CN1355842A - 制备含游离半胱氨酸残基的蛋白质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及制备含游离半胱氨酸的可溶性蛋白质的新方法,其中将宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触。然后可修饰以该方法生产的可溶性蛋白质以增强其效力。所述修饰包括附着PEG部分以形成PEG化蛋白质。

Description

制备含游离半胱氨酸残基的蛋白质的方法
                      发明领域
本发明一般涉及制备蛋白质的方法，更具体地说涉及制备含有不形成二硫键的游离半胱氨酸的重组蛋白质的方法。
                      发明背景
就病人和医护人员而言，对于开发低成本，长效，“使用方便”(“user-friendly”)的蛋白质疗法具有极大兴趣。蛋白质制备昂贵且不同于其它常规小分子药物，它通常不容易被身体吸收。而且如果经口服给药它们会被消化掉。因此，蛋白质一般必须经注射给药。注射后，大多数蛋白质被迅速从体内清除，因此必须经常，通常是每天，都要进行注射。病人不喜欢注射，这样就导致应变性下降并降低药物效力。有些蛋白质，如促红细胞生成素(EPO)，当不经常给药时也是有效的，但这是由于该蛋白质是糖基化的事实引起的。糖基化需要使用哺乳动物表达系统来生产重组蛋白质，但这较昂贵且增加了蛋白质药物的成本。
因此，强烈需要开发降低病人和医护人员对蛋白质药物花费的蛋白质传递技术。解决该问题的一个方法是开发延长蛋白质治疗剂在体内的循环半衰期的方法使得不需经常注射该蛋白质。这一解决方法也可满足病人对“使用方便”的蛋白质疗法(即，不需要经常注射的蛋白质疗法)的需要和希望。
已证实用聚乙二醇(PEG)对蛋白质的共价修饰是延长蛋白质在体内的循环半衰期的有用方法(Abuchowski等，1984；Hershfield，1987；Meyers等，1991)。将PEG共价附着到蛋白质上增加了蛋白质的有效大小并降低了从体内清除它的速率。可买到几种大小的PEG，通过使用不同大小的PEG可以使得PEG修饰的蛋白质的循环半衰期适应于个体适应症。其它文献证实PEG修饰的体内益处在于增强了蛋白质的可溶性，稳定性(很可能是防止蛋白质被蛋白酶消化)和降低蛋白质的免疫原性(Katre等，1987；Katre，1990)。
PEG连接蛋白质的一个已知方法是使用诸如N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)-PEG的化合物将PEG附着列游离胺上，一般是在赖氨酸残基或在N-末端氨基酸上。该方案的一个主要的局限性在于蛋白质除了N-末端氨基酸外，一般还含有几个赖氨酸，PEG部分非特异性地附着到蛋白质的任何可接近的游离胺上，产生不同种的产物混合物。许多NHS-PEG化蛋白质由于其低比活和异质性而不适用于商业用途。失活是由生物学活性所需的一个或多个赖氨酸残基或N-末端氨基酸被共价修饰或者由于PEG部分靠近蛋白质的活性位点的共价附着而引起的。
与本申请特别相关的是这样的发现，即用包括NHS-PEG试剂的胺反应试剂修饰的人生长激素(hGH)使得蛋白质的生物学活性降低了超过10倍(Teh和Chapman，1988；Clark等，1996)。GH是由垂体腺分泌的一种22KD的蛋白质。GH刺激骨骼，软骨和肌肉的代谢并且是儿童时期刺激躯体生长的主要激素。重组人GH(rhGH)用于治疗由于GH不足引起的躯体矮小症，特纳综合症和儿童肾机能不全症。GH不被糖基化且当在细菌中生产时具有完全的活性。该蛋白质具有较短的体内半衰期且必须每天皮下注射给药以达到最大效力(MacGillivray等，1996)。
对于开发长效形式的hGH具有极大的兴趣。用胺反应性PEG试剂经PEG连接蛋白质产生长效形式的hGH的尝试取得的成功有限，因为PEG连接时生物学活性明显下降。而且，该蛋白质变成在多个位点与PEG连接(Clark等，1996)。hGH除了N-末端氨基酸外，含有9个赖氨酸。这些赖氨酸中有些位于该蛋白质已知对受体结合关键的区域(Cunningham等，1989；Cunningham和Wells，1989)。这些赖氨酸残基的修饰明显降低了受体结合和该蛋白质的生物学活性(de la Llosa等，1985；Martal等，1985；Teh和Chapman，1988；Cunningham和Wells，1989)。hGH容易被NHS-PEG试剂修饰，但NHS-PEG蛋白质的生物学活性严重受损，用5Kda PEG部分修饰的GH蛋白质仅占野生型GH生物学活性的1％(Clark等，1996)。这种多PEG化GH蛋白质的EC50为440ng/ml或大约20nM(Clark等，1996)。除了生物学活性明显下降外，由于不同数目的PEG部分附着到蛋白质上和在不同的氨基酸残基上附着，NHS-PEG-hGH具有极大的异质性，这也影响了其作为潜在治疗剂的有用性。Clark等(1996)表明NHS-PEG-hGH在动物中的循环半衰期相对于未修饰的GH明显延长。尽管体外生物学活性明显降低，但在大鼠GH-缺陷模型中NHS-PEG-hGH是有效的且比未修饰的hGH给药频率要低(Clark等，1996)。然而，在动物模型中需要高剂量的NHS-PEG-hGH(每只大鼠每次注射60-180μg)产生效力，因为修饰的蛋白质比活较低。明显的是需要更好的方法以产生保留更高生物学活性的PEG化hGH蛋白质。还需要开发PEG连接hGH的方法，以这种方式产生同型PEG-hGH产物。
其它几种商业上重要的蛋白质的生物学活性也被胺反应PEG试剂显著降低。EPO含有几个对蛋白质的生物学活性关键性的赖氨酸残基(Boissel等，1993；Matthews等，1996)且EPO中赖氨酸残基的修饰导致几乎完全丧失生物学活性(Wojchowski和Caslake，1989)。用胺反应性PEG共价修饰α-干扰素-2导致生物学活性丧失40-75％(Goodson和Katre，1990；Karasiewicz等，1995)。用大型(例如，10KDa)PEG使得生物学活性丧失最大(Karasiewicz等，1995)。用胺反应性PEG共价修饰G-CSF导致生物学活性丧失60％以上(Tanaka等，1991)。用胺反应性PEG广泛修饰IL-2导致生物学活性丧失90％以上(Goodson和Katre，1990)。
用于PEG连接蛋白质的第二种已知的方法是使用半胱氨酸反应性PEG将PEG共价附着到半胱氨酸残基上。可以买到许多具有不同反应基团(例如，马来酰亚胺，乙烯砜)和不同大小PEG(2-40kDa)的高特异性半胱氨酸反应性PEG。在中性pH下，这些PEG试剂选择性地附着到“游离”半胱氨酸残基，即，不形成二硫键的半胱氨酸残基上。大多数蛋白质中的半胱氨酸残基参与形成二硫键且不可能用于使用半胱氨酸反应性PEG的PEG连接。通过使用重组DNA技术的体外诱变，可将额外的半胱氨酸残基导入蛋白质的任意位置。这种新添加的“游离”半胱氨酸可用作使用半胱氨酸反应性PEG的PEG部分特异性附着位点。该添加的半胱氨酸残基可取代蛋白质中已有的氨基酸，或添加到蛋白质的氨基末端之前或蛋白质的羧基末端之后，或插入到蛋白质的两个氨基酸之间。另外，可以删除天然二硫键中涉及的两个半胱氨酸中的一个或用另一氨基酸取代它，使得天然的半胱氨酸(该蛋白质中正常情况下与缺失或取代的半胱氨酸残基形成二硫键的半胱氨酸残基)游离并用于化学修饰。取代该半胱氨酸的氨基酸优选是中性氨基酸，如丝氨酸或丙氨酸。生长激素有两个能被碘乙酰胺还原并烷基化而不影响其生物学活性的二硫键(Bewley等，(1969))。4个半胱氨酸中的每一个都可以是用于缺失或以另一氨基酸取代的理想靶。
已知一些天然存在的蛋白质含有一个或多个“游离”的半胱氨酸残基。这种天然存在的蛋白质的例子包括人白细胞介素(IL)-2，β干扰素(Mark等，1984)，G-CSF(Lu等，1989)和碱性成纤维细胞生长因子(Thompson，1992)。IL-2，G-CSF和β干扰素含有奇数个半胱氨酸残基，而碱性成纤维细胞生长因子含有偶数个半胱氨酸残基。
然而，含游离半胱氨酸残基的重组蛋白质的表达由于游离巯基在生理学条件下的反应性而仍成问题。在诸如大肠杆菌的细菌中作为细胞内蛋白已经表达了一些含有游离半胱氨酸的重组蛋白质。其例子包括中性蛋白质，如IL-2，β干扰素，G-CSF，碱性成纤维细胞生长因子和改造的IL-2半胱氨酸突变蛋白(Goodson和Katre，1990)，IL-3(Shaw等，1992)，肿瘤坏死因子结合蛋白(Tuma等，1995)，IGF-I(Cox和Mcdermott，1994)，IGFBP-1(Van DenBerg等，1997)和蛋白酶连接蛋白和相关蛋白(Braxton，1998)。所有这些蛋白质当在细菌细胞内表达时都是不溶性的。这些不溶性蛋白质经过进行一系列的变性，还原和再折叠过程可再折叠成天然的构象。这些步骤增加了用于在细菌中生产这些蛋白质的生产方法的时间和成本。经过用另一氨基酸，例如丝氨酸，取代游离的半胱氨酸残基已经获得提高了稳定性和产量的IL-2(Mark等，1985)和β干扰素(DeChiara等，1986)。以可溶性，生物学活性形式表达重组蛋白以消除这些额外的步骤将是优选的。
在细菌中表达可溶性重组蛋白的一个已知方法是将它们分泌进周质空间或分泌进培养基。已知诸如GH的某些重组蛋白当它们分泌进大肠杆菌周质时以可溶性活性形式表达，而当它们在大肠杆菌细胞内表达时是不可溶的。经过将编码生长激素或其它目的蛋白的DNA序列与诸如来自stII(Fujimoto等，1988)和ompA蛋白(Ghrayeb等，1984)的那些编码细菌信号序列的DNA序列融合可实现分泌。在细菌中分泌重组蛋白是所希望的，因为可保留该重组蛋白的天然N-末端。重组蛋白的细胞内表达需要在该重组蛋白的氨基末端存在N-末端甲硫氨酸。在许多人类蛋白质的成熟形式的氨基末端正常情况下并不存在甲硫氨酸。例如，人生长激素成熟形式的氨基末端氨基酸是苯丙氨酸。为了在细菌中有效表达该蛋白质，如果在重组蛋白的氨基末端不存在甲硫氨酸，必须在该位置加上一个氨基末端甲硫氨酸。一般经过在编码重组蛋白质的DNA序列前加上ATG甲硫氨酸密码子实现添加氨基末端甲硫氨酸。加上的N-末端甲硫氨酸通常不能从重组蛋白上去掉，特别是如果重组蛋白是不溶性蛋白时。hGH就是这种情况，当在大肠杆菌细胞内表达该蛋白时，N-末端甲硫氨酸不去掉。加入的N-末端甲硫氨酸产生“非天然”的蛋白质，它可潜在地刺激人体免疫反应。相反，在使用stII(Chang等，1987)或ompA(Cheah等，1994)信号序列分泌进周质空间的hGH上没有添加的甲硫氨酸；该重组蛋白以天然氨基末端氨基酸苯丙氨酸为起始氨基酸。由于细菌酶在stII(或ompA)信号序列和成熟hGH蛋白起始处之间裂解stII-hGH蛋白质(或ompA-hGH蛋白质)，因此保留了天然的hGH蛋白质。尽管据信周质空间是一个促进二硫键形成的氧化环境，但蛋白质二硫化物异构酶与牛胰腺胰蛋白酶抑制剂的共表达导致来自大肠杆菌周质的正确折叠的蛋白质产量提高6倍(Ostermeier等，(1996))。这一结果表明周质蛋白折叠有时可能是无效的且需要改进以适用大规模的蛋白质生产。
hGH具有4个半胱氨酸，形成两个二硫键。可使用stII或ompA信号序列将hGH分泌进大肠杆菌周质中。分泌的蛋白质是可溶的且具有生物学活性(Hsiung等，1986)。hGH的主要分泌形式是一种单体，以十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测得的表观分子量为22kDa。经过使用渗透压休克方法可从周质空间分离重组hGH(Koshland和Botstein，1980)，其中优先释放周质蛋白质而不是细胞内蛋白质进入渗透压休克缓冲液。然后经过柱层析纯化释放的hGH蛋白质(Hsiung等，1986)。
当尝试相似的方法分泌含游离半胱氨酸残基的hGH变异体(5个半胱氨酸；2N+1)时，发现当使用用于hGH的标准渗透压休克和纯化方法分离时重组hGH变异体形成多聚体并聚集。在渗透压体克裂解产物中或在柱层析纯化蛋白质期间以非还原性SDS-PAGE可检测到极少的单体hGH。
α-干扰素(IFN-α2)也含有4个半胱氨酸残基，形成两个二硫键。可使用stII信号序列将IFN-α2分泌进大肠杆菌周质中(Voss等，1994)。分泌的蛋白质是可溶的且具有生物学活性(Voss等，1994)。IFN-α2的主要分泌形式是一种单体，以SDS-PAGE测得的表观分子量为19kDa。经过柱层析纯化分泌的重组IFN-α2蛋白质(Voss等，1994)。
当尝试相似的方法分泌含游离半胱氨酸残基的IFN-α2变异体(5个半胱氨酸；2N+1)时，发现当使用用于IFN-α2的标准纯化方法分离时重组IFN-α2变异体形成多聚体并聚集。从柱中洗脱的IFN-α2变异体极不同于IFN-α2且使用用于IFN-α2的柱层析方法可纯化极少的单体IFN-α2变异体。
合成含游离半胱氨酸残基的蛋白质的另一方法是经过与琥珀酰亚胺6-[(3-2-吡啶二硫代)丙酰胺基]己酸(LC-SPDP，可从Pierce化学公司买到)进行化学反应将巯基引入翻译后的蛋白质中。LC-SPDP与赖氨酸残基反应产生游离巯基。使用该试剂结合马来酰亚胺蛋白修饰试剂可制备化学交联二聚体EPO(Sytkowsk等，1998)。由于EPO中各个赖氨酸残基的非特异性修饰，纯化后回收到化学交联的EPO蛋白质的异型混合物。已观察到化学交联的EPO蛋白质的药物动力学和体内效价增强。
已被用于增加蛋白质大小并提高其体内效价的另一方法包括使用化学交联剂将蛋白质二聚体化。据认为GH通过交联两个GH受体转导细胞信号。GH-GH二聚体可能有助于增强受体二聚体化并因此放大细胞内信号。
Mockridge等(1998)已描述了化学交联的二聚体hGH蛋白质。使用水溶性交联剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)，可随机衍化GH以主要产生酰胺连接的二聚体，取决于所用的EDC试剂的浓度也可产生酰胺交联的多聚体。尽管观察到体内效价提高，但由于EDC试剂与蛋白质中的各种氨基酸，包括赖氨酸，天冬氨酸和谷氨酸残基和氨基和羧基末端的非特异性反应使得最终的蛋白制品是异型的。由于EDC的毒性和对蛋白质之间形成的非天然酰胺键的潜在免疫原性反应，将该制品注射进人体是不理想的。在生产规模上产生一致批次的纯化蛋白也是困难的。
因此，尽管作出了极大的努力，仍然需求经过增加分子量产生长效重组蛋白的同型制品的方法。也需要允许以高产量分泌和回收含游离半胱氨酸残基的重组蛋白的方法。本发明满足了这些需要并提供了相关优势。
                        发明概述
本发明涉及获得具有游离半胱氨酸的可溶性蛋白质的方法。该方法一般通过获得能表达该可溶性蛋白质的宿主细胞，将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触，并从该宿主细胞中分离该可溶蛋白来完成。在一个实施方案中，蛋白质不被宿主细胞分泌进培养基中，在半胱氨酸封闭剂存在的条件下破碎宿主细胞并从破碎的宿主细胞可溶性部分分离或纯化该可溶性蛋白质。在另一种其中宿主细胞将该可溶性蛋白质分泌进培养基的实施方式中，在宿主细胞合成该可溶性蛋白质之前，期间或之后将宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触。
合适的宿主细胞包括细菌，酵母，昆虫或哺乳动物细胞。优选的是，宿主细胞是细菌细胞，特别是大肠杆菌。
优选的是，以本发明的方法生产的可溶性蛋白质是重组蛋白质，特别是蛋白质的半胱氨酸变异体或突变体。该方法用于产生包括，但不限于下列的蛋白质，人生长激素，EPO和干扰素，特别是α干扰素，它们的衍生物或拮抗剂。其它蛋白质包括TGF-β超家族的成员，血小板衍生的生长因子-A，血小板衍生的生长因子-B，神经生长因子，脑源性神经营养(neurotophic)因子，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4，血管内皮生长因子，或其衍生物或拮抗剂。也包括免疫球蛋白重链或轻链或其衍生物的半胱氨酸突变蛋白。
有用的半胱氨酸封闭剂包括任何巯基反应性化合物，包括例如，胱氨酸，胱胺，二巯基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，碘，过氧化氢，二氢抗坏血酸，连四硫酸盐，邻-亚碘酰基苯甲酸或在金属离子存在下的氧。
本方法还包括将PEG部分附着到可溶性蛋白上形成PEG化蛋白质的各种方法，其中PEG部分通过游离半胱氨酸附着到可溶性蛋白质上。含有两个或更多个可溶性蛋白质偶连的更高级多聚体蛋白质也在本发明的范围内。
本发明还包括以本文公开的方法制备的可溶性蛋白质及其衍生物，包括PEG化蛋白质。该PEG化蛋白质包括单PEG化hGH，EPO和α干扰素。
本发明还提供了以本文描述的方法获得的PEG化可溶性蛋白质的方法。所述方法包括纯化蛋白质，用二硫键(disulfie)还原剂至少部分还原该蛋白质并将该蛋白质与半胱氨酸反应性部分接触。任选的是，可从未修饰的蛋白质中分离该修饰的半胱氨酸蛋白。
本发明还包括治疗可用生长激素，EPO和α干扰素治疗的症状的方法。将可溶性蛋白质或其衍生物，包括PEG化衍生物给病人用药，其中已知生长激素，EPO或α干扰素对其所患的症状有效。
                       附图简述
图1是通过重叠延伸进行诱变的图解，其中从一个靶DNA片段扩增两个不同的片段。
                      本发明的描述
本发明提供了获得具有游离半胱氨酸残基的蛋白质的新方法。本发明还提供了以这些新方法生产的新蛋白质，特别是重组蛋白质以及这些重组蛋白质的衍生物。制备这些蛋白质的新方法一般通过下列步骤完成：
(a)获得能够表达具有游离半胱氨酸的蛋白质的宿主细胞；
(b)将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触；和
(c)从该宿主细胞分离该蛋白质。
在一个实施方案中，所述方法包括在半胱氨酸封闭剂存在的条件下破碎该宿主细胞，随后从破碎细胞的可溶性部分中分离该蛋白质的步骤。
在另一实施方案中，该蛋白质由原核或真核宿主细胞分泌进培养基中，该方法包括下列步骤：
(a)获得能够表达具有游离半胱氨酸的蛋白质的宿主细胞；
(b)在该具有游离半胱氨酸残基的蛋白质的合成期间，或合成之后但在纯化之前将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触；和
(c)从培养基的其它细胞成份中分离该蛋白质。
如上所述，这些方法的第一步是获得能够表达具有游离半胱氨酸残基的蛋白质的宿主细胞。合适的宿主细胞可以是原核或真核细胞。可用于表达重组蛋白质的合适的宿主细胞的例子包括细菌，酵母，昆虫和哺乳动物细胞。细菌细胞特别有用，特别是大肠杆菌。
本文所用的术语“具有游离半胱氨酸残基的蛋白质”指任意含有2N+1个半胱氨酸残基的天然或重组蛋白肽，其中，N可以是0或任意整数，和含有2N个半胱氨酸的蛋白质或肽，其中两个或多个半胱氨酸在正常情况下不参与形成二硫键。因此，本发明的方法可有效用于增强具有游离半胱氨酸的任意蛋白质或肽，特别是具有一个或多个游离半胱氨酸和/或具有2个或多个在天然情况下形成二硫键的半胱氨酸的半胱氨酸添加型重组蛋白质变体(本文称为“半胱氨酸突变蛋白”或“半胱氨酸变异体”)的表达，回收和纯化。尽管可用本发明的方法增强被其天然宿主细胞表达的具有游离半胱氨酸的天然蛋白质的表达，回收和纯化，但本文的描述主要是指仅用于说明目的的重组蛋白质。另外，所述蛋白质可来自任何动物种类，包括人类，陪伴(companion)动物和农场动物。
因此本发明包括广泛的重组蛋白质。这些蛋白质包括，但不限于，胶质来源的神经营养因子(GDNF)，转化生长因子-β1(TGF-β1)，TGF-β2，TGF-β3，抑制素A，抑制素B，骨形态发生蛋白-2(BMP-2)，BMP-4，抑制素α，米勒抑制物质(MIS)，OP-1(成骨蛋白1)，它们都是TGF-β超家族的成员。TGF-β超家族的单体亚基有一些共同的结构特征：它们一般含有8个高度保守的半胱氨酸残基，形成4个分子内二硫键。一般第9个保守的半胱氨酸在蛋白质的单体形式中是游离的，但参与单体亚基的同型二聚体化或杂二聚体化期间形成的分子间二硫键。TGF-β超家族的其它成员由Massague(1990)，Daopin等(1992)，Kingsley(1994)，Kutty等(1998)和Lawton等(1997)描述，本文引用以供参考。
免疫球蛋白重链和轻链单体也含有参与分子内二硫键的半胱氨酸残基以及游离半胱氨酸(Roitt等，1989和Paul，1989)。这些游离半胱氨酸一般仅参与多聚体化事件中形成的二硫键，例如，重链同型二聚体化，重链-轻链杂二聚体化，杂二聚体(重链-轻链)的同型二聚体化，和其它高级装配，例如，IgM中杂二聚体(重链-轻链)的五聚体化。因此，可采用本发明的方法增强诸如IgG1，IgG2，IgG3，IgG4，IgM，IgA1，IgA2，分泌型IgA，IgD和IgE等人类免疫球蛋白重链和/或轻链(或其各结构域)的表达，回收和纯化。也可同样表达，回收和纯化来自其它物种的免疫球蛋白。同样，也可表达，回收和纯化Chammow & Ashkenazi(1996)中所述的遗传融合到免疫球蛋白或免疫球蛋白结构域上的蛋白质。
本方法也可增强包括生长激素超家族成员的其它重组蛋白质的表达，回收和纯化。下列蛋白质由生长激素(GH)超基因家族的基因编码(Bazan(1990)；Bazan(1991)；Mott和Campbell(1995)；Silvennoinen和Ihle(1996)；Martin等，1990；Hannum等，1994)：生长激素，泌乳素，胎盘催乳激素，促红细胞生成素(EPO)，血小板生成素(TPO)，白细胞介素-2(IL-2)，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12(p53亚基)，IL-13，IL-15，制癌蛋白M，睫状神经营养因子，白血病抑制因子，α干扰素，β干扰素，γ干扰素，Ω干扰素，τ干扰素，粒细胞集落刺激因子(G-CSF)，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)，巨噬细胞集落刺激因子(M-CSF)，心脏营养蛋白-1(CT-1)，干细胞因子和flt3/flk2配体(“GH超基因家族”)。可预期将来可通过基因克隆和测序鉴定该基因家族中的其它成员。GH超基因家族的成员具有相似的二级和三级结构，尽管事实上它们一般具有有限的氨基酸或DNA序列相同性。共同的结构特征使得该基因家族的新成员容易被鉴定。
根据称为“半胱氨酸结”的共同结构基序将一组蛋白质分类为结构超家族。半胱氨酸结由6个保守的半胱氨酸残基限定，形成拓扑学上“打结”的3个分子内二硫键(McDonald和Hendrickson，1993)。这些蛋白质也形成同型二聚体或杂二聚体，且有些但不是所有情况下二聚体化涉及分子间二硫键形成。该家族的成员包括TGF-β超家族的成员和其它蛋白质，例如，血小板衍生的生长因子-A(PDGF-A)，PDGF-B，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养蛋白-3(NT-3)，NT-4，和血管内皮生长因子(VEGF)。胱氨酸和其它半胱氨酸封闭剂也可增强具有该结构基序的蛋白质的表达，回收和纯化。
本方法也可增强其它重组蛋白质和/或这些蛋白质的半胱氨酸添加型变异体的表达，回收和纯化。蛋白质的类型包括蛋白酶和其它酶，蛋白酶抑制剂，细胞因子，细胞因子拮抗剂，过敏原，趋化因子，促性腺激素，趋化素(chemotactin)，脂结合蛋白，垂体激素，生长因子，生长调节素，免疫球蛋白，白细胞介素，干扰素，可溶性受体，疫苗和血红蛋白。蛋白质的具体例子包括，例如，leptin，胰岛素，胰岛素样生长因子1(IGF1)，超氧化物歧化酶，过氧化氢酶，天冬氨酸酶，尿酸酶，成纤维细胞生长因子，精氨酸酶，苯丙氨酸氨(phenylalanine ammonia)，制管张素，内抑制素(endostatin)，VIII因子，IX因子，白细胞介素1受体拮抗剂，蛋白酶连接蛋白和抗凝血酶III。
其它得益于PEG化且因此可作为半胱氨酸添加型修饰的合理候选者的蛋白质变异体包括具有微弱可溶性或容易聚集的蛋白质或肽，对蛋白水解易感的蛋白质或肽，需要增强机械稳定性的蛋白质或肽，从体内迅速清除的蛋白质或肽，或具有不需要的免疫原性或抗原性特征的蛋白质或肽。
如果需要，一般可使用以定点PCR为基础的诱变构建天然蛋白质的突变体，一般按下述文献的描述进行：分子生物学方法：第15卷：PCR方法：常规(current)方法和应用，White，B.A.编(1993)，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ和PCR方法：方法和应用指南，Innis，M.A.等编，(1990)，学院出版社，San Diego，CA。通常将PCR引物寡核苷酸设计为能在蛋白质的编码序列中掺入核苷酸改变，导致在蛋白质特定位置的一个氨基酸被半胱氨酸残基取代。也可将这类诱变的寡核苷酸引物设计成在蛋白质编码序列的羧基末端或氨基末端掺入一个额外的半胱氨酸残基。如果需要的话，在后一种情况下，也可将一个或多个其它氨基酸残基掺入到所添加的半胱氨酸残基的氨基末端和/或羧基末端。而且如果需要的话，可将寡核苷酸设计成在蛋白质编码序列的特定位置将半胱氨酸残基作为插入突变而掺入。同样，也可与半胱氨酸残基一起插入一个或多个其它氨基酸，这些氨基酸可位于该半胱氨酸残基的氨基末端和/或羧基末端。
对诱变型寡核苷酸(oligo)的序列的选择依赖于所需半胱氨酸将要放入的位置和有用的限制性核酸内切酶位点的相似性。一般来说，需要在靠近寡核苷酸中央的位置放置突变，即，错配片段以增强寡核苷酸与模板的退火。也需要使该诱变型寡核苷酸跨越一个特有的限制性位点，以便可裂解PCR产物产生一个容易被克隆进合适载体的片段。一个例子是可用于表达突变蛋白或提供用于切下突变基因并容易将其克隆进所述表达载体的常规限制性位点的寡核苷酸。一般需要采用长度为80个碱基以下的诱变型寡核苷酸，更优选30-40个碱基长度。有时突变位点和限制性位点分开，其距离大于合成性寡核苷酸合成所需的距离。在这种情况下，可采用多轮PCR递增式延长PCR产物的长度，以便它可包括所需有用的限制性位点或可重新改造或重新合成作为诱变的靶的基因以便在合适的位置插入限制性位点。另外，也可采用PCR诱变方法的变化形式构建该突变，例如，所谓的“大引物方法”(Barik，S.，分子生物学方法，第15卷，第277-286页；PCR方法：常规方法和应用，White，B.A.编辑(1993)Humana出版社，Totowa，NJ)或“通过重叠延伸实施的基因剪接”(Horton，R.M.分子生物学方法，第15卷，第251-261页；PCR方法：常规方法和应用，White，B.A.编辑(1993)Humana出版社，Totowa，NJ)，均为本文引用以供参考。
接着，将宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触。在一个实施方案中，该封闭剂在细胞破碎时存在，且优选在破碎细胞前加入。细胞破碎可经过，例如，机械剪切(例如费氏细胞压碎器)，酶消化，超声处理，匀浆，玻璃珠旋转，去污剂处理，有机溶剂，冻融，用氧化铝或沙研磨等(Bollag等，1996)。
在另一实施方案中，在诱导宿主细胞表达所需蛋白质之前，期间或之后将半胱氨酸封闭剂与宿主细胞接触。例如，可在半胱氨酸封闭剂存在的条件下培养宿主细胞，其中优选表达将被分泌进培养基的蛋白质，如促红细胞生成素。或者，在宿主细胞接触半胱氨酸封闭剂之前或期间，可诱导宿主细胞，或者作为分泌进周质或培养基中的蛋白质，或者作为胞质蛋白质，来表达所需蛋白质。可根据细胞来源使用本领域已知的方法诱导该细胞质中的表达或指导分泌，包括，例如，在下面实施例中所述的方法。已成功使用各种信号肽将蛋白质运输到周质空间。其例子包括原核信号序列，例如，ompA，stII，PhoA信号(Denefle等，1989)，OmpT(Johnson等，1996)，LamB和OmpF(Hoffman和Wright，1985)，β-内酰胺酶(Kadonaga等，1984)，肠毒素LT-A，LT-B(Morioka-Fujimoto等，1991)，和来自金黄色葡萄球菌的蛋白A(Abrahmsen等，1986)。帮助某些蛋白质分泌的许多非天然的，合成的信号序列也是本领域的技术人员已知的。
对于分泌进周质的蛋白质，可使用渗透压休克处理选择性地破坏宿主细胞的外膜使得周质蛋白质释放。渗透压休克缓冲液可以是本领域已知的任何渗透压休克缓冲液，包括，例如，Hsiung等(1986)所述的渗透压休克缓冲液和方法，或如下面实施例所述。对于分泌进培养基的蛋白质，优选在细胞表达和分泌该蛋白质时培养基含有半胱氨酸封闭剂。也可以在蛋白质分泌后但在蛋白质纯化之前向培养基中加入半胱氨酸封闭剂。
向培养基中加入的半胱氨酸封闭剂的浓度范围是大约0.1μM至大约100mM。优选的是，培养基中半胱氨酸封闭剂的浓度是大约50μM至大约5mM。
尽管不希望受任何特定的理论所束缚，但据信用于本方法的半胱氨酸封闭剂共价附着到“游离”的半胱氨酸残基上，形成混合的二硫化物，从而稳定游离的半胱氨酸残基并防止蛋白质的多聚体化和聚集。另外，如果在蛋白质分泌进周质空间后发生不完全复性，那么在渗透压休克缓冲液中氧化剂的存在可能扩大蛋白质的再折叠过程。然而，如上所述，周质蛋白质再折叠的效率可能较低(ineffcient)。因此，据信向渗透压休克缓冲液中加入胱氨酸也可增加含有偶数个半胱氨酸残基的重组蛋白质的回收，即使在正常情况下半胱氨酸形成二硫键。另外，本发明人相信在细菌生长期间向发酵培养基中加入胱氨酸或类似化合物可能是具有优势的，因为由于细菌外膜的多孔性这些化合物可扩散进周质。蛋白折叠和游离半胱氨酸的封闭可在细胞回收和裂解前完成。早期的蛋白质稳定可防止蛋白水解且有助于获得更高的重组蛋白回收率。
许多巯基反应性化合物可用作半胱氨酸封闭剂以稳定含有游离半胱氨酸的蛋白质。除了胱氨酸外，封闭剂也包括含二硫键的试剂，例如，胱胺，二巯基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，5，5′-二硫双(2-硝基苯甲酸)(Ellman′s试剂)，吡啶二硫化物，R-S-S-CO-OCH3型化合物，胱氨酸的其它衍生物，例如二甲酰胱氨酸，二乙酰胱氨酸，二甘氨酰胱氨酸，二丙氨酰胱氨酸，二谷氨酰胱氨酸，胱氨酰二甘氨酸，胱氨酰二谷氨酰胺，二丙氨酰胱氨酸二酐，胱氨酸苯基乙内酰脲，高胱氨酸，二硫代二丙酸，二甲基胱氨酸，或任何二巯基化合物或能进行二硫化物交换反应的化合物。亚氧硫基卤化物也可用于制备混合的二硫化物。可用于稳定半胱氨酸添加型蛋白变异体的其它巯基封闭剂包括能与游离巯基可逆反应的化合物。这些试剂包括某些重金属盐或锌，汞和银的有机衍生物。其它硫醇盐形成剂或可逆性巯基反应性化合物如R.Cecil和J.R.McPhee，(1959)和Torchinskii，(1971)所述。
在一般方法的最后一步中，所需的蛋白质从可溶性细胞质部分，可溶性周质部分或培养基的可溶性部分回收和纯化。可使用从培养基，细胞质或周质部分回收和纯化蛋白质的任何方法。这些回收和纯化方法是已知的或本领域的技术人员容易确定的，包括，例如，离心，过滤，透析，层析，包括大小排阻层析等方法。回收和纯化所需蛋白质的合适方法部分取决于蛋白质的特性和目的用途。
本发明还提供了产生可溶性干扰素，特别是α干扰素的新方法，导致回收的正确加工的干扰素的百分比显著提高。该方法包括在大约5到大约6.5，且优选大约5.5到大约6.5的pH范围内培养能表达干扰素的宿主细胞。已公开的报道(Voss等，(1994))使用更高的pH仅产生50％正确加工的干扰素，而本发明的新方法在较低的pH下回收到大约80-90％。
已发现某些单体hGH半胱氨酸变异体在使用层析方法纯化这些蛋白质时形成二硫键连接的二聚体hGH蛋白质。当从柱缓冲溶液中去除胱氨酸时形成二硫键连接的hGH二聚体。由于二硫键连接的二聚体hGH蛋白质在使用柱层析步骤纯化该蛋白质的过程中行为不同于单体hGH蛋白质，因此开发了纯化二硫键连接的二聚体hGH蛋白质的新方法。意想不到的是，已发现这些二硫键连接的二聚体hGH蛋白质在体外生物试验中具有生物学活性。具有生物学活性的，同型的，二硫键连接的二聚体hGH蛋白质是新的。因此，本发明还涉及这些具有生物学活性的，同型的，二硫键连接的二聚体hGH蛋白质。也包含高级多聚体，包括三聚体，四聚体等，如下面实施例所述。
如果需要，可进一步加工纯化的蛋白质。例如，该蛋白质可用各种半胱氨酸反应性PEG试剂在游离半胱氨酸位点被PEG化，并随后作为单PEG化蛋白质纯化。术语“单PEG化”定义为指通过单个PEG部分共价附着到蛋白质的特定位点而修饰的蛋白质。可使用本领域的技术人员已知的任何方法，包括，例如，下面实施例，特别是实施例11中描述的方法。
Braxton(1998)教导了使蛋白质的半胱氨酸突变蛋白，特别是GH和促红细胞生成素的半胱氨酸突变蛋白PEG化的方法。特别是Braxton(1998)教导了用于PEG化半胱氨酸突变蛋白的缓冲液不应含有还原剂。Braxton(1998)提供的还原剂的例子是β巯基乙醇(BME)和二硫苏糖醇(DTT)。当使用相似方法来PEG化GH，促红细胞生成素和α干扰素的半胱氨酸突变蛋白时，发现这些半胱氨酸突变蛋白不与PEG连接。现在已发现用还原剂处理纯化的半胱氨酸突变蛋白是蛋白质与PEG化蛋白质所必需的。尽管不希望被任何具体理论所束缚，但本发明人相信还原剂是还原混合的二硫化物并暴露蛋白质中的游离半胱氨酸残基以便游离的半胱氨酸与PEG试剂反应所必需的。因此，本发明还涉及使GH，促红细胞生成素，α干扰素的半胱氨酸突变蛋白和其它含有2N+1个半胱氨酸残基的蛋白质，含有2N个半胱氨酸残基且其中2个或多个半胱氨酸残基游离的蛋白质，特别是游离半胱氨酸残基被混合的二硫化物封闭的那些突变体和蛋白质PEG化的方法。
本发明还涉及由本文公开的方法产生的纯化的，单PEG化蛋白质变异体，它们不仅具有生物学活性，还在蛋白质依赖型哺乳动物细胞增殖试验中保持高比活。所述蛋白质变异体包括，例如，下列纯化的，单PEG化半胱氨酸突变蛋白：hGH，EPO和αIFN。例如，单PEG化hGH变异体的体外生物学活性比使用NHS-PEG试剂PEG化的hGH的生物学活性高10-100倍。
在单PEG化hGH的一个实施方案中，聚乙二醇附着到hGH的C-D环上，所得的单PEG化hGH的EC50不到大约110ng/ml(5nM)，优选不到大约50ng/ml(2.3nM)。另外，聚乙二醇部分可附着到hGH的靠近螺旋A的区域，所得的单PEG化hGH的EC50不到大约110ng/ml(5nM)，优选不到大约11ng/ml(0.5nM)，更优选不到大约2.2ng/ml(0.1nM)。
在单PEG化EPO的一个实施方案中，聚乙二醇附着到EPO的C-D环上，所得的单PEG化EPO的EC50不到大约1000ng/ml(21nM)，优选不到大约100ng/ml(大约6nM)，更优选不到大约10ng/ml(0.6nM)，最优选不到大约1ng/ml(大约0.06nM)。另外，聚乙二醇分子可附着到EPO的A-3环上，所得的单PEG化EPO的EC50不到大约100ng/ml(大约5nM)，优选不到20ng/ml(大约1nM)，且更优选不到大约1ng/ml(大约0.05nM)。
在单PEG化αIFN的一个实施方案中，聚乙二醇附着到αIFN的靠近螺旋A的区域，所得的单PEG化αIFN的IC50不到大约100pg/ml(大约5pM)，更优选不到大约50pg/ml(大约2.5pM)，最优选大约22ng/ml(大约1.2pM)。另外，聚乙二醇分子可附着到IFN-α2的C-D环上，所得的单PEG化IFN-α2的EC50不到大约100pg/ml(大约5pM)。
有25个以上不同的IFN-α基因(Pestka等，1987)。IFN-α家族的成员具有不同程度的氨基酸同源性且表现出生物学活性的重叠。通过将不同IFN-α蛋白质的区域连接起来产生的非天然重组IFN-α处于临床开发的各个阶段(Horisberger和DiMarco，1995)。也描述了在IFN-α的各位置掺入最常见氨基酸的非天然“共有”干扰素(Blatt等，1996)。使IFN-α2的半胱氨酸突变蛋白PEG化的合适位置可直接适用于IFN-α基因家族的其它成员和非天然IFN-α。Kinstler等，(1996)描述了单PEG化共有干扰素，其中该蛋白质在N-末端，非天然的甲硫氨酸残基上优先与单个PEG连接。PEG化蛋白质的生物学活性比未修饰的共有干扰素降低大约5倍(Kinstler等，1996)。
本发明还提供了互相之间或与化学基团之间能共价附着或连接以产生高级多聚体，如二聚体，三聚体和四聚体的蛋白质变异体。可按照本领域的技术人员已知的方法或按下面实施例15所述的方法产生该高级多聚体。例如，该连接可产生比相应的天然蛋白质具有更高分子量的hGH，EPO或αIFN加合物。适用于偶连的化学基团优选是非毒性的和非免疫原性的。这些化学基团包括糖类或聚合物，例如多元醇。
用于附着本发明的半胱氨酸变异体以形成“PEG化”蛋白质的“PEG部分”包括任何合适的多聚体，例如，线性或带支链的多元醇。优选的多元醇是聚乙二醇，它是由环氧乙烷单元组成的合成多聚体。可改变环氧乙烷单元以便通过大小排阻层析获得表观分子量范围为大约30-500,000的PEG化蛋白质变异体。PEG部分的大小直接影响其循环半衰期(Yamaoka等，(1994))。因此，可通过改变PEG部分的大小或结构来加工具有不同循环半衰期的蛋白变异体使之用于具体治疗应用或优选的剂量方案。因此，本发明包含GH蛋白质变异体，其以大小排阻层析测定具有超过大约30kDa，且更优选超过大约70kDa的表观分子量，其EC50不到大约400ng/ml(18nM)，优选不到10ng/ml(5nM)，更优选不到大约10ng/ml(0.5nM)，甚至更优选不到大约2.2ng/ml(0.1nM)。本发明还包含EPO蛋白质变异体，其以大小排阻层析测定具有超过大约30kDa，且更优选超过大约70kDa的表观分子量，其EC50不到大约1000ng/ml(21nM)，优选不到100ng/ml(6nM)，更优选不到大约10ng/ml(0.6nM)，甚至更优选不到大约1ng/ml(0.06nM)。本发明还包含αIFN(IFN-α)蛋白质变异体，其以大小排阻层析测定具有超过大约30kDa，且更优选超过大约70kDa的表观分子量，其IC50不到大约1900pg/ml(100pM)，优选不到400pg/ml(21pM)，更优选不到100pg/ml(5nM)，甚至更优选不到大约38pg/ml(2pM)。
用于半胱氨酸修饰的反应性PEG末端基团包括但不限于乙烯砜，马来酰亚胺和碘乙酰基团。PEG末端基团应对游离巯基具有特异性，在不损伤蛋白质的条件下发生反应。
也可使用添加了半胱氨酸的变异型GH制备拮抗剂hGH变异体，其中化学衍化不干扰受体结合但阻止信号加工。可得益于GH拮抗剂给药的病症包括肢端肥大症，血管性眼病，糖尿性肾病，血管形成术后的再狭窄和生长激素反应性恶性肿瘤。
本文使用的术语“衍生物”指以本文方法表达和回收的任何蛋白质变异体。这类变异体包括，但不限于，PEG化形式，二聚体或其它高级变异体，氨基酸变异体，融合蛋白，糖类的改变，磷酸化或在天然蛋白质中发现的其它附着基团，以及本文公开的任何其它变异体。
本文方法产生的化合物可用于各种体外和体内用途。本发明的蛋白质及其衍生物可用于对于其野生型，天然的，或以前已知的修饰型对应物已知的研究，诊断或治疗目的。体外用途包括，例如，使用该蛋白质用于筛选，检测和/或纯化其它蛋白质。
对于治疗用途，技术人员可容易地确定合适的剂量，给药频率和给药途径。作出这些决定的因素包括，但不限于，所施用的蛋白质的特性，所需治疗的病症，潜在的病人应变性，病人的年龄和体重等。本发明的化合物也可用作传递载体用于增强所附着的治疗剂的循环半衰期或指导向体内特异性靶的传递。
下面的实施例并不打算限制本发明，而仅仅是对本发明的具体实施方案的举例。
实施例1
人生长激素体外生物测定的建立
已建立了使用以兔GH受体稳定转染的鼠FDC-P1细胞系的hGH细胞增殖测定(Rowlinson等，1995)。小鼠FDC-P1细胞系从美国典型培养物保藏中心购买且按常规在补充了10％胎牛血清，50μg/ml青霉素，50μg/ml链霉素，2mM谷氨酰胺和17-170单位/ml小鼠IL-3的RPMI1640培养基(FDC-P1培养基)中繁殖。
A.克隆编码兔GH受体的cDNA
使用正向引物BB3(5’-CCCCGGATCCGCCACCATGGATCTCTGGCAGCTGCTGTT-3’)(SEQ.ID.NO.1)和反向引物BB36(5’-CCCCGTCGACTCTAGAGCCATTA GATACAAAGCTCT TGGG-3’)(SEQ.ID.NO.2)经过PCR克隆兔GH受体。BB3与编码受体的起始甲硫氨酸和氨基末端部分的DNA序列退火。BB3含有一个在起始甲硫氨酸之前的优化的KOZAK序列和用于克隆目的的Bam HI位点。BB36与兔GH受体mRNA的3’不翻译区退火且含有用于克隆目的的Xba I和Sal I限制性位点。兔肝脏poly(A)+mRNA(从CLONTECH公司购买)用作单链cDNA第一链合成的底物以产生用于PCR扩增的模板。使用Boehringer Mannheim公司的用于RT-PCR(AMV)的第一链cDNA合成试剂盒完成单链cDNA的第一链合成。使用随机六聚体或BB36作引物进行平行的第一链cDNA合成。使用第一链合成的产物作模板以引物BB3和BB36进行随后的PCR反应。在使用随机6聚体引发的或BB36引发的cDNA作模板的PCR反应中观察到预期的～1.9kb的PCR产物。用Bam HI和Xba I消化随机6聚体引发的cDNA，产生两个片段(～365bp和～1600bp)，因为兔GH受体基因含有一个内部Bam HI位点。凝胶纯化两个片段。然后以两步克隆全长兔GH受体cDNA。首先将～1600bp的Bam HI-Xba I片段克隆进已用相同的这两个酶消化的pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司)中。这些克隆容易以合理的频率获得并且以限制性消化和随后的测序显示没有缺失。为了完成兔受体cDNA克隆，将含有1600bp Bam HI-Xba I片段的一个测序质粒用Bam HI消化，用小牛碱性磷酸酶处理，凝胶纯化并与含有兔GH受体基因5’部分的凝胶纯化的～365bp Bam HI片段连接。挑出连接后的转化子并经过限制性消化和PCR分析以证实存在～365bp的片段并测定其相对于兔GH受体基因远端片段的方向。然后证实全长克隆的序列。该质粒命名为pBBT118，用于稳定转染FDC-P1细胞。
B.选择表达兔GH受体的稳定转染的FDC-P1细胞
使用Qiagen的“无内毒素的质粒纯化试剂盒”制备无内毒素的pBBT118DNA用于转染FDC-P1细胞。从R&D系统购买小鼠IL-3。使用从GIBCO购买的DMRIE-C阳离子化的脂试剂，按照生产商的说明用质粒pBBT118转染FDC-P1细胞。简单地说，在6孔组织培养盘中将4μg质粒DNA与4-30μl DMRIE-C试剂在1ml的OptiMEM培养基(GIBCO)中混合45分钟。复合物形成后，向各孔中加入2×106个在200μl补充了小鼠IL-3的OptiMEM培养基中的FDC-P1细胞且混合物在37℃放置4小时。最终的小鼠IL-3浓度为17单位/ml。向各孔中加入2ml含有15％胎牛血清的FDC-P1培养基并将细胞在37℃放置过夜。第二天将转染的细胞转移到含有15ml补充了IL-3(17U/ml)，hGH(5nM)和10％马血清而非胎牛血清的FDC-P1培养基中。由于有报道胎牛血清含有对FDC-P1细胞的生长促进活性而使用马血清。3天后离心细胞并重悬于含有400μg/ml G418，17U/ml IL-3，5nM hGH，10％马血清的新鲜FDC-P1培养基中并在37℃下培养。每过几天更换培养基。将各次转染的细胞分进含有新鲜培养基以及小鼠IL-3(17U/m1)，或者hGH(5nM)的T-75组织培养瓶中。从含有IL-3以及含有hGH的培养瓶中都获得了G418抗性细胞。用于生物测定的转化子来自含有hGH的培养瓶。经过有限稀释选择了12个独立的细胞系。其中5个细胞系(GH-R3，-R4，-R5，-R6和-R9)显示出对hGH较好的增殖应答。初步实验表明各个细胞系对于hGH的EC50是相似的，尽管生长应答的大小随细胞系发生变化。对GH-R4细胞系进行了最详细的研究并用于下面提供的测定。细胞系按常规在含有10％马血清，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素，2nM谷氨酰胺，400μg/ml G418和2-5nM垂体hGH或由GH的RPMI 1640培养基中繁殖。
C.使用表达兔GH受体的FDC-P1建立hGH生物测定
建立Rowlinson等(1995)所述的MTT细胞增殖测定的改良形式以测量hGH的生物学活性。我们在测定中测量了染料MTS的吸收和还原，该染料产生可溶性产物，它不同于MTT，MTT产生必须用有机溶剂溶解的不溶性产物。使用MTS的优势在于可测定孔中的吸光度而不需用有机溶剂裂解细胞。
用无酚红的RPMI 1640培养基洗涤GH-R4细胞三次并以1×105个细胞/ml的浓度重悬于测定培养基(无酚红的RPMI 1640，10％马血清，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素，400μg/ml G418)中。向96孔平底组织培养板的孔中加入50微升细胞悬液(5×103个细胞)。在测定培养基中制备3倍系列稀释的蛋白质样品并以50μl的体积加入微滴定孔中。产生每孔100μl的最终体积。蛋白质样品以一式三份孔进行测定。平板在湿润的5％CO2组织培养箱中37℃下培养66-72小时，此时向各孔中加入20μl MTS/PES(PES是电子偶合剂)试剂混合物(CellTITER 96 Aqueous One溶液试剂，Promega公司)。2-4小时后在490nm下测定孔中的吸光度。计算一式三份孔中的吸光度平均值+/-标准偏差。对照孔含有培养基但无细胞。从样品孔的吸光度值中减去对照孔的吸光度值(通常为0.06-0.2个吸光度单位)。对照实验证实与在吸光度值2以内吸光度信号细胞数相关。所有测定包括人垂体GH标准品。除了测定培养基不含G418且用胎牛血清取代马血清外按上面所述进行使用亲本FDC-P1细胞系的实验。
实施例2
克隆和表达rhGH
A.克隆编码人生长激素(GH)的cDNA
使用聚合酶链式反应(PCR)技术和引物BB1和BB2从人垂体单链cDNA(从CLONTECH公司，Palo Alto，CA购买)扩增人GH cDNA。BB1的序列是(5’-GGGGGTCGACCATATGTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3’)(SEQ.ID.NO.4)。BB2的序列是(5’-GGGGGATCCTCACTAGAAGCCACAGCTGCCCTC-3’)(SEQ.ID.NO.4)。引物BB1设计成编码成熟GH的第一个氨基酸(苯丙氨酸)之前的起始甲硫氨酸和用于克隆目的的SalI和NdeI位点。反向引物BB2含有用于克隆目的的Bam HI位点。PCR反应含有各20pmole的各种寡核苷酸引物，1XPCR缓冲液(含有MgCl2的Perkin-Elmer缓冲液)，4种核苷酸dA，dC，dG和dT的浓度各为200μM，2ng单链cDNA，2.5单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer)和2.5单位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。PCR反应条件为：96℃3分钟，35个循环的(95℃，1分钟；63℃30秒；72℃1分钟)，接着72℃10分钟。使用的热循环仪是Amplitron II热循环仪(Thermolyne)。大约600bp的PCR产物用Sal I和Bam HI消化，凝胶纯化并克隆进同样消化的质粒pUC19(可从新英格兰生物实验室，Beverly，MA买到)中。将连接混合物转化进大肠杆菌菌株DH5α中并在含氨苄青霉素的LB平板上选择转化子。几个菌落在LB培养基上生长过夜，使用从Qiagen公司(Valencia，CA)买到的小质粒DNA分离试剂盒分离质粒DNA。测定克隆LB6具有正确的DNA序列。
为了在大肠杆菌中表达，用Nde I和Eco RI消化克隆LB6，凝胶纯化大约600bp的片段并克隆进已用相同的酶消化并用小牛碱性磷酸酶处理的质粒pCYB1(可从新英格兰生物实验室，Beverly，MA买到)中。将连接混合物转化进大肠杆菌DH5α中并在含氨苄青霉素的LB平板上选择转化子。从几个转化子分离质粒DNA并通过用Nde I和Eco RI消化进行筛选。鉴定了一个正确的克隆并命名为pCYB1：wtGH(pBBT120)。将该质粒转化进大肠杆菌菌株JM109或W3110(可从新英格兰生物实验室和美国典型培养物保藏中心获得)中。
B.stII-GH的构建
使用野生型GH克隆LB6(pUC19：野生型GH)作模板以构建含有大肠杆菌stII信号序列的GH克隆。由于其长度，在连续两个PCR反应中加入stII序列。第一个反应使用正向引物BB12和反向引物BB10。BB10具有序列(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(SEQ.ID.NO.5)。BB12具有序列(5’-GCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATTCCCAACCATTCCCTTATCCAG-3’)(SEQ.ID.NO.6)。PCR反应按扩增野生型GH的所述方法进行。使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)凝胶纯化大约630bp的PCR产物，在水中稀释50倍，取2μl用作第二次PCR反应的模板。第二次PCR反应使用反义引物BB10和正向引物BB11。BB11具有序列(5’CCCCCTCTAGACATATGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG-3’)(SEQ.ID.NO.7)。引物BB11含有用于克隆目的的XbaI和NdeI位点。PCR条件按第一次反应所述进行。大约660bp的PCR产物用XbaI和BamHI消化，凝胶纯化并克隆进同样酶切的质粒pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司，Carlsbad，CA)中。测定克隆pCDNA3.1(+)∷stII-GH(5C)或“5C”具有正确的DNA序列。
用NdeI和BamHI裂解克隆“5C”并克隆进同样酶切的pBBT108(pUC19的缺失Pst I位点的衍生物，该质粒在下面描述)中。用这些酶消化后鉴定具有正确插入片段的克隆。该克隆命名为pBBT111，用Nde I和Sal I消化该克隆，凝胶纯化含有stII-GH融合基因的660bp的片段并克隆进用相同酶消化并用小牛碱性磷酸酶处理的质粒表达载体pCYB1(新英格兰生物实验室)中。用限制性核酸内切酶消化鉴定含有stII-GH插入片段的重组质粒。选择一个这样的分离物用于进一步的研究并命名为pBBT114。将该质粒转化进大肠杆菌菌株JM109或W3110(可从新英格兰生物实验室和美国典型培养物保藏中心获得)中。
C.构建ompA-GH
使用野生型GH克隆LB6(pUC19：野生型GH)作模板以构建含有大肠杆菌ompA信号序列的GH克隆。由于其长度，在连续两个PCR反应中加入ompA序列。第一个反应使用正向引物BB7(5’GCAGTGGCACTGGCTGGTTTCGCTACCGTAGCGCAGGCCTTCCCAACCATTCCCTTATCCAG3’)(SEQ.ID.NO.8)和反向引物BB10：(5’CGCGGATCCGATTAGAATCCACAGCTCCCCTC3’)(SEQ.ID.NO.5)。除了使用大约4ng的质粒LB6作为模板而不用单链cDNA外，按扩增野生型GH所述进行PCR反应，PCR条件为96℃3分钟，30个循环的(95℃，1分钟；63℃30秒；72℃1分钟)，接着72℃10分钟。使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)凝胶纯化大约630bp的PCR产物，在水中稀释50倍，取2μl用作第二次PCR反应的模板。第二次PCR反应使用反义引物BB10和正向引物BB6：(5’CCCCGTCGACACATATGAAGAAGACAGCTATCGCGATTGCAGTGGCACTGGCTGGTTTC3’)(SEQ.ID.NO.9)。PCR条件按第一次反应所述进行。大约660bp的PCR产物凝胶纯化，用Sal I和BamH1消化并克隆进用Sal I和BamH1酶切的pUC19(新英格兰生物实验室)中或用Xho I和BamH1酶切(Sal I和Xho I产生相容性单链突出端)的pCDNA3.1(+)(Invitrogen公司)中。当测序几个克隆时，发现所有的pUC19(8/8)克隆在ompA序列区域含有错误。仅测序了一个pCDNA3.1(+)克隆且它在ompA区域含有序列多义性(ambiguity)。为了产生正确的ompA-GH融合序列，将含有用常规限制性位点分离的不同错误的两个已测序克隆的基因片段重组并克隆进缺少PstI位点的pUC19衍生物(见下述pBBT108)中。所得的质粒称为pBBT112，它携带ompA-GH融合基因，将该基团作为NdeI-BamH1片段克隆进pBBT108的这些相同位点。该质粒命名为pBBT112，用于下面所述的以PCR为基础的，GH的定点诱变。
D.构建Pst I-pUC19(pBBT108)
为了促进克隆的GH基因的诱变以构建选定的半胱氨酸取代和插入突变，按如下构建质粒pUC19(新英格兰生物实验室)的缺失了Pst I位点的衍生物。用Pst I消化pUC19质粒DNA并随后使用补充了200μM dNTP的卖主提供的反应缓冲液用Pfu DNA聚合酶(Stratagene)在75℃下处理。在这些条件下，聚合酶将消化用Pst I切割产生的3’单链突出端但不消化成双链区，其净结果为缺失含有Pst I识别位点中间4个碱基的4个单链碱基。所得的分子具有双链末端，即钝末端。经过这些酶反应后，使用Qiaex II凝胶提取试剂盒(Qiagen公司)凝胶纯化线型单体。按照卖主的方案用T4 DNA连接酶(新英格兰实验室)处理纯化的DNA，用Pst I消化并用于转化大肠杆菌DH5α。挑出转化子并经过用Pst I和Bam H1限制性消化进行分析。挑出的一个转化子不被Pst I裂解但在其邻近的Bam H1位点被裂解，将该转化子命名为pBBT108。
E.在大肠杆菌中表达met-hGH和stII-hGH
将编码met-hGH的pBBT120和编码stII-hGH的pBBT114转化进大肠杆菌菌株W3110中。将亲本载体pCYB1也转化进W3110中。所得的菌株命名如下：
BOB130：W3110(pCYB1)＝仅含载体
BOB133：W3110(pBBT120)＝met-hGH
BOB132：W3110(pBBT114)＝stII-hGH
这些菌株在含有100μg/ml氨苄青霉素的Luria肉汤(LB)中37℃下生长过夜。饱和的过夜培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为大约0.025 O.D并在摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.25-0.5时，加入IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。对于起始实验，在诱导后0，1，3，5和大约16小时时取培养物样品。沉淀诱导的和未诱导的培养物样品且需要时重悬于加入了1％β-巯基乙醇(BME)的SDS-PAGE样品缓冲液。样品在预制的14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上电泳。用考马斯兰染色凝胶或经过Western印迹分析。
对表达met-hGH的BOB133菌株和表达stII-hGH的BOB132的全细胞裂解产物的考马斯兰染色显示出一条与购自Research Diagnostics公司的纯化rhGH标准品一起迁移的大约22kDa的带。诱导过夜后在诱导的培养基中rhGH带是最显著的。使用购自美国生物学公司的多克隆兔抗hGH抗血清的Western印迹证实在诱导后3和16小时的诱导的BOB132和BOB133培养物裂解产物中均存在rhGH。在诱导后3或16小时的对照菌株BOB130(仅含载体)的诱导培养物中经过Western印迹检测不到rhGH。
按上述制备诱导的BOB132(表达stII-hGH)培养物并根据Koshland和Botstein(1980)的分析方法进行渗透压休克。该方法破裂大肠杆菌的外膜并将周质内容物释放进周围的培养基中。随后的离心分离可溶性周质成分(在上清中回收)与细胞质，不溶性周质和细胞相关成分(在沉淀中回收)。具体地说，含有st-IIhGH质粒的大肠杆菌菌株W3110在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中37℃下生长过夜。饱和的过夜培养物在25ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.03 O.D并在250ml摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.4时，加入100mM IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。然后将诱导培养物在37℃下培养过夜(大约16小时)。当诱导的过夜培养物在A600下O.D.达到3.3时，在Eppendorf 5415C型微量离心机中4℃下以14,000rpm离心4 O.D.(1.2ml)5分钟。细胞沉淀经研磨和旋转重悬于冰冷却的20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH8.0中达到大约10O.D.，加入EDTA pH8.0至最终浓度为17mM。重悬的细胞在冰上培养10分钟并按上述离心。所得的沉淀经研磨和旋转重悬于冰冷却的水中达到大约10 O.D.并在冰上培养10分钟。然后按上述离心重悬的细胞并经过SDS-PAGE分析所得的上清(可溶性周质部分)和细胞沉淀(不溶性周质和细胞相关成分)。
发现BOB132合成的大量rhGH是可溶的且位于周质中。周质rhGH蛋白质与纯化的垂体hGH标准品在大小上无区别表明stII信号序列在蛋白分泌期间被除去。
实施例3
rhGH的纯化和生物活性
A.野生型rhGH的纯化
为了大量纯化野生型rhGH，根据Hsiung等(1986)所述的制备方法对330ml的BOB132培养物(表达stII-hGH)进行诱导，培养过夜并进行渗透压休克。具体地说，将含有stII-hGH质粒的大肠杆菌菌株W3110在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB培养基中37℃下生长过夜。饱和的过夜培养物在2×250ml(500ml总体积)含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.03 O.D.并在2L摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.4时，加入100mM IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。然后将诱导培养物在37℃下培养过夜(大约16小时)。诱导的过夜培养物在A600下O.D.达到大约3.8，使用Sorval RC-5离心机和GSA转子4℃下以8,000rpm离心5分钟。合并细胞沉淀，经研磨重悬于冰冷却的20％蔗糖，10mMTris-HCl pH8.0中达到大约47 O.D.，加入EDTA pH8.0至最终浓度为大约25mM。重悬的细胞在冰上培养10分钟并在带有854转子的IEC Centra MP4R离心机中4℃下以8,500rpm离心7分钟。所得的沉淀经研磨和旋转重悬于冰冷却的水中达到大约47 O.D.并在冰上培养30分钟。然后按上述在IEC离心机中离心重悬的细胞并经过SDS-PAGE分析所得的上清(可溶性周质部分)和细胞沉淀(不溶性周质和细胞相关成分)。该凝胶同样表明所产生的rhGH是可溶的且位于周质中，与垂体hGH标准品在大小上无区别。
rhGH在根据Becker和Hsiung(1986)所述的两步方法中纯化。将来自渗透压休克的上清上样到在10mM Tris-HCl pH8.0中平衡的5ml PharmaciaHiTrap Q Sepharose柱上，并用15倍柱体积的50-250mM线型NaCl梯度洗脱结合的蛋白质。经过SDS-PAGE分析柱级分。以大约100-125mM的盐浓度洗脱的级分22-25富含hGH，合并这些级分，浓缩并进一步在Superdex 200HR 10/30大小分离柱上分离。来自Superdex柱的级分34-36(根据分子量标准的洗脱曲线代表分子量大约21-22kDA)含有大多数rhGH，合并且作为冷冻等分试样贮存于-80℃。以280nm下的吸光度测定和使用Bradford蛋白测定试剂盒(Bio-Rad实验室)测定的rhGH最终产量为大约2mg。以SDS-PAGE分析时非还原的垂体hGH比还原的垂体hGH以略小的表观分子量迁移。该分子量变化是正确的二硫键形成的指标。我们纯化的rhGH与垂体hGH在还原和非还原条件下共同迁移表明rhGH正确折叠且形成二硫键。下述数据表明rhGH的生物学活性与垂体hGH无区别。
B.垂体hGH和rhGH的生物测定结果
亲本FDC-P1细胞系显示出对小鼠IL-3强烈的增殖应答，但对垂体hGH无应答。在没有IL-3时，大多数FDC-P1细胞死亡，产生不到0.2的吸光度值。相反，在细胞数和吸光度值方面的剂量依赖型增大证明用兔生长激素受体转化的FDC-P1细胞应答垂体hGH而增殖。在不同的实验中该效果的EC50(达到最大刺激的一半所需的蛋白质浓度)范围为0.75-1.2ng/ml垂体hGH(0.03-0.05nM)，与文献(Rowlinson等，1995)的报道相似。亲本FDC-P1细胞系与用兔生长激素受体转化的FDC-P1细胞之间的明显差异在于在没有IL-3或hGH时后一种细胞存活，产生更高的吸光度值(在零生长因子对照孔中依赖于测定和与MTS一起保温的时间一般为0.6-1.1)。兔生长激素受体转化子和分离的所有5个不依赖生长激素受体的细胞系的起始合并物表现出相同的效果。用第二组独立分离的兔生长激素受体转染子获得了相似的结果。Rowlinson等，(1995)观察到相似的效果，表明IL-3/GH的非依赖型存活是转化过程的后果。尽管生长激素受体细胞系的生长不需要IL-3或hGH，但它们仍然对IL-3和hGH显示出强烈的增殖应答。没有hGH时吸光度值更高的实际效果是减小了hGH应答的“窗口”(最大与最小吸光度值之间的差别)。该窗口的范围经常为零生长因子值的40-70％，与Rowlinson等，(1995)的报道相似。
垂体GH和我们制备的野生型rhGH在生物测定中具有相似的剂量反应曲线，在不同的实验中EC50范围为0.6-1.2ng/ml(表1)。
                    表1
      hGH和hGH半胱氨酸突变蛋白的生物活性
 所测的形式      平均EC50(ng/ml)            EC50范围(ng/ml)1
垂体hGH     单体 1+/-0.1(N＝11) 0.75-1.2
RhGH     单体 0.8+/-0.3(N＝3) 0.6，0.8，1.1
T3C     二聚体 1.4+/-0.6(N＝7) 0.75-2.5
S144C     单体 1.6+/-0.8(N＝5) 1.1，1.1，1.5，2.2，2.7
T148C-lotA     单体 0.5(N＝2) 0.4，0.5
T148C-lotB     单体 2.5+/-1.0(N＝4) 1.5，1.9，3.1，3.6
N/A，未应用
1EC50值来自各个实验。显示当N＞5时的EC50范围。
实施例4
构建hGH半胱氨酸突变蛋白
半胱氨酸取代突变T135C构建如下。设计诱变型反向寡核苷酸BB28(5’CTGCTTGAAGATCTGCCCACACCG                     GGGGCTGCCATC’3)(SEQ.ID.NO.10)以便将在氨基酸残基135处的苏氨酸密码子ACT改变成编码半胱氨酸的密码子TGT并跨越邻近的Bgl II位点。在PCR中使用该寡核苷酸以及与ompA-GH融合基因连接区退火且不具诱变性的BB34(5’GTAGCGCAGGCCTTCCCAACC ATT’3)(SEQ.ID.NO.11)。PCR反应在50μl反应液中进行，它含有1 X PCR缓冲液(含有1.5mM MgCl2的Perkin-Elmer缓冲液)，4种核苷酸dA，dC，dG和dT的浓度各为200μM，各0.5μM的各种寡核苷酸引物，5pg pBBT112(上述)作模板，1.25单位的AmpliTaq DNA聚合酶(Perkin-Elmer)和0.125单位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)。反应在Robocycler Gradient 96热循环仪(Stratagene公司)中进行。使用的程序限定为：95℃3分钟，接着进行25个循环的[95℃60秒；45℃或50℃或55℃75秒；72℃60秒]，接着在6℃保持。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，表明3种退火温度均明显产生大约430bp的预期产物。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”45℃反应并用Bgl II和Pst I消化。凝胶纯化所得278bp Bgl II-Pst I片段，它包括推断的T135C突变，将它连接进用Bgl II和Pst I消化过的pBBT111，即携带stII-GH融合基因的pUC19衍生物(上述)并凝胶纯化。经过用Bgl II和Pst I消化开始筛选来自该连接的转化子，随后测序一个克隆以证实存在T135C突变且不存在经过PCR反应或经过合成寡核苷酸可能导入的任何其它突变。发现测序的克隆具有Bgl II-Pst I片段的正确序列。
使用上述用于T135C的方法构建取代突变S132C，该方法有下列区别：使用诱变型反向寡核苷酸BB29(5’CTGCTTGAAGATCTGCCCAGTCCGGGGGCAGCCATCTTC’3)(SEQ.ID.NO.12)代替BB28且使用退火温度为50℃的PCR反应用于克隆。发现测序的两个克隆中的一个具有正确的序列。
使用类似的方案但采用不同的克隆策略构建了取代突变T148C。在PCR中使用诱变型正向寡核苷酸BB30(5＞GGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACAGCAAGTTCGACTGCAACTCACACAAC＞3)(SEQ.ID.NO.13)和与GH编码序列最3’端退火且跨越其下游紧邻的Bam H1位点的非诱变性反向引物BB33(5＞CGCGGTACCCGGGATCCGATTAGAATCCACAGCT＞3)(SEQ.ID.NO.14)。除了使用的退火温度为46，51和56℃外按上述进行PCR。PCR后按上述进行凝胶分析，合并46和51℃反应物用于克隆。用Bam H1和Bgl II消化该反应物，凝胶纯化所得的188bp片段并克隆进已用Bam H1和Bgl II消化，用小牛碱性磷酸酶(Promega)按卖主方案处理的pBBT111中，并凝胶纯化。经过用Bam H1和BglII消化分析来自该连接的转化子以鉴定以正确方向克隆了188bp BamH1-BglII诱变性PCR片段的克隆：由于Bam H1和Bgl II产生相匹配的末端，该克隆步骤无方向特异性。测试的6个克隆中有5个显示出正确的方向。测序了其中的一个且表明含有所需的T148C突变。已证实在该克隆中188bp BamH1-Bgl II诱变性PCR片段的剩下序列是正确的。
除了下述例外，取代突变S144C的构建与T148C的构建相同。使用诱变型正向寡核苷酸BB31(5＞GGGCAGATCTTCAAGCAGACCTACTGCAAGTTCGAC＞3)(SEQ.ID.NO.15)代替BB30。测试的6个克隆中有2个显示出正确的方向。测序了其中的一个且表明含有所需的S144C突变。已证实在该克隆中188bp BamH1-BglII诱变性PCR片段的剩下序列是正确的。
还构建了在GH的天然羧基末端添加半胱氨酸残基的突变。使用上述用于构建T148C突变蛋白的方法但采用不同的寡核苷酸引物构建称为stp192C的该突变体。使用在GH的羧基末端phe残基密码子和TAA翻译终止密码子之间插入半胱氨酸密码子TGC并跨越邻近Bam H1位点的诱变型反向寡核苷酸BB32(5＞CGCGGTACCGGATCCTTAGCAGAAGCCACAGCTGCCCTCCAC＞3)(SEQ.ID.NO.16)和上述BB34。按上述进行PCR和凝胶分析后，使用46℃反应物用于克隆。测试的6个克隆中有3个显示出正确的方向。测序了其中的一个且表明含有所需的stp192C突变。已证实在该克隆中188bp BamH1-Bgl II诱变性PCR片段的剩下序列是正确的。
使用将氨基酸残基100处的丝氨酸密码子AGC改变成编码半胱氨酸的密码子TGC的诱变型反向寡核苷酸BB25(5＞GTCAGAGGCGCCGTACACCAGGCAGTTGGCGAAGAC＞3)(SEQ.ID.NO.17)构建取代突变S100C。BB25也跨越邻近的Nar I位点。使用BB25和BB34的PCR反应采用上述用于构建T135C突变的PCR方案进行。对PCR产物进行凝胶分析后，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”50℃退火反应的产物并用Pst I和Nar I消化。凝胶纯化所得的178bp片段，将它连接进用Pst I和Nar I消化过的pBBT111中并凝胶纯化。经过用Pst I和Nar I消化以筛选来自该连接的转化子所分离的质粒，随后测序一个质粒以证实在178bp的Pst I-Nar I片段中存在S100C突变且不存在任何其它突变。
除了下述区别外使用上述用于S100C的方法构建取代突变A98C：诱变性反向寡核苷酸BB26(5＞GTCAGAGGCGCCGTACACCAGGCTGTTGCAGAAGACACTCCT＞3)(SEQ.ID.NO.18)用于代替BB25进行PCR，使用45℃退火温度进行的PCR用于克隆。测序了一个克隆并发现具有正确的序列。
取代突变A34C构建如下。设计诱变性反向寡核苷酸BB23(5＞GCGCTGCAGGAATGAATACTTCTGTTCCTTTGGGATATAGCATTCTTCAAACTC＞3)(SEQ.ID.NO.19)以便将氨基酸残基34处的丙氨酸密码子GCC改变成编码半胱氨酸的密码子TGC并跨越Pst I位点。在PCR反应中使用该寡核苷酸以及与stII先导序列的编码序列5’端退火且跨越与起始甲硫氨酸密码子重叠的Nde I位点的BB11(5＞CCCCCTCTAGACATATGAAGA AGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG＞3)(SEQ.ID.NO.20)。
PCR反应在50μl反应液中进行，反应液为含有1.5mM MgCl2的1 X PCR缓冲液(Promega)，4种核苷酸dA，dC，dG和dT各为200μM，各0.2μM的各种寡核苷酸引物，1ng pBBT111(上述)作模板，0.8单位的Tac DNA聚合酶(Promega)和033单位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)。反应在Robocycler Gradient 96热循环仪(Stratagene公司)中进行。使用的程序限定为：96℃3分钟，接着进行25个循环的[95℃60秒；50℃或55℃或60℃75秒；72℃60秒]，接着在6℃保持。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应，表明3种退火温度均产生大约220bp的预期产物。合并50和55℃反应液，使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”并用Nde I和Pst I消化。凝胶纯化所得的207bp Nde I-Pst I片段，它包括推断的A34C突变，将它连接进用Nde I和Pst I消化过并用碱性磷酸酶处理的pBBT111中并凝胶纯化。经过用Nde I和Pst I消化开始筛选来自该连接的转化子，随后测序一个克隆以证实存在A34C突变且不存在经过PCR反应或经过合成寡核苷酸可能导入的任何其它突变。发现测序的克隆具有Nde I-Pst I片段的正确序列。
使用上述用于A34C的方法构建取代突变S43C，该方法有下列区别：使用诱变型反向寡核苷酸BB24(5＞GCGCTGCAGGAAGCAATACTTCTGTTCCTTTGG＞3)(SEQ.ID.NO.21)代替BB23。测序了一个克隆且显示含有正确的序列。
使用连续两个PCR步骤构建取代突变T3C。第一步产生所需的突变而第二步延伸第一步反应的PCR产物以包含有用的克隆位点。设计诱变型正向寡核苷酸BB78(5＞GCATCTATGTTCGTTTICTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATTCCCATGCATTCCCTTATCCAG＞3)(SEQ.ID.NO.22)将氨基酸残基3处的苏氨酸密码子ACC改变成编码半胱氨酸的密码子TGC并跨越stII-hGH融合基因连接区且与之退火。BB78与上述BB33一起用于第一步PCR。
第一步PCR反应在50μl反应液中进行，反应液为含有1.5mM MgCl2的1 X PCR缓冲液(Promega)，4种核苷酸dA，dC，dG和dT各为200μM，各0.2μM的各种寡核苷酸引物，lng pBBT111(上述)作模板，1.5单位的TacDNA聚合酶(Promega)和0.25单位的Pfu DNA聚合酶(Stratagene公司)。反应在Robocycler Gradient 96热循环仪(Stratagene公司)中进行。使用的程序限定为：96℃3分钟，接着进行25个循环的[94℃60秒；60℃75秒；72℃60秒]，接着在6℃保持。乙醇沉淀PCR反应物，凝胶纯化大约630bp的产物且回收在20μl 10mM Tris-HCl(pH 8.5)中。将该凝胶纯化片段的等分试样稀释100倍，取2μl稀释的片段用作第二次PCR步骤的模板。第二次PCR步骤采用寡核苷酸BB11和BB33(均在上文描述)并使用第一步PCR反应所用的反应条件。经琼脂糖凝胶电泳分析第二步PCR反应，观察到预期大约670bp的片段。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”PCR反应物并用Nde I和Pst I消化。凝胶纯化所得的207bp Nde I-Pst I片段，它包括推断的T3C突变，将它连接进用Nde I和Pst I消化过并用碱性磷酸酶处理的pBBT111中并凝胶纯化。经过用Nde I和Pst I消化开始筛选来自该连接的转化子，随后测序一个克隆以证实存在T3C突变且不存在经过PCR反应或经过合成寡核苷酸可能导入的任何其它突变。发现测序的克隆具有Nde I-PstI片段的正确序列。
使用Horton，R.M.在分子生物学方法：第15卷，第251-261页：PCR方法：常规方法和应用，White，B.A.编(1993)，Humana Press，Inc.，Totowa，NJ中一般描述的“通过重叠延伸实施诱变”技术构建取代突变A105C。用该技术靶DNA片段扩增了图1所示的两个不同片段。一个片段是用引物a和b产生的产物AB。第二个引物对，c和d，用于产生产物CD。引物b和c分别在产物AB和CD的右侧端和左侧端引入相同的序列改变。产物AB和CD具有一段相同的(突变的)序列片段，即，“重叠”，使得AB的上链可与CD的下链退火，反之亦然。在随后的PCR反应中使用引物a和d且加入产物AB和CD两者作模板经DNA聚合酶延伸这些退火的重叠片段产生全长的突变分子AD。
除了使用不同的寡核苷酸引物外，按与上文T3C的构建所述相同的方式进行A105C构建的起始PCR反应。所用的引物对是：(BB27+BB33)和(BB11+BB79)。BB11和BB33如上所述。BB27和BB79是互补的诱变型寡核苷酸，它们将氨基酸残基105处的丙氨酸密码子GCC改变成编码半胱氨酸的密码子TGC。BB27的序列是(5＞AGCCTGGTGTACGGCTGCTCTGACAGCAA CGT C＞3)(SEQ.ID.NO.23)且BB78的序列是(5＞GACGTTGCTGTCAG AGCAGCCGTACACCAGGCT＞3(SEQ.ID，NO.24)。将(BB27×BB33)和(BB11×BB79)的PCR反应物乙醇沉淀，凝胶纯化并回收在20μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)中。制备型凝胶显示，各PCR反应的主要产物是：(BB27×BB33)反应产物的预期大小为大约290bp，(BB11×BB79)反应为大约408bp。然后，在随后的PCR反应中这两个诱变的片段“剪接”在一起。在该反应中，加入1μl来自起始反应的每种凝胶纯化的片段作为模板，BB11和BB33用作引物。此外，使用起始(BB27×BB33)和(BB11×BB79)反应所用的相同条件进行PCR反应。经过琼脂糖凝胶电泳分析第二次PCR反应的等分试样且获得预期的大约670bp的带。然后使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”批量的PCR反应物并用Bgl II和Pst I消化。凝胶纯化所得的276bp Bgl II-Pst I片段，它包括推断的A105C突变，将它连接进用Bgl II和Pst I消化的pBBT111中并凝胶纯化。经过用Bgl II和Pst I消化开始筛选来自该连接的转化子，随后测序一个克隆以证实存在A105C突变且不存在经过PCR反应或经过合成寡核苷酸可能导入的任何其它突变。发现测序的克隆具有Bgl II-Pst I片段的正确序列。
为了作为分泌进周质空间的蛋白质在大肠杆菌中表达，从pUC-19为基础的pBBT111衍生物切下大约650bp的Nde I-Xba I片段，它们是编码11种突变蛋白的stII-hGH基因，将它们亚克隆进已用于表达rhGH的pCYB1表达载体中。为了进行表达实验，将这些质粒导入大肠杆菌W3110中。
使用类似于此处和实施例23所述的方法，可构建GH的其它半胱氨酸突变蛋白。半胱氨酸突变蛋白可以是用半胱氨酸取代GH编码序列中天然氨基酸残基的取代突变，在GH编码序列的两个天然氨基酸之间插入半胱氨酸残基的插入突变，或在GH编码序列的第一个氨基酸，F1，之前加入一个半胱氨酸残基，或在GH编码序列的末端氨基酸残基，F191，之后加入一个半胱氨酸残基的添加突变。半胱氨酸残基可取代GH编码序列中任何位置的任何氨基酸残基或插入任意两个氨基酸之间。在GH中取代和插入半胱氨酸残基的优选位点是在螺旋A之前的区域，A-B环，B-C环，C-D环和螺旋D的远端区域。
其它优选的位点是A，B，C和D螺旋的第一个和最后三个氨基酸。在这些区域产生半胱氨酸取代的优选残基是F1，P2，P5，E33，K38，E39，Q40，Q46，N47，P48，Q49，T50，S51，S55，S57，T60，Q69，N72，N99，L101，V102，Y103，G104，S106，E129，D130，G131，P133，R134，G136，Q137，K140，Q141，T142，Y143，K145，D147，N149，S150，H151，N152，D153，S184，E186，G187，S188和G190。半胱氨酸残基也可插入紧靠这些氨基酸之前或之后。加入半胱氨酸残基的一个优选位点是在F1之前，本文称为*-1C。
也可经过用另一氨基酸取代GH中的一个天然半胱氨酸残基以构建含有游离半胱氨酸的GH突变体。这样在正常情况下与取代的半胱氨酸残基形成二硫键的天然存在的半胱氨酸残基游离出来。可用任何其它19种氨基酸取代非必需的半胱氨酸残基，但优选用丝氨酸或丙氨酸。也可经过化学修饰天然存在的氨基酸将游离半胱氨酸残基导入GH，例如，使用Sytkowski等(1998)所述的方法，本文引用以供参考。
使用类似于实施例1-15所述的方法，可在诸如大肠杆菌等原核细胞中表达所述蛋白质，纯化所述蛋白质，PEG化所述蛋白质和在体外生物测定中测量其生物学活性。也可使用类似于实施例16-19所述的方法或本领域的技术人员熟知的有关方法在诸如昆虫或哺乳动物细胞等真核细胞中表达GH突变蛋白。如果需要分泌，可使用天然的GH信号序列，或另一信号序列从真核细胞分泌该蛋白质。
实施例5
添加半胱氨酸提高了半胱氨酸突变蛋白T3C的回收率
将含有T3C突变的大肠杆菌菌株W3110在3ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中生长过夜。饱和的过夜培养物在300ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.03 O.D.并在2L摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到0.420时，加入1.5ml 100mM IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。然后将诱导培养物在37℃下培养过夜(大约16小时)。
诱导的过夜培养物在A600下O.D.达到大约3.6，分成2×135ml的体积并使用带有GSA转子的Sorval RC-5离心机在4℃下以8,000rpm离心10分钟。弃去上清并按下述对细胞沉淀进行渗透压休克处理。将细胞沉淀重悬于10ml冰冷的缓冲液A[20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5]或缓冲液B[20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5，5.5mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)]中至大约49O.D.。经研磨和旋转重悬沉淀并加入1ml 0.25M EDTA pH8.0以产生大约25mM的最终浓度。重悬的细胞在冰上培养30分钟并在SS-34转子上4℃下以8,500rpm离心10分钟。弃去上清并经研磨和旋转将沉淀重悬于10ml冰冷的缓中液C[5mM Tris-HCl pH7.5]或缓冲液D[5mM Tris-HCl pH7.5，5.5mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)]中并在冰上培养30分钟。然后将重悬的细胞沉淀在SS-34转子上4℃下以8,500rpm离心10分钟并回收所得的上清(可溶性周质部分)，贮存于-80℃。SDS-PAGE分析各上清揭示，经过在渗透压休克方法掺入半胱氨酸，在可溶性周质部分回收的单体hGH类型的含量显著提高。在用胱氨酸处理的样品中，我们观察到在非还原性SDS-PAGE凝胶上大多数hGH以大约22kDa的单条带迁移且该带与垂体hGH共同迁移。没有胱氨酸时，在单体范围内观察到许多不同的分子量种类。当使用Western印迹显色凝胶时可看见更大分子量的蛋白质聚集物。
实施例6
表达和纯化GH半胱氨酸添加型变异体的一般方法
分离hGH半胱氨酸突变蛋白的标准方法如下。将含有stII-hGH突变体质粒的大肠杆菌菌株W3110培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中37℃下生长至饱和。过夜培养物一般在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.025-0.030 O.D.并在摇瓶中37℃下生长。当培养物的O.D.值达到A600下为0.300-0.500时，加入IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导表达。将诱导培养物在37℃下培养过夜。经过在Sorval RC-5离心机中以8,000-10,000xg在4℃下离心10分钟沉淀诱导的过夜培养物。根据培养物的大小按Koshland和Botstein(1980)或Hsiung等，(1986)的方法对所得的沉淀进行渗透压休克。为了进行渗透压休克，将细胞沉淀以25-50 O.D.重悬于20％蔗糖，10mM Tris-HClpH7.5中。在某些情况下重悬缓冲液中包括5或25mM的EDTA pH8.0和/或5mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)。重悬的沉淀在冰上培养15-30分钟并按上述离心。弃去上清并将沉淀以A600下25-50 O.D.重悬于5或10mM Tris-HCl pH7.5中。在某些情况下重悬缓中液中包括5mM EDTApH8.0和/或5mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)。重悬的沉淀在冰上培养30分钟并按上述离心。所得的上清含有可溶性周质成分，沉淀由不溶性周质和细胞相关成分组成。
将胱氨酸加入渗透压休克缓冲液导致许多半胱氨酸突变蛋白的回收率和稳定性显著提高。存在胱氨酸时，半胱氨酸突变蛋白主要是单体，而不存在胱氨酸时，当经过非还原性SDS-PAGE和Western印迹分析样品时观察到hGH单体，二聚体和更高级聚集物的混合物。更高级聚集物很可能是在蛋白质中添加了半胱氨酸残基的后果，因为它们在野生型rhGH中大量减少或不存在。向渗透压休充缓冲液中加入胱氨酸主要解决了这一问题。我们相信胱氨酸与突变体中的游离半胱氨酸残基反应形成稳定的混合二硫化物，从而防止二硫化物移位并聚集。我们也试验了第二种二巯基，即胱胺，且观察到对hGH的半胱氨酸突变蛋白具有相似的稳定效果。很可能其它的二巯基，例如氧化型谷胱甘肽也导致含有游离半胱氨酸的蛋白质的回收率提高。
在所分析的11个hGH突变蛋白中，6个的表达水平足以分离和纯化。对A34C，S43C，A98C，S100C和S132C突变蛋白的渗透压休克上清进行非还原性SDS-PAGE分析表明很少或没有以正确分子量存在的蛋白质。加入胱氨酸不能明显提高这些蛋白质的回收率。这些突变体相对较低的表达水平使得难以观察到产量提高。对全细胞裂解物的初步分析表明这些突变蛋白质可以表达但不可溶。T3C，A105C，T135C，S144C，T148C和stp192C突变体显示出中等到较好的表达水平。其中5个半胱氨酸突变蛋白(T3C，T135C，S144C，T148C和stp192C)当在渗透压休克缓冲液中存在胱氨酸时显示出回收率显著提高。不存在胱氨酸时，没有测试A105C。一般的蛋白质纯化方法描述如下。
WT-rhGH以离子交换和凝胶过滤层析纯化。经过层析方法分类纯化半胱氨酸突变蛋白，层析方法包括离子交换，疏水相互作用(HIC)，金属螯合亲和层析(IMAC)，大小排阻层析(SEC)或这些技术的组合。一般来说，使用在20mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的Q-Sepharose快速流动树脂(Pharmacia)从新鲜的渗透压休克上清捕获hGH突变体。用20mM Tris-HCl，pH8.0洗涤柱子并用线型的10倍体积的在20mM Tris-HCl，pH8.0中从0列250mM NaCl递增的盐梯度洗脱结合的蛋白质。经过SDS-PAGE和Western印迹鉴定含有hGH突变体的级分。合并这些级分并冷冻贮存。可使用其它树脂从渗透压休克混合物中捕获hGH突变体。它们包括HIC，阳离子交换树脂或亲和树脂。
对于疏水互相作用层析(HIC)，解冻Q柱合并物至室温并加入NaCl至2M的最终浓度。将合并物装填到预先在2M NaCl，20mM磷酸钠，pH7.5中平衡的丁基-Sepharose快速流动树脂上。使用在20mM磷酸钠，pH7.5中的2M至0M NaCl反向盐梯度从树脂中洗脱hGH突变体。经过SDS-PAGE和Western印迹鉴定含有hGH突变体的级分并合并。
在有些情况下，将HIC合并物随后直接上样到在10mM磷酸钠，0.5MNaCl，pH7.5中平衡的镍螯合树脂(Qiagen)上。洗涤步骤后，使用在10mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.5中的0-30mM咪唑梯度回收突变体。hGH对镍具有高亲和性，很可能是通过H18，H21和E174形成的二价金属结合位点。结果，使用金属螯合柱以高纯度形式获得了hGH(Maisano等，1989)。测试的所有这些突变体都紧紧结合到镍柱上并与野生型rhGH一样在相似的咪唑浓度(大约15mM)洗脱。
实施例7
T3C的纯化
将在胱氨酸存在下制备的可溶性周质级分(实施例5)上样到在10mMTris-HCl，pH8.0中平衡的1ml HiTrap Q-SEPHAROSE柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上并用20倍柱体积的0-250mM NaCl线型梯度洗脱结合的蛋白质。经过14％SDS-PAGE分析柱上样和回收的级分。T3C在大约170-200mM的盐浓度处洗脱，明显晚于WT-hGH。令人惊奇的是，当上样到柱上时T3C突变体以单体形式存在，但在从Q柱上洗脱后主要以稳定的二硫键连接的同型二聚体形式回收。还原时，T3C突变体与野生型hGH在SDS-PAGE凝胶上共同迁移。二聚体形成在Q柱纯化步骤期间发生。在Q柱缓冲液或用于其它柱步骤的缓冲液中不存在胱氨酸。T3C二聚体在任何其它的浓度或纯化步骤中保持完整。将来自Q柱的合并液调节到0.5M的最终NaCl浓度并上样到预先在10mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.5中平衡的1ml Ni-琼脂糖柱(Qiagen)上。经过洗涤步骤后，使用在10mM磷酸钠，0.5MNaCl，pH7.5中的0-30mM咪唑梯度回收高度纯化的T3C二聚体。T3C二聚体在生物测定中具有活性(实施例10和表1)。
A105C，T135C和stp192C突变体作为二硫键连接的二聚体从Q柱中回收。一旦去掉胱氨酸，似乎某些突变体很可能通过添加的半胱氨酸残基形成稳定的二硫键二聚体。我们相信经过在所有柱缓冲液中包含胱氨酸或其它二巯基化合物和/或半胱氨酸封闭剂和/或将缓冲液的pH维持在7以下以防止二硫键重排可稳定这些蛋白质的单体形式。
实施例8
T148C的纯化
将表达T148C突变体的大肠杆菌菌株W3110在3ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中生长过夜。饱和的过夜培养物在500ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.025 O.D.并分成2×250ml体积在2L摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.35时，向每瓶中加入1.25ml100mM IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。将诱导培养物在37℃下培养过夜(大约16小时)。
诱导的过夜培养物在A600下O.D.达到大约3.5并使用带有GSA转子的Sorval RC-5离心机在4℃下以8,000rpm离心10分钟。弃去上清并按下述对细胞沉淀进行渗透压休克处理。经研磨和旋转将细胞沉淀重悬于冰冷的20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5，5.0mM EDTA pH8.0，5.0mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)中至大约43O.D.。重悬的细胞在冰上培养15分钟，在带有SS-34转子的Sorval离心机中4℃下以8,500rpm离心10分钟。弃去上清并经研磨和旋转将沉淀重悬于冰冷的1mM Tris-HClpH7.5，5mMEDTApH8.0，5mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)中至大约43O.D.。重悬的细胞在冰上培养30分钟并在SS-34转子中4℃下以8,500rpm离心10分钟并回收所得的上清(可溶性周质部分)，贮存于-80℃。
除了下列例外，以相同的方式制备T148C的第二种培养物：1)诱导培养物的体积为200ml且在37℃过夜培养后在A600下O.D.达到大约4.0，2)细胞沉淀的悬液制备成在A600下大约30 O.D.。
合并来自上述制品的可溶性周质部分并在1L 10mM Tris-HCl pH8.0中4℃下透析过夜。将透析存留物上样到在10mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的5mlHiTrap Q-SEPHAROSE柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上并用20倍柱体积的0-250mM NaCl线型梯度洗脱结合的蛋白质。经过14％SDS-PAGE(Novex，San Diego，CA.)分析柱级分。T148C突变体在大约60-80mM的盐浓度处以一个尖峰被洗脱。合并相应级分并在Centricon 10浓缩器(Amicon，Inc.，Beverly，MA)中浓缩。将浓缩的合并液进一步在20mM磷酸钠，pH7.5，150mM NaCl中平衡的Superdex 200 HR 10/30柱(PharmaciaBiotech Inc.，Uppsala，瑞典)上纯化。同样经过14％SDS-PAGE分析柱级分并合并含有T148C突变体的级分。我们观察到T148C在从Q-SEPHAROSE柱回收和从Superdex柱洗脱后保持单体形式，分子量相似于野生型hGH。经过Q-SEPHAROSE和大小排阻层析制备的T148C称为Lot A。
另外，可将Q-合并液直接上样到在10mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.5中平衡的镍螯合树脂(Qiagen)上。经过洗涤步骤后，使用在10mM磷酸钠，0.5M NaCl，pH7.5中的0-30mM咪唑梯度回收T148C。经过Q-SEPHAROSE和镍亲和层析制备的T148C蛋白质称为Lot B。
在不存在胱氨酸时制备渗透压休克T1548C上清并尝试在Q-SEPHAROSE柱上纯化。除了在渗透压休克缓冲液中不存在胱氨酸外按照上述相同的方案进行。在一个大的盐浓度范围内从Q柱洗脱T148C蛋白质产物，回收率较低且蛋白质制品比胱氨酸处理的T148样品纯度显著偏低。
实施例9
S144C的纯化
将含有S144C突变的大肠杆菌菌株W3110在3ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中生长过夜。饱和的过夜培养物在250ml含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为0.03 O.D.并在2L摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.3时，加入1.25ml 100mM IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导重组蛋白质的表达。将诱导培养物在37℃下培养过夜(大约16小时)。
诱导的过夜培养物在A600下O.D.达到大约3.3并使用带有GSA转子的Sorval RC-5离心机在4℃下以8,000rpm离心10分钟。弃去上清并按下述对细胞沉淀进行渗透压休克处理。经研磨和旋转将细胞沉淀重悬于冰冷的20％蔗糖，10mM Tris-HCl pH7.5，5.0mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)中至大约33O.D.并加入0.25M EDTA pH8.0至最终浓度为25mM。重悬的细胞在冰上培养30分钟，在带有SS-34转子的Sorval RC-5离心机中4℃下以8,500rpm离心10分钟。弃去上清并经研磨和旋转将沉淀重悬于冰冷的5mMTris-HCl pH7.5，5mM胱氨酸(pH调到7.5-8.0)中至大约33O.D.。重悬的细胞在冰上培养30分钟并在SS-34转子中4℃下以8,500rpm离心10分钟并回收所得的上清(可溶性周质部分)，贮存于-80℃。
将来自上述制品的可溶性周质部分上样到在10mM Tris-HCl，pH8.0中平衡的5ml HiTrap Q-SEPHAROSE柱(Pharmacia Biotech，Uppsala，瑞典)上并用20倍柱体积的0-250mM NaCl线型梯度洗脱结合的蛋白质。经过14％SDS-PAGE(Novex，San Diego，CA.)分析柱级分，合并在125-150mM NaCl处收集的含有S144C突变体的级分并冷冻。S144C突变体是单体。
实施例10
hGH半胱氨酸突变蛋白的生物活性
使用实施例1所述的细胞增殖测定测量纯化的T3C，S144C和T148C半胱氨酸突变蛋白的生物学活性。使用Bradford测定确定蛋白质的浓度。所有这三种突变体具有生物学活性。所有这些突变体在试验误差范围内达到与垂体hGH相同的最大刺激水平。T3C，S144C和T148C突变体的平均EC50类似于垂体hGH和rhGH的(表1)。T148C突变体的两个独立的样品和S144C和T3C突变体各一个样品(均在有胱氨酸时制备)测定了多次(表1)。也测定了部分纯化的A105C，T135C和stp192C突变体且具有生物学活性。
实施例11
半胱氨酸突变蛋白的PEG化和纯化的一般方法
GH突变体可使用可买到的各种半胱氨酸反应性PEG-马来酰亚胺(或PEG-乙烯砜)试剂进行PEG化。一般来说，PEG化该蛋白质和这些试剂的方法类似于WO9412219(Cox和McDermott)和WO9422466(Cox和Russell)中所述的方法，并略加改良，本文引用这两篇文献以供参考。重组蛋白质一般用二硫苏糖醇(DTT)，Tris(2-羧乙基)膦-HCl(TCEP)或一些其它的还原剂进行部分还原以实现游离半胱氨酸的最佳PEG化。游离半胱氨酸与半胱氨酸反应性PEG具有极低的反应性，除非进行所述部分还原步骤。部分还原各突变体所需的还原剂的量使用在不同pH和温度下的还原剂浓度范围凭经验确定。还原剂浓度一般从0.5等摩尔到10倍过量。优选的温度是4℃到37℃。pH范围可从6.5到9.0，但优选7.5到8.5。也可根据还原剂和接触的时间改变最佳条件。在合适条件下，首先破坏最不稳定的二硫键(一般是分子间二硫键和混合二硫键)而不是热力学上更稳定的天然二硫键。通常5-10倍摩尔过量的DTT在室温下处理30分钟是有效的。可经过在反向柱上蛋白质洗脱曲线的轻微移位来测定部分还原。对于二聚体hGH，经过在非还原条件下进行SDS-PAGE分析可见分子量的移位。必须注意不能过分还原该蛋白质而暴露其它的半胱氨酸残基。经过反向-HPLC(过分还原的蛋白质具有类似于完全还原并变性的蛋白的滞留时间)和经过PEG化反应后含两个PEG的GH分子的出现(可经过在SDS-PAGE上的分子量改变来检测)可检测过分还原。野生型GH可用作对照，因为在不还原天然分子内二硫键的条件下不应发生PEG化。可经过大小排阻层析或透析在PEG化前去掉过量的还原剂。在加入PEG化试剂前不必去掉TCEP，因为它不含游离巯基。该部分还原的蛋白质可与各种浓度的PEG-马来酰亚胺或PEG-乙烯砜(一般PEG：蛋白质的摩尔比为1∶1，5∶1，10∶1和50∶1)反应以测定两种试剂的最佳比例。使用SDS-PAGE测定分子量的改变可监测蛋白质的PEG化。一般认为产生大量单PEG化产物而不产生二PEG化产物的PEG的最低量是最佳的(一般认为80％转变成单PEG化产物是较好的)。一般来说，经过大小排阻，离子交换，亲和，反相或疏水相互作用层析从未PEG化蛋白质和未反应的PEG中纯化单PEG化蛋白质。也可使用其它的纯化方法，例如2-相有机提取或盐沉淀。可在实施例1所述的细胞增殖测定中测试纯化的PEG化蛋白质以测定其比活。
可进行实验以证实PEG部分在正确的位点附着到蛋白质上。经过化学裂解或蛋白水解消化该蛋白质，以大小排阻，离子交换或反相层析纯化PEG化肽(它具有较大的分子量)，随后进行氨基酸测序可完成该实验。在氨基酸测序过程中PEG偶连的氨基酸以空白出现。
实施例12
PEG-T3C的制备和纯化
进行初步滴定实验以测定合适的还原剂和PEG试剂的浓度并避免蛋白质的过分还原。我们经过在非还原性SDS-PAGE上将二聚体转变成非还原性单体来监测蛋白质的部分还原。将1μl的纯化T3C二聚体与浓度递增的TCEP在室温下温育60分钟。立即用非还原性SDS-PAGE分析该反应。产生大量单体T3C而不过分还原和变性该蛋白质的TCEP的量用于随后的实验。TCEP是一种用于小规模实验的常规还原剂，因为它不干扰PEG化反应；因此在加入PEG前不必透析蛋白质：TCEP混合物。在大规模实验中优选廉价的还原剂，如DTT用于还原蛋白质。一般来说，用还原剂处理蛋白质适量时间。然后将反应的pH调节到6.5或以下以限制二硫键的重排。经过透析或液相层析去掉还原剂。然后将pH重调到高于6.5或优选7.5至8.5并加入PEG试剂。
pH7.5下的滴定实验表明5倍摩尔过量的TCEP在室温下处理60分钟将大部分的T3C二聚体转变成合适的二硫键单体而不过度还原该蛋白质。对照实验表明，与预期一样，T3C二聚体需要用TCEP还原以进行PEG化。然后将这些反应条件上升到100μg的反应规模。10分钟后向T3C：TCEP混合物中加入10倍摩尔过量的5kDa马来酰亚胺-PEG(Fluka)并使PEG化反应在室温下进行60分钟。将样品快速上样到在20mM Tris-HCl，pH8.0中平衡过的1ml Q-SEPHAROSE柱上。柱子用20mM Tris-HCl，pH8.0洗涤并用线型10倍柱体积的在20mM Tris-HCl，pH8.0中从0到250mM NaCl递增的盐梯度洗脱结合的蛋白质。经过SDS-PAGE和Western印迹鉴定含有单PEG化T3C的级分(单个PEG部分附着到T3C单体上)。合并这些级分并冷冻贮存。PEG部分的存在减少了蛋白质对树脂的亲和力，允许从未PEG化蛋白质分离PEG化蛋白质。
实施例13
PEG化S144C和其它半胱氨酸突变蛋白
按实施例12对于T3C所述，对S144C也进行初步滴定实验以测定合适的还原剂，PEG试剂的浓度并避免蛋白质的过分还原。使用超出2倍摩尔量的TCEP和超出10倍摩尔量的5kDa马来酰亚胺-PEG在pH7.5室温下进行较大规模的PEG化反应2小时。对反应混合物的SDS-PAGE分析表明存在具有两个或多个PEG的一些类型。按实施例12所述使用Q-SEPHAROSE柱从单PEG化S144C中分离它们。此外，使用5kDa的乙烯砜-PEG(Fluka)进行PEG化反应，在相同的还原条件下产生了单PEG化S144C。
我们还对T148C，stp192C和T135C进行了小规模的PEG化反应，用5kDa的马来酰亚胺-PEG和/或5kDa的乙烯砜-PEG均产生单PEG化蛋白质。
实施例14
PEG-T3C和PEG-S144C hGH蛋白质的生物活性
在细胞增殖测定中测量PEG-T3C和PEG-S144C蛋白质的生物学活性(实施例1)。PEG-T3C蛋白质与垂体hGH和非PEG化T3C蛋白质显示出相似的剂量应答曲线且达到相同水平的最大刺激。PEG-T3C的平均EC50值为1.6ng/ml(0.07nM)(4个实验值为1.3，1.5，1.7，1.8ng/ml)。PEG-T3C蛋白质的生物活性比使用非特异性NHS-PEG试剂PEG化的rhGH(Clark等，(1996)所述的EC50值440ng/ml(20nM))至少高100倍。
PEG-S144C的平均EC50值为43ng/ml(2nM)(2个实验值为40和45ng/ml)。PEG-S144C蛋白质的生物活性比使用非特异性NHS-PEG试剂PEG化的rhGH(EC50值为440ng/ml(20nM)；Clark等，(1996))高大约10倍。
实施例15
构建hGH的二硫键连接的三聚体
和二硫键连接的更高级多聚体
可构建具有一个以上“游离”半胱氨酸的其它hGH变异体并用于产生hGH的更高级二硫键连接的多聚体。这些多聚体可包括三聚体，四聚体，五聚体，六聚体，七聚体，八聚体和任何更高级多聚体。例如，经过使用重组DNA技术体外重组携带单个“游离”半胱氨酸突变的DNA质粒载体可构建具有两个“游离”半胱氨酸残基的hGH变异体。另外，可通过对hGH的半胱氨酸变异体的诱变以增加一个额外的“游离”半胱氨酸突变。也可使用这两种方法中任一种的重复以构建具有3个或多个“游离”半胱氨酸的hGH变异体。
可按如下方法使用具有两个游离半胱氨酸残基的hGH变异体产生hGH三聚体和更高级多聚体。可按本文实施例5-9所述在大肠杆菌中表达该变异体且在渗透压休克裂解产物的上清中作为单体回收。然后可使用一系列加工步骤诱导二硫键形成，例如，按本文实施例6-9所述的Q琼脂糖层析法。在该条件下，具有一个游离半胱氨酸的一些hGH变异体，例如T3C和stp192C基本上定量转变成二硫键连接的二聚体。在相同或相似条件下，具有两个游离半胱氨酸的hGH变异体，例如，组合T3C和stp192C的双突变体形成的分子间二硫键可导致hGH分子的聚合且该多聚体的链长原则上是没有限制的。经过向聚合反应中加入仅具有一个游离半胱氨酸的hGH分子，如T3C变异体和/或stp192C变异体可限制链长并控制到一定程度。在不断增长的多聚体和仅具有一个游离的半胱氨酸的分子间形成的二硫键将“封住”新生多聚体中两个聚合位点中的一个或防止其进一步延伸。第二个仅具有一个游离半胱氨酸的hGH分子与该新生多聚体的另一聚合位点随后发生的反应终止了聚合且固定了多聚体分子的长度。经过化学计算反应物，即具有两个游离半胱氨酸的hGH分子与具有一个游离半胱氨酸的hGH分子的比例可控制多聚体的平均长度。经过降低比例可有助于形成平均较短的多聚体，经过提高比例可有助于形成平均更长的多聚体。从包含具有3个或多个游离半胱氨酸的hGH变异体与仅具有一个游离半胱氨酸的hGH变异体的反应可构建更复杂的“分支的”多聚体。
随后经过诸如大小排阻层析，离子交换层析，疏水相互作用层析等层析方法可纯化不连续大小类型的某些多聚体。可使用对GH所述的相似方法产生EPO和α干扰素的二硫键连接的二聚体和更高级多聚体。
实施例16
杆状病毒(BV)-表达的重组人促红细胞生成素(rEPO)
的克隆，表达和纯化
A.克隆编码EPO的cDNA。
使用正向引物BB45(5＞CCCGGAT CCATGGGGGTGC ACGAATGTCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.25)和反向引物BB47(5＞CCCGA ATTCTATGCCCAGGTGGACACACCTG＞3)(SEQ.ID.NO.26)经PCR克隆编码人EPO的cDNA。BB45与编码EPO信号序列的起始甲硫氨酸和氨基末端部分的DNA序列退火且含有用于克隆目的的Bam HI位点(Jacobs等，1985；Lin等，1985)。BB47与紧靠翻译终止信号下游的EPO mRNA 3’非翻译区退火且含有用于克隆目的的Eco RI限制性位点。在用于PCR的单链cDNA第一链合成中使用从人肝细胞系Hep 3B分离的总RNA。
为了制备总细胞RNA，将Hep3B细胞(美国典型培养物保藏中心)在补充了10％胎牛血清(FBS)的Delbecco’s改良的Eagle’s培养基(DMEM)中生长。经过用130μM去铁胺或100μM氯化钴处理细胞18小时诱导EPO的表达。两种化合物在Hep 3B细胞中均显示出诱导EPO mRNA和蛋白质表达(Wang和Semenza，1993)。使用Rneasy Mini试剂盒(Qiagen，Inc.)按厂商说明书从细胞中分离RNA。从用氯化钴处理的1.4×107个细胞中分离出大约320μg的总RNA，从用去铁胺处理的1.4×107个细胞中分离出270μg的总RNA。使用来自Boehringer Mannheim公司的用于RT-PCR(AMV)的第一链cDNA合成试剂盒且用随机6聚体作引物完成单链cDNA的第一链合成。使用第一链合成的产物作模板用引物BB45和BB47进行随后的PCR反应。当反应产物通过琼脂糖凝胶时观察到预期的大约600bp的PCR产物。两种PCR制品均产生一种EPO PCR产物。PCR产物用Bam HI和Eco RI消化并克隆进已用Bam HI和Eco RI酶切并用碱性磷酸酶处理的载体pUC19中。DNA测序鉴定了一个含有EPO基因的正确编码序列的克隆。该质粒命名为pBBT131且用于经过如实施例17所述的定点诱变构建EPO变异体。
B.BV rEPO在昆虫细胞中的表达
为了在昆虫细胞中表达，修饰pBBT131中EPO cDNA的5’和3’末端。在5’末端，在紧靠起始密码子ATG的上游加入序列CAAA以增强翻译。该序列含有认定的杆状病毒共有的翻译起始序列(Ayres等，1994；Ranjan和Hasnain，1995)。在3’末端，加入编码8氨基酸FLAG表位序列(asp-tyr-lys-asp-asp-asp-asp-lys)(SEQ.ID.NO.27)的DNA序列以提供纯化系统。FLAG表位经过弹性接头：ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser(SEQ.ID.NO.28)与EPO基因融合。使用向EPO序列中插入所需添加的寡核苷酸引物经PCR进行这些修饰。寡核苷酸引物BB63(5＞CGCGGATCCAAAATGGGGGTGCACGAATGTCCT＞3)(SEQ.ID.NO.29)用于修饰该基因的5’端。BB63在ATG的上游加入CAAA序列，与编码EPO信号序列的起始甲硫氨酸和氨基末端部分的DNA序列退火且含有用于克隆目的的Bam HI位点。使用反向引物BB60(5＞GTCTTTGTAGTCCGAGCCTCCGCTTCCGCCCGATCTGTCCCCTGTCCTGCA＞3)(SEQ.ID.NO.30)和BB61(5＞CGCGAATTCTTATTTATCGTCATCGTCTTTGTAGTCCGAGCCTCC＞3)(SEQ.ID.NO.31)在两个连续PCR反应中加入接头和FLAG序列。BB60与EPO编码序列的3’端退火且含有融合肽接头序列和FLAG序列的一部分。BB61重叠与接头-FLAG序列的连接区退火的BB60序列的一个片段且加入FLAG序列的剩下部分及随后的翻译终止密码子(TAA)和一个用于克隆目的的EcoRI位点。将修饰的EPO cDNA作为一个Bam HI-Eco RI片段克隆进pUC19且证实了该构建体的DNA序列。所得的质粒命名为pBBT132并用于按实施例17所述构建EPO变异体。为了在杆状病毒中表达，将“FLAG标记的”EPO cDNA作为大约630bp的Bam HI-Eco RI片段从pBBT132中切下，凝胶纯化并克隆进已用Bam HI和Eco RI酶切并用碱性磷酸酶处理的杆状病毒转移载体pBlueBac4.5(Invitrogen)中。挑出一个克隆备用且命名为pBBT138。
pBBT138 DNA用于与线型化的(Bsu36 I消化的)Bac-N-BlueTM(Invitrogen公司)杆状病毒DNA一起共转染来自草地贪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的细胞系Sf9。加工Bac-N-BlueTM基因组以便形成噬菌斑的病毒颗粒的产生需要在线型Bac-N-BlueTM DNA与pBlueBac4.5载体之间进行重组，导致将克隆的EPO基因插入杆状病毒基因组中。这种专性重组也导致在杆状病毒基因组中插入了功能性β-半乳糖苷酶基因。使用2×106个Sf9细胞按照Invitrogen的“Bac-N-BlueTM转染试剂盒”方案进行共转染以产生大约1ml的上清。在Sf9细胞上27℃下测定该上清稀释液的蓝色(blue)噬菌斑的形成。挑出10个蓝色噬菌斑并传代培养。使用各噬菌斑接种在含有5ml补充了10％FBS的Grace’s昆虫培养基的T25瓶中的2.5×106个Sf9细胞上。5天后从这些感染的细胞收集上清(“P1”原种)并经过Western印迹测定EPO的表达。在加入了1％β巯基乙醇(BME)的SDS样品缓冲液中制备10个所得的上清并在预制14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶(Novex)上电泳。包含未感染的SF9细胞上清作为阴性对照。电泳后，将蛋白质转移到0.45μm硝酸纤维素膜(Novex)上。硝酸纤维素膜在含有0.05％Tween 20和4％奶粉的Tris缓冲盐溶液(TBS)(封闭缓冲液)中封闭。抗-FLAG M2小鼠IgG1单克隆抗体(Eastman KODAK)以封闭缓冲液中1∶1500或1∶2500的稀释度使用，印迹在4℃按常规培养过夜。碱性磷酸酶偶联的羊抗小鼠IgG1(结合位点有限公司)在封闭缓冲液中以1∶1000稀释且印迹在室温下培养1小时。使用NBT\BCIP显色底物(Promega)显色Western印迹。10个分离物中有9个为EPO表达阳性。在还原条件下BV rEPO蛋白质的分子量大约为30kDa且在该分子量范围中并存1个主带和1至2个弱小带，它与可变糖基化蛋白一致。
在下面实施例16.D所述的体外EPO生物测定中测试了两种阳性上清。两种上清均以剂量依赖的方式刺激EPO依赖型细胞系的增殖，表明它们含有活性EPO。将模拟品的上清感染Sf9细胞，通过Western印迹证实EPO表达为阴性的一个杆状病毒上清在EPO生物测定中显示出无可检测的活性。
为了生产和纯化大量野生型BV rEPO，选择一个称为bvBBT138A的阳性重组杆状病毒用于进一步扩增。经过将分离物138A的P1原种在500ml补充了10％FBS的Grace’s昆虫培养基中的Sf9细胞转瓶培养物中27℃下传代培养以制备500ml高滴度病毒原种。Grace’s昆虫培养基含有大约100μM的L-胱氨酸。7天后从该培养物中收获上清且发现具有大约108个噬菌斑形成单位/ml的滴度。该裂解产物(“P2”原种)的等分试样随后用于感染500ml培养物以便大规模生产野生型BV rEPO。500ml在补充了10％FBS的Grace’s昆虫培养基中的Sf9细胞培养物在转瓶中生长至1.0×106/ml的滴度，然后以1的感染复数用bvBBT138A感染。3天后从该培养物中收获上清，按实施例16.C所述纯化野生型BV rEPO-138A蛋白质。
C.野生型杆状病毒所产生的rEPO的亲和纯化
经过离心和0.2μM过滤澄清细胞上清。经过Western印迹分析证实野生型BV rEPO的表达。野生型BV rEPO使用抗-FLAG M2亲和凝胶(EastmanKODAK)以一步方法纯化。简单地说，5m1 M2亲和凝胶用5倍柱体积的50mM Tris pH7.4，150mM NaCl(TBS)，5倍柱体积的0.1M甘氨酸pH3.5洗涤，然后在TBS中平衡。将澄清的杆状病毒细胞上清调节到150mM NaCl并加入平衡的树脂。在滚瓶培养装置中使批量装载物在4℃下持续过夜。过夜培养后，使用Pharmacia XK 16/20 FPLC柱回收树脂且用TBS洗涤直到A280达到基线。用0.1M甘氨酸pH3.5洗脱结合的蛋白质并收集级分且用1.0M Tris pH9.0中和。需要时在添加了1％BME的SDS-PAGE样品缓冲液中制备柱级分并在预制14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上电泳。合并含有大多数BV rEPO的来自M2亲和柱的级分并在Centricon 10旋转浓缩器(Amicon)中浓缩。使用Bradford蛋白质测定试剂盒(BIO-RAD实验室，Inc.)并以牛血清白蛋白(BSA)作标准品测定野生型BV rEPO的最终产量大约为360μg。以考马斯蓝染色SDS凝胶估测该蛋白质的纯度大于90％。
D.野生型杆状病毒rEPO的体外生物活性
建立使用人UT7/epo细胞系(Komatsu等，1991)的细胞增殖测定以测量野生型BV rEPO的生物活性。人UT7/epo细胞系从哈佛医科学校的F.Bunn博士处获得。该细胞系的细胞增殖和存活依赖于EPO(Boissel等，1993)。该细胞在补充了10％FBS，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素和1单位/mlrEPO(CHO(中国仓鼠卵巢)细胞表达的；从R&D系统公司购买)的Iscove’s改良的Delbecco’s培养基(IMDM)中维持。对于生物测定，用IMDM培养基洗涤细胞3次并以1×105个细胞/ml的浓度重悬于含有10％FBS，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素的IMDM培养基中。50μl(5×103个细胞)细胞悬液等分分配进平底96孔组织培养平板的各试验孔中。在无酚红的含有10％FBS，50单位/ml青霉素，50μg/ml链霉素的IMDM培养基中制备待测蛋白质样品的3倍系列稀释液。将50μl稀释的蛋白质样品加入试验孔中并在湿润的5％CO2组织培养箱中培养平板。蛋白质样品以一式3孔进行测定。60-72小时后，向各孔中加入20μl CellTiter 96 Aqueous One溶液试剂(Promega公司)且在组织培养箱中37℃培养平板1-4小时。使用微滴板阅读器在490nm下阅读各孔的吸光度。对照孔含有培养基但无细胞。从各组一式三份试验孔获得的平均吸光度值减去一式三份对照孔获得的平均吸光度值。平行分析系列稀释的CHO细胞表达型rEPO或野生型BV rEPO。
由细胞数和吸光度值的剂量依赖型增加证实UT7/epo细胞系显示出对rEPO强烈的增殖应答。在高达2.0的值范围内，吸光度与细胞数成比例(Promega公司产品说明书)。不存在rEPO时，大多数UT7/epo细胞死亡，产生的吸光度值小于0.1。CHO细胞表达的rEPO商品与我们制备的野生型BV rEPO在测定误差范围内达到相同的最大刺激水平，且在生物测定中具有大约0.4-0.5ng/ml的相似的平均EC50(表2)。在不同日期进行的测定中这些蛋白质的EC50值从0.21到0.65ng/ml不等(表2)。因此，对蛋白质样品间的比较在同一天分析的样品上进行。这些EC50值与R&D系统说明书中对CHO rEPO报道的值一致(0.05-0.1单位/ml或大约0.4-0.8ng/ml)。
实施例17
EPO半胱氨酸突变蛋白的构建，表达，纯化和生物活性
A.EPO半胱氨酸突变蛋白的构建
使用类似于实施例4所述用于构建生长激素突变体的定点PCR诱变方法构建8个突变的EPO基因(Innis等，1990；Horton等，1993)。我们构建了在A-B环的两个N-连接的糖基化位点上或其附近的4个突变体(N24C，T26C，N38C和T40C)，在B-C环的N-连接的糖基化位点上或其附近的2个突变体(N83C和S85C)，在C-D环的O-连接的糖基化位点上的1个突变体(S126C)和在天然羧基末端R166残基与由肽接头和FLAG序列组成的15个氨基酸羧基末端延伸之间加入一个半胱氨酸的一个突变体(*167C)。用于诱变PCR反应的模板是质粒pBBT131，其中未修饰的EPO基因作为BamHI-EcoRI片段克隆进pUC19。用合适的限制性内切酶消化PCR产物，凝胶纯化并与用相应限制性酶切割，且用碱性磷酸酶处理的pBBT132载体DNA连接并凝胶纯化。如上所述，pBBT132是携带克隆化修饰(FLAG标记)型EPO基因的pUC19衍生物。繁殖来自该连接的转化子并分离和测序质粒DNA。测定完整克隆型诱变PCR片段的序列以证实存在目的突变，且不存在由PCR反应或由合成寡核苷酸引物可能导入的任何其它突变。
半胱氨酸取代突变N24C构建如下。诱变型正向寡核苷酸BB64(5＞GAGGCCAAGGAGGCCGAGTGTATCACGACGGGCTGTGCT＞3)(SEQ.ID.NO.32)设计成将24位的天冬酰胺密码子AAT改变成编码半胱氨酸的TGT且跨越附近的Sty I位点。该寡核苷酸与反向非诱变引物BB47(5＞CCCGAATTCTGGTGGATAT GCCCAGGTGGAC＞3)(SEQ.ID.NO.33)一起用于PCR，该反向引物与EPO编码序列3′端的DNA序列退火。
PCR反应在50μl反应液中进行，反应液为含有1.5mM MgCl2的1 XPromegaPCR缓冲液，引物各0.2μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP各200μM，lng模板质粒pBBT131(实施例16所述)，1.5单位的Taq聚合酶(Promega)和0.25单位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。反应在Robocycler GradieH 96热循环仪(Stratagene公司)中进行。反应程序限定为：96℃3分钟，接着进行25个循环的[95℃1分钟；60℃1.25分钟；72℃1分钟]，接着在6℃保持。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应的5μl等分试样，发现产生大约470bp的预期大小的单一片段。按照卖主的方案使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”剩下的反应物，并按照卖主的方案用Sty I和Bsr GI(新英格兰生物实验室)消化，乙醇沉淀，重悬于20μl 10mM Tris-HCl pH8.5中并在2％琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化大约400bp的目的Sty I-Bsr GI片段。该片段与已用Sty I和Bsr GI酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理的pBBT132(实施例16所述)连接并凝胶纯化。该连接反应物用于转化大肠杆菌，测序所得的转化子的质粒以鉴定含有N24C突变且在大约400bp的StyI-Bsr GI片段的剩余部分具有正确序列的克隆。
除了使用诱变型正向寡核苷酸BB65(5＞GAGGCCAAGGA GGCCGAGAAATCTGTACGGGCTGTGCT＞3)(SEQ.ID.NO.34)代替BB64外，使用上述用于N24C的方案构建取代突变T26C并证实其序列。
使用实施例4所述的“通过重叠延伸实施诱变”的技术构建取代突变N38C。除了使用不同的寡核苷酸引物外，用于N38C构建的起始或“初级”PCR反应按与上面构建N24C所述相同的方法进行。使用的引物对是(BB66+BB47)和(BB67+BB45)。BB47如上所述。正向非诱变引物BB45(5＞CCCGGATCCATGGGGGTGCACGAATGTCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.35)与编码EPO前7个氨基酸的EPO序列退火。BB66和BB67是互补的诱变寡核苷酸，它们将N38的AAT密码子改变成半胱氨酸密码子TGT。BB66的序列是(5＞AGCTTGAATGAGTGTCACTGTCCCAGACACC＞3)(SEQ.ID.NO.36)且BB67的序列是(5＞GGTGTCTGGGACAGTGA TACACTCATTCAAGCT＞3)(SEQ.ID.NO.37)。(BB66×BB47)和(BB67×BB45)PCR反应产生的产物预期大小为：(BB66×BB47)为大约420bp且(BB67×BB45)为大约220bp。乙醇沉淀PCR产物，凝胶纯化且按上述在20μl 10mM Tris-HCl中回收。然后依次将这两个诱变的片段“剪接”在一起，或进行“二级”PCR反应。在该反应中，初级反应的凝胶纯化的PCR产物各1μl用作模板且BB45和BB47用作引物。其它反应条件与初级反应中所用的相同。经琼脂糖凝胶电泳分析二级PCR的等分试样，观察到大约630bp的预期带。按照卖主的方案使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”二级PCR反应物，并按照卖主的方案用Sty I和Bsr GI(新英格兰生物实验室)消化，乙醇沉淀，重悬于20μl 10mM Tris-HClpH8.5中并在2％琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAEXII凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化大约400bp的目的Sty I-Bsr GI片段。该片段与已用Sty I和Bsr GI酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理的pBBT132(实施例16所述)连接并凝胶纯化。该连接反应物用于转化大肠杆菌，测序所得的转化子的质粒以鉴定含有N38C突变且在大约400bp的Sty I-Bsr GI片段上具有正确序列的克隆。
除了在初级PCR反应中使用将T40的ACT密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB68(5＞AGCTTGAATGAGAATATCTGTGTCCCAGACACC＞3)(SEQ.ID.NO.38)和BB69(5＞GGTGTCTGGGACACAGATATTCTCATTCAAGCT＞3)(SEQ.ID.NO.39)分别代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案构建取代突变T40C并证实其序列。
除了在初级PCR反应中使用将N83的AAC密码子改变成半胱氨酸密码子TGC的互补诱变引物BB70(5＞GCCCTGTTGGTCTGCTCTTCCCAGCCGTGGGAGCCCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.40)和BB71(5＞CAGGGGCTCCCACGGCTGGGAAGAGCAGA CCAAC AGGGC＞3)(SEQ.ID.NO.41)分别代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案构建取代突变N83C并证实其序列。初级PCR反应的产物大小也不相同。(BB70×BB47)反应产生预期的大约300bp的产物，(BB71×BB45)反应产生预期的大约360bp的产物。
除了在初级PCR反应中使用将S85的TCC密码子改变成半胱氨酸密码子TGC的互补诱变引物BB72(5＞GCCCTGTTGGTCAACTCTTGCCAGCCGTGGGAGCCCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.42)和BB73(5＞CAGGGGCTCCCACGGCTGGCAAGAGTTGACC AACAGGGC＞3)(SEQ.ID.NO.43)分别代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案构建取代突变S85C并证实其序列。初级PCR反应的产物大小也不相同。(BB72×BB47)反应产生预期的大约300bp的产物，且(BB73×BB45)反应产生预期的大约360bp的产物。
除了在初级PCR反应中使用将S126的TCA密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB74(5＞CCAGATGCGGCCTGTGCTGCTCCACTC＞3)(SEQ.ID.NO.44)和BB75(5＞GAGTGGAGCAGCACAGGCCGCATCTGG＞3)(SEQ.ID.NO.45)分别代替BB66和BB67外，使用上述用于N38C的方案构建取代突变S126C。初级PCR反应的产物大小也不相同。(BB74×BB47)反应产生预期的大约175bp的产物，(BB75×BB45)反应产生预期的大约480bp的产物。
也构建了一种在EPO编码序列的羧基末端氨基酸之后添加一个半胱氨酸的突变。称为*167C的该突变构建如下。在上述用于N24C突变体构建的条件下进行PCR反应，但采用寡核苷酸BB45(见上文)和反向诱变寡核苷酸BB77(5＞TTTGTAGTCCGAGCCTCCGCTTCCGCCCGAACATCTGTCCCCTGTCCTGCA＞3)(SEQ.ID.NO.46)并使用2.5单位的Taq聚合酶和0.5单位的Pfu聚合酶。BB77与EPO编码序列末端21个残基退火且在EPO编码序列末端氨基酸R166的密码子AGA之后加入一个半胱氨酸残基TGT密码子。BB77还加入编码7氨基酸接头-ser-gly-gly-ser-gly-gly-ser-(SEQ.ID.NO.27)的序列和FLAG表位序列的一部分。凝胶纯化该PCR反应的大约630bp的产物并用作随后的PCR反应的模板，该PCR采用相同的反应条件但使用引物BB47和BB61(5＞CGCGAATTCTTATTTATCGTCATCG TCTTTGTAGTCCGAGCCTCC＞3)(SEQ.ID.NO.30)，它添加进FLAG表位序列的剩余部分及随后的TAA终止密码子和一个Eco RI克隆位点。按照卖主的方案使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”该PCR反应物的大约675bp的产物，并按照卖主的方案用Sty I和Eco RI(新英格兰生物实验室)消化，乙醇沉淀，重悬于20μl 10mM Tris-HCl pH8.5中并在2％琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化大约86bp的目的Eco RI-Bsr GI片段。该片段与已用Eco RI和Bsr GI酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理的pBBT132(实施例16所述)连接并凝胶纯化。该连接反应物用于转化大肠杆菌，测序所得的转化子的质粒以鉴定含有*167C突变且在大约86bp的Eco RI-Bsr GI片段上具有正确序列的克隆。
为了在杆状病毒中表达，从pUC19为基础的pBBT132衍生物中作为大约630bp的Bam HI-Eco RI片段切下编码8个突变蛋白的EPO基因并亚克隆进用于表达野生型EPO的pBlueBac4.5杆状病毒转移载体中。
使用相似于本文所述的方法，可构建EPO的其它半胱氨酸突变蛋白。半胱氨酸突变蛋白可以是用半胱氨酸取代EPO编码序列中天然氨基酸残基的取代突变，在EPO编码序列的两个天然存在的氨基酸之间插入半胱氨酸残基的插入突变，或在EPO编码序列的第一个氨基酸，A1，之前加入一个半胱氨酸残基，或在EPO编码序列的末端氨基酸残基，R166，之后加入一个半胱氨酸残基的添加突变。半胱氨酸残基可取代EPO编码序列中任何位置的任何氨基酸残基或插入任意两个氨基酸之间。在EPO中取代和插入半胱氨酸残基的优选位点是在螺旋A之前的区域，A-B环，B-C环，C-D环和螺旋D远端的区域。其它优选的位点是A，B，C和D螺旋的第一个和最后三个氨基酸。在这些区域产生半胱氨酸取代的优选残基是A1，P2，P3，R4，L5，D8，S9，I25，T27，G28，A30，E31，H32，S34，N36，I39，D43，T44，K45，N47，Y49，A50，K52，R53，M54，E55，G57，Q58，G77，Q78，A79，S84，Q86，W88，E89，T107，R110，A111，G113，A114，Q115，K116，E117，A118，S120，P121，P122，D123，A124，A125，A127，A128，R131，T132，K154，Y156，T157，G158，E159，A160，T163，G164，D165，R166。半胱氨酸残基也可插入至紧靠这些氨基酸之前或之后。加入半胱氨酸残基的另一优选位点是在A1之前，我们称为*-1C。
也可经过用另一氨基酸取代EPO中的一个天然存在的半胱氨酸残基以构建含有游离半胱氨酸的EPO突变体。这样在正常情况下与取代的半胱氨酸残基形成二硫键的天然存在的半胱氨酸残基游离出来。可用任何其它19种氨基酸取代非必需的半胱氨酸残基，但优选用丝氨酸或丙氨酸残基。也可经过化学修饰天然存在的氨基酸将游离半胱氨酸残基导入EPO，例如，使用Sytkowski等(1998)所述的方法。
使用类似于实施例16-19所述的方法，可在真核细胞(例如，昆虫细胞或哺乳动物细胞)中表达该蛋白质，纯化该蛋白质，PEG化该蛋白质和在体外生物测定中测量其生物学活性。也可使用类似于实施例1-15所述的方法或本领域的技术人员熟知的有关方法在诸如大肠杆菌等原核细胞中表达EPO突变体。
B.昆虫细胞表达EPO-Cys突变体
为了进行表达实验，使用上述用于质粒pBBT138的方法将编码突变EPO基因的8个质粒与线型化的Bac-N-BlueTM DNA一起共转染Sf9细胞。在Sf9细胞上测定转染上清的蓝色噬菌斑形成。对于各突变，挑出10个蓝色噬菌斑并按实施例16所述传代。经过SDS-PAGE和Western印迹筛选10个所得上清中的5个以检测EPO突变体的表达。使用实施例16对野生型EPO所述的方法进行Western印迹分析。Western印迹表明从各克隆筛选的5个上清中至少有3个含有FLAG标记的EPO蛋白质。Western印迹结果还揭示编码在一个N-连接的糖基化位点防止糖基化的突变体(N24C，T26C，N38C，T40C，N83C和S85C)的质粒产生分子量比野生型BV rEPO小大约2,200-2,800道尔顿的蛋白质。相反，在O-连接的糖基化位点的S126突变体和*167C(添加C-末端半胱氨酸)产生的EPO蛋白质与野生型BV rEPO共同迁移。这些结果与昆虫细胞一般进行N-连接的糖基化且附着到O-连接的糖基化位点的糖基一般较小并导致蛋白质分子量的微弱增加的观察结果一致。已报道昆虫细胞可进行O-连接的糖基化(Davies，1995)。
为了纯化大量的EPO突变体，挑选一个编码各突变体的阳性重组杆状病毒分离物用于进一步扩增。按上文对野生型分离物所述经过传代从各突变型P1原种制备500ml高滴度的病毒原种。使用实施例16中对野生型EPO所述的方法将这些P2裂解物的等分试样随后用于感染500ml培养物以便大规模产生各种EPO突变体。随后无菌过滤500ml来自杆状病毒感染的细胞的上清并在4℃贮存。使用抗-FLAG M2亲和凝胶柱(Eastman Kodak)纯化rEPO-Cys突变体，对于各突变体使用不同批的树脂以保证无交叉污染。5ml树脂首先用50mM Tris，150mM NaCl，pH7.4(TBS)，接着用0.1M甘氨酸pH3.0洗涤，最后在TBS中重新平衡。在加入亲和树脂之前向杆状病毒培养物滤液中加入氯化钠至最终浓度为0.15M。将树脂分批上样到滚瓶培养装置上在4℃过夜。第二天早晨使用XK 16 Pharmacia柱捕获树脂且用TBS洗涤直到A280达到基线。用0.1M甘氨酸pH3.0洗脱rEPO-Cys突变体。将级分(1.5ml)收集进含有20μl 1M Tris碱，pH9.0的试管中以中和该溶液。根据层析和SDS-PAGE分析，合并含有基本上纯的rEPO-Cys蛋白质的级分并冷冻。来自500ml上清培养物的蛋白回收量根据各突变体从75到800μg之间不等(表2)。
纯化的rEPO-Cys突变体在非还原条件下以27-30kDa的表观分子量迁移，与单体蛋白质一致。rEPO-Cys突变体的表观分子量分成两类，很可能是由于糖基化的差异。在O-糖基化位点(S126C)和在C-末端(*167C)含有突变的rEPO-Cys蛋白质迁移到与野生型BV rEPO相似的位置。含有能阻止N-连接的糖基化位点之一糖基化的突变的蛋白质(N24C，T26C，N38C，T40C，N83C和S85C蛋白质)以27-28kDa的表观分子量迁移，略小于野生型BV rEPO。令人惊奇的是，S85蛋白质在还原和非还原条件下都以双联体迁移；双联体的主要带是N-连接的糖基化位点之一未糖基化的蛋白质的预期大小，而弱小带是全部糖基化的野生型BV rEPO的预期大小。S85C突变体的所有原始重组杆状病毒噬菌斑分离物均产生以双联体形式迁移的rEPO蛋白质，表明双联体是由于在N83(或另一氨基酸)处部分糖基化而不是S85C被野生型BV EPO或S126C或*167C蛋白质污染。几种突变体，例如，S126C，*167C具有少量以45-55kDa的表观分子量迁移的第二种蛋白质，这取决于各突变体。这是二硫键连接的rEPO二聚体预期的分子量。这些带在Western印迹中与抗-FLAG抗体反应且在还原条件下在SDS凝胶中移动时不存在。这些资料表明45-55kDa的带代表二硫键连接的rEPO-Cys二聚体。
C.EPO半胱氨酸突变蛋白的生物活性
在实施例16所述的UT7/epo细胞增殖测定中测量纯化的rEPO-Cys突变体的生物学活性。使用Bradford测定法确定蛋白质的浓度。由于有大量的样品，将突变体分成两组用于分析：一组包含突变体T26C，T40C，N83C和S126C，第二组包含突变体N24C，N38C，S85C和*167C。同组突变体在同一天分析。野生型BV rEPO和CHO rEPO在同一天平行分析以控制在测定中不同天之间的可变性。所有的突变体刺激UT7/epo细胞的增殖且具有野生型rEPO对照蛋白质3倍以内的EC50值。N24C，T26C，N83C，S85C，S126和*167C突变体的平均EC50值相似于野生型BV rEPO和CHO rEPO的平均EC50值，平均为0.3-0.8ng/ml(表2)。N38C和T40C蛋白质的平均EC50值大约为1ng/ml(表2)。
Bill等，(1995)报道了EPO半胱氨酸突变蛋白，N24C，N38C和N83C在大肠杆菌中的表达。与我们的结果相反，他们报道了这些半胱氨酸突变蛋白的生物活性相对于野生型EPO显著下降。N38C突变体的生物活性比野生型EPO的生物活性下降不超过20％且N24C和N83C突变体的生物活性比野生型EPO的生物活性下降不超过5％。没有报道EC50值。Bill等，(1995)推测半胱氨酸突变蛋白活性下降是由于导入蛋白质中的额外半胱氨酸残基导致形成错误的二硫键而引起了错误的折叠。他们在用于纯化半胱氨酸突变蛋白的溶液中没有采用胱氨酸或其它半胱氨酸封闭剂。
根据Bill等，(1995)的结果，令人惊奇的是我们纯化的N24C，N38C和N83C突变体具有与野生型EPO相当或3倍以内的生物学活性。这些数据表明我们表达和纯化EPO半胱氨酸突变蛋白的方法与Bill等，(1995)采用的方法相比产生了具有较高的体外生物学活性的蛋白质。
             表2.人EPO半胱氨酸突变蛋白的特性
表达质粒  EPO蛋白质 蛋白质回收量μg/500ml   突变位置 平均EC50(ng/ml)     EC50范围1
    -     rEPO(CHO)      -    -     0.50   0.29-0.65(N＝6)
pBBT138  rEPO(BV)     345    -     0.37   0.21-0.51(N＝6)
pBBT150     N24C     75  A-B环     0.76   0.58，0.85，0.85
pBBT151     T26C     805  A-B环     0.27   0.21，0.22，0.39
pBBT152     N38C     85  A-B环     1.05   0.65，1.20，1.30
pBBT161     T40C     102  A-B环     0.95   0.60，0.75，1.50
pBBT162     N83C     96  B-C环     0.50   0.42，0.49，0.60
pBBT153     S85C     135  B-C环     0.72   0.50，0.80，0.85
pBBT154     S126C     220  C-D环     0.31   0.25，0.25，0.42
pBBT155     *167C     129  C-末端     0.61   0.51，0.65，0.68
1来自各个实验的数据。显示当N＞3时的范围。
实施例18
EPO半胱氨酸突变蛋白的PEG化
A.EPO半胱氨酸突变蛋白的小规模PEG化
检验了几种半胱氨酸突变蛋白和野生型EPO用还原剂TCEP(三(2-羧乙基)膦-HCl)处理后与5kDa半胱氨酸反应性PEG发生PEG化能力。用T26C突变体进行滴定试验以鉴定用于PEG化的合适的TCEP和PEG试剂浓度，同时避免蛋白质的过度还原。我们使用野生型BV rEPO作对照，经过SDS-PAGE监测蛋白质的部分还原。在10-40倍摩尔过量的乙烯砜或马来酰亚胺5kDa PEG(Fluka)存在下测试了递增浓度的TCEP(0.5M到6.0M过量)。经过非还原性SDS-PAGE分析反应物。平行处理野生型BV rEPO作为对照以鉴定大量产生单PEG化EPO-Cys突变体(单个PEG部分附着到EPO-Cys突变体上)，但不与野生型BV rEPO发生PEG化部分还原条件。TCEP过量5倍摩尔量且5kDa乙烯砜-PEG过量30倍摩尔量将产生大量单PEG化T26C蛋白质而不与野生型BV rEPO发生PEG连接。
根据我们对T26C突变体的发现，使用如下条件PEG化几种其它的半胱氨酸突变蛋白。等分试样(1-2μg)的纯化BV rEPO和EPO-Cys突变体与5倍摩尔过量的TCEP和30倍摩尔过量的5kDa乙烯砜PEG在pH8.0下室温温育1小时。经过稀释进SDS样品缓冲液(不含还原剂)终止反应并经过SDS-PAGE分析。新蛋白质带以大约35kDa迁移的现象证明，4种半胱氨酸突变蛋白(N24C，T26C，S126C和*167C)在这些条件下容易发生单PEG化。35kDa种类是单PEG化EPO预期的大小；在这些反应条件下对于任何EPO-Cys突变体检测不到预期具有大约40kDa分子量的双PEG化种类。对照实验表明需要用TCEP还原半胱氨酸突变蛋白以便PEG化。野生型BV EPO在相同的部分还原条件下不发生PEG化。这些数据表明PEG部分附着到已导入N24C，T26C，S126C和*167C EPO-Cys突变体的游离半胱氨酸上。
B.制备PEG-T26C和PEG-S126C用于生物活性测定
我们对大量的T26C和S126C蛋白质进行PEG化以便纯化PEG化蛋白质用于生物活性测量。PEG化反应的规模上升到包括各种蛋白质各75μg和与小规模1μg反应中所用相同摩尔比率的TCEP和5kDa-PEG。1小时后，将PEG化混合物用20mM Tris-HCl，pH8.0，20％甘油(缓冲液A)稀释10倍并立即上样到在缓冲液A中平衡的1ml Q-SEPHAROSE柱上。用平衡缓冲液洗涤柱并用线型10倍柱体积的在20mM Tris-HCl，pH8.0，20％甘油中从0到150mM NaCl递增的盐梯度洗脱结合的蛋白质。PEG部分的存在减小了蛋白质对树脂的亲和力，允许从未PEG化的蛋白质分离出PEG化的蛋白质。经过SDS-PAGE，随后以考马斯蓝染色鉴定含有单PEG化蛋白质的级分。含有PEG-T26C但无可见的未衍化蛋白质的级分在-80℃冷冻贮存并随后用于生物测定。使用相似的方法获得纯化的PEG-S126C。进行Western印迹以评估用于生物测定的PEG-T26C和PEG-S126C制品的纯度。Western印迹按实施例16所述进行。Western印迹在PEG-T26C和PEG-S126C预期的大小处产生强烈的信号，但在未PEG化的S126C和T26C蛋白质预期的位置检测不到任何蛋白质的迁移。从这些结果我们推断在纯化的PEG化突变体中很少存在未PEG化蛋白质(＜5％)。
C.PEG-T26C和PEG-S126C半胱氨酸突变蛋白的生物活性
在实施例16所述的UT7/epo细胞增殖测定中测量纯化的PEG-T26C和PEG-S126C蛋白质的生物学活性。使用人EPO ELSA试剂盒(R&D系统)按厂商建议定量PEG-EPO-Cys突变体的蛋白质浓度。还经过ELISA定量了未PEG化突变体和野生型BV rEPO的蛋白质浓度。所有的蛋白质在同一天进行ELISA测定。制备蛋白质样品的3倍系列稀释液并在生物测定中分析。各系列稀释液的未使用的材料在-80℃冷冻贮存并随后在ELISA中分析以测定起始材料的精确蛋白质浓度。分析各蛋白质样品的几个系列稀释液以保证至少在一个试验样品中的蛋白质浓度落在标准ELISA曲线的线型范围内，该范围是0.0025-0.2单位/ml或大约0.02-1.6ng/ml。各样品至少有两个系列稀释液落在该线型范围内。
PEG-T26C和PEG-S126C突变体的生物学活性类似于未修饰的T26C和S126C蛋白质及野生型BV rEPO。PEG-T26C和PEG-S126C突变体的平均EC50值类似于对未PEG化T26C和S126C蛋白质及野生型BV rEPO所测定的平均EC50值，范围为0.48-0.82ng/ml(表3)。具有生物学活性的PEG化EPO蛋白质以前未见描述。
           表3.PEG-Cys EPO突变体的生物活性
    EPO蛋白质   平均EC50值(ng/ml)     EC50值范围1(ng/ml)
    BVEPO     0.82     0.55，0.95，0.95
    T26C     0.73     0.50，0.85，0.85
    PEG-T26C     0.58     0.35，0.65，0.75
    S126C     0.74     0.65，0.75，0.82
    PEG-S126C     0.48     0.38，0.52，0.55
1数据来自3个实验。
实施例19
EPO半胱氨酸突变蛋白在哺乳动物细胞中的表达和纯化
EPO半胱氨酸突变蛋白也可在哺乳动物细胞中表达并从条件培养基中纯化。经过瞬时转染哺乳动物细胞或经过构建表达EPO半胱氨酸突变蛋白的稳定转化的哺乳动物细胞系可表达EPO半胱氨酸突变蛋白。为了在人类的治疗应用，优选不用接头和FLAG序列表达EPO半胱氨酸突变蛋白。使用本领域的技术人员熟知的方法可将猴COS细胞(可从美国典型培养物保藏中心获得)用于瞬时转染实验。许多商品来源，例如GIBCO/BRL出售脂转染试剂并提供可用于经瞬时转染表达EPO半胱氨酸突变蛋白的详细方案。使用表达该蛋白质的稳定转化的中国仓鼠卵巢(CHO)细胞可生产野生型EPO用于人类。稳定转染的CHO细胞系广泛用于高水平地表达重组蛋白质(Geisse等，1996；Trill等，1995)。在CHO细胞中，经过基因扩增可实现染色体整合的异源基因的高水平表达。一般目的基因与可筛选扩增子的标记基因连接。已描述了提供扩增选择的各种基因(Kaufman，1990)，但鼠二氢叶酸还原酶(dhfr)最常用。该基因的扩增提供对叶酸类似物氨甲蝶呤(MTX)的抗性且抗性水平随dhfr基因拷贝数的增加而增加(Alt等，1978)。dhfr缺陷型CHO细胞系的可获得性增强了MTX筛选的应用性(Urlaub和Chasin，1980)。
本领域的技术人员可将鼠dhfr基因插入可买到的pCDNA3.1表达载体(Invitrogen)来构建EPO半胱氨酸突变蛋白的表达载体，所述载体包含抗G418的新霉素磷酸转移酶(NPT)基因。鼠dhfr表达载体pdhfr2.9可从美国典型培养物保藏中心获得(目录号37165)。该dhfr基因可在dhfr-CHO细胞系中选择并可经过标淮的MTX抗性筛选来扩增(Crouse等，1983)。dhfr编码序列可从pdhfr2.9中作为大约900bp的BglII片段切下并克隆进表达载体pREP4(Invitrogen)中多接头的唯一Bam HI位点。该构建体将基因放在已知在CHO细胞中发挥功能的强RSV启动子(Trill等，1995)的下游，且在来自SV40的多聚腺苷化位点的上游。然后可从pREP4作为Sal I片段切下dhfr表达盒，因为Sal I位点紧靠启动子和polyA添加位点。使用寡核苷酸接头，可将该SalI片段克隆进pCDNA3.1的唯一Bgl II位点。
为了在诸如COS或CHO细胞等哺乳动物细胞中表达，EPO半胱氨酸突变蛋白的cDNA可经过PCR为基础的诱变进行修饰。在5’端，可在翻译起始密码子ATG之前加入一个Kozak共有序列以增强在哺乳动物细胞中的翻译。在3’端，可去掉接头和FLAG序列并恢复天然编码序列和翻译终止信号。然后将这些修饰的EPO cDNA作为Bam HI-Eco RI片段克隆进pCDNA3.1的多接头用于瞬时转染实验或克隆进pCDNA3.1∷dhfr载体的多接头用于在哺乳动物细胞中稳定表达。为了在哺乳动物细胞中表达，编码半胱氨酸突变蛋白的突变EPO基因在5’端修饰以在紧靠翻译起始密码子ATG之前插入一个Kozak共有序列(GCCACC)以便增强在哺乳动物细胞中的翻译。在3’端，可去掉接头和FLAG序列并恢复天然编码序列。以本领域的技术人员熟知的各种诱变技术可实现这些修饰。可采用根据实施例4和17所述的PCR-为基础的诱变方法。PCR引物BB302(5＞CGCGGATCCGCCACCATGGGGGTGCACGAATGTCCT＞3)(SEQ.ID.NO.47)和BB303(5＞CGCGAATTCTCATCTGTCCCCTGTCCTGCAGCC＞3)(SEQ.ID.NO.48)可用于PCR，克隆在pUCl9或pBlueBac4.5中的突变EPO基因作为模板。正向引物BB302与编码EPO分泌信号前7个氨基酸的EPO基因序列退火，在紧靠翻译起始密码子TGA之前加入一个Kozak共有序列，GCCACC，且包含一个用于克隆目的的Bam HI位点。反向引物BB303与EPO编码序列中编码羧基末端7个氨基酸的序列退火，在EPO编码序列之后加入一个AGT翻译终止密码子，且包含一个用于克隆目的的Eco RI位点。使用这些引物和在这两个引物之间有一个突变，例如在成熟EPO编码序列的氨基酸1到159发生氨基酸取代的任何突变EPO基因模板进行的各PCR反应的产物将产生可被纯化，用Bam HI和Eco RI消化并克隆进诸如pCDNA3.1(+)(Invitrogen)等适合于在哺乳动物细胞中表达的载体中的PCR产物。PCR引物302和303也可用于修饰EPO半胱氨酸突变蛋白，其中，在成熟EPO编码序列的第一个氨基酸，A1，之前，但远离EPO信号序列加入一个半胱氨酸。在编码羧基末端7个氨基酸的EPO序列中的突变，或实施例17中所述的*167C突变需要使用另一反向引物代替BB303。这些引物可分别设计成包含突变的半胱氨酸密码子，与模板靶精确配对的寡核苷酸3’端至少21个核苷酸，并含有用于克隆目的的Eco RI位点。例如反向引物BB304(5＞CGCGAATTCTCAACATCTGTCCCCTGTCCTGCAGCC＞3)(SEQ.ID.NO.49)和BB302可用于以克隆在pUC19或pBlueBac4.5中的突变的EPO*167C基因作模板的PCR反应，以产生适合于在哺乳动物细胞表达系统中表达的编码*167C突变体的修饰的突变型EPO基因。
无内毒素的质粒DNA优选用于转染诸如COS或dhfr-CHO细胞等哺乳动物细胞。dhfr-CHO细胞系可从许多来源获得，例如哥伦比亚大学L.Chasin博士(CHO K1 DUKX B11)或从美国典型培养物保藏中心(CHO duk，ATCC号CRL-9096)获得。该细胞在补充了10％FBS，谷氨酰胺，甘氨酸，次黄嘌呤和腺苷的F12/DMEM培养基中培养(Lucas等，1996)。经过电穿孔或经过使用本领域的技术人员熟知的转染试剂，例如LipofectAMINE(GibcoBRL)，使用卖主方案和/或文献所述的方法(Kaufman，1990)进行转染。可在补充了7％已透析的FCS且缺乏谷氨酰胺，甘氨酸，次黄嘌呤和腺苷的F12/DMEM(Lucas等，1996)中选择dhfr+转染子。另外，可选择G418抗性(由pCDNA3.1的NPT基因编码)并随后筛选dhfr+表型的转染子。可在选择培养基上扩增dhfr+克隆并使用可买到的EPO ELISA试剂盒(可从R&D系统获得)或经过使用抗-EPO抗血清(可从R&D系统获得)进行Western印迹筛选培养物上清的EPO半胱氨酸突变蛋白的生产。然后合并表达EPO半胱氨酸突变蛋白的克隆并按Kaufman(1990)所述在递增药物浓度下进行多轮MTX抗性筛选。每轮MTX选择后，可测试各克隆的EPO半胱氨酸突变蛋白生产。这些方法在文献中已充分描述且已被用于在CHO细胞中表达各种异源性蛋白质(在Kaufman，1990中综述)。
优选的是，可供表达EPO半胱氨酸突变蛋白的CHO细胞进行生长的培养基应含有半胱氨酸或另一种半胱氨酸封闭剂。可使用类似于Imai等，(1990)所述的方法从CHO细胞条件培养基中纯化EPO半胱氨酸突变蛋白。离心去掉CHO细胞后，使用本领域的技术人员熟知的技术经过柱层析可从上清纯化EPO半胱氨酸突变蛋白。用于纯化EPO半胱氨酸突变蛋白的柱层析步骤可包括Blue Sepharose，羟基磷灰石，反相，疏水相互作用，大小排阻和离子交换层析。
实施例20
IFN-α2的克隆，表达和纯化
A.克隆编码IFN-α2的DNA序列
有至少25种不同的IFN-α基因编码具有70％或更大氨基酸相同性的蛋白质(Blatt等，1996)。由于在IFN-α类型之间的高度DNA序列同源性，以两步法克隆IFN-α2基因。首先，使用相应于IFN-α2基因上游和下游特有序列的引物从人基因组DNA经过PCR扩增IFN-α2基因。克隆该PCR产物并测序以证实其编码IFN-α2基因。随后，经过PCR修饰IFN-α2编码序列并进行亚克隆以便在大肠杆菌中表达并定点诱变。从人基因组DNA(CLONTECH)经PCR扩增编码IFN-α2的DNA。用BB93(5＞CGCGAATTCGGATATGTAAATAGATACACAGTG＞3)(SEQ.ID.NO.50)和BB94(5＞CGCAAGCTTAAAAGATTTAAATCGTGTCATGGT＞3)(SEQ.ID.NO.51)进行PCR反应。BB93与IFN-α2编码序列上游(即5’端)大约300bp的基因组序列退火且含有用于克隆目的的Eco RI位点。BB94与IFN-α2编码序列下游(即3’端)大约100bp的基因组序列退火且含有用于克隆目的的Hind III位点。用Eco RI和Hind III消化所得的大约1kb PCR产物并克隆进同样消化并用碱性磷酸酶处理的pCDNA3.1(+)(Invitrogen)中。鉴定了一个具有IFN-α2正确DNA序列(Henco等，1985)的克隆并命名为pBBT160。
为了在大肠杆菌中进行细胞质表达，将pBBT160的克隆的IFN-α2基因经过PCR修饰以便在成熟的IFN-α2蛋白质紧靠第一个残基(C1)之前插入一个甲硫氨酸密码子。在羧基末端残基E165之后加入一个TAA终止密码子。同时，加入Xba I和Sal I位点并删除一个Bgl II位点以便提供方便的限制性位点用于随后诱变。在该反应中，pBBT160用作模板并使用引物BB99(5＞CGCAAGCTTCATATGTGTGATCTGCCTCAAACCCACAGCCTGGGTTCTAGAAGGACCTTGATGCTC＞3)(SEQ.ID.NO.52)和BB100(5＞CGCGAATTCTTATTCCTTACTTCTTAAACTTTCTTGCAAGTTTGTCGACAAAGAAAAGGATCTCATGAT＞3)(SEQ.ID.NO.53)进行扩增。BB99与成熟IFN-α2编码序列的5’端退火且在成熟IFN-α2第一个氨基酸之前编码一个起始甲硫氨酸。BB99在起始密码子ATG下游大约30bp处导入一个Xba I位点，但不改变该蛋白质的氨基酸序列。此外还包含用于克隆目的的Hind III位点和Nde I位点，它们覆盖ATG。反向引物BB100与编码序列3’端退火且加入了一个TAA终止密码子。BB100在TAA密码子下游大约30bp处导入一个Sal I位点并删除了位于更下游大约15bp处的一个天然存在的Bgl II位点。结果，位于起始密码子ATG下游大约185bp的天然存在的Bgl II位点变成唯一位点。这些变化均不改变氨基酸序列。在紧靠终止密码子下游加入一个Eco RI位点用于克隆目的。用Hind III和Eco RI消化大约520bp的PCR产物，凝胶纯化并克隆进同样消化的质粒pCDNA3.1(+)中。测定了一个克隆具有正确的DNA序列。该质粒命名为pBBT164。为了在大肠杆菌中进行细胞质表达，将pBBT164的大约520 bp Nde I-Eco RI片段克隆进同样消化的表达载体pCYB1(新英格兰生物实验室)。质粒载体pCYB1允许基因作为非融合蛋白质或作为融合蛋白质表达；该载体可构建成使得该蛋白质以非融合蛋白质形式表达。所得的质粒称为pBBT170且编码met-IFN-α2。含有pBBT164的met-IFN-α2序列的Nde I-Eco RI片段也亚克隆进Nde I-EcoRI消化的pUC18中以产生质粒pBBT168。
IFN-α2也可以经过分泌进周质空间而在大肠杆菌中以活性形式表达(Voss等，1994)。分泌型IFN-α2缺乏N-末端甲硫氨酸且具有与天然存在的IFN-α2相同的氨基酸序列。为了表达IFN-α2的分泌形式，将大肠杆菌热稳定性肠毒素(STII)基因的先导序列(Picken等，1983)经过PCR融合到成熟IFN-α2的编码序列上。由于其长度，在连续两个PCR反应中加入ST II序列。第一个反应使用正向引物BB101(5＞GCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCGCTACCAACGCTTACGCATGTGATCTGCCTCAAACCCACAGC＞3)(SEQ.ID.NO.54)和反向引物BB100并用pBBT164(上述)作模板。BB101的3’末端(21bp)与成熟IFN-α2的编码序列5’端退火。BB101的5’片段(39个核苷酸)编码STII先导肽的一部分。凝胶纯化该反应的大约550bp PCR产物并用作第二PCR反应的模板。第二PCR反应使用反向引物BB100和正向引物BB11(5’-CCCCCTCTAGACATATGAAGAAGAACATCGCATTCCTGCTGGCATCTATGTTCGTTTTCTCTATCG-3’)(SEQ.ID.NO.7)。BB11加入STII先导肽的剩余部分且含有与STII先导序列起始密码子ATG重叠的Nde I位点。用Nde I和Xba I消化该反应的大约590bp的产物。凝胶纯化含有STII先导序列和IFN-α2氨基末端大约30bp的大约100bp的Nde I-Xba I片段并与已用Nde I和Xba I消化且用碱性磷酸酶处理的pBBT168[pUC18∷met-IFN-α2]连接并凝胶纯化。在该步骤中，用PCR产生的STII-IFN-α2 PCR产物的大约100bp的Nde I-Xba I氨基末端片段代替met-IFN-α2基因的大约30bp的Nde I-Xba I氨基末端片段。证实所得的pUC18∷STII-IFN-α2构建体的序列且该质粒命名为pBBT177。为了在大肠杆菌中表达，用Nde I和Eco RI消化pBBT177且凝胶纯化含有STII-IFN-α2基因的大约570bp的片段并克隆进表达载体pCYB1中置于tac启动子控制下。所得的质粒命名为pBBT178。
B.rIFN-α2在大肠杆菌中的表达
将编码met-IFN-α2的pBBT170和亲本载体pCYB1转化进大肠杆菌JM109中。用这些菌株进行的实验导致表达met-IFN-α-2。分泌的IFN-α2优选是胞质met-IFN-α2，其中分泌的IFN-α2与天然存在的IFN-α2具有相同的氨基酸序列。
为了表达分泌型r IFN-α2，将pBBT178[pCYB1∷STII-IFN-α2]和亲本载体pCYB1转化进大肠杆菌W3110中。所得的菌株命名为BOB202：W3110(pBBT178)和BOB130：W3110(pCYB1)。我们进行了一系列实验在起始pH为5.0到7.0范围的磷酸盐或MES缓冲的LB培养基中试验BOB202的生长和r IFN-α2表达。饱和的过夜培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB中稀释至A600下为大约0.025 O.D并在摇瓶中37℃下培养。当培养物的O.D.达到大约0.3-0.5时，加入IPTG至最终浓度为0.5mM以诱导r IFN-α2的表达。对于起始实验，在诱导后0，1，3，5和大约16小时时取培养物样品。在预制的14％Tris-甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶上进行SDS-PAGE并经考马斯亮兰染色分析诱导的和未诱导的培养物样品。除了表达预期大约19kDa的IFN-α2的加工形式外，我们还观察到比预期分子量更高的蛋白质形式(大约21.5kDa)。更高分子量形式可能由缺乏对STII先导肽的蛋白裂解而产生；先导肽的分子量与该假设一致。我们的结果表明较低的pH值增强正确大小的rIFN-α2带的积累。我们观察到在pH6.5或以上时，21.5kDa是主要形式，而在pH6.0或以下时，与大肠杆菌表达的r IFN-α2标准品(Endogen公司)共迁移的大约19kDa的带是主要的蛋白质形式。在pH6.0或以下时，19kDa的带占大肠杆菌细胞表达的IFN-α2的至少80％且很可能占90％以上。根据这些发现，使用以100mM MES缓冲到pH5.5的LB培养基进行进一步的表达实验。Voss等，(1994)也报道了使用STII先导序列将IFN-α2分泌进大肠杆菌周质中。他们还观察到培养物pH维持在6.7时与维持在7.0相比，21.5kDa带中r IFN-α2的比例降低，19kDa中的比例增加。在pH7.0时，Voss等，(1994)报道了10-30％的STII：IFN-α2融合蛋白质被加工成19kDa的成熟IFN-α2蛋白质。大肠杆菌在pH6.7生长时正确加工的19kDa IFN-α2蛋白质的百分比可增加到50-60％。然而，即使在该pH下，大量(40-50％)的STII：IFN-α2融合蛋白质仍未加工，减少了正确加工的19kDa IFN-α2的产量。Voss等，(1994)认为，为了使19kDa的分泌型IFN-α2的含量最大化，pH6.7是最佳的。Voss等，(1994)改变了一些生长参数以尝试将正确加工的19kDa IFN-α2蛋白质的百分比增加到超过50-60％，但没有成功。我们的数据表明将pH降低到6.5以下，且优选5.5至6.0，可使裂解(19kDa)与未裂解(21.5kDa)的r IFN-α2产物的比率最大化。在这些较低pH值下，正确加工的19kDa IFN-α2的百分比增加到该细胞合成的总IFN-α2的至少80％且很可能到90-100％。
根据Koshland和Botstein(1980)的方法对表达r IFN-α2的培养物进行渗透压休克。该方法破裂大肠杆菌的外膜并将周质内容物释放进周围的培养基中。随后的离心分离可溶性周质成分(在上清中回收)与细胞质，不溶性周质和细胞相关成分(在沉淀中回收)。在上清中回收到BOB202合成的大约25-50％的19kDa rIFN-α2。在可溶性周质部分中没有观察到rIFN-α2的21.5kDa形式。
C.rIFN-α2在大肠杆菌中的大规模表达和纯化：
为了纯化野生型rIFN-α2蛋白质，将新鲜饱和的BOB202过夜培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的LB 100mM MES(pH5.5)中接种至A600下为大约0.02 O.D。一般来说，将325ml培养物在2L摇瓶中37℃下在旋转(gyrotory)摇床水浴中以大约160-200rpm培养。当培养物的密度达到大约0.3-0.4 O.D.时，加入IPTG至最终浓度为0.5mM。然后将诱导培养物培养大约16小时。按照Hsuing等(1986)的方法对培养物进行渗透压休克。离心沉淀细胞并以大约25 OD/ml重悬于冰冷却的20％蔗糖，10mM Tris-HCl(pH8.0)中。重悬的细胞在冰上培养15分钟并以9500xg离心10分钟。沉淀重悬于冰冷却的10mM Tris-HCl(pH8.0)中并在冰上培养15分钟，以9500xg离心10分钟。所得的上清(渗透压休克裂解物)立即加工或贮存于-80℃。
rIFN-α2纯化如下。将来自渗透压休克的上清的pH调节到3，离心去掉任何沉淀并上样到在20mM MES pH5.0(缓冲液A)中平衡的5ml PharmaciaHiTrap S-Sepharose柱上。用0-100％缓冲液B(500mM NaCl，20mM MES，10％乙二醇)的线型盐梯度洗脱结合的蛋白质。经过非还原性SDS-PAGE分析柱级分。rIFN-α2在大约225-235mM NaCl处洗脱。合并富集rIFN-α2的级分并进一步在预先用40mM磷酸钠pH6.0，1M NaCl，0.1％Tween 20中平衡的1ml Cu++IMAC(固定化金属亲和层析)Hi Trap柱中分离。用在40mM磷酸钠，1M NaCl，0.1％Tween 20中从5.5到4.1的反向pH梯度洗脱rIFN-α2。在梯度达到100％缓冲液B后，洗脱液的pH最终达到pH4.1时洗脱rIFN-α2。合并含有纯化的，正确折叠的rIFN-α2的来自Cu++IMAC柱的级分并作为等分试样冻存在-80℃。在某些早期洗脱级分中可检测到少量rIFN-α2变异体。这种由于不完全二硫键形成所产生的且具有生物学活性的变异体以前已有描述(Khan和Rai，1990)。含有该变异体的级分不加入纯化rIFN-α2的最终合并液中。经过在280nm下的吸光度和经过Bradford分析测定的rIFN-α2最终产量为从250ml培养物中得到大约400μg。用SDS-PAGE分析时还原的IFN-α2比非还原的IFN-α2以略大的表观分子量迁移(Morehead等，1984)。该表观分子量的改变是由于在IFN-α2中天然二硫键的还原产生的。我们的rIFN-α2在还原和非还原条件下都与商品化rIFN-α2标准品共迁移。
D.野生型r IFN-α2的体外生物活性
使用体外抗病毒试验或细胞增殖抑制试验测量IFN-α的生物活性。我们建立了测量野生型r IFN-α2生物活性的细胞生长抑制试验。人Daudi B细胞系(美国典型培养物保藏中心)对IFN-α的生长抑制特性敏感且通常用于测量IFN-α的生物活性(Horoszewicz等，1979；Evinger和Pestka，1981)。Daudi细胞在补充了10％FBS，50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI1640培养基中维持。为了进行生物测定，用RPMI 1640培养基洗涤细胞3次并以4×105个细胞/ml的浓度重悬于含有10％FBS，50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中。将50μl(2×104个细胞)的细胞悬液等分分配进平底96孔组织培养板的各试验孔中。在含有10％FBS，50单位/ml青霉素和50μg/ml链霉素的RPMI 1640培养基中制备待测蛋白质样品的3倍系列稀释液。将50μl的稀释的蛋白质样品加入试验孔中并在湿润的5％CO2组织培养箱中37℃培养平板。蛋白质样品以一式3孔进行测定。4天后，向各孔中加入20μl CellTiter 96 Aqueous One溶液试剂(Promega公司)且在组织培养箱中37℃培养平板1-4小时。使用微滴板阅读器在490nm下读取吸光度。对照孔含有培养基但无细胞。从各组一式三份试验孔获得的平均吸光度值减去一式三份对照孔获得的平均吸光度值。平行分析系列稀释的大肠杆菌表达的r IFN-α2(Endogen公司)。计算各样品的IC50值(最大生长抑制的一半所需的蛋白质浓度)并用于比较蛋白质的生物活性。
由吸光度值的剂量依赖型减小证实Daudi细胞系的增殖受到r IFN-α2的强烈抑制。商品r IFN-α2(Endogen公司)与我们制备的野生型r IFN-α2在测定误差范围内达到相同的最大生长抑制水平，且具有大约13-16pg/ml的相似的平均IC50值(表4)。在不同日期进行的测定中这些蛋白质的IC50值从7到29pg/ml不等(表4)。因此，蛋白质之间的比较对同一天分析的样品进行。
实施例21
IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的构建，表达，纯化和生物活性
A，IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的构建
使用类似于实施例4所述的定点PCR为基础的诱变方法构建17个突变的IFN-α2基因。我们构建了在靠近螺旋A的氨基末端区域中的1个突变体[Q5C]；在A-B环中的6个突变体[N45C，Q46C，F47C，Q48C，A50C和43C44(在残基43和44之间插入一个半胱氨酸)]；在短的两个残基的BC环中的1个突变体[D77C]；在CD环中的4个突变体[Q101C，T106C，E107C和T108C]；在E螺旋远端的羧基末端区域中的3个突变体[S163C，E165C和*166C(在天然羧基末端加入一个半胱氨酸残基)]。我们还构建了突变体C1S和C98S，它们删除了天然存在的，但非必须的C1-C98二硫键(Lydon等，1985；Morehead等，1994)。在靠近螺旋A的氨基末端区域中的C1S取代在C螺旋中产生了一个游离半胱氨酸(C98)，而在C螺旋中的C98S取代在靠近螺旋A的区域产生了一个游离半胱氨酸(C1)。
为了进行诱变，将PCR引物寡核苷酸设计成可掺入核苷酸改变，其导致在IFN-α2编码序列中的选定位置插入一个半胱氨酸残基。如果可行，也可将诱变寡核苷酸设计成跨越邻近的可用于将诱变的PCR片段克隆进合适质粒的限制性位点。当没有有用的限制性位点足够靠近突变位点时，可采用“通过重叠延伸实施诱变”的技术(Horton等，1993)。用于诱变PCR反应的模板是质粒pBBTl77(实施例20所述)，其中STII-IFN-α2基因作为NdeI-EcoRI片段克隆进pUC18。用合适的限制性内切酶消化PCR产物，凝胶纯化并与用那些相同的限制性酶切割，且用碱性磷酸酶处理的pBBT177载体DNA连接并凝胶纯化。繁殖来自该连接的转化子并分离和测序质粒DNA。测定完整克隆化诱变PCR片段的序列以证实存在目的突变，且不存在由PCR反应或由合成寡核苷酸引物可能导入的任何其它突变。
使用实施例4所述的“通过重叠延伸实施诱变”的技术构建取代突变Q5C。用于Q5C构建的起始，或“初级”PCR反应在50μl反应体积中进行，反应液为含有1.5mM MgCl2的1 X Promega PCR缓冲液，引物各0.2μM，dATP，dGTP，dTTP和dCTP各200μM，1ng模板质粒pBBT177(实施例20所述)，1.5单位的Taq聚合酶(Promega)和0.25单位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。反应在Robocycler Gradient 96热循环仪(Stratagene公司)中进行。反应程序限定为：96℃3分钟，接着进行25个循环的[95℃1分钟；60℃1.25分钟；72℃1分钟]，接着在6℃保持。使用的引物对是[BB125×BB130]和[BB126×BB129]。BB125(5＞CTATGCGGCATCAGAGCAGATA＞3)(SEQ.ID.NO.55)与克隆的IFN-α2序列上游大约20bp处的pUC18载体序列退火。BB126(5＞TGTGGAATTGTGAGCGGATAAC＞3)(SEQ.ID.NO.56)与克隆的IFN-α2序列下游大约40bp处的pUC18载体序列退火。BB129和BB130是将Q5的CAA密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变寡核苷酸。BB129的序列是(5＞TGTGATCT GCCTTGTACCCACAGCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.57)，BB130的序列是(5＞CAGGCTGTGGGTACAAGGCAGATCACA＞3)(SEQ.ID.NO.58)。[BB125×BB130]和[BB126×BB129]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB130]为大约140bp，[BB126×BB129]为大约560bp。按照卖主的方案使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”PCR产物，在2％琼脂糖凝胶上电泳，使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化并在20μl 10mM Tris-HCl(pH8.5)中回收。然后依次将这两个诱变的片段“剪接”在一起，或进行“二级”PCR反应。在该反应中，初级反应的凝胶纯化的PCR产物各2μl用作模板且BB125和BB126用作引物。反应体积为100μl并使用2.5单位的Taq聚合酶和0.5单位的Pfu聚合酶。其它反应条件与初级反应中所用的相同。经琼脂糖凝胶电泳分析二级PCR的等分试样且观察到大约670bp的预期带。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”大批二级PCR反应物，并按照卖主的方案用NdeI和Xba I(新英格兰生物实验室)消化，使用QIAquick PCR纯化试剂盒“清理”并在2％琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化大约100bp的目的Nde I-Xba I片段。该片段与已用Nde I和Xba I酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理的pBBT177(实施例20所述)连接并凝胶纯化。该连接反应物用于转化大肠杆菌，测序所得的转化子的质粒以鉴定含有Q5C突变且在大约100bp的NdeI-XbaI片段上具有正确序列的克隆。
除了在初级PCR反应中使用将C1的TGT密码子改变成丝氨酸密码子TCT的互补诱变引物BB128(5＞AGGCAGATCAGATGCGTAAGC＞3)(SEQ.ID.NO.59)和BB127(5＞GCTTACGCATCTGATCTGCCT＞3)(SEQ.ID.NO.60)分别代替BB130和BB129外，使用上述用于Q5C的方案构建取代突变C1S并证实其序列。[BB125×BB128]和[BB126×BB127]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB128]为大约120bp，[BB126×BB127]为大约570bp。
除了下述区别外使用上述用于Q5C的方案构建取代突变N45C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将N45的AAC密码子改变成半胱氨酸密码子TGC的互补诱变引物BB134(5＞CTTTTGGAACTGGCAGCCAAACTCCTC＞3)(SEQ.ID.NO.61)和BB133(5＞GAGGAGTTTGGCTGCCAGTTCCAAAAG＞3)(SEQ.ID.NO.62)分别代替BB130和BB129。[BB125×BB134]和[BB126×BB133]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB134]为大约255bp，[BB126×BB133]为大约440bp。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”二级PCR反应的产物，并按照卖主的方案用Bgl II和Xba I(新英格兰生物实验室)消化，使用QIAquick PCR纯化试剂盒“清理”并在2％琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化大约155bp的目的Bgl II-Xba I片段。该片段与已用Bgl II和Xba I酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理的pBBT177连接并凝胶纯化。该连接反应物用于转化大肠杆菌，测序所得的转化子的质粒以鉴定含有N45C突变且在大约155bp的Bgl II-Xba I片段上具有正确序列的克隆。
除了下述区别外使用上述用于N45C的方案构建取代突变F47C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将F47的TTC密码子改变成半胱氨酸密码子TGC的互补诱变引物BB136(5＞TTCAGCCTTTTGGCACTGGTTGCCAAA＞3)(SEQ.ID.NO.63)和BB135(5＞TTTGGCAACCAGTGCCAAAAGGCTGAA＞3)(SEQ.ID.NO.64)分别代替BB134和BB133。[BB125×BB136]和[BB126×BB135]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB136]为大约260bp，[BB126×BB135]为大约435bp。
除了下述区别外使用上述用于N45C的方案构建插入突变43C44并证实其序列。在初级PCR反应中使用在编码氨基酸残基43和44的密码子之间插入一个半胱氨酸密码子TGC的互补诱变引物BB132(5＞TTCAGCCTTTTGGCACTGGTTGCCAAA＞3)(SEQ.ID.NO.65)和BB131(5＞TTTGGCAACCAGTGCCAAAAGGCTGAA＞3)(SEQ.ID.NO.66)分别代替BB134和BB133。[BB125×BB132]和[BB126×BB131]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB132]为大约250bp，[BB126×BB131]为大约445bp。
除了下述区别外使用上述用于N45C的方案构建取代突变Q46C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将Q46的CAG密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB154(5＞AGCCTTTTGGAAACAGTTGCCAAACTC＞3)(SEQ.ID.NO.67)和 BB153(5＞GAGTTTGGCAACTGTTTCCAAAAGGCT＞3)(SEQ.ID.NO.68)分别代替BB134和BB133。在Perkin-ElmerGeneAmpPCR系统2400热循环仪中进行初级反应。反应程序限定为：95℃5分钟，30个循环的[95℃30秒；62℃30秒；72℃1分钟]，接着在72℃7分钟并在4℃保持。[BB125×BB154]和[BB126×BB153]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB154]为大约260bp，[BB126×BB153]为大约440bp。第二PCR反应也在Perkin-Elmer GeneAmpPCR系统2400热循环仪中进行。反应程序限定为：96℃5分钟，25个循环的[95℃30秒；60℃30秒；72℃1分钟]并在4℃保持。用Bgl II和Xba I消化后，在连接前使用QIAquickPCR纯化试剂盒清理该反应的产物，但不进行凝胶纯化。
除了下述区别外使用上述用于Q46C的方案构建取代突变Q48C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将Q48的CAA密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB156(5＞GGTTTCAGCCTTACAGAACTGGTTGCC＞3)(SEQ.ID.NO.69)和BB155(5＞GGCAACCAGTTCTGTAAGGCTGAAACC＞3)(SEQ.ID.NO.70)分别代替BB154和BB153。[BB125×BB156]和[BB126×BB155]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB156]为大约265bp，[BB126×BB155]为大约435bp。
除了下述区别外使用上述用于Q46C的方案构建取代突变A50C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将A50的GCT密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB158(5＞AGGGATGGTITCACTTTTGGAACTG＞3)(SEQ.ID.NO.71)和BB157(5＞CAGTTCCAAAAGTGTGAAACCATCCCT＞3)(SEQ.ID.NO.72)分别代替BB154和BB153。[BB125×BB158]和[BB126×BB157]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB158]为大约270bp，[BB126×BB157]为大约440bp。
除了下述区别外使用上述用于Q5C的方案构建取代突变D77C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将D77的GAT密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB138(5＞TAGGAGGGTCTCACACCAAGCAGCAGA＞3)(SEQ.ID.NO.73)和BB137(5＞TCTGCTGCTTGGTGTGAGACCCTCCTA＞3)(SEQ.ID.NO.74)分别代替BB130和BB129。[BB125×BB138]和[BB126×BB137]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB138]为大约350bp，[BB126×BB137]为大约345bp。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”二级PCR反应的产物，并按照卖主的方案用Bgl II和Sal I(新英格兰生物实验室)消化，使用QIAquick PCR纯化试剂盒“清理”并在2％琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化大约275bp的目的Bgl II-Sal I片段。该片段与已用Bgl II和Sal I酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理的pBBT177连接并凝胶纯化。该连接反应物用于转化大肠杆菌，测序所得的转化子的质粒以鉴定含有D77C突变且在大约275bp的Bgl II-Sal I片段上具有正确序列的克隆。
除了下述区别外使用上述用于D77C的方案构建取代突变T106C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将T106的ACA密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB140(5＞CAGGGGAGTCTCACACACCCCCACCCC＞3)(SEQ.ID.NO.75)和BB139(5＞GGGGTGGGGGTGTGTGAGACTCCCCTG＞3)(SEQ.ID.NO.76)分别代替BB138和BB137。[BB125×BB140]和[BB126×BB139]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB140]为大约435bp，[BB126×BB139]为大约260bp。
除了下述区别外使用上述用于D77C的方案构建取代突变T108C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将T108的ACT密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB142(5＞CTTCATCAGGGGACACTCTGTCACCCC＞3)(SEQ.ID.NO.78)和BB141(5＞GGGGTGACAGAGTGTCCCCTGATGAAG＞3)(SEQ.ID.NO.79)分别代替BB138和BB137。[BB125×BB142]和[BB126×BB141]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB142]为大约440bp，[BB126×BB1419]为大约250bp。
除了下述区别外使用上述用于D77C的方案构建取代突变Q101C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将Q101的CAG密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB162(5＞CACCCCCACCCCACATATCACACAGGC＞3)(SEQ.ID.NO.80)和BB161(5＞GCCTGTGTGATATGTGGGGTGGGGGTG＞3)(SEQ.ID.NO.81)分别代替BB138和BB137。在Perkin-ElmerGeneAmpPCR系统2400热循环仪中进行初级反应。反应程序限定为：95℃5分钟，30个循环的[95℃30秒；62℃30秒；72℃1分钟]，接着在72℃7分钟并在4℃保持。[BB125×BB162]和[BB126×BB161]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB162]为大约425bp，[BB126×BB161]为大约275bp。第二PCR反应也在Perkin-Elmer GeneAmpPCR系统2400热循环仪中进行。反应程序限定为：96℃5分钟，25个循环的[95℃30秒；60℃30秒；72℃1分钟]并在4℃保持。该反应的产物用Bgl II和Sal I消化后，在连接前使用QIAquick PCR纯化试剂盒清理，但不进行凝胶纯化。
除了下述区别外使用上述用于Q101C的方案构建取代突变E107C并证实其序列。在初级PCR反应中使用将E107的GAG密码子改变成半胱氨酸密码子TGT的互补诱变引物BB164(5＞CATCAGGGGAGTACATGTCACCCCCAC＞3)(SEQ.ID.NO.81)和BB163(5＞GTGGGGGTGACATGTACTCCCCTGATG＞3)(SEQ.ID.NO.82)分别代替BB162和BB161。[BB125×BB164]和[BB126×BB163] PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB164]为大约440bp，[BB126×BB163]为大约255bp。
除了下述区别外使用上述用于Q101C的方案构建取代突变C98S并证实其序列。在初级PCR反应中使用将C98的TGT密码子改变成丝氨酸密码子TCT的互补诱变引物BB160(5＞CCCCTGTATCACAGAGGCTTCCAGGTC＞3)(SEQ.ID.NO.83)和BB159(5＞GACCTGGAAGCCTCTGTGATACAGGGG＞3)(SEQ.ID.NO.84)分别代替BB162和BB161。[BB125×BB160]和[BB126×BB159]PCR反应产生预期大小的产物，[BB125×BB160]为大约415bp，[BB126×BB159]为大约285bp。
半胱氨酸取代突变体S163C构建如下。诱变型反向寡核苷酸BB143(5＞CGCGAATTCTTATTCCTTACATCTTAAACTTTC＞3)(SEQ.ID.NO.85)设计成将163位的丝氨酸密码子AGT改变成编码半胱氨酸的TGT并跨越附近的Eco RI位点。该寡核苷酸与正向，非诱变引物BB125一起用于PCR。PCR反应在50μl反应体积中进行，反应液为含有1.5mM MgCl2的1 X Promega PCR缓冲液，各0.2μM的各引物，dATP，dGTP，dTTP和dCTP各200μM，lng模板质粒pBBT131，1.5单位的Taq聚合酶(Promega)和0.25单位的Pfu聚合酶(Stratagene公司)。反应在Robocycler Gradient 96热循环仪(Stratagene公司)中进行。反应程序限定为：96℃3分钟，25个循环的[95℃1分钟；60℃1.25分钟；72℃1分钟]，接着在6℃保持。经琼脂糖凝胶电泳分析PCR反应的5μl等分试样，发现产生预期大约610bp的单个片段。按照卖主的方案使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)“清理”剩下的反应产物，并按照卖主的方案用Sal I和Eco RI(新英格兰生物实验室)消化，乙醇沉淀，重悬于20μl 10mM Tris-HCl pH8.5中并在2％琼脂糖凝胶上电泳。使用QIAEX II凝胶提取试剂盒(Qiagen)按照卖主方案凝胶纯化大约42bp的目的Sal I-Eco RI片段。该片段与已用Sal I和Eco RI酶切并用小牛肠碱性磷酸酶(新英格兰生物实验室)处理的pBBT132连接并凝胶纯化。该连接反应物用于转化大肠杆菌，测序所得的转化子的质粒以鉴定含有E107C突变且在大约42bp的Sal I-Eco RI片段上具有正确序列的克隆。
还构建了在IFN-α2编码序列羧基末端氨基酸后加入一个半胱氨酸的突变。除了下述区别外使用上述用于S163C构建的方案来构建称为*167C的该突变体。在E165的GAA密码子与TAA终止密码子之间加入一个半胱氨酸密码子TGT且跨越附近的Eco RI位点的诱变型反向寡核苷酸BB144(5＞CGCGAATTCTTAACATTCCTTACTTCTTAAACTTTC＞3)(SEQ.ID.NO.86)用于在PCR反应中代替BB143。
除了下述区别外使用上述用于S163C的方案构建取代突变E165C并证实其序列。将E165的GAA密码子改变成半胱氨酸密码子TGT且跨越附近的Eco RI位点的诱变型反向寡核苷酸BB165(5＞CGCGAATTCTTAACACTTACTTCTTAAACT＞3)(SEQ.ID.NO.87)用于在PCR反应中代替BB143。PCR反应在Perkin-Elmer GeneAmpPCR系统2400热循环仪中进行。反应程序限定为：95℃5分钟，30个循环的[95℃30秒；62℃30秒；72℃1分钟]，接着在72℃7分钟并在4℃保持。用Eco RI和Sal I消化后，使用QIAquickPCR纯化试剂盒清理该反应的产物。
为了作为分泌进周质空间的蛋白质在大肠杆菌中表达，从pUC-18为基础的pBBT177衍生物以大约590bp的Nde I-Eco RI片段切下编码17种突变体的STII-IFN-α2基因并亚克隆进已用于表达野生型STII-IFN-α2的pCYB1表达载体中。为了进行表达实验，将这些质粒导入大肠杆菌W3110中。
使用类似于此处所述的方法，可构建IFN-α2的其它半胱氨酸突变蛋白。半胱氨酸突变蛋白可以是用半胱氨酸取代IFN-α2编码序列中天然氨基酸残基的取代突变，在IFN-α2编码序列的两个天然存在的氨基酸之间插入一个半胱氨酸残基的插入突变，或在IFN-α2编码序列的第一个氨基酸，C1，之前加入一个半胱氨酸残基，或在IFN-α2编码序列的末端氨基酸残基，E165，之后加入一个半胱氨酸残基的添加突变。半胱氨酸残基可取代IFN-α2编码序列中任何位置的任何氨基酸残基或插入任意两个氨基酸之间。在IFN-α2中取代和插入半胱氨酸残基的优选位点是在螺旋A之前的区域，A-B环，B-C环，C-D环，D-E环和螺旋E远端的区域。其它优选的位点是A，B，C，D和E螺旋的第一个和最后三个氨基酸。在这些区域产生半胱氨酸取代的优选残基是D2，L3，P4，T6，H7，S8，Q20，R22，K23，S25，F27，S28，K31，D32，R33，D35，G37，F38，Q40，E41，E42，F43，G44，K49，T52，N65，S68，T69，K70，D71，S72，S73，A74，A75，D77，E78，T79，Y89，Q90，Q91，N93，D94，E96，A97，G102，V103，G104，V105，P109，M111，K112，E113，D114，S115，K131，E132，K133，K134，Y135，S136，A139，S152，S154，T155，N156，L157，Q158，E159，S160，L161，R162和K164。半胱氨酸残基也可插入紧靠这些氨基酸之前或之后的位置。加入半胱氨酸残基的另一优选位点是在Cl之前，本文称为*-1C。
也可经过用另一氨基酸取代IFN-α2中的一个天然存在的半胱氨酸残基以构建含有游离半胱氨酸的IFN-α2突变体。这样在正常情况下与被取代的半胱氨酸残基形成二硫键的天然存在的半胱氨酸残基游离出来。可用任何其它19种氨基酸取代非必需的半胱氨酸残基，但优选用丝氨酸或丙氨酸。也可经过化学修饰天然存在的氨基酸将游离半胱氨酸残基导入IFN-α2，例如，使用Sytkowski等(1998)所述的方法。
使用类似于实施例20-22所述的方法，可在大肠杆菌中表达所述蛋白质，纯化所述蛋白质，PEG化所述蛋白质和在体外生物测定中测量其生物学活性。也可使用类似于实施例16-20所述的方法或本领域的技术人员熟知的有关方法在诸如昆虫或哺乳动物细胞的真核细胞中表达IFN-α2突变体。
B.rIFN-α2半胱氨酸突变蛋白的大肠杆菌表达
为了评估表达，培养r IFN-α2突变体的培养物并按上文对野生型rIFN-α2所述进行诱导。一般来说，45ml培养物在250ml摇瓶中37℃下在旋转摇床水浴中以大约180-200rpm培养。我们观察到摇瓶培养物的剧烈通气导致渗透压休克裂解物上清中的IFN-α2蛋白质水平降低。因此我们使用对通气为亚最佳但对于可溶性r IFN-α2和r IFN-α2突变体生产是优选的常规条件。培养已诱导的培养物大约16小时并收获，除了向用于渗透压休克方法的缓冲液中加入胱氨酸至5mM的最终浓度外按上文对野生型r IFN-α2所述进行渗透压休克。向渗透压休克缓冲液中加入胱氨酸导致所分析的前两个突变体，Q5C和S163C的层析特性明显改进。未用胱氨酸处理的干扰素突变体作为宽带从S-SEPHAROSE柱中连续洗脱为宽带，当以非还原性SDS-PAGE分析时在预期的单体分子量处和附近显示出多个分子量类型。这些类型很可能代表错误折叠或不完全折叠的干扰素变异体。相反，在渗透压休克过程期间用胱氨酸处理的干扰素突变体从S-SEPHAROSE柱中洗脱为窄带，当以非还原性SDS-PAGE分析时，仅由一个与干扰素野生型标准品共迁移的干扰素类型组成。当在渗透压休克缓冲液中包含胱氨酸时，来自S-SEPHAROSE柱的纯化干扰素突变体的回收率也提高1.5到2倍。根据这些结果，向渗透压休克缓冲液中加入5mM胱氨酸用于纯化所有的半胱氨酸突变蛋白。
对突变蛋白的渗透压休克上清的SDS-PAGE分析表明大多数具有水平下降(与野生型相比)的19kDa rIFN-α2带。两个突变体，Q5C和S163C以相当于野生型干扰素的水平表达，这些突变体每种均可按下面的详细描述容易地纯化几百微克。8个突变体(C1S，43C44，N45C，Q46C，Q48C，A50C，D77C和T108C)在渗透压休克上清中基本上检测不到。剩下的7个突变体(F47C，C98S，Q101C，T106C，E107C，E165C，*166C)在渗透压休克上清中检测到其水平不同程度地下降(与野生型相比)。从渗透压休克上清中纯化了一些突变体(T106C，C98S，E107C和Q101C)，但仅回收到少量的纯蛋白质。某些突变体，C98S，Q101C，T106C，E107C和*166C以相当高的水平表达但主要为不溶性形式，很可能在周质中积累。这些蛋白质在还原条件下与野生型rIFN-α2标准品共迁移表明STII先导序列已被去掉。突变体相对表达水平的定性评估在表4中概括。
C.rIFN-α2半胱氨酸突变蛋白的纯化
为了纯化rIFN-α2突变体，一般来说，将在2升摇瓶中的325ml培养物，或在2升带挡板摇瓶中的500ml培养物在旋转摇床水浴(New BrunswickScientific)中以大约170-220rpm的转速在37℃下培养。培养物按实施例20所述生长，诱导，收获并进行渗透压休克。所得的渗透压休克上清立即加工或贮存于-80℃。
按上文对野生型rIFN-α2纯化的详细描述使用S-SEPHAROSE和Cu++IMAC层析纯化渗透压休克上清中的可溶性IFN-α2突变体。所有待测突变体紧密结合到铜柱上且在相似于野生型rIFN-α2的条件下洗脱。该结果表明半胱氨酸突变蛋白的构象至少在包括金属结合袋的区域中类似于天然rIFN-α2。
对纯化的Q5C，C98S，Q101C，T106C，E107C，S163C和*166C半胱氨酸突变蛋白的非还原性SDS-PAGE分析表明突变体主要以单体回收，以大约19kDa的预期分子量迁移。C98S由于缺少天然Cysl-Cys-98二硫键比其它rIFN-α2突变体以略高的分子量迁移。有些纯化的突变体含有少量的二硫键连接的rIFN-α2二聚体。该二聚体类型的分子量为大约37-38kDa。
D.rIFN-α2半胱氨酸突变蛋白的生物活性
在实施例20所述的Daudi生长抑制试验中测量纯化的Q5C和S163CrIFN-α2半胱氨酸突变蛋白的生物活性。使用Bradford或BCA蛋白质测定试剂盒(Bio-Rad Laboratories and Pierce)测定蛋白质浓度。野生型rIFN-α2商品和我们制备的rIFN-α2在同一天平行分析以控制不同日期间测定的可变性。突变体与野生型rIFN-α2对照蛋白质在测定误差范围内以相同的程度抑制Daudi细胞的增殖。Q5C突变体的平均IC50值为13pg/ml，类似于野生型rIFN-α蛋白质的平均IC50值。S163C蛋白质的平均IC50值为27pg/ml。这些数据在表4中概括。
                      表4
   IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的表达和体外生物活性
  IFN-α2蛋白质    突变位置            相对表达   平均IC50(pg/ml)    IC50范围3(pg/ml)
    总细胞1  可溶性百分数2
  rIFN-α24       -     -     -   16+/-7    8-29(n＝10)
  rIFN-α25       -     ++++     ～33   13+/-4     7-19(n＝10)
  C1S  N-末端区域6     +/-     0
  Q5C  N-末端区域     ++++     ～20     13  9，11，15，18
  43C44  A-B环     ++     0
  N45C  A-B环     ++     0
  Q46C  A-B环     +/-     0
  F47C  A-B环     +++     ～5
  Q48C  A-B环     +/-     0
  A50C  A-B环     +/-     0
  D77C  B-C环     +/-     0
  C98S  C螺旋7     +++++     ～5-10
  Q101C  C-D环     ++++     ～5-10
  T106C  C-D环     +++++     ～5-10
  E107C  C-D环     +++     ～5-10
  T108C  C-D环     +/-     0
  S163C  C-末端区域     ++++     ～33    27+/-8     18-40(n＝6)
  E165C  C-末端区域     +++     ～20
  *166C  C-末端     +++     ～20
1在全细胞提取物中IFN-α2蛋白质的相对积累2以SDS-PAGE凝胶估测的渗透压休克上清中的IFN-α2蛋白质部分3单个实验的IC50值4野生型rIFN-α2商品(Endogen公司)
5Bolder生物技术公司制备的野生型r IFN-α2
6突变在C-螺旋中产生游离半胱氨酸(C98)
7突变在N-末端区域产生游离半胱氨酸(C1)
实施例22
PEG-Q5C和PEG-S163C的
PEG化，纯化和生物活性
A.IFN-α半胱氨酸突变蛋白的PEG化
用纯化的r IFN-α2半胱氨酸突变蛋白进行小规模PEG化实验以鉴定允许蛋白质在游离半胱氨酸残基处进行单PEG化的条件。以非还原性SDS-PAGE监测蛋白质的过度还原，寻找由于蛋白质未折叠而导致的比预期表观分子量更高的漂移，或寻找由于天然二硫键还原使多个PEG化类型出现。用Q5C蛋白质进行起始滴定实验。室温下在100mM Tris，pH8.5中在各种含量的过量5kDa马来酰亚胺-PEG存在下用递增浓度的TCEP[三(2-羧乙基)膦]-HCl温育1μg等分试样的纯化Q5C。60分钟后，终止反应并立即以非还原性SDS-PAGE进行分析。能产生大量单PEG化Q5C蛋白质(以非还原性SDS-PAGE得到的分子量为大约28kDa)而不修饰野生型rIFN-α2的TCEP和PEG试剂的含量用于进一步的实验。滴定实验表明10倍摩尔过量的TCEP和20倍摩尔过量的5kDa马来酰亚胺PEG产生大约60％单PEG化蛋白质而检测不到双或三PEG化的蛋白质或对野生型rIFN-α2的修饰。
这些条件也用于对几个其它的rIFN-α2突变体进行PEG化。室温下用10倍摩尔过量的TCEP和20倍摩尔过量的5kDa马来酰亚胺PEG在pH8.5温育1μg等分试样的纯化野生型和rIFN-α2突变体(Q5C，T106C，E107C，S163C)1小时。根据对反应混合物的SDS-PAGE分析4种突变体发生不同程度的单PEG化(估计30-60％)。野生型rIFN-α2表现为在这些条件下检测不到PEG化。对照实验表明Q5C，T106C，E107C和S163C半胱氨酸突变蛋白需要用TCEP还原以进行PEG化。这些数据表明PEG部分附着到已导入Q5C，T106C，E107C和S163C蛋白质中的半胱氨酸残基上。
B.PEG-Q5C IFN-α2和PEG-S163C的制备和纯化
PEG化大量的Q5C和S163C突变体以便可测量PEG化蛋白质的生物活性。对于Q5C蛋白质，将用于小规模实验的PEG化条件的规模上升到140μg蛋白质以产生足够的物质用于纯化和鉴定。在室温下进行大规模PEG化反应1小时，用10倍的20mM MES，pH5.0稀释，调节到pH3.0，然后迅速上样到使用相似于rIFN-α2突变体起始纯化的条件的S-SEPHAROSE柱上。PEG部分的存在降低了蛋白质对树脂的亲和力，允许从非PEG化蛋白质分离PEG化蛋白质。S-SEPHAROSE柱的层析显示出在大约190mMNaCl和230mM NaCl处洗脱的两个主要蛋白质峰。经过SDS-PAGE确定较早洗脱的主要峰(在大约190mM NaCl处洗脱)是单PEG化Q5C。经过SDS-PAGE确定的单PEG化Q5C的表观分子量是大约28kDa。后来洗脱的主要峰(在大约230mM NaCl处洗脱)确定为未反应的Q5C蛋白质。合并含有主要PEG-Q5C的早期洗脱峰级分并用于生物活性测量。
使用基本上相同于PEG-Q5C的方案以90μg的规模PEG化S163C半胱氨酸突变蛋白并纯化。
C.PEG-Q5C和PEG-S163C半胱氨酸突变蛋白的生物活性
以实施例20所述的Daudi细胞试验测量纯化的PEG-Q5C蛋白质的生物学活性。使用Bradford染料结合试验测定蛋白质的浓度。PEG-Q5C蛋白质与野生型rIFN-α2和未修饰的Q5C蛋白质显示出相似的剂量-反应曲线且在试验误差范围内达到相同的最大生长抑制水平。PEG-Q5C突变体的平均IC50值为大约22pg/ml，在同一天分析的野生型IFN-α2和未修饰的Q5C蛋白质所测定的IC50值的2倍以内(表5)。PEG-Q5C蛋白质的生物活性明显大于用非特异性氨反应性PEG试剂进行了PEG化的rIFN-α2。后一蛋白质在Daudi细胞试验中具有164pg/ml的IC50值(Monkarsh等，1997)。这些数据在表5中概括。
也对PEG-S163C蛋白质进行了生物活性实验。PEG-S163C蛋白质也具有生物学活性且在试验误差范围内以与野生型rIFN-α2相同的程度抑制Daudi细胞增殖。PEG-S163C蛋白质的平均IC50值为大约42pg/ml，比氨-PEG化的IFN-α更好。
表5.PEG-Q5C IFN-α的生物活性
        IFN-α蛋白质  平均IC50值(pg/ml)      IC50值范围1(pg/ml)
  实验A   实验B   实验C
     内源性rIFN-α     13     9     11     20
       rIFN-α2     12     10     10     16
         Q5C     12     8.5     11     18
       PEG-Q5C     22     18     18     30
 氨-PEG化的-IFN-α3     164     -     -     -
1数据来自3个实验。
2由Bolder生物技术公司制备的rIFN-α2。
3数据来自Monkarsh等，(1997)。
实施例23
在垂体摘除(HYPOX)的大鼠中试验PEG化GH半胱氨酸突变蛋白的体内效力。这是一种充分鉴定的GH缺陷型模型(Cox等，1994；Clark等，1996)。在HYPOX大鼠中GH刺激体重增长和骨骼及软骨的生长(Cox等，1994；Clark等，1996)。垂体摘除的Sprague-Dawley大鼠可从诸如CharlesRiver(Wilmington，MA)等商家购买。一般来说，大鼠在40-50天龄期间和体重大约120g时进行垂体摘除。各8只大鼠的组以特定的间隔接受rhGH，PEG-Cys-GH或安慰剂(载体溶液)的皮下注射并在10天期间每天测量体重增长。大鼠每天应在同一时间称重以消除与喂食相关的可能变化。除了总体重增长外，可测量骨骼生长(胫骨骺宽度)。处死大鼠时，取出靠近胫骨骺的左右侧并固定在福尔马林中。可在羽状三辐骨针(saggital)平面近端断裂固定的胫骨，用硝酸银染色且暴露于强光中(Greenspan等，1949)。可使用装配有目镜测微尺的立体显微镜测量软骨骺板的宽度。对每个骺应进行10次测量并计算左右胫骨组合值的平均值+/-SEM。使用用于单项比较的student T检验和用于多项比较的方差单向分析进行各组间的比较。P＜0.05可认为显著。
经过每天，每隔一天，每隔3天，每隔4天给大鼠施用蛋白质或在单次注射后测试用10kDa或20kDa PEG修饰的GH半胱氨酸突变蛋白的效力。经过皮下注射每天两次施用5μg非PEG化hGH(10μg BID)在HYPOX大鼠模型中产生强烈的生长应答(Cox等，1994；Clark等，1996)。在起始实验中，不同组的大鼠接受0.08，0.4，2，10或50μg PEG化Cys-GH蛋白质/次注射/大鼠的皮下注射。对照大鼠仅接受载体溶液。其它的对照组用与PEG化Cys-GH蛋白质相同的剂量方案接受非PEG化rhGH(10μg/BID)和10μg非PEG化hGH。给HYPOX大鼠施用PEG化GH半胱氨酸突变蛋白导致与载体处理组相比体重增长和胫骨骺宽度加大。
也可在恶病质啮齿类模型中试验PEG化GH半胱氨酸突变蛋白的效力。可给大鼠施用地塞米松(DEX)以诱导体重下降。正常Sprague-Dawley大鼠组(220-225g)每天接受地塞米松的皮下注射(200μg/大鼠；大约1mg/kg)。该地塞米松量在8天期间应诱导大约5-6g的体重下降。在不同实验中给大鼠施用载体或各种剂量的PEG化GH半胱氨酸突变蛋白一次，每天一次，每隔一天一次，每隔3天或每隔4天一次。不同组的大鼠接受0.08，0.4，2，10或50μg PEG化Cys-GH蛋白质/次注射/大鼠的皮下注射。其它对照应包括不接受DEX或注射的一组大鼠，接受DEX和非PEG化rhGH(10μg/BID)的一组大鼠和接受DEX和非PEG化rhGH(根据不同实验每天，每隔一天，每隔3天或每隔4天接受10μg，即施用PEG化GH半胱氨酸突变蛋白的频率)的一组大鼠。动物应每天称重。每天监测食物和水的消费。处死时，称重体内器官。按对HYPOX大鼠试验所述进行统计分析。用PEG化GH半胱氨酸突变蛋白处理的动物比载体处理的动物体重下降要小。
经过证实与载体处理的动物相比，蛋白质刺激血细胞比容(hemocnt)和红细胞生成的增加，可在正常大鼠中测量PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白的体内效力。当每天用药时EPO刺激大鼠血细胞比容的显著增加(Matsumoto等，1990；Vaziri等，1994；Baldwin等，1998)。Sprague-Dawley大鼠可从诸如Charles River(Wilmington，MA)等商家购买。各5只大鼠的组以最多5天的特定间隔接受BV rEPO，PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白或安慰剂(载体溶液)的皮下注射。在第6天处死动物，收集血样用于血细胞比容并完成可由商业实验室进行的血细胞计数(CBC)分析。收集造血组织(肝脏和脾脏)，称重并在福尔马林中固定用于组织病理学分析以寻找红细胞生成增加的证据。从各种长骨和胸骨中取出骨髓用于单位颗粒制备(unit particlepreparations)和组织病理学分析以寻找红细胞生成增加的证据。使用用于单项比较的Student T检验和用于多项比较的方差单向分析进行各组间的比较。P＜0.05可认为显著。与注射载体的动物相比，PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白在大鼠中刺激血细胞比容和红细胞生成的增加。当施用一次，每隔一天或每隔3天施用一次时可试验用10kDa或20kDa PEG修饰的PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白的效力。当经过皮下注射每天一次施用100IU/kg(～800ng/kg)的非PEG化EPO时导致血细胞比容显著增加(Matsumoto等，1990；Vaziri等，1994；Baldwin等，1998)。在起始实验中，不同组的大鼠接受0.32，1.6，8，40或160ngPEG化EPO半胱氨酸突变蛋白的皮下注射。对照大鼠仅接受载体溶液。另一对照组使用与PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白相同的剂量方案接受非PEG化rEPO(160ng/SID)和160ng非PEG化rEPO。
也可在化疗诱导的贫血模型中试验PEG化EPO突变体的效力。顺式铂氨诱导的贫血是一种充分鉴定的化疗诱导型贫血的啮齿类模型且与人类临床设定(setting)直接相关。当以100单位/kg的日剂量用药时rEPO逆转该模型中的贫血(Matsumoto等，1990；Vaziri等，1994；Baldwin等，1998)。在第0天以腹膜内注射顺式铂氨(3.5mg/kg)处理Sprague-Dawley大鼠(～200g)以诱导贫血并随机分成各处理组。当一次(第1天)，每隔一天或每隔3天一次施用时可试验用10kDa或20kDa PEG修饰的PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白的效力。不同组的大鼠接受0.32，1.6，8，40或160ng/次注射的PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白的皮下注射。用待测化合物注射大鼠达到8天。一个大鼠对照组每天接受rEPO(100单位/kg)的皮下注射。另一对照组不接受起始顺式铂氨注射但使用与PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白相同的剂量方案接受盐水注射。在第9天处死大鼠，获得血液和组织样品用于综合CBC和组织病理学分析。与注射载体的对照组相比，PEG化EPO半胱氨酸突变蛋白刺激大鼠中血细胞比容和红细胞生成的增加。
IFN-α的生物学活性具有相对物种特异性，限制了可研究的临床前动物模型的范围。可用于测量PEG化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的体内效力的一个模型是无胸腺裸鼠中人肿瘤异种移植物生长的抑制。人IFN-α2对小鼠细胞没有活性且裸鼠中人肿瘤异种移植生长的抑制通过对人肿瘤细胞的直接抗增殖效应产生。IFN-α2在无胸腺小鼠中抑制各种原发性人肿瘤异种移植物和人肿瘤细胞系的生长(Balkwill等，1985；Balkwill，1986；Johns等，1992；Lindner和Borden，1997)。研究的终点是在处理的小鼠中的肿瘤体积。我们预期发现相对于载体处理的动物，施用PEG化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白抑制小鼠中的肿瘤生长(如肿瘤体积所指示)。无胸腺裸鼠可从诸如Charles River等商家买到。各小鼠在第0天用2×106个NIH-OVCAR-3或MCF-7肿瘤细胞(该细胞系可从美国典型培养物保藏中心获得)注射并随机分成由各10只小鼠组成的试验组。肿瘤细胞注射进最靠近腋的乳腺表层的真皮中。不同试验组以特定的间隔：每天(SID)，每隔一天(EOD)或每隔3天(ETD)接受各种剂量的野生型rIFN-α2，10kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白，20kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白或安慰剂(载体溶液)的皮下注射。按Linder和Borden(1997)所述通过用卡钳测量肿瘤的长度和宽度以4天的间隔测定肿瘤体积。处死时，切下肿瘤并称重。对各取样点计算各试验组的平均肿瘤体积+/-SEM。使用用于单项比较的Student T检验和用于多项比较的方差单向分析进行各组间的比较。每天一次皮下注射5μg的非PEG化IFN-α2时，6周后在无胸腺小鼠中抑制NIH-OVCAR-3细胞和MCF-7细胞的生长达80％(Linder和Borden，1997)。这些试验可使用任一细胞系。NIH-OVCAR-3细胞系(可从ATCC获得)的生长不需要雌激素，和MCF-7细胞一样。用MCF-7细胞进行的异种移植实验需要对小鼠摘除卵巢并用雌激素片移植(Linder和Borden，1997)。在起始实验中，不同组的小鼠使用每天，每隔一天或每隔3天的剂量方案接受每次注射1或5μg的rIFN-α2，10kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白或20kDa PEG化IFN-α2半胱氨酸突变蛋白的皮下注射。在肿瘤细胞注射进小鼠后的第2天开始用药。对照小鼠仅接受载体溶液。在每隔一天和每隔3天用药的实验中，另一阳性对照组每天接受5μg未修饰的rIFN-α2的皮下注射。
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尽管已详细描述了本发明的各种实施方案，但很明显本领域的技术人员可对这些实施方案进行修改和适应。然而应特别理解的是，这些修改和适应在本发明的范围内。

Claims (31)

1.获得具有游离半胱氨酸的可溶性蛋白质的方法，包括下列步骤：
(a)获得能表达该可溶性蛋白质的宿主细胞；
(b)将该宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触；和
(c)从宿主细胞分离可溶性蛋白质。
2.权利要求1的方法，进一步包括在半胱氨酸封闭剂存在下破裂宿主细胞并从破碎的宿主细胞可溶性部分分离该蛋白质。
3.权利要求1的方法，其中在宿主细胞合成可溶性蛋白质之前，期间或之后将宿主细胞与半胱氨酸封闭剂接触且其中可溶性蛋白质从宿主细胞分泌。
4.权利要求1-3的方法，其中所述的宿主细胞是细菌，酵母，昆虫或哺乳动物细胞。
5.权利要求1-3的方法，其中所述的宿主细胞是细菌细胞。
6.权利要求5的方法，其中所述的宿主细胞是大肠杆菌。
7.权利要求1-3的方法，其中所述的可溶性蛋白质是重组蛋白质。
8.权利要求7的方法，其中所述的重组蛋白质是生长激素超基因家族成员，其衍生物或拮抗剂的半胱氨酸突变体。
9.权利要求8的方法，其中所述的成员是生长激素。
10.权利要求8的方法，其中所述的成员是促红细胞生成素。
11.权利要求8的方法，其中所述的干扰素是α干扰素(IFN-α)。
12.权利要求8的方法，其中所述的α干扰素是干扰素α2(IFN-α2)。
13.权利要求7的方法，其中所述的重组蛋白质是TGF-β超家族的成员，血小板衍生的生长因子-A，血小板衍生的生长因子-B，神经生长因子，脑源性神经营养因子，神经营养蛋白-3，神经营养蛋白-4，血管内皮生长因子，或其衍生物或拮抗剂的半胱氨酸突变蛋白。
14.权利要求7的方法，其中所述的重组蛋白质是免疫球蛋白重链或轻链或其衍生物的半胱氨酸突变体。
15.权利要求1的方法，其中所述的半胱氨酸封闭剂是巯基反应性化合物。
16.权利要求15的方法，其中所述的巯基反应性化合物是半胱氨酸，胱胺，二巯基乙醇酸，氧化型谷胱甘肽，碘，过氧化氢，二氢抗坏血酸，连四硫酸盐，邻-亚碘酰基苯甲酸盐或在金属离子存在下的氧。
17.权利要求15的方法，其中所述的巯基反应性化合物是半胱氨酸。
18.权利要求1-3的方法，进一步包括将半胱氨酸反应性部分附着到所述的分离蛋白上以形成半胱氨酸修饰的蛋白质。
19.权利要求1-3的方法，进一步包括将聚乙二醇附着到所述的分离蛋白上形成PEG化蛋白质。
20.PEG化人生长激素(hGH)或其衍生物，它具有不超过大约110ng/ml的EC50。
21.权利要求20的PEG化hGH，其中PEG部分附着到所述hGH的C-D环或靠近螺旋A的区域。
22.PEG化促红细胞生成素(EPO)或其衍生物，它具有不超过大约1000ng/ml的EC50。
23.权利要求22的PEG化EPO，其中PEG部分附着到EPO的C-D环或A-B环上。
24.PEG化α干扰素(IFN-α2)或其衍生物，它具有不超过大约100pg/ml的EC50。
25.权利要求24的PEG化IFN-α2，其中PEG部分附着到IFN-α2的靠近螺旋A的区域或C-D环上。
26.一种多聚体蛋白质，包括具有游离半胱氨酸的至少两个蛋白质且其中所述的蛋白质通过所述的游离半胱氨酸附着。
27.一种治疗可用生长激素，EPO或α干扰素治疗的症状的方法，包括给需要该治疗的病人施用有效量的生长激素，EPO或α干扰素的半胱氨酸变异体或其衍生物以治疗所述的症状。
28.权利要求27的方法，其中所述的衍生物是生长激素，EPO或α干扰素的PEG化半胱氨酸变异体。
29.共价修饰根据权利要求1-3产生的蛋白质的方法，包括下列步骤：
(a)纯化该可溶性蛋白质；
(b)用二硫键还原剂还原该蛋白质；和
(c)将该蛋白质与半胱氨酸反应性部分接触以获得半胱氨酸修饰的蛋白质。
30.权利要求29的方法，进一步包括从未修饰的蛋白质分离半胱氨酸修饰的蛋白质。
31.权利要求29的方法，其中半胱氨酸反应性部分是聚乙二醇。
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