JP2005528372A - 抗菌ポリマー複合体 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国特許法第119条(e)のもとに、2002年3月26日出願の米国仮特許出願第60/368,112号の優先権を主張するものであり、この仮出願の開示内容は本明細書に援用される。
リソスタフィンは(かつて、スタフィロコッカス・スタフィロリティカス(S.staphylolyticus )として知られていた)スタフィロコッカス・シムランス(Staphylococcus simulans )において最初に同定された強力な抗菌薬である。リソスタフィンは、ブドウ球菌細胞壁中の特定の架橋ポリグリシンブリッジを開裂し得る細菌性エンドペプチダーゼであり、したがって、ブドウ球菌に対して高い致死性を示す。リソスタフィンは単一のポリペプチド鎖として発現され、約27kDaの分子量を有する。
ソスタフィン遺伝子のクローニングおよび配列決定により、野生型リソスタフィンの特性と類似または異なる特性を有し得る変異型リソスタフィンの単離が可能であることを開示している。
B.ポリマーの結合
生物活性ポリペプチドとPEGなどの水溶性ポリマーとを結合させることは周知である。PEG化は、酵素やホルモンなどの治療ポリペプチドをポリエチレングリコールの1つ以上の鎖に結合させて、薬物動態学、薬力学、および免疫原性に関して改良された臨床特性を得る方法である。
G部分を単一の結合部位に結合させるか、単一の分岐(但し小さい)PEG部分を単一の結合部位に結合させるか、またはいくつかの小さいPEG部分を複数の結合部位に結合させて形成し得る。複数の結合部位を用いると、結合によって生物活性が失活し得る。PEGホモポリマーに加えて、ポリマー分子を他のアルキレンオキシド部分と共重合させることもできるし、さもなければ、ポリマー分子は別のポリアルキレンオキシドホモポリマーもしくはコポリマーであってよい。
されたアミド結合を介して遊離アミノ基に結合される。ポリアルキレンオキシドは、約5〜約100kDaの分子量を有する直鎖または分岐mPEGであってよい。
クン(Jon Kokai ‐Kun )、アンドリュー リース(Andrew Lees )およびジェイムス ヤコブ モンド(James Jacob Mond)により出願された「高いブドウ球菌溶解活性を有する短いリソスタフィン分子(Truncated Lysostaphin Molecule with Enhanced Staphylolytic Activity )」と題する米国特許出願に開示されており、同出願の開示内容はその全文が本明細書に文献援用される。同出願は、2001年12月21日出願の米国特許仮出願第60/341,804号の優先権を主張している。
めの乾燥製剤(例えば、凍結乾燥結晶質または非晶質で、浸透平衡を得るために溶質を追加してもしなくてもよい)として配合する。製剤は、慣用のプロトコルおよび投与計画に従って投与するための、pHが約3〜8、典型的には5〜8の無毒性で安定な医薬として許容し得る水性の担体媒体に含めてもよいし、同媒体中で再構成してもよいし、またはクリームなどの半固体製剤に含めてもよい。送達は、点眼投与、静脈内(iv)、筋肉内、皮下もしくは腹腔内経路を介しても、髄腔内、吸入でもよく、または、医療装置、カテーテルおよび埋め込み可能な装置のコーティングに用いてもよく、あるいは、感染を治癒または軽減させるために活性物質の最小発育阻止濃度(MIC)を上回る血中および組織濃度を達成して微生物力価を低下させるように感染部位に直接導入してもよい。さらに、抗菌薬を、局所または経鼻製剤に用い得るクリームなどの半固体製剤として配合することも可能である。
抗菌薬の例としてこれらの検討にリソスタフィンを用いたが、抗菌薬との用語が本明細書で定義されているように基本的に任意の抗菌薬を用いて同じ検討を実施することが可能である。リソスタフィン(Ambicin(登録商標)L)は、AMBIインコーポレイテッド社(AMBI,Inc. )(現ニュートリション21社(Nutrition 21)から得た。10および40kDaのmPEG2‐NHSエステルは、シアウォーター コーポレーション(Shearwater Corporation)(米国アラバマ州ハンツビル所在)(現ネクター セラピューティクス社、米国アラバマ州所在)から購入した。ホウ酸ナトリウム、DMSO、ウシ血清アルブミン、およびextravidin(登録商標)‐HRPはシグマケミカル社(Sigma Chemical Co.)(米国ミズーリ州セントルイス所在)から購入した。グリシンは、EMサイエンス社(EM Science)、(米国ニュージャージー州ギブズタウン(Gibbstown )所在)から購入した。NuPage(登録商標)電気泳動システムおよびコロイドブルー(Colloidal Blue)染色液は、インビトロジェン社(Invitrogen)(米国カリフォルニア州カールズバッド(Carlsbad)所在)から購入した。Sephacryl(登録商標)S‐100HRおよびHiTrap(登録商標)SP FFは、アマシャム‐ファルマシア社(Amersham‐Pharmacia )(米国ニュージャージー州ピスカタウェイ所在)から購入した。トリプティック・ソイ・ブロス(Tryptic Soy Broth )(TSB)および陽イオン調整ミュラーヒントンブロス(Cation-Adjusted Mueller Hinton Broth)(CAMHB)は、ベクトンディッキンソン社(Becton Dickinson)(米国メリーランド州スパークス(Sparks)所在)から購入した。TMBマイクロウェル(TMB Microwell )および450停止用試薬(450 STOP Reagent)はBioFX社(米国メリーランド州オウイングスミルズ(Owings Mills)所在)から購入した。
(リソスタフィンのPEG化)
0.27、1または5mg/mlのリソスタフィンを0.2Mホウ酸緩衝液(pH8.5)またはDMSOに溶解した。mPEG2‐NHSエステルをDMSOに溶解して調製し、リソスタフィン溶液に、40、20、10、5または2.5:1のモル比で加えた。3種の異なる緩衝液条件:ホウ酸緩衝液(PEG添加により<10%のDMSOを含有)、50%ホウ酸/50%DMSO、および100%DMSOを用い、いずれも室温下に1、2または3時間、PEG化を実施した。グリシンを25mMまで加え、渦流混合して、すべての反応を停止させた。
熱死滅(熱で死滅させた)黄色ブドウ球菌5型(HKSA5)を含有する溶液の650nmでの吸光度の低下を測定することにより、リソスタフィンの黄色ブドウ球菌5型(SA5)溶解能を測定した。HKSA5は、生細菌を62℃で2時間インキュベートしてから初期吸光度が約1になるように希釈して調製した。次いで、リソスタフィンを32μg/mlの濃度で加え、60秒毎に20分間吸光度の読取りを行った。PBS中のSA5懸濁液(%T=40)に0〜10μg/mlのリソスタフィンを加えてSA5生菌培養物の清澄化を測定した。サンプルを37℃で1時間培養し、次いで、血液寒天プレート上に塗り拡げた。37℃で一晩培養した後、コロニーを計数し、非処理サンプルと比較した。
PEG化リソスタフィンがこのタンパク質を抗体の結合から保護するかどうかを決定するためにリソスタフィン捕捉ELISAを実施した。96ウエルマイクロタイタープレートをポリクローナルウサギ抗リソスタフィン抗体で一晩コーティングした。ウエルを1%BSAでブロックし、次いで、PBS/0.5%Tween20(商標)+0.1%BSA中でリソスタフィンサンプルと共にインキュベートした。ビオチン標識したポリクローナルウサギ抗リソスタフィン抗体を用いてリソスタフィンの結合を検出し、次いで、Extravidin(登録商標)‐HRPとともにインキュベーションし、TMB比色検出を行った。SpectraMAX(登録商標)Plusプレートリーダー(米国カリフォルニア州サニーベイル所在のモレキュラーデバイス社(Molecular Devices ))で450nmの吸光度についてプレートを測定した。
CF1マウスの尾静脈に、S‐100HRで精製したPEG‐リソスタフィンを0.8または0.2mg(0.2mlのPBS中4または1mg/ml)の用量で注射した。対照のマウスには、0.8mgの非複合リソスタフィンを注射した。投与後1、4、7、24時間目に、眼窩採血により血液を採取した。この血液を37℃で30分間、次いで4℃で30分間インキュベートした。その後、1000gで10分間遠心分離して血清を分離した。血清中のリソスタフィン濃度を上述のようにELISAにより測定した。
リソスタフィンは、多数のリシン(16)およびアルギニン(6)残基に起因する、pH7で+10.53という高い正味電荷を有する。これらのリシン側鎖の第1級アミン基は、N‐ヒドロキシスクシンイミドで活性化されたPEGを共有結合させるのに理想的な標的である。分岐PEGを選択したが、これは、分岐PEGが大きな空間体積を有しているために、酵素の結合モチーフおよび活性部位であることの多いタンパク質の裂け目に入り込みにくいからである。
は、リソスタフィンがシステイン残基を全く含んでいないという理由で、この目的を達成する1つの方法であろう。この目的を達成する別の方法は、遺伝子組換え技術によりリソスタフィンタンパク質のアミノ酸配列にチオール含有アミノ酸のシステインを導入して、同タンパク質にチオール基を導入する方法であろう。
熱死滅SA5の溶解の測定(図1)およびSA5生菌の殺菌(図2)により、5種のPEG化リソスタフィンサンプルのin vitroにおける殺菌活性をテストした。図1において、10kDaのPEGに結合させたリソスタフィンは3133A‐B pHおよび3133A‐DMSOの線で表されている。pHという表示は、水溶液中で行われたPEG化反応を示している。DMSOという表示は、100%DMSO中で行われたPEG化反応を示している。すべてのサンプルは酵素活性に関して陽性を示した。PEG化の度合が増すにつれて活性が低下したことは、10kDaのPEGがリソスタフィンの活性部位またはそのペプチドグリカン結合ドメインにアクセスして、その酵素活性を低下させるのに十分な小ささであることを示唆している。それに対し、40kDaのPEGサンプルでは、これらのサンプルに関してサイズ分離が行われなかったという事実にもかかわらず、酵素活性の低下は観察されなかった。これは、高度にPEG化された形態が軽度の複合形態と類似の活性を保持することを意味すると共に、40kDaのPEGが酵素機能に重要な部位に容易にはアクセスし得ないことを示している。
最小発育阻止濃度(MIC)は、種々の細菌株における抵抗性レベルの検査に一般的に用いられる薬物活性の定量的測度である。このアッセイでは、表1に示されているように、SA5という一菌株に対してこのMICを用い、リソスタフィンのPEG化による薬物の失活を測定した。いくつかの製剤は高レベルの活性を維持していたが、非複合リソスタフィンほど高くはなかった。種々のPEG‐リソスタフィン種で観察された活性パターンは先の殺菌アッセイで観察されたものと一致する。PEG化度が低いリソスタフィンほど高度にPEG結合したものより高い活性を維持しており、同一反応条件下では、40kDa PEG複合体は10kDa PEG複合体の8倍も活性が高かった。
リソスタフィン捕捉イムノアッセイを用いて抗体からリソスタフィンを保護するPEGの能力をin vitroでテストした(図3)。非複合リソスタフィンは、0.3〜20ng/mlという標準的な反応を示す。PEG‐リソスタフィンが抗リソスタフィン抗体と結合すると不均一な反応が見られるが、いずれも非複合リソスタフィンより結合効率は低い。観察された中で最も良く保護したものでは、PEG化リソスタフィンに対する抗体の親和性を10倍以上も低下させた。このアッセイ環境は粘膜表面または流動血清中における結合とは異なるが、PEGがリソスタフィン表面上に結合していると、酵素を抗体結合から少なくとも部分的には保護し得ることを証明している。酵素活性と抗体結合の減少との間になんら相関関係は存在しないように見えるが、40kDa複合体と10kDa複合体への抗体結合の差は、PEG化度の違いで説明し得る。一般に、40kDa PEGの場合には、リソスタフィンに結合しているPEG分子が10kDa形態より少ないので、10kDa型ほどは抗体を排除しない、より開放的な構造を有している可能性があり、このことも、40kDa複合体の方が高い活性を有する理由を説明し得る。それでもなお、40kDa複合体に対する抗体活性は非複合リソスタフィンに比べると低下している。
タンパク薬物上にPEGを結合させると、薬物が身体の正常なクリアランス機構を回避できるようになり、それによって薬物の血清中半減期が延長される。マウスで、低度にPEG修飾したリソスタフィン(1リソスタフィン当たり1〜4PEG)の薬物動態プロファイルを測定し、非複合リソスタフィンのクリアランスと比較した(図4)。グラフからPEG化に起因する2つの増大が明らかである:(1)リソスタフィンの半減期が劇的に延びたこと、および(2)達成された総血清中濃度が非複合リソスタフィンの場合よりはるかに高いこと。PEG‐リソスタフィン複合体の血清中濃度は24時間で2〜10倍しか低下しないのに対し、非複合リソスタフィンは同一時間でほぼ500倍低下する。このようなリソスタフィン保持時間の延長により、薬物を治療上の有効濃度より高く維持するのに必要な投与頻度が減少するはずである。
酵素活性をPEG結合数の関数としてテストする手段として、イオン交換クロマトグラフィーにより実施例1の種々の40kD PEG‐リソスタフィン複合体分子種の分画化を実施した。完全には分割できなかったが、画分は単一の特異的バンドに濃縮される傾向があった。サイズ排除クロマトグラフィーHPLCで測定すると、1PEG化物は1‐mer(モノマー)が99%を超えたが、2PEG化物は精製により93%が2‐mer(ダイマー)に、残りは大部分が1‐merとなった。
1つずつ連続的に付加するとリソスタフィンの分子量が増大し、空間体積が1‐merから2‐merに増大すると、酵素が細胞壁中のペンタグリシン架橋へ接近するのが妨害され、その結果該酵素の殺菌活性が失われるのかもしれない。
40kD PEGの代わりに30kD PEGを用いて実施例2を繰り返し、mPEG
30kD リソスタフィン複合体の1‐merおよび2‐merを以下の特性を有する別個の画分に分離した。
寒天プレート上に画線塗布し、翌日、生存コロニーを計数した。このデータは、グラフ上の値が小さい程、より効率よくリソスタフィンがSAを殺菌していることを示すように、SAの生存コロニー数として図13に記載されている。40k 1‐merは30k 1‐merより高い活性を有するが、どちらも非複合リソスタフィンに比べると活性がはるかに低い。
アミノ酸配列Ala‐ala‐Cysを含む(すなわち、「成熟」リソスタフィンと同様であるが末端システインを含む)こと以外はリソスタフィンと同様のリソスタフィン構築物を調製した。システインの挿入に関しては、グッドソン(Goodson )ら、Bio Technology、1990年、第8巻,p.343およびベンハー(Benhar)ら、J.Biol Chem.、1994年、第269巻,p.13398に記載の手順に従った。
250ml培養物から遠心分離により細胞をハーベストし、冷凍した。細胞を解凍し、70mlの0.1M HCl中でペレットを抽出して溶解した。抽出物を4000rpmで遠心分離し、上清を、水で1:2希釈したPBS4リットルに対して4℃で一晩透析した。透析液(約150ml)をさらに水で希釈して約250mlとした。
DTNB(エルマン試薬)を用いて組換えリソスタフィンの遊離チオール(SH基)を測定すると、23.6μMであると判明した。したがって、他のタンパク質が寄与していないと仮定すれば、少なくとも23.6/85=28%のリソスタフィンが遊離チオールを含んでいる。8〜25%のPhast gel(登録商標)(ファルマシア社)を用いたSDS PAGEから、1つの画分は二量化しており、二量体を還元すると得られるシステイン‐リソスタフィンの割合がさらに増大することが示された。
リソスタフィンはそのアミノ末端にトレオニンを有する。例えば、フィールズ(Fields)ら、Biochem.J.、1968年、第108巻,p.883、ゲルトナー(Gaertner)ら、J.Biol.Chem.、1994年、第269巻,p.7224、およびジョーヒガン(Geoghegan )ら、Bioconj.Chem.、1992年、第3巻,p.7224に記載されているように、アミノ末端のセリンまたはトレオニンは、穏和な条件下に過ヨウ素酸ナトリウムを用いて酸化させてグリオキシリル誘導体とすることができる。次いで、この基をアミノ‐オキシPEG、ヒドラジドPEGまたはヒドラジンPEGと反応させて、そのアミノ末端がPEG化されたリソスタフィンを得ることができる。IL‐8をPEG化するためのこの反応の例が、ゲルトナー(Gaertner)ら、Bioconj.Chem.、1996年、第7巻、p.38に記載されている。
ヘテロライゲーション化学反応は、成分A(この場合はリソスタフィン)を、成分B(この場合はPEG)上に存在する反応基とのみ反応し得る反応基で標識することを含む。この実施例では、リソスタフィンを遺伝的に修飾してシステイン基を挿入する実施例4(リソスタフィンが反応性チオール基を含有する)に対比して、リソスタフィンをリシンのアミノ基上でチオール基により化学修飾し、次いで求電子PEG試薬(例えば、PEG‐マレイミド)と反応させる。ヘテロライゲーション化学反応については先に参照したBioconjugate Chemistry誌に記載されている。
M‐MAL‐5000)およびmPEG‐オルトピリジルジスルフィド(シアウォーター社 M‐OPSS‐5000)と反応させた。ハロアシルPEGも適当であろう。これらの反応は、PEG試薬をチオール選択的にするのに適切なpHで実施した。例えば、ビニルスルホンの添加は約pH7〜8で実施した。マレイミドの添加およびジスルフィドの交換はpH6〜7で実施した。
Claims (29)
- 抗菌薬の抗菌活性の少なくとも一部が保持されるように前記抗菌薬に結合された水溶性ポリマー。
- 抗菌ペプチドまたはタンパク質の抗菌活性の少なくとも一部が保持されるように前記抗菌ペプチドまたはタンパク質に結合された水溶性ポリマー。
- 前記ペプチドまたはタンパク質が抗菌酵素である、請求項2に記載のポリマー複合薬。
- 前記酵素が、ブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカンの架橋ポリグリシンブリッジを開裂し得るブドウ球菌溶解活性を有する酵素である、請求項3に記載のポリマー複合薬。
- 前記酵素がリソスタフィンまたはリソスタフィン類似体である、請求項4に記載のポリマー複合薬。
- 前記リソスタフィンまたはリソスタフィン類似体が、組換え発現させた完全な活性を有する同種リソスタフィンである、請求項5に記載のポリマー複合薬。
- 前記リソスタフィンが天然由来である、請求項5に記載のポリマー複合薬。
- 前記リソスタフィンが人工合成されている、請求項5に記載のポリマー複合薬。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリアルキレンオキシド、ポリオキシエチル化ポリオールおよびポリビニルアルコールからなる群から選択される、請求項1、2、5、7または8に記載のポリマー複合薬。
- 前記水溶性ポリマーが、ポリエチレングリコール(PEG)、ポリオキサマーおよびポリオキサミンからなる群から選択されるポリアルキレンオキシドである、請求項9に記載のポリマー複合薬。
- 前記ポリアルキレンオキシドがPEGである、請求項10に記載のポリマー複合薬。
- 前記PEGが直鎖状である、請求項11に記載のポリマー複合薬。
- 前記PEGが分岐状である、請求項12に記載のポリマー複合薬。
- 抗菌薬1分子当たり1〜約4個のポリマー分子を含んでなる、請求項1または2に記載のポリマー複合薬。
- 種々の結合度を有することを特徴とする、請求項1または2に記載のポリマー複合薬。
- 分画化されていることを特徴とする、請求項1または2に記載のポリマー複合薬。
- 感染治療用の抗菌医薬組成物であって、前記感染用の請求項1または2に記載の抗菌薬の水溶性ポリマー複合体と、医薬として許容し得る担体とを含んでなる医薬組成物。
- 前記抗菌薬がタンパク質またはペプチドである、請求項17に記載の医薬組成物。
- 前記タンパク質またはペプチドが抗菌酵素である、請求項18に記載の医薬組成物。
- 前記酵素が、ブドウ球菌の細胞壁ペプチドグリカンの架橋ポリグリシンブリッジを開裂し得るブドウ球菌溶解活性を有する酵素である、請求項19に記載の医薬組成物。
- 非複合抗菌酵素をさらに含んでなる、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記非複合抗菌酵素が、リソスタフィン、リゾチーム、ムタノリシン、セロジルムラミダーゼ、およびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項21に記載の医薬組成物。
- 抗生物質をさらに含んでなる、請求項19に記載の医薬組成物。
- 前記抗生物質が、β‐ラクタム、セファロスポリン、アミノグリコシド、スルホンアミド、抗葉酸剤、マクロライド、キノロン、グリコペプチド、ポリペプチドおよびそれらの組み合わせからなる群から選択される、請求項23に記載の医薬組成物。
- 哺乳動物の微生物感染を予防または治療処置する方法であって、前記感染の治療に有効な量の請求項17、19または21に記載の医薬組成物を前記哺乳動物に投与することを含んでなる方法。
- 前記感染が細菌感染であり、前記医薬組成物が前記感染に有効な抗菌酵素の水溶性ポリマー複合体を含んでなる、請求項25に記載の方法。
- 前記細菌感染がブドウ球菌種によって起こり、前記ブドウ球菌種が、その細胞壁ペプチドグリカン中に、該菌種の細胞がリソスタフィンの水溶性ポリマー複合体との接触により溶解するのに十分なポリグリシン架橋を有する、請求項26に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌感染が黄色ブドウ球菌によって起こる、請求項27に記載の方法。
- 前記ブドウ球菌感染が表皮ブドウ球菌によって起こる、請求項27に記載の方法。
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