ml或6E6细胞/ml的密度接种于常规CD CHO培养基(Thermo Fisher,Waltham,MA)，并在37摄氏度，5％CO2的加湿培养箱中生长和维持。在一种情况下，向CD CHO培养基加入5mM胱氨酸。细胞在37摄氏度培养72小时。测量细胞活力并收获条件培养基。大于98％的细胞是有活力的。
抗体蛋白经ProA和尺寸排阻柱如下纯化。条件培养基用0.2μm滤器过滤并通过用50mM Tris、150mM NaCl、pH 7.5(TBS)预平衡的蛋白A树脂(GE Healthcare,Piscataway,NJ)。柱用2个柱体积(CV)的TBS，5CV CaCl2，pH 7.5，3CV 10mM Tris，10mM NaCl，pH 7.5洗涤，然后蛋白用100％步骤的150mM甘氨酸，40mM NaCl，pH 3.5洗脱。蛋白用2M HEPES,pH8.0调至pH 7.0，且蛋白加样到用PBS(137mM NaCl、2.7mM KCl、8.1mMNa2HPO4、2.7mMKH2PO4，pH 7.2)平衡的Superdex 200柱。收集峰级分，用50kDa MWCO离心装置浓缩至10mg/mL。
通过质谱就Cys-加帽状态量度分析蛋白样品如下。液相色谱质谱(LC/MS)分析用偶联Agilent(Santa Clara,CA)1200毛细管HPLC的WatersXevo Q-TOF G2质谱仪(Waters,Milford,MA)进行。蛋白样品用IdeS蛋白酶(Promega,Madison,WI)室温处理2小时。蛋白样品用0.05％TFA(Sigma-Aldrich,St Louis,MO)稀释来酸化，然后是液相色谱质谱分析。样品在Waters BEH300C4,1.7μm(1.0x 50mm)柱上分离，以65μl/min流速维持于80℃。流动相A是带有0.05％TFA的水，流动相B是带有0.05％TFA的乙腈。蛋白从柱中洗脱，使用梯度：0.5min内的2％-20％B，6min内的20％-40％B以及4min内的40％-100％B。质谱仪以仅MS阳性模式运行，扫描从800到3500m/z，数据用MassLynx(Waters)4.1软件获取。汇总对应抗体的TOF-MS信号并用MaxEnt1(Waters)程序去卷积。半胱氨酸和谷胱甘肽加帽种类用质量位移(Cys:119.004Da,GSH:305.068Da)确定。
如图1所示，对于CD CHO培养基，当向培养基加入5mM胱氨酸时，半胱氨酸突变抗体完全半胱氨酸化。在常规CD CHO培养基中，CHO细胞在3E6细胞/mL细胞密度产生基本未加帽的半胱氨酸突变蛋白。当CHO细胞增加到6E6细胞/mL时，生成完全未加帽的半胱氨酸突变抗体，表明培养基中的大部分胱氨酸用于细胞生长。细胞密度增加能耗尽培养基的胱氨酸并最终影响未配对的表面半胱氨酸的加帽状态。
实施例2：通过常规CHO培养基中高细胞密度的稳定CHO来产生完全TNB-加帽的半胱氨酸突变抗体
如实施例1所示，高密度的细胞生长能消耗培养基中的大量半胱氨酸或胱氨酸。最终生成完全未加帽的半胱氨酸突变抗体。基于实施例1，这允许大量生成完全TNB-加帽半胱氨酸突变抗体，这是通过在不同时间点向细胞培养物加入各种浓度的DTNB。DTNB有效烷基化未加帽的突变抗体上的游离巯基，导致生成TNB-加帽抗体。
因此，CHO细胞系稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C，该细胞系接种于受控补料分批生物反应器(Applikon,Inc.,Schiedam,Netherlands)，初始工作体积为1L。如所示，运行8种条件，评估基础培养基中不同浓度的半胱氨酸和/或胱氨酸，如图2A所示。补料分批过程以0.6E6细胞/mL接种，并用基于培养体积的固定百分比营养补料控制，从第3天开始给予；生成TNB-加帽抗体的条件使用没有半胱氨酸和胱氨酸的补料培养基。在第7天，向培养物加入1mM DTNB，且细胞培养再继续5天。
如图2B所示，细胞加倍和活力在所测试的全部条件下正常。
当纯化抗体蛋白时，对其进行Cys-加帽分析。如图3A所示，抗体由Ides蛋白酶消化以生成Fc片段和Fab2片段。混合物如上面实施例1所述通过LC/MS分析。如图3B所示，对于更少溶剂暴露的Fc-定位的K290C位点，所有加入TNB的条件(运行2-8)生成>95％TNB-加帽材料。如图4所示，对于更多溶剂暴露的轻链定位的Fab K183C位点，加入TNB的条件(运行5-8)也主要产生TNB-加帽材料。
为进一步提高TNB-加帽效率，测试细胞密度更高的培养条件。采用控制葡萄糖的HiPDOG工艺以更好控制乳酸(Gagnon等,Biotechnol Bioeng2011)。具有接种密度和半胱氨酸/胱氨酸培养基密度的实验条件如图5A所示。控制乳酸的HiPDOG工艺(运行3)生成显著高于对应补料分批条件(运行7)的峰值细胞密度(图5B)。
抗体纯化自条件培养基并通过LC/MS进行Cys-加帽分析。如图6所示，Fab K183C位点就条件运行3-7而言实现约95％TNB-加帽，而K290C位点就条件运行3-7而言实现约98％TNB-加帽。
实施例3：在目标是有限半胱氨酸/胱氨酸暴露的过程中生成完全TNB-加帽的半胱氨酸突变抗体
在以下实施例中，半胱氨酸突变抗体的加帽效率读数由粗DAR4(药物与抗体比率)百分比表示，其在接头-有效载荷缀合抗体后、终纯化前获得。粗DAR4值用于这些实施例作为加帽效率的替代标记；然而，确定抗体上各突变半胱氨酸残基的加帽状态能通过更漫长的LC/MS分析(描述于实施例1)确定，然后是缀合过程。LC/MS分析的实施例可见图7，其中每抗体的不同加帽种类被鉴定和定量。用于此分析的样品是有DTNB补料的低半胱氨酸/胱氨酸工艺以生成TNB-加帽抗体。想要的目标种类是每抗体4个TNB，其在此特定实施例的LC/MS结果中占>95％，该实施例有低水平的非可还原帽和一些低于4的抗体种类。
实施例3.1：通过减少补料培养基中配制的浓度来故意限制培养物的半胱氨酸/胱氨酸
方法1：此实施例证明通过减少补充加料培养基中配制的任一组分含量，故意限制培养物的半胱氨酸和/或胱氨酸浓度。用于此实施例的2种条件在基础培养基中具有类似的半胱氨酸和/或胱氨酸起始浓度；然而，一种条件在营养补料培养基中没有半胱氨酸或胱氨酸组分，而第二条件使用仅含胱氨酸的补料培养基(表1)；2种条件的所有其它工艺参数相同。标准哺乳动物细胞培养工艺在额外补充加料中纳入半胱氨酸和/或胱氨酸，这是由于细胞培养基中这些组分的溶解度变化。
对于此实施例，稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞与专有的基础培养基和补料培养基一起在1L Applikon生物反应器(Applikon,Inc.,Schiedam,Netherlands)中使用，用带蠕动泵和气体质量流量控制器模块的BioNet模块化控制器(Broadley-James Corp.,Irvine,CA)操作。培养物以约2E6细胞/mL接种，温度维持于约37摄氏度，而pH通过加入碳酸钠/钾溶液或CO2来控制到接近7.0。溶解氧水平通过鼓泡纯氧来控制到>20％空气饱和。为了抗体的TNB-加帽，在生长期后开始DTNB补料，目标是生物反应器中的4mM DTNB浓度范围。如下所提供实施例的批次处理时间是约12天。
标准化的粗DAR4值显示，从补料培养基去除胱氨酸被证明是耗尽培养物中可用半胱氨酸/胱氨酸的成功方法，其进而允许抗体用TNB更好加帽和更高百分比的DAR4抗体-药物缀合物，而没有对细胞生长或产率产生有害影响。
表1.方法1-曲妥珠单抗K183C-K290C的半胱氨酸和胱氨酸培养基浓度以及粗DAR4
Acquity UPLC(Waters Corp,Milford,MA)用于后续实验中条件的氨基酸分析，其中对照条件是在第7、9和11天给予0.5mM半胱氨酸以避免每个合理(rational)培养基设计中任何批次点的胱氨酸限制，如前所述(表2)；就TNB-加帽而言所用DTNB目标浓度是5mM。所有其它工艺参数与表1的上述实验相同。
表2.方法1-曲妥珠单抗K183C-K290C的半胱氨酸和胱氨酸培养基浓度以及耗尽时间
结果清楚地说明，对于此特定实施例，从补料培养基去除半胱氨酸/胱氨酸在第6-7天之间不导致培养物中半胱氨酸/胱氨酸浓度耗尽；获自UPLC分析的胱氨酸浓度化学计量转换成半胱氨酸并图示于图8。
应理解此特定实施例的批次处理时间仅为通过第5天，过量半胱氨酸/胱氨酸在运行4的培养物中存在，导致抗体的TNB-加帽欠佳。此示例中，延长批次处理时间到第8天或更后面是耗尽半胱氨酸/胱氨酸的有效方法，产生用于最优TNB-加帽的合适环境。
另外，应理解可以实施培养基交换策略如灌注以在工艺后面的运行4培养物中耗尽半胱氨酸/胱氨酸。半胱氨酸/胱氨酸水平较高的补料培养基能在批次生长期中使用，且在达到峰值活细胞密度后，培养基交换能用含低水平半胱氨酸/胱氨酸的培养基进行，从而模拟极类似的半胱氨酸/胱氨酸耗尽谱，与图8相当。
方法2：此实施例显示与方法1所示相同的策略，即通过减少补充加料培养基中配制的任一组分含量，故意限制培养物的半胱氨酸和/或胱氨酸浓度，但用产生第二抗体的细胞系。用于此实施例的条件分成高或低接种条件，且在基础培养基中具有类似的半胱氨酸和/或胱氨酸起始浓度。一种高或低接种密度的条件除了基础培养基中的起始浓度没有补充半胱氨酸或胱氨酸，而剩余条件有单独补充胱氨酸补料(表3)；所有条件都有无半胱氨酸或胱氨酸的营养补料。对于2种条件(根据其接种条件(如更高的接种密度条件需要更高的补充营养加料速度))，所有其它工艺参数相同。
对于此实施例，稳定表达抗EDB K183C-K290C的半胱氨酸突变抗体的CHO-K1细胞与专有的基础培养基和补料培养基一起在1L Applikon生物反应器(Applikon,Inc.,Schiedam,Netherlands)中使用，用带蠕动泵和气体质量流量控制器模块的BioNet模块化控制器(Broadley-James Corp.,Irvine,CA)操作。培养物以约0.6E6细胞/mL或3E6细胞/mL接种，温度维持于约37摄氏度，而pH通过加入碳酸钠/钾溶液或CO2来控制到接近7.0。溶解氧水平通过鼓泡纯氧来控制到>20％空气饱和。为了抗体的TNB-加帽，在生长期后开始DTNB补料，目标是生物反应器中的4mM DTNB浓度范围。如下所提供实施例的批次处理时间是约12天。
第二细胞系的评估证明，从任何补充加料去除半胱氨酸和/或胱氨酸是耗尽培养物中可用半胱氨酸和/或胱氨酸的一种稳健策略，随后允许更好地用TNB加帽抗体。此策略最终产生更高百分比的粗DAR4抗体-药物缀合物，而没有对细胞生长或产率产生有害影响(表3)。
表3.方法2-抗EDB K183C-K290C的半胱氨酸和胱氨酸培养基浓度以及标准化的粗DAR4
Acquity UPLC(Waters Corp,Milford,MA)用于方法2中条件的氨基酸分析(表4)。所有获自UPLC分析的胱氨酸浓度转换成半胱氨酸并示于图9。结果清楚地说明，去除补充半胱氨酸和/或胱氨酸确实早在第7天引起培养物中浓度耗尽(图9)，产生用于最优TNB-加帽的合适环境，如粗DAR4值所示。
表4.方法2-抗EDB K183C-K290C的半胱氨酸和胱氨酸培养基浓度以及耗尽时间
1第7天值是0.54mM；基于生长性能和培养物产率假定第8天消耗低于0.5mM
实施例3.2：用化学计量方法和目标分数半胱氨酸限制比来限制培养物的半胱氨酸/胱氨酸：使用前述合理培养基设计和化学计量方法，能计算特定峰值细胞密度所需的要求量和所产生的产品量并用于设计该特定工艺的最优培养基(方程式1)。此实施例中，半胱氨酸/胱氨酸的要求量根据合理培养基设计计算，使用估计的峰值活细胞密度和收获的工艺效价。评估一定范围的低于所计算半胱氨酸/胱氨酸要求量(例如相较US 8,232,075B中教授的比率)的不同分数半胱氨酸限制比以发现会限制或耗尽半胱氨酸/胱氨酸的理想目标比率，从而促进抗体的TNB-加帽，且仍达到可接受的峰值活细胞密度和收获效价。
所有需要的半胱氨酸/胱氨酸浓度基于目标分数半胱氨酸限制比计算并且仅加入基础培养基。稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞与专有基础培养基和补料培养基一起在1L Applikon生物反应器(Applikon,Inc.,Schiedam,Netherlands)中使用，用带蠕动泵和气体质量流量控制器模块的BioNet模块化控制器(Broadley-James Corp.,Irvine,CA)操作。培养物以约2E6细胞/mL接种，温度维持于约37摄氏度，而pH通过加入碳酸钠/钾溶液或CO2来控制到接近7.0。溶解氧水平通过鼓泡纯氧来控制到>20％空气饱和。对于抗体的TNB-加帽，DTNB补料在生长期后开始，目标是生物反应器中的4mM DTNB浓度范围。如下所提供实施例的批次处理时间是约12天。对评估的全部条件而言，除了基础培养基的半胱氨酸/胱氨酸浓度，所有工艺参数相同。
表5清楚显示，随着分数半胱氨酸限制比增加，粗DAR4百分比(和因而的抗体加帽)减少；这表明较低的分数半胱氨酸限制比对抗体加帽而言最优，且此实施例的0.63x和0.76x比率提供可接受的峰值活细胞密度、收获效价和类似的加帽结果(表5)。收获效价和粗DAR4值被标准化。
表5.分数半胱氨酸限制比的比较
Acquity UPLC(Waters Corp,Milford,MA)用于与表5所述那些类似条件的氨基酸分析。所有获自UPLC分析的胱氨酸浓度由化学计量转换成半胱氨酸。结果清楚显示，较低的分数半胱氨酸限制比引起培养物的半胱氨酸/胱氨酸水平相较1.15x条件更早耗尽，表明用目标分数半胱氨酸限制比能引起恒定和可预测的低水平Cys-加帽以及高TNB-加帽效率(图10)。
实施例3.3：通过增加峰值细胞密度来限制培养物的半胱氨酸/胱氨酸：如前面实施例3.1中2个细胞系所证明，如果半胱氨酸/胱氨酸在批次中限于低浓度或完全耗尽，TNB-加帽效率增加。故意减少或消耗培养物中半胱氨酸/胱氨酸浓度水平的第二示例能用峰值活细胞密度完成。随着给定培养物中的活细胞密度增加，氨基酸的消耗和需求通常也增加(US 8,232,075B)。此实施例中，评估2种达到不同峰值活细胞密度的单独条件。
稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞与专有的基础培养基和补料培养基一起在1L Applikon生物反应器(Applikon,Inc.,Schiedam,Netherlands)中使用，用带蠕动泵和气体质量流量控制器模块的BioNet模块化控制器(Broadley-James Corp.,Irvine,CA)操作。条件以约0.6E6或2E6细胞/mL接种，温度维持于约37摄氏度，而pH通过加入碳酸钠/钾溶液或CO2来控制到接近7.0。溶解氧水平通过鼓泡纯氧来控制到>20％空气饱和。如下所提供实施例的批次处理时间是约12天；1种条件的收获早，这是由于低活力。用于2种条件的一些工艺参数如营养加料速度有差异，从而达到和维持不同峰值细胞密度。然而，基础培养基中的半胱氨酸和胱氨酸浓度类似，补料培养基的胱氨酸浓度相同(表6)。
表6.半胱氨酸和和胱氨酸培养基浓度
Acquity UPLC(Waters Corp,Milford,MA)用于表6所述条件的氨基酸分析。所有获自UPLC分析的胱氨酸浓度转换成半胱氨酸。这些条件的氨基酸分析显示，相较于峰值活细胞密度较低的条件(图11B)，峰值活细胞密度较高的条件在批次中更早地成功耗尽半胱氨酸/胱氨酸，峰值活细胞密度较低的条件维持残余浓度的半胱氨酸/胱氨酸，直至收获。对这些样品不分析粗DAR4，但基于氨基酸分析数据；高接种条件的半胱氨酸/胱氨酸耗尽更早。从此数据可推断，有效TNB-加帽的最优低半胱氨酸/胱氨酸环境由较高峰值活细胞密度诱导。这证明，能促进培养物达到更高细胞密度的培养条件可以是使细胞培养物中半胱氨酸/胱氨酸保持低或耗尽水平的有效替代方法，以促进抗体TNB-加帽的所需环境。
实施例4.在没有细胞的情况下生成TNB-加帽Cys突变抗体。产生抗体或融合蛋白的形式使得其可随后用于缀合步骤，以生成想要的抗体药物缀合物，这常规实现作为一部分的生产细胞系开发和/或实现作为一部分的生产过程的上游/细胞培养过程部分。在产生TNB-加帽抗体的情况中，迄今描述的方法已纳入DTNB补料作为部分细胞培养工艺，有或没有多种额外修改的细胞培养工艺(例如但不限于调整半胱氨酸/胱氨酸补料浓度、批次长度修改)，如前所述。尽管这能生成想要的加帽抗体，但这些方法取决于制造工艺的细胞培养部分，且能降低生产设备的总产率。因此，TNB-加帽抗体的生产量有限，这是由于设备的利用欠佳，尤其是用于细胞培养的生产生物反应器或发酵罐。
此实施例中，半胱氨酸突变重组蛋白如半胱氨酸突变抗体、半胱氨酸融合蛋白等，经细胞培养/发酵技术产生。含有蛋白的条件培养基可随后通过离心、微滤或其它适当细胞分离技术与细胞分开。细胞分离可以是完全或部分的。下一步是突变cys重组蛋白暴露于DTNB/与DTNB温育以生成TNB-加帽抗体。通过分开步骤a)产生半胱氨酸突变重组蛋白和b)加帽半胱氨酸突变重组蛋白，制造工艺和生产设备可优化以通过在工艺的加帽部分避免使用细胞培养生物反应器/发酵罐和因而尽可能减少生物反应器/发酵罐所需的循环时间，来使产率最大。因此，尽可能减少生物反应器/发酵罐的循环时间可允许更高的生产量(通过每时间段执行更高循环数)。
方法1：对于此实施例，稳定表达半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C的CHO-K1细胞与专有的基础培养基和补料培养基一起在1LApplikon生物反应器(Applikon,Inc.,Schiedam,Netherlands)中使用，用带蠕动泵和气体质量流量控制器模块的BioNet模块化控制器(Broadley-JamesCorp.,Irvine,CA)操作。细胞培养温度维持于约37摄氏度，而pH通过加入碳酸钠/钾溶液或CO2来控制到接近7.0。溶解氧水平通过鼓泡纯氧来控制到>20％空气饱和。细胞培养后，含有蛋白的条件培养基通过离心和0.2um过滤分离。条件培养基随后转至分开的容器。对于此容器，向含条件培养基的蛋白直接加入特定浓度的DTNB。反应能持续不同时间段发生，从而证明过程的稳健性以产生想要的材料。如图12可见(曲妥珠单抗K183C-K290C)，想要的产物用一定范围的温育时间段生成，时间更长使得性能提高。
方法2：对于此实施例，稳定表达半胱氨酸突变抗体抗EDB K183C-K290C的CHO-K1细胞与专有的基础培养基和补料培养基一起在1L Applikon生物反应器(Applikon,Inc.,Schiedam,Netherlands)中使用，用带蠕动泵和气体质量流量控制器模块的BioNet模块化控制器(Broadley-James Corp.,Irvine,CA)操作。细胞培养温度维持于约37摄氏度，而pH通过加入碳酸钠/钾溶液或CO2来控制到接近7.0。溶解氧水平通过鼓泡纯氧来控制到>20％空气饱和。细胞培养后，含有蛋白的条件培养基通过离心和0.2um过滤分离。条件培养基随后转至分开的容器。对于此容器，向含条件培养基的蛋白直接加入特定浓度的DTNB。反应能持续不同时间段发生，从而证明过程的稳健性以产生想要的材料。如图13可见(抗EDBK183C-K290C)，想要的产物用一定范围的温育时间段生成，时间更长使得性能提高，显示2种不同抗体表达细胞系中观察到的相同趋势。
实施例5：TNB缀合工艺。TNB加帽的半胱氨酸突变抗体用TSPP选择性还原。产生的游离巯基允许直接药物缀合，而不需超滤/透析过滤(UF/DF)和再氧化步骤，这简化了工艺。产生用TNB完全加帽的半胱氨酸突变抗体曲妥珠单抗K183C-K290C，其采用每抗体4个帽形式(DAR4)，该抗体在TSPP处理后直接缀合，效率为70％。
作为另一示例，本文讨论TNB加帽和缀合(在K183C-K290C)。半胱氨酸突变缀合的TNB加帽缀合方案由产生粗缀合物的2个步骤组成：选择性还原和缀合。在第一步骤中，完成选择性还原突变半胱氨酸以实现从突变半胱氨酸残基去除保护基，链间二硫化物的还原最小化或没有。通常，这用过量(～7当量)还原剂如三(3-磺苯基)膦(TSPP)在环境温度持续2小时来完成。在第二步骤中，未受保护的突变半胱氨酸缀合接头-有效载荷。通常，向反应加入过量(～12当量)接头-有效载荷且反应在环境温度进行1小时以生成粗缀合物。终缀合物维持天然链间二硫键，因为其在还原步骤中未破损。
在一个特定示例中：向1.0g(6.9μmol；25mg/mL溶于60mM组氨酸,pH 7；38.9mL)曲妥珠单抗K183C-K290C抗体加入27.5mg TSPP(7当量；48.3μmol；水中10mM；4.83mL)。反应混合物在环境温度温育2小时。向此反应混合物加入111mg mcvcPABC0101接头-有效载荷(12当量,82.7μmol；二甲亚砜中25mM；3.31mL)。反应混合物在环境温度温育1小时以提供粗缀合物。
实施例6：有还原后透析过滤的TNB缀合工艺。用于实施例5所述工艺的过量接头-有效载荷含量能如下减少：在TSPP还原后加入透析过滤(缓冲液更换)步骤以去除与接头-有效载荷反应的种类。如图14所示，缓冲液更换后用6当量的接头有效载荷实现70％DAR4，而当未进行缓冲液更换时，需要显著更高的当量。同样，TSPP的量通过增加还原温度和/或时间而略有减少。
在一个特定示例中：向4.0g(27.6μmol；25mg/mL溶于60mM组氨酸,pH 7；156mL)曲妥珠单抗K183C-K290C抗体加入93.8mg TSPP(6当量；165μmol；水中10mM；16.5mL)。反应混合物在37℃温育3小时，然后通过透析过滤(TangenX ProStream 50kD膜,110-210g/m2,10透析体积的60mM组氨酸,pH 7)进行缓冲液更换。透析过滤后，加入222mg mcvcPABC0101接头-有效载荷(6当量,165μmol；二甲亚砜中25mM；6.62mL)。反应混合物在25℃温育1小时以提供粗缀合物。
实施例7：有TSPP化学计量增加、还原后透析过滤和再氧化的TNB缀合工艺。由实施例6所述的工艺陈述的聚集物的量能通过增加TSPP化学计量来减少。增加的TSPP化学计量可从突变半胱氨酸更迅速去除TNB并防止抗体间二硫键形成。然而，增加的TSPP化学计量也引起少部分链间二硫键还原。存在氯化钠和其它盐(参见实施例8)可减少在较高TSPP化学计量下的链间二硫化物还原程度。透析过滤后加入再氧化步骤修复一些还原的链间二硫键。如图15所示，用20当量TSPP还原和缓冲液更换后的缀合，没有再氧化步骤，可产生低水平的过度缀合种类，这是由于链间二硫键还原。当再氧化加入工艺时，不形成过度缀合种类。
在一个特定示例中：向24.7g(0.170mmol；26mg/mL溶于60mM组氨酸,150mM NaCl,pH 7；961mL)曲妥珠单抗K183C-K290C抗体加入1.94g TSPP(20当量；3.41mmol；水中100mM；34.1mL)。反应混合物在37℃搅拌3小时，然后通过透析过滤(TangenX ProStream 50kD膜,110-210g/m2,10透析体积的60mM组氨酸,150mM NaCl,pH 7)进行缓冲液更换。透析过滤后，混合物冷却至4℃，加入0.45g脱氢抗坏血酸(15当量；2.56mmol；50mM溶于1:1DMSO/水；51.2mL)，混合物在4℃搅拌16小时。混合物加热至25℃，加入1.37g mcvcPABC0101接头-有效载荷(6当量,1.02mmol；二甲亚砜中25mM；40.9mL)，混合物在25℃搅拌1.5小时以提供粗缀合物。
实施例8：有TSPP化学计量增加、还原后透析过滤、再氧化和接头-有效载荷阻断的TNB缀合工艺。还原混合物中存在盐，如实施例7的氯化钠，可减少在较高TSPP化学计量下的链间二硫化物还原程度。
作为另一示例，使用图15中未进行再氧化时形成的过缀合种类的量度，链间二硫化物还原从没有盐存在时的～33％减少到存在150-500mM盐时的10-20％。盐如氯化钠、乙酸钠、硝酸钾、磷酸氢钾、硝酸镁、硫酸镁、盐酸胍和硫酸铵减少链间二硫化物还原。
在一个特定示例中，链间二硫化物还原从没有盐时的33％，分别减少到存在150mM、250mM和500mM氯化钠时的15％、14％和12％。
实施例9：有TSPP化学计量增加、还原后透析过滤、再氧化和接头-有效载荷阻断的TNB缀合工艺。此实施例与实施例7类似，但特征在于(1)再氧化在25℃运行，这显著减少再氧化时间并消除透析过滤后耗时的冷却和缀合前的加热，和(2)通过与半胱氨酸反应阻断接头-有效载荷，这在某些条件下改善下游纯化(参见下面的实施例14)。
在一个特定示例中：向80.0g(0.541mmol；26mg/mL溶于60mM组氨酸,150mM NaCl,pH 7；3053mL)曲妥珠单抗K183C-K290C抗体加入6.14g TSPP(20当量；10.8mmol；水中100mM；108mL)。反应混合物在37℃搅拌3小时，然后通过透析过滤(TangenX ProStream50kD膜,110-210g/m2,10透析体积的60mM组氨酸,150mM NaCl,pH 7)进行缓冲液更换。透析过滤后，加入0.19g脱氢抗坏血酸(2当量；1.08mmol；50mM溶于1:1DMSO/水；21.6mL)，混合物在25℃搅拌0.5小时。随后，加入4.35g mcvcPABC0101接头-有效载荷(6当量,3.24mmol；二甲亚砜中25mM；130mL)，混合物在25℃搅拌1小时。最后，加入0.79g半胱氨酸(12当量,6.48mmol；水中100mM；64.9mL)，混合物在25℃搅拌1小时以提供粗缀合物。
实施例10：TNB缀合工艺-通过再氧化的抗体片段修复。加入再氧化步骤如实施例7和9，修复形成的抗体中存在的片段，因而改善终缀合物的品质和产率。片段源自抗体，其中一个或多个链间二硫键不完整。因此，使用实施例9所述工艺含15-35％片段水平的抗体批次(lot)缀合可产生片段水平低和相当的缀合物。
在一个特定示例中：有35％片段的抗体生成有约10％片段的粗缀合物；大部分片段通过再氧化修复。最终纯化的缀合物包含小于3％片段。
实施例11：抗EDBK183C-K290C抗体的TNB缀合工艺。TNB缀合工艺适合曲妥珠单抗以外的TNB-加帽抗体。
在一个特定示例中：用实施例9所述工艺加工TNB加帽的抗EDB K183C-K290C抗体，提供的粗缀合物与用曲妥珠单抗K183C-K290C抗体获得的相当。如图16所示，这些抗体的粗缀合物高度相似，有～75％DAR4。
实施例12：纯化通过TNB缀合工艺生成的缀合物。由所述工艺生成的粗缀合物能通过疏水作用层析(HIC)纯化。HIC纯化去除或显著减少游离的接头-有效载荷、聚集物、片段和较低DAR缀合物。
作为另一示例，HIC纯化用串联的CaptoTMButyl ImpRes树脂(GE)柱和PPG-600M(Tosoh)柱完成。CaptoTMButyl ImpRes提供适当去除聚集物、片段和较低DAR缀合物，PPG-600M保留游离mcvcPABC0101接头-有效载荷。纯化的缀合物能浓缩并通过超滤/透析过滤(UF/DF)进行缓冲液更换。UF/DF也去除剩余的游离接头-有效载荷，如果其在HIC纯化后存在。
在一个特定示例中：用实施例6所述工艺产生的粗缀合物(4.0g,26mg/mL)用1体积的10mM磷酸钠，pH 7稀释。稀释的粗混合物用20mM磷酸钠、1M硫酸铵，pH 7进一步1:1稀释，以提供HIC加样溶液。HIC纯化用串联的CaptoTMButyl ImpRes树脂(GE)柱(24cm(h)x 2.6cm(d))和PPG-600M(Tosoh)柱((4cm(h)x 2.6cm(d))完成。引入加样溶液到CaptoTMButyl ImpRes柱上后，纯化的缀合物从两柱串联中洗脱，梯度为25柱体积中溶于缓冲液A的50-100％缓冲液B；缓冲液A：20mM磷酸钠，1M硫酸铵，pH 7；缓冲液B：10mM磷酸钠，pH7。收集含想要的缀合物的部分并进行UF/DF以浓缩和缓冲液更换(TangenX ProStream50kD膜,110-210g/m2,10透析体积的20mM组氨酸，pH 5.8)。
实施例13：以增加的回收率纯化通过TNB缀合工艺生成的缀合物。当通过HIC纯化时，DAR4ADC的回收能如下提高：向流动相缓冲液B加入异丙醇，因而增加工艺产率。
在一个特定示例中：由实施例7所述工艺生成的粗缀合物(12.4g,26mg/mL)用1体积的10mM磷酸钠，pH 7，5％(v/v)异丙醇稀释。稀释的粗混合物用20mM磷酸钠、1M硫酸铵，pH7进一步1:1稀释，以提供HIC加样溶液。HIC纯化用串联的CaptoTMButyl ImpRes树脂(GE)柱(22cm(h)x5cm(d))和PPG-600M(Tosoh)柱((4cm(h)x 5cm(d))完成。引入加样溶液到CaptoTMButyl ImpRes柱上后，纯化的缀合物从两柱串联中洗脱，梯度为25柱体积中溶于缓冲液A的50-100％缓冲液B；缓冲液A：20mM磷酸钠，1M硫酸铵，pH 7；缓冲液B：10mM磷酸钠，pH 7，5％(v/v)异丙醇。收集含想要的缀合物的部分并进行UF/DF以浓缩和缓冲液更换(TangenX ProStream 50kD膜,110-210g/m2,10透析体积的20mM组氨酸,pH 5.8)。全过程的ADC产率相比采用实施例12的纯化过程提高约50％，该全过程中，HIC纯化的缓冲液B中存在异丙醇。
实施例14：纯化通过TNB缀合工艺生成的缀合物，采用接头-有效载荷阻断。当mcvcPABC0101接头-有效载荷在阻断步骤中用半胱氨酸加帽时，如实施例9，HIC纯化能用单独CaptoTMButyl ImpRes树脂(GE)柱完成。半胱氨酸加帽的mcvcPABC0101洗脱早于DAR4缀合物且在CaptoTMButylImpRes柱上良好分离。如图17所示，DAR4缀合物与半胱氨酸加帽的mcvcPABC0101、较低DAR缀合物、聚集物和片段分离，使用此实施例所述条件。半胱氨酸加帽的mcvcPABC0101也容易通过透析过滤清除。
在一个特定示例中：由实施例9所述工艺生成的粗缀合物(40.0g,26mg/mL)用1体积的10mM磷酸钠,pH 7,5％(v/v)异丙醇稀释。稀释的粗混合物用20mM磷酸钠、1M硫酸铵,pH7进一步1:1稀释，以提供HIC加样溶液。HIC纯化用CaptoTMButyl ImpRes树脂(GE)柱(24.5cm(h)x 10cm(d))完成。引入加样溶液到柱上后，洗脱纯化的缀合物，梯度为10柱体积中溶于缓冲液A的50-100％缓冲液B；缓冲液A：20mM磷酸钠，1M硫酸铵，pH 7；缓冲液B：10mM磷酸钠，pH 7，5％(v/v)异丙醇。收集含想要的缀合物的部分并进行UF/DF以浓缩和缓冲液更换(TangenX ProStream 50kD膜,110-210g/m2,10透析体积的20mM组氨酸，pH 5.8)。
在一个不同的特定示例中：由实施例9所述工艺生成的粗缀合物(0.83g，～23mg/mL)用1体积的10mM磷酸钠，pH 7，5％(v/v)异丙醇稀释。稀释的粗混合物用20mM磷酸钠、1M硫酸铵，pH 7进一步1:1稀释，以提供HIC加样溶液。HIC纯化用串联的Butyl HP树脂(GE)柱(24cm(h)x1.6cm(d))和PPG-600M(Tosoh)柱(5.3cm(h)x 1.6cm(d))完成。引入加样溶液到柱上后，洗脱纯化的缀合物，梯度为10柱体积中溶于缓冲液A的50-100％缓冲液B；缓冲液A：20mM磷酸钠，1M硫酸铵，pH 7；缓冲液B：10mM磷酸钠，pH 7，5％(v/v)异丙醇。收集含想要的缀合物的部分。连同从DAR4缀合物分离mcvcPABC0101接头-有效载荷，实现高回收。
实施例15：分析抗体铰链区二硫键混杂(scrambling)的测定。TNB缀合工艺的一个益处是显著减少或完全消除抗体上的铰链二硫化物还原，并因而生成具有天然链间二硫键的缀合物。开发一种测定以测量抗体和缀合物中铰链混杂的水平。该测定中，抗体或缀合物用在铰链下切割的酶和铰链上切割的第二酶处理，如下所示：
铰链片段随后通过HPLC或LC-MS分析以确定抗体或缀合物中存在的天然和混杂铰链含量。
1mg/mL ADC样品用IdeS(酶1，1单位/μg ADC)在37℃处理30分钟，然后用Lys-C(酶2，1μg/150μg ADC)在37℃处理5分钟。然后，反应用三氟乙酸阻断。样品通过HPLC:WatersXBridge BEH C18柱分析，柱温：60℃，流动相A：水中0.1％TFA，流动相B：乙腈中0.1％TFA，梯度：30分钟内20–30％流动相B，流速：0.2mL/min，在214nm进行UV检测。峰通过MS确认。
实施例16：与缀合半胱氨酸加帽抗体比较。从半胱氨酸加帽抗体产生的ADC包含铰链混杂产物。为缀合半胱氨酸加帽抗体，抗体必须用过量三(2-羧乙基)膦盐酸盐(TCEP)充分还原，且还原的链间二硫键用脱氢抗坏血酸再氧化，仅留下突变半胱氨酸残基可用作游离巯基用于缀合。突变半胱氨酸残基随后缀合接头-有效载荷以提供粗ADC。再氧化步骤在抗体铰链区生成天然链间二硫键和混杂二硫键。对于此完全还原/再氧化过程产生的ADC，通过实施例15所述测定测量的铰链混杂水平通产是5–20％。应注意，所有铰链混杂源自ADC缀合过程，因为起始抗体中未检测到铰链混杂。
向4.0g(27.6μmol；27mg/mL溶于60mM组氨酸,pH 7；144mL)半胱氨酸加帽曲妥珠单抗K183C-K290C抗体加入1.65mL的0.5M TCEP(30当量；0.827mmol；溶于水的0.5M溶液)。反应混合物在37℃温育5小时，然后通过透析过滤(TangenX ProStream 50kD膜,110-210g/m2,10透析体积的60mM组氨酸,pH 7)进行缓冲液更换。透析过滤后，混合物冷却到4℃，加入0.144g脱氢抗坏血酸(30当量；0.827mmol；50mM溶于1:1DMSO/水；16.5mL)，混合物在4℃温育16小时。混合物加热至25℃，加入0.185gmcvcPABC0101接头-有效载荷(5当量,0.138mmol；二甲亚砜中25mM；5.51mL)，混合物在25℃温育1小时以提供粗缀合物。HIC纯化后，通过实施例15所述测定测量的ADC中铰链混杂水平为18％。
为了比较，如实施例15所述测定测量的，如上面实施例6、7和9从TNB加帽抗体生成的ADC在HIC纯化后不含可检测的铰链混杂。

Claims (31)

1.一种生成能缀合化学有效载荷的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：
(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包含选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分；
(b)温育所述细胞达到足以耗尽所述生长培养基中所存在的大部分生长组分的细胞密度；和
(c)进一步温育所述细胞以表达具有一个或多个包含游离巯基的未加帽的半胱氨酸残基的含半胱氨酸蛋白。
2.如权利要求1所述的工艺，还包括步骤：
(d)将预先确定的加帽部分或其前体引入到所述表达的含半胱氨酸蛋白；
其中所述蛋白上的一个或多个半胱氨酸用所述预先确定的加帽部分加帽。
3.一种生成能缀合化学有效载荷的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：
(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包括选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分；
(b)温育所述细胞以表达具有一个或多个包含游离巯基的未加帽的半胱氨酸残基的含半胱氨酸蛋白；和
(c)在步骤(a)、步骤(b)或步骤(a)和(b)中，维持所述一种或多种生长组分浓度低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM。
4.如权利要求3所述的工艺，还包括步骤：
(d)将预先确定的加帽部分或其前体引入到所述表达的含半胱氨酸蛋白；
其中所述蛋白上的一个或多个半胱氨酸用所述预先确定的加帽部分加帽。
5.一种生成能缀合化学有效载荷的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：
(a)用能表达含半胱氨酸蛋白的细胞接种细胞生长培养基，所述培养基包括选自半胱氨酸、胱氨酸和谷胱甘肽的一种或多种生长组分，和
(b)温育所述细胞以表达具有一个或多个包含游离巯基的未加帽的半胱氨酸残基的含半胱氨酸蛋白，其中所述生长组分在所述温育后的浓度低于2.0mM、低于0.4mM、低于0.3mM、低于0.2mM、低于0.1mM或低于0.05mM。
6.如权利要求5所述的工艺，在所述温育步骤后还包括步骤：
(c)将预先确定的加帽部分或其前体引入到所述表达的含半胱氨酸蛋白；
其中所述蛋白上的一个或多个半胱氨酸用所述预先确定的加帽部分加帽。
7.如权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中通过将所述细胞生长培养基的分数半胱氨酸限制比限制到小于1.0x来耗尽所述生长组分。
8.如权利要求7所述的工艺，其中所述比是约：0.95x、0.90x、0.85x、0.80x、0.75x、0.70x、0.65x、0.60x、0.55x、0.50x、0.45x、0.40x、0.35x、0.30x、0.25x、0.20x、0.15x、0.10x或0.05x。
9.如权利要求1-6中任一项所述的工艺，其中所述含半胱氨酸蛋白选自抗体和融合蛋白。
10.如权利要求1-2中任一项所述的工艺，其中所述达到的细胞密度是至少约1E6细胞/mL。
11.如权利要求10所述的工艺，其中所述细胞密度是至少约：5E6细胞/mL、10E6细胞/mL、50E6细胞/mL、100E6细胞/mL或500E6细胞/mL。
12.如权利要求2、4和6中任一项所述的工艺，其中所述预先确定的加帽部分选自5-硫代-2-硝基苯甲酸(TNB)、2-巯基吡啶、二硫代联吡啶(DTDP)、4-硫代苯甲酸、2-硫代苯甲酸、4-硫代苯磺酸、2-硫代苯磺酸、磺酸甲酯(Ms)、对甲苯磺酸盐(Ts)和三氟甲基磺酸盐(Tf)。
13.如权利要求2、4和6中任一项所述的方法，其中所述预先确定的加帽部分选自由以下组成的反应基：带有醛支链的马来酰亚胺三氧杂-4-甲酰苯甲酰胺(MTFB)样分子或带有叠氮化物支链的马来酰亚胺叠氮基-赖氨酸样分子，或带有炔烃支链的二苯并环辛基-聚乙烯马来酰亚胺(DBCO-PEG4-马来酰亚胺)样分子。
14.如权利要求2、4和6中任一项所述的工艺，其中所述预先确定的加帽部分是TNB。
15.如权利要求2、4和6中任一项所述的工艺，其中所述前体是DTNB。
16.如权利要求2、4和6中任一项所述的工艺，其中对所述加帽的蛋白进行进一步加工，所述加工由分离、纯化和浓缩的一种或多种组成。
17.如权利要求2、4和6中任一项所述的工艺，其中在引入所述预先确定的加帽部分或其前体之前，将至少50％的所述细胞与所述表达的含半胱氨酸蛋白分离。
18.如权利要求17所述的工艺，其中所述分离通过离心或过滤完成。
19.一种用于缀合TNB-加帽的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：
(a)使所述TNB-加帽的含半胱氨酸蛋白与还原剂反应，所述还原剂能使所述TNB-加帽部分与所述蛋白脱离而不显著还原抗体链间的硫键；
(b)任选地，过滤所述反应混合物以去除过量还原剂、脱离的TNB，或两者都去除；和
(c)不引入氧化剂，通过反应性连接部分将所述抗体上一个或多个经还原的硫键与有效载荷缀合。
20.一种用于缀合TNB-加帽的含半胱氨酸蛋白的工艺，所述工艺包括以下步骤：
(a)使所述TNB-加帽的含半胱氨酸蛋白与约4:1-6:1化学计量过量的还原剂反应，所述还原剂能使所述TNB-加帽部分与蛋白脱离而不显著还原抗体链间的硫键，任选地，所述反应存在氯化钠；
(b)过滤所述反应混合物以去除过量的还原剂、脱离的TNB的一种或多种；
(c)引入氧化剂；和
(d)通过反应性连接部分将所述蛋白上一个或多个还原的硫键与有效载荷缀合。
21.如权利要求20所述的工艺，其中所述化学计量过量是约5:1。
22.如权利要求20所述的工艺，其中所述步骤(c)在环境温度进行。
23.如权利要求20所述的工艺，其中所述步骤(c)在约25摄氏度进行。
24.如权利要求20所述的工艺，其中所述步骤(c)在约4摄氏度进行。
25.如权利要求20所述的工艺，其中所述工艺进一步包括步骤：(e)在步骤(d)后加入过量半胱氨酸以阻断所述连接部分的反应；和(f)将所述经阻断的接头-有效载荷与所述缀合物分离。
26.权利要求25所述的工艺，其中通过透析过滤或柱层析进行所述分离。
27.如权利要求26所述的工艺，其中所述柱层析是疏水作用层析(HIC)。
28.如权利要求27所述的工艺，其中一种或多种含有异丙醇的缓冲液用于进行所述HIC纯化。
29.如权利要求1-28中任一项所述的工艺，其中所述含半胱氨酸蛋白是抗体。
30.如权利要求1-28中任一项所述的工艺，其中所述含半胱氨酸蛋白是选自抗EDB抗体和抗HER2抗体的抗体。
31.如权利要求30所述的工艺，其中所述抗HER2抗体是曲妥珠单抗。
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Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018085769A1 (en) * 2016-11-07 2018-05-11 Seattle Genetics, Inc. Distribution of engineered-cysteine caps
TW201927335A (zh) * 2017-10-02 2019-07-16 美商拜耳保健有限責任公司 防止雙硫鍵於細胞培養收集物中還原之方法

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042175A1 (en) * 1999-01-14 2000-07-20 Bolder Biotechnology Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
US20080108553A1 (en) * 2006-11-08 2008-05-08 Yen-Tung Luan Rationally designed media for cell culture
US20080306246A1 (en) * 2005-07-06 2008-12-11 Ucb Pharma S.A. Process for Attaching Effector Molecules to Proteins
US20080311134A1 (en) * 2007-05-08 2008-12-18 Junutula Jagath R Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
US20130330350A1 (en) * 2010-11-09 2013-12-12 Medimmune, Llc Antibody Scaffold For Homogenous Conjugation
WO2015157595A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies
WO2015162563A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 Rinat Neuroscience Corp. Antibody-drug conjugates with high drug loading
US20160347824A1 (en) * 2014-02-11 2016-12-01 Seattle Genetics, Inc. Selective reduction of proteins

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SI2247620T1 (sl) * 2008-01-31 2016-09-30 Genentech, Inc. Protitelesa proti CD79b in imunokonjugati in postopki za uporabo
WO2015140708A1 (en) 2014-03-19 2015-09-24 Pfizer Inc. Method of cell culture
CN106536540A (zh) * 2014-07-24 2017-03-22 基因泰克公司 将试剂缀合至含有至少一个三硫键的蛋白质中的巯基部分的方法
EP3808768A1 (en) 2015-08-12 2021-04-21 Pfizer Inc. Capped and uncapped antibody cysteines, and their use in antibody-drug conjugation

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2000042175A1 (en) * 1999-01-14 2000-07-20 Bolder Biotechnology Inc. Methods for making proteins containing free cysteine residues
CN1355842A (zh) * 1999-01-14 2002-06-26 博尔德生物技术公司 制备含游离半胱氨酸残基的蛋白质的方法
US20080306246A1 (en) * 2005-07-06 2008-12-11 Ucb Pharma S.A. Process for Attaching Effector Molecules to Proteins
US20080108553A1 (en) * 2006-11-08 2008-05-08 Yen-Tung Luan Rationally designed media for cell culture
CN104152395A (zh) * 2006-11-08 2014-11-19 惠氏公司 合理设计的细胞培养基
US20080311134A1 (en) * 2007-05-08 2008-12-18 Junutula Jagath R Cysteine engineered anti-muc16 antibodies and antibody drug conjugates
US20130330350A1 (en) * 2010-11-09 2013-12-12 Medimmune, Llc Antibody Scaffold For Homogenous Conjugation
US20160347824A1 (en) * 2014-02-11 2016-12-01 Seattle Genetics, Inc. Selective reduction of proteins
WO2015157595A1 (en) * 2014-04-11 2015-10-15 Medimmune, Llc Conjugated compounds comprising cysteine-engineered antibodies
WO2015162563A1 (en) * 2014-04-25 2015-10-29 Rinat Neuroscience Corp. Antibody-drug conjugates with high drug loading

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
VISWANADHAM DUPPATLA等: "Enzymatic deglutathionylation to generate interleukin-4 cysteine muteins with free thiol", 《BIOCONJUGATE CHEM.》 *

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