TWI619510B - 因子ｖｉｉｉ聚合共軛物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種包含經由因子VIII之碳水化合物部分與水溶性聚合物共軛之因子VIII分子的蛋白質構築體及其製備方法。

Description

因子VIII聚合共軛物
本申請案為2007年3月29日申請之美國專利申請案第11/729,625號之部份接續申請案，美國專利申請案第11/729,625號主張分別在2006年6月6日及2006年3月31日申請之美國臨時專利申請案第60/790,239號及第60/787,968號的優先權。
本發明係關於一種包含與至少一種水溶性聚合物(包括聚(環氧烷)，諸如聚乙二醇)結合之凝血因子VIII(FVIII)的蛋白質構築體。此外，本發明係關於用於延長患有與FVIII功能缺陷或缺乏有關之出血病症之哺乳動物血液中FVIII之活體內半衰期的方法。
凝血因子VIII(FVIII)在血漿中以極低濃度循環且與溫韋伯氏因子(von Willebrand factor，VWF)非共價結合。在止血期間，FVIII與VWF分開且藉由在鈣及磷脂或細胞膜存在下加快活化速度而充當活化因子IX(FIXa)介導之因子X(FX)活化的輔因子。
FVIII合成為具有域結構A1-A2-B-A3-C1-C2之約270-330kD的單鏈前驅體。當FVIII自血漿純化時(例如，「血漿來源之FVIII」或「血漿FVIII」)，其由重鏈(A1-A2-B)及輕鏈(A3-C1-C2)構成。輕鏈分子質量為80kD，然而，由於B域內蛋白水解，所以重鏈分子質量在90-220kD之範圍內。
FVIII亦被合成為用於治療出血病症之重組蛋白質。已設計各種試管內檢定來測定重組FVIII(rFVIII)作為治療藥品之潛在功效。此等檢定模擬內源性FVIII之活體內作用。如藉由試管內檢定所量測，FVIII之試管內凝血酶處理導致其促凝血活性快速增加且隨後降低。此活化及失活同重鏈與輕鏈中有限之特異性蛋白水解一致，其會改變FVIII中不同結合抗原決定基之可用性，例如允許FVIII脫離VWF且結合磷脂表面或改變結合某些單株抗體之能力。
FVIII之缺乏或功能障礙與最常見之出血病症，即血友病A相關聯。選擇用於治療血友病A之治療係使用血漿來源或rFVIII濃縮物之替代療法。患有嚴重血友病A且FVIII含量低於1%的患者一般已開始預防性療法，旨在使給藥之間的FVIII保持在1%以上。考慮到各種FVIII產品循環之平均半衰期，此通常可藉由一週給與兩至三次FVIII來實現。
市場上存在多種用於治療血友病A之濃縮物。此等濃縮物中之一者為重組產品Advate，其係在CHO細胞中產生且由Baxter Healthcare公司製造。在此產品之細胞培養過程、純化或最終調配中未添加人類或動物血漿蛋白或白蛋白。
許多FVIII濃縮物及治療性多肽藥物製造商的目標係開發具有增強藥效及藥物動力學性質同時維持所有其他產品特徵的下一代產品。
治療性多肽藥物由蛋白水解酶快速降解且由抗體中和。此縮短其半衰期及循環時間，從而限制其治療效力。已展示添加可溶性聚合物或碳水化合物至多肽來防止降解且增加多肽半衰期。例如，將多肽藥物聚乙二醇化可保護該等多肽藥物且改善其藥效及藥物動力學概況(Harris J M et Chess R B,Nat Rev Drug Discov 2003;2:214-21)。聚乙二醇化過程將聚乙二醇(PEG)之重複單元連接至多肽藥物。分子聚乙二醇化可導致藥物對酶促降解之抵抗性增加、活體內半衰期增加、給藥頻率減少、免疫原性降低、物理及熱穩定性增加、溶解性增加、液體穩定性增加及凝集減少。
因此，諸如經由聚乙二醇化來添加可溶性聚合物為一種改善FVIII產品性質之方法。藉由不同專利及專利申請案來評述現行技術：美國專利第6,037,452號描述一種聚(環氧烷)-FVIII或FIX共軛物，其中該蛋白質係經由該FVIII之羰基與聚(環氧烷)共價結合。
EP1258497B1描述一種製備FVIII與生物相容性聚合物之共軛物的方法。此專利由等人之公開案(Bioconj Chem 2000;11:387-96)補充。該等共軛物包含經單甲氧基聚乙二醇修飾之B域缺失之重組FVIII。共軛物具有降低之FVIII功能且凝血活性隨修飾程度而快速降低。
WO04075923A3描述包含複數個共軛物之聚合物-FVIII分子共軛物，其中各共軛物具有1至3個共價連接至FVIII分子之水溶性聚合物。該FVIII分子缺乏B域。
美國專利第4,970,300號描述一種經修飾之FVIII，其中包含具有FVIII活性之蛋白質的不溶性共軛物共價鍵聯至非抗原性配位體。
美國專利第6,048,720號描述多肽與生物相容性聚合物之共軛物。
WO94/15625描述與分子量較佳不超過5,000道爾頓(Dalton)之聚乙二醇結合的FVIII。
對連接可溶性聚合物以延長FVIII活體內半衰期之FVIII仍存在需要，例如聚乙二醇化FVIII，諸如超過10,000道爾頓之PEG與之共軛的全長FVIII，如與非聚乙二醇化FVIII相比，其保留功能活性同時提供延長之活體內半衰期。
本發明係關於一種包含因子VIII分子的蛋白質構築體及其製備方法，該因子VIII分子經由因子VIII之碳水化合物部分與水溶性聚合物共軛。
在本發明之一具體實例中，提供一種使水溶性聚合物與FVIII之經氧化之碳水化合物部分共軛的方法，其包含在允許共軛的條件下使經氧化之碳水化合物部分與經活化之水溶性聚合物接觸。在一相關態樣中，水溶性聚合物係選自由PEG、PSA及聚葡萄糖組成之群。在另一態樣中，經活化之水溶性聚合物係選自由PEG-醯肼、PSA-肼及醛活化之聚葡萄糖組成之群。在本發明之另一態樣中，碳水化合物部分藉由在包含NaIO4之緩衝液中培育而氧化。在本發明之另一態樣中，FVIII之經氧化之碳水化合物部分位於FVIII之B域中。
在本發明之另一具體實例中，提供一種藉由根據任何以上提及之方法的方法產生之經修飾FVIII。在另一具體實例中，提供一種蛋白質構築體，其包含(a)因子VIII分子；及(b)至少一種與該因子VIII分子結合之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII B域中之一或多個碳水化合物部分連接至因子VIII。在本發明之一相關態樣中，水溶性聚合物係選自由PEG、PSA及聚葡萄糖組成之群。
本發明為一種包含與水溶性聚合物結合之便至少一部分B域保持完整之FVIII分子的蛋白質構築體，該水溶性聚合物包括聚環氧烷、聚乙烯基吡咯啶酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉或碳水化合物，諸如聚唾液酸(PSA)或聚葡萄糖。在本發明之一具體實例中，水溶性聚合物為分子量超過10,000道爾頓之聚乙二醇分子。在另一具體實例中，水溶性聚合物具有超過10,000Da至約125,000Da、約15,000Da至20,000Da或約18,000Da至約25,000Da之分子量。在一具體實例中，構築體保留標準治療性FVIII產品之全部功能活性，且提供如與標準治療性FVIII產品相比延長的活體內半衰期。在另一具體實例中，構築體相對於天然因子VIII保留至少50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140或150%之生物活性。在一相關態樣中，構築體及天然因子VIII之生物活性藉由顯色活性與FVIII抗原值之比率(FVIII:Chr:FVIII:Ag)來確定。在本發明之另一具體實例中，構築體之半衰期相對於天然因子VIII之活體內半衰期減少或增加0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、2、3、4、5、6、7、8、9或10倍。
本發明之起始物質為FVIII，其可來源於人類血漿，或藉由如美國專利第4,757,006號、美國專利第5,733,873號、美國專利第5,198,349號、美國專利第5,250,421號、美國專利第5,919,766號、EP 306 968等專利中所述之重組工程技術產生。
本文中，術語「因子VIII」或「FVIII」係指使至少一部分B域保持完整且展現與天然FVIII有關之生物活性的任何FVIII分子。在本發明之一具體實例中，FVIII分子為全長因子VIII。FVIII分子為藉由能夠與編碼因子VIII:C之DNA雜交的DNA序列編碼之蛋白質。此類蛋白質可在域A1-A2-B-A3-C1-C2之間或域內各位點上含有胺基酸缺失(美國專利第4,868,112號)。FVIII分子亦可為天然FVIII之類似物，其中一或多個胺基酸殘基因定點突變誘發而置換。
可用於本發明之FVIII分子包括全長蛋白質、蛋白質之前驅體、蛋白質之生物活性或功能次單元或片段及其功能衍生物以及如下所述之其變異體。提及FVIII意謂包括該等蛋白質之所有可能形式且其中每一FVIII形式使至少一部分或整個天然B域序列保持完整。
根據本發明，術語「重組因子VIII」(rFVIII)可包括經由重組DNA技術獲得之異源性或天然存在之任何rFVIII或其生物活性衍生物。在某些具體實例中，該術語包含如上所述之蛋白質及編碼本發明之rFVIII之核酸。該等核酸包括例如(但不限於)基因、前mRNA、mRNA、多型變異體、對偶基因、合成及天然存在之突變體。術語rFVIII所包含之蛋白質包括例如(但不限於)上述彼等蛋白質及多肽、由上述核酸編碼之蛋白質、種間同系物及如下其他多肽：(1)在至少約25、約50、約100、約200、約300、約400或400以上胺基酸之區域(至多為成熟天然蛋白質之406個胺基酸的全長序列)上的胺基酸序列相較於由本文所述之參考核酸或胺基酸序列編碼之多肽具有超過約60%、約65%、約70%、約75%、約80%、約85%、約90%、約91%、約92%、約93%、約94%、約95%、約96%、約97%、約98%或約99%或99%以上胺基酸序列一致性；及/或(2)特異性結合針對包含如本文所述之參考胺基酸序列之免疫原、其免疫原性片段及/或其保守修飾之變異體產生的抗體，例如多株或單株抗體。
編碼本發明之rFVIII之聚核苷酸包括(但不限於)如下聚核苷酸：(1)在嚴格雜交條件下與編碼如本文所述之參考胺基酸序列之核酸及其保守修飾變異體特異性雜交；(2)在至少約25、約50、約100、約150、約200、約250、約500、約1000或1000以上核苷酸之區域(至多為成熟蛋白質之1218個核苷酸之全長序列)上的核酸序列相較於如本文所述之參考核酸序列具有超過約95%、約96%、約97%、約98%、約99%或99%以上核苷酸序列一致性。
如本文所用，「內源性FVIII」包括來源於意欲接收治療之哺乳動物的FVIII。該術語亦包括自存在於該哺乳動物體內之轉殖基因或任何其他外源DNA轉錄的FVIII。如本文所用，「外源性FVIII」包括非來源於該哺乳動物之FVIII。
變異多肽(或類似多肽)包括插入變異體，其中一或多個胺基酸殘基添加至本發明之FVIII胺基酸序列中。插入可位於蛋白質之任一末端或兩個末端，及/或可位於FVIII胺基酸序列之內部區域內。在任一末端或兩個末端具有額外殘基的插入變異體包括例如融合蛋白及包括胺基酸標籤或其他胺基酸標記之蛋白質。在一態樣中，FVIII分子視情況可含有N-末端Met，尤其當分子在諸如大腸桿菌(E. coli)之細菌細胞中重組表現時。
在缺失變異體中，移除如本文所述之FVIII多肽中的一或多個胺基酸殘基。可在FVIII多肽之一或兩個末端產生缺失，及/或在FVIII胺基酸序列內移除一或多個殘基。因此，缺失變異體包括FVIII多肽序列之所有片段。
在取代變異體中，FVIII多肽之一或多個胺基酸殘基被移除且經替代性殘基置換。在一態樣中，取代實質上為保守的且此類型之保守取代在此項技術中熟知。或者，本發明亦包含非保守之取代。例示性保守取代描述於Lehninger,[Biochemistry,第2版；Worth Publishers公司,New York(1975),第71-77頁]中且立即陳述於下文中。
或者，例示性保守取代立即陳述於下文中。
「天然存在」之聚核苷酸或多肽序列典型地來自包括(但不限於)以下之哺乳動物：靈長類動物，例如人類；齧齒動物，例如大鼠、小鼠、倉鼠；母牛、豬、馬、綿羊或任何哺乳動物。本發明之核酸及蛋白質可為重組分子(例如，異源且編碼野生型序列或其變異體或非天然存在)。參考聚核苷酸及多肽序列包括例如UniProtKB/Swiss-Prot P00451(FA8_人類)；Gitschier J等人，Characterization of the human Factor VIII gene,Nature,312(5992):326-30(1984)；Vehar GH等人，Structure of human Factor VIII,Nature,312(5992):337-42(1984)；及Thompson AR. Structure and Function of the Factor VIII gene and protein,Semin Thromb Hemost,2003:29;11-29(2002)(參考文獻全文併入本文中)。
如本文所用，「生物活性衍生物」或「生物活性變異體」包括分子的具有與該分子實質上相同之功能及/或生物性質(諸如，結合性質)及/或相同結構基礎(諸如，肽主鏈或基礎聚合單元)之任何衍生物或變異體。
如本文所用，「血漿來源之FVIII」或「血漿FVIII」包括可見於獲自哺乳動物之血液中的具有活化凝血途徑性質之所有形式蛋白質。
在各態樣中，rFVIII之產生包括此項技術中已知用於以下之任何方法(i)藉由基因工程產生重組DNA，(ii)藉由例如(不限於)轉染、電穿孔或顯微注射將重組DNA引入原核細胞或真核細胞中，(iii)培養該轉型細胞，(iv)例如組成性或在誘發之後表現rFVIII，及(v)例如自培養基分離或藉由採集轉型細胞來分離該rFVIII，以(vi)獲得經純化之rFVIII。
在其他態樣中，藉由在以產生藥理學上可接受之rFVIII分子為特徵之合適原核或真核宿主系統中表現來產生rFVIII。真核細胞之實例為哺乳動物細胞，諸如CHO、COS、HEK 293、BHK、SK-Hep及HepG2。
在其他態樣中，使用多種載體來製備rFVIII且其係選自真核及原核表現載體。用於原核表現之載體之實例包括諸如(但不限於)pRSET、pET及pBAD之質體，其中原核表現載體中所用之啟動子包括一或多個(但不限於)Iac、trc、trp、recA或araBAD。用於真核表現之載體之實例包括：(i)對於在酵母中表現，載體諸如(但不限於)pAO、pPIC、pYES或pMET，使用諸如(但不限於)AOX1、GAP、GAL1或AUG1之啟動子；(ii)對於在昆蟲細胞中表現，載體諸如(但不限於)pMT、pAc5、pIB、pMIB或pBAC，使用諸如(但不限於)PH、p10、MT、Ac5、OpIE2、gp64或polh之啟動子；及(iii)對於在哺乳動物細胞中表現，載體諸如(但不限於)pSVL、pCMV、pRc/RSV、pcDNA3或pBPV，及在一態樣中為來源於諸如(但不限於)痘瘡病毒、腺相關病毒、疱疹病毒或逆轉錄病毒之病毒系統的載體，使用諸如(但不限於)CMV、SV40、EF-1、UbC、RSV、ADV、BPV及β-肌動蛋白之啟動子。
在某些態樣中，FVIII分子藉由多種化學方法中之任一者與水溶性聚合物共軛(Roberts JM等人，Advan Drug Delivery Rev 2002;54:459-76)。舉例而言，在一具體實例中，FVIII藉由使用N-羥基丁二醯亞胺(NHS)酯使PEG與該蛋白質之自由胺基共軛而聚乙二醇化。在另一具體實例中，利用順丁烯二醯亞胺化學性質使水溶性聚合物(例如，PEG)與自由SH基團偶合，或在FVIII之碳水化合物部分事先氧化後使PEG醯肼或PEG胺與其偶合。
在其他具體實例中，FVIII與其他水溶性聚合物共軛，其中該等水溶性聚合物為例如聚環氧烷、聚乙烯基吡咯啶酮、聚乙烯醇、聚噁唑啉、聚丙烯醯基嗎啉、碳水化合物或多醣，諸如聚唾液酸(PSA)或聚葡萄糖。水溶性聚合物之偶合可藉由直接與蛋白質偶合或經由鍵聯子分子而進行。化學鍵聯子之一實例為含有碳水化合物選擇性醯肼及硫氫基反應性順丁烯二醯亞胺基之MBPH(4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼)(Chamow等人，J Biol Chem 1992;267:15916-22)。
共軛作用可藉由水溶性聚合物與因子VIII在穩定鍵形成下直接偶合(或經由鍵聯子系統偶合)來進行。此外，可降解、可釋放或可水解鍵聯子系統可用於本發明中(Tsubery等人，J Biol Chem 2004;279:38118-24/Greenwald等人，J Med Chem 1999;42:3657-67/Zhao等人，Bioconj Chem 2006;17:341-51/WO2006/138572A2/US7259224B2/US7060259B2)。
如本文中所討論，本發明之一具體實例為經活化之可溶性聚合物與FVIII之經氧化之碳水化合物部分偶合。術語「經活化之水溶性聚合物」在本文中用以指用於與FVIII偶合且具有活性官能基的水溶性聚合物，該活性官能基允許水溶性聚合物與鍵聯子化學共軛或與FVIII直接化學共軛(其含有活性醛基)。如本文所用，術語「經氧化之碳水化合物部分」係指含有由諸如NaIO4之氧化劑產生之自由醛基的FVIII。在本發明之一態樣中，醛活化之聚葡萄糖(含有活性醛基)經由二醯肼鍵聯子與FVIII之醛基偶合。
根據FVIII之糖基化型式(Lenting等人；Blood,92:3983-96(1998))，FVIII經由碳水化合物部分進行之共軛作用應可能會發生在FVIII之B域內。需要靶向B域進行該等共軛反應，因為B域在FVIII活性中不起作用。酶促糖共軛反應描述於US 2008/00700275中。
在本發明之一具體實例中，藉由使用含有活性N-羥基丁二醯亞胺酯(NHS)(諸如，丁二醯亞胺基丁二酸酯、丁二醯亞胺基戊二酸酯或丁二醯亞胺基丙酸酯)之聚乙二醇衍生物經由離胺酸殘基來修飾FVIII。此等衍生物藉由在溫和條件下形成穩定醯胺鍵與FVIII之離胺酸殘基起反應。在本發明之一具體實例中，PEG衍生物之鏈長為5,000Da。鏈長為500至2,000Da、2,000至5,000Da、5,000Da以上直至多達10,000Da或10,000Da以上直至多達20,000Da或20,000Da以上直至多達150,000Da的其他PEG衍生物用於各具體實例中，包括線性及支鏈結構。
胺基聚乙二醇化之替代性方法為藉由形成胺基甲酸酯鍵而與PEG碳酸酯化學共軛，或藉由還原胺化形成二級醯胺鍵而與醛或酮反應。
在本發明中，使用市售PEG衍生物將FVIII分子化學修飾。此等PEG衍生物可具有線性或支鏈結構。含有NHS基團之PEG衍生物之實例列於下文中。
以下PEG衍生物為可購自Nektar Therapeutics(Huntsville,Ala.；參見www.nektar.com/PEG試劑目錄；Nektar Advanced PEGylation,價格清單2005-2006)之PEG衍生物的實例：
mPEG-丁二醯亞胺基丙酸酯(mPEG-SPA)
mPEG-丁二醯亞胺基α-甲基丁酸酯(mPEG-SMB)
mPEG-CM-HBA-NHS(CM=羧甲基；HBA=羥基丁酸)
支鏈PEG衍生物(Nektar Therapeutics)之結構：支鏈PEG N-羥基丁二醯亞胺(mPEG2-NHS)
具有支鏈結構之此試劑由Kozlowski等人(BioDrugs 2001;5:419-29)更詳細地描述。
PEG衍生物之其他實例可購自NOF公司(Tokyo,Japan；參見www.nof.co.jp/english:Catalogue 2005)。
線性PEG衍生物(NOF公司)之通用結構：
X=羧甲基
X=羧戊基
x=丁二酸酯
mPEG丁二醯亞胺基丁二酸酯
x=戊二酸酯
mPEG丁二醯亞胺基戊二酸酯
支鏈PEG衍生物(NOF公司)之結構：2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(1,5-二側氧基-5-丁二醯亞胺氧基，戊氧基)丙烷
2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(丁二醯亞胺基，羧基戊氧基)丙烷
此等丙烷衍生物展示具有1,2取代型式之丙三醇主鏈。在本發明中，亦可使用基於具有1,3取代之丙三醇結構或US2003/0143596A1中描述之其他支鏈結構的支鏈PEG衍生物。
如Tsubery等人(J Biol Chem 2004;279:38118-24)及Shechter等人(WO04089280A3)所述之具有可降解(例如，可水解)鍵聯子之PEG衍生物亦可用於本發明中。
意外地，本發明之聚乙二醇化FVIII展現全部功能活性以及延長之FVIII活體內半衰期。此外，似乎聚乙二醇化rFVIII針對凝血酶失活性的抗性更強。此由多種試管內及活體內方法展示且以下列實例說明之。
如本文所用，「唾液酸部分」包括可溶於水溶液或水性懸浮液且在以醫藥學上有效量投予PSA-FVIII共軛物後對哺乳動物具有很小負面影響或無負面影響(諸如副作用)的唾液酸單體或聚合物(「多醣」)。對根據本發明使用之唾液酸單元無特別限制。在一態樣中，聚合物特徵為具有1至4個單元。在某些態樣中，不同唾液酸單元組合於鏈中。
在本發明之各態樣中，唾液酸部分例如藉由美國專利第4,356,170號(以引用的方式併入本文中)中描述之方法與FVIII結合。在本發明之各具體實例中，多醣化合物為天然存在之多醣、天然存在之多醣的衍生物或天然存在之多醣衍生物。一般而言，化合物中所有醣殘基均為唾液酸殘基。
亦已知使PSA與多肽偶合的其他技術。舉例而言，美國公開案第2007/0282096號描述例如PSA之胺或醯肼衍生物與蛋白質共軛。此外，美國公開案第2007/0191597號描述含有醛基以與受質(例如，蛋白質)在還原末端反應之PSA衍生物。
在本發明之一具體實例中，多醣化合物之聚唾液酸部分為高度親水性的，且在另一具體實例中整個化合物為高度親水性的。親水性主要由唾液酸單元之側位羧基以及羥基賦與。醣單元可含有其他官能基，諸如胺基、羥基或硫酸酯基或其組合。此等基團可存在於天然存在之醣化合物上，或引入衍生多醣化合物中。
在一態樣中，特別用於本發明之多醣化合物為由細菌產生之多醣化合物。某些此等天然存在之多醣稱為糖脂。在一具體實例中，多醣化合物實質上不含末端半乳糖單元。
在本發明之一具體實例中，蛋白質構築體之活體內半衰期延長。如與未與水溶性聚合物結合之FVIII相比，在一相關具體實例中，蛋白質構築體之活體內半衰期延長至少2倍，而在另一具體實例中活體內半衰期延長至少3倍。
在一具體實例中，本發明之蛋白質構築體可藉由注射、諸如靜脈內、肌肉內或腹膜內注射來投予。
為向人類或試驗動物投予包含本發明之蛋白質構築體之組合物，在一態樣中，該等組合物包含一或多種醫藥學上可接受之載劑。術語「醫藥學上可接受」或「藥理學上可接受」係指穩定、抑制蛋白質降解(諸如，凝集及裂解產物)且此外當使用此項技術中熟知之如下所述之途徑投予時不產生過敏性或其他有害反應的分子實體及組合物。「醫藥學上可接受之載劑」包括任何及所有臨床適用之溶劑、分散介質、塗層、抗細菌劑及抗真菌劑、等張劑及吸收延遲劑及其類似物，包括上文揭示之彼等試劑。
如本文所用，「有效量」包括適於治療患有如上概述之出血病症之哺乳動物的劑量。
組合物可經口、局部、經皮、非經腸、藉由吸入噴霧、陰道、直腸或藉由顱內注射來投予。如本文所用，術語非經腸包括皮下注射、靜脈內、肌肉內、腦池內注射或輸液技術。亦涵蓋藉由靜脈內、皮內、肌肉內、乳房內、腹膜內、鞘內、眼球後、肺內注射及/或特定位點處外科手術植入來投予。一般而言，組合物基本上不含熱原以及對接受者可能有害之其他雜質。
組合物之單次或多次投藥可由治療醫師選擇劑量濃度及型式來進行。為預防或治療疾病，合適劑量將視如上所述之待治療之疾病類型、疾病之嚴重程度及病程、藥物係出於預防抑或治療之目的而投予、先前療法、患者之臨床病史及對藥物之反應及主治醫師之判斷而定。
本發明亦係關於一種包含有效量之如上定義之蛋白質構築體的醫藥組合物。該醫藥組合物可進一步包含醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑、鹽、緩衝劑或賦形劑。醫藥組合物可用於治療以上定義之出血病症。本發明之醫藥組合物可為溶液或凍乾製品。醫藥組合物溶液可經受任何合適之凍乾過程。
作為另一態樣，本發明包括包含以便於向個體投藥之方式包裝之本發明組合物的套組。在一具體實例中，此類套組包括包裝在諸如密封瓶或密封容器之容器中的本文所述之化合物或組合物(例如，包含蛋白質構築體之組合物)，其中描述化合物或組合物在實施方法時之用途的標籤附著於該容器或包括在包裝內。在一具體實例中，套組含有：第一容器，其具有包含蛋白質構築體之組合物；及第二容器，其具有用於第一容器中之組合物的生理學上可接受之復原溶液。在一態樣中，化合物或組合物以單位劑型包裝。套組可進一步包括適於根據特定投藥途徑投予組合物之裝置。套組較佳含有描述治療性蛋白質或肽組合物用途之標籤。
實施例
實施例1用mPEG丁二醯亞胺基丁二酸酯聚乙二醇化rFVIII中之離胺酸殘基
藉由利用Econo-Pac 10DG管柱(Bio-Rad)使用含有0.5%蔗糖及0.1%聚山梨醇酯80之20mM Hepes緩衝液、150mM NaCl(pH 7.4)將來源於Advate製造方法之rFVIII主體溶液(3,400U/ml)凝膠過濾。接著在平緩攪拌下將鏈長5,000Da之mPEG丁二醯亞胺基丁二酸酯(PEG-SS 5000)(Abuchowski等人Cancer Biochim Biophys 1984；7：175-86)添加至此溶液中(5mg PEG-SS/mg蛋白質)且藉由逐滴添加0.5M NaOH將pH值調至7.4。接著在室溫下在平緩攪拌下進行聚乙二醇化，歷時1小時。
隨後將反應混合物施加至存於含有0.5%蔗糖及0.1%聚山梨醇酯80之20mM Hepes緩衝液、150mM NaCl(pH 7.4)中的平衡離子交換層析樹脂(Fractogel EMD TMAE 650M/Pharmacia XK-10管柱，床高：15.0cm)上。接著用20CV平衡緩衝液洗滌管柱以移除過量試劑且用洗提緩衝液(20mM Hepes、1.0M NaCl、0.5%蔗糖、0.1%聚山梨醇酯80，pH 7.4)將聚乙二醇化rFVIII洗提。藉由用由再生纖維素組成且具有30kD之截留分子量之膜使用由20mM Hepes、150mM NaCl、0.5%蔗糖組成之緩衝系統(pH 7.4)超濾/透濾來濃縮洗提液。
實施例2
試管內聚乙二醇化rFVIII之生物化學特性化
根據實施例1將來源於Advate製造方法之rFVIII聚乙二醇化且在生物化學上特性化聚乙二醇化FVIII產物。藉由利用FVIII顯色檢定測定PEG-rFVIII之功能活性(Rosen S,Scand J Haematol 1984;33(增刊40):139-45)。該方法係基於Ph. Eur.第5版(5.05)2.7.4 Assay of Blood Coagulation Factor VIII。
將含有因子VIII(FVIII:C)之樣品與凝血酶、活化因子IX(FIXa)、磷脂及因子X(FX)混合於含鈣緩衝液中。FVIII由凝血酶活化且隨後與磷脂、FIXa及鈣離子形成複合物。此複合物將因子X活化成因子Xa，因子Xa又使顯色受質FXa-1(AcOH*CH3OCO-D-CHA-Gly-Arg-pNA)裂解。使用微量培養盤讀取儀在405nm下量測釋放之對硝基苯胺(pNA)的時程。反應斜率與樣品中因子VIII濃度成比例。藉由利用進行少許修改之市售ELISA系統(Cedarlane,Hornby,Ontario,Canada)量測FVIII抗原值。由此等值，計算出FVIII色原/FVIII抗原之比率。藉由量測280nm下光學密度來測定該等製劑中之蛋白質含量。由此等數據，計算出蛋白質含量(Hoyer LW,Human Protein Data. Installments 1-6；Heberli編；Wiley V C H,Weinheim,Germany,1998)且以mg/ml表示。
表1中之數據展示與天然rFVIII之生物活性(100%)相比，在聚乙二醇化rFVIII製劑中，生物活性(藉由FVIII顯色活性與FVIII抗原之比率表示)恢復到超過90%。
實施例3藉由SDS-PAGE及免疫墨點技術特性化聚乙二醇化rFVIII
根據製造商之說明書藉由使用獲自Invitrogen(Carlsbad,Calif.,USA)之4-12%聚丙烯醯胺梯度凝膠藉由SDS PAGE在還原條件下特性化天然rFVIII。使用獲自Bio-Rad(Hercules. Calif.,USA)之Precision Plus標記物(10kD-250kD)作為分子量標記物(MW)。接著藉由電轉印(electroblotting)將蛋白質轉移至獲自Bio-Rad(Hercules,Calif.,USA)之PVDF膜上且隨後用獲自Cedarlane(Hornby,Ontario,Canada)之綿羊抗人類FVIII:C多株抗體培育。免疫染色程序之最後步驟為用獲自Accurate(Westbury,N.Y.,USA)之鹼性磷酸酶(ALP)共軛抗綿羊抗體培育，接著利用ALP受質套組(Bio-Rad,Hercules,Calif.,USA)進行最終目測。結果概述於圖1中。墨點顯示天然rFVIII及聚乙二醇化rFVIII之域結構。其展示聚乙二醇化rFVIII具有比天然重組蛋白質寬的帶及高分子質量。
實施例4FVIII缺乏之剔除小鼠模型中聚乙二醇化rFVIII之藥物動力學
由Bi等人(Nai Genet 1995;10:119-21)詳細描述之FVIII缺乏小鼠用作嚴重人類血友病A之模型。以每公斤體重200IU FVIII之劑量，使每組5隻小鼠之各組經由尾靜脈接收快速注射(10ml/kg)根據實施例1製備之PEG-rFVIII(PEG-SS,5K)或天然rFVIII。在注射後5分鐘、3小時、6小時、9小時及24小時藉由麻醉後心臟穿刺自各組製備檸檬酸鹽血漿。量測血漿樣品中FVIII活性程度。此實驗之結果概述於圖2中。平均半衰期自1.9小時(天然rFVIII)增至4.9小時(聚乙二醇化rFVIII)，曲線下面積(AUC)自13.0增至25.2h*IU/ml。使用來自藥物動力學文庫(MicroMath,Saint Louis,Mo.,USA)之MicroMath Scientist模型1計算半衰期。
實施例5藉由SDS-PAGE及免疫轉印技術詳細分析rFVIII之聚乙二醇化
在60℃下用1nM凝血酶消化天然及聚乙二醇化rFVIII 60分鐘，導致FVIII分子特異性裂解，伴隨清晰降解產物。如實施例3中所述，藉由SDS-PAGE、接著電轉印法使此等重鏈及輕鏈片段分離。為目測裂解片段，應用針對重鏈A1及A2域、B域及輕鏈N末端A3域之多株抗體及單株抗體。
如圖3中所見，所有域雖然聚乙二醇化至不同程度但均聚乙二醇化。B域強烈聚乙二醇化。重鏈之A1與A2域均部分聚乙二醇化。可在輕鏈A3域中觀測到各種聚乙二醇化程度(單聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化…)。與實施例6相符合，似乎聚乙二醇化FVIII對凝血酶更具抵抗性。
實施例6聚乙二醇化rFVIII之抗凝血酶性
FVIII之試管內凝血酶處理導致其促凝血活性快速增加且隨後降低。如下藉由FIXa輔因子檢定監測活化及失活之速率，該速率視凝血酶濃度及FVIII之完整性而定。
在37℃下用0.5nM或1nM凝血酶培育FVIII。以介於0.5至40分鐘之間的時間間隔取出子樣品，且添加至亦含有特定凝血酶抑制劑以使凝血酶介導之其他反應停止的FIXa、FX、PL微脂粒及CaCl2之混合物中且培育3分鐘。將子樣品添加至顯色受質中，該受質由FXa選擇性裂解且含有EDTA以進一步使Xa活化停止。培育15min後，藉由乙酸使反應終止。在ELISA讀取儀中量測吸光度(A405)值，其與FXa濃度成比例，且利用經純化之FXa參考曲線轉化為FXa濃度。繪示所產生之FXa濃度相對於用凝血酶培育之時間的曲線圖。
藉由用單指數擬合來擬合曲線之下降部分，從而測定FVIII之假一級失活速率。
如圖4及表2中所示，聚乙二醇化rFVIII展示在兩種所用凝血酶濃度下較慢之失活速率。
實施例7用支鏈2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(1,5-二側氧基-5-丁二醯亞胺氧基，戊氧基)丙烷聚乙二醇化rFVIII中之離胺酸殘基
自來源於Advate製造方法且含有489IU FVIII/ml之本體材料製備rFVIII於含有150mM NaCl、0.5%蔗糖及0.1%聚山梨醇酯80之20mM Hepes緩衝液(pH 7.4)中之溶液。在平緩攪拌下將獲自NOF公司(Tokyo,Japan)之分子量為20kD的支鏈PEG丁二醯亞胺基戊二酸酯(PEG-SG)試劑(2,3-雙(甲基聚氧乙烯-氧基)-1-(1,5-二側氧基-5-丁二醯亞胺氧基，戊氧基)丙烷)添加至153ml此溶液中(5mg試劑/mg蛋白質)，且在10分鐘後藉由逐滴添加0.5M NaOH將pH值調至7.4。接著在室溫下在平緩攪拌下進行rFVIII之聚乙二醇化，歷時1小時。
隨後將反應混合物施加至存於含有0.5%蔗糖及0.1%聚山梨醇酯80之20mM Hepes緩衝液、150mM NaCl(pH 7.4)中的平衡離子交換層析樹脂(Fractogel EMD TMAE 650M/Pharmacia XK-50管柱，床高：14.5cm)上。用25CV平衡緩衝液洗滌管柱以移除過量試劑(線性流動速率：2cm/min)且以0.5cm/min之線性流動速率用洗提緩衝液(20mM Hepes、1.0M NaCl、0.5%蔗糖、0.1%聚山梨醇酯80，pH 7.4)洗提聚乙二醇化rFVIII。接著藉由用由再生纖維素組成且具有30kD之截留分子量之膜使用由20mM Hepes、150mM NaCl、0.5%蔗糖組成之緩衝系統(pH 7.4)超濾/透濾來濃縮洗提液。
實施例8經20kD支鏈PEG-SG聚乙二醇化之rFVIII的試管內特性化
根據實施例7使用支鏈PEG-SG試劑經由離胺酸殘基使來源於Advate製造方法之rFVIII聚乙二醇化，且如實施例2中所述，生物化學上特性化該聚乙二醇化rFVIII產物。
表3中之數據展示與天然rFVIII之生物活性(100%)相比，在聚乙二醇化rFVIII製劑中，生物活性(藉由FVIII顯色活性與FVIII抗原之比率表示)完全恢復。
如實施例3中所述，使用4-12%聚丙烯醯胺梯度凝膠藉由SDS-PAGE及免疫轉印技術在還原條件下特性化聚乙二醇化rFVIII。結果概述於圖5中。墨點顯示天然rFVIII及聚乙二醇化rFVIII之域結構。其展示聚乙二醇化rFVIII具有比天然重組蛋白質寬的帶及高分子質量。
為藉由SDS-PAGE及免疫轉印技術更詳細地分析rFVIII製劑之聚乙二醇化，如實施例5中所述，在60℃下用1nM凝血酶消化天然rFVIII及聚乙二醇化rFVIII，導致FVIII分子特異性裂解，伴隨清晰降解產物。藉由SDS-PAGE、接著電轉印法使該等片段分離，且藉由不同抗FVIII抗體目測。如圖6中所見，所有域雖然聚乙二醇化至不同程度但均聚乙二醇化。B域強烈聚乙二醇化。可在輕鏈A3域中觀測到各種聚乙二醇化程度(單聚乙二醇化、二聚乙二醇化、三聚乙二醇化)。結果指示似乎聚乙二醇化rFVIII對凝血酶更具抵抗性。
如實施例6中所述，藉由FIXa輔因子檢定監測藉由凝血酶之活化及失活的速率。藉由用單指數擬合來擬合曲線之下降部分，從而測定FVIII之假一級失活速率。
如圖7及表4中所示，聚乙二醇化rFVIII展示在兩種所用凝血酶濃度下較慢之失活速率。
實施例9經由碳水化合物部分使rFVIII聚乙二醇化
為經由碳水化合物殘基製備PEG-rFVIII共軛物，在25mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.7)中製備rFVIII溶液(最終濃度：1.2mg/ml)。添加NaIO4(最終濃度為0.3mM)，以氧化碳水化合物殘基(Roberts等人；Advanced Drug Del Rev.;54:459-76(2002)；Meir及Wilchek;Meth Enzymol;138:429-42(1987))。藉由添加丙三醇達10%之最終濃度，使反應中止，且藉由使用Amicon Micron-10裝置(Amicon,Billerica,MA)重複離心來分離過量試劑。添加PEG-醯肼(MW 3300Da/Nektar,Huntsville,Alabama)以產生1.5mM最終濃度之試劑。接著在室溫下進行聚乙二醇化，歷時2h。隨後，獲得共軛物且藉由使用25mM磷酸鹽緩衝液(pH 6.7)在Amicon Micron-10裝置上重複離心來分離過量試劑。
實施例10用PSA-肼使rFVIII聚唾液酸化
為經由碳水化合物殘基製備PSA-rFVIII共軛物，在20mM乙酸鈉緩衝液(pH 6.0)中製備rFVIII溶液(最終濃度：1mg/ml)。添加NaIO4(最終濃度為0.25mM)，以氧化碳水化合物殘基。在黑暗中於4℃下進行氧化反應。添加亞硫酸氫鈉(最終濃度為25mM)以使反應停止。藉由在DG-10管柱(Bio-Rad)上凝膠過濾來分離過量過碘酸鈉。隨後，添加鏈長20kD之PSA-肼(根據WO2006/016168製備)(最終濃度為10mM)。在室溫下進行聚唾液酸化程序，歷時2h。藉由HIC在Butyl-Sepharose(GE-Healthcare)上純化聚唾液酸化rFVIII。將5M NaCl溶液添加至混合物中，得到3M最終濃度之NaCl。將此混合物施加於填充Butyl-Sepharose(GE-Heallhcare)之管柱且使用含有6.7mM CaCl2之50mM Hepes緩衝液(pH 7.4)洗提rFVIII-PSA共軛物。在共軛物洗提後，將pH值調至pH 6.9。
實施例11聚唾液酸之純化及衍生化
如WO06016161A1中所述，藉由陰離子交換層析法在Q-Sepharose FF上純化聚唾液酸。將5公克PSA溶於含有25mM NaCl之50mL 10mM三乙醇胺緩衝液(pH 7.4)(=起始緩衝液)中。將此溶液施加至填充Q-Sepharose FF(GE Healthcare,Munich,Germany)之經起始緩衝液平衡的Pharmacia XK50管柱上。接著用8管柱體積(CV)起始緩衝液洗滌管柱，且用存於起始緩衝液中之3CV 200mM NaCl、350mM NaCl及500mM NaCl逐步洗提經結合之PSA。如藉由SDS凝膠電泳所指示，以350mM NaCl洗提之部份展示20kDa之分子量。藉由使用由再生纖維素(Millipore,Billerica,MA)製成之5kD膜超濾來濃縮此部份，且隨後針對50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.2)進行透濾。用NaIO4氧化PSA且藉由還原胺化反應引入末端一級胺基，如WO05016973A1中所述。為進行還原胺化反應，將11mL 2M NH4Cl溶液添加至20mL溶液中，每毫升溶液在50mM磷酸鹽緩衝液(pH 7.2)中含有58mg氧化PSA。接著添加5M NaCNBH3於1M NaOH中之溶液，得到75mM之最終濃度。在室溫下在pH 8.0下反應5天。
接著針對含有10mM NaCl之(NH4)2CO3溶液(50mg/L)透析混合物，且隨後針對含有5mM EDTA之50mM磷酸鹽緩衝液(pH 8.0)透析。接著藉由使末端一級胺基與2-亞胺基硫雑環戊烷(喬氏試劑(Traut's reagent)/Pierce,Rockford,IL)反應來引入硫氫基。在室溫下在含有5mM EDTA之50mM磷酸鹽緩衝液(pH 8.0)中與20倍莫耳過量之試劑反應1h。最終使用具有5kD之截留分子量且由再生纖維素(Millipore,Billerica,MA)製成之膜對含有末端自由硫氫基之PSA溶液進行超濾/透濾。
實施例12藉由使用雜雙官能交聯劑使rFVIII聚唾液酸化
為使PSA-SH與rFVIII偶合，使用含有碳水化合物選擇性醯肼及硫氫基反應性順丁烯二醯亞胺基之雜雙官能交聯劑MBPH(4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼鹽酸鹽/Pierce,Rockford,1L)(Chamow等人，J Biol Chem;267:15916-22(1992))。根據實施例11製備含有活性硫氫基之PSA-SH。
根據製造商之說明書使用去鹽管柱(Bio-Rad Econopac 10DG)將2ml rFVIII(638mg，濃度為3.856mg/ml蛋白質)轉移至氧化緩衝液(50mM乙酸鈉，pH 6)中。接著用0.25mM NaIO4(Merck)(在黑暗中於4℃下1h)氧化蛋白質。用最終濃度為10%之丙三醇使氧化反應中止。移除丙三醇及NaIO4，且根據製造商之說明書使用去鹽管柱(Bio-Rad Econopac 10 DG)將蛋白質轉移至反應緩衝液(50mM磷酸鈉，pH 6.5)中。接著在pH 6.5下於室溫下將含有1mg MBPH/mg蛋白質及PSA-SH(對蛋白質而言200倍莫耳過量)之混合物培育2h。根據製造商之說明書使用去鹽管柱(Bio-Rad Econopac 10 DG)移除過量鍵聯子，且將鍵聯子-PSA共軛物轉移至反應緩衝液中。
將MPBH-PSA共軛物添加至氧化rFVIII(0.105mg/ml蛋白質)中且在輕微震盪下於室溫下將反應混合物培育2h。藉由HIC使用預填充Butyl Sepharose管柱(GE Healthcare,Butyl HiTrap FF 5ml)純化rFVIII-PSA共軛物。為允許共軛物與Butyl Sepharose進行疏水性相互作用，使樣品冷卻至2-8℃，且藉由添加含有5M NaCl之緩衝溶液(50mM Hepes、5M NaCl、6.7mM CaCl2、0.01% Tween，pH 6.9)將反應混合物之離子強度增至約185mS/cm之導電率。將反應混合物負載於經pH 6.9之平衡緩衝液(含有50mM Hepes、3M NaCl、6.7mM CaCl2、0.01% Tween 80)平衡之管柱上，流動速率為1.2cm/min。用10管柱體積(CV)平衡緩衝液洗去未結合樣品。用pH 7.4之低離子強度緩衝液(50mM Hepes、6.7mM CaCl2)洗提共軛物，流動速率為1.2cm/min。在層析過程期間，使用冰浴來冷卻樣品及緩衝液。最終，洗提液之pH值調至6.9。
實施例13rFVIII與聚葡萄糖之共軛
為使rFVIII與聚葡萄糖共軛，根據製造商之說明書使用去鹽管柱(Bio-Rad Econopac 10 DG)將2ml rFVIII(638mg，3.4mg/ml蛋白質)轉移至氧化緩衝液(50mM乙酸鈉，pH 6)中。接著用0.25mM NaIO4氧化蛋白質(在黑暗中於4℃下1h)。首先根據製造商之說明書使用截留分子量(MWCO)為30kDa之vivaspin超濾離心柱(Sartorius Stedim Biotech GmbH)濃縮氧化蛋白質。接著在4℃下針對反應緩衝液(50mM磷酸鈉，pH 7)使樣品透析隔夜。
透析後，添加26.58mg己二酸二醯肼(ADH)(Sigma)(500倍莫耳過量)，且在輕微震盪下在pH 7下於室溫下將反應混合物培育2h。根據製造商之說明書使用去鹽管柱(Bio-Rad Econopac 10 DG)移除ADH。添加10mg醛活化之聚葡萄糖(Pierce)(對蛋白質而言17倍莫耳過量)，且在pH 7下於室溫下將混合物培育2h。
藉由IEX層析法在Q-Sepharose HP(GE-Healthcare)上純化共軛物。將樣品負載於經緩衝液A(50mM磷酸鈉，pH 6.8)平衡之管柱(6.4mm×3cm，V=1ml)上，流動速率為0.5ml/min。用5CV緩衝液A洗去未結合樣品。最終，用線性鹽梯度(10CV之0-100%緩衝液B[50mM磷酸鈉pH 6.8+1M NaCl])洗提共軛物，流動速率為0.5ml/min。
圖1展示藉由SDS-PAGE、隨後免疫轉印法量測之在rFVIII與PEG共軛後其擴展及質量增加。
圖2展示在血友病小鼠中與未共軛FVIII相比PEG-rFVIII共軛物之藥物動力學。空心正方形：PEGrFVIII，劑量為200IU FVIII/kg。閉合菱形：天然rFVIII，劑量為200IU FVIII/kg。
圖3展示藉由SDS-PAGE使用各種抗FVIII抗體詳細分析聚乙二醇化位點。
圖4展示天然rFVIII及聚乙二醇化rFVIII之凝血酶誘發之活化及失活。
圖5展示顯示天然rFVIII及聚乙二醇化rFVIII之域的帶。
圖6展示天然rFVIII及聚乙二醇化FVIII之各域聚乙二醇化的程度。
圖7展示天然rFVIII及聚乙二醇化rFVIII之凝血酶失活速率。

Claims (190)

  1. 一種使水溶性聚合物與因子VIII(FVIII)之經氧化之碳水化合物部分共軛的方法，其包含在允許共軛的條件下使該經氧化之碳水化合物部分與經活化之水溶性聚合物接觸，其中已經與水溶性聚合物共軛之該FVIII保留至少50%之天然FVIII的活性，其中「經活化之水溶性聚合物」表示用於與FVIII偶合且具有活性官能基的水溶性聚合物，該活性官能基允許水溶性聚合物與鍵聯子化學共軛或與FVIII(其含有活性醛基)直接化學共軛，其中「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物。
  2. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  3. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該經活化之水溶性聚合物係選自由PSA-肼及醛活化之聚葡萄糖組成之群。
  4. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該碳水化合物部分藉由在包含NaIO4之緩衝液中培育而氧化。
  5. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該FVIII之經氧化之碳水化合物部分位於因子VIII之B域中。
  6. 如申請專利範圍第1項之方法，其中該已與水溶性聚合物共軛之FVIII保留至少80%之天然FVIII的活性。
  7. 一種經修飾之因子VIII，其由如申請專利範圍第1項至第5項中任一項之方法產生，其中至少一種水溶性聚合物經由一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該經修飾之因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，其中該碳水化合物部分為經氧化之碳水化合物部分，其中「該經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物。
  8. 一種蛋白質分子，其包含：(a)因子VIII分子；及(b)至少一種與該因子VIII分子結合之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由一或多個位於該因子VIII B域中之碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然FVIII的活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物。
  9. 如申請專利範圍第8項之蛋白質分子，其中該水溶性聚合物係選自由PSA及聚葡萄糖組成之群。
  10. 如申請專利範圍第8項之分子，其中該分子保留至少80%之天然FVIII的活性。
  11. 一種組合物，其包含包含經水溶性聚合物結合所修飾的天然因子FVIII之共軛物，該水溶性聚合物由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，且該組合物實質上不含白蛋白，其中「該經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物。
  12. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中水溶性聚合物經由鍵聯子連接至該經氧化之碳水化合物部分。
  13. 如申請專利範圍第12項之組合物，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  14. 如申請專利範圍第12項之組合物，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  15. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該經氧化之碳水化合物部分位於天然因子VIII之B域中。
  16. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  17. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該經修飾的因子VIII保留至少60%之天然FVIII的活性。
  18. 如申請專利範圍第17項之組合物，其中該經修飾的因子VIII保留至少70%之天然FVIII的活性。
  19. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該水溶性聚合物具有2,000Da至150,000Da之分子量。
  20. 如申請專利範圍第19項之組合物，其中該水溶性聚合物具有5,000Da至50,000Da之分子量。
  21. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該水溶性聚合物為支鏈的。
  22. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該水溶性聚合物為直鏈的。
  23. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  24. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  25. 如申請專利範圍第11項之組合物，其中該組合物包含(i)複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，以及(ii)醫藥上可接受的賦形劑。
  26. 如申請專利範圍第11項之組合物，其進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  27. 一種含有醫藥組合物之套組，該醫藥組合物包含(i)如申請專利範圍第11項之組合物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑；該套組係包裝於具有描述如申請專利範圍第11項之方法中的醫藥組合物之用途的標籤的容器內。
  28. 如申請專利範圍第27項之套組，其中該醫藥組成物以單位劑型包裝。
  29. 一種套組，其包含：包含如申請專利範圍第11項之組合物之第一容器，及第二容器，其包含用於第一容器中之組合物的生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述如申請專利範圍第11項之方法中的醫藥組合物之用途的標籤來包裝。
  30. 如申請專利範圍第29項之套組，其中該醫藥組成物以單位劑型包裝。
  31. 一種包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII之共軛物之用途，其係用於製造用於治療有需要個體之出血病症的醫藥品，其中該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，且該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物。
  32. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該醫藥品實質上不含白蛋白。
  33. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該水溶性聚合物經由鍵聯子連接該經氧化之碳水化合物部分。
  34. 如申請專利範圍第33項之用途，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  35. 如申請專利範圍第33項之用途，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  36. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該經氧化之碳水化合物部分位於天然因子VIII之B域中。
  37. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  38. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該經修飾的因子VIII保留至少60%之天然FVIII的活性。
  39. 如申請專利範圍第38項之用途，其中該經修飾的因子VIII保留至少70%之天然FVIII的活性。
  40. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該出血病症為血友病A。
  41. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該水溶性聚合物具有2,000Da至150,000Da之分子量。
  42. 如申請專利範圍第41項之用途，其中該水溶性聚合物具有5,000Da至50,000Da之分子量。
  43. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該水溶性聚合物為支鏈的。
  44. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該水溶性聚合物為直鏈的。
  45. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  46. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  47. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該醫藥品包含複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性。
  48. 如申請專利範圍第31項之用途，其中該醫藥品進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  49. 一種含有醫藥品之套組，該醫藥品包含(i)包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII之共軛物，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑；該套組係包裝於具有描述如申請專利範圍第31項之用途中的醫藥品之用途的標籤的容器內。
  50. 如申請專利範圍第49項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  51. 一種套組，其包含：包含共軛物之第一容器，該共軛物包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中之共軛物的生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述如申請專利範圍第31項之用途中的醫藥品之用途的標籤來包裝。
  52. 如申請專利範圍第51項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  53. 一種包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII之共軛物的用途，其係用於製造用於治療有需要個體之出血病症的醫藥品，其中該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，且該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，且其中該醫藥品係用於包含以下步驟之方法：i)依據出血病症的類型、出血病症的嚴重程度及患者之臨床病史，決定用於出血病症患者之劑量；及ii)投予該醫藥品。
  54. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該醫藥品實質上不含白蛋白。
  55. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該水溶性聚合物經由鍵聯子連接該經氧化之碳水化合物部分。
  56. 如申請專利範圍第55項之用途，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  57. 如申請專利範圍第55項之用途，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  58. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該經氧化之碳水化合物部分位於天然因子VIII之B域中。
  59. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  60. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該因子VIII保留至少60%之天然FVIII的活性。
  61. 如申請專利範圍第60項之用途，其中該因子VIII保留至少70%之天然FVIII的活性。
  62. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該出血病症為血友病A。
  63. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該水溶性聚合物具有2,000Da至150,000Da之分子量。
  64. 如申請專利範圍第63項之用途，其中該水溶性聚合物具有5,000Da至50,000Da之分子量。
  65. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該水溶性聚合物為支鏈的。
  66. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該水溶性聚合物為直鏈的。
  67. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  68. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  69. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該醫藥品包含複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性。
  70. 如申請專利範圍第53項之用途，其中該醫藥品進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  71. 一種含有醫藥品之套組，該醫藥品包含(i)包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII之共軛物，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑；該套組係包裝於具有描述如申請專利範圍第53項之用途中的醫藥品之用途的標籤的容器內。
  72. 如申請專利範圍第71項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  73. 一種套組，其包含：包含共軛物之第一容器，該共軛物包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中之共軛物的生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述如申請專利範圍第53項之用途中的醫藥品之用途的標籤來包裝。
  74. 如申請專利範圍第73項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  75. 一種使患有出血病症之患者中的FVIII分子濃度有效保持在至少1%之醫藥組合物之單位劑型，其包含(i)共軛物，該共軛物包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑。
  76. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該組合物實質上不含白蛋白。
  77. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該水溶性聚合物經由鍵聯子連接該經氧化之碳水化合物部分。
  78. 如申請專利範圍第77項之單位劑型，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  79. 如申請專利範圍第77項之單位劑型，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  80. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該經氧化之碳水化合物部分位於天然因子VIII之B域中。
  81. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該醫藥組合物儲存於器皿中。
  82. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該醫藥組合物儲存於注射器中。
  83. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其為適合注射的形式。
  84. 如申請專利範圍第83項之單位劑型，其為粉末的形式，該粉末的形式在注射前以稀釋劑復原。
  85. 如申請專利範圍第84項之單位劑型，其以稀釋劑復原。
  86. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該組合物包含(i)複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑。
  87. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  88. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物具有在約大於5,000道爾頓至約150,000道爾頓的範圍內之標稱(nominal)平均分子量。
  89. 如申請專利範圍第75項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  90. 如申請專利範圍第89項之單位劑型，其中該組合物包含相同的水溶性聚合物。
  91. 如申請專利範圍第90項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物具有在約2,000道爾頓至約150,000道爾頓的範圍內之標稱平均分子量。
  92. 如申請專利範圍第90項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物具有在約5,000道爾頓至約50,000道爾頓的範圍內之標稱平均分子量。
  93. 如申請專利範圍第90項之單位劑型，其中每個水溶性聚合物為直鏈的。
  94. 如申請專利範圍第90項之單位劑型，其中每個水溶性聚合物為支鏈的。
  95. 如申請專利範圍第90項之單位劑型，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  96. 如申請專利範圍第90項之單位劑型，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  97. 一種含有如申請專利範圍第75項之醫藥組合物的單位劑型之套組，其包含(i)包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII之共軛物，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑；該套組係包裝於具有描述該醫藥組合物之用途的標籤的容器內。
  98. 如申請專利範圍第97項之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。
  99. 一種含有如申請專利範圍第75項之醫藥組合物的單位劑型之套組，該套組包含：包含共軛物之第一容器，該共軛物包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中之共軛物的生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述該醫藥組合物之用途的標籤來包裝。
  100. 如申請專利範圍第99項之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。
  101. 一種含有醫藥組合物之套組，其包含(i)包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII之共軛物，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物及(ii)醫藥上可接受之賦形劑；該套組係包裝於具有描述該醫藥組合物之用途的標籤的容器內。
  102. 一種套組，其包含：包含共軛物之第一容器，該共軛物包含經所連接的水溶性聚合物修飾的天然因子VIII，該水溶性聚合物經由經氧化之碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該「經氧化之碳水化合物部分」表示含有由氧化劑產生之自由醛基的FVIII，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中之共軛物的生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述該醫藥組合物之用途的標籤來包裝。
  103. 一種含有醫藥組合物之套組，其包含(i)因子VIII分子，其中至少一種水溶性聚合物連接至該因子VIII分子，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物及(ii)醫藥上可接受之賦形劑；該套組係包裝於具有描述該醫藥組合物之用途的標籤的容器內。
  104. 一種套組，其包含：包含因子VIII分子之第一容器，其中至少一種水溶性聚合物連接該因子VIII分子，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中之共軛物的生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述該醫藥組合物之用途的標籤來包裝。
  105. 一種組合物，其包含(a)因子VIII分子；及(b)至少一種連接至該因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，且該組合物實質上不含白蛋白。
  106. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該水溶性聚合物經由鍵聯子連接該碳水化合物部分。
  107. 如申請專利範圍第106項之組合物，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  108. 如申請專利範圍第106項之組合物，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  109. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  110. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該經修飾的因子VIII保留至少60%之天然因子VIII的活性。
  111. 如申請專利範圍第110項之組合物，其中該經修飾的因子VIII保留至少70%之天然因子VIII的活性。
  112. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該水溶性聚合物具有2,000Da至150,000Da之分子量。
  113. 如申請專利範圍第112項之用途，其中該水溶性聚合物具有5,000Da至50,000Da之分子量。
  114. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該水溶性聚合物為支鏈的。
  115. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該水溶性聚合物為直鏈的。
  116. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  117. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  118. 如申請專利範圍第105項之組合物，其中該組合物包含(i)複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑。
  119. 如申請專利範圍第105項之組合物，其進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  120. 一種套組，其包含(i)如申請專利範圍第105項之組合物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑；該套組係包裝於具有描述如申請專利範圍第105項之組合物之用途的標籤的容器內。
  121. 如申請專利範圍第120項之套組，其中該組合物以單位劑型包裝。
  122. 一種套組，其包含：包含如申請專利範圍第105項之組合物之第一容器；及第二容器，其包含用於第一容器中之共軛物的生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述如申請專利範圍第105項之組合物之用途的標籤來包裝。
  123. 如申請專利範圍第122項之套組，其中該組合物以單位劑型包裝。
  124. 一種連接至少一種水溶性聚合物之因子VIII分子之用途，其係用於製造治療有需要患者之出血病症之醫藥品，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物。
  125. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該醫藥品實質上不含白蛋白。
  126. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該水溶性聚合物經由鍵聯子連接該碳水化合物部分。
  127. 如申請專利範圍第126項之用途，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  128. 如申請專利範圍第126項之用途，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  129. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  130. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該經修飾的因子VIII保留至少60%之天然因子VIII的活性。
  131. 如申請專利範圍第130項之用途，其中該經修飾的因子VIII保留至少70%之天然因子VIII的活性。
  132. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該出血病症為血友病A。
  133. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該水溶性聚合物具有2,000Da至150,000Da之分子量。
  134. 如申請專利範圍第133項之用途，其中該水溶性聚合物具有5,000Da至50,000Da之分子量。
  135. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該水溶性聚合物為支鏈的。
  136. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該水溶性聚合物為直鏈的。
  137. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  138. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  139. 如申請專利範圍第124項之用途，其中該醫藥品包含複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性。
  140. 如申請專利範圍第124項之用途，該醫藥品進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  141. 一種含有醫藥品之套組，該醫藥品包含(i)(a)因子VIII分子；及(b)至少一種連接該因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受之賦形劑；該套組係包裝於具有描述如申請專利範圍第124項之用途中的醫藥品之用途的標籤的容器內。
  142. 如申請專利範圍第141項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  143. 一種套組，其包含第一容器，該第一容器包含(a)因子VIII分子，及(b)至少一種連接該因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中的共軛物之生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述如申請專利範圍第124項之用途中的醫藥品之用途之標籤來包裝。
  144. 如申請專利範圍第143項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  145. 一種連接至少一種水溶性聚合物之因子VIII分子之用途，其係用於製造治療有需要患者之出血病症之醫藥品，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，且其中該醫藥品用於包含以下步驟之方法：i)依據出血病症的類型、出血病症的嚴重程度及患者之臨床病史，決定出血病症患者之劑量；及ii)投予該醫藥品。
  146. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該醫藥品實質上不含白蛋白。
  147. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該水溶性聚合物經由鍵聯子連接該碳水化合物部分。
  148. 如申請專利範圍第147項之用途，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  149. 如申請專利範圍第147項之用途，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  150. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  151. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該經修飾的因子VIII保留至少60%之天然因子VIII的活性。
  152. 如申請專利範圍第151項之用途，其中該經修飾的因子VIII保留至少70%之天然因子VIII的活性。
  153. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該出血病症為血友病A。
  154. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該水溶性聚合物具有2,000Da至150,000Da之分子量。
  155. 如申請專利範圍第154項之用途，其中該水溶性聚合物具有5,000Da至50,000Da之分子量。
  156. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該水溶性聚合物為支鏈的。
  157. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該水溶性聚合物為直鏈的。
  158. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  159. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  160. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該醫藥品包含複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性。
  161. 如申請專利範圍第145項之用途，其中該醫藥品進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  162. 一種含有醫藥品之套組，該醫藥品包含(i)(a)因子VIII分子；及(b)至少一種連接該因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受之賦形劑；該套組係包裝於具有描述如申請專利範圍第145項之用途中的醫藥品之用途的標籤的容器內。
  163. 如申請專利範圍第162項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  164. 一種套組，其包含第一容器，該第一容器包含(a)因子VIII分子，及(b)至少一種連接該因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中的共軛物之生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述如申請專利範圍第145項之用途中的醫藥品之用途的標籤來包裝。
  165. 如申請專利範圍第164項之套組，其中該醫藥品以單位劑型包裝。
  166. 一種使患有出血病症之患者中的FVIII分子濃度有效保持在至少1%之醫藥組合物之單位劑型，其包含(i)(a)因子VIII分子；及(b)至少一種連接因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑。
  167. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其中該組合物實質上不含白蛋白。
  168. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其中該水溶性聚合物經由鍵聯子連接該碳水化合物部分。
  169. 如申請專利範圍第168項之單位劑型，其中該鍵聯子為4-[4-N-順丁烯二醯亞胺基苯基]丁酸肼(MBPH)。
  170. 如申請專利範圍第168項之單位劑型，其中該鍵聯子為可釋放或可水解的。
  171. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其中該醫藥組合物儲存於器皿中。
  172. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其中該醫藥組合物儲存於注射器中。
  173. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其為適合注射的形式。
  174. 如申請專利範圍第173項之單位劑型，其中該組合物為粉末的形式，該粉末的形式在注射前以稀釋劑復原。
  175. 如申請專利範圍第174項之單位劑型，其以稀釋劑復原。
  176. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其中該組合物包含(i)複數個共軛物，每個共軛物具有至少一種連接天然因子VIII之水溶性聚合物，該水溶性聚合物經由一或多個碳水化合物部分連接至該經修飾的因子VIII，該經修飾的因子VIII保留至少50%之天然FVIII的活性，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑。
  177. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其進一步包含未共軛的因子VIII部分。
  178. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物具有在約大於5,000道爾頓至約150,000道爾頓的範圍內之標稱平均分子量。
  179. 如申請專利範圍第166項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物係選自由聚唾液酸(PSA)及聚葡萄糖組成之群。
  180. 如申請專利範圍第179項之單位劑型，其中該組合物包含相同的水溶性聚合物。
  181. 如申請專利範圍第180項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物具有在約2,000道爾頓至約150,000道爾頓的範圍內之標稱平均分子量。
  182. 如申請專利範圍第181項之單位劑型，其中該組合物中的每個水溶性聚合物具有在約5,000道爾頓至約50,000道爾頓的範圍內之標稱平均分子量。
  183. 如申請專利範圍第180項之單位劑型，其中每個水溶性聚合物為直鏈的。
  184. 如申請專利範圍第180項之單位劑型，其中每個水溶性聚合物為支鏈的。
  185. 如申請專利範圍第180項之單位劑型，其中該因子VIII為重組因子VIII。
  186. 如申請專利範圍第180項之單位劑型，其中該因子VIII為血漿因子VIII。
  187. 一種含有如申請專利範圍第166項之醫藥組合物的單位劑型之套組，其包含(i)(a)因子VIII分子，及(b)至少一種連接該因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物，及(ii)醫藥上可接受的賦形劑；該套組係包裝於具有描述該醫藥組合物之用途的標籤的容器內。
  188. 如申請專利範圍第187項之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。
  189. 一種含有如申請專利範圍第166項之醫藥組合物的單位劑型之套組，該套組包含：第一容器，其包含(a)因子VIII分子；及(b)至少一種連接該因子VIII分子之水溶性聚合物，其中該水溶性聚合物經由位於因子VIII之B域中的一或多個碳水化合物部分連接至該因子VIII，其中該分子保留至少50%之天然因子VIII之活性，且其中該水溶性聚合物係選自聚唾液酸(PSA)和其包含PSA-肼在內之衍生物、以及聚葡萄糖和其包含醛活化聚葡萄糖在內之衍生物；及第二容器，其包含用於第一容器中的共軛物之生理學上可接受之復原溶液，其中該套組以描述該醫藥組合物之用途的標籤來包裝。
  190. 如申請專利範圍第189項之套組，其中該醫藥組合物以單位劑型包裝。
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